JPH10165190A - ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸の探索用プローブおよびこのプローブを用いて分離されるＤＮＡまたはｃＤＮＡ。 - Google Patents

ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸の探索用プローブおよびこのプローブを用いて分離されるＤＮＡまたはｃＤＮＡ。

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JPH10165190A
JPH10165190A JP9325042A JP32504297A JPH10165190A JP H10165190 A JPH10165190 A JP H10165190A JP 9325042 A JP9325042 A JP 9325042A JP 32504297 A JP32504297 A JP 32504297A JP H10165190 A JPH10165190 A JP H10165190A
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ダン・アシュレー・ロジャー
Nicholas M Gough
グー・ニコラス・マーチン
Donald Metcalf
メトカーフ・ドナルド
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子
（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡを
探索用プローブを提供する。 【解決手段】 本発明はマウスの顆粒球・マクロファー
ジ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードするＤ
ＮＡの配列の一部、もしくは前記ＤＮＡの配列に相補的
な配列の一部からなるＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸の
探索用プローブであり、このＧＭ−ＣＳＦ探索用プロー
ブを用いて分離されるＤＮＡまたはｃＤＮＡを包含す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、ＤＮＡ配列、組
換え体ＤＮＡ分子および特定の血液細胞の産生を制御す
る蛋白分子の特異性をもつ蛋白群またはポリペプタイド
群の製法に関するものである。さらに具体的には、この
発明は顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ）として知られている蛋白分子に関する遺伝
暗号を指定するか、あるいは遺伝暗号を指定するフラグ
メントを包含することを特徴とするＤＮＡ配列および組
換えＤＮＡ分子に関するものである。
【０００２】特に、本発明はこのなかのうち、ＧＭ−Ｃ
ＳＦをコードする核酸の探索用プローブおよびこのプロ
ーブを用いて分離されるＤＮＡまたはｃＤＮＡに関する
ものである。
【０００３】
【従来の技術】赤血球（赤色血液細胞）、顆粒球、マク
ロファージおよびリンパ球などのような血液細胞の産生
は、骨髄中の多能性前駆体または幹細胞を刺激する一組
の蛋白分子の制御下に行われる。造血過程において、こ
れらの多能性細胞は、始動前駆細胞、コロニー形成細胞
または個々の血液細胞に対するＣＦＣ群等の様々の名で
呼ばれる限定された分化能を有する細胞を形成する。フ
ュング、エム．シー．等著、ネイチャー３０７巻、２３
３−２３７頁（１９８４年）およびヨコタ、ティ等著、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス（アメリカ）８１巻、１０７０−１０７
４頁（１９８４年）に記載のいわゆるマルチ−ＣＳＦ
（インターロイキン３）の様な前駆体幹細胞またはＣＦ
Ｃ群の非特異的刺激因子も存在し得るが、一方では個々
の異種細胞系に対する特異的調節遺伝子が存在する。特
に、それぞれのＣＦＣ群からの顆粒球およびマクロファ
ージの産生は、ブルゲル、エイ．ダブル．等著、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー ２５２
巻、１９９８−２００３頁（１９７７年）に記載の顆粒
球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ
Ｆ）、スタンレイ、イー．アール．およびハード、ピ
ー．エム．著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー ２５２巻、４３０５−４３１２頁（１９７
７年）に記載の顆粒球コロニー刺激因子およびニコラ、
エヌ．エイ．等著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー ２５８巻、９０１７−９０２１頁（１
９８３年）に記載のマクロファージ・コロニー刺激因子
（Ｍ−ＣＳＦ）の様な糖蛋白の制御下で行われる。これ
らの糖蛋白は体内での発生量が少ないにもかかわらず、
一部分のアミノ酸配列分析および生物的特徴づけのため
に少量のねずみＧＭ−ＣＳＦを精製することが可能であ
った。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの蛋白
の代替源を発見できるまでは、このような少量では臨床
的応用には不十分である。しかしながら、もしこれらの
コロニー刺激因子が化学的にまたは生合成的に産生でき
れば、これらの因子を使用することによって生体内の血
液細胞産生を向上し、実験室において輸血用の血液細胞
を産生し、白血病細胞が熟成するのを促進することが可
能になるであろう。これら各々の応用について、血液細
胞の型が制限されるのは避けられない。特に、リンパ球
および／またはそれらの前駆体を産生または活性化する
のを制限することは重要である。従ってマルチ−ＣＳＦ
の様な分子が、血液細胞産生の一般的増大を要するある
種の疾患に応用できると同時に、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−Ｃ
ＳＦおよびＭ−ＣＳＦの様な糖蛋白の用途も、これらの
糖蛋白が一次感染に対抗しまたは破壊された組織を除去
するために必要な細胞の産生のみを刺激するという理由
で特に重要である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】この発明は顆粒球・マク
ロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）または
この因子の単一性または複合性塩基置換、欠失、挿入ま
たは逆転の遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列を提供するも
のである。すなわち、本発明は図２に示す塩基配列を有
するＤＮＡの配列の一部、もしくは前記ＤＮＡの配列に
相補的な配列の一部からなる顆粒球・マクロファージ・
コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする核酸の
探索用プローブであり、このＧＭ−ＣＳＦ探索用プロー
ブを用いて分離されるＤＮＡまたはｃＤＮＡを包含す
る。
【０００６】さらに、本発明はＧＭ−ＣＳＦをコードす
るＤＮＡまたはｃＤＮＡを分離するにあたり、次の
（ａ）〜（ｅ）の各段階を備える方法により行うことを
特徴とし、分離されたＤＮＡまたはｃＤＮＡを包含す
る。
【０００７】（ａ）ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡを含むｍＲ
ＮＡ源を調製する段階と、（ｂ）前記ｍＲＮＡ源の二重
鎖ＤＮＡ複製を合成する段階と、（ｃ）前記ＤＮＡ複製
をクローン化する段階と、（ｄ）上記に記載したＧＭ−
ＣＳＦ探索用プローブを用いたコロニーハイブリダイゼ
イションによって段階（ｂ）のＤＮＡ複製を発現するク
ローンを選択する段階と、（ｅ）上記プローブとハイブ
リダイゼションしたクローンを採取する段階とを備える
ＧＭ−ＣＳＦをコードする分離されたＤＮＡまたはｃＤ
ＮＡ製造法。
【０００８】
【発明の実施の形態】この発明は、特異的血液細胞調節
遺伝子である顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因
子（ＧＭ−ＣＳＦ）を産生するための組換え体ＤＮＡ分
子の産生および特徴づけに関するものである。特にこの
発明は、細菌および動物細胞のような代替宿主中におけ
るＧＭ−ＣＳＦ産生に基礎を与える点で特に重要である
ことを示し得るねずみＧＭ−ＣＳＦの遺伝暗号を指定す
るＤＮＡ分子の製造を包含する。例として、この発明の
ＤＮＡ分子は、ヒトの顆粒球およびマクロファージの産
生に使用するための等価ヒトＧＭ−ＣＳＦに対する遺伝
子配列を単離するプローブとして使用できる。
【０００９】一つの実施形態において、この発明は少な
くともその一部が、ねずみＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性
を示している蛋白まはたポリペプチドの遺伝暗号を指定
することを特徴としたＤＮＡ配列を提供する。この発明
に係る特異的なヌクレオチド配列を第２（ｂ）図に示
す。
【００１０】この発明を実施する上で有用なヌクレオチ
ド配列を宿すクローンは以下に示すクローン化法によっ
て得られる。
【００１１】［ねずみＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡのクロー
ンの単離］最良のＧＭ−ＣＳＦ供給源の一つは、刺激さ
れたはつかねずみの肺である。エンドトキシンで処理し
たはつかねずみ由来の肺のｍＲＮＡに対する１０5 個よ
り大きいｃＤＮＡの相捕的クローンのライブラリーは実
施例Ｉで詳細に述べる。
【００１２】組換え体を含むＧＭ−ＣＳＦは、蛋白の一
部のアミノ酸配列から予測される、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲ
ＮＡ配列の内２つの部分に相捕的な、短い合成オリゴヌ
クレオチドをプローブとして使用するこのライブラリー
で同定された。図１は、残基７と１６の間のＧＭ−ＣＳ
Ｆアミノ酸配列、このペプチドを暗号化することのでき
るヌクレオチド配列の可能な組合せ、およびハイブリダ
イゼイション・プローブとして使用されたオリゴヌクレ
オチドの領域を示している。アミノ酸残基９の指定がは
っきりしない（ヒステジンまたはシステインのいずれ
か）ので、この領域を包含する異なった２組のオリゴヌ
クレオチドが生成される。９の位置にプローブ１はヒス
チジン残基を採り、プローブ２はシステインを採る。ア
ミノ酸配列をその中に伴う第２の領域は、４８の部分か
らなる変性した２組として合成される、極端に変性した
１組のオリゴヌクレオチドを必要とする（プローブ３お
よび４）。
【００１３】ＧＭ−ＣＳＦ組換え体を同定するために、
コロニー・ハイブリダイゼイション・アッセイを行っ
た。寒天平板上でｃＤＮＡクローン群のライブラリーを
単一コロニー群として生育させ、コロニー群の複製を、
ニトロセルロース・フィルターに移植し、そこでコロニ
ーを溶解しプラスミドＤＮＡをその場所で固定する。こ
れらのフィルターを32Ｐで標識した総ての合成オリゴヌ
クレオチド・プローブの混合物でハイブリダイゼイショ
ンすることによってスクリーニングする。
【００１４】ハイブリダイゼイション後フィルターを洗
浄しプローブでハイブリダイズされたコロニー群をオー
トラジオグラフィーで同定する。この方法を用いて、プ
ローブの混合物でハイブリダイズした２２の独立組換え
体を同定する。これらの内のいくつかはオリゴヌクレオ
チドの内の１つと偶然相同である不適当な配列を発現さ
せ得るが、真生のＧＭ−ＣＳＦ配列がプローブ３／４と
１もしくは２の両者とハイブリダイズしなければならな
いので、不適当は配列が独立に２つの異なったプローブ
とハイブリダイズすることは起りそうにない。それで両
方の２２クローン由来のプラスミドＤＮＡを単離し、３
枚のアガロースゲルで電気泳動させた。ＤＮＡをサザン
法（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー９
８巻、５０３頁（１９７５年）によってニトロセルロー
スに移植し、３枚のフィルターを３つの異なったプロー
ブを独立に用いて、ハイブリダイズする。実験した２２
のクローンの内２つ（クローン３７および３８）をプロ
ーブ１と３／４の両方でハイブリダイズし、それからＧ
Ｍ−ＣＳＦのＤＮＡと成るための強力な候補を現した。
【００１５】［クローンの同一性の確認］２つの実験系
はクローン３７および３８が実際にＧＭ−ＣＳＦ遺伝子
配列に関与していることを示している。最初に、クロー
ン群のヌクレオチド配列を決定し、遺伝暗号の指定され
たアミノ酸配列と共に第２（ｂ）図に示した。クローン
のヌクレオチド配列によって予測されるアミノ酸配列は
蛋白を分析して決定したＮ末端アミノ酸配列と実質的に
一致する。ただし、比較した２９の位置の内両者の食い
違いがたった４つだけある。食い違いの内２つは、蛋白
配列に仮に指定されただけの位置に起る。さらに、クロ
ーンのヌクレオチド配列は、ＧＭ−ＣＳＦ蛋白に対して
予期されるのと極めて近い分子量（１３，５００ダルト
ン）をもつペプチドを予告する。
【００１６】二番目に、クローン３８は生物学的に活性
なＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡを特異的に選択できる。クロ
ーン３８のＤＮＡ（および親のプラスミドｐＪＬ３由来
のＤＮＡ）をニトロセルロース上に固定し、細胞をcon
Ａで刺激した後、はつかねずみの肺およびＧＭ−ＣＳＦ
および関連（但し別個の）調節因子ＩＬ３を造るＴセル
ラインからのＲＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダ
イゼイション後、フィルターを洗浄しハイブリダイズさ
れていないＲＮＡを取り除き、その後特異的にハイブリ
ダイズしたＲＮＡを溶出する。このＲＮＡをつめがえる
の卵母細胞に注射し（外来のｍＲＮＡを置換する能力が
よく記録されている）、その培養基のＧＭ−ＣＳＦおよ
びＩＬ３の存在を３−５日後測定する。数回の実験結果
は、（ａ）ベクターＤＮＡはそれ一つではＧＭ−ＣＳＦ
のｍＲＮＡを選択しないし、（ｂ）クローン３８のＤＮ
Ａは肺のＲＮＡからとＬＢ３からの両方から由来のＧＭ
−ＣＳＦを選択し、および（ｃ）クローン３８は特異的
を内部制御するＬＢ３のＲＮＡ由来のＩＬ３のｍＲＮＡ
を選択しないということを示している（実施例IIを参
照）。
【００１７】３番目の実験は、クローン３８を同定する
ための強力で付加的な支持を提供する。ノーザン・プロ
ッティング法でハイブリダイゼイション・プローブとし
て使用されると、クローン３８は、ＧＭ−ＣＳＦを合成
しないリンパ細胞のある骨髄の範囲でなく、con Ａで刺
激されないＬＢ３細胞由来のＲＮＡ中でもなくて、ＧＭ
−ＣＳＦを合成する細胞（はつかねずみの肺およびcon
Ａで刺激したＬＢ３）から由来するＲＮＡ中にある長さ
約１．２kbのｍＲＮＡ種を検出する。従って、ＬＢ３の
場合にはクローン３８に対応するｍＲＮＡがＧＭ−ＣＳ
Ｆ蛋白と共に誘導できる（実施例III 参照）。
【００１８】［この発明を実施するのに有用な株の寄
託］以下に記載する株の生物学的に純粋な培養物の寄託
は、１９８５年２月２１日付でアメリカ合衆国メリーラ
ンド、ロックビル、パークローン・ドライブ １２３０
１番のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
に行った。生存試験後指示された取得番号が与えられ、
必要な料金を支払った。上述の培養の入手は、本特許出
願が係属中、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４および３５
Ｖ．Ｓ．Ｃ．§１２２の下に長官によって決められた方
法で入手可能である。公衆に対する上述の培養の入手の
可能性における全ての制限は本出願の特許後に不可逆的
に取り除かれる。そして、上述の培養は、備え付けの標
本を最も最近に請求してから少なくとも５年間、または
いかなる場合にも寄託の日から少なくとも３０年の終り
まで不変的に入手可能にしてある。もしその培養が生存
不可能になったり不注意にもそこなわれた場合には、同
じ分類学的内容の生存可能な培養（Ｓ）で置き換える。
【００１９】 ［ｐＧＭ３７およびｐＧＭ３８の有用性］なずみＧＭ−
ＣＳＦのクローン化可能な遺伝子情報源を提供すること
に加えて、ここに記載するハイブリッドＤＮＡ分子も、
他の哺乳類のＤＮＡライブラリーから関連遺伝子配列を
検出または分類するためのプローブとして有用である。
関連遺伝子配列を検出する用途では、このプローブは分
析的に検出可能な試薬で適当に標識される。しかしなが
ら、本発明は標識するいかなる特定手段によっても限定
されるべきでない。実施例は、検出のため放射線標識を
使うが、他の検出法は当業者に公知であり簡単に代用し
てもよい。代替系としては、ビオナン・アビジン、蛍光
染料、蛋白、誘導したプローブ分子に対する抗体が使用
されるかまたはＤＮＡ・ＤＮＡハイブリッド自体に対す
る抗体が使われるＥＬＩＳＡのような免疫学的アッセ
イ、およびその中で一本鎖のＤＮＡか酵素の不活性サブ
ユニットで標識され、およびプローブが、ハイブリダイ
ゼイションにおいてサブユニットが再結合し酵素活性が
復活するように第２の不活性サブユニットで標識される
アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではな
い。
【００２０】クローン化した配列は発現ベクター中へサ
ブクローン化されてもよい。遺伝子配列が一部の配列を
欠失しているかもしれない場合にはそのような配列を化
学的に合成し、クローン化した配列と連結して発現ベク
ター中に導入できる。適切な発現ベクターの選択は、こ
の分野の技術者の技術の範囲内にある。最小限として、
この発現ベクターが形質転換される宿主内で作用するプ
ロモータ・フラグメントと適当なエンドヌクレアーゼ開
裂部位をＧＭ−ＣＳＦの遺伝暗号を指定する遺伝子配列
が結合できるように含んでいる。
【００２１】
【実施例】
［実施例Ｉ］この実施例は、この発明を実施するのに有
益なＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡクローン群の単離を示す。
【００２２】［はつかねずみの肺のｍＲＮＡの単離］Ｃ
５７ ＢＬ／６はつかねずみ９０匹に細菌性内毒素（５
μｇ／一匹）を注射する。３時間後、肺を摘出し、血清
非含有ダルベック改良イーグル培地（セリダン・ジェ
イ．およびディ．メカルフ著、ジャーナル・オブ・セル
ラル・フィジオロジー ８１巻、１１−２４頁（１９７
３年））中で試験官内でインキュベイトする。０．５お
よび１５時間後、一群３０組の肺を６０秒間、１モル
トリス（ｐＨ７．５）、１モル ＮａＣｌ、１モルＥＤ
ＴＡ、０．５％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌプロティナー
ゼ Ｋを含む１５０ｍｌ溶液中でホモジナイズする。３
７℃で１時間インキュベイトした後、ホモジナイズ液を
７モル 尿素、０．３５モル ＮａＣｌ、１０ミリモル
ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳよび１０ミリモル トリス−Ｃｌ
（ｐＨ７．４）を含む同量溶液と混合し、その後フェノ
ール／クロロフォルム／イソアミルアルコールで抽出す
る。エタノールを加えて水相からＲＮＡを沈降させる。
２段階のオリゴ−ｄＴセルロース・クロマトグラフィに
よって全ＲＮＡからポリＡ+ のＲＮＡを選択する。別に
３回試験官中で培養して産生したＲＮＡを保存する。
【００２３】［ｃＤＮＡクローン群の合成および構造］
標準の技術［エブストラティダス、エイ等著、セル ７
巻、２７９−２８８頁（１９７６年）およびマニアティ
ス、ティ等著、「モレキュラル・クローニング」（コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボ刊、ニューヨーク
（１９８２年））］を用い、第一鎖を合成するためのに
わとり骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素および第二鎖を合
成するためのエッシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（クレノー・フラグメント）を用いて、保存した肺の
ｍＲＮＡの二重鎖コピーを合成する。Ｓ1 ヌクレアーゼ
でヘアピンループを開裂した後、ターミナルジオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼ（ミッチェルソン、エ
イ．エムおよびエヌ．オーキン・ジェイ．著、バイオロ
ジカル・ケミストリー ２５７巻、１４７７３−１４７
８２頁（１９８２年））を用いて、オリゴ（ｄＣ）末端
を付加する。連結したｃＤＮＡを１．５％アガロース上
で電気泳動して分画し、長さが５００塩基以上の長い分
子を採取し、ｄＧ連結ＤＮＡプラスミドにアニール化す
る。用いたプラスミド（ｐＪＬ３）は、β−ラクタマー
ゼ遺伝子、ｐＡＴ１５３由来のＤＮＡ複製の起点、ＤＮ
Ａ複製およびＴ抗原暗号を指定する配列ＳＶ４０起点お
よびＳＶ４０の後期プロモータに隣接する複合クローニ
ング部位を含むＳＶ４０に基づく発現ベクターである
（図３参照）。ＤＮＡベクター１μｇ当り１０8 転換体
を得るかなり効果的な形質転換によってエッシェリヒア
・コリ（E.coli）ＭＣ１０６１（カサダボン、エムおよ
びエス．コーエン著、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー １３８巻、１７９−２０７頁（１９８
０年））をアニール化ｃＤＮＡプラスミド混合物で形質
転換する。約２，０００−３，０００のアンピシリン耐
性クローンを包含する４６の独立プールを−７０℃で１
０％グリセロール中に保存する。
【００２４】［ｃＤＮＡクローンのスクリーニング］コ
ロニー・ハイブリダイゼイションによってスクリーニン
グするため、各プールから約４，０００子の細菌コロニ
ーを寒天平板（４０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）上
に形成し、これをニトロセルロースフィルターディスク
に移し、プラスミドＤＮＡを２００μｇ／ｍｌ クロラ
ムフェニコール（ハナハン、ディ．およびエム．メセル
ソン著、ジーン １０巻、６３−６７頁（１９８０
年））を含む寒天平板上でフィルターをインキュベイト
して増殖する。元の平板でコロニーを再生した後、第２
のニトロセルロースフィルターを造る。マスタープレー
トを２回再生した後、４℃で保存する。プラスミドＤＮ
Ａを細菌コロニーから溶離し、ニトロセルロースフィル
ターに固定する（ニコラ・エヌ．およびディ．メカルフ
著、ジャーナル・オブ・セルラル・フィジオロジー １
１２巻、２５７−２６４頁（１９８２年））。ハイブリ
ダイゼイションする前に、そのフィルターを数時間、３
７℃で、６×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５モルＮａＣｌ、
０．０１５モルクエン酸ナトリウム）、０．２％フィコ
ール、０．２％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および
変性さけ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）と変性エッシェ
リヒア・コリＤＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）を含む０．２％
うし血清アルブミン（ＢＳＡ）中でインキュベイトす
る。０．１％ＮＰ４０を含む上記と同様の溶液で、３７
℃で約１８時間ハイブリダイゼンションする。［γ−32
Ｐ］ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いて、
上記合成オリゴヌクレオチドプローブを放射性標識す
る。各々は１．５ｎｍ／ｍｌでハイブリダイゼイション
反応物中に存在する。ハイブリダイゼイション後、フィ
ルターを６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用い４２℃
で隅々まで洗浄しオートラジオグラフに付す。複製フィ
ルター上の完全なコロニーを取り、前と同様にして密度
を下げて再スクリーニングする。
【００２５】１００，０００以下のｃＤＮＡクローンを
スクリーニングし、２２の陽性物を得、そのうち２つ
（ｐＧＭ３７およびｐＧＭ３８）をプローブ１およびプ
ローブ３＋４と別々にハイブリダイズし、したがってＧ
Ｍ−ＣＳＦ暗号化配列を含むための有力候補となった。
【００２６】［実施例II］この実施例はＧＭ−ＣＳＦの
合成を指令する力のあるｍＲＮＡを選択するｐＧＭ３８
の能力を立証する。
【００２７】［ＧＭ−ＣＳＦの検定］ＧＭ−ＣＳＦ ｍ
ＲＮＡをつめがえる卵母細胞中で同定し、この培養基が
３種のミクロ培養系、（１）４種全てのコロニー・刺激
因子に直接応答する精製胎児肝臓造血前駆細胞を含む液
体培地（ブルゲス、エイ．ダブル．等著、ブラッド６０
巻、１２１９−２３頁（１９８２年））、（２）４種全
ての刺激因子によって刺激されうる形態学的に同一とみ
なし得る顆粒球、マクロファージ・コロニーを形成する
骨髄細胞を含むミクロ寒天培地および（３）複合ＣＳＦ
に応答しＧＭ−ＣＳＦには応答しない因子従属マストセ
ルライン３２Ｄ Ｃ１３を含む液体培地での顆粒球／マ
クロファージ増殖を刺激する能力を検定する。この組の
検定から見て、ＣＭ−ＣＳＦおよび複合ＣＳＦは疑いな
しに識別できる。
【００２８】［種々の細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ ｍＲ
ＮＡの検出］初めに、種々の細胞型においてｐＧＭ３８
に関連する転写の発生量がＧＭ−ＣＳＦを合成するそれ
らの細胞の能力と平行して表れるかどうかを決める。は
つかねずみの肺（ＧＭ−ＣＳＦを合成する）からとＧＭ
−ＣＳＦを生成しない種々の細胞から由来するメッセン
ジャーＲＮＡ ｍＲＮＡをホルムアルデヒド寒天ゲル上
で分画し、ニトロセルロースに移し、上に詳説したｐＧ
Ｍ３８から誘導したプローブでハイブリダイゼイション
する。図４はこのプローブが、はつかねずみの肺由来の
ｍＲＮＡ上に約１．２キロ塩基（kb）という低い発生量
を検出したことを示している（レーン３）が、ＧＭ−Ｃ
ＳＤを合成しない任意に選択した数種の細胞系由来のｍ
ＲＮＡには胸腺腫由来の細胞系であるティカウト（ＴＩ
ＫＡＵＴ）（レーン１）およびプラズマ細胞腫（レーン
２）では検出しないことを示している。さらにこのプロ
ーブを行なって、複合ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＭ−Ｃ
ＳＦをそれぞれ合成するＷＥＨ１−３Ｂ Ｄ- （レ−ン
６）、ＲＩＩＩ（レーン７）およびＬ細胞（レーン８）
由来のｍＲＮＡに転写していることを検出しなかった。
肺のｍＲＮＡにｐＧＭ３８に関連する転写の発生がかな
り低いのは意外なもので、肺のｃＤＮＡライブラリーの
ｐＧＭ３８関連ｃＤＮＡクローンでまれにしか見られな
いものである（５０，０００中１以内）。
【００２９】ｐＧＭ８３に対して相捕的な転写がＧＭ−
ＣＳＦ産生に関連しているかどうかについてのさらに重
要な試験として、ＧＭ−ＣＳＦおよび複合ＣＳＦの両方
の合成がコンカナバリンＡによってその中で誘発される
クローン化したＴリンパ球セルライン（ＬＢ３）を用い
た。図４は、ｐＧＭ３８追跡プローブはコンカナバリン
Ａで刺激されたＬＢ３細胞中に豊富にｍＲＮＡを検出す
る（レーン５）が非刺激のＬＢ３細胞由来のｍＲＮＡで
は転写を検出しないことを示している（レーン４）。用
いたプローブが、ＷＥＨ１−３Ｂ Ｄ-1中の複合ＣＳＦ
ｍＲＮＡにハイブリダイゼイションしていないので、
このことはｐＧＭ３８がＬＢ３細胞中ＧＭ−ＣＳＦ ｍ
ＲＮＡにハイブリダイゼイションしたことのいっそうの
証拠になる。
【００３０】種々の細胞中のＧＭ−ＣＳＦ ｍＲＮＡの
検出は以下のように行なわれる。ＴＩＫＡＵＴ（レーン
１）、Ｐ３（レーン２）、はつかねずみの肺（レーン
３）、非刺激ＬＢ３（レーン４）、コンカナバリンＡ刺
激ＬＢ３（レーン５）、ＷＥＨ１３Ｂ Ｄ-1（レーン
６）、ＲＩＩＩ（レーン７）およびＬ細胞（レーン８）
由来のポリ（Ａ）５μｇをそれぞれ１％ホルムアルデヒ
ド／寒天ゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースに移
し、ニック・トランスレーション（nick-translation）
法（リグビ−、ピ−．ダブル．ジェイ．等著、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー １１３巻、２
３７−２５１頁（１９７７年））によって、32Ｐ標識さ
れたｐＧＭ３８の完全挿入をスパンするＤＮＡフラグメ
ントと、ハイブリダイゼイションする。６５℃で１６時
間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２％フィコー
ル、０．２％ＰＶＰおよび変性さけ精子のＤＮＡ５０μ
ｇ／ｍｌを含む０．２％ＢＳＡ中でハイブリダイゼイシ
ョンする。ＬＢ３（以前はＢ３）は、白血球培養を混合
したＢＡＬＢ／Ｃ抗ＤＢＡ／２から誘導し、インターロ
イキン−２の存在下で被照射ＤＢＡ／２脾臓細胞（１５
００Ｒ）と一週間継代で維持されたクローン化Ｔhy−１
+ 、Ｌyt−２- 、ＭＴ4 + ＋リンパ球である。コンカナ
バリンＡ刺激ＬＢ３細胞は、５％子うし胎児の血清を含
んだ組織培養基中で、５時間、コンカナバリンＡ５μｇ
／ｍｌと共に、１ｍｌ中に１０6 の割で細胞を培養する
ことによって産生する。分子量マーカーを用いると、推
定分子量は、哺乳類２８および１８５のｒＲＮＡは、４
７００および１８００ヌクレオチド、エッシェリヒア・
コリ２３および１６ＳのｒＲＮＡは、２９０４および１
５４１ヌクレオチドである。長時間オートラジオグラフ
ィにかけた後では、残りの２８ＳｒＲＮＡに低水準のハ
イブリダイゼイションしているのが明らかである（トラ
ック１−３）。
【００３１】［ＧＭ−ＣＳＦ ｍＲＮＡのハイブリッド
選択およびつめがえるの卵母細胞中への移殖］ハイブリ
ッド選択は、基本的にミラー、ジェイ．エス．等著、
（メソッド・オブ・エンチモロジー １０１巻、６５０
−６７４頁（１９８３年））に記載のように形成され
た。ｐＧＭ３８またはベクター（ｐＪＬ３）ＤＮＡ（５
−μｇ部分標本）をニトロセルロースの小さな四角い片
上に付けて、コンカナバリンＡ刺激ＬＢ３（５０％ホル
ムアミド中）のｍＲＮＡの一部１−２μｇ、０．５モル
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．７５モルＮａＣ
ｌ、０．００２モルＥＤＴＡ、０．４％ＳＤＳおよび１
０μｇ／ｍｌエッシャリヒア・コリのｔＲＮＡと共に、
反応容量３０μｌ、３７℃で１６時間培養する。培養
後、瀘紙をハイブリダイゼイション用緩衝液中、３７℃
で念入りに洗浄し、その後５２℃で１０ミリモルトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および２ミリモルＥＤＴＡを用
いて洗浄する。結合したＲＮＡをエッシェリヒア・コリ
のｔＲＮＡ１．５μｇを含む１０ミリモルトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）および２ミリモルＥＤＴＡ３００μｌ
中で１分間煮沸して溶出する。酢酸ナトリウムおよびエ
タノールを加えてＲＮＡを沈降させ、１６時間、−２０
℃で冷やす。遠心分離後、沈降したＲＮＡを冷７０％エ
タノールで洗浄し、乾燥後、１ミリモルトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）および０．１ミリモルＥＤＴＡ １．５
μｌに溶かす。各々のＲＮＡ標品に対して、つめがえる
卵母細胞３０個ごとの集団に一卵当りＲＮＡ５０ｎｌの
割合で注射する。非分画ＬＢ３のｍＲＮＡは一投与につ
き１μｇ／ｍｌであり、一卵当り５０ｎｌ注射した。注
射した卵母細胞を４日間培養した後、卵母細胞培養基を
５％子うし胎児の血清を含む培養基で１：２に希釈し、
瀘過し、５μｌ容量を、１４日ＣＢＡ胎仔肝臓前駆細胞
分画蛍光活性化細胞ソーター２００を含む１５μｌ培養
中で系列希釈して２００・３２ＤＣ１３細胞についてア
ッセイした。図５の各点はインキュベーション２日後の
２培養からの平均細胞カウントを示す。
【００３２】初めに、ｐＧＭ３８のＤＮＡがはつかねず
みの肺のＲＮＡからＧＭ−ＣＳＦｍＲＮＡを選択できる
かどうかを決定するために試験した。非分画の肺のｍＲ
ＮＡまたはｐＧＭ３８のＤＮＡとハイブリダイズして選
別したｍＲＮＡをつめがえるの卵母細胞の中に注射する
と、きわめて低いレベルのＣＳＦ活性が培養基中に検出
されるが、この知見は、はつかねずみの肺にあるｐＧＭ
３８に対応しているｍＲＮＡが極めて少ないことから予
測されたものである（図４）。対照的に、コンカナバリ
ンＡで刺激したＬＢ３細胞群（ＧＭ−ＣＳＦおよび複合
ＣＳＦの両方を合成する）由来のｍＲＮＡはｐＧＭ３８
に対応するｍＲＮＡに富んでおり（図４）、つめがえる
の卵母細胞の中に注射したとき、胎児肝臓および３２Ｄ
Ｃ１３細胞の増殖を刺激する物質で高濃度に精製する
よう再指示する（図５）。それで、ｐＧＭ３８またはベ
クターＤＮＡ群のいずれかを含んだ３枚の瀘紙を上述と
同様のハイブリッド選択実験によって、コンカナバリン
Ａ刺激ＬＢ３のｍＲＮＡを作用させた。図５は、ｐＧＭ
３８のＤＮＡによって選択したｍＲＮＡを用いて注射し
た卵母細胞由来の培養基が胎児前駆細胞の増殖を強力に
刺激し、成熟途中の顆粒球とマクロファージの成長を刺
激したこと（図６）を示している。これらのつめがえる
調製培養基も微量寒天培養（１８％顆粒球、５３％顆粒
球・マクロファージ混合物および２９％マクロファージ
のコロニー）で典型的な顆粒球・マクロファージ・コロ
ニー形成を刺激する。他のどんな検出においても、これ
らの卵母細胞調製培養基が赤血球細胞、巨大核細胞また
は好酸性細胞の増殖を刺激し、したがって活性因子が複
合ＣＳＦではなくＧＭ−ＣＳＦであるという証拠はなか
った。この結論の確認として、これらの卵母細胞調製培
養基が３２Ｄ Ｃ１３細胞の増殖を刺激することができ
ないということが分かった。ベクターＤＮＡだけではＧ
Ｍ−ＣＳＦまたは複合ＣＳＦに対応するｍＲＮＡを選択
しない（図５のａ，ｂ）。
【００３３】以上のことを合せると、これらのデータ
は、ｐＧＭ３８が、ＧＭ−ＣＳＦおよび複合ＣＳＦのｍ
ＲＮＡ群をどちらも含む混合物からＧＭ−ＣＳＦの独特
の生物学的特徴を持つ因子の暗号配列を指令するｍＲＮ
Ａを特異的に選択できることを示している。
【００３４】［実施例III]この実施例はＧＭ−ＣＳＦ遺
伝子のヌクレオチド配列を提供する。
【００３５】ｐＧＭ３７およびｐＧＭ３８のｃＤＮＡ部
についてのヌクレオチド配列分析は、同じｍＲＮＡの重
複部分に相捕的な配列を含んでいるこれら２つのクロー
ンが推定ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ配列を有していること
を示している。この２つのクローンのｃＤＮＡ部とｍＲ
ＮＡの関係を図２（ａ）に示す。図２（ｂ）に与えられ
たヌクレオチド配列は両方のクローンから誘導した複合
物である。ｍＲＮＡのポリ（Ａ）末端に対応しており、
ヘキサヌクレオチドＡＡＴＡＡ（ほとんどの真核生物の
ｍＲＮＡの３’末端の近くで見られる）より前に置かれ
る２０アデノシン残基の区間がｐＧＭ３８の一方の末端
に現れる。これはｃＤＮＡクローンの配列とｍＲＮＡの
配列の配向を可能にする。図２（ｂ）に表した配列は一
本の３５４ヌクレオチドの長いオープン・リーディング
・フレームを含む。そしてこの領域によって予告された
アミノ酸配列は成熟蛋白の最初の残基から発現し、ヌク
レオチド配列の上方に示す。残基２から２９まではアミ
ノ酸配列が、ｃＤＮＡによって予告された上記配列を示
すＧＭ−ＣＳＦに対する部分的なＮＨ2 末端アミノ酸配
列と一致する（ただし４つの残基については一致しな
い。）４つの食い違いのうち２つの残基（２０および２
４）は蛋白の配列においてただ仮に指定されただけであ
る。蛋白配列内で位置を決定できない成熟ペプチド上の
最初の残基は、ヌクレオチド配列によってイソロイシン
と予測される。ヌクレオチド配列から導き出された一次
構造の蛋白は、分子量１３，５００、エンドグリコシダ
ーゼＦで広範囲に脱グリコシル化したＧＭ−ＣＳＦの見
かけの分子量１６，８００とよく一致する。予告された
アミノ酸配列の内で起るＮ−グリコシル化の２つの強い
部位（Ａsn−Ｘ−Ｔhr）を図２（ｂ）に星印で示す。
【００３６】ｐＧＭ３７は図２（ｂ）に示される最初の
位置まで２０のヌクレオチド５’を伸ばすが、開始コド
ンを含まない。このコドンは数種の疎水性アミノ酸をこ
の範囲内に含み（図示しない）、分泌された蛋白のシグ
ナル・ペプチドの特徴を示さない。ＧＭ−ＣＳＦのｍＲ
ＮＡの大きさは１，２００ヌクレオチド以内であり（図
４）、その内の１５０ヌクレオチド以内のものはたぶん
ポリ（Ａ）末端の寄与による。３’非移殖領域は３１９
ヌクレオチドで成熟蛋白の暗号を指令する領域は３５４
ヌクレオチドである（図２（ｂ））。それで約３５０の
ヌクレオチドが、推定されるＮＨ2 - 末端シグナル・ペ
プチドのために５’側の翻訳されない領域を残した。
【００３７】２つのｃＤＮＡクローン（位置、２３４，
３４６および５０７）から導びかれたヌクレオチド配列
には３箇所食い違うところがある。その内の１つ（位置
３４６）はアミノ酸配列のあいまいさによるものであ
る（１１６番目のアミノ酸残基にＧlyまたはＳer）。ｃ
ＤＮＡクローンが単離されたはつかねずみ（Ｃ５７ＢＬ
／６）は高度に同系交配しているのでそのためＧＭ−Ｃ
ＳＦの座ではホモ接合になるはずである。また、はつか
ねずみの生殖細胞系上のＧＭ−ＣＳＦの暗号を指令する
のは唯一の遺伝子であるらしいので、これら３つの配列
の食い違いはｃＤＮＡ合成の間に造られた人為構造を反
映しているようだ。そして実際には逆転写は６００ヌク
レオチド中に約１個の合成ポリヌクレオチド誤謬頻度で
ある。
【００３８】図２に現わした配列を決定するのには標準
の方法を使用した。簡単に述べると、Ｍ１３ベクター中
でサブクローン化したＤＮＡフラグメントをジデオキサ
・ヌクレオシドトリスフォスフェイトを使用するチェー
ン・ターミネイション法によって配列した（サンガー、
エフ．等著、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（アメリカ）７４巻、５４
６３−６７頁（１９７７年））。配列した反応物は、厚
さ０．２ｍｍにした８％（重量比）ポリアクリルアミド
ゲル上で温度を調節して電気泳動にかける。図２に関し
て上で述べたようにｍＲＮＡに同調する鎖のストランド
は上で得たＧＭ−ＣＳＦの予測されるアミノ酸配列をも
ち、５’から３’まで列挙される。列の一番終りにある
数は、その列での最終残基（アミノ酸またはヌクレオチ
ド）の位置を示す。ＧＭ−ＣＳＦを決定する部分的なア
ミノ酸配列はクローンから導いた配列の上に示してあ
る。二者の間に食い違いのない位置には「棒線」を付け
た。蛋白分析によって決定した最初のアミノ最初残基は
同定できず疑問符で示す。強いＮ−グリコシル化部位は
星印で示し、推定されるポリアデニル化シグナルは下線
で示してある。
【００３９】［実施例IV］この実施例はＧＭ−ＣＳＦが
１個の特定の遺伝子によって暗号を指定されることを示
す。
【００４０】種々のはつかねずみの器官から単離したＧ
Ｍ−ＣＳＦの多分子形態が知られているので、どれだけ
の数の遺伝子を成熟ゲノム中でＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ
が検出できるかを試験した。種々の制限エンドヌクレア
ーゼによって消化されたＢＡＬＢ／ｃの胚またはＣ５７
ＢＬ／６の肝のＤＮＡをアガロースゲルで分画し、ニト
ロセルロースに移してから、ｐＧＭ３８に完全ｃＤＮＡ
挿入を含んだフラグメントとハイブリダイズする。両方
のはつかねずみの系統には、単一ＥcoＲＩフラグメント
（図７、第１および第２レーン）、単一ＰstＩフラグメ
ント（第３および第４レーン）および単一ＢamＨＩフラ
グメント（図示しない）が検出される。ＰstＩフラグメ
ントは、僅か２．５kbの長さしかないので、このフラグ
メントは一つより多い遺伝子に適応しそうにない。それ
で、２個（またはそれ以上）の遺伝子を、同位置のＥco
ＲＩ、ＰstＩおよびＢamＨＩ制限部位で囲まれていると
いう可能性は低いから除いて、はつかねずみの生殖系に
おいて肺型のＧＭ−ＣＳＦを暗号化しているのは唯一の
遺伝子であると結論する。
【００４１】図７は、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子が胚のＤＮＡ
中と同様のコンカナバリンＡ刺激ＬＢ３細胞（レーン
６）由来のＤＮＡ中にも同じＥcoＲＩフラグメント中に
含まれていることを示している。ＬＢ３ＤＮＡ中に別の
バンドはなく、胚ＤＮＡと異なるハイブリダイゼイショ
ン強度もないので、大量のＧＭ−ＣＳＦを合成する細胞
中のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子脈中におけるコピー数変化また
は総体的変化はないと推論される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＧＭ−ＣＳＦクローンを同定するために
用いた合成オリゴヌクレオチドを示している。ねずみＧ
Ｍ−ＣＳＦ（残基７〜１６）のアミノ酸配列の一部が一
番上の段に、このペプチド断片の遺伝暗号を指定できる
ヌクレオチド（ｍＲＮＡ）配列の可能な組合せを中央
に、ｍＲＮＡの涼気に対して相捕的なオリゴヌクレオチ
ドプローブの４つの異なる組を下に示す。
【図２】図２（ａ）は、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの、お
よびｐＧＭ３７とｐＧＭ３８のクローンの、遺伝子地図
である。このｍＲＮＡは鎖長１２００ヌクレオチドにな
る。成熟蛋白を暗号指令するｍＲＮＡの領域を太い線で
示す。非翻訳領域はＵＴで表し、推定される前駆体ペプ
チドはＰで表す。ｐＧＭ３７クローンおよびｐＧＭ３８
クローンを中に含む領域を棒線で示す。ｐＧＭ３８は図
２（ｂ）に表示された配列のヌクレオチド１４からポリ
Ａ末端まで延びており、一方ｐＧＭ３７はヌクレオチド
配列５’から位置５７４に表示された配列まで延びてい
る。図２（ｂ）は、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡのヌクレオ
チド配列およびＧＭ−ＣＳＦの内包されたアミノ酸配列
を示している。示されたヌクレオチド配列はｐＧＭ３７
およびｐＧＭ３８のクローンから由来する複合配列であ
る。そして、ｐＧＭ３７のヌクレオチド配列がｐＧＭ３
８のヌクレオチド配列およびｐＧＭ３７オルターナテイ
ブと異なる３点が線の下に与えられている。ｍＲＮＡ−
同義ストランドは上で与えられたＧＭ−ＣＳＦアミノ酸
配列ともに５’から３’にリストされている。列の終端
にある数字は、その列の最終残基（アミノ酸またはヌク
レオチド）の位置を示す。ＧＭ−ＣＳＦについて決定し
た部分のアミノ酸配列はクローン由来の配列上に示され
る。また、二者の間に一致しない所がない位置にダッシ
ュを付す。蛋白分析による最初のアミノ酸残基は同定で
きず、疑問符で示す。
【図３】図３は、ｐＪＬ３ベクターの地図を示してい
る。ＳＶ−４０由来の部分を斜線部分で示し、ｐＡＴ１
５３プラスミド由来の部分を白抜き部分で示す。複合ク
ローン化部位を上部に表示する。表わされた数字は親の
ＳＶ４０またはｐＡＴ１５３の配列を示している。
【図４】図４は、ｐＧＭ由来の32Ｐで標識したＤＮＡを
用いてハイブリダイゼイションさせた種々の細胞中のＧ
Ｍ−ＣＳＦのｍＲＮＡの検出を表示している。
【図５】図５は、胎児の肝臓の造血前駆細胞（上のプレ
ート）および複合−ＣＳＦ依存性３２Ｄ Ｃ１２細胞
（下のプレート）の培養懸濁液での細胞の増殖を、ｍＲ
ＮＡを注射したつめがえるの卵母細胞の培養基を用いて
刺激したものを表示する。非分画ＬＢ３のｍＲＮＡは太
線で示され、ｐＧＭ３８のＤＮＡにハイブリダイゼイシ
ョンして選択したｍＲＮＡは○−○で示され、ベクター
ＤＮＡのみによって選択したものは○−○で示される。
３つの異なる曲線は、３つの実験を現わしている。
【図６】図６は、ＬＢ３細胞由来のｐＧＭ３８選択ｍＲ
ＮＡで注射した卵母細胞から得た培養基で刺激後の精製
胎児肝臓造血前駆細胞の４日培養懸濁液の写真である。
分裂活性および成熟中の顆粒球とマクロファージの産生
が注目される。
【図７】図７は、ｐＧＭ３８由来の32Ｐ標識ＤＮＡでハ
イブリダイゼイションしたＥcoＲＩまたはＰstＩ消化Ｄ
ＮＡ由来のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を検出したものを表示す
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 グー・ニコラス・マーチン オーストラリア国・ビクトリア・ノース・ バルウィン・レインジ・ビュー・グロー ブ・20番 (72)発明者 メトカーフ・ドナルド オーストラリア国・ビクトリア・バルウィ ン・ユニオン・ロード・268番

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の塩基配列、ＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡ
    ＣＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＧＴＡＧＡＧＧＣ
    ＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＣＴＧ
    ＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＧＴＴＧＡＡＴＧ
    ＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＧＴＣＴＣＴＡＡＣＧＡ
    ＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＣＡＴＧＴ
    ＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧ
    ＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＧＧＣＡＡＴＴＴＣＡＣ
    ＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧ
    ＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＣＴ
    ＧＣ（Ｔ）ＣＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＣＧＧＡ
    ＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣＴＡＴ
    ＧＣＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣＡＧＣＣＴＴＡＡＡＡ
    ＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡ
    ＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡ（Ｇ）ＧＣＣＡＡＡＡＡ
    ＴＧＡ（ただし上記配列中（）内の塩基は前の塩基と置
    換可能であることを示す）、または、ＡＴＡＡＴＴＧＴ
    ＴＡＣＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＧＴＡＧＡＧ
    ＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＣ
    ＴＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＧＴＴＧＡＡ
    ＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＧＴＣＴＣＴＡＡＣ
    ＧＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＣＡＴ
    ＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴ
    ＣＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＧＧＣＡＡＴＴＴＣ
    ＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡ
    ＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡ
    ＣＴＧＣ（Ｔ）ＣＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＣＧ
    ＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣＴ
    ＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣＡＧＣＣＴＴＡＡ
    ＡＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＡＴＣＣＣＣＴＴＴ
    ＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡ（Ｇ）ＧＣＣＡＡＡ
    ＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧ
    ＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＴ
    ＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣＧＴＡＡＴＧＡＧＣＣＡＡＧＡＡ
    ＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＡＣ
    ＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＴ
    ＧＧＡＡＧＧＣＡＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＡＡＡ
    ＣＧＣＴＡ（Ｇ）ＡＣＴＣＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＧＣＧ
    ＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＧＡＧＡＧＡＴＡＴＴＴＴＣＴＡ
    ＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＣＡＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴ
    ＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＡ
    ＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＣＡＡ
    ＣＴＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡＧＡＡＴＧＴＣＴＴＡＣＣ
    ＡＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＣＴＴＴＡ
    ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（ただし上記
    配列中（）内の塩基は前の塩基と置換可能であることを
    示す）、の一部の塩基配列からなる顆粒球・マクロファ
    ージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする
    核酸の探索用プローブ。
  2. 【請求項２】 以下の塩基配列、ＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡ
    ＣＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＧＴＡＧＡＧＧＣ
    ＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＣＴＧ
    ＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＧＴＴＧＡＡＴＧ
    ＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＧＴＣＴＣＴＡＡＣＧＡ
    ＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＣＡＴＧＴ
    ＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧ
    ＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＧＧＣＡＡＴＴＴＣＡＣ
    ＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧ
    ＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＣＴ
    ＧＣ（Ｔ）ＣＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＣＧＧＡ
    ＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣＴＡＴ
    ＧＣＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣＡＧＣＣＴＴＡＡＡＡ
    ＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡ
    ＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡ（Ｇ）ＧＣＣＡＡＡＡＡ
    ＴＧＡ（ただし上記配列中（）内の塩基は前の塩基と置
    換可能であることを示す）、または、ＡＴＡＡＴＴＧＴ
    ＴＡＣＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＧＴＡＧＡＧ
    ＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＣ
    ＴＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＣＡＣＧＴＴＧＡＡ
    ＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＧＴＣＴＣＴＡＡＣ
    ＧＡＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＴＡＡＣＡＴ
    ＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴ
    ＣＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＧＧＣＡＡＴＴＴＣ
    ＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡ
    ＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡ
    ＣＴＧＣ（Ｔ）ＣＣＣＣＣＡＡＣＴＣＣＧＧＡＡＡＣＧ
    ＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣＴ
    ＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＡＣＡＧＣＣＴＴＡＡ
    ＡＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＡＴＣＣＣＣＴＴＴ
    ＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡ（Ｇ）ＧＣＣＡＡＡ
    ＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧ
    ＡＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＴ
    ＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣＧＴＡＡＴＧＡＧＣＣＡＡＧＡＡ
    ＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＡＣ
    ＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＴ
    ＧＧＡＡＧＧＣＡＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＡＡＡ
    ＣＧＣＴＡ（Ｇ）ＡＣＴＣＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＧＣＧ
    ＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＧＡＧＡＧＡＴＡＴＴＴＴＣＴＡ
    ＣＴＧＡＴＡＧＧＧＡＣＣＡＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴ
    ＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＡ
    ＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＣＡＡ
    ＣＴＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡＧＡＡＴＧＴＣＴＴＡＣＣ
    ＡＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＣＴＴＴＡ
    ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（ただし上記
    配列中（）内の塩基は前の塩基と置換可能であることを
    示す）、に対して相補的な塩基配列の一部の塩基配列か
    らなるＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸の探索用プロー
    ブ。
  3. 【請求項３】 前記一部の塩基配列の塩基数が２５〜２
    ５０である請求項１または請求項２に記載のＧＭ−ＣＳ
    Ｆをコードする核酸の探索用プローブ。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載のＧＭ−
    ＣＳＦ探索用プローブを用いて分離されるＤＮＡまたは
    ｃＤＮＡ。
  5. 【請求項５】 （ａ）ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡを含むｍ
    ＲＮＡ源を調製する段階と、 （ｂ）前記ｍＲＮＡ源の二重鎖ＤＮＡ複製を合成する段
    階と、 （ｃ）前記ＤＮＡ複製をクローン化する段階と、 （ｄ）請求項１〜３のいずれかに記載のＧＭ−ＣＳＦ探
    索用プローブを用いたコロニーハイブリダイゼイション
    によって段階（ｂ）のＤＮＡ複製を発現するクローンを
    選択する段階と、 （ｅ）上記プローブとハイブリダイゼションしたクロー
    ンを採取する段階とを備える製造法によって調製され
    る、ＧＭ−ＣＳＦをコードする分離されたＤＮＡまたは
    ｃＤＮＡ。
JP9325042A 1984-03-21 1997-11-26 ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸の探索用プローブおよびこのプローブを用いて分離されるＤＮＡまたはｃＤＮＡ。 Pending JPH10165190A (ja)

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