JPH0573389B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（発明の目的） 本発明の目的は、遺伝子工学的手法により、医
薬等に有用な物質を生産する方法を提供すること
にあり、特に従来に比して効率良く物質を生産す
る方法を提供することにあり、また、ウイルス
DNAを利用してin vitro的にまたは生物体内に
おいて物質を生産する方法を提供することにあ
り、更にはカイコ生体内において核多角体病ウイ
ルスを利用して種々の有用物質を効率よく生産す
る方法を提供することにある。また、本発明は、
これらの方法に有用なベクター、組換ウイルス
DNAおよびそれらの製造法を提供することにあ
る。また、本発明は、これらの方法に有用なベク
ター、組換ウイルスDNAおよびそれらの製造法
を提供することも目的とする。 （従来技術） 遺伝子組換技術によりプラスミド等を利用して
大腸菌、枯草菌、酵母等で有用物質を生産する方
法が多数報告されている。また、ウイルスDNA
の一種（Autograapha california nuclear
polyhedrosis virus DNA）を利用してその構造
遺伝子を置換して培養細胞中（Spodoptera
frugiperdaの樹立培養細胞中）においてβ−イン
ターフエロンおよびβ−ガラクトシデースを生産
させる試みも報告された（Molecular and
Celluar Biology３(12)2156〜2165（1983）、４(3)
399〜406（1984）。しかし、この方法は野外に生息
する害虫であるA.Californicaを利用する点で問
題があり、有用物質の製造法として満足できるも
のではない。本発明者らは、さらに優れた有用物
質の生産方法を提供すべく研究の結果本発明を完
成した。 （発明の構成） 本発明は、カイコ核多角体病ウイルス
（Bombyx Nuclear Polyhedrosis Virus、以下
BmNPVと略す）のDNAを利用して蛋白または
糖蛋白等の有用物質を遺伝子工学的に生産する方
法に関し、BmNPV DNAのプロモーター領域の
機能を活用して有用物質を効率よく生産する方法
に関し、BmNPV DNAを有用物質生産用遺伝子
で組換（リコンビネーシヨン）した組換DNAに
関し、その組換に有用な組換ベクターに関する。
また本発明は、BmNPV DNAの多角体蛋白構造
遺伝子のプロモーター領域を含む5′上流DNA断
片、翻訳開始コドン及び有用物質生産用遺伝子を
有し、更にBmNPV DNAの多角体蛋白構造遺伝
子の3′下流DNA断片を含む又は含まない転移用
組換ベクターとBmNPV DNAを感染導入する方
法に関す。また本発明は転移用組織ベクターと
BmNPV DNAの混合物を培養細胞又はカイコ生
体に接種してそれらの中で組換BmNPVを作ら
せたり、BmNPV DNAと大腸菌プラスミド
pBR322との組換DNAを作成し、更にこの多角
体蛋白構造遺伝子部分を有用物質生産用遺伝子と
組換る等の方法により組換BmNPV DNAを作
り、これを同様に培養細胞またはカイコ生体に接
種して増殖させ、有用物質を生産する方法に関す
る。更に本発明は、カイコ核多角体病ウイルス
DNAの多角体蛋白遺伝子のプロモーター領域を
含む5′上流DNA断片、翻訳開始コドン及び有用
物質生産用遺伝子を含み、更にBmNPV DNAの
多角体蛋白構造遺伝子の3′下流DNA断片を含む、
または含まない二重鎖DNAで組換されている
BmNPV DNAを、培養細胞中または宿主中（特
にカイコ樹立細胞中またはカイコ生体中）で増殖
させて有用物質を生産する方法に関し、また、本
発明はBmNPV DNAの多角体蛋白構造遺伝子の
プロモーター領域を含む5′上流DNA断片及び
3′下流断片を含有するベクター及びこの5′上流
DNA断片に続き翻訳開始コドン及び有用物質生
産用遺伝子を含んだベクターに関し、更に
BmNPV DNAの多角体蛋白構造遺伝子を、プロ
モーター領域を含む5′上流部分及び3′下流部分を
含めて切り出し、得られたDNA断片の構造遺伝
子部分を有用物質生産用遺伝子と置換し、このも
のをベクターに導入して転移用組換DNAを製し、
この組換DNAとBmNPV DNAを細胞または宿
主に感染導入し、生じた組換BmNPV DNAを増
殖させることを特徴とする有用物質の生産方法に
関し、また有用物質生産用遺伝子を外来遺伝子と
して遺伝子組換えされた組換BmNPV DNAおよ
びその遺伝子組換が多角体蛋白遺伝子領域の置換
またはその他の領域への挿入である組換
BmNPV DNAに関し、BmNPV DNAをベクタ
ーとして利用して遺伝子工学的に有用物質を生産
する方法に関し、また本発明はBmNPV DNAの
多角体蛋白構造遺伝子のプロモーター領域を含む
5′上流DNA部分と、同遺伝子の3′下流DNA部分
を利用して遺伝子工学的に有用物質を生産する方
法に関するものである。 次に本発明の態様を示しつつ更に詳細に説明す
る。 BmNPVはバキユロウイルス（baculovirus）
に属する昆虫ウイルスの一種であり宿主特異性は
高くカイコ（Bombyx mori）に感染してその細
胞中に多角体蛋白を多量に蓄積する。このウイル
スは約140Kbpの環状二重鎖DNAのゲノムを持
ち、これはウイルス粒子からプロテアーゼ処理、
ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）処理等及び抽出
等の常法により得ることができる。この環状二重
鎖DNA（以下ウイルスDNAまたはBmNPV
DNAと略す）は相当大きな環状DNAであるの
で、制限酵素処理により小さなDNA断片を製し、
多角体蛋白構造遺伝子及びその前後（5′上流及び
3′下流部分）を含有する断片を選択して使用する
のが適当である。制限酵素としては種々のものが
知られ、かつ市販されているので適当なものを選
んで用いればよく、使用条件も酵素に応じ適宜設
定する。なお、本発明の技術内容におけるDNA
断片の合成（化学的、制限酵素処理による切断）、
分離および検索、DNA配列の解析、大腸菌等の
処理（形質転換、培養、プラスミドの取得等）な
どはよく知られた遺伝子操作技術を利用して行う
ことができる。 BmNPV DNAから得た多くのDNA断片より
構造遺伝子部分を含むDNA断片を選択するには、
常法によつて製したプローブを用いたサザンハイ
プリダイゼーシヨン等により行えばよい。選ぶべ
き断片は、構造遺伝子部分を含んでいることが必
要であるが、その5′側（上流）及び場合によつて
は3′側（下流）にも相当の長さのDNA鎖を有し
ていることが重要である。この長さをどの程度に
するかは、目的の有用物質の生産の効率に関して
重要であり、かつ以下に述べる取扱いの容易さに
も関係してくるが、実験により確かめることが可
能であり、たとえ手数がかかるとしてもこの分野
で通常の知識を有する者にとつて、以下の説明、
特に実施例を参考にすれば、困難ではない。この
目的にかなつた一つは、EcoRIで切断して得た約
10.6kbpの断片であるがその他の制限酵素を用い
て得る種々の断片が使用可能であろう。 多角体蛋白の構造遺伝子及びその前後のDNA
鎖を含む断片から構造遺伝子部分を除去し、その
上流側のプロモーター領域を含む適当な長さの
DNA鎖を取り出し、また構造遺伝子の下流の適
当な長さのDNA鎖を取り出して利用するには
種々の手法が活用される。 すなわち、種々の制限酵素で処理して得た断片
のDNA配列を検索して構造遺伝子部分を同定し、
その部分を制限酵素で切断（例えばBal31による
消化）して除去することができる。必要とされる
上流側および下流側のDNA鎖は、Bal31消化に
よつて残つた部分として調整するなど、あるいは
DNA配列を解明した後に制限酵素で切断して製
造するか、化学合成によつて製造することも可能
である。 カイコの多角体蛋白については、S.セレブリア
ニらがアミノ酸分析を行い、244個のアミノ酸配
列を発表している（J.Invertebrate Pathology30
442〜443（1977））。従つて、BmNPV由来のDNA
断片について塩基配列を解明してそのコドンとア
ミノ酸を対応させてアミノ酸配列を作成し、これ
をセレブリアニらの配列と照合すれば多角体遺伝
子のどの部分に相当するか、或いは別の部分であ
るかを判断することができる。 本発明者は、構造遺伝子部分の除去およびその
上流並びに下流のDNA断片部分の利用のために
は、BmNPV DNAのEcoRI切断断片（約
10.6kbp）が好適であり、かつそのものをHind
で切断するとき使用に便利な二個の断片が得られ
ることを確かめた。ただし、本発明の目的を達す
るためには必ずしもこの断片に限られることはな
いのであつて、種々の制限酵素を用いて検索を行
うことにより、他にも好適な断片を作成すること
が可能と考えられる。以下においては、必要に応
じて上記の好適な断片の例により説明する。な
お、DNA配列等の表示においては特に示す以外
は一般的方法により5′側を左に3′側を右にして行
い制限酵素名をハイフン（−）で継ぐことにより
その断片を表す。 この場合にも左右は同じ意味を有する。 上に述べた好適なEcoRI−EcoRI断片の概要を
次に示す。

【表】 この断片を更に小さな断片に分け、サザンハイ
ブリダイゼーシヨン等の方法で検索すれば多角体
蛋白遺伝子部分を見出すことができる。この例で
は、HpaI−Hind断片（約1.8kb）中にこの構
造遺伝子の存在が認められた。なお、このHpaI
−Hind断片の一部分の塩基配列（HpaI−
Hind断片のHpaI切断点の下流201番目の塩基
からHind切断点まで（−382から1185までの
1567bp）を参考のために最後に示す。従つて、
構造遺伝子の上流部分及び下流部分を利用するた
めにはHind処理によりHind−Hind（約
3.9kb）およびHind−Hind（約3.1kb）の二
種の断片を調整して利用するのが便利である。こ
の二種はアガロース電気泳動等の常法で分離でき
る。 分離して二種の断片は人工リンカーを含有する
別々のプラスミドに組込んで操作するのが便利で
あり、例えば、市販のプラスミドpUC9および
pUC8（いずれもPharmacia Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）はこのために適している。 下流側のHind−Hind断片（約3.1kb）は
pUC8のHind部位に組込んで利用する。多角体
蛋白遺伝子を含む上流側のHind−Hind断片
はpuC9のHind部位に組込んだ後に、制限酵素
（例えばEcoRI）で一箇所切断し、得たDNA断片
にBal31を働らかすとDNA鎖を切断点から両側
に塩基を一個ずつ消化していくので、DNA鎖の
長さの調節に便利である。反応時間を換えて幾種
類かの長さの断片を作り、その塩基配列を解析す
れば多角体遺伝子の除去されたものを見出すこと
ができる。 このようにして多角体遺伝子を除去し、その上
流のウイルス由来のプロモーター領域を含む
DNA断片を得ることができる。このものは、も
う一方の多角体遺伝子の下流のDNA断片と組み
合わせて、プラスミドに組込んでベクター用プラ
スミドとし、両断片の間の多角体遺伝子が存在し
ていた部位に有用物質生産用遺伝子を組込んで組
換プラスミドを製造するために有用である。ここ
で、本発明における有用物質とは、ペプチド、蛋
白、又は糖蛋白を意味する。 例えば、上流部分はHind処理後pUC9に組込
んでプラスミドを作り、下流部分はHind−
Hind断片（約3.1kb）をpUC8のHind部位に
組込んでプラスミドとなし、両プラスミドの制限
酵素の共通部位を利用して上流部分と下流部物を
同一プラスミドに組込む。この場合両者の間に人
工リンカー部分が存在するように設計すると有用
物質生産用遺伝子の組込みに便利なことがある。 なお、多角体遺伝子の翻訳開始コード近辺およ
び終了コード近辺が欠損している場合は、合成
DNAで補充するなどの方法により修復してもよ
い。これらは一般的な組換DNA技術によつて行
う。 有用物質生産用遺伝子としては種々のものが報
告され、今後も多くのものの天然の遺伝子の単離
および合成の報告がされるであろうが、それらの
利用が可能なことは容易に理解できるであろう。
例えば、有用物質として、インターフエロン類
（α−インターフエロン、β−インターフエロン、
γ−インターフエロン）、インシユリン、ヒト成
長ホルモン、ソマトメジン類、インターロイキ
ン、各種リンホカインなどペプチド類、蛋白類、
糖蛋白類を挙げることができる。通常この有用物
質生産用遺伝子に予め翻訳開始コドン（ATG）
を結合して後の操作を行うのが適当である。な
お、有用物質生産用遺伝子としては、多角体蛋白
構造遺伝子と目的蛋白質の遺伝子とを結合させた
連結遺伝子を利用する一般的な方法もある
（Science 1981056（1977）参照）。 有用物質生産用遺伝子は、リンカーを両端に結
合させてベクターに組込むなど、常用される方法
を利用して組換プラスミドを製造する。その結
果、得られた組換プラスミドは有用物質生産遺伝
子の上流および下流にそれぞれウイルス由来の断
片、プロモーター領域を含むDNA断片と終了コ
ドンの下流のDNA断片が組込まれたものである。
以上の操作において、DNA断片の組込みあるい
は切断等さらに断片の選択等で、塩基配列が逆に
なる場合も考えられるが、各々の段階で正しい向
きのものであることを確認しながら先に進める必
要のあることは当然である。 上述の如くして得た組換プラスミドは、それ自
体大腸菌に形質転換して増殖させることは可能で
あるが、BmNPVの増殖力を利用することによ
り著しい効果が得られる。この効果を奏するため
に、組換プラスミド中に存在するウイルス由来の
プロモーター領域を含むDNA断片および終了コ
ドン以下のDNA断片が極めて有用である。上記
のプロモーター領域は、カイコ核多角体病ウイル
ス（BmNPV）DNAの多角体蛋白構造遺伝子の
翻訳開始コドンATGとその上流約4.5KbpのHid
サイト間に存在し、この領域が構造遺伝子部分
の蛋白への翻訳にとつて翻訳を促進するために重
要な役割を果たす。 プロモーター領域を含む5′上流断片は、必ずし
も元のBmNPV DNAに存在する塩基配列そのま
まである必要はなく、多少の修飾があつても同様
の効果が期待できる。また、BmNPVの多角体
蛋白構造遺伝子のATGの上流には、一般のプロ
モーター領域に存在するといわれている典型的な
TATAボツクスを明確に指摘することができな
い。しかし、後に実施例のＣ−２以下と表１に示
すように、ATGの上流−７〜−1bpの欠損、−18
〜−1bpの欠損、および−19〜−1bpの欠損のも
のを用いた場合でも優れた効果が得られ、−29〜
−1bpの欠損の場合でも充分な効果が得られるに
もかかわらず、−82〜−1bpの欠損の場合では相
当の低下傾向が見られるので−80番目の塩基の近
辺は既に重要なプロモーター領域であると考えら
れる。このプロモーター領域と、ウイルスDNA
組換えのために有用な領域としての上流DNAと
を合せた5′上流DNAは種々の長さのものが使用
可能であり、例えば、ATG前後キロ塩基対の範
囲で使用することが出来る。更に具体的には、後
に述べるHpa−Hind断片（約1.8kb）内の
ATG上流部分やHind−Hind断片（約3.9kb）
内のATGより上流の部分およびその一部分の使
用で充分であり、この断片（約3.9kb）の更に上
流までも含ませなければならない必然性はないと
考えられる。このプロモーター領域は、先にも述
べたように、BmNPV DNAの優れた蛋白生産性
を発揮させるために重要である。 また、更に上流に位置するDNA配列および多
角体蛋白構造遺伝子の3′下流DNA配列は、有用
物質生産用遺伝子（および翻訳開始コドン）を
BmNPV DNAに組込んで組換DNAを製造する
ときの足がかりとして重要である。すなわち、有
用物質生産用遺伝子を含んだDNA断片（有用物
質生産用遺伝子の上流と下流にそれぞれ
BmNPV DNAと相同性を有するDNA配列を有
する）を有する転移用組換DNA（例えばプラスミ
ド）とBmNPV DNAを混合感染すると、この足
がかりの部分の相同性によりBmNPV DNAに有
用物質生産用遺伝子の乗換えが起こり、組換
BmNPV DNAが生ずる。 これらの多角体蛋白構造遺伝子の上流部分およ
び下流部分のDNA配列の確定、修飾、利用等は
前述の部分および後述の部分の説明と実施例を参
考にすれば通常の知識を有する者にとつて困難で
はなく、手間がかかることがあつても発明的な技
術思想の飛躍なしに理解し実行することが可能で
あり、それらは本発明の態様のうちである。 上述の組換プラスミドを利用して、有用物質生
産用遺伝子が組換された組換BmNPV DNAを得
るには種々の方法がある、例えば、一つはin
vitro的な方法であり、一つはカイコを使う方法
である。又この様な組換プラスミドを利用せず
に、BmNPV DNAとpBR322等との組換体を製
し、その多角体遺伝子を有用物質生産用遺伝子と
組換える事により組換ウイルスDNAを作る方法
も態様の一つである。 培養細胞、例えばカイコ樹立細胞（Bm細胞
（ATCC No.CRL−8851））を用いてin vitro的
に、BmNPV DNAと有用物質生産用遺伝子を有
する組換プラスミドを混合感染すると、目的の遺
伝子（有用物質生産用遺伝子）のウイルスDNA
への組換が起こり、組換ウイルスDNA（組換
BmNPV DNA）が生じる。この組換としては、
目的の遺伝子と多角体蛋白構造遺伝子領域の置換
の形態をとることもあり、ウイルスDNAのその
他の領域へ有用物質生産用遺伝子が一個乃至複数
個付加的に組込まれる形態をとることもある。こ
のように、in vitroでの混合感染を行えば組換ウ
イルスDNAが増殖して有用物質が蓄積される。
培地中には非組換体と組換体のウイルスが存在し
得るが、希釈法またはプラーク法などの一般的方
法によつて組換ウイルスを単離することが可能で
ある。 又、上記の混合感染をカイコを用いて行うこと
もできる。 Bm細胞で増殖されたウイルス（組換ウイルス
と非組換ウイルスの混合物、またはそれから組換
体を単離したもの）をin vitroでBm細胞に感染
させるか、またはカイコに経皮的、あるいは体腔
内に注射して効率よく目的の有用物質を生産する
ことができ、これらは公知の方法により単離精製
することができる。 （発明の効果） 本発明によれば、有用なペプチド類、蛋白類、
糖蛋白類を、安全、且つ、経済的に多量に製造す
る事が可能である。 本発明により生産されるペプチドおよび蛋白質
は、真核細胞中において産生されるため、真核生
物遺伝子を使用した場合、その生体内におけると
同様な修飾、すなわちシグナルペプチドの切断、
糖鎖の付加等を受けることができ、従来の細菌類
を用いる遺伝子操作生産物より遥かに有用性が高
いと期待される。またこれらの生産物は細胞外へ
分泌される為、その精製は極て容易である。 更に、カイコは、人類の多年にわたる飼育経
験、およびその研究蓄積により、大量飼育は容易
であり、又、現在では人工飼料による飼育も可能
である。従つて、ウイルスベクターを用いる有用
産物の生産を細胞レベルで行うよりは、生体レベ
ルで行う事が可能であれば、遥かに工業的、且
つ、経済的になると推定される。 以下に有用遺伝子としてα−インターフエロン
（α−IFN）遺伝子を用い医薬品として有用な蛋
白質α−IFNを生産する例を挙げて、その実施の
態様を示すが、本発明の範囲がこれに限定されな
い事は勿論である。 実施例 １ Ａ BmNPVのプラーク法によるクローニング
と増殖 BmNPVを３令期のカイコに経口感染させ、
数日後、体液を採取した。これを牛胎児性血清
を１％含んだTc−10培地（J.Invertebrate
Pathology 25363〜370（1975））で希釈し、単
層に培養したBm細胞（カイコ樹立細胞：
Appl.Environ.Microbiol.44227〜233（1982））
に感染させた後、アガロース0.75％および牛胎
児性血清５％を含んだTC−10培地に重層し、
固化後、27℃で数日間インキユベートした。こ
のプレートに形成したプラーク班をパスツール
ピペツトで採取した。このプラーク法による操
作を２回繰返して遺伝的に均一なウイルスを得
た。このウイルスの代表的な株である
BmNPV T3株を以下の実験に使用した。 T3株をBm細胞で増殖させた後、更に５令期
のカイコに経皮接種感染させ、６日後、形成さ
れた多角体を含む感染組織を蒸留水を加えて遠
心しその沈殿を蒸留水に懸濁し、磨細し、分画
遠心（3000rpm、30分）および45％と55％
（ｗ／ｗ）の蔗糖溶液の不連続の密度平衡遠心
（20000rpm、30分）により精製した。この多角
体浮遊液より分画遠心（3000rpm、10分）で蔗
糖液を除去後、精製多角体を0.1M炭酸ソーダ
（PH11）−0.05M塩化ナトリウム液に浮遊させ、
25℃で30分反応させて多角体を溶解し、ウイル
ス粒子を放出させる。 このウイルス浮遊液を10〜40％（ｗ／ｗ）蔗
糖液の密度勾配平衡遠心（18000rpm、30分）
して、ウイルスを精製した。蔗糖は透析又は分
画遠心（40000rpm、30分）により除去し、精
製ウイルス粒子を得た。 Ｂ ウイルスDNAの調整、多角体遺伝子の同定、
クローニング Ｂ−１ ウイルスDNAの抽出 精製したウイルス溶液に、SDS（ラウリル
硫酸ナトリウム、1w／ｗ％）およびプロテ
アーゼＫ（メルク社製１mg／ml）を加え、37
℃で約２時間インキユベートした。この溶液
に等量のフエノール溶液（10ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（PH7.6）−１ｍMEDTA飽和）を加
え静かに約５分間振とうし次に12000rpmで
５分間遠心した。水層を採り、同様のフエノ
ール処理を２回繰返した。このDNAを含む
水層に等量のクロロホルムを加え、静かに約
５分間振とうし、次いで12000rpmで２分間
遠心した。水層を採り、同様のクロロホルム
処理を２回繰返した後、水層を10ｍＭ−トリ
ス−塩酸緩衝液（PH7.6）−１ｍＭ EDTAに
対して約２日間透析した。得られたウイルス
（ATCC No.40188）を以下の遺伝子のクロー
ニング及びBm細胞に対する形質転換
（transfection）に用いた。 Ｂ−２ 多角体遺伝子のクローニング プローブの作成：５令中期のカイコに
BmNPV T3株を経皮的に注入して感染さ
れ、数日後、脂肪体組織により塩酸グアニジ
ン法により全RNAを抽出した。これをオリ
ゴdTセルロースカラムでポリＡを有する
mRNAを精製した。このmRNAについて、
ウサギ網状赤血球のin vitroの翻訳系により
調べたところ、全mRNAの90％以上が多角
体のmRNAであつた。このmRNAよりオリ
ゴdTプライマーおよび逆転写酵素を用いて
cDNAを合成した。この場合³²Pを含む
dCTPを基質に用いてcDNAをラベルし、多
角体遺伝子の検索の為のプローブとした。 多角体遺伝子を含むEcoRIの断片のクロー
ニング：BmNPV T3株の精製DNAを
EcoRIで消化し、その断片を0.7％アガロー
スゲルにて電気泳動した後、ニトロセルトー
スフイルターに転写（transfer）し、前記の
プローブとハイブリダイゼーシヨンを行つ
た。約10.6kbのDNA断片が特異的にハイブ
リダイズした。この断片をpBH322のEcoRI
切断部位に挿入した。即ち、ウイルスDNA
をEcoRIで消化し、Ｂ−１で記述したと同様
のフエノール処理およびクロロホルム処理を
行い、水層を分離した。これに1/20量の4M
塩化ナトリウム溶液および２倍量の冷エタノ
ールを加えて沈殿したDNAを少量のトリス
緩衝液（10ｍＭトリス−塩酸（PH7.6）−１ｍ
MEDTA）に溶解した。一方、pBR322は
EcoRIで消化後、上記と同様に処理し、更に
BAP（bacterial alkaline phosphatase
（Besesda Research Labora tories製））で
処理し、再びフエノール処理、クロロホルム
処理を行い、エタノールを加えて沈殿させ、
これを少量のトリス緩衝液に溶解した。 これらのEcoRI消化したウイルスDNAお
よびrBR322にT4−リガーゼ加え、５℃で10
時間反応、結合させた。これを大腸菌K12
JM83に挿入した。形質転換したテトラサイ
クリン耐性の大腸菌を前記のラベルした
cDNAをプローブとして用いたコロニーハイ
ブリダイゼイシヨンによりスクリーニング
し、多角体遺伝子を含む約10.6kbのEcoRI断
片を含んだプラスミドを有する大腸菌を得
た。これを培養し、セシウムクロライド法で
プラスミドDNAを精製した。このプラスミ
ドをpBmE36とした。プラスミドpBmE36を
含む大腸菌を、大腸菌（Escherichia coli）
K12 JM83 DGB−0036と名付けこのものは
微生物工業技術研究所にFERM BP−813と
して寄託されている。pBmE36のEcoRI−
EcoRI挿入部分の制限酵素地図は図面に示
す。前記のcDNAをプローブとしてサザン
（Southern）ハイブリダイゼイシヨン法によ
り更に挿入DNA部分を検索したところ、
Hpa−Hind断片（約1.8kb）とのみハイ
ブリダイズした。 Ｃ 多角体構造遺伝子部分の除去 Ｃ−１ 多角体遺伝子を含む部分及びその下流
部分のクローニング 前記のHpa−Hind断片を含む部分で
あるHind−Hind断片（約3.9kb）及び
多角体遺伝子の下流部分を含むHind−
Hind断片（約3.1kb）を、市販のクローニ
ング・ベクターpUC9及びpUC8のHind切
断部に組込み、夫々p9H18及びp8H225を作
成した。 Ｃ−２ 多角体遺伝子部分の除去 プラスミドp9H18をEcoRIにて切断後、
Bal31にて処理し、切断点から両側を削り取
らせた。Bal31の処理時間を変えて、種々の
長さの断片を製した。これをHindで処理
し、0.7％アガロースゲル電気泳動で分離、
抽出し、種々の長さのウイルス由来のDNA
断片を得た。 pUC9をSmaおよびHindで処理し、先
に得たDNA断片（平滑末端およびHind末
端を有する）をライゲートしてプラスミドを
製し、大腸菌Ｋ−12 JM83を形質転換させ
た。これを増殖後、プラスミドを取り、挿入
したウイルス由来のDNA断片の3′側からの
塩基配列をプライマー（M13用15base
sequencing primer）を用い、ダイデオキシ
（dideoxy）法により決定し、ウイルスの多
角体遺伝子部分を同定した。即ち、セレブリ
アニらの文献記載の多角体蛋白のアミノ酸配
列に対応する塩基配列を、ウイルス由来の
DNA断片の塩基配列中に見出し、翻訳開始
コドンATGも決定した。Bal31の処理時間
に対応して得られた種々のプラスミドの内、
多角遺伝子の翻訳開始コドンATGの上流の
29bpおよびATG以下の多角体蛋白構造遺伝
子が欠損しているものをp9B241とした。 同様にしてATGの上流82bp、19bp、18bp
または7bpおよびATG以下が欠損している
ものを夫々p9B587、p9B310、p9B276および
p9B585と命名した。この領域の塩基配列を
次に示す。

【表】 Ｄ 多角体構造遺伝子部分欠損プラスミドの構築 プラスミドp9B241をEcoRおよびAatで
処理し、別にp8H225〔Ｃ−１にて作成〕を
EcoR、AatおよびScaで処理した（不要
なpUC8由来の断片をScaで小片とした）。両
反応液を夫々、フエノール処理、クロロホルム
処理し、エタノール沈殿させて得た２種の
DNAをライゲートし、生成したプラスミドで
大腸菌K12 JM83を形質転換した。形質転換体
からプラスミドを抽出し、ウイルス由来DNA
断片の上流部分と下流部分が正しい方向に結合
しているプラスミドを選択した。この組換えプ
ラスミドは各種制限酵素による切断像から、ア
ンピシリン耐性マーカーを有し、多角体遺伝子
の開始コードATGから上流30bp目からさらに
上流に約3kb迄の部分（プロモーターを含む非
翻訳部分）及び同遺伝子の終止コードから下流
約3.1kbの部分（但し、終止コードから下流約
300bpは欠損している）を、元のウイルスと同
じ向きに含有しており、大腸菌系で増殖可能で
ある。これをp89B241とした。同様に、
p9B587、p9B310、p9B276およびp9B585を素
材としてp89B587、p89B310、p89B276および
p89B585を構築した。 Ｅ α−IFM遺伝子の挿入 (i) ヒト・ゲノムのλフアージCharon4A組換
体ライブラリー（Lawn糖、Cell151157
（1978））より白血球IFM遺伝子を検索し、
得られたα−IFM−Ｊ遺伝子を含むDNAを
HindおよびEcoRで処理し、アガロース
ゲル電気泳動でα−IFM−Ｊ遺伝子を含む
断片を分離し、これをHindおよびEcoR
で処理したpUC9とライゲートした。得られ
たプラスミドで大腸菌K12JM83を形質転換
させた。このプラスミドを取り出し、Mst
およびPvuで処理し、α−IFM−Ｊ遺伝子
を含むDNA断片を分離し、その両端にSma
リンカー（宝酒造製）を結合させた。これ
をSam処理し、Ｄ項で得たプラスミド
p89B241のSam切断片とライゲートして組
換えプラスミドを製した。α−IFM−Ｊ遺
伝子が正しい方向に入つている事を確かめ、
このプラスミドで大腸菌Ｋ−12 JM83を形質
転換し、増殖させ、多量のプラスミドを製し
た。このプラスミドをpIFN−１−B241とし
た。これは多角体遺伝子の上流部分（約−
3kb目から−30番目まで）に続き、プラスミ
ドp89B241構築の際に使用したリンカー残基
13bpおよび染色体より得られたα−IFN−
Ｊ遺伝子の5′非翻訳領域32bpの次にATGで
始まるα−IFN−Ｊ遺伝子が正しい方向に結
合し、更に多角体遺伝子の下流部分（終止コ
ドンから下流約300番目のbpから約3.1kbpま
で）が結合している。 (ii) α−IFN−Ｊ遺伝子を含む前記のHind、
EcoR切断片をpUC9にライゲートして得
られたプラスミドで大腸菌K12JM83を形質
転換させ、そのプラスミドを取り出し、Hpa
で処理し、α−IFM−Ｊ遺伝子を含む
DNA断片を分離し、別途化学合成したオリ
ゴマー（CGGGCATC）を³²P−ATPおよび
T₄−ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社
製）を用いてリン酸化し、別の合成オリゴマ
ー（CCGGGATGGCC）とアニーリングさ
せたものとライゲートさせた。これをアガロ
ースゲル電気泳動により分離抽出し、ふたた
び³²P−ATPおよびT₄ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いてリン酸化したのちＤ項で得たプ
ラスミドp89B241のXma切断片とライゲ
ートして組換えプラスミドを製した。α−
IFN−Ｊ遺伝子が正しい方向に入つている事
を確かめ、このプラスミドで大腸菌
K12JM83を形質転換し、増殖させ多量のプ
ラスミドを製し、これをpIFN−２−Ｂ−241
とした。 これは多角体遺伝子の上流部分（約3kb上
流から−30番目のbp）に続き、プラスミド
p89B241構築の際に使用したリンカー残基
13bpおよびATGで始まるα−IFN−Ｊ遺伝
子が正しい方向に結合し、更に多角体遺伝子
の下流部分（終止コドンから下流約300番目
のbpから約3.1kb下流まで）か結合してい
る。 同様にしてp89B587、p89B310、p89B276
およびp89B585を素材としてpIFN−２−
B587、pIFN−２−B310、pIFN−２−B276
およびpIFN−２−B585を構築した。 (iii) リンカーの合成 オリゴデオキシリボヌクレオチド類の化学
合成： H.Itoらの報告〔Nucleic Acids
Research、101755（1982）〕に準じて、ポリ
スチレン樹脂を用いた固相法により、オリゴ
マーを合成した。完全に保護された二官能性
ダイマー（）（約100mg）をｔ−ブチルアミ
ン−ピリジン（１：9v／ｖ）溶液により、
対応する3′−燐酸ジエステル（）に変換
し、5′−遊離−ヌクレオシド樹脂（）と縮
合剤メシチレンスルホニル−ニトロリアゾリ
ド（MSNT、100mg）を用いて縮合させ、未
反応の5′−水酸基は無水酢酸−ピリジン
（１：9v／ｖ）溶液によつてアセチル化し、
縮合生成物は２％トリクロル酢酸（TCA）−
塩化メチレンにより脱トリメチル化処理して
脱トリチル体（）を得た（反応式参照：
COCH₂CH₂CONHCH₂C₆H₄−R₅部分は樹脂
部分）。これらの一連の反応を目的とするシ
ークエンスまで繰り返した。得られたオリゴ
マー結合樹脂（約20mg）に0.5Mテトラメチ
ルグアニジン−ピリジン−２−アルドキシム
（ピリジン−水（15：４）中）0.5mlを加えて
37℃、８時間反応させ、次いで濃アンモニア
水で55℃、８時間処理した。溶液を
SephadexG−50fine（2.5×60cm）のカラムで
ゲルろ化し、DMTrオリゴマーを得た。こ
れを高速液体クロマトグラフイー（HPLC）
を用いて、更に精製した。カラムは逆相カラ
ム（SSC−ODS−272、0.6×20cm）を用い、
溶液Ａ（0.02M−TEAA、PH7.0）と溶液Ｂ
（0.02M TEAA、PH7.0中50％アセトニトリ
ル）による直線濃度勾配法を用いてDMTr
オリゴマーを精製した。これに80％酢酸を加
え、室温で20分処理し、脱トリチル化を行
い、更に上述のHPLCによつてオリゴマーを
得た。目的とするオリゴマーは10ｍMTris
−HCl（PH7.5）−１ｍMEDTA（PH8.0）で透析
することにより得られた。この様にして得た
完全脱保護したオリゴデオキシリボヌクレオ
チドの均一性（homogeneity）は、逆相カラ
ムクロマトグラフイーで単一ピークで得られ
ること、T₄−ポリヌクレオチドキナーゼを
用い〔γ−³²P〕ATPで5′−末端を標識した
後、15％ポリアクリルアミドゲル−7M尿素
の電気泳動で単一バンドであることにより確
認した。

【化】

【化】

【化】

【化】 Ｆ Bm細胞へのトランスフエクシヨン BmNPV T3株のウイルスDNAとpIFN−１
−B241をモル比で１：100になる様にし、下記
組成液とを混合した。 蒸留水 2.1ml キヤリアDNA（鮭精巣、１mg／ml） 50μ BmNPV DNA 10μ pIFN−１−B241 DNA 50μｇ 2M塩化カルシウム液 300μｇ 0.28M塩化ナトリウム含有の 50ｍＭ HEPES緩衝液（PH7.1） 2.5ml リン酸緩衝液（35ｍＭ Na₂HPO₄−35ｍ
Ｍ NaH₂O₄） 50μ 生じた懸濁液の１mlを４mlのBm細胞培養液に
加え、カイコ細胞に上記DNAを導入した。20
時間後、新鮮な培地と交換し、更に５日間培養
後、培地を回収した。遠心して清澄化した上清
をとり、α−IFNの活性検定に用いた。また、
回収した培地を1000rpmで５分間遠心し、上清
液を希釈しプラークアツセイを行なつた。４日
後プラークを検鏡し、多角体のないプラークを
選出した。この操作を３回繰返し単一なウイル
スを得た。これを用いてBm細胞に感染させ５
日間培養後、培地を回収した。 Ｇ カイコでのα−IFNの発現 ５令１日目のカイコに、Ｆ項記載の５日間培
養後の培地および単一ウイルスを感染させて５
日間培養後の培地0.5ml／匹（10⁷pfu）を経皮
的に注入し、25℃で５日間、クワ葉を与えて飼
育後、腹脚に採取針をさし、体液を氷冷したエ
ツペンドルフ・チユーブに採取し、等量のTC
−10倍地を加えて遠心し（10000rpm、５分）、
上清をとりα−IFMの活性検定に用いた。 Ｈ α−IFMのバイオアツセイ (i) 活性測定 C.Philip等の報告（Method in
Enzymolozy、Vol.78387〜394（1981））に準
じ、FL細胞（ヒト羊膜由来）、VSV
（vesicular stomatitis virus）を用い、96穴
のマイクロタイター・トレーの中で、NIH
のα−IFN標準品との比較で、50％CPE阻止
法（cytopathic effect inhibition assay）
により測定した。結果を表１および表２（単
一ウイルス使用）に示す。

【表】

【表】 (ii) α−IFNのＮ端の同定 カイコ体液中に産生したα−IFNを抗体カ
ラムを用いて精製後分析したところ、Ｎ端の
11個のアミノ酸は標準のα−IFNと一致し
た。 これはカイコ細胞がヒトのタンパクのシグ
ナル配列を正確に認識し、細胞中で正確なプ
ロセツシングが行われていることを意味して
いる。 Ｊ β−IFNの発現と同定 ヒト・ゲノムのλフアージCharon4A組換体
ライブラリーよりβ−IFN遺伝子を検索し、得
られたβ−IFN遺伝子を含むDNAをHindで
処理し、アガロースゲルで電気泳動でβ−IFN
遺伝子を含む断片を分離し、これをHindで
処理したpUC3とライゲートした。得られたプ
ラスミドをHindとBglで処理し、上記と同
様にβ−IFN遺伝子を含む断片を分離し、これ
をEcoRVで処理したpBM010とライゲートし
た。このプラスミドをpBM211とし、これを用
いて組換ウイルス（BmNPV）を作成した。 この組換ウイルスによるβ−IFNの生産はカ
イコ体液で８×10⁵u／ml、Bm細胞上清で８×
10⁴u／mlであつた。また、この組換ウイルスの
生産するインターフエロンは抗ヒトβ−IFNモ
ノクロナール抗体によつて中和された。 なお、プラスミドpBM010はp9Bシリーズの
プラスミドの一つであるp9B312（ATGの下流
23bpまでが残つている、すなわち、24bp以下
が欠損している）を用いてインビトロ・ミユー
タゲネシス（in vitro mutagenesis：Nucleic
Acids Research９(15)3647〜3856（1981））によ
つて導いたものであり、概略を次に示す。

【表】 なお、本発明で用いたBmNPVおよびBm細胞
は微生物工業技術研究所へ寄託申請したが受託を
拒否された。 本発明の実験は、組換えDNA実験指針及び化
学技術庁へ提出した組換えDNA実験計画書に基
づいて実施したものである。 参考：Hpa−Hind断片の一部分の塩基配列

【表】

【表】 ^１１８５

【図面の簡単な説明】

第１図は、組換BmNPV DNA製造に有用な組
換プラスミド作成例の概略図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ カイコ核多角体病ウイルスDNA（BmNPV
   DNA）の多角体蛋白構造遺伝子の翻訳開始コド
   ンATGとその上流約4.5KbpのHind サイト間
   に存在するプロモーターを含む5′上流DNA断片
   （）、翻訳開始コドン（）、ペプチド、蛋白又
   は糖蛋白の生産用遺伝子（）および翻訳終止コ
   ドン（）を含み、更にBmNPV DNAの多角体
   蛋白構造遺伝子の3′下流DNA断片（）を含む
   DNAで組換されているBmNPV DNA。 ２ カイコ核多角体病ウイルスDNA（BmNPV
   DNA）の多角体蛋白構造遺伝子の翻訳開始コド
   ンATGとその上流約4.5KbpのHindサイト間に
   存在するプロモーターを含む5′上流DNA断片
   （）、翻訳開始コドン（）、ペプチド、蛋白、
   又は糖蛋白の生産用の遺伝子（）および翻訳終
   止コドン（）を含み、更にBmNPV DNAの多
   角体蛋白構造遺伝子の3′下流DNA断片（）を
   含むDNAで組換されているBmNPV DNAを含
   有するウイルス。 ３ BmNPV DNAの多角体蛋白構造遺伝子の翻
   訳開始コドンATGとその上流約4.5KbpのHind
   サイト間に存在するプロモーターを含む5′上流
   DNA断片（）、BmNPV DNAの多角体蛋白構
   造遺伝子の3′下流DNA断片（）を含有するプ
   ラスミドベクター。 ４ BmNPV DNAの多角体蛋白構造遺伝子の翻
   訳開示コドンATGとその上流約4.5KbpのHind
   サイト間に存在するプロモーターを含む5′上流
   DNA断片（）に続き翻訳開始コドンATG
   （）、ペプチド、蛋白、又は糖蛋白の生産用遺伝
   子（）及び翻訳終止コドン（）を含む特許請
   求の範囲第３項のプラスミドベクター。