JPH1017594A - 癌関連糖鎖抗原に対する抗体産生を誘導するペプチド抗 原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、癌関連糖鎖抗原に対する抗体産生を
誘導するペプチド抗原を提供することを課題とする。 【解決手段】（１）ペプチド顕示ファ−ジを用いたペプ
チドライブラリ−を作製し、（２）癌関連糖鎖抗原であ
るＴｎ抗原に選択的に結合するレクチンをビオチン化
し、（３）該レクチンを用いて、該レクチンに特異的に
結合するペプチド顕示ファ−ジをペプチドライブラリ−
より選択し、（４）選択したペプチドを作製し、（５）
作製したペプチドの免疫原性の有無を確認し、（６）抗
ペプチド血清の癌細胞障害活性の有無を確認することに
より、癌関連糖鎖抗原に対する抗体産生を誘導するペプ
チド抗原を得て課題を解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、癌治療に有用な癌
関連糖鎖Ｔｎ抗原に対する抗体（以下Ｔｎ抗体という）
の産生を誘導する活性を有するペプチドに関する。

【０００２】Ｔｎ抗原はＳｐｒｉｎｇｅｒ等によって発
見された癌関連糖鎖抗原の一種で、蛋白質中のＳｅｒ又
はＴｈｒの水酸基にＮ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサ
ミン（以下ＧａｌＮＡｃという）が結合した構造をして
おり、多くの癌細胞上に発現される癌関連糖鎖抗原の一
つである（クリチカル レビユ− イン オンコジェネ
シス、第６巻、第１号、５７頁、１９９５年）。したが
って、Ｔｎ抗原は癌細胞特有のマ−カ−と考えられ、こ
れに対するＴｎ抗体のうちＩｇＧクラスの抗体は、補体
および抗体依存性細胞介在細胞障害（以下ＡＤＣＣとい
う）を惹起する抗体として、癌治療に有用である。本発
明のペプチドは、このようなＴｎ抗体のうちＩｇＧクラ
スの抗体の産生を誘導する免疫原性を有するために、癌
治療に有用である。

【従来の技術】

【０００３】一般に糖鎖に対しては補体による細胞障害
を媒介するＩｇＭ抗体のみが誘導され、ＡＤＣＣを惹起
するＩｇＧ抗体は誘導されない。しかし、Ｔｎ抗原を多
量に発現しているアシアロ羊顎下腺ムチン（以下ａＯＳ
Ｍという）またはアシアロ牛顎下腺ムチン（以下ａＢＳ
Ｍという）をマウスにワクチネ−ションすることにより
抗ＴｎＩｇＧ、ＩｇＭ抗体の産生が誘導され、Ｔｎ高発
現癌細胞に対する免疫が成立したという報告があった
（キャンサ− リサ−チ 第５１巻 １４０６頁 １９
９１年）。

【０００４】それに基づいて、ａＯＳＭ抗原を用いる、
大腸癌患者に対する癌免疫治療が行われたが、Ｔｎ抗原
の類縁抗原であるシアリルＴｎ抗原に対しては抗シアリ
ルＴｎＩｇＧ、ＩｇＭ両クラスの抗体の産生が誘導され
たにもかかわらず、Ｔｎ抗原に対しては抗ＴｎＩｇＭ抗
体のタイタ−の上昇が見られたものの抗ＴｎＩｇＧの産
生は誘導されなかった（キャンサ− リサ−チ 第５２
巻 ５６６３頁 １９９２年）。

【０００５】このことは癌患者においてＴｎ抗原が十分
な免疫反応を惹起し得ていないことを示している。更に
これらの免疫原は高分子量の蛋白質と糖鎖および脂質な
どを含む極めて複雑な複合体であり、まだ構造の明確で
ない成分も含んでいることから、そのワクチンとしての
効果以外にも副作用を惹起する可能性がある。従って、
ワクチンとしては成分の構成が明らかである免疫原が好
ましい。しかしながら、純粋なＴｎ抗原を大量に得るこ
とは、精製の点で困難であり、そのため全合成したＴｎ
抗原ワクチンの開発が試みられている（バイオオルガニ
ック アンド メディシナル ケミストリ− 第２巻、
１１１９頁、１９９４年）が、Ｔｎ抗原そのものの癌患
者における免疫原性の弱さの問題が残っていることは、
前記の癌免疫治療試験の結果からも明らかである。

【０００６】癌関連糖鎖抗原の免疫原性が弱い問題を解
決する方法としては、例えばシアリルＬｅｘ糖鎖やスフ
ィンゴ糖脂質を構造的に模倣する抗体（抗イディオタイ
プ抗体）のワクチンとしての開発も試みられている（臨
床免疫、第２４巻、１３００頁、１９９２年および公表
公報特開平５−５００６００号公報参照）。また、Ａｌ
ｅｘａｎｄｅｒ等はヒト サイトケラチン１４由来の１
０アミノ酸よりなるペプチドとキャリア蛋白とのコンジ
ュゲ−トをマウスに免疫したところ抗Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミン（以下ＧｌｃＮＡＣという）抗体が
誘導されたことを報告している（ジャ−ナル オブ イ
ミュノロジ−、第１５３巻、５５９３頁、１９９４
年）。しかしながら、これらの試みはＴｎ抗原を対象と
してはなされていない。

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、前記の
公知の研究における問題点を改良すべく、鋭意検討した
結果、容易に大量に得ることのできる、癌治療に有用な
Ｔｎ抗体の産生を誘導する活性を有する構造を持つペプ
チドに、ＡＤＣＣを惹起させる抗ＴｎＩｇＧ抗体を効果
的に誘導させる免疫原性を有することを見出して本発明
を完成させた。

【０００７】従って、本発明は、ＡＤＣＣを惹起させる
抗ＴｎＩｇＧ抗体を効果的に誘導させる免疫原性を有す
るペプチドを提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、Ｔｎ抗原結合
レクチンに結合するペプチドに関する。

【０００９】上記本発明の好ましい様態は以下のとおり
である。 １）癌関連糖鎖Ｔｎ抗原に対する抗体産生を誘導させる
免疫原性を有する上記ペプチド。 ２）該抗原結合レクチンがＶｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓ
ａ、Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ又はＳａｌｖｉａ ｓ
ｃｌａｒｅａ由来である癌関連糖鎖抗原結合レクチンに
結合する上記ペプチド。 ３）配列１

【００１０】

【化１１】

【００１１】（式中、Ｘ１およびＸ６は、同一または異
なって、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｌａを示し、
Ｘ２およびＸ３はＳｅｒまたはＴｈｒを示し、Ｘ４およ
びＸ５は、同一または異なって、芳香族アミノ酸又は脂
肪族アミノ酸を示し、Ｘ７はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒま
たはＴｈｒを示す）で表わされるアミノ酸配列を有する
上記ペプチド。

【００１２】４）配列２

【００１３】

【化１２】

【００１４】（式中、Ｙ１およびＹ４は、同一または異
なって、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｓｎを示し、
Ｙ２およびＹ３は、同一または異なって、芳香族アミノ
酸、脂肪族アミノ酸又はＭｅｔを示す）で表わされるア
ミノ酸配列を有する上記ペプチド。 ５）配列３

【００１５】

【化１３】

【００１６】（式中、Ｚ１はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓ
を示し、Ｚ２はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎまたは
Ｌｙｓを示す）で表されるアミノ酸配列を有する上記ペ
プチド。 ６）配列４

【００１７】

【化１４】

【００１８】を有する上記ペプチド。 ７）配列５

【００１９】

【化１５】

【００２０】を有する上記ペプチド。 ８）配列６

【００２１】

【化１６】

【００２２】を有する上記ペプチド。 ９）配列７

【００２３】

【化１７】

【００２４】を有する上記ペプチド。 １０）配列８

【００２５】

【化１８】

【００２６】を有する上記ペプチド。 １１）配列９

【００２７】

【化１９】

【００２８】を有する上記ペプチド。 １２）配列１０

【００２９】

【化２０】

【００３０】を有する上記ペプチド。

【００３１】

【発明の実施の形態】

【００３２】本発明の配列１で表わされるペプチドのＸ
１およびＸ６としては、同一または異なって、例えばＡ
ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｌａを挙げることができ、好
ましくはＸ１がＡｒｇであり、Ｘ６がＬｙｓである。Ｘ
２およびＸ３としては、同一または異なって、側鎖に水
酸基を有する脂肪族アミノ酸であり、例えばＳｅｒおよ
びＴｈｒを挙げることができ、好ましくはＸ２およびＸ
３がＴｈｒである。

【００３３】Ｘ４およびＸ５としては、同一または異な
って、芳香族アミノ酸又は脂肪族アミノ酸である。芳香
族アミノ酸としては、例えばＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅを
挙げることができ、好ましくはＴｙｒである。脂肪族ア
ミノ酸としては、例えばＶａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅを
挙げることができ、好ましくはＬｅｕである。Ｘ７とし
ては、例えばＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒを挙げる
ことができ、好ましくはＡｓｎである。

【００３４】配列１を有するペプチドのより好ましい具
体例としては、配列４を有するペプチドである。

【００３５】本発明の配列２を有するペプチドのＹ１お
よびＹ４としては、同一または異なって、例えばＡｒ
ｇ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｓｎを挙げることができ、
好ましくはＡｒｇである。Ｙ２およびＹ３は、同一また
は異なって、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸又はＭｅ
ｔである。芳香族アミノ酸としては、例えばＴｒｐ、Ｔ
ｙｒ、Ｐｈｅを挙げることができる。脂肪族アミノ酸と
しては、例えばＶａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅを挙げるこ
とができ、好ましくはＶａｌである。配列２を有するペ
プチドのより好ましい具体例としては、配列７を有する
ペプチドである。

【００３６】本発明の配列３で表わされるペプチドのＺ
１としては、例えばＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓを挙げる
ことができ、好ましくはＬｙｓである。Ｚ２としては、
例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓを挙げ
ることができ、好ましくはＴｈｒである。配列３を有す
るペプチドのより好ましい具体例としては、配列１０を
有するペプチドである。

【００３７】本発明のペプチドのより好ましい具体例と
しては、配列４、５、６、７、８、９、１０を有するペ
プチドである。

【００３８】本発明のペプチドは、例えば以下に示すよ
うな方法によって得ることができる。 レクチン結合活性を有するペプチドのランダムスクリ
−ニングの対象となるペプチドライブラリ−の作製 レクチン結合ペプチド顕示ファ−ジのみを選択的に回
収するためのビオチン化レクチンの作製 Ｔｎ抗原を構造的に模倣するペプチドを選択するため
のＴｎ抗原特異的レクチンによるペプチドライブラリ−
のスクリ−ニング スク−ニングによって選ばれたペプチドの作製 （１）化学合成法 （２）遺伝子組換え法 作製されたペプチドの、免疫原性の有無の確認。 抗ペプチド血清の癌細胞障害活性の有無の確認。

【００３９】本発明のペプチドを得る方法を以下に詳細
に説明する。 １）ペプチドライブラリ−の作製 ペプチドライブラリ−は、Ｊ．Ｄｅｖｌｉｎ等の方法
（サイエンス 第２４９巻、４０４頁、１９９０年）に
準じて，Ｍ１３ファ−ジ（ニッポンジ−ン社製）を使用
して作製することができる。

【００４０】例えば、図１に示すように、ペプチドライ
ブラリ−は、Ｍ１３ｍｐ８ファ−ジ（ニッポンジ−ン社
製）のマイナ−コ−トタンパク質のシグナル配列をコ−
ドする塩基配列直下に、ランダムな１０個のアミノ酸配
列をコ−ドする塩基配列の合成ＤＮＡを挿入し、組換え
ファ−ジＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０株（ベセスダ リサ−
チ ラボラトリ−社製、以下ＢＲＬ社という）へ導入
し、個々のファ−ジに固有のアミノ酸配列を有するペプ
チドを顕示する組換えファ−ジ粒子を大量に産生するこ
とにより作製できる。

【００４１】２）ビオチン化レクチンの製造法 ビオチン化レクチンは、Ｔｎ抗原を認識するＶｉｃｉａ
ｖｉｌｌｏｓａレクチン（以下ＶＶＡという）、Ｈｅ
ｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａレクチン（以下ＨＰＡという）
又はＳａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａレクチン（以下ＳＳ
Ａという）を、ＥＣＬタンパクビオチン化システム（ア
マ−シャム社製）を使用して、得ることができる。即
ち、１ｍｇのレクチンを、キット中に含まれるバイカ−
ボネ−トバッファ−１ミリリットルに溶解し、キット中
に含まれる４０マイクロリットルのビオチン化溶液を添
加し、室温（２０℃）・１時間でインキュベ−トし、キ
ットに含まれるセファデックスＧ−２５カラムで精製す
る。なお、ビオチン化した上記レクチンの市販品（例え
ばコスモバイオ社製）を使用してもよい。

【００４２】３）Ｔｎ抗原特異的レクチンによるペプチ
ドライブラリ−のスクリ−ニング Ｓｍｉｔｈ等の方法（ジ−ン 第７３巻、３０５頁 １
９８８年）およびＯｌｄｅｎｂｕｒｇ等の方法（プロシ
−ディングス オブ ザ ナショナル アカデミ− オ
ブ サイエンシス ＵＳＡ 第８９巻 ５３９３頁 １
９９２年）とに記載の方法に準じて行うことができる。
即ち、上記ペプチドライブラリ−とビオチン化レクチン
とを混合した後、ペプチドを顕示するファ−ジ溶液に添
加して混合液を作製し、１晩混合する。該混合液をスト
レプトアビジンをコ−トしたポリスチレン製プレ−トに
添加する。非吸着ファ−ジを洗浄して除去した後、例え
ば０．１Ｍ塩酸−グリシン（ｐＨ２．２）のような酸性
バッファ−を用いて、レクチンを介してプレ−トに吸着
しているファ−ジを溶出させる。該溶出ファ−ジを大腸
菌に感染させて増殖させ、得られたファ−ジ溶液を、再
度レクチンとの結合反応およ非吸着ファ−ジの除去を行
う。これを４〜５回繰り返して、最終的に選択したファ
−ジを増殖させ、ファ−ジの顕示するペプチドのアミノ
酸配列をコ−ドするＤＮＡ塩基配列を、例えばシ−ケネ
スバ−ジョン２〔ユナイテッド ステイツス バイオケ
ミカル社（以下ＵＳＢ社という）製〕、を使用して決定
する。決定した配列に従って合成ペプチドを作製し、前
記レクチンとの結合がＧａｌＮＡｃによって阻害される
ペプチドを、目的とするペプチドとして選択できる。

【００４３】４）スク−ニングによって選ばれたペプチ
ドの作製 このようにして選択されたペプチドは、化学合成法で作
製することもできるし、遺伝子組換え法で作製すること
もできる。

【００４４】前記の選択されたペプチドは、化学合成法
によって得ることができる。例えば、マルチピンペプ
チド合成キット（カイロン社製）を使用する固層合成法
により合成することができる。また、多価抗原ペプチド
（以下ＭＡＰという）合成用レジン（カルビオケム−ノ
バジャパン社製）を使用して、ペプチド合成装置モデル
４３０Ａ〔アプライド バイオシステムズ社（以下ＡＢ
社という）製〕を使用する自動合成により合成すること
もできる。

【００４５】前記の選択されたペプチドは、遺伝子組換
え法によっても得ることができる。遺伝子組換え法を使
用した場合、免疫原性の高い蛋白質との融合蛋白として
も製造することが可能である。例えば、Ｐ．Ｍａｒｔｉ
ｎｅａｕ等の方法（ジ−ン 第１１３巻、３５頁 １９
９２年）に準じて得ることができる。即ち、ｐＭＡＬ−
ｐ２プラスミドＤＮＡ〔ニュ−イングランド バイオ
ラボ社（以下ＮＥＢ社という）製〕に含まれるマルト−
ス結合タンパク質（以下ＭＢＰという）構造遺伝子内部
の１３３番アミノ酸から１４２番アミノ酸までをコ−ド
する塩基配列を、上記の選択されたペプチドのアミノ酸
配列をコ−ドする塩基配列で置換し、組換えプラスミド
ＤＮＡを得る。得られた組換えプラスミドＤＮＡを、例
えばエレクトロポ−レ−タ−（ＢＲＬ社製：セルポレ−
タ− エレクトロポ−レ−ションシステム ＩＩＩ）を
使用するエレクトロポ−レション法により、大腸菌（例
えば大腸菌ＤＨ１０株）に導入して、形質導入大腸菌を
得る。得られた形質導入大腸菌を、蛋白融合−精製シス
テムマニュアル（ＮＥＢ社製）に準じて、イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下ＩＰＴＧとい
う）により、Ｔａｃプロモ−タ−を使用して、ＭＢＰ−
ペプチド融合タンパク質の産生誘導を行うことにより、
前記の選択されたペプチドを得ることができる。

【００４６】また、ワクチンとしての使用を考える場
合、遺伝子組換え法を用いると、１蛋白質当たりのエピ
ト−プ数を正確に決定できる点において、キャリア蛋白
質とエピト−プとを化学反応によりコンジュゲ−トさせ
る方法（キャンサ− リサ−チ、第４９巻、７０４５
頁、１９８９年）より優れている。以上のことにより、
目的とするペプチドを作製する方法としては、遺伝子組
換え法を使用するほうが好ましい。

【００４７】５）作製されたペプチドの、免疫原性の有
無の確認。 ａ）抗血清の作製 例えば、（村松 繁等編 実験生物学講座１４ 免疫生
物学 昭和６０年１月、丸善株式会社発行）に記載の方
法に従って、作製することができる。即ち、４〜６匹の
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、８週令）に対して、ペプチド
抗原５００μｇを溶解した生理食塩水１．５ミリリット
ルとフロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ
ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）１．５ミリリッ
トルとを混合して作製したエマルジョンを、腹腔内投与
する。その後、ペプチド抗原５００μｇを溶解した生理
食塩水１．５ミリリットルとフロイント不完全アジュバ
ント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄ
ｊｕｖａｎｔ）１．５ミリリットルとを混合して作製し
たエマルジョンを、２〜３週間間隔で腹腔内投与する。
４次感作終了後１週間目に、マウス心臓より全血採血
し、抗血清を得る。

【００４８】ｂ）抗血清の抗原特異性の確認 例えば、Ｈａｒｉｏｗ等〔Ｈａｒｉｏｗ等、Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（１９８８），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ〕の方法に準じて、ｅｎｚｙｍ
ｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓ
ｓａｙ（以下ＥＬＩＳＡ法という）によって確認するこ
とができる。即ち、ａＢＳＭを１μｇ／ウエルの濃度で
固相化した９６ウエルマイクロタイタ−プレ−トとハイ
ブリド−マ スクリ−ニングシステム（ファ−ミンジェ
ン社製）、２次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ
抗体（ザイメッド社製）およびアルカリフォスフォタ−
ゼ標識ストレプトアビジン（ベ−リンガ−マンハイム社
製）を使用して、ハイブリド−マ スクリ−ニングシス
テム マニュアル（ファ−ミンジェン社製）に記載の方
法に従って、抗血清中に抗ＴｎＩｇＧ抗体が誘導された
か否かを確認する。

【００４９】６）抗ペプチド血清の癌細胞障害活性の有
無の確認。 例えば、Ｋａｗａｓｈｉｍａ等〔ジャ−ナル オブ バ
イオケミストリ−、第１０８巻、１０９頁、１９９０
年）の方法に準じて行うことができる。即ち、ヒト末梢
血２０ミリリットルから、リンホプレップ（第１化学社
製）を使用して、単核球を分離する。得られた単核球
を、インタ−ロイキン３、単核コロニ−刺激因子、１０
％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地（ギブコ社製）で３
日間培養することによりエフェクタ−細胞とする。一
方、Ｔｎ抗原を発現しているＬＳ１８０大腸癌由来細胞
（大日本製薬社より購入）を、１０％ウシ胎児血清を含
むＤＭＥＭ培地（ギブコ社製）で培養して、標的癌細胞
とする。１（Ｘ）１０⁵ 個／ウエルの標的癌細胞に対し
て、，１（Ｘ）１０⁶ 個／ウエルのエフェクタ−細胞
＋終濃度が１００倍希釈となるように１０％ウシ胎児血
清を含むＤＭＥＭ培地で調製された抗ペプチド血清、
，１（Ｘ）１０⁶ 個／ウエルのエフェクタ−細胞＋終
濃度が１００倍希釈となるように１０％ウシ胎児血清を
含むＤＭＥＭ培地で調製された抗ａＢＳＭ抗体、又は
、１（Ｘ）１０⁶ 個／ウエルのエフェクタ−細胞＋１
０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地のみ、を添加す
る。添加後、２４時間インキュベ−トした培養液中の障
害細胞の割合を、Ｃｙｔｏｘ ９６キット（生化学工業
社製）を用いて解析する。

【００５０】

【実施例】これらのペプチドあるいは融合蛋白質を使用
すれば、癌細胞を殺傷する抗Ｔｎ抗体の産生を誘導する
ので、癌免疫療法に応用できる。以下に、本発明のペプ
チド抗原の製造方法を実施例により詳細に説明する。

【００５１】ＤＮＡ操作にあたり、〔Ｍａｎｉａｔｉｓ
等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９） Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ〕に記載の標準方法に準じて各操作を行った。

【００５２】実施例１：ペプチドライブラリ−の作製 Ｍ１３ファ−ジマイナ−コ−ト蛋白シグナル配列をコ−
ドするＤＮＡ塩基配列中に、制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉおよ
びＫｐｎＩの切断部位を導入する目的で、突然変異を誘
起するための配列１１

【００５３】

【化２１】

【００５４】で表わされる合成ＤＮＡを、ＤＮＡ合成装
置モデル３８１Ａ（ＡＢ社製）で合成し、合成ＤＮＡを
リン酸化するために、合成ＤＮＡ２００ｎｇを、リン酸
化バッファ−（組成：１０ｍＭ トリス塩酸、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭ ＤＴＴ）２０マイクロリットル
に溶解し、６０℃・５分間加熱した後、０℃に急冷し、
Ｔ4 ポリヌクレオチドキナ−ゼ（宝酒造社製）４Ｕおよ
び１０ｍＭ ＡＴＰ２マイクロリットルを添加し、３７
℃・１時間インキュベ−トした。

【００５５】得られたリン酸化合成ＤＮＡとＭ１３ｍｐ
８一本鎖ＤＮＡ（ニッポンジ−ン社製）とをアニ−リン
グさせ、Ｔ7 −ＧＥＮインビトロ突然変異導入キット
（ＵＢＳ社製）を用いて、該使用マニュアルの記載の方
法に準じて、マイナ−コ−ト蛋白シグナル配列コ−ド領
域に制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏ５２Ｉ切断部位を持
つ突然変異ファ−ジを作製した。さらにＥｃｏＲＩ切断
末端を有するカナマイシン耐性遺伝子（ファルマシア社
製）を該ファ−ジ二本鎖ＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断部位に
ｌａｃプロモ−タ−に対して順方向に組み込みペプチド
顕示ファ−ジベクタ−を作製した。

【００５６】次に、ランダムなアミノ酸配列のペプチド
をコ−ドするＤＮＡ断片を作製するため、配列１２

【００５７】

【化２２】

【００５８】（配列中、ＮはＧ、Ｔ、ＡまたはＣを示
し、ＫはＧまたはＴを示す）で表わされる合成ＤＮＡ
（１）および 配列１３

【００５９】

【化２３】

【００６０】（配列中、Ｎは前記と同じ意味を示し、Ｓ
はＡ又はＣを示す）で表わされる合成ＤＮＡ（２）をＤ
ＮＡ合成装置モデル３８１Ａで合成した。

【００６１】上記合成ＤＮＡ（１）２ｎｍｏｌおよび合
成ＤＮＡ（２）２ｎｍｏｌを、Ｔ4ポリヌクレオチドキ
ナ−ゼ反応液〔組成：１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭ ジチオスレイト
−ル、Ｔ4 ポリヌクレオチドキナ−ゼ ６０Ｕ、５ｍＭ
ＡＴＰ〕５０マイクロリットル中で、３７℃・１時間
インキュベ−トして、リン酸化した後、アニ−リングバ
ッファ−〔組成：２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭ ＮａＣｌ〕５０
０マイクロリットルを添加した後、９５℃で５分間加熱
後、６５℃に冷却し、更に２時間かけて徐々に室温にも
どした。二本鎖を形成したリン酸化合成ＤＮＡ（１）お
よび（２）とを、エタノ−ル沈殿法で回収した。該ＤＮ
Ａを、制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉ（宝酒造社製）およびＫｐ
ｎＩ（宝酒造社製）で切断・脱リン酸化処理したペプチ
ド顕示ファ−ジベクタ−二本鎖ＤＮＡ６０μｇと、ライ
ゲ−ションキット（宝酒造社製）を使用して結合させて
ランダムペプチド掲示組換えファ−ジＤＮＡを得た。

【００６２】得られたペプチド顕示組換えファ−ジＤＮ
Ａをエタノ−ル沈殿法で回収し、水１００マイクロリッ
トルに溶解した後、エレクトロポレ−タ−（ＢＲＬ社
製）を使用して、大腸菌ＤＨ１０株（ＢＲＬ社製）に導
入した。得られた形質転換菌の一部を採取し、カナマイ
シン耐性菌の出現頻度からライブラリ−の大きさを測定
すると、２（Ｘ）１０⁷ 個の独立したクロ−ンからなっ
ていることがわかった。

【００６３】残部の形質転換菌は、Ｌ培地５００ミリリ
ットルで３７℃・２時間でインキュベ−トした後、終濃
度が２０マイクログラムになるようにカナマイシンを添
加して１晩培養し、培養液を得た。得られた培養液を遠
心分離〔５０００ｇ（Ｘ）１０分間〕して得られた培養
上清に、溶液１（組成：２０％ポリエチレングリコ−
ル、３．５Ｍ 酢酸アンモニア）１２５ミリリットルを
加えた後、４℃・３０分間インキュベ−トを行い，遠心
分離〔５０００ｇ（Ｘ）１０分間〕してファ−ジを回収
し、ペプチドライブラリ−として以下の試験に供した。

【００６４】実施例２：ＶＶＡによるペプチドライブラ
リ−のスクリ−ニング 実施例１で得られたファ−ジ１０¹⁰〜１０¹¹個のファ−
ジとビオチン化ＶＶＡ（フナコシ社製）、ビオチン化Ｈ
ＰＡ（コスモバイオ社製）およびビオチン化ＳＳＡ（コ
スモバイオ社製）各々１μｇとを、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０（商標）を含むＴＢＳ溶液（組成：５０ｍＭ ト
リス塩酸 ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）２０マ
イクロリットルに溶解し、４℃で一晩インキュベ−トし
て、ペプチド発現ファ−ジ・レクチン複合体を得た。

【００６５】ペプチド顕示ファ−ジ・レクチン複合体吸
着用の固相として、１ミリリットルのストレプトアビジ
ン溶液〔組成：０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．
６）、１ｍｇ／ミリリットル ストレプトアビジン〕
を、ポリスチレン製シャ−レ（内径６０ｍｍ）に加えて
密封し、４℃で一晩インキュベ−トした後、０．５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０（商標）を含むＴＢＳ溶液６ミリリットル
で３回洗浄して、ストレプトアビジン処理シャ−レを作
製した。

【００６６】上記ペプチド顕示ファ−ジ・レクチン複合
体を含む溶液を、ＴＢＳ溶液２００マイクロリットルを
添加した後、上記のストレプトアビジン処理シャ−レ内
に加えた。室温・１５分間インキュベ−トした後、ペプ
チド発現ファ−ジ・レクチン複合体を含む溶液を除去
し、シャ−レを氷冷した０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（商
標）を含むＴＢＳ溶液６ミリリットルで洗浄した。洗浄
を７回繰り返して非特異的吸着ファ−ジを除いた。該シ
ャ−レに溶液２〔組成：０．１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ
２．２）、１ｍｇ／ミリリットル濃度のウシ血清アルブ
ミン（以下ＢＳＡという）〕４００マイクロリットルと
を加えて、室温・１５分間インキュベ−トし、シャ−レ
に吸着したファ−ジを溶出した。得られたファ−ジ溶出
溶液に２Ｍ トリス塩酸溶液２４マイクロリットルを加
えて中和した。中和後のファ−ジ溶出溶液は、セントリ
コン１００（グレ−スジャパン社製）を用いて、滅菌水
１ミリリットルで洗浄した後、７０マイクロリットルま
で濃縮し、レクチン結合ファ−ジ溶液とした。

【００６７】回収したファ−ジを増幅するためのファ−
ジ増幅用大腸菌液は以下のように調製した。大腸菌ＪＭ
１０９株（宝酒造社製）の３７℃・一晩培養液２ミリリ
ットルを、Ｌ培地１００ミリリットルに加えて、３７℃
で振盪培養し、菌液のＯＤ₅₅₀ が０．７を示した時点で
培養を停止し、遠心分離〔３０００ｇ（Ｘ）５分間〕し
て菌体を得た。得られた菌体を８０ｍＭ 塩化ナトリウ
ム水溶液１００ミリリットルに懸濁し、３７℃・４５分
間緩やかに振盪した後、菌懸濁液を遠心分離〔３０００
ｇ（Ｘ）５分間〕して菌体を得た。該菌体を溶液３〔組
成：８０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸アンモニウム
（ｐＨ７．０）〕５ミリリットルに懸濁した。該菌液に
８０％グリセロ−ル溶液０．８ミリリットルを加えて−
８０℃にストックした。

【００６８】上記レクチン結合ファ−ジ液７０マイクロ
リットルと上記ファ−ジ増幅用大腸菌液１００マイクロ
リットルとを混合してファ−ジ・大腸菌混合液を得た。
得られたファ−ジ・大腸菌混合液に、５倍Ｌ培地４５マ
イクロリットル、１００ｍＭＩＰＴＧ２．５マイクロリ
ットルと１００ｍｇ／ミリリットル チアミン溶液２．
５マイクロリットルとを添加して、室温・３０分間で培
養した。培養後のファ−ジ・大腸菌混合液を１２．５ｍ
ｇ／ミリリットルのカナマイシンを含むＬ寒天培地にま
き、３７℃・一晩培養した。寒天培地上に形成された大
腸菌とファ−ジを３ミリリットルのＬ培地に回収し、遠
心分離〔５０００ｇ（Ｘ）１０分間〕して菌体を除き、
上清に含まれるファ−ジを回収した。遠心分離は４回行
った。ファ−ジを含む上清に、溶液１（組成：２０％ポ
リエチレングリコ−ル、３．５Ｍ 酢酸アンモニア）
０．７５ミリリットルを加えて、４℃・３０分間インキ
ュベ−トした後、遠心分離〔５０００ｇ（Ｘ）５分間〕
してファ−ジを回収した。回収したファ−ジを滅菌水２
０マイクロリットルに溶解し、ファ−ジ溶解液を得て、
その５マイクロリットルをファ−ジ力価測定に使用し
た。

【００６９】ファ−ジ溶解液を、再度ＶＶＡを使用し
て、前記のスクリ−ニングを行った。選択されたファ−
ジが顕示しているペプチドのアミノ酸配列分析を同定す
るために、ファ−ジ１本鎖ＤＮＡを抽出し、シ−クエン
スプライマ−として、配列１４

【００７０】

【化２４】

【００７１】で表わされるＤＮＡを、ＤＮＡ合成装置モ
デル３８１Ａを使用して合成し、シ−ケナ−ゼバ−ジョ
ン２（ＵＳＢ社製）を用いて塩基配列分析を行った。そ
の結果、配列４（以下ペプチド−１という）および配列
５で表わされる、ＶＶＡに特異的に吸着するペプチドの
アミノ酸配列がわかった。その結果を表１

【００７２】

【表１】

【００７３】に示す。 実施例３：ＨＰＡによるペプチドライブラリ−のスクリ
−ニング ビオチン化ＶＶＡの代わりにビオチン化ＨＰＡ（コスモ
バイオ社製）を使用した他は、実施例２と同様にして、
配列６で表わされる、ＨＰＡに特異的に吸着するペプチ
ドのアミノ酸配列がわかった。その結果を表１に示す。

【００７４】実施例４：ＳＳＡによるペプチドライブラ
リ−のスクリ−ニング ビオチン化ＶＶＡの代わりにビオチン化ＳＳＡ（コスモ
バイオ社製）を使用した他は、実施例２と同様にして、
配列７、配列８、配列９、または配列１０で表わされ
る、ＳＳＡに特異的に吸着するペプチドのアミノ酸配列
がわかった。その結果を表１に示す。

【００７５】実施例５：マルチピンペプチド合成 上記で得られたペプチド−１と同様のアミノ酸配列を持
つペプチドをマルチピンペプチド合成法で合成した。マ
ルチピンペプチド合成は、マルチピンペプチド合成シス
テム用マニュアル（カイロン社製）に記載の方法に準じ
てマルチピンペプチド合成システムを使用して行った。

【００７６】合成ペプチドとレクチンとの結合反応は、
岡崎等〔実験医学、第１０巻、８８頁、（１９９２）〕
に記載の方法に従って、ＥＬＩＳＡ法によって解析し
た。ペプチド−１合成の終了したピンペプチドをＰＢＳ
Ｔ溶液〔組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％Ｔ
ｗｅｅｎ２０（商標）、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液〕で洗浄し、ブロッキング溶液（組成：１％ＢＳＡ
を含むＰＢＳ溶液）に浸して、室温で１時間ブロッキン
グした。各ウエルにビオチン化ＶＶＡ（１μｇ／ミリリ
ットル）溶液１５０マイクロリットルを入れた９６ウエ
ルマイクロタイタ−プレ−トに、アルカリホスホタ−ゼ
標識ストレプトアビジン溶液（ベ−リンガ−マンハイム
社製）１５０マイクロリットル加えた後に、ピンブロッ
クを乗せ、室温で１５分間反応させた。取り出したピン
ブロックをＰＢＳＴ溶液に浸して洗浄した後、各ウエル
に基質溶液（マウスハイブリド−マスクリ−ニングシス
テム、ファ−ミンゲン社製）１５０マイクロリットルを
加えた新しい９６ウエルマイクロタイタ−プレ−トに洗
浄済ピンブロックを乗せ、３７℃・１５分間インキュベ
−トした後、溶液のＯＤ₄₀₅ を測定して、ペプチド−１
のレクチン結合活性を確認した。ピン上に合成したペプ
チドに対して、ＶＶＡは用量依存的に結合した。その結
果を図２に示す。また、上記ビオチン化ＶＶＡ溶液に２
５０ｍｍｏｌガラクト−ス（以下Ｇａｌという）又は２
５０ｍｍｏｌ ＧａｌＮＡｃを添加すると、ＶＶＡとペ
プチドとの結合は、ＧａｌＮＡｃによってのみ強く阻害
された。その結果を図３に示す。

【００７７】マウス免疫実験に用いる多価ペプチド化ペ
プチド（以下ＭＡＰという）は、ＡＢ社ペプチド合成装
置モデル４３０Ａを使用し、合成用レジン（カルビオム
−ノバジャパン社製）１．２ｍｍｏｌを用いて合成し
た。得られた合成ペプチド−レジン混合物０．２〜０．
４ｇに、切り出し溶液〔組成；トリフルオロ酢酸：チオ
アニソ−ル：１，２−エタンジオ−ル：アニソ−ル（重
量比）＝９０：６：３：１〕１０ミリリットルを加え
て、丸底フラスコ内で室温（２０℃）・２時間攪拌した
後濾過した。レジンをトリフルオロ酢酸５ミリリットル
で３回洗浄した。洗浄液を合わせた後、得られた洗浄液
１５ミリリットルを約２ミリリットルに濃縮し、濾過溶
液中のペプチドは冷メチルブチルエ−テル４０ミリリッ
トルを加えて沈殿させた。得られた沈殿をジエチルエ−
テル１０ミリリットルで、３回洗浄し、乾燥後、１０％
酢酸に溶解した後に凍結乾燥してＭＡＰ化ペプチドを得
た。

【００７８】ＭＡＰ化ペプチド−１ １μｇを含む０．
１ｍｏｌ ＮａＨＣＯ₃ 水溶液１００マイクロリットル
を９６ウエルマイクロタイタ−プレ−トの各ウエルに加
え、４℃・一晩吸着させ、上記ブロッキング溶液でブロ
ッキングした後、ビオチン化レクチン溶液（１μｇ／１
ミリリットル）１０マイクロリットル加えて室温（２０
℃）・１時間インキュベ−トした。上記ＰＢＳＴ溶液で
３回洗浄した各ウエルに、アルカリホスホタ−ゼ標識ス
トレプトアビジン溶液を１００マイクロリットル添加
し、室温・１５分間反応させた後、ＰＢＳＴ溶液で３回
洗浄した。洗浄済各ウエルに基質溶液１００マイクロリ
ットルを添加し、３７℃・１５分間インキュベ−トした
後、溶液のＯＤ₄₀₅ を測定した。

【００７９】ＭＡＰ化ペプチド−１の各種レクチンとの
結合反応を図４および図５に示す。ＭＡＰ化ペプチド−
１は、ＶＶＡの他ＨＰＡ、ＳＳＡと結合し、そのＳＳＡ
との結合はＧａｌＮＡｃによって特異的に阻害された
が、ＧｌｃＮＡｃの認識レクチンであるＤａｔｕｒａ
ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ由来のレクチン（以下ＤＳＡとい
う）とは弱い結合しか示さないことがわかった。

【００８０】実施例６：ＭＡＰ化ペプチド−１によるマ
ウスの免疫と抗Ｔｎ抗体の産生誘導 ＭＡＰ化したペプチド−１の５００μｇを溶解した生理
食塩水溶液１．５ミリリットルと、フロイント完全アジ
ュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄ
ｊｕｖａｎｔ）１．５ミリリットルとを混合して作製し
た抗原＋完全アジュバンド混合物を、均等に６匹のＢＡ
ＬＢ／ｃマウス（雌、８週齢）に、腹腔内投与した（初
回投与）。更に、ＭＡＰ化したペプチド−１の５００μ
ｇを溶解した生理食塩水溶液１．５ミリリットルと、フ
ロイント不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎ
ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）１．５ミリリッ
トルとを混合して作製した抗原＋不完全アジュバント混
合物を、初回投与後１４日目、２８日目および４２日目
（最終投与）の計４回腹腔内投与して免疫させた。最終
投与後７日目に、血清を採取した。得られた血清をＰＢ
ＳＴ溶液で５０倍希釈して希釈血清を作製した。得られ
た希釈血清を、Ｔｎ抗原高発現蛋白であるａＢＳＭ、Ｔ
ｎ抗原低発現蛋白であるウシ顎下腺ムチン（以下ＢＳＭ
という）、複合糖鎖発現蛋白である卵白アルブミン（以
下ＯＶＡという）および糖鎖のない蛋白であるＢＳＡ１
μｇをコ−トした９６ウエルプレ−トに加え、２次抗体
としてのビオチン化抗マウスＩｇＧ兎抗体とアルカリホ
スホタ−ゼ標識ストレプトアビジンとを用いたＥＬＩＳ
Ａ法によって抗ＴｎＩｇＧの力価を測定した。

【００８１】その結果、図６〔図中、ＢＳＭはＴｎ陽
性、ａＢＳＭはＴｎ強陽性、ＯＶＡはＴｎ陰性、ＢＳＡ
はＴｎ陰性であり、ＭＡＰ化ペプチド−１免疫マウス抗
血清の使用濃度は５０倍希釈であり、無処理（ｎｏｒｍ
ａｌ）マウス血清の使用濃度は５０倍希釈であり、使用
したＧａｌＮＡｃ濃度は１００ｍＭであった。〕に示す
ように上記希釈血清は、ＶＶＡと同様にＢＳＭおよびａ
ＢＳＭに特異的に結合した。結合反応はＴｎ抗原構成糖
であるＧａｌＮＡｃ（１００ｍＭ）により阻害されたこ
とから、ＭＡＰ化されたペプチド−１免疫による抗Ｔｎ
抗体の産生誘導が確認された。

【００８２】実施例７：大腸菌マルト−ス結合蛋白質
（以下ＭＢＰという）−ペプチド融合蛋白発現プラスミ
ドの作製 Ｐ．Ｍａｒｔｉｎｅａｕ等の報告（ジ−ン、第１１３
巻、３５頁 １９９２年）に記載の方法に準じて行っ
た。概略は、図７および図８（図中、ｍａｌＥはＭＢＰ
構造遺伝子を示す）に示したとおりである。ｐＭＡＬ−
ｐ２ベクタ−ＤＮＡ（ニュ− イングランド バイオラ
ブ社製）を、制限酵素ＨｐａＩおよびＥｃｏＲＩで切断
して、ＭＢＰ構造遺伝子を含む約１．８ｋｂのＤＮＡ断
片をアガロ−ス電気泳動法で精製し、制限酵素ＳｍａＩ
およびＥｃｏＲＩで切断したＭ１３ｍｐ８二本鎖ＤＮＡ
（ニッポンジ−ン社製）に組み込み、大腸菌ＪＭ１０９
株に導入し、増殖させたＭ１３ファ−ジ粒子より、一本
鎖ＤＮＡを調製した。

【００８３】ＤＮＡ合成装置モデル３８１Ａを使用し
て、配列１５

【００８４】

【化２５】

【００８５】で表わされる合成ＤＮＡ（３）を作成し
た。得られた合成ＤＮＡ（３）を、実施例１と同様にリ
ン酸化した後、Ｔ7 −ＧＥＮインビトロ突然変異導入キ
ットを用いて、上記一本鎖ＤＮＡにアニ−リングさせ、
ＭＢＰ構造遺伝子内に目的の制限酵素ＢａｍＨＩ切断部
位を導入した。変異ＭＢＰ構造遺伝子を有するファ−ジ
２本鎖ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ ＩＩ
で切断して、約８００ｂｐのＤＮＡを分離し、アガロ−
ス電気泳動法で精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
Ｂｇｌ ＩＩで切断することにより、約８００ｂｐＤＮ
Ａ断片を除去したｐＭＡＬ−ｐ２ベクタ−ＤＮＡに組み
込み、目的とするペプチド発現用ベクタ−を作製した。

【００８６】ペプチド−１のアミノ酸配列の２回繰り返
しを含む配列１６

【００８７】

【化２６】

【００８８】で表わされるペプチドをコ−ドする配列１
７

【００８９】

【化２７】

【００９０】および配列１８

【００９１】

【化２８】

【００９２】を合成し、各々の２μｇをアニ−リングさ
せた後、ＤＮＡポリメラ−ゼＩクレノウ断片（宝酒造社
製）２Ｕと０．５ｍＭ ｄＮＴＰとを使用して、二本鎖
ＤＮＡに変換した。該二本鎖ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断
した後、同酵素で切断したペプチド発現用ベクタ−ＤＮ
Ａに組み込んだ（図８参照）。ペプチド発現用プラスミ
ドＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０株（ＢＲＬ社製）に導入して
形質変換菌を得た。

【００９３】ペプチド−１をコ−ドするＤＮＡ断片がマ
ルト−ス発現遺伝子に対して順方向（＋）又は逆方向
（−）に組み込まれたクロ−ンを選択し、組換え蛋白の
発現試験をニュ− イングランド バイオラブ社実験マ
ニュアルの記載に従って行った。菌体をサンプルバッフ
ァ−〔組成：５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ６．８）、１
００ｍＭ ＭＤＴＴ、２％ＳＤＳ、０．１％ ブロムフ
ェノ−ルブル−、１０％グリセロ−ル〕０．２ミリリッ
トルに懸濁し、１００℃・５分間加熱処理することによ
り可溶化した後、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動した後、抗ＶＶＡペプチドマウス血清及び抗ＭＢＰ兎
血清（ニュ− イングランド バイオラブ社製）を使用
するウェスタンブロッティングを行った。

【００９４】その結果、図９（図中、＋はＴａｃプロモ
−タ−転写方向に対して順方向に融合蛋白遺伝子配列が
組込まれたプラスミドを示し、−はＴａｃプロモ−タ−
転写方向に対して逆方向に融合蛋白遺伝子配列が組込ま
れたプラスミドを示す。）に示すように順方向（＋）に
ペプチド−１をコ−ドしたＤＮＡが挿入されたベクタ−
の保持菌のみに、予想された分子量約４０ｋｂの蛋白が
大量に発現していることがわかった。また、該蛋白は抗
ＭＢＰ兎血清及び抗ペプチド−１マウス血清と反応した
ことにより、ＭＢＰ−ペプチド−１融合蛋白の発現が確
認された。

【００９５】実施例８：免疫マウス抗血清およびヒト末
梢血単核球による癌細胞障害活性 ＭＡＰ化したペプチド−１の５００μｇ又はａＢＳＭの
１６０μｇを溶解した生理食塩水１ミリリットルと、フ
ロイント完全アジュバント１ミリリットルとを混合して
作製した抗原＋完全アジュバント混合物を、均等に４匹
のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、８週齢）に、腹腔内投与し
た（初回投与）。更に、ＭＡＰ化したペプチド−１の５
００μｇ又はａＢＳＭの１６０μｇを溶解した生理食塩
水１ミリリットルと、フロイント不完全アジュバント１
ミリリットルとを混合して作製した抗原＋不完全アジュ
バント混合物を、初回投与後２週間目、４週間目および
６週間目（最終投与）の計４回腹腔内投与して免疫させ
た。最終投与後７日目に、血清を採取した。得られた血
清をＰＢＳＴ溶液で１０００倍希釈して希釈血清を作製
した。得られた希釈血清を、ａＢＳＭ、ＢＳＭおよびＯ
ＶＡ１μｇを、それぞれコ−トした９６ウエルプレ−ト
に加え、２次抗体としてのビオチン化抗マウスＩｇＧ兎
抗体（ザイメッド社製）とアルカリホスホタ−ゼ標識ス
トレプトアビジン（ベ−リンガ−マンハイム社製）とを
使用したＥＬＩＳＡ法によって、抗ＴｎＩｇＧの力価を
測定した。

【００９６】その結果を、図１０（図中、ＭＡＰ化ペプ
チド−１免疫マウス抗血清の濃度は１０００倍希釈であ
る。）に示す。最も抗体価の高かったマウス１の血清を
使用して、試験管内の癌細胞障害試験を行った。ＩＭＤ
Ｍ培地（ギブコ社製）で２倍に希釈したヒト末梢血２０
ミリリットルを、リンホプレップ（第一化学社製）１５
ミリリットル上に静かに重層し、遠心分離〔８００ｇ
（Ｘ）２０分間〕してヒト単核球を分離した。該ヒト単
核球を〔インタ−ロイキン−３（以下ＩＬ−３という）
１０ｎｇ／ミリリットル、単球コロニ−刺激因子（以下
Ｍ−ＣＳＦという）５０ｎｇ／ミリリットルを含むＩＭ
ＤＭ＋１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）培地で３日間培養
しエフェクタ−細胞とした。Ｔｎ抗原を高発現している
ヒト大腸癌細胞株ＬＳ１８０（バイオケミ バイオリサ
−チ コミュニケ−ション 第１７０巻、９８１頁、１
９９０年）（大日本製薬社より購入）を使用した。ヒト
大腸癌細胞株ＬＳ１８０をＤＭＥＭ（ギブコ社製）＋１
０％ＦＣＳ培地を使用して、２４ウエルディッシュ（フ
ァルコン社製）中で１（Ｘ）１０⁵ ／ウエルの細胞濃度
になるまで培養した後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地で
２回洗浄した。

【００９７】該ヒト大腸癌細胞株ＬＳ１８０の付着して
いるウエルに、ＩＭＤＭ＋５％ＦＣＳ培地で２回洗浄し
た後、１（Ｘ）１０⁶ ／４９５マイクロリットルの細胞
濃度に調製したエフェクタ−細胞を加え、さらに抗ａＢ
ＳＭマウス血清又は抗ペプチド−１マウス血清を５マイ
クロリットル加えた。なお、抗血清の代わりにＩＭＤＭ
＋５％ＦＣＳ培地５マイクロリットルを加えたコントロ
−ルを設けた。炭酸ガス培養器（ヤマト科学社製、３７
℃、ＣＯ₂ 濃度５％）中で２４時間培養した後、ウエル
より培地を回収して９６ウエルプレ−トに移して、Ｃｙ
ｔｏｘ９６キット（生化学工業社製）を使用して、障害
を受けたタ−ゲット細胞の割合を求めた。その結果を、
図１１〔図中、タ−ゲット細胞はＬＳ１８０。エフェク
タ−細胞は、ヒト末梢血単核球。抗血清はａＢＳＭ免疫
マウス血清（１００倍希釈）および実施例７のマウス１
の血清（１００倍希釈）を使用した。〕に示す。その結
果、抗ペプチド血清にエフェクタ−細胞を介する細胞障
害活性が認められた。

【００９８】

【図面の簡単な説明】

【図１】ファ−ジを用いたペプチドライブラリ−の作製
法の概略を表す。

【図２】ペプチド−１とＶＶＡとの用量依存的結合を表
す。

【図３】ペプチド−１とＶＶＡとの結合反応のＧａｌＮ
Ａｃによる阻害を表す。

【図４】ＭＡＰ化ペプチド−１とＶＶＡ、ＨＰＡ、ＳＳ
ＡまたはＤＳＡとの結合反応と該結合反応のＧａｌＮＡ
ｃによる阻害を表す。

【図５】ＭＡＰ化ペプチド−１とＳＳＡとの結合反応と
該結合反応のＧａｌＮＡｃによる阻害を表す。

【図６】ＭＡＰ化ペプチド−１免疫マウス抗血清、無処
理（ｎｏｒｍａｌ）マウス血清およびＶＶＡの糖蛋白と
の反応性をＥＬＩＳＡにより分析した結果を表す。

【図７】ＭＢＰ−ペプチド融合蛋白発現ベクタ−の作製
方法を表す。

【図８】ＭＢＰ−ペプチド融合蛋白発現プラスミドの作
製方法を表す。

【図９】大腸菌に発現させたペプチド−１の２量体＋大
腸菌ＭＢＰ融合蛋白質の電気泳動による分子量測定並び
に該蛋白質と抗ＭＢＰ血清又は抗ポリペプチド−１血清
との反応を表す。

【図１０】抗血清依存細胞障害試験に用いたＭＡＰ化ペ
プチド−１免疫マウス抗血清の糖蛋白との反応性をＥＬ
ＩＳＡ法で分析した結果を表す。

【図１１】抗血清依存細胞障害試験結果。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 癌関連糖鎖Ｔｎ抗原結合レクチンに結合
   するペプチド。
2. 【請求項２】 癌関連糖鎖Ｔｎ抗原に対する抗体産生を
   誘導する免疫原性を有する請求項１記載のペプチド。
3. 【請求項３】 該抗原結合レクチンがＶｉｃｉａ ｖｉ
   ｌｌｏｓａ、Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ又はＳａｌｖ
   ｉａ ｓｃｌａｒｅａ由来である請求項１記載のペプチ
   ド。
4. 【請求項４】 配列１ 【化１】 （式中、Ｘ１およびＸ６は、同一または異なって、Ａｒ
   ｇ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｌａを示し、Ｘ２およびＸ
   ３はＳｅｒまたはＴｈｒを示し、Ｘ４およびＸ５は、同
   一または異なって、芳香族アミノ酸又は脂肪族アミノ酸
   を示し、Ｘ７はＧｌｎ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒを
   示す）で表わされるアミノ酸配列を有する請求項１記載
   のペプチド。
5. 【請求項５】 配列２ 【化２】 （式中、Ｙ１およびＹ４は、同一または異なって、Ａｒ
   ｇ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｓｎを示し、Ｙ２およびＹ
   ３は、同一または異なって、芳香族アミノ酸、脂肪族ア
   ミノ酸又はＭｅｔを示す）で表わされるアミノ酸配列を
   有する請求項１記載のペプチド。
6. 【請求項６】 配列３ 【化３】 （式中、Ｚ１はＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓを示し、Ｚ２
   はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＬｙｓを示
   す）で表されるアミノ酸配列を有する請求項１記載のペ
   プチド。
7. 【請求項７】 配列４ 【化４】 を有する請求項１記載のペプチド。
8. 【請求項８】 配列５ 【化５】 を有する請求項１記載のペプチド。
9. 【請求項９】 配列６ 【化６】 を有する請求項１記載のペプチド。
10. 【請求項１０】 配列７ 【化７】 を有する請求項１記載のペプチド。
11. 【請求項１１】 配列８ 【化８】 を有する請求項１記載のペプチド。
12. 【請求項１２】 配列９ 【化９】 を有する請求項１記載のペプチド。
13. 【請求項１３】 配列１０ 【化１０】 を有する請求項１記載のペプチド。