JPH10191982A - レジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブおよびレジオネラ属に属する細菌の検出方法 - Google Patents
レジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブおよびレジオネラ属に属する細菌の検出方法Info
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- JPH10191982A JPH10191982A JP9005050A JP505097A JPH10191982A JP H10191982 A JPH10191982 A JP H10191982A JP 9005050 A JP9005050 A JP 9005050A JP 505097 A JP505097 A JP 505097A JP H10191982 A JPH10191982 A JP H10191982A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種
類のプローブで特異的に高精度で検出することができ、
しかも容易に調製することができるレジオネラ属細菌検
出用のオリゴヌクレオチドプローブを提供し、これを用
いてレジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ
属細菌を特異的に高精度で検出する。 【解決手段】 塩基配列5'AGC AAA CGC GAT AAG TTG AC
3'を有するオリゴヌクレオチドプローブを放射性元素、
酵素、蛍光物質または化学物質で標識してなる標識オリ
ゴヌクレオチドプローブを、レジオネラ属に属する細菌
またはそのＤＮＡに接触させてハイブリダイゼーション
を行った後、標識を指標にしてレジオネラ（Legionell
a）属に属する細菌を検出する。
類のプローブで特異的に高精度で検出することができ、
しかも容易に調製することができるレジオネラ属細菌検
出用のオリゴヌクレオチドプローブを提供し、これを用
いてレジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ
属細菌を特異的に高精度で検出する。 【解決手段】 塩基配列5'AGC AAA CGC GAT AAG TTG AC
3'を有するオリゴヌクレオチドプローブを放射性元素、
酵素、蛍光物質または化学物質で標識してなる標識オリ
ゴヌクレオチドプローブを、レジオネラ属に属する細菌
またはそのＤＮＡに接触させてハイブリダイゼーション
を行った後、標識を指標にしてレジオネラ（Legionell
a）属に属する細菌を検出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、レジオネラ（Legi
onella）属に属する細菌（以下、レジオネラ属細菌とい
う場合がある）を検出、同定または定量するためのオリ
ゴヌクレオチドプローブおよび標識オリゴヌクレオチド
プローブ、この標識オリゴヌクレオチドプローブを含む
レジオネラ属細菌検出用試薬、ならびにこれらを用いた
レジオネラ属細菌の検出方法である。
onella）属に属する細菌（以下、レジオネラ属細菌とい
う場合がある）を検出、同定または定量するためのオリ
ゴヌクレオチドプローブおよび標識オリゴヌクレオチド
プローブ、この標識オリゴヌクレオチドプローブを含む
レジオネラ属細菌検出用試薬、ならびにこれらを用いた
レジオネラ属細菌の検出方法である。
【０００２】
【従来の技術】環境中からのレジオネラ検出では、通常
低ｐＨ処理後WYOαなどのレジオネラ選択培地による培
養によりレジオネラの定量を行っている。しかし、レジ
オネラ属に共通でかつ特異的な形態、生化学的性質は報
告されておらず、このためコロニーが形成された後に栄
養要求性やグラム染色、形態観察、抗体との反応性など
を試験し、これらのいくつかの同定試験結果からレジオ
ネラかどうか判断している。
低ｐＨ処理後WYOαなどのレジオネラ選択培地による培
養によりレジオネラの定量を行っている。しかし、レジ
オネラ属に共通でかつ特異的な形態、生化学的性質は報
告されておらず、このためコロニーが形成された後に栄
養要求性やグラム染色、形態観察、抗体との反応性など
を試験し、これらのいくつかの同定試験結果からレジオ
ネラかどうか判断している。
【０００３】すなわち培養による方法では、コロニーが
レジオネラ特有の色、形、その他の特徴を示すまでには
５〜１０日間必要であり、また完全な選択培地ではない
ため、生ずるコロニーの中にはレジオネラと類似するコ
ロニーを形成する菌もあり、コロニーを釣菌して栄養要
求性やグラム染色などの同定が必須である。このためレ
ジオネラ細菌の検出に２週間程度の長期間を要するとい
う問題点がある。またレジオネラが生育していた環境中
の生育条件と、選択培地を用いた生育条件とは大きく異
なり、レジオネラの生理状態によっては培地上でコロニ
ーを形成しない場合も十分考えられるという問題点もあ
る。
レジオネラ特有の色、形、その他の特徴を示すまでには
５〜１０日間必要であり、また完全な選択培地ではない
ため、生ずるコロニーの中にはレジオネラと類似するコ
ロニーを形成する菌もあり、コロニーを釣菌して栄養要
求性やグラム染色などの同定が必須である。このためレ
ジオネラ細菌の検出に２週間程度の長期間を要するとい
う問題点がある。またレジオネラが生育していた環境中
の生育条件と、選択培地を用いた生育条件とは大きく異
なり、レジオネラの生理状態によっては培地上でコロニ
ーを形成しない場合も十分考えられるという問題点もあ
る。
【０００４】レジオネラを検出、定量する別の手段とし
て抗体を用いる方法があるが、レジオネラ属の広い範囲
の種を検出できる抗体は報告されていない。また抗体を
用いる方法は、抗体を得るまでに手間と時間がかかると
いう問題点がある。
て抗体を用いる方法があるが、レジオネラ属の広い範囲
の種を検出できる抗体は報告されていない。また抗体を
用いる方法は、抗体を得るまでに手間と時間がかかると
いう問題点がある。
【０００５】ところで、特開昭61-88900号には、ＤＮＡ
プローブを用いたレジオネラの検出方法が記載されてい
る。しかし、この方法はゲノムＤＮＡを制限酵素で部分
分解して一定の分離操作後に得られるゲノムＤＮＡの断
片混合物を用いているので、全く同様の断片混合物を繰
返し得ることが困難であり、ロットにより特異性に差が
生じるという問題点がある。また、いわゆるin situハ
イブリダイゼーションに用いることができないという問
題点がある。さらに、ゲノムＤＮＡ断片混合物をプロー
ブとして使用する場合、検出対象としている部分が明ら
かではなく、得られた結果の学問的意味付けが困難であ
る。
プローブを用いたレジオネラの検出方法が記載されてい
る。しかし、この方法はゲノムＤＮＡを制限酵素で部分
分解して一定の分離操作後に得られるゲノムＤＮＡの断
片混合物を用いているので、全く同様の断片混合物を繰
返し得ることが困難であり、ロットにより特異性に差が
生じるという問題点がある。また、いわゆるin situハ
イブリダイゼーションに用いることができないという問
題点がある。さらに、ゲノムＤＮＡ断片混合物をプロー
ブとして使用する場合、検出対象としている部分が明ら
かではなく、得られた結果の学問的意味付けが困難であ
る。
【０００６】また特公平5-78319号には、核酸プローブ
を用いて生物を検出、同定または定量する方法が記載さ
れており、その実施例には２３種のレジオネラ種、具体
的にはL. pnueumophila(PHA1), L. micdadei(HEBA), L.
bozemanii(WIGA), L. dumoffi(TEX-KL), L. garmanii
(LS-13), L. jordanis(BL540), L. longbeachae, L. MS
H9, L. oakridgenis(オークリツジ10), L. lansing2,
L. SC-32C-C8, L. WA-316, L. WO-44-3C(L. feeleii),
L. phoenix 1, L. WA-270A, L. PF-209C-C2, L.SC 65C3
(ORW), L. jamestown 26G1-E2, L. MSH-4, L. lansing
3, L. SC18-C9,L. SC63-C7, L-81-716(L. wadsworthii)
を特異的に検出することができる例証的プローブが記載
されている。しかし、この核酸プローブも混合物であ
り、前記と同様の問題点がある。またプローブの塩基の
長さや配列が明らかではなく、ｒＲＮＡのどの部分を認
識しているのか不明確であり、検出精度に問題がある。
を用いて生物を検出、同定または定量する方法が記載さ
れており、その実施例には２３種のレジオネラ種、具体
的にはL. pnueumophila(PHA1), L. micdadei(HEBA), L.
bozemanii(WIGA), L. dumoffi(TEX-KL), L. garmanii
(LS-13), L. jordanis(BL540), L. longbeachae, L. MS
H9, L. oakridgenis(オークリツジ10), L. lansing2,
L. SC-32C-C8, L. WA-316, L. WO-44-3C(L. feeleii),
L. phoenix 1, L. WA-270A, L. PF-209C-C2, L.SC 65C3
(ORW), L. jamestown 26G1-E2, L. MSH-4, L. lansing
3, L. SC18-C9,L. SC63-C7, L-81-716(L. wadsworthii)
を特異的に検出することができる例証的プローブが記載
されている。しかし、この核酸プローブも混合物であ
り、前記と同様の問題点がある。またプローブの塩基の
長さや配列が明らかではなく、ｒＲＮＡのどの部分を認
識しているのか不明確であり、検出精度に問題がある。
【０００７】また特表平1-503356号には、特定の配列を
有する核酸プローブを用いたレジオネラの検出方法が記
載され、実施例において３種の混合したプローブを用い
て、２１種類（血清型を除く）のレジオネラ種を検出し
ている。対象とされたレジオネラ種を表１に示す。
有する核酸プローブを用いたレジオネラの検出方法が記
載され、実施例において３種の混合したプローブを用い
て、２１種類（血清型を除く）のレジオネラ種を検出し
ている。対象とされたレジオネラ種を表１に示す。
【０００８】
【表１】
【０００９】しかし上記検出方法では、３種類のプロー
ブを調製して用いる必要があり、また知られている３８
種のレジオネラ（１９９４）の約５５％しか試験されて
おらず、残り４５％を検出できるかどうか不明であると
いう問題点がある。
ブを調製して用いる必要があり、また知られている３８
種のレジオネラ（１９９４）の約５５％しか試験されて
おらず、残り４５％を検出できるかどうか不明であると
いう問題点がある。
【００１０】また特表平5-507206号にも、特定の配列を
有するプローブを用いたレジオネラ種の検出方法が記載
されている。しかしこのプローブは、レジオネラに特異
的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅された配列を検出
するためのものであり、プローブのレジオネラ特異性が
明らかではないという問題点がある。
有するプローブを用いたレジオネラ種の検出方法が記載
されている。しかしこのプローブは、レジオネラに特異
的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅された配列を検出
するためのものであり、プローブのレジオネラ特異性が
明らかではないという問題点がある。
【００１１】また、In situ identification of Legion
ellaceae using 16S rRNA-targetedoligonucleotide pr
obes and confocal laser scanning microscopy, Werne
r Manz, Rudolf Amann et. al. Microbiology(1995), 1
41, 29-39には、レジオネラファミリーを検出するため
のプローブとして、２種類のプローブの評価結果が報告
されている。一つは16SrRNAの226-243（大腸菌の16SrRN
Aナンバーリング）をターゲットとするプローブ、もう
一つは同705-722をターゲットとするプローブである。
ellaceae using 16S rRNA-targetedoligonucleotide pr
obes and confocal laser scanning microscopy, Werne
r Manz, Rudolf Amann et. al. Microbiology(1995), 1
41, 29-39には、レジオネラファミリーを検出するため
のプローブとして、２種類のプローブの評価結果が報告
されている。一つは16SrRNAの226-243（大腸菌の16SrRN
Aナンバーリング）をターゲットとするプローブ、もう
一つは同705-722をターゲットとするプローブである。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、短時
間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで
特異的に高精度で検出することができ、しかも容易に調
製することができるレジオネラ属細菌検出用のオリゴヌ
クレオチドプローブを提供し、これを用いてレジオネラ
属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異的
に高精度で検出することである。
間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類のプローブで
特異的に高精度で検出することができ、しかも容易に調
製することができるレジオネラ属細菌検出用のオリゴヌ
クレオチドプローブを提供し、これを用いてレジオネラ
属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を特異的
に高精度で検出することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、次のレジオネ
ラ属細菌検出用のオリゴヌクレオチドプローブおよび標
識オリゴヌクレオチドプローブ、この標識オリゴヌクレ
オチドプローブを含むレジオネラ属細菌検出用試薬、な
らびにこれらを用いたレジオネラ属細菌の検出方法であ
る。 （１）デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチ
ドからなり、レジオネラ（Legionella）属に属する細菌
の16SrRNAの可変領域に相補的な配列を持つプローブで
あって、塩基配列5'AGC AAA CGC GAT AAG TTG AC3'を有
することを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用
オリゴヌクレオチドプローブ。 （２）上記（１）記載のオリゴヌクレオチドプローブを
放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質で標識して
なることを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用
標識オリゴヌクレオチドプローブ。 （３）上記（２）記載の標識オリゴヌクレオチドプロー
ブを含むことを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検
出用試薬。 （４）レジオネラ属に属する細菌、そのDNAまたはrRNA
を含む検体に上記（２）記載の標識オリゴヌクレオチド
プローブまたは上記（３）記載の試薬を接触させてハイ
ブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出
することを特徴とするレジオネラ属に属する細菌の検出
方法。
ラ属細菌検出用のオリゴヌクレオチドプローブおよび標
識オリゴヌクレオチドプローブ、この標識オリゴヌクレ
オチドプローブを含むレジオネラ属細菌検出用試薬、な
らびにこれらを用いたレジオネラ属細菌の検出方法であ
る。 （１）デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチ
ドからなり、レジオネラ（Legionella）属に属する細菌
の16SrRNAの可変領域に相補的な配列を持つプローブで
あって、塩基配列5'AGC AAA CGC GAT AAG TTG AC3'を有
することを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用
オリゴヌクレオチドプローブ。 （２）上記（１）記載のオリゴヌクレオチドプローブを
放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質で標識して
なることを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検出用
標識オリゴヌクレオチドプローブ。 （３）上記（２）記載の標識オリゴヌクレオチドプロー
ブを含むことを特徴とするレジオネラ属に属する細菌検
出用試薬。 （４）レジオネラ属に属する細菌、そのDNAまたはrRNA
を含む検体に上記（２）記載の標識オリゴヌクレオチド
プローブまたは上記（３）記載の試薬を接触させてハイ
ブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出
することを特徴とするレジオネラ属に属する細菌の検出
方法。
【００１４】本発明のプローブは既知のレジオネラ16Sr
RNAの可変領域に相補的な配列のなかから、レジオネラ
属に保存性の良く、かつ他の属と相違する部分を選び出
すことによって得られたものである。すなわち本発明の
プローブの配列は、レジオネラ ニューモフィラ（Legi
onella pneumophila）および他のレジオネラの16SrRNA
をコードするDNAの塩基配列871-890（大腸菌16SrRNAの
ナンバーリング）に相当する。従って本発明のプローブ
の配列は、レジオネラ ニューモフィラ（Legionella p
neumophila）および他のレジオネラの16SrRNAをコード
するDNAの塩基配列871-890（大腸菌16SrRNAのナンバー
リング）の相補的配列、または16SrRNAの塩基配列871-8
90（大腸菌16SrRNAのナンバーリング）をターゲットに
し、これらの配列を認識するに足るものである。
RNAの可変領域に相補的な配列のなかから、レジオネラ
属に保存性の良く、かつ他の属と相違する部分を選び出
すことによって得られたものである。すなわち本発明の
プローブの配列は、レジオネラ ニューモフィラ（Legi
onella pneumophila）および他のレジオネラの16SrRNA
をコードするDNAの塩基配列871-890（大腸菌16SrRNAの
ナンバーリング）に相当する。従って本発明のプローブ
の配列は、レジオネラ ニューモフィラ（Legionella p
neumophila）および他のレジオネラの16SrRNAをコード
するDNAの塩基配列871-890（大腸菌16SrRNAのナンバー
リング）の相補的配列、または16SrRNAの塩基配列871-8
90（大腸菌16SrRNAのナンバーリング）をターゲットに
し、これらの配列を認識するに足るものである。
【００１５】Escherichia coli、Ps. aeruginosa、Legi
onella pneumophiliaおよび他のLegionellaの16SrRNA配
列の一部の塩基配列を表２に示す。
onella pneumophiliaおよび他のLegionellaの16SrRNA配
列の一部の塩基配列を表２に示す。
【表２】
【００１６】本発明のプローブは、前記のように塩基配
列が明らかで、塩基配列の長さも２０塩基程度であるた
め、ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドから化学
合成により容易に合成することができる。このため、同
一のプローブを何度でも容易に得ることができ、ロット
により特異性が異なるということはない。また本発明の
プローブは塩基数が比較的短いことから、in situハイ
ブリダイゼーションに用いることもでき、しかも一種類
のプローブから検出できるレジオネラ属細菌の種類も多
い。これらの点から、検出試薬として優れている。
列が明らかで、塩基配列の長さも２０塩基程度であるた
め、ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドから化学
合成により容易に合成することができる。このため、同
一のプローブを何度でも容易に得ることができ、ロット
により特異性が異なるということはない。また本発明の
プローブは塩基数が比較的短いことから、in situハイ
ブリダイゼーションに用いることもでき、しかも一種類
のプローブから検出できるレジオネラ属細菌の種類も多
い。これらの点から、検出試薬として優れている。
【００１７】本発明のレジオネラ属に属する細菌検出用
標識オリゴヌクレオチドプローブは、前記プローブを放
射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質などの標識物
質で標識したプローブである。このような標識物質とし
ては従来から使用されている標識物質が使用でき、具体
的なものとしては32Ｐ等の放射性元素；ＦＩＴＣ、ロー
ダミン等の蛍光物質；ジコキシゲニン等のハプテン；ア
ルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素；
ビオチン等の生化学物質などがあげられる。これらの標
識物質は、公知の方法でプローブに導入することができ
る。
標識オリゴヌクレオチドプローブは、前記プローブを放
射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質などの標識物
質で標識したプローブである。このような標識物質とし
ては従来から使用されている標識物質が使用でき、具体
的なものとしては32Ｐ等の放射性元素；ＦＩＴＣ、ロー
ダミン等の蛍光物質；ジコキシゲニン等のハプテン；ア
ルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素；
ビオチン等の生化学物質などがあげられる。これらの標
識物質は、公知の方法でプローブに導入することができ
る。
【００１８】本発明のレジオネラ属に属する細菌検出用
試薬は上記標識オリゴヌクレオチドプローブを含むもの
であり、標識オリゴヌクレオチドプローブだけからなっ
ていてもよく、また緩衝液などに溶解したものでもよ
く、またレジオネラ属細菌とのハイブリダイゼーション
を容易に実施することができるようにキット化されたも
のでもよい。
試薬は上記標識オリゴヌクレオチドプローブを含むもの
であり、標識オリゴヌクレオチドプローブだけからなっ
ていてもよく、また緩衝液などに溶解したものでもよ
く、またレジオネラ属細菌とのハイブリダイゼーション
を容易に実施することができるようにキット化されたも
のでもよい。
【００１９】本発明の標識オリゴヌクレオチドプローブ
またはこれを含む試薬は、レジオネラ属細菌またはこの
DNAを含む検体とハイブリダイゼーションを実施し、そ
の後標識物質を指標にして検出することにより、例えば
放射能、発色、蛍光、発光などを指標にして検出するこ
とにより、プローブがハイブリダイゼーションしたレジ
オネラ属細菌を特異的に高精度で、目視や顕微鏡等によ
り容易に検出、同定または定量することができる。
またはこれを含む試薬は、レジオネラ属細菌またはこの
DNAを含む検体とハイブリダイゼーションを実施し、そ
の後標識物質を指標にして検出することにより、例えば
放射能、発色、蛍光、発光などを指標にして検出するこ
とにより、プローブがハイブリダイゼーションしたレジ
オネラ属細菌を特異的に高精度で、目視や顕微鏡等によ
り容易に検出、同定または定量することができる。
【００２０】本発明のプローブは一種類で検出、同定ま
たは定量することができるレジオネラ属細菌の種の種類
が多く、少なくともレジオネラ３４種（後記表３参照）
を検出することができる。このように本発明のプローブ
は、従来のプローブに比べて、一種類のプローブでより
多くの種の種類のレジオネラを検出することができる。
たは定量することができるレジオネラ属細菌の種の種類
が多く、少なくともレジオネラ３４種（後記表３参照）
を検出することができる。このように本発明のプローブ
は、従来のプローブに比べて、一種類のプローブでより
多くの種の種類のレジオネラを検出することができる。
【００２１】本発明の検出方法は、前記標識オリゴヌク
レオチドプローブまたは試薬を、レジオネラ属に属する
細菌またはそのDNAを含む検体に接触させてハイブリダ
イゼーションを行った後、標識を指標にしてレジオネラ
属細菌を検出する方法である。ハイブリダイゼーション
は従来と同様の方法により行うことができる。例えば、
細菌を対象とする場合は、ナイロンフィルターなどのフ
ィルターに菌体をしみ込ませ、フィルター上で溶菌操作
を行った後、紫外線照射または８０℃以上の高温にする
ことにより、レジオネラ属細菌のDNAをフィルター上に
固定する。このフィルターをハイブリダイゼーション溶
液に通常１時間以上浸したのち、さらに標識オリゴヌク
レオチドを添加したハイブリダイゼーション溶液に浸漬
し、２〜２４時間反応させる。ハイブリダイゼーション
時の温度は、十分な特異性および検出感度を示す温度を
選択するのが好ましく、通常プローブのＴｍ値マイナス
５〜１０℃を目安にする。十分な特異性および検出感度
を示す温度は、予め実験により求めることができる。プ
ローブと反応が終了したフィルターは緩衝液で洗浄し、
非特異的な結合をしているプローブを除去する。洗浄は
緩衝液を新しいものに交換して２〜３回行うのが好まし
い。洗浄時の温度は、十分な感度を保つ温度で行うのが
好ましく、通常ハイブリダイゼーションの温度よりも低
く設定される。十分な感度を保つ温度は、予め実験によ
り求めることができる。
レオチドプローブまたは試薬を、レジオネラ属に属する
細菌またはそのDNAを含む検体に接触させてハイブリダ
イゼーションを行った後、標識を指標にしてレジオネラ
属細菌を検出する方法である。ハイブリダイゼーション
は従来と同様の方法により行うことができる。例えば、
細菌を対象とする場合は、ナイロンフィルターなどのフ
ィルターに菌体をしみ込ませ、フィルター上で溶菌操作
を行った後、紫外線照射または８０℃以上の高温にする
ことにより、レジオネラ属細菌のDNAをフィルター上に
固定する。このフィルターをハイブリダイゼーション溶
液に通常１時間以上浸したのち、さらに標識オリゴヌク
レオチドを添加したハイブリダイゼーション溶液に浸漬
し、２〜２４時間反応させる。ハイブリダイゼーション
時の温度は、十分な特異性および検出感度を示す温度を
選択するのが好ましく、通常プローブのＴｍ値マイナス
５〜１０℃を目安にする。十分な特異性および検出感度
を示す温度は、予め実験により求めることができる。プ
ローブと反応が終了したフィルターは緩衝液で洗浄し、
非特異的な結合をしているプローブを除去する。洗浄は
緩衝液を新しいものに交換して２〜３回行うのが好まし
い。洗浄時の温度は、十分な感度を保つ温度で行うのが
好ましく、通常ハイブリダイゼーションの温度よりも低
く設定される。十分な感度を保つ温度は、予め実験によ
り求めることができる。
【００２２】ハイブリダイゼーション後の検出は、標識
物質の種類に応じて公知の方法により行うことができ
る。例えば、放射性元素で標識した場合は公知の方法で
放射能を測定することにより検出できる。また酵素で標
識した場合は公知の方法で酵素活性を測定することによ
り検出できる。また螢光物質で標識した場合は公知の方
法により光量を測定することにより検出できる。また抗
原または抗体で標識した場合は、標識した抗原または抗
体と特異的に反応する抗体または抗原を用いて抗原抗体
反応させ、反応生成物を公知の方法により測定すること
により検出できる。
物質の種類に応じて公知の方法により行うことができ
る。例えば、放射性元素で標識した場合は公知の方法で
放射能を測定することにより検出できる。また酵素で標
識した場合は公知の方法で酵素活性を測定することによ
り検出できる。また螢光物質で標識した場合は公知の方
法により光量を測定することにより検出できる。また抗
原または抗体で標識した場合は、標識した抗原または抗
体と特異的に反応する抗体または抗原を用いて抗原抗体
反応させ、反応生成物を公知の方法により測定すること
により検出できる。
【００２３】このように本発明のプローブを用いること
により、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ属の
広範囲のレジオネラ種を特異的に検出することができ
る。このため、従来行っていたレジオネラコロニーの複
数の同定操作を省略することができ、検出を容易に行う
ことができる。すなわち、従来の培養方法では一つ一つ
のコロニーを釣菌して同定に供さなくてはならないが、
本発明のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行うことにより、例えば培地プレートに生育して
いるコロニーすべてについてレジオネラであるかどうか
一度に判別することができる。また、原理的に培養によ
る検出では、培養できないレジオネラは検出対象外であ
ったが、本発明の検出方法では培養できないレジオネラ
種も検出可能である。また、環境中の生物膜や生物組織
中でレジオネラがどのように分布しているかということ
を明らかすることも可能である。さらにプローブがゲノ
ムＤＮＡ断片混合物ではないので、同じ性能のプローブ
を容易に入手できる。
により、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ属の
広範囲のレジオネラ種を特異的に検出することができ
る。このため、従来行っていたレジオネラコロニーの複
数の同定操作を省略することができ、検出を容易に行う
ことができる。すなわち、従来の培養方法では一つ一つ
のコロニーを釣菌して同定に供さなくてはならないが、
本発明のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行うことにより、例えば培地プレートに生育して
いるコロニーすべてについてレジオネラであるかどうか
一度に判別することができる。また、原理的に培養によ
る検出では、培養できないレジオネラは検出対象外であ
ったが、本発明の検出方法では培養できないレジオネラ
種も検出可能である。また、環境中の生物膜や生物組織
中でレジオネラがどのように分布しているかということ
を明らかすることも可能である。さらにプローブがゲノ
ムＤＮＡ断片混合物ではないので、同じ性能のプローブ
を容易に入手できる。
【００２４】
実施例および比較例 １）オリゴヌクレオチドプローブの調製 本発明のプローブを、公知の固相ホスホロアミダイド法
により合成した。合成したプローブは高速液体クロマト
グラフィーにより精製した。精製後は凍結乾燥して保管
した。その後の操作には、脱イオン水に溶解して用い
た。
により合成した。合成したプローブは高速液体クロマト
グラフィーにより精製した。精製後は凍結乾燥して保管
した。その後の操作には、脱イオン水に溶解して用い
た。
【００２５】上記プローブをDIG oligoprobe tailed la
bel kit(ベーリンガーマンハイム社製)を用いてジコキ
シゲニンによりラベルした。このジコキシゲニンでラベ
ルしたオリゴヌクレオチドプローブを0.3pmol/mlの濃度
になるように、ハイブリダイゼーション溶液〔0.75M Na
Cl, 75mM sodium citrate, 1%(w/v) Blockingreagent,
0.1%(w/v)N-lauroylsarkosine, 0.02%(w/v) Sodium dod
esyl sulfate(以下SDS), 0.1mg/l Poly(a)〕に溶解し、
後述のハイブリダイゼーションで使用した。なお上記ジ
コキシゲニンはハプテンの１種であり、抗原として作用
する化合物である。
bel kit(ベーリンガーマンハイム社製)を用いてジコキ
シゲニンによりラベルした。このジコキシゲニンでラベ
ルしたオリゴヌクレオチドプローブを0.3pmol/mlの濃度
になるように、ハイブリダイゼーション溶液〔0.75M Na
Cl, 75mM sodium citrate, 1%(w/v) Blockingreagent,
0.1%(w/v)N-lauroylsarkosine, 0.02%(w/v) Sodium dod
esyl sulfate(以下SDS), 0.1mg/l Poly(a)〕に溶解し、
後述のハイブリダイゼーションで使用した。なお上記ジ
コキシゲニンはハプテンの１種であり、抗原として作用
する化合物である。
【００２６】２）検体の調製 報告されているレジオネラ属のうち、表３に示す３５種
（うち二種はL. pneumophilaのサブスピーシズ）を入手
し、DNA抽出後、ドットブロットを実施した。なお比較
例としては、Enterobacter cloacae(ATCC 23355)、Esch
erichia coli(ATCC 25922)、Klebsiella pneumoniae(AT
CC 13883)、Proteus vulgaris(ATCC 13315)、Pseudomon
as aeruginosa(ATCC 27853)、Salmonella typhimurium
(ATCC 14028)、Serratia marcescens(ATCC 8100)、Stap
hylococcus aureus(ATCC 12600)を用い、レジオネラと
同様にDNAを抽出後、ドットブロットに供した。
（うち二種はL. pneumophilaのサブスピーシズ）を入手
し、DNA抽出後、ドットブロットを実施した。なお比較
例としては、Enterobacter cloacae(ATCC 23355)、Esch
erichia coli(ATCC 25922)、Klebsiella pneumoniae(AT
CC 13883)、Proteus vulgaris(ATCC 13315)、Pseudomon
as aeruginosa(ATCC 27853)、Salmonella typhimurium
(ATCC 14028)、Serratia marcescens(ATCC 8100)、Stap
hylococcus aureus(ATCC 12600)を用い、レジオネラと
同様にDNAを抽出後、ドットブロットに供した。
【００２７】すなわち、レジオネラをBCYEα寒天培地
（Buffered charcoal-yeast extractagar supplemented
with α-ketoglutarate、組成；蒸留水1000ml当たり酵
母エキス10.0g、活性炭末1.5g、ＡＣＥＳバッファー10.
0g、寒天15.0g、Ｌ−システイン一塩酸塩0.4g、可溶性
ピロリン酸鉄0.25g、α−ケトグルタル酸一カリウム1.0
gを含有するｐＨ６．９±０．０５の培地）で培養した
後、プレート上から白金耳でかきとり使用した。DNAの
抽出はCurrent Protocols in Molecular Biology. 2.4.
1. Preparation of Genomic DNA form Bacteriaに従っ
て実施した。
（Buffered charcoal-yeast extractagar supplemented
with α-ketoglutarate、組成；蒸留水1000ml当たり酵
母エキス10.0g、活性炭末1.5g、ＡＣＥＳバッファー10.
0g、寒天15.0g、Ｌ−システイン一塩酸塩0.4g、可溶性
ピロリン酸鉄0.25g、α−ケトグルタル酸一カリウム1.0
gを含有するｐＨ６．９±０．０５の培地）で培養した
後、プレート上から白金耳でかきとり使用した。DNAの
抽出はCurrent Protocols in Molecular Biology. 2.4.
1. Preparation of Genomic DNA form Bacteriaに従っ
て実施した。
【００２８】抽出したDNAのＡ260nmにおける吸収を測定
し、それぞれのDNAを同一濃度になるよう調整した後、
ナイロンフィルターに100ngずつドットブロットした。
風乾後、次に示す各液で湿らせた濾紙の上に、フィルタ
ーを５分間ずつ順次置き、DNAを変性させた。（１）0.5
N NaOH,0.5M NaCl, （２）1.5M NaCl, 0.5M Tris-HClpH
7.4, （３）0.3M NaCl, 30mM sodium citorate pH7.0。
その後、120℃で30分間加温してDNAをフィルターに固定
し、下記のハイブリダイゼーションに使用した。
し、それぞれのDNAを同一濃度になるよう調整した後、
ナイロンフィルターに100ngずつドットブロットした。
風乾後、次に示す各液で湿らせた濾紙の上に、フィルタ
ーを５分間ずつ順次置き、DNAを変性させた。（１）0.5
N NaOH,0.5M NaCl, （２）1.5M NaCl, 0.5M Tris-HClpH
7.4, （３）0.3M NaCl, 30mM sodium citorate pH7.0。
その後、120℃で30分間加温してDNAをフィルターに固定
し、下記のハイブリダイゼーションに使用した。
【００２９】３）ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションはDIG oligoprobe tailed labe
l kitのStandard 5 xSSC procedureに基づき実施した。
以下に手順を示す。DNAを固定した前記フィルターをプ
ラスチックバッグの中に入れ、100cm2あたり20mlのハイ
ブリダイゼーション溶液〔0.75M NaCl, 75mM sodium ci
trate, 1%(w/v) Blockingreagent, 0.1%(w/v)N-lauroyl
sarkosine, 0.02%(w/v) Sodium dodesyl sulfate(以下S
DS), 0.1mg/l Poly(a)〕を入れ、気泡を除いてシールし
た。ハイブリダイゼーションオーブンで緩やかに振とう
しながら68℃で１時間以上反応させた。プレハイブリダ
イゼーション液を捨て、前記１）で調製したオリゴヌク
レオチドプローブを0.3pmol/ml濃度で含む新しいハイブ
リダイゼーション液を100cm2あたり2.5mlになるようプ
ラスチックバッグに入れた。気泡を除いてシール後、ハ
イブリダイゼーションオーブンで緩やかに振とうしなが
ら50℃で２〜３時間反応させた。
l kitのStandard 5 xSSC procedureに基づき実施した。
以下に手順を示す。DNAを固定した前記フィルターをプ
ラスチックバッグの中に入れ、100cm2あたり20mlのハイ
ブリダイゼーション溶液〔0.75M NaCl, 75mM sodium ci
trate, 1%(w/v) Blockingreagent, 0.1%(w/v)N-lauroyl
sarkosine, 0.02%(w/v) Sodium dodesyl sulfate(以下S
DS), 0.1mg/l Poly(a)〕を入れ、気泡を除いてシールし
た。ハイブリダイゼーションオーブンで緩やかに振とう
しながら68℃で１時間以上反応させた。プレハイブリダ
イゼーション液を捨て、前記１）で調製したオリゴヌク
レオチドプローブを0.3pmol/ml濃度で含む新しいハイブ
リダイゼーション液を100cm2あたり2.5mlになるようプ
ラスチックバッグに入れた。気泡を除いてシール後、ハ
イブリダイゼーションオーブンで緩やかに振とうしなが
ら50℃で２〜３時間反応させた。
【００３０】その後、フィルターをプラスチックバッグ
から取出し、0.3M NaCl, 30mM sodium citrate pH7.0,
0.1%SDS溶液をタッパーなどの容器に100cm2あたり50ml
入れ、フィルターを浸漬、振とうして洗浄し、結合の弱
いプローブを除去した。５分後液を入替え、さらに５分
間洗浄した。その後、15mM NaCl, 1.5 mM sodium citra
te pH7.0, 0.1%SDS溶液をタッパーなどの容器に100cm2
あたり50ml入れ、フィルターを浸漬、振とうして洗浄
し、結合の弱いプローブを除去した。1５分後液を入替
え、さらに1５分間洗浄した。
から取出し、0.3M NaCl, 30mM sodium citrate pH7.0,
0.1%SDS溶液をタッパーなどの容器に100cm2あたり50ml
入れ、フィルターを浸漬、振とうして洗浄し、結合の弱
いプローブを除去した。５分後液を入替え、さらに５分
間洗浄した。その後、15mM NaCl, 1.5 mM sodium citra
te pH7.0, 0.1%SDS溶液をタッパーなどの容器に100cm2
あたり50ml入れ、フィルターを浸漬、振とうして洗浄
し、結合の弱いプローブを除去した。1５分後液を入替
え、さらに1５分間洗浄した。
【００３１】フィルターを100mlあたり160mlの100mM Ma
leic acid, 150mM NaCl pH7.5溶液に入れた。次に、フ
ィルターを上記溶液に1% blockingreagentを加えた液に
浸し、緩やかに振とうしながら20分間反応させた。抗ジ
コキシゲニンアルカリフォスファターゼ結合抗体を上記
液量の1/10000量添加し、20分間緩やか振とうしながら
反応させた。フィルターを取出し、新しい容器に100mM
Maleic acid, 150mM NaCl pH7.5, 0.3% tween20を入
れ、フィルターを浸漬し、緩やかに振とうしながら10分
間洗浄した。新しい液に変え、繰返した。再度新しい液
に変え、繰返した。
leic acid, 150mM NaCl pH7.5溶液に入れた。次に、フ
ィルターを上記溶液に1% blockingreagentを加えた液に
浸し、緩やかに振とうしながら20分間反応させた。抗ジ
コキシゲニンアルカリフォスファターゼ結合抗体を上記
液量の1/10000量添加し、20分間緩やか振とうしながら
反応させた。フィルターを取出し、新しい容器に100mM
Maleic acid, 150mM NaCl pH7.5, 0.3% tween20を入
れ、フィルターを浸漬し、緩やかに振とうしながら10分
間洗浄した。新しい液に変え、繰返した。再度新しい液
に変え、繰返した。
【００３２】100mM Tris-HCl pH9.5, 100mM NaCl, 50mM
MgCl2溶液にフィルターを入れ、２分間以上放置した。
CDP-Star(ベーリンガーマンハイム社製)を上記溶液で1
／100に希釈し、フィルターを浸漬し５分間放置した。
フィルターの余分な液を切り、プラスチックバッグに入
れて37℃で10分間反応させた。その後Ｘ線フィルム(ECL
ハイパーフィルム、アマシャム社製)に30分間露光し、
現像した。プローブが反応した部分は黒いシグナルとな
って現れるので、生じたシグナルを目視により、４段階
に分けて反応性を判断した。その結果を表３に示す。
MgCl2溶液にフィルターを入れ、２分間以上放置した。
CDP-Star(ベーリンガーマンハイム社製)を上記溶液で1
／100に希釈し、フィルターを浸漬し５分間放置した。
フィルターの余分な液を切り、プラスチックバッグに入
れて37℃で10分間反応させた。その後Ｘ線フィルム(ECL
ハイパーフィルム、アマシャム社製)に30分間露光し、
現像した。プローブが反応した部分は黒いシグナルとな
って現れるので、生じたシグナルを目視により、４段階
に分けて反応性を判断した。その結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】
【００３４】
【表４】
【００３５】
【表５】
【００３６】表３の注 Ｎｏ．１〜３６の菌が実施例、Ｎｏ．１０１〜１０８の
菌が比較例 評価基準 ＋＋：強いシグナルあり ＋：シグナルあり ±：わずかにシグナルが確認される −：反応確認されず ＊１ DNAが抽出できず、ハイブリダイゼーションは実
施せず
菌が比較例 評価基準 ＋＋：強いシグナルあり ＋：シグナルあり ±：わずかにシグナルが確認される −：反応確認されず ＊１ DNAが抽出できず、ハイブリダイゼーションは実
施せず
【００３７】表３の結果から、本発明のプローブを用い
ると、試験に供したレジオネラのうちL. islaelensisを
除く全てのレジオネラから強いシグナルが得られたこと
がわかる。またレジオネラ以外の菌からはほとんどシグ
ナルが得られなかった。このことから、本発明のプロー
ブはほとんどのレジオネラ種を検出することが可能で、
レジオネラ属特異性があることが確認された。
ると、試験に供したレジオネラのうちL. islaelensisを
除く全てのレジオネラから強いシグナルが得られたこと
がわかる。またレジオネラ以外の菌からはほとんどシグ
ナルが得られなかった。このことから、本発明のプロー
ブはほとんどのレジオネラ種を検出することが可能で、
レジオネラ属特異性があることが確認された。
【００３８】
【発明の効果】本発明のオリゴヌクレオチドプローブ
は、特定な塩基配列を有し、多数の種のレジオネラ属細
菌の16SrRNAの特定の位置の配列および16SrRNAをコード
するDNAの相補的配列と、特異的に相補的な塩基対を形
成する。このため、短時間で多数の種のレジオネラ属細
菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出するため
のプローブとして好適に用いることができる。また塩基
が短いので容易に調製することができる。
は、特定な塩基配列を有し、多数の種のレジオネラ属細
菌の16SrRNAの特定の位置の配列および16SrRNAをコード
するDNAの相補的配列と、特異的に相補的な塩基対を形
成する。このため、短時間で多数の種のレジオネラ属細
菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出するため
のプローブとして好適に用いることができる。また塩基
が短いので容易に調製することができる。
【００３９】本発明の標識オリゴヌクレオチドプローブ
は上記オリゴヌクレオチドプローブを標識物質で標識し
ているので、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ
属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類
のプローブで特異的に高精度で検出することができる。
は上記オリゴヌクレオチドプローブを標識物質で標識し
ているので、ハイブリダイゼーションによりレジオネラ
属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌を一種類
のプローブで特異的に高精度で検出することができる。
【００４０】本発明の試薬は上記標識オリゴヌクレオチ
ドプローブを含んでいるので、ハイブリダイゼーション
によりレジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネ
ラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出す
ることができる。
ドプローブを含んでいるので、ハイブリダイゼーション
によりレジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネ
ラ属細菌を一種類のプローブで特異的に高精度で検出す
ることができる。
【００４１】本発明の検出方法は上記標識オリゴヌクレ
オチドプローブまたは試薬をレジオネラ属細菌またはそ
のDNAと接触させてハイブリダイゼーションを行った
後、標識を指標にして検出するようにしているので、レ
ジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌
を一種類のプローブで特異的に高精度で検出することが
できる。
オチドプローブまたは試薬をレジオネラ属細菌またはそ
のDNAと接触させてハイブリダイゼーションを行った
後、標識を指標にして検出するようにしているので、レ
ジオネラ属細菌を短時間で多数の種のレジオネラ属細菌
を一種類のプローブで特異的に高精度で検出することが
できる。
【００４２】
配列番号：1 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella pneumophila 配列 AGCAAACGCG ATAAGTTGAC 20
【００４３】配列番号：2 配列の長さ：48 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Escherichia coli 配列 TTGAGGCGTG GCTTCCGGAG CTAACGCGTT AAGTCGACCG CCTGGGGA 48
【００４４】配列番号：3 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Ps. aeruginosa 配列 CCTTGAGATC TTAGTGGCGC ACGTAACGCG ATAAGTCGAC CGCCTGGGGA 50
【００４５】配列番号：4 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella pneumophila 配列 ATGAAAATAA TTAGTGGCGC AGCAAACGCG ATAAGTTGAC CGCCTGGGGA 50
【００４６】配列番号：5 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella pneumophila 配列 ATGAAAATAA TTAGTGGCGC AGCAAACGCG ATAAGTTGAC CGCCTRGGGA 50
【００４７】配列番号：6 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella pneumophila 配列 ATGAAAATAA TTAGTGGCGC AGCAAACGCG ATAAGTTGAC CGCCTGGGGA 50
【００４８】配列番号：7 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella sp. 配列 ATGAATATAA TTAGTGGCGC AGCAAACGCG ATAAGTTGAC CGCCTGGGGA 50
【００４９】配列番号：8 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella erythra 配列 ATGAATGAGA TTAGTGGCGC AGCAAACGCG ATWAGTTGAC CGCCTNGGGA 50
【００５０】配列番号：9 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella micdadei 配列 ATGAATGAGG TTAGTGACGA AGCAAACGCG ATAAGTTGAC CGCCTNGGGA 50
【００５１】配列番号：10 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella spiritensis 配列 ATAAATNAGG TTAGTGGCGC AGCAAACGCG ATAAGTTGAC CGCCTNGGGA 50
【００５２】配列番号：11 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella hackeliae 配列 ATAAATGAGA TTAGTGGCGC AGCAAACGCG ATAAGTTGAC CGCCTNGGGA 50
【００５３】配列番号：12 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella bozemanii 配列 GTGAAAATCA TTAGTGGCGC AGCAAACGCG ATWAGTTGAC CGCCTNGGGA 50
【００５４】配列番号：13 配列の長さ：50 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Legionella longbeachae 配列 ATGAATNTRT TTAGTGGCGC AGCAAACGCG ATAAGTWGAC CGCCTNGGGA 50
Claims (4)
- 【請求項１】 デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌ
クレオチドからなり、レジオネラ（Legionella）属に属
する細菌の16SrRNAの可変領域に相補的な配列を持つプ
ローブであって、塩基配列5'AGC AAA CGC GAT AAG TTG
AC3'を有することを特徴とするレジオネラ属に属する細
菌検出用オリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項２】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドプロ
ーブを放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質で標
識してなることを特徴とするレジオネラ属に属する細菌
検出用標識オリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項３】 請求項２記載の標識オリゴヌクレオチド
プローブを含むことを特徴とするレジオネラ属に属する
細菌検出用試薬。 - 【請求項４】 レジオネラ属に属する細菌、そのDNAま
たはrRNAを含む検体に請求項２記載の標識オリゴヌクレ
オチドプローブまたは請求項３記載の試薬を接触させて
ハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして
検出することを特徴とするレジオネラ属に属する細菌の
検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00505097A JP3814909B2 (ja) | 1997-01-14 | 1997-01-14 | レジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブおよびレジオネラ属に属する細菌の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00505097A JP3814909B2 (ja) | 1997-01-14 | 1997-01-14 | レジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブおよびレジオネラ属に属する細菌の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10191982A true JPH10191982A (ja) | 1998-07-28 |
| JP3814909B2 JP3814909B2 (ja) | 2006-08-30 |
Family
ID=11600586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00505097A Expired - Fee Related JP3814909B2 (ja) | 1997-01-14 | 1997-01-14 | レジオネラ属に属する細菌検出用オリゴヌクレオチドプローブおよびレジオネラ属に属する細菌の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3814909B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009044773A1 (ja) * | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Tosoh Corporation | レジオネラ属菌ｒＲＮＡ増幅用プライマー、検出方法および検出キット |
-
1997
- 1997-01-14 JP JP00505097A patent/JP3814909B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009044773A1 (ja) * | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Tosoh Corporation | レジオネラ属菌ｒＲＮＡ増幅用プライマー、検出方法および検出キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3814909B2 (ja) | 2006-08-30 |
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