JPH10191986A - 腫瘍壊死因子−αおよび−βレセプター - Google Patents
腫瘍壊死因子−αおよび−βレセプターInfo
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- JPH10191986A JPH10191986A JP9225286A JP22528697A JPH10191986A JP H10191986 A JPH10191986 A JP H10191986A JP 9225286 A JP9225286 A JP 9225286A JP 22528697 A JP22528697 A JP 22528697A JP H10191986 A JPH10191986 A JP H10191986A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、腫瘍壊死因子レセプターを提供する
ことを目的とする。 【解決手段】本発明の腫瘍壊死因子レセプターは、図２
または図３に開示されアミノ酸配列、あるいは前記アミ
ノ酸配列から１つまたはそれ以上のアミノ酸配列残基が
削除、追加もしくは置換によって変化したアミノ酸配列
を含み、かつＴＮＦ結合活性を有する。
ことを目的とする。 【解決手段】本発明の腫瘍壊死因子レセプターは、図２
または図３に開示されアミノ酸配列、あるいは前記アミ
ノ酸配列から１つまたはそれ以上のアミノ酸配列残基が
削除、追加もしくは置換によって変化したアミノ酸配列
を含み、かつＴＮＦ結合活性を有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は一般にサイトカイン
レセプターに関し、より詳細には腫瘍壊死因子レセプタ
ーに関する。
レセプターに関し、より詳細には腫瘍壊死因子レセプタ
ーに関する。
【０００２】
【従来の技術】腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα、カケクチ
ンとも呼ばれる）および腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦβ、
リンフォトキシンとも呼ばれる）は、多くの細胞型に対
して様々な作用を誘導しうる相同な哺乳類内因性分泌蛋
白である。これら２種類のサイトカインは構造的および
機能的特性が非常に類似しているために、一まとめにし
て“ＴＮＦ”と記載された。ＴＮＦα（Pennica et a
l., Nature 312:724,1984)およびＴＮＦβ（Gray et a
l., Nature 312:721, 1984)をコードする相補ｃＤＮＡ
クローンが単離され、ＴＮＦの更なる構造的および生物
学的特性決定が可能となった。
ンとも呼ばれる）および腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦβ、
リンフォトキシンとも呼ばれる）は、多くの細胞型に対
して様々な作用を誘導しうる相同な哺乳類内因性分泌蛋
白である。これら２種類のサイトカインは構造的および
機能的特性が非常に類似しているために、一まとめにし
て“ＴＮＦ”と記載された。ＴＮＦα（Pennica et a
l., Nature 312:724,1984)およびＴＮＦβ（Gray et a
l., Nature 312:721, 1984)をコードする相補ｃＤＮＡ
クローンが単離され、ＴＮＦの更なる構造的および生物
学的特性決定が可能となった。
【０００３】ＴＮＦ蛋白は、ＴＮＦ応答細胞の原形質膜
上に発現された特定のＴＮＦレセプター（ＴＮＦ−Ｒ）
蛋白に結合することによって、細胞に対するそれらの生
物学的作用を開始する。ＴＮＦαおよびＴＮＦβは最
初、ヒト子宮頸癌細胞株ＭＥ−１８０上の共通のレセプ
ターに結合することが示された(Aggarwal et al.,Natur
e 318:665,1985)。アフィニティーラベル実験により測
定されたＴＮＦ−Ｒの大きさの概算値は５４〜１７５ｋ
Ｄａの範囲であった（Creasey et al.,Proc. Natl.Acad.
Sci.USA 84:3293,1987; Stauber et al.,J.Biol.Chem.2
63:19098,1988; Hohmann et al., J.Biol.Chem.264:149
27, 1989）。異なる分子量のこれらのＴＮＦ−Ｒ間の関
係ははっきりしないが、Hohmann et al., (J.Biol.Che
m.264:14927, 1989)はＴＮＦの少なくとも２つの異なる
細胞表面レセプターが異なる細胞型に存在することを報
告した。これらのレセプターはそれぞれ約８０ｋＤａと
約５５〜６０ｋＤａの見掛け分子量を有する。しかしな
がら、上記刊行物はどれも細胞表面ＴＮＦレセプターの
均質精製を報じていない。
上に発現された特定のＴＮＦレセプター（ＴＮＦ−Ｒ）
蛋白に結合することによって、細胞に対するそれらの生
物学的作用を開始する。ＴＮＦαおよびＴＮＦβは最
初、ヒト子宮頸癌細胞株ＭＥ−１８０上の共通のレセプ
ターに結合することが示された(Aggarwal et al.,Natur
e 318:665,1985)。アフィニティーラベル実験により測
定されたＴＮＦ−Ｒの大きさの概算値は５４〜１７５ｋ
Ｄａの範囲であった（Creasey et al.,Proc. Natl.Acad.
Sci.USA 84:3293,1987; Stauber et al.,J.Biol.Chem.2
63:19098,1988; Hohmann et al., J.Biol.Chem.264:149
27, 1989）。異なる分子量のこれらのＴＮＦ−Ｒ間の関
係ははっきりしないが、Hohmann et al., (J.Biol.Che
m.264:14927, 1989)はＴＮＦの少なくとも２つの異なる
細胞表面レセプターが異なる細胞型に存在することを報
告した。これらのレセプターはそれぞれ約８０ｋＤａと
約５５〜６０ｋＤａの見掛け分子量を有する。しかしな
がら、上記刊行物はどれも細胞表面ＴＮＦレセプターの
均質精製を報じていない。
【０００４】ＴＮＦの細胞表面レセプターのほかに、Ｔ
ＮＦに結合しうるヒト尿からの可溶性蛋白も同定された
（Peetre et al., Eur.J.Haematol. 41:414,1988; Sec
kinger et al.,J.Exp.Med.167: 1511, 1988; Seckinger
et al., J.Biol.Chem.264:11966,1989; Seckinger et
al.,のＵＫ特許出願、公開番号２２１８０１Ａ；Engelm
ann et al.,J.Biol.Chem.264: 11974,1989)。ＵＫ２２
１８１０１Ａに開示された可溶性尿ＴＮＦ結合蛋白は、
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−の部分Ｎ末
端アミノ酸配列を有し、これは Engelmann et al., (19
89)によってあとで開示された部分配列と一致する。上
記の可溶性尿結合蛋白類の関係は、本出願のもとの親出
願（米国特許出願第４０３２４１号）が提出された後で
さらに解明され、そのとき Engelmann et al., はＶａ
ｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−のＮ末端アミノ
酸配列を有する第二の別個の可溶性尿ＴＮＦ結合蛋白の
同定および精製を報告した（J.Biol.Chem.265: 1531, 1
990)。ＵＫ２２１８１０１Ａおよび Engelmann et al.,
の刊行物に開示された２種類の尿蛋白は、ある種の細胞
へのＴＮＦ結合を阻止する結合蛋白に対する抗血清の能
力により、２つの明らかに異なる細胞表面蛋白に免疫学
的に関係があると分かった。
ＮＦに結合しうるヒト尿からの可溶性蛋白も同定された
（Peetre et al., Eur.J.Haematol. 41:414,1988; Sec
kinger et al.,J.Exp.Med.167: 1511, 1988; Seckinger
et al., J.Biol.Chem.264:11966,1989; Seckinger et
al.,のＵＫ特許出願、公開番号２２１８０１Ａ；Engelm
ann et al.,J.Biol.Chem.264: 11974,1989)。ＵＫ２２
１８１０１Ａに開示された可溶性尿ＴＮＦ結合蛋白は、
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−の部分Ｎ末
端アミノ酸配列を有し、これは Engelmann et al., (19
89)によってあとで開示された部分配列と一致する。上
記の可溶性尿結合蛋白類の関係は、本出願のもとの親出
願（米国特許出願第４０３２４１号）が提出された後で
さらに解明され、そのとき Engelmann et al., はＶａ
ｌ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−のＮ末端アミノ
酸配列を有する第二の別個の可溶性尿ＴＮＦ結合蛋白の
同定および精製を報告した（J.Biol.Chem.265: 1531, 1
990)。ＵＫ２２１８１０１Ａおよび Engelmann et al.,
の刊行物に開示された２種類の尿蛋白は、ある種の細胞
へのＴＮＦ結合を阻止する結合蛋白に対する抗血清の能
力により、２つの明らかに異なる細胞表面蛋白に免疫学
的に関係があると分かった。
【０００５】最近になって、２つの別々のグループがヒ
ト５５ｋＤａ ＴＮＦ−Ｒの分子クローニングおよび発
現を報告した（Loetscher et al., Cell 61:351,1990;
Schall et al., Cell 61:361, 1990)。両グループのＴ
ＮＦ−ＲはＵＫ２２１８１０１Ａ、Engelmann et al.
(1989)およびEngelmann et al. (1990)により開示され
た尿結合蛋白の部分アミノ酸配列に一致するＮ末端アミ
ノ酸配列をもっている。
ト５５ｋＤａ ＴＮＦ−Ｒの分子クローニングおよび発
現を報告した（Loetscher et al., Cell 61:351,1990;
Schall et al., Cell 61:361, 1990)。両グループのＴ
ＮＦ−ＲはＵＫ２２１８１０１Ａ、Engelmann et al.
(1989)およびEngelmann et al. (1990)により開示され
た尿結合蛋白の部分アミノ酸配列に一致するＮ末端アミ
ノ酸配列をもっている。
【０００６】多数の形態のＴＮＦ−Ｒと可溶性尿ＴＮＦ
結合蛋白の関係を明らかにするために、またはＴＮＦ−
Ｒの構造的・生物学的性質並びにＴＮＦまたは他のサイ
トカイン刺激に対する各種細胞集団の応答においてＴＮ
Ｆ−Ｒが果す役割を研究するために、あるいは治療、診
断またはアッセイにおいてＴＮＦ−Ｒを効果的に使用す
るために、ＴＮＦ−Ｒの精製組成物が必要とされる。し
かしながら、この種の組成物は、組換えＤＮＡ技術を使
って、これらのレセプターをコードする遺伝子をクロー
ニングし、発現させることによってのみ得ることができ
る。しかし、生化学的分析用のＴＮＦ−Ｒ分子を精製し
ようとする努力、またはＴＮＦ−Ｒをコードする哺乳類
遺伝子をクローニングして発現させようとする努力は、
レセプター蛋白またはｍＲＮＡの適当な供給源がないた
めに妨げられている。本発明以前には、高レベルのＴＮ
Ｆ−Ｒを構成的にかつ連続して発現する細胞株は全く知
られておらず、その結果シークエンシング用のレセプタ
ーの精製またはｃＤＮＡクローニング用の遺伝子ライブ
ラリーの作製が阻まれていた。
結合蛋白の関係を明らかにするために、またはＴＮＦ−
Ｒの構造的・生物学的性質並びにＴＮＦまたは他のサイ
トカイン刺激に対する各種細胞集団の応答においてＴＮ
Ｆ−Ｒが果す役割を研究するために、あるいは治療、診
断またはアッセイにおいてＴＮＦ−Ｒを効果的に使用す
るために、ＴＮＦ−Ｒの精製組成物が必要とされる。し
かしながら、この種の組成物は、組換えＤＮＡ技術を使
って、これらのレセプターをコードする遺伝子をクロー
ニングし、発現させることによってのみ得ることができ
る。しかし、生化学的分析用のＴＮＦ−Ｒ分子を精製し
ようとする努力、またはＴＮＦ−Ｒをコードする哺乳類
遺伝子をクローニングして発現させようとする努力は、
レセプター蛋白またはｍＲＮＡの適当な供給源がないた
めに妨げられている。本発明以前には、高レベルのＴＮ
Ｆ−Ｒを構成的にかつ連続して発現する細胞株は全く知
られておらず、その結果シークエンシング用のレセプタ
ーの精製またはｃＤＮＡクローニング用の遺伝子ライブ
ラリーの作製が阻まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、単離したＴ
ＮＦレセプターおよび哺乳類腫瘍壊死因子レセプター
（ＴＮＦ−Ｒ）、特にヒトＴＮＦ−ＲをコードするＤＮ
Ａ配列を提供する。このようなＤＮＡ配列には（ａ）天
然ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のコード領域から誘導されたヌクレ
オチド配列を有するｃＤＮＡクローン；（ｂ）適度なス
トリンジェント条件下で（ａ）のｃＤＮＡクローンにハ
イブリダイズすることができ、かつ生物学的に活性なＴ
ＮＦ−Ｒ分子をコードするＤＮＡ配列；または（ｃ）
（ａ）および（ｂ）で定めたＤＮＡ配列に遺伝暗号の結
果として縮重しており、かつ生物学的に活性なＴＮＦ−
Ｒ分子をコードするＤＮＡ配列；が含まれる。特に、本
発明は可溶性ＴＮＦレセプターをコードするＤＮＡ配列
を提供する。
ＮＦレセプターおよび哺乳類腫瘍壊死因子レセプター
（ＴＮＦ−Ｒ）、特にヒトＴＮＦ−ＲをコードするＤＮ
Ａ配列を提供する。このようなＤＮＡ配列には（ａ）天
然ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のコード領域から誘導されたヌクレ
オチド配列を有するｃＤＮＡクローン；（ｂ）適度なス
トリンジェント条件下で（ａ）のｃＤＮＡクローンにハ
イブリダイズすることができ、かつ生物学的に活性なＴ
ＮＦ−Ｒ分子をコードするＤＮＡ配列；または（ｃ）
（ａ）および（ｂ）で定めたＤＮＡ配列に遺伝暗号の結
果として縮重しており、かつ生物学的に活性なＴＮＦ−
Ｒ分子をコードするＤＮＡ配列；が含まれる。特に、本
発明は可溶性ＴＮＦレセプターをコードするＤＮＡ配列
を提供する。
【０００８】また、本発明は上で定義したＤＮＡ配列を
含む組換え発現ベクター、その組換え発現ベクターを使
って生産された組換えＴＮＦ−Ｒ分子、およびその発現
ベクターを使って組換えＴＮＦ−Ｒ分子を生産する方法
を提供する。
含む組換え発現ベクター、その組換え発現ベクターを使
って生産された組換えＴＮＦ−Ｒ分子、およびその発現
ベクターを使って組換えＴＮＦ−Ｒ分子を生産する方法
を提供する。
【０００９】本発明はまた、ＴＮＦ−Ｒ、特に可溶性形
態のＴＮＦ−Ｒから成る単離したまたは精製した蛋白組
成物を提供する。
態のＴＮＦ−Ｒから成る単離したまたは精製した蛋白組
成物を提供する。
【００１０】さらに、本発明は、上記方法により生産さ
れた有効量の可溶性天然または組換えレセプター蛋白を
含む、ＴＮＦ−Ｒの治療、診断、アッセイに用いるため
の、あるいはＴＮＦ−Ｒに対する抗体を誘導するための
組成物を提供する。
れた有効量の可溶性天然または組換えレセプター蛋白を
含む、ＴＮＦ−Ｒの治療、診断、アッセイに用いるため
の、あるいはＴＮＦ−Ｒに対する抗体を誘導するための
組成物を提供する。
【００１１】ＴＮＦレセプター（ＴＮＦ−Ｒ）に特異的
に結合するＴＮＦの能力ゆえに、精製ＴＮＦ−Ｒ組成物
はＴＮＦの診断アッセイに、または診断や治療に用いる
ＴＮＦレセプターに対する抗体の誘導に有用であるだろ
う。さらに、精製ＴＮＦレセプター組成物は、ＴＮＦを
結合または捕捉するための治療に直接使用され、これに
よりこのサイトカインの免疫活性を調節するための手段
を提供する。
に結合するＴＮＦの能力ゆえに、精製ＴＮＦ−Ｒ組成物
はＴＮＦの診断アッセイに、または診断や治療に用いる
ＴＮＦレセプターに対する抗体の誘導に有用であるだろ
う。さらに、精製ＴＮＦレセプター組成物は、ＴＮＦを
結合または捕捉するための治療に直接使用され、これに
よりこのサイトカインの免疫活性を調節するための手段
を提供する。
【００１２】本発明のこれらの面および他の面は以下の
詳細な記述より明らかになるであろう。
詳細な記述より明らかになるであろう。
【００１３】
【課題を解決するための手段】定義 本明細書中で用いる“ＴＮＦレセプター”および“ＴＮ
Ｆ−Ｒ”なる用語は、天然哺乳類ＴＮＦレセプターアミ
ノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列を有し、かつ
ＴＮＦ分子を結合することができる；細胞へのＴＮＦ分
子の結合により開始される生物学的信号を伝達すること
ができる；または天然（すなわち、非組換え）源由来の
ＴＮＦ−Ｒに対して誘導された抗ＴＮＦ−Ｒ抗体と交差
反応することができるという点で、以下で定義するよう
に、生物学的に活性である蛋白を意味する。成熟全長ヒ
トＴＮＦ−Ｒは約８０キロダルトン（ｋＤａ）の分子量
をもつ糖蛋白である。本明細書全体を通して用いられる
“成熟”なる用語は、天然遺伝子の全長転写物に存在し
うるリーダー配列を欠いた形態で発現される蛋白を意味
する。全長ヒトＴＮＦ−ＲをコードするｃＤＮＡでトラ
ンスフェクトしたＣＯＳ細胞を用いた実験により、ＴＮ
Ｆ−Ｒは約５×１０9Ｍ-1の見掛けＫａで125Ｉ−ＴＮＦ
αを結合し、また約２×１０9Ｍ-1の見掛けＫａで125Ｉ
−ＴＮＦβを結合することが判明した。“ＴＮＦレセプ
ター” または“ＴＮＦ−Ｒ”なる用語には、限定する
ものではないが、少なくとも２０個のアミノ酸を有する
天然蛋白の類縁体またはサブユニットであって、少なく
ともいくらかのＴＮＦ−Ｒと共通した生物学的活性を示
すもの、例えばトランスメンブラン領域を欠く（従って
細胞から分泌される）がＴＮＦを結合する能力を保持す
る可溶性ＴＮＦ−Ｒ構築物が含まれる。種々の生物学的
に均等な蛋白およびアミノ酸類縁体は以下で詳しく述べ
ることにする。
Ｆ−Ｒ”なる用語は、天然哺乳類ＴＮＦレセプターアミ
ノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列を有し、かつ
ＴＮＦ分子を結合することができる；細胞へのＴＮＦ分
子の結合により開始される生物学的信号を伝達すること
ができる；または天然（すなわち、非組換え）源由来の
ＴＮＦ−Ｒに対して誘導された抗ＴＮＦ−Ｒ抗体と交差
反応することができるという点で、以下で定義するよう
に、生物学的に活性である蛋白を意味する。成熟全長ヒ
トＴＮＦ−Ｒは約８０キロダルトン（ｋＤａ）の分子量
をもつ糖蛋白である。本明細書全体を通して用いられる
“成熟”なる用語は、天然遺伝子の全長転写物に存在し
うるリーダー配列を欠いた形態で発現される蛋白を意味
する。全長ヒトＴＮＦ−ＲをコードするｃＤＮＡでトラ
ンスフェクトしたＣＯＳ細胞を用いた実験により、ＴＮ
Ｆ−Ｒは約５×１０9Ｍ-1の見掛けＫａで125Ｉ−ＴＮＦ
αを結合し、また約２×１０9Ｍ-1の見掛けＫａで125Ｉ
−ＴＮＦβを結合することが判明した。“ＴＮＦレセプ
ター” または“ＴＮＦ−Ｒ”なる用語には、限定する
ものではないが、少なくとも２０個のアミノ酸を有する
天然蛋白の類縁体またはサブユニットであって、少なく
ともいくらかのＴＮＦ−Ｒと共通した生物学的活性を示
すもの、例えばトランスメンブラン領域を欠く（従って
細胞から分泌される）がＴＮＦを結合する能力を保持す
る可溶性ＴＮＦ−Ｒ構築物が含まれる。種々の生物学的
に均等な蛋白およびアミノ酸類縁体は以下で詳しく述べ
ることにする。
【００１４】本明細書中で用いるＴＮＦ−Ｒ類縁体の命
名法は、ｈｕ（ヒト）またはｍｕ（マウス）が先行し、
Δ（欠失を表す）とＣ末端アミノ酸の番号が後に続く蛋
白（例．ＴＮＦ−Ｒ）の慣例的な命名法に従う。例え
ば、ｈｕＴＮＦ−ＲΔ２３５はＣ末端アミノ酸としてＡ
ｓｐ235をもつヒトＴＮＦ−Ｒ（つまり、第２Ａ図のア
ミノ酸１−２３５の配列をもつポリペプチド）を表す。
ヒトまたはマウスの種指示がない場合には、ＴＮＦ−Ｒ
は総称的に哺乳類ＴＮＦ−Ｒを意味する。同様に、欠失
変異体の特定指示がない場合には、用語ＴＮＦ−ＲはＴ
ＮＦ−Ｒの生物学的活性を有する変異体および類縁体を
含めて、あらゆる形態のＴＮＦ−Ｒを意味する。
名法は、ｈｕ（ヒト）またはｍｕ（マウス）が先行し、
Δ（欠失を表す）とＣ末端アミノ酸の番号が後に続く蛋
白（例．ＴＮＦ−Ｒ）の慣例的な命名法に従う。例え
ば、ｈｕＴＮＦ−ＲΔ２３５はＣ末端アミノ酸としてＡ
ｓｐ235をもつヒトＴＮＦ−Ｒ（つまり、第２Ａ図のア
ミノ酸１−２３５の配列をもつポリペプチド）を表す。
ヒトまたはマウスの種指示がない場合には、ＴＮＦ−Ｒ
は総称的に哺乳類ＴＮＦ−Ｒを意味する。同様に、欠失
変異体の特定指示がない場合には、用語ＴＮＦ−ＲはＴ
ＮＦ−Ｒの生物学的活性を有する変異体および類縁体を
含めて、あらゆる形態のＴＮＦ−Ｒを意味する。
【００１５】本発明との関係において用いられる“可溶
性ＴＮＦ−Ｒ”または“ｓＴＮＦ−Ｒ”は、天然ＴＮＦ
−Ｒの細胞外領域の全部または一部に一致するアミノ酸
配列（例えば、ｈｕＴＮＦ−ＲΔ２３５、ｈｕＴＮＦ−
ＲΔ１８５、ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１６３）、あるいは第２
Ａ図のアミノ酸１−１６３、アミノ酸１−１８５、また
はアミノ酸１−２３５の配列に実質的に類似したアミノ
酸配列を有し、しかもＴＮＦリガンドに結合するという
点で生物学的に活性である蛋白、または実質的に均等な
類縁体を意味する。均等な可溶性ＴＮＦ−Ｒには、１以
上の置換、欠失または付加によりこれらの配列と異なる
ポリペプチドであって、ＴＮＦ結合能力を保持するか、
または細胞表面結合ＴＮＦレセプター蛋白によるＴＮＦ
信号伝達を阻止するもの、例えばｈｕＴＮＦ−ＲΔｘ
（ここで、ｘは第２Ａ図のアミノ酸１６３−２３５のい
ずれか１つより成る群から選ばれる）が含まれる。ｍｕ
ＴＮＦ−Ｒに対しても類似の欠失を作ることができる。
ＴＮＦ信号伝達活性の阻止は、細胞を組換えＴＮＦ−Ｒ
ＤＮＡでトランスフェクトして組換えレセプターを発
現させ、その後細胞をＴＮＦと接触させて、生じた代謝
結果を調べることにより確認できる。リガンドの作用に
よると考え得る結果が得られるならば、その組換えレセ
プターは信号伝達活性をもつといえる。ポリペプチドが
信号伝達活性をもつかどうかを調べる方法は、例えば I
dzerda et al.,J.Exp.Med. 171:861 (1990);Curtis et
al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3045(1989); Prywes
et al.,EMBO J.5:2179(1986);および Chou et al., J.B
iol.Chem.262:1842(1987)に記載されている。また、内
因性ＴＮＦレセプターを発現し、ＴＮＦに対して検出し
うる生物学的応答を有する一次細胞または細胞株も利用
できるだろう。
性ＴＮＦ−Ｒ”または“ｓＴＮＦ−Ｒ”は、天然ＴＮＦ
−Ｒの細胞外領域の全部または一部に一致するアミノ酸
配列（例えば、ｈｕＴＮＦ−ＲΔ２３５、ｈｕＴＮＦ−
ＲΔ１８５、ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１６３）、あるいは第２
Ａ図のアミノ酸１−１６３、アミノ酸１−１８５、また
はアミノ酸１−２３５の配列に実質的に類似したアミノ
酸配列を有し、しかもＴＮＦリガンドに結合するという
点で生物学的に活性である蛋白、または実質的に均等な
類縁体を意味する。均等な可溶性ＴＮＦ−Ｒには、１以
上の置換、欠失または付加によりこれらの配列と異なる
ポリペプチドであって、ＴＮＦ結合能力を保持するか、
または細胞表面結合ＴＮＦレセプター蛋白によるＴＮＦ
信号伝達を阻止するもの、例えばｈｕＴＮＦ−ＲΔｘ
（ここで、ｘは第２Ａ図のアミノ酸１６３−２３５のい
ずれか１つより成る群から選ばれる）が含まれる。ｍｕ
ＴＮＦ−Ｒに対しても類似の欠失を作ることができる。
ＴＮＦ信号伝達活性の阻止は、細胞を組換えＴＮＦ−Ｒ
ＤＮＡでトランスフェクトして組換えレセプターを発
現させ、その後細胞をＴＮＦと接触させて、生じた代謝
結果を調べることにより確認できる。リガンドの作用に
よると考え得る結果が得られるならば、その組換えレセ
プターは信号伝達活性をもつといえる。ポリペプチドが
信号伝達活性をもつかどうかを調べる方法は、例えば I
dzerda et al.,J.Exp.Med. 171:861 (1990);Curtis et
al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3045(1989); Prywes
et al.,EMBO J.5:2179(1986);および Chou et al., J.B
iol.Chem.262:1842(1987)に記載されている。また、内
因性ＴＮＦレセプターを発現し、ＴＮＦに対して検出し
うる生物学的応答を有する一次細胞または細胞株も利用
できるだろう。
【００１６】ＴＮＦ−Ｒ蛋白または蛋白組成物の純度を
定義するために本明細書との関係において用いられる
“単離された”または“精製された”なる用語は、蛋白
または蛋白組成物が実質的に天然または内因性起源の他
の蛋白を実質的に含まず、しかも生産プロセスの蛋白汚
染残留物を約１％より少ない量で含むことを意味する。
しかしながら、この種の組成物は安定剤、担体、賦形剤
または補助治療剤として添加された他の蛋白を含むこと
ができる。ＴＮＦ−Ｒはポリアクリルアミドゲルで銀染
色により単一の蛋白バンドとして検出しうるならば単離
できる。
定義するために本明細書との関係において用いられる
“単離された”または“精製された”なる用語は、蛋白
または蛋白組成物が実質的に天然または内因性起源の他
の蛋白を実質的に含まず、しかも生産プロセスの蛋白汚
染残留物を約１％より少ない量で含むことを意味する。
しかしながら、この種の組成物は安定剤、担体、賦形剤
または補助治療剤として添加された他の蛋白を含むこと
ができる。ＴＮＦ−Ｒはポリアクリルアミドゲルで銀染
色により単一の蛋白バンドとして検出しうるならば単離
できる。
【００１７】アミノ酸または核酸配列を定義するために
用いられる“実質的に類似した”なる用語は、特定の対
象配列（例えば、変異体配列）が１以上の置換、欠失、
または付加により基準配列からはずれ、その最終的な作
用が、例えば以下の実施例１に示すＴＮＦ−Ｒ結合検定
の１つで測定されるような、ＴＮＦ−Ｒ蛋白の生物学的
活性を保持すべきであることを意味する。また、核酸サ
ブユニットおよび類縁体は、（ａ）そのＤＮＡ配列が天
然哺乳類ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のコード領域から誘導される
場合；（ｂ）そのＤＮＡ配列が適度なストリンジェント
条件（５０℃、２×ＳＳＣ）下で（ａ）のＤＮＡ配列に
ハイブリダイズすることができ、かつ生物学的に活性な
ＴＮＦ−Ｒ分子をコードする場合；または（ｃ）そのＤ
ＮＡ配列が（ａ）または（ｂ）で定義したＤＮＡ配列に
遺伝暗号の結果として縮重しており、かつ生物学的に活
性なＴＮＦ−Ｒ分子をコードする場合に、ここに開示し
た特定のＤＮＡ配列に“実質的に類似している”といえ
る。
用いられる“実質的に類似した”なる用語は、特定の対
象配列（例えば、変異体配列）が１以上の置換、欠失、
または付加により基準配列からはずれ、その最終的な作
用が、例えば以下の実施例１に示すＴＮＦ−Ｒ結合検定
の１つで測定されるような、ＴＮＦ−Ｒ蛋白の生物学的
活性を保持すべきであることを意味する。また、核酸サ
ブユニットおよび類縁体は、（ａ）そのＤＮＡ配列が天
然哺乳類ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のコード領域から誘導される
場合；（ｂ）そのＤＮＡ配列が適度なストリンジェント
条件（５０℃、２×ＳＳＣ）下で（ａ）のＤＮＡ配列に
ハイブリダイズすることができ、かつ生物学的に活性な
ＴＮＦ−Ｒ分子をコードする場合；または（ｃ）そのＤ
ＮＡ配列が（ａ）または（ｂ）で定義したＤＮＡ配列に
遺伝暗号の結果として縮重しており、かつ生物学的に活
性なＴＮＦ−Ｒ分子をコードする場合に、ここに開示し
た特定のＤＮＡ配列に“実質的に類似している”といえ
る。
【００１８】本明細書中で用いる“組換え体”なる用語
は、蛋白が組換え体（例．微生物または哺乳類）発現系
から誘導されることを意味する。“マイクロバイアル”
は細菌または真菌（例．酵母）発現系により作られた組
換え蛋白を意味する。産物として、“組換えマイクロバ
イアル”は天然内因性物質を本質的に含まない微生物発
現系により生産された蛋白を表す。大部分の細菌培養物
（例．E.coli)により発現された蛋白はグリカンを含ま
ないであろう。酵母内で発現された蛋白は哺乳類細胞内
で発現されたものと異なるグリコシル化パターンを示す
ことがある。
は、蛋白が組換え体（例．微生物または哺乳類）発現系
から誘導されることを意味する。“マイクロバイアル”
は細菌または真菌（例．酵母）発現系により作られた組
換え蛋白を意味する。産物として、“組換えマイクロバ
イアル”は天然内因性物質を本質的に含まない微生物発
現系により生産された蛋白を表す。大部分の細菌培養物
（例．E.coli)により発現された蛋白はグリカンを含ま
ないであろう。酵母内で発現された蛋白は哺乳類細胞内
で発現されたものと異なるグリコシル化パターンを示す
ことがある。
【００１９】ＴＮＦレセプターの特性として明細書全体
を通して用いられる“生物学的に活性”とは、特定の分
子が検出可能な量のＴＮＦを結合でき、ＴＮＦ刺激を例
えばハイブリッドレセプター構築物の一成分として細胞
に伝達でき、または天然（つまり非組換え体）源からの
ＴＮＦ−Ｒに対して誘導された抗ＴＮＦ−Ｒと交差反応
できるように、ここに開示した本発明の具体例と十分な
アミノ酸配列類似性を共有することを意味する。好まし
くは、本発明の範囲内の生物学的に活性なＴＮＦレセプ
ターは標準結合検定（以下参照）でレセプター１ｎｍｏ
ｌｅ当たりＴＮＦを０．１ｎｍｏｌｅより多く結合で
き、最も好ましくは、レセプター１ｎｍｏｌｅ当たりＴ
ＮＦを０．５ｎｍｏｌｅより多く結合できる。
を通して用いられる“生物学的に活性”とは、特定の分
子が検出可能な量のＴＮＦを結合でき、ＴＮＦ刺激を例
えばハイブリッドレセプター構築物の一成分として細胞
に伝達でき、または天然（つまり非組換え体）源からの
ＴＮＦ−Ｒに対して誘導された抗ＴＮＦ−Ｒと交差反応
できるように、ここに開示した本発明の具体例と十分な
アミノ酸配列類似性を共有することを意味する。好まし
くは、本発明の範囲内の生物学的に活性なＴＮＦレセプ
ターは標準結合検定（以下参照）でレセプター１ｎｍｏ
ｌｅ当たりＴＮＦを０．１ｎｍｏｌｅより多く結合で
き、最も好ましくは、レセプター１ｎｍｏｌｅ当たりＴ
ＮＦを０．５ｎｍｏｌｅより多く結合できる。
【００２０】“単離されたＤＮＡ配列”は、実質的に純
粋な形態で（すなわち、内因性汚染物質を含まない）か
つ標準生化学的方法（例えば、クローニングベクターを
使用）によるその配列およびその構成ヌクレオチド配列
の同定、操作および回収を可能にする量または濃度で少
なくとも一度単離されたＤＮＡから誘導される、分離断
片の形をしたまたは大きいＤＮＡ構築物の一成分として
のＤＮＡポリマーを意味する。このような配列は好まし
くは、真核生物遺伝子中に一般に存在する内部非翻訳配
列すなわちイントロンが介在しないオープン・リーディ
ング・フレームの形で提供される。関係した配列を含む
ゲノムＤＮＡはコード配列の供給源としても用いられる
だろう。非翻訳ＤＮＡの配列はオープン・リーディング
・フレームの５’または３’側に存在してもよく、その
場合非翻訳ＤＮＡ配列はコード領域の遺伝子操作または
発現を妨げない。
粋な形態で（すなわち、内因性汚染物質を含まない）か
つ標準生化学的方法（例えば、クローニングベクターを
使用）によるその配列およびその構成ヌクレオチド配列
の同定、操作および回収を可能にする量または濃度で少
なくとも一度単離されたＤＮＡから誘導される、分離断
片の形をしたまたは大きいＤＮＡ構築物の一成分として
のＤＮＡポリマーを意味する。このような配列は好まし
くは、真核生物遺伝子中に一般に存在する内部非翻訳配
列すなわちイントロンが介在しないオープン・リーディ
ング・フレームの形で提供される。関係した配列を含む
ゲノムＤＮＡはコード配列の供給源としても用いられる
だろう。非翻訳ＤＮＡの配列はオープン・リーディング
・フレームの５’または３’側に存在してもよく、その
場合非翻訳ＤＮＡ配列はコード領域の遺伝子操作または
発現を妨げない。
【００２１】“ヌクレオチド配列”はデオキシリボヌク
レオチドのヘテロポリマーである。本発明により提供さ
れる蛋白をコードするＤＮＡ配列は、組換え転写単位内
で発現されうる合成遺伝子を得るために、ｃＤＮＡ断片
と短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連の
オリゴヌクレオチドから構築することができる。
レオチドのヘテロポリマーである。本発明により提供さ
れる蛋白をコードするＤＮＡ配列は、組換え転写単位内
で発現されうる合成遺伝子を得るために、ｃＤＮＡ断片
と短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連の
オリゴヌクレオチドから構築することができる。
【００２２】ＴＮＦ−ＲをコードするｃＤＮＡの単離 ＴＮＦ−Ｒのコード配列は、組換えｃＤＮＡまたはゲノ
ムＤＮＡライブラリーからＴＮＦ−Ｒをコードする相補
ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を単離することにより得られ
る。ｃＤＮＡライブラリーは好ましくは、哺乳類ＴＮＦ
−Ｒを発現する特定の細胞株（例えば、ヒト線維芽細胞
株ＷＩ−２６ＶＡ４（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９５．１）から
ポリアデニル化ｍＲＮＡを分離し、このｍＲＮＡを鋳型
として用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成することにより作製
される。その後、二本鎖ｃＤＮＡは組換えベクターにパ
ッケージングし、そのベクターを適切なE.coli 株内に
導入して増幅させる。ＴＮＦ−Ｒを発現するマウスまた
は他の哺乳類細胞株も使用できる。ｃＤＮＡライブラリ
ー中に含まれるＴＮＦ−Ｒ配列は、そのライブラリーを
ＴＮＦ−Ｒ ｃＤＮＡとハイブリダイズしうる適当な核
酸プローブを使ってスクリーニングすることにより簡単
に同定できる。別法として、ＴＮＦ−Ｒ蛋白をコードす
るＤＮＡは、第２Ａ−２Ｂ図または第３Ａ−３Ｃ図の配
列の全部または一部に対応する合成オリゴヌクレオチド
サブユニットを連結して完全なコード配列を得ることに
より構築することができる。
ムＤＮＡライブラリーからＴＮＦ−Ｒをコードする相補
ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を単離することにより得られ
る。ｃＤＮＡライブラリーは好ましくは、哺乳類ＴＮＦ
−Ｒを発現する特定の細胞株（例えば、ヒト線維芽細胞
株ＷＩ−２６ＶＡ４（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９５．１）から
ポリアデニル化ｍＲＮＡを分離し、このｍＲＮＡを鋳型
として用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成することにより作製
される。その後、二本鎖ｃＤＮＡは組換えベクターにパ
ッケージングし、そのベクターを適切なE.coli 株内に
導入して増幅させる。ＴＮＦ−Ｒを発現するマウスまた
は他の哺乳類細胞株も使用できる。ｃＤＮＡライブラリ
ー中に含まれるＴＮＦ−Ｒ配列は、そのライブラリーを
ＴＮＦ−Ｒ ｃＤＮＡとハイブリダイズしうる適当な核
酸プローブを使ってスクリーニングすることにより簡単
に同定できる。別法として、ＴＮＦ−Ｒ蛋白をコードす
るＤＮＡは、第２Ａ−２Ｂ図または第３Ａ−３Ｃ図の配
列の全部または一部に対応する合成オリゴヌクレオチド
サブユニットを連結して完全なコード配列を得ることに
より構築することができる。
【００２３】本発明のヒトＴＮＦレセプターｃＤＮＡは
直接発現クローニング法により単離した。ｃＤＮＡライ
ブラリーは初めにヒト線維芽細胞株ＷＩ−２６ＶＡ４か
ら細胞質ｍＲＮＡを分離することにより作製した。ポリ
アデニル化ＲＮＡを分離し、これを用いて二本鎖ｃＤＮ
Ａを作製した。精製ｃＤＮＡ断片はその後、以下の実施
例２に詳述される、ｐＤＣ２０１（ｐＭＬＳＶの誘導
体、Cosman et al., Nat ure 312:768, 1984 に以前に開
示された）由来の調節配列、ＳＶ４０およびサイトメガ
ロウイルスＤＮＡを使用するｐＣＡＶ／ＮＯＴベクター
ＤＮＡに連結した。ｐＣＡＶ／ＮＯＴはアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに受託番号ＡＴＣＣ６
８０１４として寄託された。ＷＩ２６−ＶＡ４ ｃＤＮ
Ａ断片を含むｐＣＡＶ／ＮＯＴベクターは E.coli Ｄ
Ｈ５α株に形質転換させた。形質転換体は平板培養し
て、平板当たり約８００コロニーを得た。形成されたコ
ロニーを収穫し、各プールは、本質的に Cosman et al.
(Nature 312:768, 1984)およびLuthman et al.(Nucl.A
cid Res. 11:1295, 1983)に記載されるようなＣＯＳ−
７細胞へのトランスフェクションのためのプラスミドＤ
ＮＡを作るべく使用した。生物学的に活性な細胞表面Ｔ
ＮＦレセプターを発現する形質転換体は、125Ｉ−ＴＮ
Ｆと結合するそれらの能力についてスクリーニングして
同定した。このスクリーニング法では、トランスフェク
トされたＣＯＳ−７細胞を125Ｉ−ＴＮＦ含有培地を用
いてインキュベートし、細胞を洗って未結合標識ＴＮＦ
を除き、細胞単層をＸ線フィルムと接触させて、Sims e
t al., Science 241:585(1988)に記載されるように、
ＴＮＦ結合の濃度を検出した。この方法で検出される形
質転換体は、比較的明るいバックグラウンドに対して暗
い点として現れる。
直接発現クローニング法により単離した。ｃＤＮＡライ
ブラリーは初めにヒト線維芽細胞株ＷＩ−２６ＶＡ４か
ら細胞質ｍＲＮＡを分離することにより作製した。ポリ
アデニル化ＲＮＡを分離し、これを用いて二本鎖ｃＤＮ
Ａを作製した。精製ｃＤＮＡ断片はその後、以下の実施
例２に詳述される、ｐＤＣ２０１（ｐＭＬＳＶの誘導
体、Cosman et al., Nat ure 312:768, 1984 に以前に開
示された）由来の調節配列、ＳＶ４０およびサイトメガ
ロウイルスＤＮＡを使用するｐＣＡＶ／ＮＯＴベクター
ＤＮＡに連結した。ｐＣＡＶ／ＮＯＴはアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに受託番号ＡＴＣＣ６
８０１４として寄託された。ＷＩ２６−ＶＡ４ ｃＤＮ
Ａ断片を含むｐＣＡＶ／ＮＯＴベクターは E.coli Ｄ
Ｈ５α株に形質転換させた。形質転換体は平板培養し
て、平板当たり約８００コロニーを得た。形成されたコ
ロニーを収穫し、各プールは、本質的に Cosman et al.
(Nature 312:768, 1984)およびLuthman et al.(Nucl.A
cid Res. 11:1295, 1983)に記載されるようなＣＯＳ−
７細胞へのトランスフェクションのためのプラスミドＤ
ＮＡを作るべく使用した。生物学的に活性な細胞表面Ｔ
ＮＦレセプターを発現する形質転換体は、125Ｉ−ＴＮ
Ｆと結合するそれらの能力についてスクリーニングして
同定した。このスクリーニング法では、トランスフェク
トされたＣＯＳ−７細胞を125Ｉ−ＴＮＦ含有培地を用
いてインキュベートし、細胞を洗って未結合標識ＴＮＦ
を除き、細胞単層をＸ線フィルムと接触させて、Sims e
t al., Science 241:585(1988)に記載されるように、
ＴＮＦ結合の濃度を検出した。この方法で検出される形
質転換体は、比較的明るいバックグラウンドに対して暗
い点として現れる。
【００２４】この手法を使って、１つのトランスフェク
タントプールのアッセイがＴＮＦ結合について陽性を示
すまで、約８００のｃＤＮＡプールにおいて約２４００
００のｃＤＮＡをスクリーニングした。陽性プールから
の細菌凍結物は培養下に増殖させ、平板培養して個々の
コロニーを形成させ、検出しうるＴＮＦ結合活性を有す
る表面蛋白の合成を導きうる単一クローン（クローン１
１）が同定されるまでこれらのコロニーをスクリーニン
グした。上記方法により単離されたｃＤＮＡクローン１
１の配列は第３Ａ−３Ｃ図に示してある。
タントプールのアッセイがＴＮＦ結合について陽性を示
すまで、約８００のｃＤＮＡプールにおいて約２４００
００のｃＤＮＡをスクリーニングした。陽性プールから
の細菌凍結物は培養下に増殖させ、平板培養して個々の
コロニーを形成させ、検出しうるＴＮＦ結合活性を有す
る表面蛋白の合成を導きうる単一クローン（クローン１
１）が同定されるまでこれらのコロニーをスクリーニン
グした。上記方法により単離されたｃＤＮＡクローン１
１の配列は第３Ａ−３Ｃ図に示してある。
【００２５】別のｃＤＮＡクローンは他の哺乳類種のｃ
ＤＮＡライブラリーから交差種ハイブリダイゼーション
により単離することができる。ハイブリダイゼーション
で使用するために、ＴＮＦ−ＲをコードするＤＮＡは、
当分野でよく知られた方法により検出可能な物質（例え
ば、蛍光基、放射性原子または化学発光基）で共有結合
的に標識される。この種のプローブは特定疾患の in vi
tro 診断にも利用されるだろう。
ＤＮＡライブラリーから交差種ハイブリダイゼーション
により単離することができる。ハイブリダイゼーション
で使用するために、ＴＮＦ−ＲをコードするＤＮＡは、
当分野でよく知られた方法により検出可能な物質（例え
ば、蛍光基、放射性原子または化学発光基）で共有結合
的に標識される。この種のプローブは特定疾患の in vi
tro 診断にも利用されるだろう。
【００２６】たいていの哺乳類遺伝子と同様に、哺乳類
ＴＮＦレセプターも恐らく多重エクソン遺伝子によりコ
ードされる。転写後に異なるｍＲＮＡスプライシング現
象を受けたためと考えられ、ここで請求したｃＤＮＡと
同一性または類似性の大きい領域を共有する別のｍＲＮ
Ａも本発明の範囲内であるとみなされる。
ＴＮＦレセプターも恐らく多重エクソン遺伝子によりコ
ードされる。転写後に異なるｍＲＮＡスプライシング現
象を受けたためと考えられ、ここで請求したｃＤＮＡと
同一性または類似性の大きい領域を共有する別のｍＲＮ
Ａも本発明の範囲内であるとみなされる。
【００２７】他の哺乳類ＴＮＦ−Ｒ ｃＤＮＡは、特定
の哺乳類ｃＤＮＡライブラリーを交差種ハイブリダイゼ
ーションによりスクリーニングするためのプローブとし
て、適当なヒトＴＮＦ−Ｒ ＤＮＡ配列を使用すること
により単離される。
の哺乳類ｃＤＮＡライブラリーを交差種ハイブリダイゼ
ーションによりスクリーニングするためのプローブとし
て、適当なヒトＴＮＦ−Ｒ ＤＮＡ配列を使用すること
により単離される。
【００２８】蛋白および類縁体 本発明は、単離された組換え哺乳類ＴＮＦ−Ｒポリペプ
チドを提供する。本発明の単離ＴＮＦ−Ｒポリペプチド
は実質的に天然または内因性起源の他の汚染物質を含ま
ず、生産プロセスの残留蛋白汚染を約１％より少ない量
で含む。天然ヒトＴＮＦ−Ｒ分子はＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より約８０キロダルトン（ｋＤａ）の見掛け分子量をも
つ糖蛋白として細胞リゼイトから回収される。本発明の
ＴＮＦ−Ｒポリペプチドには、天然パターンのグリコシ
ル化結合が存在しなくてもよい。
チドを提供する。本発明の単離ＴＮＦ−Ｒポリペプチド
は実質的に天然または内因性起源の他の汚染物質を含ま
ず、生産プロセスの残留蛋白汚染を約１％より少ない量
で含む。天然ヒトＴＮＦ−Ｒ分子はＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より約８０キロダルトン（ｋＤａ）の見掛け分子量をも
つ糖蛋白として細胞リゼイトから回収される。本発明の
ＴＮＦ−Ｒポリペプチドには、天然パターンのグリコシ
ル化結合が存在しなくてもよい。
【００２９】本発明の哺乳類ＴＮＦ−Ｒには、例えば霊
長類、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウ
マ、およびブタＴＮＦ−Ｒが含まれる。哺乳類ＴＮＦ−
Ｒは、哺乳類ｃＤＮＡライブラリーからＴＮＦ−Ｒ ｃ
ＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションプロー
ブとしてヒトＴＮＦ−ＲＤＮＡ配列から誘導された一本
鎖ｃＤＮＡを使って、交差種ハイブリダイゼーションに
より得ることができる。
長類、ヒト、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウ
マ、およびブタＴＮＦ−Ｒが含まれる。哺乳類ＴＮＦ−
Ｒは、哺乳類ｃＤＮＡライブラリーからＴＮＦ−Ｒ ｃ
ＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションプロー
ブとしてヒトＴＮＦ−ＲＤＮＡ配列から誘導された一本
鎖ｃＤＮＡを使って、交差種ハイブリダイゼーションに
より得ることができる。
【００３０】本発明の範囲内のＴＮＦ−Ｒ誘導体には、
生物学的活性を保持するいろいろな構造形態の一次蛋白
が含まれる。イオン化可能なアミノ基およびカルボキシ
ル基が存在するために、例えば、ＴＮＦ−Ｒ蛋白は酸性
または塩基性塩の形をとることができ、また中性の形で
あってもよい。さらに、個々のアミノ酸残基は酸化また
は還元によって修飾されてもよい。
生物学的活性を保持するいろいろな構造形態の一次蛋白
が含まれる。イオン化可能なアミノ基およびカルボキシ
ル基が存在するために、例えば、ＴＮＦ−Ｒ蛋白は酸性
または塩基性塩の形をとることができ、また中性の形で
あってもよい。さらに、個々のアミノ酸残基は酸化また
は還元によって修飾されてもよい。
【００３１】一次アミノ酸構造は、他の化学成分（例え
ば、グリコシル基、脂質、ホスフェート、アセチル基）
との共有結合複合体または集合複合体を形成するか、あ
るいはアミノ酸配列変異体を形成することにより修飾さ
れる。共有結合誘導体は特定の官能基をＴＮＦ−Ｒアミ
ノ酸側鎖に、あるいはＮまたはＣ末端に結合させること
によって作られる。本発明の範囲内の他のＴＮＦ−Ｒ誘
導体には、Ｎ末端またはＣ末端融合体として組換え体の
培養により合成されるような、ＴＮＦ−Ｒまたはその断
片と他の蛋白またはポリペプチドとの共有結合もしくは
集合複合体が含まれる。例えば、結合されるペプチドは
翻訳と同時にまたは翻訳後に蛋白をその合成部位から細
胞膜または細胞壁の内側もしくは外側の機能部位へ移動
させる蛋白のＮ末端領域にあるシグナル（またはリーダ
ー）ポリペプチド配列（例．酵母α−因子リーダー）で
ありうる。ＴＮＦ−Ｒ蛋白融合体はＴＮＦ−Ｒの精製ま
たは同定を容易にするために付加されたペプチド（例．
ポリ−Ｈｉｓ）を含むことができる。また、ＴＮＦ−Ｒ
レセプターのアミノ酸配列はペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−
Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（Ｄ
ＹＫＤＤＤＤＫ）に結合させてもよい（Hopp et al., B
io/Technology 6:1204, 1988)。後者の配列は高度に抗
原性があり、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合
するエピトープを提供して、発現された組換え蛋白の迅
速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。この配列
はまたＡｓｐ−Ｌｙｓ対のすぐ後の残基でウシ粘膜エン
テロキナーゼにより特異的に切断される。このペプチド
でキャップされた融合蛋白は、E.coli による細胞内分
解に抵抗するだろう。
ば、グリコシル基、脂質、ホスフェート、アセチル基）
との共有結合複合体または集合複合体を形成するか、あ
るいはアミノ酸配列変異体を形成することにより修飾さ
れる。共有結合誘導体は特定の官能基をＴＮＦ−Ｒアミ
ノ酸側鎖に、あるいはＮまたはＣ末端に結合させること
によって作られる。本発明の範囲内の他のＴＮＦ−Ｒ誘
導体には、Ｎ末端またはＣ末端融合体として組換え体の
培養により合成されるような、ＴＮＦ−Ｒまたはその断
片と他の蛋白またはポリペプチドとの共有結合もしくは
集合複合体が含まれる。例えば、結合されるペプチドは
翻訳と同時にまたは翻訳後に蛋白をその合成部位から細
胞膜または細胞壁の内側もしくは外側の機能部位へ移動
させる蛋白のＮ末端領域にあるシグナル（またはリーダ
ー）ポリペプチド配列（例．酵母α−因子リーダー）で
ありうる。ＴＮＦ−Ｒ蛋白融合体はＴＮＦ−Ｒの精製ま
たは同定を容易にするために付加されたペプチド（例．
ポリ−Ｈｉｓ）を含むことができる。また、ＴＮＦ−Ｒ
レセプターのアミノ酸配列はペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−
Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（Ｄ
ＹＫＤＤＤＤＫ）に結合させてもよい（Hopp et al., B
io/Technology 6:1204, 1988)。後者の配列は高度に抗
原性があり、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合
するエピトープを提供して、発現された組換え蛋白の迅
速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。この配列
はまたＡｓｐ−Ｌｙｓ対のすぐ後の残基でウシ粘膜エン
テロキナーゼにより特異的に切断される。このペプチド
でキャップされた融合蛋白は、E.coli による細胞内分
解に抵抗するだろう。
【００３２】また、ＴＮＦ−Ｒ誘導体は免疫原、レセプ
ターに基づくイムノアッセイ用の試薬、またはＴＮＦや
他の結合リガンドのアフィニティー精製用の結合剤とし
て使用される。ＴＮＦ−Ｒ誘導体はシステインおよびリ
シン残基にＭ−マレイミドベンゾイルスクシンイミドエ
ステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような作
用物質を架橋することによっても得られる。また、ＴＮ
Ｆ−Ｒ蛋白は反応性側基を介して臭化シアン活性化、ビ
スオキシラン活性化、カルボニルジイミダゾール活性化
またはトシル活性化アガロース構造物のような種々の不
溶性支持体へ共有結合で結合させることができ、あるい
はポリオレフィン表面（グルタルアルデヒド架橋を含む
または含まない）へ吸着させることもできる。ひとたび
支持体に結合されると、ＴＮＦ−Ｒは抗ＴＮＦ−Ｒ抗体
またはＴＮＦを（アッセイや精製の目的で）選択的に結
合させるべく用いられる。
ターに基づくイムノアッセイ用の試薬、またはＴＮＦや
他の結合リガンドのアフィニティー精製用の結合剤とし
て使用される。ＴＮＦ−Ｒ誘導体はシステインおよびリ
シン残基にＭ−マレイミドベンゾイルスクシンイミドエ
ステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような作
用物質を架橋することによっても得られる。また、ＴＮ
Ｆ−Ｒ蛋白は反応性側基を介して臭化シアン活性化、ビ
スオキシラン活性化、カルボニルジイミダゾール活性化
またはトシル活性化アガロース構造物のような種々の不
溶性支持体へ共有結合で結合させることができ、あるい
はポリオレフィン表面（グルタルアルデヒド架橋を含む
または含まない）へ吸着させることもできる。ひとたび
支持体に結合されると、ＴＮＦ−Ｒは抗ＴＮＦ−Ｒ抗体
またはＴＮＦを（アッセイや精製の目的で）選択的に結
合させるべく用いられる。
【００３３】本発明はまた、天然パターンのグリコシル
化結合を含むまたは含まないＴＮＦ−Ｒを包含する。酵
母または哺乳類発現系（例．ＣＯＳ−７細胞）により発
現されたＴＮＦ−Ｒは、発現系に応じて、天然分子と類
似しているか、あるいは分子量およびグリコシル化パタ
ーンがわずかに異なる。E.coli のような細菌によるＴ
ＮＦ−Ｒ ＤＮＡの発現は非グリコシル化分子をもたら
す。不活性化Ｎグリコシル化部位をもつ哺乳類ＴＮＦ−
Ｒの機能的な変異類縁体は、オリゴヌクレオチドの合成
および連結により、または特定部位の突然変異誘発法に
より作ることができる。これらの蛋白類縁体は、酵母発
現系を使って、良好な収量で均質な還元炭水化物形態と
して生産される。真核生物蛋白のＮグリコシル化部位は
アミノ酸トリプレット：Ａｓｎ−Ａ1−Ｚ（ここで、Ａ1
はＰｒｏ以外のアミノ酸で、ＺはＳｅｒまたはＴｈｒで
ある）により特徴づけられる。この配列において、アス
パラギンは炭水化物の共有結合のための側鎖アミノ基を
提供する。このような部位はＡｓｎまたは残基Ｚを他の
アミノ酸で置換するか、ＡｓｎまたはＺを欠失させる
か、あるいはＡ1とＺの間にＺ以外のアミノ酸を、また
はＡｓｎとＡ1の間にＡｓｎ以外のアミノ酸を挿入する
ことにより排除しうる。
化結合を含むまたは含まないＴＮＦ−Ｒを包含する。酵
母または哺乳類発現系（例．ＣＯＳ−７細胞）により発
現されたＴＮＦ−Ｒは、発現系に応じて、天然分子と類
似しているか、あるいは分子量およびグリコシル化パタ
ーンがわずかに異なる。E.coli のような細菌によるＴ
ＮＦ−Ｒ ＤＮＡの発現は非グリコシル化分子をもたら
す。不活性化Ｎグリコシル化部位をもつ哺乳類ＴＮＦ−
Ｒの機能的な変異類縁体は、オリゴヌクレオチドの合成
および連結により、または特定部位の突然変異誘発法に
より作ることができる。これらの蛋白類縁体は、酵母発
現系を使って、良好な収量で均質な還元炭水化物形態と
して生産される。真核生物蛋白のＮグリコシル化部位は
アミノ酸トリプレット：Ａｓｎ−Ａ1−Ｚ（ここで、Ａ1
はＰｒｏ以外のアミノ酸で、ＺはＳｅｒまたはＴｈｒで
ある）により特徴づけられる。この配列において、アス
パラギンは炭水化物の共有結合のための側鎖アミノ基を
提供する。このような部位はＡｓｎまたは残基Ｚを他の
アミノ酸で置換するか、ＡｓｎまたはＺを欠失させる
か、あるいはＡ1とＺの間にＺ以外のアミノ酸を、また
はＡｓｎとＡ1の間にＡｓｎ以外のアミノ酸を挿入する
ことにより排除しうる。
【００３４】さらに、ＴＮＦ−Ｒ誘導体はＴＮＦ−Ｒま
たはそのサブユニットの突然変異によっても得られる。
本明細書中で述べるＴＮＦ−Ｒ変異体はＴＮＦ−Ｒに相
同であるが、欠失、挿入または置換のために天然ＴＮＦ
−Ｒと相違するアミノ酸配列をもつポリペプチドであ
る。
たはそのサブユニットの突然変異によっても得られる。
本明細書中で述べるＴＮＦ−Ｒ変異体はＴＮＦ−Ｒに相
同であるが、欠失、挿入または置換のために天然ＴＮＦ
−Ｒと相違するアミノ酸配列をもつポリペプチドであ
る。
【００３５】ＴＮＦ−Ｒ蛋白の生物学的均等類縁体は、
例えば残基または配列の各種置換をつくるか、あるいは
末端残基、内部残基もしくは生物学的活性に必要でない
配列を欠失させることにより構築できる。例えば、シス
テイン残基を欠失させたり（例．Ｃｙｓ178）、再生の
際の不必要なまたは不正確な分子内ジスルフィド橋の形
成を防ぐために他のアミノ酸と置換させたりすることが
できる。その他の突然変異誘発法には、ＫＥＸ２プロテ
アーゼ活性が存在する酵母系での発現を高めるための隣
接二塩基性アミノ酸残基の修飾が含まれる。一般に、置
換は保存的に行われるべきである；すなわち、最適な代
替アミノ酸は置換しようとする残基の物理化学的特性と
似通った特性をもつものである。同様に、欠失または挿
入戦略を採用する場合、欠失または挿入が生物学的活性
に与える影響を考慮すべきである。先に定義した実質的
に類似したポリペプチド配列は、一般に同数のアミノ酸
配列から成るが、可溶性ＴＮＦ−Ｒを構築するためのＣ
末端切断はより少ないアミノ酸配列を含むであろう。Ｔ
ＮＦ−Ｒの生物学的活性を保持するために、欠失および
置換は好ましくは相同なまたは保存的に置換された配列
（すなわち、所定の残基が生物学的に類似した残基によ
って置換されることを意味する）をもたらすだろう。保
存的置換の例には、ある細胞族残基の他の細胞族残基と
の置換（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌ
ａの互いとの置換）、あるいはある極性残基の別の極性
残基との置換（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓ
ｐ；またはＧｌｎとＡｓｎ間の置換）が含まれる。その
他のこのような保存的置換、例えば類似の疎水特性をも
つ全領域の置換もよく知られている。さらに、ヒト、マ
ウスおよび他の哺乳類ＴＮＦ−Ｒ間の特定のアミノ酸の
差異は、ＴＮＦ−Ｒの本質的な生物学的活性を変えずに
行うことのできる別の保存的置換を示唆している。
例えば残基または配列の各種置換をつくるか、あるいは
末端残基、内部残基もしくは生物学的活性に必要でない
配列を欠失させることにより構築できる。例えば、シス
テイン残基を欠失させたり（例．Ｃｙｓ178）、再生の
際の不必要なまたは不正確な分子内ジスルフィド橋の形
成を防ぐために他のアミノ酸と置換させたりすることが
できる。その他の突然変異誘発法には、ＫＥＸ２プロテ
アーゼ活性が存在する酵母系での発現を高めるための隣
接二塩基性アミノ酸残基の修飾が含まれる。一般に、置
換は保存的に行われるべきである；すなわち、最適な代
替アミノ酸は置換しようとする残基の物理化学的特性と
似通った特性をもつものである。同様に、欠失または挿
入戦略を採用する場合、欠失または挿入が生物学的活性
に与える影響を考慮すべきである。先に定義した実質的
に類似したポリペプチド配列は、一般に同数のアミノ酸
配列から成るが、可溶性ＴＮＦ−Ｒを構築するためのＣ
末端切断はより少ないアミノ酸配列を含むであろう。Ｔ
ＮＦ−Ｒの生物学的活性を保持するために、欠失および
置換は好ましくは相同なまたは保存的に置換された配列
（すなわち、所定の残基が生物学的に類似した残基によ
って置換されることを意味する）をもたらすだろう。保
存的置換の例には、ある細胞族残基の他の細胞族残基と
の置換（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌ
ａの互いとの置換）、あるいはある極性残基の別の極性
残基との置換（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓ
ｐ；またはＧｌｎとＡｓｎ間の置換）が含まれる。その
他のこのような保存的置換、例えば類似の疎水特性をも
つ全領域の置換もよく知られている。さらに、ヒト、マ
ウスおよび他の哺乳類ＴＮＦ−Ｒ間の特定のアミノ酸の
差異は、ＴＮＦ−Ｒの本質的な生物学的活性を変えずに
行うことのできる別の保存的置換を示唆している。
【００３６】ＴＮＦ−Ｒのサブユニットは末端または内
部の残基もしくは配列を欠失させることにより構築され
る。特に好適な配列には、ＴＮＦ−Ｒのトランスメンブ
ラン領域および細胞内ドメインが培地へのレセプターの
分泌を促すために欠失されたか、または親水性残基で置
換されたものが含まれる。生成した蛋白はＴＮＦ結合能
を保持する可溶性ＴＮＦ−Ｒ分子と呼ばれる。特に好適
な可溶性ＴＮＦ−Ｒ構築物はＴＮＦ−ＲΔ２３５（第２
Ａ図のアミノ酸１−２３５の配列）であり、これはトラ
ンスメンブラン領域に隣接したＡｓｐ235で終わるＴＮ
Ｆ−Ｒの全細胞外領域を含んでいる。追加のアミノ酸が
ＴＮＦ結合活性を保持しつつトランスメンブラン領域か
ら欠失される。例えば、第２Ａ図のアミノ酸１−１８３
の配列から成るｈｕＴＮＦ−ＲΔ１８３、および第２Ａ
図のアミノ酸１−１６３の配列から成るＴＮＦ−ＲΔ１
６３は、以下の実施例１で述べる結合検定を使って調べ
たとき、ＴＮＦリガンド結合能を保持している。しか
し、ＴＮＦ−ＲΔ１４２はＴＮＦリガンド結合能をもっ
ていない。これはＣｙｓ157とＣｙｓ163の一方または両
方がＴＮＦ−Ｒの適切な折りたたみ（folding)のための
分子内ジスルフィド橋の形成に必要であることを暗示し
ている。可溶性ＴＮＦ−ＲのＴＮＦ結合能に対して明ら
かな悪影響を及ぼすことなく欠失されたＣｙｓ178は、
ＴＮＦ−Ｒの適切な折りたたみに必要ではないらしい。
従って、Ｃ末端からＣｙｓ163までのいずれの欠失も生
物学的に活性な可溶性ＴＮＦ−Ｒをもたらすことが期待
される。本発明はＣｙｓ163以後のアミノ酸で終わるＴ
ＮＦ−Ｒの細胞外領域の全部または一部に相当するこの
種の可溶性ＴＮＦ−Ｒ構築物を包含するものである。Ｔ
ＮＦ−ＲΔ１５７のような他のＣ末端欠失物は、便宜
上、ＴＮＦ−Ｒ ｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、
必要に応じて、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用い
て特定配列を再構築することにより作られる。その後、
得られた可溶性ＴＮＦ−Ｒ構築物は適当な発現ベクター
に挿入して発現させ、実施例１に記載するようにＴＮＦ
結合能を検定する。このような構築から得られた生物学
的に活性な可溶性ＴＮＦ−Ｒも本発明の範囲内に含まれ
るものである。
部の残基もしくは配列を欠失させることにより構築され
る。特に好適な配列には、ＴＮＦ−Ｒのトランスメンブ
ラン領域および細胞内ドメインが培地へのレセプターの
分泌を促すために欠失されたか、または親水性残基で置
換されたものが含まれる。生成した蛋白はＴＮＦ結合能
を保持する可溶性ＴＮＦ−Ｒ分子と呼ばれる。特に好適
な可溶性ＴＮＦ−Ｒ構築物はＴＮＦ−ＲΔ２３５（第２
Ａ図のアミノ酸１−２３５の配列）であり、これはトラ
ンスメンブラン領域に隣接したＡｓｐ235で終わるＴＮ
Ｆ−Ｒの全細胞外領域を含んでいる。追加のアミノ酸が
ＴＮＦ結合活性を保持しつつトランスメンブラン領域か
ら欠失される。例えば、第２Ａ図のアミノ酸１−１８３
の配列から成るｈｕＴＮＦ−ＲΔ１８３、および第２Ａ
図のアミノ酸１−１６３の配列から成るＴＮＦ−ＲΔ１
６３は、以下の実施例１で述べる結合検定を使って調べ
たとき、ＴＮＦリガンド結合能を保持している。しか
し、ＴＮＦ−ＲΔ１４２はＴＮＦリガンド結合能をもっ
ていない。これはＣｙｓ157とＣｙｓ163の一方または両
方がＴＮＦ−Ｒの適切な折りたたみ（folding)のための
分子内ジスルフィド橋の形成に必要であることを暗示し
ている。可溶性ＴＮＦ−ＲのＴＮＦ結合能に対して明ら
かな悪影響を及ぼすことなく欠失されたＣｙｓ178は、
ＴＮＦ−Ｒの適切な折りたたみに必要ではないらしい。
従って、Ｃ末端からＣｙｓ163までのいずれの欠失も生
物学的に活性な可溶性ＴＮＦ−Ｒをもたらすことが期待
される。本発明はＣｙｓ163以後のアミノ酸で終わるＴ
ＮＦ−Ｒの細胞外領域の全部または一部に相当するこの
種の可溶性ＴＮＦ−Ｒ構築物を包含するものである。Ｔ
ＮＦ−ＲΔ１５７のような他のＣ末端欠失物は、便宜
上、ＴＮＦ−Ｒ ｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、
必要に応じて、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用い
て特定配列を再構築することにより作られる。その後、
得られた可溶性ＴＮＦ−Ｒ構築物は適当な発現ベクター
に挿入して発現させ、実施例１に記載するようにＴＮＦ
結合能を検定する。このような構築から得られた生物学
的に活性な可溶性ＴＮＦ−Ｒも本発明の範囲内に含まれ
るものである。
【００３７】ＴＮＦ−Ｒ類縁体の発現のために構築され
たヌクレオチド配列中の突然変異は、もちろん、コード
配列のリーディング・フレームを保持しなければなら
ず、好ましくはレセプターｍＲＮＡの翻訳に悪影響を及
ぼすループやヘアピンのような二次ｍＲＮＡ構造をもた
らすようにハイブリダイズする相補領域を形成しないで
あろう。変異部位は前以て特定しうるが、突然変異の性
質それ自体を予め決定することは必要でない。例えば、
特定部位の突然変異体の最適性質を選ぶために、標的コ
ドンでランダムな突然変異誘発を行い、発現されたＴＮ
Ｆ−Ｒ変異体を目的の活性についてスクリーニングする
ことができる。
たヌクレオチド配列中の突然変異は、もちろん、コード
配列のリーディング・フレームを保持しなければなら
ず、好ましくはレセプターｍＲＮＡの翻訳に悪影響を及
ぼすループやヘアピンのような二次ｍＲＮＡ構造をもた
らすようにハイブリダイズする相補領域を形成しないで
あろう。変異部位は前以て特定しうるが、突然変異の性
質それ自体を予め決定することは必要でない。例えば、
特定部位の突然変異体の最適性質を選ぶために、標的コ
ドンでランダムな突然変異誘発を行い、発現されたＴＮ
Ｆ−Ｒ変異体を目的の活性についてスクリーニングする
ことができる。
【００３８】ＴＮＦ−Ｒをコードするヌクレオチド配列
中のすべての変異が最終産物において発現されるわけで
はなく、例えば、発現を高めるために、主として転写さ
れたｍＲＮＡ中の二次構造ループを避けるために（欧州
特許公開第７５４４４Ａ号参照）、あるいは所定の宿主
によって翻訳されやすいコドン（例．E.coli 発現の場
合はよく知られたE.coli 優先コドン）を与えるため
に、ヌクレオチド置換が行われる。
中のすべての変異が最終産物において発現されるわけで
はなく、例えば、発現を高めるために、主として転写さ
れたｍＲＮＡ中の二次構造ループを避けるために（欧州
特許公開第７５４４４Ａ号参照）、あるいは所定の宿主
によって翻訳されやすいコドン（例．E.coli 発現の場
合はよく知られたE.coli 優先コドン）を与えるため
に、ヌクレオチド置換が行われる。
【００３９】突然変異は、天然配列の断片への連結を可
能にする制限部位が両末端に存在する変異配列を含むオ
リゴヌクレオチドを合成することにより、特定の箇所に
導入することができる。連結後に得られる再構築配列は
目的のアミノ酸の挿入、置換または欠失を含む類縁体を
コードする。
能にする制限部位が両末端に存在する変異配列を含むオ
リゴヌクレオチドを合成することにより、特定の箇所に
導入することができる。連結後に得られる再構築配列は
目的のアミノ酸の挿入、置換または欠失を含む類縁体を
コードする。
【００４０】また、オリゴヌクレオチドにより誘導され
る特定部位の突然変異誘発法は、必要な置換、欠失、ま
たは挿入により変更された特定のコドンをもつ変異遺伝
子を与えるために使用される。上記の変異を作る方法
は、例えば、Walder et al.,(Gene 42:133, 1986);Baue
r et al.,(Gene 37:73, 1985);Craik(BioTechniques,Ja
nuary 1985,12-19);Smith et al.,(Genetic Engineerin
g: Principles and Methods,Plenum Press,1981);米国特
許第４５１８５８４号および同第４７３７４６２号に記
載されている。これらの文献は適切な技術を開示してお
り、参照によりここに引用される。
る特定部位の突然変異誘発法は、必要な置換、欠失、ま
たは挿入により変更された特定のコドンをもつ変異遺伝
子を与えるために使用される。上記の変異を作る方法
は、例えば、Walder et al.,(Gene 42:133, 1986);Baue
r et al.,(Gene 37:73, 1985);Craik(BioTechniques,Ja
nuary 1985,12-19);Smith et al.,(Genetic Engineerin
g: Principles and Methods,Plenum Press,1981);米国特
許第４５１８５８４号および同第４７３７４６２号に記
載されている。これらの文献は適切な技術を開示してお
り、参照によりここに引用される。
【００４１】ＴＮＦ−Ｒの１価形態および多価形態は両
方とも本発明の組成物および方法において有用である。
多価形態はＴＮＦリガンドの結合部位を複数もってい
る。例えば、２価の可溶性ＴＮＦ−Ｒはリンカー領域に
よって隔てられた第２Ａ図のアミノ酸１−２３５の直列
反復から成っている。また、別の多価形態は、例えば、
ＴＮＦ−Ｒを臨床的に許容しうる担体分子（フィコー
ル、ポリエチレングリコールまたはデキストランより成
る群から選ばれるポリマー）の通常のカップリング技術
を使って化学的にカップリングすることにより構築でき
る。別法として、ＴＮＦ−Ｒはビオチンに化学的にカッ
プリングすることができ、その後ビオチン−ＴＮＦ−Ｒ
複合体をアビジンに結合させて、４価のアビジン−ビオ
チン−ＴＮＦ−Ｒ分子を得ることができる。ＴＮＦ−Ｒ
はさらにジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニト
ロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合でカップリングさ
せ、生成した複合体を抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭ
で沈澱させて、１０価のＴＮＦ−Ｒ結合部位をもつデカ
マー複合体を形成することができる。
方とも本発明の組成物および方法において有用である。
多価形態はＴＮＦリガンドの結合部位を複数もってい
る。例えば、２価の可溶性ＴＮＦ−Ｒはリンカー領域に
よって隔てられた第２Ａ図のアミノ酸１−２３５の直列
反復から成っている。また、別の多価形態は、例えば、
ＴＮＦ−Ｒを臨床的に許容しうる担体分子（フィコー
ル、ポリエチレングリコールまたはデキストランより成
る群から選ばれるポリマー）の通常のカップリング技術
を使って化学的にカップリングすることにより構築でき
る。別法として、ＴＮＦ−Ｒはビオチンに化学的にカッ
プリングすることができ、その後ビオチン−ＴＮＦ−Ｒ
複合体をアビジンに結合させて、４価のアビジン−ビオ
チン−ＴＮＦ−Ｒ分子を得ることができる。ＴＮＦ−Ｒ
はさらにジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニト
ロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合でカップリングさ
せ、生成した複合体を抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭ
で沈澱させて、１０価のＴＮＦ−Ｒ結合部位をもつデカ
マー複合体を形成することができる。
【００４２】また、免疫グロブリン分子重鎖および軽鎖
のいずれか一方または両方の可変部ドメインの代わりに
ＴＮＦ−Ｒ配列を有しかつ未修飾不変部ドメインを有す
る組換えキメラ抗体分子を作ることができる。例えば、
キメラＴＮＦ−Ｒ／ＩｇＧ１は、２つのキメラ遺伝子−
−ＴＮＦ−Ｒ／ヒトκ軽鎖キメラ（ＴＮＦ−Ｒ／Ｃκ）
およびＴＮＦ−Ｒ／ヒトγ1重鎖キメラ（ＴＮＦ−Ｒ／
Ｃγ-1）から作られる。２つのキメラ遺伝子の転写・翻
訳後に、これらの遺伝子産物は２価のＴＮＦ−Ｒをもつ
単一のキメラ抗体分子に組み立てる。このようなＴＮＦ
−Ｒの多価形態はＴＮＦリガンドに対する結合親和性が
増強される。この種のキメラ抗体分子の構築に関する細
部は、国際出願ＷＯ８９／０９６２２および欧州特許第
３１５０６２号に記載されている。
のいずれか一方または両方の可変部ドメインの代わりに
ＴＮＦ−Ｒ配列を有しかつ未修飾不変部ドメインを有す
る組換えキメラ抗体分子を作ることができる。例えば、
キメラＴＮＦ−Ｒ／ＩｇＧ１は、２つのキメラ遺伝子−
−ＴＮＦ−Ｒ／ヒトκ軽鎖キメラ（ＴＮＦ−Ｒ／Ｃκ）
およびＴＮＦ−Ｒ／ヒトγ1重鎖キメラ（ＴＮＦ−Ｒ／
Ｃγ-1）から作られる。２つのキメラ遺伝子の転写・翻
訳後に、これらの遺伝子産物は２価のＴＮＦ−Ｒをもつ
単一のキメラ抗体分子に組み立てる。このようなＴＮＦ
−Ｒの多価形態はＴＮＦリガンドに対する結合親和性が
増強される。この種のキメラ抗体分子の構築に関する細
部は、国際出願ＷＯ８９／０９６２２および欧州特許第
３１５０６２号に記載されている。
【００４３】組換えＴＮＦ−Ｒの発現 本発明は、ＴＮＦ−ＲをコードするＤＮＡを増幅または
発現するための組換え発現ベクターを提供する。組換え
発現ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルス、または昆
虫の遺伝子から誘導された適当な転写または翻訳調節要
素に機能しうる状態で連結された、哺乳類ＴＮＦ−Ｒま
たは生物学的に均等な類縁体をコードする合成またはｃ
ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を含む、複製可能なＤＮＡ構築
物である。転写単位は一般に、（１）遺伝子発現におい
て調節の役割をもつ１以上の遺伝要素、例えば転写プロ
モーターまたはエンハンサー；（２）ｍＲＮＡに転写さ
れ、蛋白に翻訳される構造配列またはコード配列；およ
び（３）以下で詳述するような、転写および翻訳の開始
および終結配列；の集合体から成る。前記の調節要素に
は転写を制御するオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリ
ボソーム結合部位をコードする配列が含まれる。通常複
製起点によって与えられる宿主内での複製能力、および
形質転換体の確認を容易にする選択遺伝子がさらに組み
込まれる。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関係
がある場合、機能しうる状態で連結される。例えば、シ
グナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、それがポ
リペプチドの分泌に関与する前駆物質として発現される
とき、ポリペプチドのＤＮＡに機能しうる状態で連結さ
れる；プロモーターは、それがコード配列の転写を制御
するとき、コード配列に機能しうる状態で連結される；
また、リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にする
ように配置されるとき、コード配列に機能しうる状態で
連結される。一般に、“機能しうる状態で連結される”
という表現は隣接することを意味し、分泌リーダーの場
合には、隣接してしかも同じリーディング・フレームで
連結されることを意味する。酵母発現系での使用を目的
とした構造要素は、好ましくは、宿主細胞による翻訳蛋
白の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。ま
た、組換え蛋白がリーダーまたは輸送配列なしで発現さ
れる場合、それはＮ末端メチオニン残基を含むことがで
きる。場合により、この残基は発現された組換え蛋白か
らその後切断されて、最終産物を与える。
発現するための組換え発現ベクターを提供する。組換え
発現ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルス、または昆
虫の遺伝子から誘導された適当な転写または翻訳調節要
素に機能しうる状態で連結された、哺乳類ＴＮＦ−Ｒま
たは生物学的に均等な類縁体をコードする合成またはｃ
ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を含む、複製可能なＤＮＡ構築
物である。転写単位は一般に、（１）遺伝子発現におい
て調節の役割をもつ１以上の遺伝要素、例えば転写プロ
モーターまたはエンハンサー；（２）ｍＲＮＡに転写さ
れ、蛋白に翻訳される構造配列またはコード配列；およ
び（３）以下で詳述するような、転写および翻訳の開始
および終結配列；の集合体から成る。前記の調節要素に
は転写を制御するオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリ
ボソーム結合部位をコードする配列が含まれる。通常複
製起点によって与えられる宿主内での複製能力、および
形質転換体の確認を容易にする選択遺伝子がさらに組み
込まれる。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関係
がある場合、機能しうる状態で連結される。例えば、シ
グナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、それがポ
リペプチドの分泌に関与する前駆物質として発現される
とき、ポリペプチドのＤＮＡに機能しうる状態で連結さ
れる；プロモーターは、それがコード配列の転写を制御
するとき、コード配列に機能しうる状態で連結される；
また、リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にする
ように配置されるとき、コード配列に機能しうる状態で
連結される。一般に、“機能しうる状態で連結される”
という表現は隣接することを意味し、分泌リーダーの場
合には、隣接してしかも同じリーディング・フレームで
連結されることを意味する。酵母発現系での使用を目的
とした構造要素は、好ましくは、宿主細胞による翻訳蛋
白の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。ま
た、組換え蛋白がリーダーまたは輸送配列なしで発現さ
れる場合、それはＮ末端メチオニン残基を含むことがで
きる。場合により、この残基は発現された組換え蛋白か
らその後切断されて、最終産物を与える。
【００４４】微生物により発現される哺乳類ＴＮＦレセ
プターをコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、ＤＮＡ
のｍＲＮＡへの転写を早まって終止させるイントロンを
含まないだろう。しかしながら、転写の早期終止は、例
えば、それが有利なＣ末端切断（例えば、細胞膜に結合
しない可溶性レセプターをもたらすトランスメンブラン
領域の欠失）をもつ変異体を生じさせる場合には、望ま
しいかも知れない。遺伝暗号の縮重のために、同一のア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相当の変動
が存在しうる。他の実施態様には、適度のストリンジェ
ント条件（５０℃、２×ＳＳＣ）下で所定のｃＤＮＡ配
列にハイブリダイズしうる配列、および生物学的に活性
なＴＮＦレセプターポリペプチドをコードする配列にハ
イブリダイズまたは縮重している他の配列が含まれる。
プターをコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、ＤＮＡ
のｍＲＮＡへの転写を早まって終止させるイントロンを
含まないだろう。しかしながら、転写の早期終止は、例
えば、それが有利なＣ末端切断（例えば、細胞膜に結合
しない可溶性レセプターをもたらすトランスメンブラン
領域の欠失）をもつ変異体を生じさせる場合には、望ま
しいかも知れない。遺伝暗号の縮重のために、同一のア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相当の変動
が存在しうる。他の実施態様には、適度のストリンジェ
ント条件（５０℃、２×ＳＳＣ）下で所定のｃＤＮＡ配
列にハイブリダイズしうる配列、および生物学的に活性
なＴＮＦレセプターポリペプチドをコードする配列にハ
イブリダイズまたは縮重している他の配列が含まれる。
【００４５】組換えＴＮＦ−Ｒ ＤＮＡは、組換え転写
単位を染色体ＤＮＡに（形質転換またはトランスフェク
ションにより）安定した状態で組み込んだ、または組換
え転写単位を内在プラスミドの一成分として保有する、
適当な宿主微生物（例えば、E.coli のような細菌、ま
たはS.cerevisiae のような酵母）の実質的に均質な単
一培養から成る組換え発現系により発現または増幅され
る。一般に、この系を構成する細胞は単一の先駆形質転
換細胞の子孫である。ここで定義される組換え発現系
は、発現しようとするＤＮＡ配列または合成遺伝子に連
結された調節要素の誘導の際に異種蛋白を発現するであ
ろう。
単位を染色体ＤＮＡに（形質転換またはトランスフェク
ションにより）安定した状態で組み込んだ、または組換
え転写単位を内在プラスミドの一成分として保有する、
適当な宿主微生物（例えば、E.coli のような細菌、ま
たはS.cerevisiae のような酵母）の実質的に均質な単
一培養から成る組換え発現系により発現または増幅され
る。一般に、この系を構成する細胞は単一の先駆形質転
換細胞の子孫である。ここで定義される組換え発現系
は、発現しようとするＤＮＡ配列または合成遺伝子に連
結された調節要素の誘導の際に異種蛋白を発現するであ
ろう。
【００４６】形質転換宿主細胞は組換えＤＮＡ技術を使
って構築されたＴＮＦ−Ｒベクターで形質転換またはト
ランスフェクションされた細胞である。形質転換された
宿主細胞は通常ＴＮＦ−Ｒを発現するが、ＴＮＦ−Ｒ
ＤＮＡのクローニングまたは増幅のために形質転換され
た宿主細胞はＴＮＦ−Ｒを発現する必要がない。発現さ
れたＴＮＦ−Ｒは、選択したＴＮＦ−Ｒ ＤＮＡに応じ
て、細胞膜にとどまるか、または培養上清に分泌される
だろう。哺乳類ＴＮＦ−Ｒの発現に適する宿主細胞は、
適当なプロモーターの支配下にある原核生物、酵母また
は高等真核生物の細胞である。原核生物にはグラム陰性
またはグラム陽性生物、例えば、E.coliまたはバチルス
が含まれる。高等真核生物細胞には以下で述べるような
哺乳類由来の樹立された細胞株が含まれる。また、本発
明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを使って哺乳類
ＴＮＦ−Ｒを作るために、無細胞翻訳系も使用できるだ
ろう。細菌、真菌、酵母、および哺乳類の細胞宿主と共
に使用するのに適したクローニングおよび発現ベクター
は Pouwels et al.(Cloning Vectors: A Laborator y Ma
nual, Elsevier, New York, 1985)に記載されており、
この文献の関連内容は参照によりここに引用される。
って構築されたＴＮＦ−Ｒベクターで形質転換またはト
ランスフェクションされた細胞である。形質転換された
宿主細胞は通常ＴＮＦ−Ｒを発現するが、ＴＮＦ−Ｒ
ＤＮＡのクローニングまたは増幅のために形質転換され
た宿主細胞はＴＮＦ−Ｒを発現する必要がない。発現さ
れたＴＮＦ−Ｒは、選択したＴＮＦ−Ｒ ＤＮＡに応じ
て、細胞膜にとどまるか、または培養上清に分泌される
だろう。哺乳類ＴＮＦ−Ｒの発現に適する宿主細胞は、
適当なプロモーターの支配下にある原核生物、酵母また
は高等真核生物の細胞である。原核生物にはグラム陰性
またはグラム陽性生物、例えば、E.coliまたはバチルス
が含まれる。高等真核生物細胞には以下で述べるような
哺乳類由来の樹立された細胞株が含まれる。また、本発
明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを使って哺乳類
ＴＮＦ−Ｒを作るために、無細胞翻訳系も使用できるだ
ろう。細菌、真菌、酵母、および哺乳類の細胞宿主と共
に使用するのに適したクローニングおよび発現ベクター
は Pouwels et al.(Cloning Vectors: A Laborator y Ma
nual, Elsevier, New York, 1985)に記載されており、
この文献の関連内容は参照によりここに引用される。
【００４７】原核生物発現宿主は広範な蛋白加水分解お
よびジスルフィドプロセッシングを必要としないＴＮＦ
−Ｒの発現に使用される。原核生物発現ベクターは一般
に１以上の表現型選択マーカー（例えば、抗生物質耐性
を与える蛋白をコードする遺伝子または独立栄養要求を
与える遺伝子）、および宿主によって認識されて宿主内
での増幅を確実にする複製起点を含む。形質転換用の適
当な原核生物宿主には大腸菌（E.coli）、枯草菌（Baci
llus subtilis)、ネズミチフス菌（Salmonellatyphimur
ium)、およびシュードモナス属（Pseudomonas)、ストレプ
トミセス属（Streptomyces)、ブドウ球菌属（Staphyloco
ccus)に属する様々な種が含まれるが、他の微生物を選
んで使用してもよい。
よびジスルフィドプロセッシングを必要としないＴＮＦ
−Ｒの発現に使用される。原核生物発現ベクターは一般
に１以上の表現型選択マーカー（例えば、抗生物質耐性
を与える蛋白をコードする遺伝子または独立栄養要求を
与える遺伝子）、および宿主によって認識されて宿主内
での増幅を確実にする複製起点を含む。形質転換用の適
当な原核生物宿主には大腸菌（E.coli）、枯草菌（Baci
llus subtilis)、ネズミチフス菌（Salmonellatyphimur
ium)、およびシュードモナス属（Pseudomonas)、ストレプ
トミセス属（Streptomyces)、ブドウ球菌属（Staphyloco
ccus)に属する様々な種が含まれるが、他の微生物を選
んで使用してもよい。
【００４８】細菌用の有用な発現ベクターは、選択マー
カーおよび公知のクローニングベクターｐＢＲ３２２
（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素を含む市販のプラス
ミドから誘導される細菌の複製起点を含む。このような
市販のベクターには、例えばｐＫＫ２２３−３（Pharmc
ia Fine Chemicls,Uppsala,Sweden)およびｐＧＥＭ１
（Promega Biotec,Madison,WI,USA)が含まれる。これら
のｐＢＲ３２２“バックボーン”部分は適当なプロモー
ターおよび発現される構造配列と組み合わされる。E.co
li は一般に E.coli 種から誘導されたプラスミドｐＢ
Ｒ３２２の誘導体を使って形質転換される(Bolivar et
al.，Gene 2:95, 1977)。ｐＢＲ３２２はアンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、従って形質
転換細胞の簡単な同定手段を提供する。
カーおよび公知のクローニングベクターｐＢＲ３２２
（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素を含む市販のプラス
ミドから誘導される細菌の複製起点を含む。このような
市販のベクターには、例えばｐＫＫ２２３−３（Pharmc
ia Fine Chemicls,Uppsala,Sweden)およびｐＧＥＭ１
（Promega Biotec,Madison,WI,USA)が含まれる。これら
のｐＢＲ３２２“バックボーン”部分は適当なプロモー
ターおよび発現される構造配列と組み合わされる。E.co
li は一般に E.coli 種から誘導されたプラスミドｐＢ
Ｒ３２２の誘導体を使って形質転換される(Bolivar et
al.，Gene 2:95, 1977)。ｐＢＲ３２２はアンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、従って形質
転換細胞の簡単な同定手段を提供する。
【００４９】組換え微生物発現ベクターにおいて常用さ
れるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナ
ーゼ）およびラクトースプロモーター系(Chang et al.,
Nature 275:615, 1978;Goeddel et al.,Nature 281:54
4, 1979)、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系
（Goeddel et al.,Nucl.Acids Res.8:4057,1980;欧州特
許公開第３６７７６号）、およびｔａｃプロモーター
（Maniatis, Molecu lar Cloning: A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor Labortory,p.412,1982)が含ま
れる。特に有用な細菌発現系ファージλＰLプロモータ
ーおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定リプレッサーを使用す
る。λＰLプロモーターの誘導体を組み込んだアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手しうる
プラスミドベクターは、E.coli ＪＭＢ９株（ＡＴＣＣ
３７０９２）中に存在するプラスミドｐＨＵＢ２、およ
びE.coli ＲＲ１株（ＡＴＣＣ５３０８２）中に存在す
るｐＰＬｃ２８である。
れるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナ
ーゼ）およびラクトースプロモーター系(Chang et al.,
Nature 275:615, 1978;Goeddel et al.,Nature 281:54
4, 1979)、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系
（Goeddel et al.,Nucl.Acids Res.8:4057,1980;欧州特
許公開第３６７７６号）、およびｔａｃプロモーター
（Maniatis, Molecu lar Cloning: A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor Labortory,p.412,1982)が含ま
れる。特に有用な細菌発現系ファージλＰLプロモータ
ーおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定リプレッサーを使用す
る。λＰLプロモーターの誘導体を組み込んだアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手しうる
プラスミドベクターは、E.coli ＪＭＢ９株（ＡＴＣＣ
３７０９２）中に存在するプラスミドｐＨＵＢ２、およ
びE.coli ＲＲ１株（ＡＴＣＣ５３０８２）中に存在す
るｐＰＬｃ２８である。
【００５０】また、組換えＴＮＦ−Ｒ蛋白は、酵母宿
主、好ましくはS.cerevisiaeのようなサッカロミセス種
からの宿主により発現させてもよい。ピキア属（Pichi
a)またはクリベロミセス属（Kluyveromyces)のような他
の属の酵母も使用される。酵母ベクターは一般に２μ酵
母プラスミド由来の複製起点または自律複製配列（ＡＲ
Ｓ）、プロモーター、ＴＮＦ−ＲをコードするＤＮＡ、
ポリアデニル化および転写終結の配列、および選択遺伝
子を含むであろう。好ましくは、酵母ベクターは酵母と
E.coliの両方の形質転換を可能にする複製起点および選
択マーカー、例えば、E.coliおよびS.cerevisiaeのアン
ピシリン耐性遺伝子、トリプトファン中での生育能を欠
く酵母変異株のための選択マーカーを提供するＴＲＰ１
またはＵＲＡ３遺伝子、および下流の構造配列の転写を
誘導するための高度発現酵母遺伝子由来のプロモーター
を含むであろう。酵母宿主細胞ゲノム中のＴＲＰ１また
はＵＲＡ３欠損の存在は、トリプトファンまたはウラシ
ルの不在下で生育させることによって形質転換を検出す
るための有利な環境を提供する。
主、好ましくはS.cerevisiaeのようなサッカロミセス種
からの宿主により発現させてもよい。ピキア属（Pichi
a)またはクリベロミセス属（Kluyveromyces)のような他
の属の酵母も使用される。酵母ベクターは一般に２μ酵
母プラスミド由来の複製起点または自律複製配列（ＡＲ
Ｓ）、プロモーター、ＴＮＦ−ＲをコードするＤＮＡ、
ポリアデニル化および転写終結の配列、および選択遺伝
子を含むであろう。好ましくは、酵母ベクターは酵母と
E.coliの両方の形質転換を可能にする複製起点および選
択マーカー、例えば、E.coliおよびS.cerevisiaeのアン
ピシリン耐性遺伝子、トリプトファン中での生育能を欠
く酵母変異株のための選択マーカーを提供するＴＲＰ１
またはＵＲＡ３遺伝子、および下流の構造配列の転写を
誘導するための高度発現酵母遺伝子由来のプロモーター
を含むであろう。酵母宿主細胞ゲノム中のＴＲＰ１また
はＵＲＡ３欠損の存在は、トリプトファンまたはウラシ
ルの不在下で生育させることによって形質転換を検出す
るための有利な環境を提供する。
【００５１】酵母ベクター用の適当なプロモーター配列
には、メタロチオネインプロモーター、３−ホスホグリ
セリン酸キナーゼプロモーター（Hitzeman et al.,Bio
l.Che m.255:2073,1980)または他の解糖系の酵素（Hess
et al.,Adv.Enzyme Reg.7:149,1968;およびHolland et
al.,Biol.Chem.17:4900,1978）、例えばエノラーゼ、グ
リセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキ
ソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラー
ゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナ
ーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコー
スイソメラーゼ、およびグルコキナーゼが含まれる。酵
母発現に適したベクターおよびプロモーターはR.Hitzem
an et al.の欧州特許公開第７３６５７号に詳しく記載
されている。
には、メタロチオネインプロモーター、３−ホスホグリ
セリン酸キナーゼプロモーター（Hitzeman et al.,Bio
l.Che m.255:2073,1980)または他の解糖系の酵素（Hess
et al.,Adv.Enzyme Reg.7:149,1968;およびHolland et
al.,Biol.Chem.17:4900,1978）、例えばエノラーゼ、グ
リセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキ
ソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラー
ゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナ
ーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコー
スイソメラーゼ、およびグルコキナーゼが含まれる。酵
母発現に適したベクターおよびプロモーターはR.Hitzem
an et al.の欧州特許公開第７３６５７号に詳しく記載
されている。
【００５２】好適な酵母ベクターは、E.coliでの選択お
よび複製に適するｐＵＣ１８からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ
r遺伝子および複製起点）、およびグルコース抑制ＡＤ
Ｈ２プロモーターおよびα−因子分泌リーダーを含む酵
母ＤＮＡ配列を使って作製することができる。ＡＤＨ２
プロモーターはRussell et al.(J.Biol.Chem.258:2674,
1982)およびBeier et al.(Nature 300:724, 1982)に記
載されている。異種蛋白の分泌を支配する酵母α−因子
リーダーは、プロモーターと発現される構造遺伝子の間
に挿入することができる。例えば、Kurjan et al.,Cell
30:933,1982;Bitter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
81:5330,1984 を参照されたい。このリーダー配列は、
その３’末端近傍に、外来遺伝子へのリーダー配列の融
合を容易にするための１以上の有用な制限部位を含むよ
うに修飾されてもよい。
よび複製に適するｐＵＣ１８からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ
r遺伝子および複製起点）、およびグルコース抑制ＡＤ
Ｈ２プロモーターおよびα−因子分泌リーダーを含む酵
母ＤＮＡ配列を使って作製することができる。ＡＤＨ２
プロモーターはRussell et al.(J.Biol.Chem.258:2674,
1982)およびBeier et al.(Nature 300:724, 1982)に記
載されている。異種蛋白の分泌を支配する酵母α−因子
リーダーは、プロモーターと発現される構造遺伝子の間
に挿入することができる。例えば、Kurjan et al.,Cell
30:933,1982;Bitter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
81:5330,1984 を参照されたい。このリーダー配列は、
その３’末端近傍に、外来遺伝子へのリーダー配列の融
合を容易にするための１以上の有用な制限部位を含むよ
うに修飾されてもよい。
【００５３】適当な酵母形質転換プロトコールは当分野
で知られており、代表的な技術がHinnen et al., Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929,1978 に記載され、この
技術は０.６７％酵母窒素塩基、０.５％カザミノ酸、２
％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ
／ｍｌウラシルから成る選択培地中のＴｒｐ+形質転換
体を選択するものである。また、アミノ酸と塩基を含む
０．６７％ＹＮＢから成る培地中のＵＲＡ+形質転換体
を選択する技術は、Sherman et al.,Laborato ry Course
Manual for Methods in Yeast Genetics,Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,New York,198
6 に記載されている。
で知られており、代表的な技術がHinnen et al., Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929,1978 に記載され、この
技術は０.６７％酵母窒素塩基、０.５％カザミノ酸、２
％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ
／ｍｌウラシルから成る選択培地中のＴｒｐ+形質転換
体を選択するものである。また、アミノ酸と塩基を含む
０．６７％ＹＮＢから成る培地中のＵＲＡ+形質転換体
を選択する技術は、Sherman et al.,Laborato ry Course
Manual for Methods in Yeast Genetics,Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,New York,198
6 に記載されている。
【００５４】ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターで形
質転換された宿主細胞は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよ
び８０μｇ／ｍｌウラシルを補給した１％酵母エキス、
２％ペプトン、および１％または４％グルコースから成
るリッチ培地中で発現のために増殖させる。ＡＤＨ２プ
ロモーターの抑制解除は培地グルコースの枯渇により起
こる。粗製酵母上清は濾過により回収し、精製に先立っ
て４℃に保持する。
質転換された宿主細胞は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよ
び８０μｇ／ｍｌウラシルを補給した１％酵母エキス、
２％ペプトン、および１％または４％グルコースから成
るリッチ培地中で発現のために増殖させる。ＡＤＨ２プ
ロモーターの抑制解除は培地グルコースの枯渇により起
こる。粗製酵母上清は濾過により回収し、精製に先立っ
て４℃に保持する。
【００５５】また、種々の哺乳類または昆虫細胞培養系
も組換え蛋白の発現のために有利に使用される。哺乳類
細胞による組換え蛋白の発現は、この種の蛋白が一般に
正しく折りたたまれ、適切に修飾されて、完全に機能す
るので、特に好適である。適当な哺乳類宿主細胞株の例
には、Gluzman(Cell 23:175,1981) に記載されるサル腎
細胞のＣＯＳ−７細胞、および適当なベクターを発現し
うる他の細胞株、例えばＬ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａおよび
ＢＨＫ細胞株が含まれる。哺乳類発現ベクターは、発現
される遺伝子に連結された、複製起点、適当なプロモー
ターおよびエンハンサーのような非転写要素、および他
の５’または３’隣接非転写配列、並びに必要なリボソ
ーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与お
よび受容部位、転写終止配列のような５’または３’非
翻訳配列を含む。昆虫細胞により異種蛋白を生産するた
めのバキュロウイルス系はLuckow and Summers,Bio/Tec
hnology 6:47(1988)に載っている。
も組換え蛋白の発現のために有利に使用される。哺乳類
細胞による組換え蛋白の発現は、この種の蛋白が一般に
正しく折りたたまれ、適切に修飾されて、完全に機能す
るので、特に好適である。適当な哺乳類宿主細胞株の例
には、Gluzman(Cell 23:175,1981) に記載されるサル腎
細胞のＣＯＳ−７細胞、および適当なベクターを発現し
うる他の細胞株、例えばＬ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａおよび
ＢＨＫ細胞株が含まれる。哺乳類発現ベクターは、発現
される遺伝子に連結された、複製起点、適当なプロモー
ターおよびエンハンサーのような非転写要素、および他
の５’または３’隣接非転写配列、並びに必要なリボソ
ーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与お
よび受容部位、転写終止配列のような５’または３’非
翻訳配列を含む。昆虫細胞により異種蛋白を生産するた
めのバキュロウイルス系はLuckow and Summers,Bio/Tec
hnology 6:47(1988)に載っている。
【００５６】脊椎動物細胞の形質転換に使用される発現
ベクター中の転写・翻訳調節配列はウイルス源から得る
ことができる。例えば、常用されるプロモーターおよび
エンハンサーはポリオーマ、アデノウイルス２、シミア
ンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガ
ロウイルスから誘導される。ＳＶ４０ウイルスゲノム由
来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０複製起点、初期およ
び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およ
びポリアデニル化部位は、異種ＤＮＡ配列の発現に必要
な他の遺伝要素を提供すべく使用される。初期および後
期プロモーターは、これらがＳＶ４０ウイルス複製起点
を含む断片としてこのウイルスから容易に得られるので
特に有用である（Fiers et al.,Nature 273:113, 197
8)。より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片も、Ｈｉ
ｎｄIII部位からＢｇＩII部位（ウイルス複製起点中に
位置する）まで延びる約２５０ｂｐの配列が含まれると
いう条件で、使用することができる。さらに、哺乳類ゲ
ノムＴＮＦ−Ｒプロモーター、調節および／またはシグ
ナル配列も、この種の調節配列が選ばれた宿主細胞と適
合しうるという条件で利用される。組換え哺乳類ＴＮＦ
レセプターを生産するための哺乳類高発現ベクターの使
用に関する細部は以下の実施例２および７に示してあ
る。代表的なベクターはOkayama and Berg(Mol.Cell.Bi
ol.3:280,1983)の方法により構築できる。
ベクター中の転写・翻訳調節配列はウイルス源から得る
ことができる。例えば、常用されるプロモーターおよび
エンハンサーはポリオーマ、アデノウイルス２、シミア
ンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガ
ロウイルスから誘導される。ＳＶ４０ウイルスゲノム由
来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０複製起点、初期およ
び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およ
びポリアデニル化部位は、異種ＤＮＡ配列の発現に必要
な他の遺伝要素を提供すべく使用される。初期および後
期プロモーターは、これらがＳＶ４０ウイルス複製起点
を含む断片としてこのウイルスから容易に得られるので
特に有用である（Fiers et al.,Nature 273:113, 197
8)。より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片も、Ｈｉ
ｎｄIII部位からＢｇＩII部位（ウイルス複製起点中に
位置する）まで延びる約２５０ｂｐの配列が含まれると
いう条件で、使用することができる。さらに、哺乳類ゲ
ノムＴＮＦ−Ｒプロモーター、調節および／またはシグ
ナル配列も、この種の調節配列が選ばれた宿主細胞と適
合しうるという条件で利用される。組換え哺乳類ＴＮＦ
レセプターを生産するための哺乳類高発現ベクターの使
用に関する細部は以下の実施例２および７に示してあ
る。代表的なベクターはOkayama and Berg(Mol.Cell.Bi
ol.3:280,1983)の方法により構築できる。
【００５７】Ｃ１２７マウス乳房上皮細胞による哺乳類
レセプターｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系
は、実質的にCosman et al.(Mol.Immunol. 23:935,198
6)によって開示されるように構築することができる。
レセプターｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系
は、実質的にCosman et al.(Mol.Immunol. 23:935,198
6)によって開示されるように構築することができる。
【００５８】本発明の好適な面において、ＴＮＦ−Ｒ
ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターは宿主細胞のＤＮＡ
に安定して組み込まれる。発現産物のレベル上昇は増幅
された数のベクターＤＮＡをもつ細胞株を選択すること
により達成される。増幅された数のベクターＤＮＡをも
つ細胞株は、例えば、既知薬剤によって阻害される酵素
をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで宿主細胞を形
質転換することにより選択される。このベクターは目的
の蛋白をコードするＤＮＡ配列も含む。これとは別に、
目的の蛋白をコードするＤＮＡ配列を含む第二ベクター
を用いて、宿主細胞を同時形質転換することができる。
その後、形質転換または同時形質転換された宿主細胞は
次第に増加する濃度の既知薬剤の存在下で培養し、これ
により薬剤耐性細胞を選択する。このような薬剤耐性細
胞は、しばしばその酵素をコードする遺伝子の増幅の結
果として、薬剤により阻害される酵素を過剰生産するた
めに、増加した濃度の毒性薬剤の存在下で生き残る。薬
剤耐性が阻害可能な酵素をコードするベクターＤＮＡの
コピー数の増加によって起こる場合は、宿主細胞のＤＮ
Ａにおいて目的蛋白（ＴＮＦ−Ｒ）をコードするベクタ
ーＤＮＡの同時増幅が起こっているだろう。
ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターは宿主細胞のＤＮＡ
に安定して組み込まれる。発現産物のレベル上昇は増幅
された数のベクターＤＮＡをもつ細胞株を選択すること
により達成される。増幅された数のベクターＤＮＡをも
つ細胞株は、例えば、既知薬剤によって阻害される酵素
をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで宿主細胞を形
質転換することにより選択される。このベクターは目的
の蛋白をコードするＤＮＡ配列も含む。これとは別に、
目的の蛋白をコードするＤＮＡ配列を含む第二ベクター
を用いて、宿主細胞を同時形質転換することができる。
その後、形質転換または同時形質転換された宿主細胞は
次第に増加する濃度の既知薬剤の存在下で培養し、これ
により薬剤耐性細胞を選択する。このような薬剤耐性細
胞は、しばしばその酵素をコードする遺伝子の増幅の結
果として、薬剤により阻害される酵素を過剰生産するた
めに、増加した濃度の毒性薬剤の存在下で生き残る。薬
剤耐性が阻害可能な酵素をコードするベクターＤＮＡの
コピー数の増加によって起こる場合は、宿主細胞のＤＮ
Ａにおいて目的蛋白（ＴＮＦ−Ｒ）をコードするベクタ
ーＤＮＡの同時増幅が起こっているだろう。
【００５９】このような同時増幅のための好適な系は、
薬剤メトトレキセート（ＭＴＸ）によって阻害されるジ
ヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の遺伝子を使用する。
同時増幅を達成するためには、ＤＨＦＲをコードする活
性遺伝子を欠く宿主細胞を、ＤＨＦＲと目的蛋白をコー
ドするＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換するか、ま
たはＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列を含むベクターと
目的蛋白をコードするＤＮＡ配列を含むベクターとで同
時形質転換する。形質転換または同時形質転換された宿
主細胞は次第に増加する濃度のＭＴＸを含む培地で培養
し、生き残る細胞株を選択する。
薬剤メトトレキセート（ＭＴＸ）によって阻害されるジ
ヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の遺伝子を使用する。
同時増幅を達成するためには、ＤＨＦＲをコードする活
性遺伝子を欠く宿主細胞を、ＤＨＦＲと目的蛋白をコー
ドするＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換するか、ま
たはＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列を含むベクターと
目的蛋白をコードするＤＮＡ配列を含むベクターとで同
時形質転換する。形質転換または同時形質転換された宿
主細胞は次第に増加する濃度のＭＴＸを含む培地で培養
し、生き残る細胞株を選択する。
【００６０】特に好適な同時増幅系は、グルタミン酸と
アンモニアの合成（この反応を進行させるためにＡＤＰ
とリン酸へのＡＴＰの加水分解を使用）に関与するグル
タミンシンテターゼ（ＧＳ）の遺伝子を使用する。ＧＳ
はいろいろな阻害剤、例えばメチオニンスルホキシミン
（ＭＳＸ）による阻害を受ける。従って、ＧＳと目的蛋
白のＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換された細胞、
またはＧＳをコードするＤＮＡ配列を含むベクターと目
的蛋白をコードするＤＮＡ配列を含むベクターとで同時
形質転換された細胞を同時増幅し、この宿主細胞を次第
に増加する濃度のＭＳＸを含む培地で培養し、生存細胞
を選択することによって、ＴＮＦ−Ｒを高濃度で発現さ
せることが可能である。ＧＳ同時増幅系、適当な組換え
発現ベクター、および細胞株は次のＰＣＴ出願：ＷＯ８
７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６、ＷＯ８９／１
０４０４、およびＷＯ８６／０５８０７に開示されてい
る。
アンモニアの合成（この反応を進行させるためにＡＤＰ
とリン酸へのＡＴＰの加水分解を使用）に関与するグル
タミンシンテターゼ（ＧＳ）の遺伝子を使用する。ＧＳ
はいろいろな阻害剤、例えばメチオニンスルホキシミン
（ＭＳＸ）による阻害を受ける。従って、ＧＳと目的蛋
白のＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換された細胞、
またはＧＳをコードするＤＮＡ配列を含むベクターと目
的蛋白をコードするＤＮＡ配列を含むベクターとで同時
形質転換された細胞を同時増幅し、この宿主細胞を次第
に増加する濃度のＭＳＸを含む培地で培養し、生存細胞
を選択することによって、ＴＮＦ−Ｒを高濃度で発現さ
せることが可能である。ＧＳ同時増幅系、適当な組換え
発現ベクター、および細胞株は次のＰＣＴ出願：ＷＯ８
７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６、ＷＯ８９／１
０４０４、およびＷＯ８６／０５８０７に開示されてい
る。
【００６１】組換え蛋白は好ましくは、チャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類宿主細胞、
あるいはＰＣＴ出願ＷＯ８９／１０４０４およびＷＯ８
６／０５８０７に記載される、ＳＰ２／０−Ａｇ１４ま
たはＮＳ０のようなマウス・ミエローマ細胞株またはＹ
Ｂ２／３．０−Ａｇ２０のようなラット・ミエローマ細
胞株におけるＤＨＦＲまたはＧＳの同時増幅により発現
される。
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類宿主細胞、
あるいはＰＣＴ出願ＷＯ８９／１０４０４およびＷＯ８
６／０５８０７に記載される、ＳＰ２／０−Ａｇ１４ま
たはＮＳ０のようなマウス・ミエローマ細胞株またはＹ
Ｂ２／３．０−Ａｇ２０のようなラット・ミエローマ細
胞株におけるＤＨＦＲまたはＧＳの同時増幅により発現
される。
【００６２】ＴＮＦ−Ｒ ＤＮＡ発現用の好適な真核細
胞ベクターは以下の実施例２に示してある。ｐＣＡＶ／
ＮＯＴと呼ばれるこのベクターは哺乳類の高発現ベクタ
ーｐＤＣ２０１から誘導され、ＳＶ４０、アデノウイル
ス−２、およびヒト・サイトメガロウイルス由来の調節
配列を含んでいる。
胞ベクターは以下の実施例２に示してある。ｐＣＡＶ／
ＮＯＴと呼ばれるこのベクターは哺乳類の高発現ベクタ
ーｐＤＣ２０１から誘導され、ＳＶ４０、アデノウイル
ス−２、およびヒト・サイトメガロウイルス由来の調節
配列を含んでいる。
【００６３】組換えＴＮＦ−Ｒの精製 精製された哺乳類ＴＮＦレセプターまたは類縁体は、適
当な宿主／ベクター系を培養して本発明ＤＮＡの組換え
翻訳産物を発現させ、その後培地または細胞抽出物から
その産物を精製することにより得られる。
当な宿主／ベクター系を培養して本発明ＤＮＡの組換え
翻訳産物を発現させ、その後培地または細胞抽出物から
その産物を精製することにより得られる。
【００６４】例えば、組換え蛋白を培地中に分泌する系
からの上清は、初めに市販の蛋白濃縮濾過装置、例え
ば、Amicon またはMillipore Pellicon 限外濾過装置
を使って濃縮される。濃縮工程後、濃縮物は適当な精製
マトリックスに加えられる。例えば、適当なアフィニテ
ィーマトリックスは適当な支持体に結合されたＴＮＦ、
レクチンまたは抗体分子を含むことができる。また、ア
ニオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエ
チル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基剤も
使用できる。マトリックスはアクリルアミド、アガロー
ス、デキストラン、セルロース、または蛋白精製におい
て普通に用いられる他の種類でありうる。また、カチオ
ン交換工程も使用される。適当なカチオン交換体にはス
ルホプロピル基またはカルボキシメチル基を有する不溶
性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好適で
ある。
からの上清は、初めに市販の蛋白濃縮濾過装置、例え
ば、Amicon またはMillipore Pellicon 限外濾過装置
を使って濃縮される。濃縮工程後、濃縮物は適当な精製
マトリックスに加えられる。例えば、適当なアフィニテ
ィーマトリックスは適当な支持体に結合されたＴＮＦ、
レクチンまたは抗体分子を含むことができる。また、ア
ニオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエ
チル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基剤も
使用できる。マトリックスはアクリルアミド、アガロー
ス、デキストラン、セルロース、または蛋白精製におい
て普通に用いられる他の種類でありうる。また、カチオ
ン交換工程も使用される。適当なカチオン交換体にはス
ルホプロピル基またはカルボキシメチル基を有する不溶
性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好適で
ある。
【００６５】最後に、１以上の逆相高性能液体クロマト
グラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程が、疎水性ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ媒体（例．ペンダントメチル基または他の脂肪族
基を有するシリカゲル）を使用して、ＴＮＦ−Ｒ組成物
をさらに精製するために行われる。また、前記精製工程
の一部または全部をいろいろに組み合わせることによ
り、均質な組換え蛋白を得ることもできる。
グラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程が、疎水性ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ媒体（例．ペンダントメチル基または他の脂肪族
基を有するシリカゲル）を使用して、ＴＮＦ−Ｒ組成物
をさらに精製するために行われる。また、前記精製工程
の一部または全部をいろいろに組み合わせることによ
り、均質な組換え蛋白を得ることもできる。
【００６６】細菌培養物により生産された組換え蛋白
は、通常、細胞ペレットからの抽出、これに続く１回以
上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロ
マトグラフィー工程により単離される。最後に、最終精
製工程として高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）を行うことができる。組換え哺乳類ＴＮＦ−Ｒの発
現に使用した微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波
処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含めた通
常の方法で破壊できる。
は、通常、細胞ペレットからの抽出、これに続く１回以
上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロ
マトグラフィー工程により単離される。最後に、最終精
製工程として高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）を行うことができる。組換え哺乳類ＴＮＦ−Ｒの発
現に使用した微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波
処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含めた通
常の方法で破壊できる。
【００６７】分泌蛋白として哺乳類ＴＮＦ−Ｒを発現す
る酵母の発酵は精製を非常に単純化する。大規模発酵か
ら得られる分泌組換え蛋白は、Urdal et al.(J.Chromat
og.296:171,1984) により開示された方法と類似した方
法により精製できる。この文献は分離用ＨＰＬＣカラム
で組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを精製するための２連続逆相
ＨＰＬＣ工程を述べている。
る酵母の発酵は精製を非常に単純化する。大規模発酵か
ら得られる分泌組換え蛋白は、Urdal et al.(J.Chromat
og.296:171,1984) により開示された方法と類似した方
法により精製できる。この文献は分離用ＨＰＬＣカラム
で組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを精製するための２連続逆相
ＨＰＬＣ工程を述べている。
【００６８】組換え培養物により合成されたヒトＴＮＦ
−Ｒは、培養物からヒトＴＮＦ−Ｒを回収するために採
用した精製工程に左右される量および性質の、蛋白を含
む非ヒト細胞成分の存在により特徴づけられる。これら
の成分は通常、酵母、原核生物、またはヒト以外の高等
真核生物に由来するものであり、好ましくは約１重量％
より少ないくらいの、無毒の汚染量で存在するであろ
う。さらに、組換え細胞培養は、ＴＮＦ−Ｒが自然界で
その起源種（例．細胞、細胞浸出物または体液）中に存
在するときＴＮＦ−Ｒと通常結合される蛋白を含まない
ＴＮＦ−Ｒの生産を可能にする。
−Ｒは、培養物からヒトＴＮＦ−Ｒを回収するために採
用した精製工程に左右される量および性質の、蛋白を含
む非ヒト細胞成分の存在により特徴づけられる。これら
の成分は通常、酵母、原核生物、またはヒト以外の高等
真核生物に由来するものであり、好ましくは約１重量％
より少ないくらいの、無毒の汚染量で存在するであろ
う。さらに、組換え細胞培養は、ＴＮＦ−Ｒが自然界で
その起源種（例．細胞、細胞浸出物または体液）中に存
在するときＴＮＦ−Ｒと通常結合される蛋白を含まない
ＴＮＦ−Ｒの生産を可能にする。
【００６９】組換え可溶性ＴＮＦ−Ｒの治療上の投与 本発明は、有効量の可溶性ＴＮＦ−Ｒ蛋白および適当な
希釈剤および担体を含有する治療用組成物の使用方法、
並びに有効量の可溶性ＴＮＦ−Ｒ蛋白を投与することか
ら成るヒトにおけるＴＮＦ依存性炎症応答の制御方法を
提供する。
希釈剤および担体を含有する治療用組成物の使用方法、
並びに有効量の可溶性ＴＮＦ−Ｒ蛋白を投与することか
ら成るヒトにおけるＴＮＦ依存性炎症応答の制御方法を
提供する。
【００７０】治療用途の場合、精製した可溶性ＴＮＦ−
Ｒ蛋白は、症状に適したやり方で処置するために患者
（好ましくはヒト）に投与される。こうして、例えば、
可溶性ＴＮＦ−Ｒ蛋白組成物はボーラス注射、連続輸
液、移植物からの持続放出、または他の適当な手法によ
り投与される。一般に、可溶性ＴＮＦ−Ｒ治療剤は、生
理学的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤と共に精
製蛋白を含有する組成物の形で投与されるであろう。こ
のような担体は投与量および使用濃度で受容者に無毒性
であるだろう。通常、この種の組成物の調製はＴＮＦ−
Ｒと緩衝剤、酸化防止剤（例．アスコルビン酸）、低分
子量（約１０残基以下）ポリペプチド、蛋白、アミノ
酸、炭水化物（グルコース、スクロース、デキストリン
を含む）、キレート剤（例．ＥＤＴＡ）、グルタチオ
ン、他の安定剤または賦形剤とを組み合わせることを必
要とする。中性緩衝塩溶液または同種血清アルブミンと
混合した塩溶液が適当な希釈剤の例である。好ましく
は、製剤は希釈剤として適当な賦形剤溶液（例．スクロ
ース）を使って凍結乾燥物として製剤化される。適切な
投与量は試験により決定できる。投与量および投与回数
は、もちろん、治療すべき症状の性質および重症度、希
望する応答、患者の健康状態などの諸要因に左右される
であろう。
Ｒ蛋白は、症状に適したやり方で処置するために患者
（好ましくはヒト）に投与される。こうして、例えば、
可溶性ＴＮＦ−Ｒ蛋白組成物はボーラス注射、連続輸
液、移植物からの持続放出、または他の適当な手法によ
り投与される。一般に、可溶性ＴＮＦ−Ｒ治療剤は、生
理学的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤と共に精
製蛋白を含有する組成物の形で投与されるであろう。こ
のような担体は投与量および使用濃度で受容者に無毒性
であるだろう。通常、この種の組成物の調製はＴＮＦ−
Ｒと緩衝剤、酸化防止剤（例．アスコルビン酸）、低分
子量（約１０残基以下）ポリペプチド、蛋白、アミノ
酸、炭水化物（グルコース、スクロース、デキストリン
を含む）、キレート剤（例．ＥＤＴＡ）、グルタチオ
ン、他の安定剤または賦形剤とを組み合わせることを必
要とする。中性緩衝塩溶液または同種血清アルブミンと
混合した塩溶液が適当な希釈剤の例である。好ましく
は、製剤は希釈剤として適当な賦形剤溶液（例．スクロ
ース）を使って凍結乾燥物として製剤化される。適切な
投与量は試験により決定できる。投与量および投与回数
は、もちろん、治療すべき症状の性質および重症度、希
望する応答、患者の健康状態などの諸要因に左右される
であろう。
【００７１】可溶性ＴＮＦ−Ｒ蛋白はＴＮＦ依存性応答
を抑制するために投与される。いろいろな病気および疾
患（例えば、悪液質や敗血症性ショック）がＴＮＦによ
って引き起こされると考えられる。さらに、他の重要な
サイトカイン類（ＩＬ−１、ＩＬ−２、および他のコロ
ニー形成刺激因子）もＴＮＦの有意な宿主生産を誘発す
ることができる。従って、可溶性ＴＮＦ−Ｒ組成物は、
例えば、悪液質や敗血症性ショックを治療するために、
あるいはサイトカイン療法に伴う副作用を治療するため
に使用される。ＩＬ−１およびＩＬ−２はＴＮＦの生産
において重要な役割を演ずるので、両方のＩＬ−１レセ
プターまたはＩＬ−２レセプターを用いる併用療法がＴ
ＮＦ関連臨床疾患の治療に好適であるかも知れない。
を抑制するために投与される。いろいろな病気および疾
患（例えば、悪液質や敗血症性ショック）がＴＮＦによ
って引き起こされると考えられる。さらに、他の重要な
サイトカイン類（ＩＬ−１、ＩＬ−２、および他のコロ
ニー形成刺激因子）もＴＮＦの有意な宿主生産を誘発す
ることができる。従って、可溶性ＴＮＦ−Ｒ組成物は、
例えば、悪液質や敗血症性ショックを治療するために、
あるいはサイトカイン療法に伴う副作用を治療するため
に使用される。ＩＬ−１およびＩＬ−２はＴＮＦの生産
において重要な役割を演ずるので、両方のＩＬ−１レセ
プターまたはＩＬ−２レセプターを用いる併用療法がＴ
ＮＦ関連臨床疾患の治療に好適であるかも知れない。
【００７２】以下の実施例は、制限としてではなく、例
示として提供されるものである。
示として提供されるものである。
【００７３】
【実施例】実施例１ 結合検定 Ａ．ＴＮＦαおよびＴＮＦβの放射性ラベリング：Ｎ末
端に親水性オクタペプチドを含む融合蛋白の形の組換え
ヒトＴＮＦαは酵母により分泌蛋白として発現させ、ア
フィニティークロマトグラフィーで精製した（Hopp et
al.,Bio/Techno logy 6:1204,1988)。精製された組換え
ヒトＴＮＦβはR&D Systems(Minneapolis,MN)から購入
した。両蛋白は市販の固相剤、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（Pier
ce)を使って放射性標識化した。この方法では、５μｇ
のＩＯＤＯ−ＧＥＮを１０×７５ｍｍガラス試験管の底
に入れ、７５μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．
４および２０μｌ（２ｍＣｉ）のＮａ125Ｉと共に４℃
で２０分インキュベートした。その後、この溶液をＰＢ
Ｓ４５μｌ中のＴＮＦα（またはＴＮＦβ）５μｇを含
む第二のガラス試験管に４℃で２０分間移した。この反
応混合物は２．５ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、０．２ｗ／ｖ％アジ化ナトリウム、および２０ｍ
ＭヘペスｐＨ７．４を含むRoswell Park Memorial Inst
itute(ＲＰＭＩ）１６４０媒体（結合媒体）で平衡化し
た、２ｍｌ床容量のセファデックスＧ−２５（Sigma)で
ゲル濾過することにより分画化した。125Ｉ−ＴＮＦの
最終プールは結合媒体中１×１０-7Ｍの原液に希釈し、
レセプター結合活性の検出しうる損失なしに４℃で１カ
月までの間貯蔵した。比活性は通常１×１０6ｃｐｍ／
ｍＭＴＮＦである。
端に親水性オクタペプチドを含む融合蛋白の形の組換え
ヒトＴＮＦαは酵母により分泌蛋白として発現させ、ア
フィニティークロマトグラフィーで精製した（Hopp et
al.,Bio/Techno logy 6:1204,1988)。精製された組換え
ヒトＴＮＦβはR&D Systems(Minneapolis,MN)から購入
した。両蛋白は市販の固相剤、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（Pier
ce)を使って放射性標識化した。この方法では、５μｇ
のＩＯＤＯ−ＧＥＮを１０×７５ｍｍガラス試験管の底
に入れ、７５μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．
４および２０μｌ（２ｍＣｉ）のＮａ125Ｉと共に４℃
で２０分インキュベートした。その後、この溶液をＰＢ
Ｓ４５μｌ中のＴＮＦα（またはＴＮＦβ）５μｇを含
む第二のガラス試験管に４℃で２０分間移した。この反
応混合物は２．５ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、０．２ｗ／ｖ％アジ化ナトリウム、および２０ｍ
ＭヘペスｐＨ７．４を含むRoswell Park Memorial Inst
itute(ＲＰＭＩ）１６４０媒体（結合媒体）で平衡化し
た、２ｍｌ床容量のセファデックスＧ−２５（Sigma)で
ゲル濾過することにより分画化した。125Ｉ−ＴＮＦの
最終プールは結合媒体中１×１０-7Ｍの原液に希釈し、
レセプター結合活性の検出しうる損失なしに４℃で１カ
月までの間貯蔵した。比活性は通常１×１０6ｃｐｍ／
ｍＭＴＮＦである。
【００７４】Ｂ．完全細胞への結合：完全細胞を用いた
結合検定は２つの方法で行った。第一の方法では、初め
に細胞を懸濁させて（例．Ｕ９３７）または組織培養皿
に付着させて（例．ＷＩ２６−ＶＡ４、組換えＴＮＦレ
セプターを発現するＣＯＳ細胞）増殖させた。付着細胞
はその後５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて３７℃で１０分処理
して培養皿からはがした。結合検定は、本質的にPark e
t al.(J.Biol.Chem.261:4177,1986)によって開示された
フタレート油分離法（Dower et al.,J.Immun ol.132:75
1,1984)により行った。125Ｉ−ＴＮＦの非特異的結合は
２００倍またはそれ以上の過剰モル量の未標識ＴＮＦの
存在下で測定した。アジ化ナトリウム（０．２％）は細
胞による125Ｉ−ＴＮＦのインターナリゼーション（取
り込み）を阻害するために結合検定において使用され
た。第二の方法では、ＴＮＦ−Ｒ含有プラスミドでトラ
ンスフェクトされて細胞表面にＴＮＦレセプターを発現
するＣＯＳ細胞が、Sims et al.(Science 241:585,198
8)により開示されたプレート結合検定によって125Ｉ−
ＴＮＦを結合する能力について試験された。
結合検定は２つの方法で行った。第一の方法では、初め
に細胞を懸濁させて（例．Ｕ９３７）または組織培養皿
に付着させて（例．ＷＩ２６−ＶＡ４、組換えＴＮＦレ
セプターを発現するＣＯＳ細胞）増殖させた。付着細胞
はその後５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて３７℃で１０分処理
して培養皿からはがした。結合検定は、本質的にPark e
t al.(J.Biol.Chem.261:4177,1986)によって開示された
フタレート油分離法（Dower et al.,J.Immun ol.132:75
1,1984)により行った。125Ｉ−ＴＮＦの非特異的結合は
２００倍またはそれ以上の過剰モル量の未標識ＴＮＦの
存在下で測定した。アジ化ナトリウム（０．２％）は細
胞による125Ｉ−ＴＮＦのインターナリゼーション（取
り込み）を阻害するために結合検定において使用され
た。第二の方法では、ＴＮＦ−Ｒ含有プラスミドでトラ
ンスフェクトされて細胞表面にＴＮＦレセプターを発現
するＣＯＳ細胞が、Sims et al.(Science 241:585,198
8)により開示されたプレート結合検定によって125Ｉ−
ＴＮＦを結合する能力について試験された。
【００７５】Ｃ．固相結合検定：ＴＮＦ結合活性を保持
するヒト細胞の洗剤抽出物からニトロセルロースに安定
した状態で吸着されるＴＮＦ−Ｒの能力は、ＴＮＦ−Ｒ
を検出する手段を与えた。細胞抽出物は細胞ペレットを
１％トリトンＸ−１００およびプロテアーゼ阻害剤のカ
クテル（２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１０
μＭペプスタチン、１０μＭロイペプチン、２μＭｏ−
フェナントロリンおよび２ｍＭ ＥＧＴＡ）を含む２倍
容量のＰＢＳと激しくヴォルテックス混合することによ
り調製した。この混合物を氷上で３０分インキュベート
し、次に１２０００×ｇ、８℃で１５分遠心して核と他
の細胞破片を除いた。細胞抽出物の２μｌアリコートを
乾燥ＢＡ８５／２１ニトロセルロース膜（Schleicher a
nd Schuell,Keene,NH)の上におき、乾燥させた。これら
の膜は組織培養皿に入れた３ｗ／ｖ％ＢＳＡを含むトリ
ス（０．０５Ｍ）緩衝塩溶液（０．１５Ｍ）中で３０分
インキュベートして非特異的結合部位をブロックした。
その後、膜をＰＢＳ＋３％ＢＳＡ中の５×１０-11Ｍ
125Ｉ−ＴＮＦで覆って、４℃で振とうしながら２時間
インキュベートした。この時間の終わりに、膜をＰＢＳ
中で３回洗い、乾燥し、Kodak X-Omat ARフィルムの上
に−７０℃で１８時間おいた。
するヒト細胞の洗剤抽出物からニトロセルロースに安定
した状態で吸着されるＴＮＦ−Ｒの能力は、ＴＮＦ−Ｒ
を検出する手段を与えた。細胞抽出物は細胞ペレットを
１％トリトンＸ−１００およびプロテアーゼ阻害剤のカ
クテル（２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１０
μＭペプスタチン、１０μＭロイペプチン、２μＭｏ−
フェナントロリンおよび２ｍＭ ＥＧＴＡ）を含む２倍
容量のＰＢＳと激しくヴォルテックス混合することによ
り調製した。この混合物を氷上で３０分インキュベート
し、次に１２０００×ｇ、８℃で１５分遠心して核と他
の細胞破片を除いた。細胞抽出物の２μｌアリコートを
乾燥ＢＡ８５／２１ニトロセルロース膜（Schleicher a
nd Schuell,Keene,NH)の上におき、乾燥させた。これら
の膜は組織培養皿に入れた３ｗ／ｖ％ＢＳＡを含むトリ
ス（０．０５Ｍ）緩衝塩溶液（０．１５Ｍ）中で３０分
インキュベートして非特異的結合部位をブロックした。
その後、膜をＰＢＳ＋３％ＢＳＡ中の５×１０-11Ｍ
125Ｉ−ＴＮＦで覆って、４℃で振とうしながら２時間
インキュベートした。この時間の終わりに、膜をＰＢＳ
中で３回洗い、乾燥し、Kodak X-Omat ARフィルムの上
に−７０℃で１８時間おいた。
【００７６】実施例２ ＣＯＳ−７細胞内での活性蛋白の直接発現によるヒトＴ
ＮＦ−Ｒ ｃＤＮＡの単離 各種のヒト細胞株は125Ｉ−標識ＴＮＦを結合する能力
に基づいてＴＮＦ−Ｒの発現についてスクリーニングし
た。ヒト線維芽細胞株ＷＩ−２６ＶＡ４は細胞当たり相
当量のレセプターを発現することが分かった。平衡結合
実験により、この細胞株は細胞当たり約４０００高親和
部位（Ｋａ＝１×１０10Ｍ-1）および約１５００低親和
部位（Ｋａ＝１×１０8Ｍ-1）と125Ｉ−ＴＮＦとの２段
階的結合を示すことが判明した。
ＮＦ−Ｒ ｃＤＮＡの単離 各種のヒト細胞株は125Ｉ−標識ＴＮＦを結合する能力
に基づいてＴＮＦ−Ｒの発現についてスクリーニングし
た。ヒト線維芽細胞株ＷＩ−２６ＶＡ４は細胞当たり相
当量のレセプターを発現することが分かった。平衡結合
実験により、この細胞株は細胞当たり約４０００高親和
部位（Ｋａ＝１×１０10Ｍ-1）および約１５００低親和
部位（Ｋａ＝１×１０8Ｍ-1）と125Ｉ−ＴＮＦとの２段
階的結合を示すことが判明した。
【００７７】標準技術（Gubler et al.,Gene 25:263,19
83;Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in Molecul
ar Biology,Vol.1,1987) を使って、アメリカヤマゴボ
ウ（pokeweed)マイトジェンの存在下に増殖させたヒト
線維芽細胞ＷＩ−２６ＶＡ４細胞より抽出した全ＲＮＡ
から単離したポリアデニル化ｍＲＮＡの逆転写により、
大きさによって分画化されていないｃＤＮＡライブラリ
ーを作製した。細胞はグアニジン塩酸塩溶液中で溶解す
ることにより回収し、以前に開示された方法（March et
al.,Nature 315:641,1985) により全ＲＮＡを単離し
た。
83;Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in Molecul
ar Biology,Vol.1,1987) を使って、アメリカヤマゴボ
ウ（pokeweed)マイトジェンの存在下に増殖させたヒト
線維芽細胞ＷＩ−２６ＶＡ４細胞より抽出した全ＲＮＡ
から単離したポリアデニル化ｍＲＮＡの逆転写により、
大きさによって分画化されていないｃＤＮＡライブラリ
ーを作製した。細胞はグアニジン塩酸塩溶液中で溶解す
ることにより回収し、以前に開示された方法（March et
al.,Nature 315:641,1985) により全ＲＮＡを単離し
た。
【００７８】ポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースク
ロマトグラフィーで単離し、Gublerand Hoffman(Gene 2
5:263,1983)の方法と類似した方法により二本鎖ｃＤＮ
Ａを作製した。簡単に述べると、ポリＡ+ＲＮＡはオリ
ゴｄＴをプライマーとして使って逆転写酵素によりＲＮ
Ａ−ｃＤＮＡハイブリッドに変換した。その後、ＲＮＡ
−ｃＤＮＡハイブリッドはＤＮＡポリメラーゼＩと共に
ＲＮＡアーゼＨを使って二本鎖ｃＤＮＡに変換した。得
られた二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平
滑末端とした。この平滑末端化ｃＤＮＡに、一端のみで
リン酸化されたＥｃｏＲＩリンカー−アダプター（内部
ＮｏｔＩ部位をもつ）（Invitrogen)を付加した。リン
カー−アダプター付加ｃＤＮＡはＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼで処理してリンカー−アダプターの５’突出領
域をリン酸化し、未連結リンカーはセファロースＣＬ４
ＢカラムにｃＤＮＡを流すことにより除去した。リンカ
ー−アダプター付加ｃＤＮＡは等モル濃度のバクテリオ
ファージλｇｔ１０のＥｃｏＲＩ切断／脱リン酸化アー
ムに連結した（Huynh et al.,DNA Cloning:A Pract ical
Approach,Glover,ed.,IRL Press,p.49-78)。連結ＤＮ
Ａは市販のキットを使ってファージ粒子にパッケージン
グして組換え体のライブラリーを作製した（Stratagene
Cloning Systems,San Diego,CA,USA)。組換え体は、E.
coli c600(hfl-)株の菌叢上にファージをまいてさらに
増幅させた。
ロマトグラフィーで単離し、Gublerand Hoffman(Gene 2
5:263,1983)の方法と類似した方法により二本鎖ｃＤＮ
Ａを作製した。簡単に述べると、ポリＡ+ＲＮＡはオリ
ゴｄＴをプライマーとして使って逆転写酵素によりＲＮ
Ａ−ｃＤＮＡハイブリッドに変換した。その後、ＲＮＡ
−ｃＤＮＡハイブリッドはＤＮＡポリメラーゼＩと共に
ＲＮＡアーゼＨを使って二本鎖ｃＤＮＡに変換した。得
られた二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平
滑末端とした。この平滑末端化ｃＤＮＡに、一端のみで
リン酸化されたＥｃｏＲＩリンカー−アダプター（内部
ＮｏｔＩ部位をもつ）（Invitrogen)を付加した。リン
カー−アダプター付加ｃＤＮＡはＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼで処理してリンカー−アダプターの５’突出領
域をリン酸化し、未連結リンカーはセファロースＣＬ４
ＢカラムにｃＤＮＡを流すことにより除去した。リンカ
ー−アダプター付加ｃＤＮＡは等モル濃度のバクテリオ
ファージλｇｔ１０のＥｃｏＲＩ切断／脱リン酸化アー
ムに連結した（Huynh et al.,DNA Cloning:A Pract ical
Approach,Glover,ed.,IRL Press,p.49-78)。連結ＤＮ
Ａは市販のキットを使ってファージ粒子にパッケージン
グして組換え体のライブラリーを作製した（Stratagene
Cloning Systems,San Diego,CA,USA)。組換え体は、E.
coli c600(hfl-)株の菌叢上にファージをまいてさらに
増幅させた。
【００７９】ファージＤＮＡは得られたλｇｔ１０ｃＤ
ＮＡライブラリーから精製し、制限酵素ＮｏｔＩで消化
してｃＤＮＡ挿入物を切り取った。アガロースゲルによ
る消化物の電気泳動後、２０００ｂｐより大きいｃＤＮ
Ａを単離した。
ＮＡライブラリーから精製し、制限酵素ＮｏｔＩで消化
してｃＤＮＡ挿入物を切り取った。アガロースゲルによ
る消化物の電気泳動後、２０００ｂｐより大きいｃＤＮ
Ａを単離した。
【００８０】得られたｃＤＮＡは、哺乳類細胞にトラン
スフェクトしたとき多重クローニング部位に挿入された
ｃＤＮＡ配列を発現するようにデザインされた、真核生
物発現ベクターｐＣＡＶ／ＮＯＴに連結した。ｐＣＡＶ
／ＮＯＴはｐＤＣ２０１（ｐＭＬＳＶの誘導体、以前に
Cosman et al.,Nature 312:768,1984 によって開示さ
れた）、ＳＶ４０、およびサイトメガロウイルスＤＮＡ
から構築され、複製起点から転写の方向で順に、（１）
複製起点、エンハンサー配列、初期および後期プロモー
ターを含むコオーディネート５１７１−２７０のＳＶ４
０配列；（２）プロモーターおよびエンハンサー領域を
含むサイトメガロウイルス配列(Boechart et al.,Cell
41:521,1985 により発表された配列からのヌクレオチ
ド６７１から＋６３まで）；（３）３分節（tripartit
e) リーダーの第一エクソンおよび第一エクソンと第二
エクソン間のイントロンの一部、３分節リーダーの第二
エクソンおよび第三エクソンの一部、並びにＸｈｏＩ、
ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＮｏｔＩ、およびＢｇｌＩ部位を
含む多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含むアデノウイ
ルス−２配列；（４）初期転写のためのポリアデニル化
および終結シグナルを含むコオーディネート４１２７−
４１００および２７７０−２５３３からのＳＶ４０配
列；（５）ＶＡＩおよびＶＡII遺伝子を含むアデノウイ
ルス配列１０５３２−１１１５６の後にアンピシリン耐
性遺伝子と複製起点を含む４３６３−２４８６および１
０９４−３７５からのｐＢＲ３２２配列が続く、ｐＢＲ
３２２由来の配列およびｐＤＣ２０１のウイルス関連配
列ＶＡＩおよびＶＡII；を含んでいる。
スフェクトしたとき多重クローニング部位に挿入された
ｃＤＮＡ配列を発現するようにデザインされた、真核生
物発現ベクターｐＣＡＶ／ＮＯＴに連結した。ｐＣＡＶ
／ＮＯＴはｐＤＣ２０１（ｐＭＬＳＶの誘導体、以前に
Cosman et al.,Nature 312:768,1984 によって開示さ
れた）、ＳＶ４０、およびサイトメガロウイルスＤＮＡ
から構築され、複製起点から転写の方向で順に、（１）
複製起点、エンハンサー配列、初期および後期プロモー
ターを含むコオーディネート５１７１−２７０のＳＶ４
０配列；（２）プロモーターおよびエンハンサー領域を
含むサイトメガロウイルス配列(Boechart et al.,Cell
41:521,1985 により発表された配列からのヌクレオチ
ド６７１から＋６３まで）；（３）３分節（tripartit
e) リーダーの第一エクソンおよび第一エクソンと第二
エクソン間のイントロンの一部、３分節リーダーの第二
エクソンおよび第三エクソンの一部、並びにＸｈｏＩ、
ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＮｏｔＩ、およびＢｇｌＩ部位を
含む多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含むアデノウイ
ルス−２配列；（４）初期転写のためのポリアデニル化
および終結シグナルを含むコオーディネート４１２７−
４１００および２７７０−２５３３からのＳＶ４０配
列；（５）ＶＡＩおよびＶＡII遺伝子を含むアデノウイ
ルス配列１０５３２−１１１５６の後にアンピシリン耐
性遺伝子と複製起点を含む４３６３−２４８６および１
０９４−３７５からのｐＢＲ３２２配列が続く、ｐＢＲ
３２２由来の配列およびｐＤＣ２０１のウイルス関連配
列ＶＡＩおよびＶＡII；を含んでいる。
【００８１】得られたｐＣＡＶ／ＮＯＴ中のＷＩ−２６
ＶＡ４ ｃＤＮＡはE.coli DH5α株を形質転換するため
に使用した。形質転換体はプレート当たり約８００コロ
ニーを与えるようにまき、スクリーン当たり約５０００
０の全コロニーを与えるに足るプレートを使用した。コ
ロニーを各プレートからかき取り、プールし、そして各
プールからプラスミドＤＮＡを調製した。その後、プー
ルしたＤＮＡは、Luthman et al.,(Nucl.Acids Res.11:
1295,1983)およびMcCutchan et al.,(J.Natl. Cancer In
st.41:351,1986) により開示されたように、ＤＥＡＥ−
デキストランとその後のクロロキン処理を使ってサルＣ
ＯＳ−７細胞の不完全生長層をトランスフェクトするた
めに使用した。次いで、細胞を３日間培養して、挿入し
た配列を一時的に発現させた。３日後、培養上清を捨
て、各プレートの細胞単層はＴＮＦ結合について次のよ
うに検定した。１．２×１０-11Ｍ 125Ｉ−標識ＦＬＡ
Ｇ（商標）−ＴＮＦを含む結合媒体３ｍｌを各プレート
に加え、プレートを４℃で１２０分インキュベートし
た。次に、この媒体を捨て、各プレートを冷結合媒体
（標識ＴＮＦ不含）で１回、冷ＰＢＳで２回洗った。そ
の後、各プレートの縁を壊し、平らなディスクを残し、
このディスクは増感スクリーンを使ってＸ線フィルムと
−７０℃で７２時間接触させた。ＴＮＦ結合活性は比較
的均一なバックグラウンドに対して黒点として露光フィ
ルム上に視覚化された。
ＶＡ４ ｃＤＮＡはE.coli DH5α株を形質転換するため
に使用した。形質転換体はプレート当たり約８００コロ
ニーを与えるようにまき、スクリーン当たり約５０００
０の全コロニーを与えるに足るプレートを使用した。コ
ロニーを各プレートからかき取り、プールし、そして各
プールからプラスミドＤＮＡを調製した。その後、プー
ルしたＤＮＡは、Luthman et al.,(Nucl.Acids Res.11:
1295,1983)およびMcCutchan et al.,(J.Natl. Cancer In
st.41:351,1986) により開示されたように、ＤＥＡＥ−
デキストランとその後のクロロキン処理を使ってサルＣ
ＯＳ−７細胞の不完全生長層をトランスフェクトするた
めに使用した。次いで、細胞を３日間培養して、挿入し
た配列を一時的に発現させた。３日後、培養上清を捨
て、各プレートの細胞単層はＴＮＦ結合について次のよ
うに検定した。１．２×１０-11Ｍ 125Ｉ−標識ＦＬＡ
Ｇ（商標）−ＴＮＦを含む結合媒体３ｍｌを各プレート
に加え、プレートを４℃で１２０分インキュベートし
た。次に、この媒体を捨て、各プレートを冷結合媒体
（標識ＴＮＦ不含）で１回、冷ＰＢＳで２回洗った。そ
の後、各プレートの縁を壊し、平らなディスクを残し、
このディスクは増感スクリーンを使ってＸ線フィルムと
−７０℃で７２時間接触させた。ＴＮＦ結合活性は比較
的均一なバックグラウンドに対して黒点として露光フィ
ルム上に視覚化された。
【００８２】この方法で、ライブラリーからの約２４０
０００個の組換え体をスクリーニングした後で、１つの
トランスフェクタントプールはバックグラウンド露光に
対して明らかなＴＮＦ結合黒点を与えることが観察され
た。
０００個の組換え体をスクリーニングした後で、１つの
トランスフェクタントプールはバックグラウンド露光に
対して明らかなＴＮＦ結合黒点を与えることが観察され
た。
【００８３】その後、陽性プールからの細菌の凍結物は
約１５０コロニーのプレートを得るために使用した。こ
れらのプレートのレプリカをニトロセルロースフィルタ
ー上につくり、その後プレートからコロニーをかき取
り、プラスミドＤＮＡを調製し、上記のようにトランス
フェクトして陽性プレートを同定した。このプレートの
ニトロセルロースレプリカからの個々のコロニーの細菌
は０．２ｍｌ培地中で増殖させ、細菌からプラスミドＤ
ＮＡを回収し、これを上記のようにＣＯＳ−７細胞にト
ランスフェクトした。この方法で、単一のクローン、ク
ローン１、が単離され、これはＣＯＳ細胞によるヒトＴ
ＮＦ−Ｒの発現を誘導することができた。ＴＮＦ−Ｒ
ｃＤＮＡクローン１を含む発現ベクターｐＣＡＶ／ＮＯ
Ｔはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852, USA)
に受託番号６８０８８としてｐＣＡＶ／ＮＯＴ−ＴＮＦ
−Ｒという名称のもとに寄託された。
約１５０コロニーのプレートを得るために使用した。こ
れらのプレートのレプリカをニトロセルロースフィルタ
ー上につくり、その後プレートからコロニーをかき取
り、プラスミドＤＮＡを調製し、上記のようにトランス
フェクトして陽性プレートを同定した。このプレートの
ニトロセルロースレプリカからの個々のコロニーの細菌
は０．２ｍｌ培地中で増殖させ、細菌からプラスミドＤ
ＮＡを回収し、これを上記のようにＣＯＳ−７細胞にト
ランスフェクトした。この方法で、単一のクローン、ク
ローン１、が単離され、これはＣＯＳ細胞によるヒトＴ
ＮＦ−Ｒの発現を誘導することができた。ＴＮＦ−Ｒ
ｃＤＮＡクローン１を含む発現ベクターｐＣＡＶ／ＮＯ
Ｔはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852, USA)
に受託番号６８０８８としてｐＣＡＶ／ＮＯＴ−ＴＮＦ
−Ｒという名称のもとに寄託された。
【００８４】実施例３ 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ２３５をコードするｃＤＮＡの
構築 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ２３５（第２Ａ図のアミノ酸１
−２３５の配列をもつ）をコードするｃＤＮＡは、制限
酵素ＮｏｔＩおよびＰｖｕIIを用いてｐＣＡＶ／ＮＯＴ
−ＴＮＦ−Ｒから８４０ｂｐ断片を切断することにより
構築した。ＮｏｔＩはｐＣＡＶ／ＮＯＴ−ＴＮＦ−Ｒの
多重クローニング部位を切断し、そしてＰｖｕIIはトラ
ンスメンブラン領域の５’側から２０ヌクレオチドのＴ
ＮＦ−Ｒコード領域内を切断する。ＴＮＦ−Ｒ配列の
３’末端を再構築するために、２つのオリゴヌクレオチ
ドを合成し、アニーリングして次のオリゴヌクレオチド
リンカーを作った：
構築 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ２３５（第２Ａ図のアミノ酸１
−２３５の配列をもつ）をコードするｃＤＮＡは、制限
酵素ＮｏｔＩおよびＰｖｕIIを用いてｐＣＡＶ／ＮＯＴ
−ＴＮＦ−Ｒから８４０ｂｐ断片を切断することにより
構築した。ＮｏｔＩはｐＣＡＶ／ＮＯＴ−ＴＮＦ−Ｒの
多重クローニング部位を切断し、そしてＰｖｕIIはトラ
ンスメンブラン領域の５’側から２０ヌクレオチドのＴ
ＮＦ−Ｒコード領域内を切断する。ＴＮＦ−Ｒ配列の
３’末端を再構築するために、２つのオリゴヌクレオチ
ドを合成し、アニーリングして次のオリゴヌクレオチド
リンカーを作った：
【化６】 このオリゴヌクレオチドリンカーは末端ＰｖｕIIおよび
ＢｇｌII制限部位を有し、ＴＮＦ−Ｒの２０ヌクレオチ
ド、これに続く終結コドン（下線が引いてある）および
ＢａｍＨＩ制限部位（ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ消化により
全可溶性ＴＮＦ−Ｒを単離するのに便利）を再生する。
このオリゴヌクレオチドはその後ＢｇｌII／ＮｏｔＩ切
断ｐＣＡＶ／ＮＯＴ中の８４０ｂｐのＮｏｔＩ／Ｐｖｕ
II ＴＮＦ−Ｒ挿入物と連結してｐｓｏｌｈｕＴＮＦ−
ＲΔ２３５／ＣＡＶＮＯＴを作製し、これを上記のよう
にＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。この発現ベ
クターは可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒの発現を誘導し、発現さ
れたＴＮＦ−ＲはＴＮＦを結合することができた。
ＢｇｌII制限部位を有し、ＴＮＦ−Ｒの２０ヌクレオチ
ド、これに続く終結コドン（下線が引いてある）および
ＢａｍＨＩ制限部位（ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ消化により
全可溶性ＴＮＦ−Ｒを単離するのに便利）を再生する。
このオリゴヌクレオチドはその後ＢｇｌII／ＮｏｔＩ切
断ｐＣＡＶ／ＮＯＴ中の８４０ｂｐのＮｏｔＩ／Ｐｖｕ
II ＴＮＦ−Ｒ挿入物と連結してｐｓｏｌｈｕＴＮＦ−
ＲΔ２３５／ＣＡＶＮＯＴを作製し、これを上記のよう
にＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。この発現ベ
クターは可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒの発現を誘導し、発現さ
れたＴＮＦ−ＲはＴＮＦを結合することができた。
【００８５】実施例４ 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１８５をコードするｃＤＮＡの
構築 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１８５（第２Ａ図のアミノ酸１
−１８５の配列をもつ）をコードするｃＤＮＡは、制限
酵素ＮｏｔＩおよびＢｇｌIIを用いてｐＣＡＶ／ＮＯＴ
−ＴＮＦ−Ｒから６４０ｂｐ断片を切断することにより
構築した。ＮｏｔＩはｐＣＡＶ／ＮＯＴ−ＴＮＦ−Ｒの
多重クローニング部位を切断し、そしてＢｇｌIIはトラ
ンスメンブラン領域の５’側から２３７ヌクレオチドの
ヌクレオチド６３７でＴＮＦ−Ｒコード領域内を切断す
る。次のオリゴヌクレオチドリンカーを合成した：
構築 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１８５（第２Ａ図のアミノ酸１
−１８５の配列をもつ）をコードするｃＤＮＡは、制限
酵素ＮｏｔＩおよびＢｇｌIIを用いてｐＣＡＶ／ＮＯＴ
−ＴＮＦ−Ｒから６４０ｂｐ断片を切断することにより
構築した。ＮｏｔＩはｐＣＡＶ／ＮＯＴ−ＴＮＦ−Ｒの
多重クローニング部位を切断し、そしてＢｇｌIIはトラ
ンスメンブラン領域の５’側から２３７ヌクレオチドの
ヌクレオチド６３７でＴＮＦ−Ｒコード領域内を切断す
る。次のオリゴヌクレオチドリンカーを合成した：
【化７】 BglII 5'-GATCTGTAACGTGGTGGCCATCCCTGGGAATGCAAGCATGGATGC-3' ACATTGCACCACCGGTAGGGACCCTTACGTTCG IleCysAsnValValAlaIleProGlyAsnAlaSerMetAspAla NotＩ 5'- AGTCTGCACGTCCACGTCCCCCACCCGGTGAGC -3' TACCTACGTCAGACGTGCAGGTGCAGGGGGTGGGCCACTCGCCGG ValCysThrSerThrSerProThrArgEnd 上記のオリゴヌクレオチドリンカーはヌクレオチド７０
８までのレセプター分子の３’末端、これに続く終結コ
ドン（下線が引いてある）を再構築する。これらのオリ
ゴヌクレオチドはその後ＮｏｔＩ切断ｐＣＡＶ／ＮＯＴ
中の６４０ｂｐのＮｏｔＩ ＴＮＦ−Ｒ挿入物と連結さ
せて発現ベクターｐｓｏｌＴＮＦ−ＲΔ１８５／ＣＡＶ
ＮＯＴを作製し、これを上記のようにＣＯＳ−７細胞に
トランスフェクトした。この発現ベクターは可溶性ヒト
ＴＮＦ−Ｒの発現を誘導し、発現されたＴＮＦ−ＲはＴ
ＮＦを結合することができた。
８までのレセプター分子の３’末端、これに続く終結コ
ドン（下線が引いてある）を再構築する。これらのオリ
ゴヌクレオチドはその後ＮｏｔＩ切断ｐＣＡＶ／ＮＯＴ
中の６４０ｂｐのＮｏｔＩ ＴＮＦ−Ｒ挿入物と連結さ
せて発現ベクターｐｓｏｌＴＮＦ−ＲΔ１８５／ＣＡＶ
ＮＯＴを作製し、これを上記のようにＣＯＳ−７細胞に
トランスフェクトした。この発現ベクターは可溶性ヒト
ＴＮＦ−Ｒの発現を誘導し、発現されたＴＮＦ−ＲはＴ
ＮＦを結合することができた。
【００８６】実施例５ 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１６３をコードするｃＤＮＡの
構築 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１６３（第２Ａ図のアミノ酸１
−１６３の配列をもつ）をコードするｃＤＮＡは、実施
例４に記載したように制限酵素ＮｏｔＩおよびＢｇｌII
を用いてｐＣＡＶ／ＮＯＴ−ＴＮＦ−Ｒから６４０ｂｐ
断片を切断することにより構築した。次のオリゴヌクレ
オチドリンカーを合成した：
構築 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１６３（第２Ａ図のアミノ酸１
−１６３の配列をもつ）をコードするｃＤＮＡは、実施
例４に記載したように制限酵素ＮｏｔＩおよびＢｇｌII
を用いてｐＣＡＶ／ＮＯＴ−ＴＮＦ−Ｒから６４０ｂｐ
断片を切断することにより構築した。次のオリゴヌクレ
オチドリンカーを合成した：
【化８】 上記のオリゴヌクレオチドリンカーはヌクレオチド６４
２（アミノ酸１６３）までのレセプター分子の３’末
端、これに続く終結コドン（下線が引いてある）を再構
築する。このオリゴヌクレオチドはその後ＮｏｔＩ切断
ｐＣＡＶ／ＮＯＴ中の６４０ｂｐのＮｏｔＩ ＴＮＦ−
Ｒ挿入物と連結させて発現ベクターｐｓｏｌＴＮＦ−Ｒ
Δ１６３／ＣＡＶＮＯＴを作製し、これを上記のように
ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。この発現ベク
ターは可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒの発現を誘導し、発現され
たＴＮＦ−Ｒは実施例１で述べた結合検定においてＴＮ
Ｆを結合することができた。
２（アミノ酸１６３）までのレセプター分子の３’末
端、これに続く終結コドン（下線が引いてある）を再構
築する。このオリゴヌクレオチドはその後ＮｏｔＩ切断
ｐＣＡＶ／ＮＯＴ中の６４０ｂｐのＮｏｔＩ ＴＮＦ−
Ｒ挿入物と連結させて発現ベクターｐｓｏｌＴＮＦ−Ｒ
Δ１６３／ＣＡＶＮＯＴを作製し、これを上記のように
ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。この発現ベク
ターは可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒの発現を誘導し、発現され
たＴＮＦ−Ｒは実施例１で述べた結合検定においてＴＮ
Ｆを結合することができた。
【００８７】実施例６ 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１４２をコードするｃＤＮＡの
構築 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１４２（第２Ａ図のアミノ酸１
−１４２の配列をもつ）をコードするｃＤＮＡは、制限
酵素ＮｏｔＩおよびＡｌｗＮＩを用いてｐＣＡＶ／ＮＯ
Ｔ−ＴＮＦ−Ｒから５５０ｂｐ断片を切断することによ
り構築した。次のオリゴヌクレオチドリンカーを合成し
た：
構築 可溶性ｈｕＴＮＦ−ＲΔ１４２（第２Ａ図のアミノ酸１
−１４２の配列をもつ）をコードするｃＤＮＡは、制限
酵素ＮｏｔＩおよびＡｌｗＮＩを用いてｐＣＡＶ／ＮＯ
Ｔ−ＴＮＦ−Ｒから５５０ｂｐ断片を切断することによ
り構築した。次のオリゴヌクレオチドリンカーを合成し
た：
【化９】 上記のオリゴヌクレオチドリンカーはヌクレオチド５７
９（アミノ酸１４２）までのレセプター分子の３’末
端、これに続く終結コドン（下線が引いてある）を再構
築する。このオリゴヌクレオチドはその後ＮｏｔＩ／Ｂ
ｇｌII切断ｐＣＡＶ／ＮＯＴ中の５５０ｂｐのＮｏｔＩ
／ＡｌｗＮＩ ＴＮＦ−Ｒ挿入物と連結させて発現ベク
ターｐｓｏｌＴＮＦ−ＲΔ１４２／ＣＡＶＮＯＴを作製
し、これを上記のようにＣＯＳ−７細胞にトランスフェ
クトした。この発現ベクターはＴＮＦを結合しうる可溶
性ヒトＴＮＦ−Ｒの発現を誘導しなかった。この特定構
築物は、（ＴＮＦ−Ｒ分子の適切な三次構造を形成する
ための）分子内結合に必要なシステイン残基（例えば、
Ｃｙｓ157またはＣｙｓ163）が１個またはそれ以上除か
れたために、生物学的に活性なＴＮＦ−Ｒを発現するの
に失敗したと考えられる。
９（アミノ酸１４２）までのレセプター分子の３’末
端、これに続く終結コドン（下線が引いてある）を再構
築する。このオリゴヌクレオチドはその後ＮｏｔＩ／Ｂ
ｇｌII切断ｐＣＡＶ／ＮＯＴ中の５５０ｂｐのＮｏｔＩ
／ＡｌｗＮＩ ＴＮＦ−Ｒ挿入物と連結させて発現ベク
ターｐｓｏｌＴＮＦ−ＲΔ１４２／ＣＡＶＮＯＴを作製
し、これを上記のようにＣＯＳ−７細胞にトランスフェ
クトした。この発現ベクターはＴＮＦを結合しうる可溶
性ヒトＴＮＦ−Ｒの発現を誘導しなかった。この特定構
築物は、（ＴＮＦ−Ｒ分子の適切な三次構造を形成する
ための）分子内結合に必要なシステイン残基（例えば、
Ｃｙｓ157またはＣｙｓ163）が１個またはそれ以上除か
れたために、生物学的に活性なＴＮＦ−Ｒを発現するの
に失敗したと考えられる。
【００８８】実施例７ ＣＨＯ細胞による可溶性ＴＮＦレセプターの発現 可溶性ＴＮＦレセプターは、実質的にＰＣＴ特許出願Ｗ
Ｏ８７／０４４６２およびＷＯ８９／０１０３６に記載
されているように、グルタミン−シンテターゼ（ＧＳ）
遺伝子増幅系を使ってチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞により発現させた。簡単に説明すると、ＣＨ
Ｏ細胞はＴＮＦ−ＲとＧＳの両方の遺伝子を含む発現ベ
クターでトランスフェクトされる。ＣＨＯ細胞は、トラ
ンスフェクトされたＤＮＡが低レベルのメチオニンスル
ホキシミン（ＭＳＸ）に対する耐性を賦与するその能力
に基づいてＧＳ遺伝子発現について選択される。このよ
うな細胞内のＧＳ配列増幅現象はＭＳＸ濃度の上昇を用
いて選択される。この方法では、隣接するＴＮＦ−Ｒ配
列も増幅され、ＴＮＦ−Ｒ発現の増加が達成される。
Ｏ８７／０４４６２およびＷＯ８９／０１０３６に記載
されているように、グルタミン−シンテターゼ（ＧＳ）
遺伝子増幅系を使ってチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞により発現させた。簡単に説明すると、ＣＨ
Ｏ細胞はＴＮＦ−ＲとＧＳの両方の遺伝子を含む発現ベ
クターでトランスフェクトされる。ＣＨＯ細胞は、トラ
ンスフェクトされたＤＮＡが低レベルのメチオニンスル
ホキシミン（ＭＳＸ）に対する耐性を賦与するその能力
に基づいてＧＳ遺伝子発現について選択される。このよ
うな細胞内のＧＳ配列増幅現象はＭＳＸ濃度の上昇を用
いて選択される。この方法では、隣接するＴＮＦ−Ｒ配
列も増幅され、ＴＮＦ−Ｒ発現の増加が達成される。
【００８９】ＧＳ発現系で用いるベクターはｐｓｏｌＴ
ＮＦ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳであり、これは次のように構
築した。初めに、ベクターｐＳＶＬＧＳ．１（ＰＣＴ出
願ＷＯ８７／０４４６２およびＷＯ８９／０１０３６に
開示されており、Celltech,Ltd.,Berkshire,UK から入
手できる）をＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、ウシ腸アル
カリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化してベ
クターがそれ自体に再連結しないようにした。その後、
ＢａｍＨＩ切断ｐＳＶＬＧＳ．１断片は、ＢｇｌII、Ｂ
ａｍＨＩおよびＦｓｐＩ（同じ大きさの２つの断片を回
避するため）で切断したｐＥＥ６ｈＣＭＶ（ＰＣＴ出願
ＷＯ８９／０１０３６に開示されており、Celltech か
ら入手できる）の２．４ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII断
片に連結させて、ｐ６／ＰＳＶＬＧＳ．１と呼ばれる１
１．２ｋｂベクターを作製した。ｐＳＶＬＧＳ．１はＳ
Ｖ４０後期プロモーターの支配下にあるグルタミンシン
テターゼ選択マーカー遺伝子を含む。ｐＥＥ６ｈＣＭＶ
のＢａｍＨＩ／ＢｇｌII断片はヒト・サイトメガロウイ
ルス主要即時（immediate early) プロモーター（ｈＣ
ＭＶ）、ポリリンカー、およびＳＶ４０初期ポリアデニ
ル化シグナルを含む。可溶性ＴＮＦ−Ｒのコード配列
は、発現ベクターｐｓｏｌＴＮＦＲ／ＣＡＶＮＯＴ（上
記実施例３に従って作製した）からＮｏｔＩ／ＢａｍＨ
Ｉ断片を切断し、Klenow で平滑末端となし、ＳｍａＩ
切断脱リン酸化ｐ６／ＰＳＶＬＧＳ．１と連結させるこ
とによってｐ６／ＰＳＶＬＧＳ．１に挿入し、これによ
りｓｏｌＴＮＦ−Ｒコード配列をｈＣＭＶプロモーター
の支配下においた。これはＳＶ４０／ＧＳおよびｈＣＭ
Ｖ／ｓｏｌＴＮＦ−Ｒ転写単位が相反する方向で転写さ
れる単一のプラスミドベクターをもたらした。このベク
ターはｐｓｏｌＴＮＦＲ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳと命名さ
れた。
ＮＦ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳであり、これは次のように構
築した。初めに、ベクターｐＳＶＬＧＳ．１（ＰＣＴ出
願ＷＯ８７／０４４６２およびＷＯ８９／０１０３６に
開示されており、Celltech,Ltd.,Berkshire,UK から入
手できる）をＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、ウシ腸アル
カリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化してベ
クターがそれ自体に再連結しないようにした。その後、
ＢａｍＨＩ切断ｐＳＶＬＧＳ．１断片は、ＢｇｌII、Ｂ
ａｍＨＩおよびＦｓｐＩ（同じ大きさの２つの断片を回
避するため）で切断したｐＥＥ６ｈＣＭＶ（ＰＣＴ出願
ＷＯ８９／０１０３６に開示されており、Celltech か
ら入手できる）の２．４ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII断
片に連結させて、ｐ６／ＰＳＶＬＧＳ．１と呼ばれる１
１．２ｋｂベクターを作製した。ｐＳＶＬＧＳ．１はＳ
Ｖ４０後期プロモーターの支配下にあるグルタミンシン
テターゼ選択マーカー遺伝子を含む。ｐＥＥ６ｈＣＭＶ
のＢａｍＨＩ／ＢｇｌII断片はヒト・サイトメガロウイ
ルス主要即時（immediate early) プロモーター（ｈＣ
ＭＶ）、ポリリンカー、およびＳＶ４０初期ポリアデニ
ル化シグナルを含む。可溶性ＴＮＦ−Ｒのコード配列
は、発現ベクターｐｓｏｌＴＮＦＲ／ＣＡＶＮＯＴ（上
記実施例３に従って作製した）からＮｏｔＩ／ＢａｍＨ
Ｉ断片を切断し、Klenow で平滑末端となし、ＳｍａＩ
切断脱リン酸化ｐ６／ＰＳＶＬＧＳ．１と連結させるこ
とによってｐ６／ＰＳＶＬＧＳ．１に挿入し、これによ
りｓｏｌＴＮＦ−Ｒコード配列をｈＣＭＶプロモーター
の支配下においた。これはＳＶ４０／ＧＳおよびｈＣＭ
Ｖ／ｓｏｌＴＮＦ−Ｒ転写単位が相反する方向で転写さ
れる単一のプラスミドベクターをもたらした。このベク
ターはｐｓｏｌＴＮＦＲ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳと命名さ
れた。
【００９０】ｐｓｏｌＴＮＦＲ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳを
使ってＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ，Rochville,MD か
ら受託番号ＣＣＬ ６１として入手可能）を次のように
トランスフェクトした。ＣＨＯ−Ｋ１細胞の単層は１０
％透析ウシ胎児血清（Gibco:220-6300AJ)、１ｍＭピル
ビン酸ナトリウム（Sigma)、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Gi
bco:320-1140AG)、５００μＭアスパラギンおよびグル
タミン酸（Sigma)およびヌクレオシド類（３０μＭアデ
ノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンおよび１
０μＭチミジン）（Sigma)を補給したグルタミン不含最
小必須培地（ＭＥＭ）１０Ｘ（Gibco:330-1581AJ) で
不完全集密的（Subconfluency)に増殖させた。
使ってＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ，Rochville,MD か
ら受託番号ＣＣＬ ６１として入手可能）を次のように
トランスフェクトした。ＣＨＯ−Ｋ１細胞の単層は１０
％透析ウシ胎児血清（Gibco:220-6300AJ)、１ｍＭピル
ビン酸ナトリウム（Sigma)、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Gi
bco:320-1140AG)、５００μＭアスパラギンおよびグル
タミン酸（Sigma)およびヌクレオシド類（３０μＭアデ
ノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンおよび１
０μＭチミジン）（Sigma)を補給したグルタミン不含最
小必須培地（ＭＥＭ）１０Ｘ（Gibco:330-1581AJ) で
不完全集密的（Subconfluency)に増殖させた。
【００９１】約１×１０6細胞／１０ｃｍペトリ皿は、
実質的に Grham & van der Eb,Virol ogy 52:456(1983)
に開示されるように、標準的なリン酸カルシウム沈降に
より１０μｇのｐｓｏｌＴＮＦＲ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳ
でトランスフェクトした。その後、実質的にFrost & Wi
lliams,Virology 91:39(1978)に記載されるように、細
胞はトランスフェクションの約４時間後にグリセロール
ショック（無血清培地中の１５％グリセロールで約１．
５分）に付し、無血清培地で洗った。１日後、トランス
フェクトした細胞に２５μＭの最終濃度でＭＳＸを含む
新しい選択培地を供給した。ＭＳＸ耐性生存細胞のコロ
ニーは３〜４週間以内に肉眼で見えた。生存コロニーを
２４−ウェルプレートに移し、選択培地で集密的に増殖
させた。集密的ウェルからのならし培地はその後上記の
実施例１で説明した結合検定を用いて、可溶性ＴＮＦ−
Ｒ活性について調べた。これらの検定は、コロニーが生
物学的に活性な可溶性ＴＮＦ−Ｒを発現することを示し
た。
実質的に Grham & van der Eb,Virol ogy 52:456(1983)
に開示されるように、標準的なリン酸カルシウム沈降に
より１０μｇのｐｓｏｌＴＮＦＲ／Ｐ６／ＰＳＶＬＧＳ
でトランスフェクトした。その後、実質的にFrost & Wi
lliams,Virology 91:39(1978)に記載されるように、細
胞はトランスフェクションの約４時間後にグリセロール
ショック（無血清培地中の１５％グリセロールで約１．
５分）に付し、無血清培地で洗った。１日後、トランス
フェクトした細胞に２５μＭの最終濃度でＭＳＸを含む
新しい選択培地を供給した。ＭＳＸ耐性生存細胞のコロ
ニーは３〜４週間以内に肉眼で見えた。生存コロニーを
２４−ウェルプレートに移し、選択培地で集密的に増殖
させた。集密的ウェルからのならし培地はその後上記の
実施例１で説明した結合検定を用いて、可溶性ＴＮＦ−
Ｒ活性について調べた。これらの検定は、コロニーが生
物学的に活性な可溶性ＴＮＦ−Ｒを発現することを示し
た。
【００９２】ＧＳ遺伝子の増幅について選択するため
に、数種類のＭＳＸ耐性細胞株をｐｓｏｌＴＮＦＲ／Ｐ
６／ＰＳＶＬＧＳでトランスフェクトし、いろいろな濃
度のＭＳＸ中で増殖させた。各細胞株において、約１×
１０6細胞を次第に増加する濃度の１００μＭ、２５０
μＭ、５００μＭおよび１ｍＭ ＭＳＸの存在下にま
き、１０〜１４日間インキュベートした。１２日後、比
較的高濃度のＭＳＸに対して耐性を示すコロニーが出現
した。生き残っているコロニーは実施例１に記載した結
合検定を使ってＴＮＦ−Ｒ活性について調べた。これら
の高度に耐性の細胞株は、複数の独立した増幅現象より
生じた細胞を含んでいる。これらの細胞株から、１つま
たはそれ以上の最も強く耐性を示す細胞株が単離され
た。その後、高生産性の増幅細胞は限界希釈クローニン
グによりクローン化した。トランスフェクタントの大量
培養物は生物学的に活性な可溶性ＴＮＦ−Ｒを分泌し
た。
に、数種類のＭＳＸ耐性細胞株をｐｓｏｌＴＮＦＲ／Ｐ
６／ＰＳＶＬＧＳでトランスフェクトし、いろいろな濃
度のＭＳＸ中で増殖させた。各細胞株において、約１×
１０6細胞を次第に増加する濃度の１００μＭ、２５０
μＭ、５００μＭおよび１ｍＭ ＭＳＸの存在下にま
き、１０〜１４日間インキュベートした。１２日後、比
較的高濃度のＭＳＸに対して耐性を示すコロニーが出現
した。生き残っているコロニーは実施例１に記載した結
合検定を使ってＴＮＦ−Ｒ活性について調べた。これら
の高度に耐性の細胞株は、複数の独立した増幅現象より
生じた細胞を含んでいる。これらの細胞株から、１つま
たはそれ以上の最も強く耐性を示す細胞株が単離され
た。その後、高生産性の増幅細胞は限界希釈クローニン
グによりクローン化した。トランスフェクタントの大量
培養物は生物学的に活性な可溶性ＴＮＦ−Ｒを分泌し
た。
【００９３】実施例８ 酵母による可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒの発現 可溶性ヒトＴＮＦ−Ｒは、酵母発現ベクターｐＩＸＹ１
２０およびプラスミドｐＹＥＰ３５２から誘導された発
現ベクターｐＩＸＹ４３２を用いて酵母により発現させ
た。ｐＩＸＹ１２０は、それがｃＤＮＡ挿入物を含ま
ず、ポリリンカー／多重クローニング部位（ＮｃｏＩ制
限部位を含む）を有することを除いて、ｐＹαＨｕＧＭ
（ＡＴＣＣ５３１５７）と同一である。
２０およびプラスミドｐＹＥＰ３５２から誘導された発
現ベクターｐＩＸＹ４３２を用いて酵母により発現させ
た。ｐＩＸＹ１２０は、それがｃＤＮＡ挿入物を含ま
ず、ポリリンカー／多重クローニング部位（ＮｃｏＩ制
限部位を含む）を有することを除いて、ｐＹαＨｕＧＭ
（ＡＴＣＣ５３１５７）と同一である。
【００９４】ＴＮＦレセプターをコードし、酵母発現ベ
クターｐＩＸＹ１２０にクローニングするのに適したＤ
ＮＡ断片は、ｐＣＡＶ／ＮＯＴ−ＴＮＦ−Ｒからの全長
レセプターの細胞外部分のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ
Ｒ）増幅により生成させた。このＰＣＲ増幅では、次の
プライマーを使用した：
クターｐＩＸＹ１２０にクローニングするのに適したＤ
ＮＡ断片は、ｐＣＡＶ／ＮＯＴ−ＴＮＦ−Ｒからの全長
レセプターの細胞外部分のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ
Ｒ）増幅により生成させた。このＰＣＲ増幅では、次の
プライマーを使用した：
【化１０】 増幅に用いた５’末端オリゴヌクレオチドプライマー
は、その５’末端にＡｓｐ７１８制限部位、これに続い
て酵母α−因子リーダー配列の３’末端（Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）をコードするヌクレオチ
ド、および成熟レセプターの５’末端をコードする配列
に融合されたＦＬＡＧ（商標名）ペプチド（ＡｓｐＴｙ
ｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ）の８アミノ
酸をコードする配列を含んでいた。ＦＬＡＧペプチド
（Hopp et al.,Bio/Technology 6:1204,1988) はモノク
ローナル抗体Ｍ１（ＡＴＣＣ ＨＢ ９２５９）を可逆
的に結合する高度に抗原性のある配列である。ＰＣＲ誘
導断片の３’末端を生成させるために使用したオリゴヌ
クレオチドは、ＴＡＡ停止コドン（下線が引いてある）
を導入することによって成熟コード領域のヌクレオチド
７０４の後（トランスメンブランドメインに先行するＡ
ｓｐ残基の後）でレセプターのオープン・リーディング
・フレームを終わらせるＤＮＡコード配列のアンチセン
ス鎖である。停止コドンの後にＢａｍＨＩ制限部位が存
在する。ＴＮＦ−ＲをコードするＤＮＡ配列はその後、
実質的にInnis et al.,PCR Protocols: A Guide to Met
hods and Applications(Academic Press,1990)に開示さ
れているように、ＰＣＲによって増幅される。
は、その５’末端にＡｓｐ７１８制限部位、これに続い
て酵母α−因子リーダー配列の３’末端（Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）をコードするヌクレオチ
ド、および成熟レセプターの５’末端をコードする配列
に融合されたＦＬＡＧ（商標名）ペプチド（ＡｓｐＴｙ
ｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ）の８アミノ
酸をコードする配列を含んでいた。ＦＬＡＧペプチド
（Hopp et al.,Bio/Technology 6:1204,1988) はモノク
ローナル抗体Ｍ１（ＡＴＣＣ ＨＢ ９２５９）を可逆
的に結合する高度に抗原性のある配列である。ＰＣＲ誘
導断片の３’末端を生成させるために使用したオリゴヌ
クレオチドは、ＴＡＡ停止コドン（下線が引いてある）
を導入することによって成熟コード領域のヌクレオチド
７０４の後（トランスメンブランドメインに先行するＡ
ｓｐ残基の後）でレセプターのオープン・リーディング
・フレームを終わらせるＤＮＡコード配列のアンチセン
ス鎖である。停止コドンの後にＢａｍＨＩ制限部位が存
在する。ＴＮＦ−ＲをコードするＤＮＡ配列はその後、
実質的にInnis et al.,PCR Protocols: A Guide to Met
hods and Applications(Academic Press,1990)に開示さ
れているように、ＰＣＲによって増幅される。
【００９５】可溶性ヒトＴＮＦ−ＲをコードするＰＣＲ
誘導ＤＮＡ断片は、ＰＣＲ誘導ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ
とＡｓｐ７１８制限酵素で消化し、ｐＩＸＹ１２０をＢ
ａｍＨＩとＡｓｐ７１８で消化し、ＰＣＲ断片を切断ベ
クターにＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてin vitroで連結
することにより、酵母発現ベクターｐＩＸＹ１２０にサ
ブクローニングした。得られた構築物（ｐＩＸＹ４２
４）はＦＬＡＧ−可溶性ＴＮＦレセプターのオープン・
リーディング・フレームを完全なα−因子リーダー配列
に同調融合させ、そして酵母による発現を調節された酵
母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）プロモータ
ーの支配下に置いた。ｐＩＸＹ４２４に保有される可溶
性ＴＮＦレセプターのヌクレオチド配列とｃＤＮＡクロ
ーン１中の配列との同一性は、ジデオキシヌクレオチド
・チェイン・ターミネーション法を使ってＤＮＡ塩基配
列を決定することにより証明した。ｐＩＸＹ４２４はそ
の後E.coli ＲＲ１株に形質転換した。
誘導ＤＮＡ断片は、ＰＣＲ誘導ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ
とＡｓｐ７１８制限酵素で消化し、ｐＩＸＹ１２０をＢ
ａｍＨＩとＡｓｐ７１８で消化し、ＰＣＲ断片を切断ベ
クターにＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてin vitroで連結
することにより、酵母発現ベクターｐＩＸＹ１２０にサ
ブクローニングした。得られた構築物（ｐＩＸＹ４２
４）はＦＬＡＧ−可溶性ＴＮＦレセプターのオープン・
リーディング・フレームを完全なα−因子リーダー配列
に同調融合させ、そして酵母による発現を調節された酵
母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）プロモータ
ーの支配下に置いた。ｐＩＸＹ４２４に保有される可溶
性ＴＮＦレセプターのヌクレオチド配列とｃＤＮＡクロ
ーン１中の配列との同一性は、ジデオキシヌクレオチド
・チェイン・ターミネーション法を使ってＤＮＡ塩基配
列を決定することにより証明した。ｐＩＸＹ４２４はそ
の後E.coli ＲＲ１株に形質転換した。
【００９６】また、可溶性ヒトＴＮＦレセプターは第二
ベクターを使って酵母により発現・分泌させた。この第
二ベクターは、ｐＩＸＹ４２４プラスミドをE.coliから
回収し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ制限酵素で消化して、
ＡＤＨ２プロモーター、α−因子リーダー、ＦＬＡＧ−
可溶性ＴＮＦレセプターおよび停止コドンをコードする
領域にわたる断片を単離し、この断片をＥｃｏＲＩ／Ｂ
ａｍＨＩ切断プラスミドｐＹＥＰ３５２（Hill et al.,
Yeast 2:163(1986))に in vitroで連結して、発現プラ
スミドｐＩＸＹ４３２を得ることにより作製した。この
発現プラスミドｐＩＸＹ４３２はE.coli ＲＲ１株に形
質転換した。
ベクターを使って酵母により発現・分泌させた。この第
二ベクターは、ｐＩＸＹ４２４プラスミドをE.coliから
回収し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ制限酵素で消化して、
ＡＤＨ２プロモーター、α−因子リーダー、ＦＬＡＧ−
可溶性ＴＮＦレセプターおよび停止コドンをコードする
領域にわたる断片を単離し、この断片をＥｃｏＲＩ／Ｂ
ａｍＨＩ切断プラスミドｐＹＥＰ３５２（Hill et al.,
Yeast 2:163(1986))に in vitroで連結して、発現プラ
スミドｐＩＸＹ４３２を得ることにより作製した。この
発現プラスミドｐＩＸＹ４３２はE.coli ＲＲ１株に形
質転換した。
【００９７】可溶性ヒトＴＮＦレセプターの酵母からの
分泌を評価するために、ｐＩＸＹ４２４は精製して、エ
レクトロポレーションによりS.cerevisiae(ＸＶ２１８
１）の２倍体酵母株に導入し、トリプトファン欠損培地
でプラスミド由来酵母ＴＲＰ１+遺伝子の獲得について
選択した。ｐＩＸＹ４３２により誘導されたレセプター
の分泌を評価するために、このプラスミドはエレクトロ
ポレーションにより酵母ＰＢ１４９−６ｂに導入し、次
いでウラシル欠損培地で増殖させてプラスミド由来ＵＲ
Ａ３+遺伝子について選択した。培養物は適当な選択培
地中３０℃で一晩増殖させた。ＰＢ１４９−６ｂ／ｐＩ
ＸＹ４３２形質転換体はＹＥＰ−１％グルコース培地に
希釈し、３０℃で３８〜４０時間増殖させた。遠心して
細胞を除き、０．４５μフィルターを通して濾過するこ
とにより上清を調製した。
分泌を評価するために、ｐＩＸＹ４２４は精製して、エ
レクトロポレーションによりS.cerevisiae(ＸＶ２１８
１）の２倍体酵母株に導入し、トリプトファン欠損培地
でプラスミド由来酵母ＴＲＰ１+遺伝子の獲得について
選択した。ｐＩＸＹ４３２により誘導されたレセプター
の分泌を評価するために、このプラスミドはエレクトロ
ポレーションにより酵母ＰＢ１４９−６ｂに導入し、次
いでウラシル欠損培地で増殖させてプラスミド由来ＵＲ
Ａ３+遺伝子について選択した。培養物は適当な選択培
地中３０℃で一晩増殖させた。ＰＢ１４９−６ｂ／ｐＩ
ＸＹ４３２形質転換体はＹＥＰ−１％グルコース培地に
希釈し、３０℃で３８〜４０時間増殖させた。遠心して
細胞を除き、０．４５μフィルターを通して濾過するこ
とにより上清を調製した。
【００９８】上清中に分泌されたレセプターのレベルは
イムノ−ドットブロットにより測定した。簡単に説明す
ると、１μｌの上清と上清の希釈物をニトロセルロース
フィルターに点在させ、乾燥させた。３％ＢＳＡ溶液で
非特異的蛋白結合をブロックした後、このフィルターを
希釈したＭ１抗ＦＬＡＧ抗体とインキュベートし、過剰
の抗体を洗浄して除き、西洋ワサビペルオキシダーゼ結
合抗マウスＩｇＧ抗体の希釈物をフィルターとインキュ
ベートした。過剰の第二抗体を除去した後、ペルオキシ
ダーゼ基質を加え、約１０分間発色させた後で基質溶液
を除去した。
イムノ−ドットブロットにより測定した。簡単に説明す
ると、１μｌの上清と上清の希釈物をニトロセルロース
フィルターに点在させ、乾燥させた。３％ＢＳＡ溶液で
非特異的蛋白結合をブロックした後、このフィルターを
希釈したＭ１抗ＦＬＡＧ抗体とインキュベートし、過剰
の抗体を洗浄して除き、西洋ワサビペルオキシダーゼ結
合抗マウスＩｇＧ抗体の希釈物をフィルターとインキュ
ベートした。過剰の第二抗体を除去した後、ペルオキシ
ダーゼ基質を加え、約１０分間発色させた後で基質溶液
を除去した。
【００９９】上清中に存在する抗ＦＬＡＧ反応性物質
は、有意なレベルのレセプターが両方の発現系により分
泌されたことを立証した。両発現系の比較により、ｐＩ
ＸＹ４３２系はｐＩＸＹ４２４系よりも約８〜１６倍多
い可溶性ヒトＴＮＦレセプターを分泌することが分かっ
た。上清は、実施例１に記載したように、125Ｉ−ＴＮ
Ｆαを結合してＴＮＦα結合を阻止する能力により、可
溶性ＴＮＦ−Ｒ活性について検定した。ｐＩＸＹ４３２
上清は有意なレベルの活性可溶性ＴＮＦ−Ｒを含むこと
が見だされた。
は、有意なレベルのレセプターが両方の発現系により分
泌されたことを立証した。両発現系の比較により、ｐＩ
ＸＹ４３２系はｐＩＸＹ４２４系よりも約８〜１６倍多
い可溶性ヒトＴＮＦレセプターを分泌することが分かっ
た。上清は、実施例１に記載したように、125Ｉ−ＴＮ
Ｆαを結合してＴＮＦα結合を阻止する能力により、可
溶性ＴＮＦ−Ｒ活性について検定した。ｐＩＸＹ４３２
上清は有意なレベルの活性可溶性ＴＮＦ−Ｒを含むこと
が見だされた。
【０１００】実施例９ マウスＴＮＦ−Ｒ ｃＤＮＡの単離 マウスＴＮＦ−Ｒ ｃＤＮＡは、ヒトＴＮＦ−Ｒプロー
ブとの交差種ハイブリダイゼーションにより、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６マウス由来の抗原依存性ヘルパーＴ細胞株、マウ
ス７Ｂ９細胞より作製されたｃＤＮＡライブラリーから
単離した。ｃＤＮＡライブラリーは、実質的に実施例２
に記載したように、７Ｂ９細胞からポリアデニル化ＲＮ
Ａを単離することにより、λＺＡＰ(Stratagene,San Di
ego)中に作製した。
ブとの交差種ハイブリダイゼーションにより、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６マウス由来の抗原依存性ヘルパーＴ細胞株、マウ
ス７Ｂ９細胞より作製されたｃＤＮＡライブラリーから
単離した。ｃＤＮＡライブラリーは、実質的に実施例２
に記載したように、７Ｂ９細胞からポリアデニル化ＲＮ
Ａを単離することにより、λＺＡＰ(Stratagene,San Di
ego)中に作製した。
【０１０１】二本鎖ヒトＴＮＦ−Ｒ ｃＤＮＡプローブ
は、ヒトＴＮＦ−Ｒクローン１の約３．５ｋｂ Ｎｏｔ
Ｉ断片を切断し、このｃＤＮＡをランダムプライマー
（Boehringer-Mannheim)を使って32Ｐ−ラベリングする
ことにより作った。
は、ヒトＴＮＦ−Ｒクローン１の約３．５ｋｂ Ｎｏｔ
Ｉ断片を切断し、このｃＤＮＡをランダムプライマー
（Boehringer-Mannheim)を使って32Ｐ−ラベリングする
ことにより作った。
【０１０２】マウスｃＤＮＡライブラリーは一度増幅さ
せ、全部で９００，０００プラークをヒトＴＮＦ−Ｒ
ｃＤＮＡプローブで実質的に実施例２に記載したように
スクリーニングした。約２１の陽性プラークを精製し、
ＥｃｏＲＩリンカー付加挿入物を含むBluescriptプラス
ミドを切断した（Stratagene,San Diego)。マウスＴＮ
Ｆ−Ｒクローン１１の部分の核酸配列解析により、マウ
スＴＮＦ−Ｒのコード配列はヒトＴＮＦ−Ｒの対応ヌク
レオチド配列と約８８％相同であると判明した。マウス
ＴＮＦ−Ｒ ｃＤＮＡクローン１１の部分ヌクレオチド
配列は第３Ａ−３Ｂ図に示してある。
せ、全部で９００，０００プラークをヒトＴＮＦ−Ｒ
ｃＤＮＡプローブで実質的に実施例２に記載したように
スクリーニングした。約２１の陽性プラークを精製し、
ＥｃｏＲＩリンカー付加挿入物を含むBluescriptプラス
ミドを切断した（Stratagene,San Diego)。マウスＴＮ
Ｆ−Ｒクローン１１の部分の核酸配列解析により、マウ
スＴＮＦ−Ｒのコード配列はヒトＴＮＦ−Ｒの対応ヌク
レオチド配列と約８８％相同であると判明した。マウス
ＴＮＦ−Ｒ ｃＤＮＡクローン１１の部分ヌクレオチド
配列は第３Ａ−３Ｂ図に示してある。
【０１０３】実施例１０ ＴＮＦ−Ｒに対するモノクローナル抗体の調製 精製した組換えＴＮＦ−Ｒ（例．ヒトＴＮＦ−Ｒ）の調
製物、または高レベルのＴＮＦ−Ｒを発現するトランス
フェクトされたＣＯＳ細胞を使用して、慣用技法によ
り、例えば米国特許第４４１１９９３号に記載される方
法により、ＴＮＦ−Ｒに対するモノクローナル抗体を製
造した。この種の抗体はＴＮＦレセプターへのＴＮＦ結
合を妨げるのに、例えばＴＮＦの毒性または他の望まし
くない作用を改善するために、あるいはＴＮＦまたは可
溶性ＴＮＦレセプターの診断または検索アッセイの成分
として、有用であるだろう。
製物、または高レベルのＴＮＦ−Ｒを発現するトランス
フェクトされたＣＯＳ細胞を使用して、慣用技法によ
り、例えば米国特許第４４１１９９３号に記載される方
法により、ＴＮＦ−Ｒに対するモノクローナル抗体を製
造した。この種の抗体はＴＮＦレセプターへのＴＮＦ結
合を妨げるのに、例えばＴＮＦの毒性または他の望まし
くない作用を改善するために、あるいはＴＮＦまたは可
溶性ＴＮＦレセプターの診断または検索アッセイの成分
として、有用であるだろう。
【０１０４】マウスを免疫するために、ＴＮＦ−Ｒ免疫
原を完全フロインドアジュバントで乳化し、Ｂａｌｂ／
ｃマウスに１０〜１００μｇの量を皮下注射した。１０
〜１２日後、免疫した動物に不完全フロインドアジュバ
ントで乳化した追加免疫原を投与し、その後定期的に毎
週または隔週免疫スケジュールで追加免疫を施した。血
清サンプルをドット−ブロット検定（抗体サンドイッ
チ）またはＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッ
セイ）で試験するために、眼窩後方採血もしくは尾先端
切除により定期的にサンプルを採取した。その他のアッ
セイ法も適している。適当な抗体価の検出後、陽性動物
に食塩水中の抗原を静脈内注射した。３〜４日後、動物
を殺し、脾細胞を回収し、マウス・ミエローマ細胞株Ｎ
Ｓ１に融合させた。この方法によって得られたハイブリ
ドーマ細胞株は、多重マイクロタイタープレートを使っ
て、非融合細胞、ミエローマハイブリッドおよび脾細胞
ハイブリッドの増殖を抑制するＨＡＴ選択培地（ヒポキ
サンチン、アミノプテリンおよびチミジン）にまいた。
原を完全フロインドアジュバントで乳化し、Ｂａｌｂ／
ｃマウスに１０〜１００μｇの量を皮下注射した。１０
〜１２日後、免疫した動物に不完全フロインドアジュバ
ントで乳化した追加免疫原を投与し、その後定期的に毎
週または隔週免疫スケジュールで追加免疫を施した。血
清サンプルをドット−ブロット検定（抗体サンドイッ
チ）またはＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッ
セイ）で試験するために、眼窩後方採血もしくは尾先端
切除により定期的にサンプルを採取した。その他のアッ
セイ法も適している。適当な抗体価の検出後、陽性動物
に食塩水中の抗原を静脈内注射した。３〜４日後、動物
を殺し、脾細胞を回収し、マウス・ミエローマ細胞株Ｎ
Ｓ１に融合させた。この方法によって得られたハイブリ
ドーマ細胞株は、多重マイクロタイタープレートを使っ
て、非融合細胞、ミエローマハイブリッドおよび脾細胞
ハイブリッドの増殖を抑制するＨＡＴ選択培地（ヒポキ
サンチン、アミノプテリンおよびチミジン）にまいた。
【０１０５】このようにして得られたハイブリドーマク
ローンは、例えばEngvall et al.,Immunochem.8:871(19
71)および米国特許第４７０３００４号に記載された技
術を用いて、ＴＮＦ−Ｒとの反応性についてＥＬＩＳＡ
でスクリーニングすることができる。その後、陽性クロ
ーンを同系Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射して、高
濃度（＞１ｍｇ／ｍｌ）の抗ＴＮＦ−Ｒモノクローナル
抗体を含む腹水を得た。このモノクローナル抗体は、硫
酸アンモニウム沈澱とその後のゲル排除クロマトグラフ
ィーおよび／またはStaphylococcus aureusのプロティ
ンＡへの抗体の結合に基づいたアフニティクロマトグラ
フィーにより精製した。
ローンは、例えばEngvall et al.,Immunochem.8:871(19
71)および米国特許第４７０３００４号に記載された技
術を用いて、ＴＮＦ−Ｒとの反応性についてＥＬＩＳＡ
でスクリーニングすることができる。その後、陽性クロ
ーンを同系Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射して、高
濃度（＞１ｍｇ／ｍｌ）の抗ＴＮＦ−Ｒモノクローナル
抗体を含む腹水を得た。このモノクローナル抗体は、硫
酸アンモニウム沈澱とその後のゲル排除クロマトグラフ
ィーおよび／またはStaphylococcus aureusのプロティ
ンＡへの抗体の結合に基づいたアフニティクロマトグラ
フィーにより精製した。
【図１】第１図は、ヒトおよびマウスＴＮＦ−Ｒをコー
ドする種々のｃＤＮＡのコード領域の模式図である。リ
ーダー配列は斜線で、トランスメンブラン領域は黒で示
してある。
ドする種々のｃＤＮＡのコード領域の模式図である。リ
ーダー配列は斜線で、トランスメンブラン領域は黒で示
してある。
【図２】第２Ａ−２Ｂ図は、ヒトＴＮＦ−Ｒクローン１
の部分ｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す。ヌ
クレオチドは５’非翻訳領域の始めから番号がつけてあ
る。アミノ酸はシグナルペプチド配列の始めから番号が
つけてある。推定上のシグナルペプチド配列はアミノ酸
−２２ないし−１により表される。成熟ＴＮＦ−Ｒ蛋白
のＮ末端ロイシンは位置１に下線が引いてある。アミノ
酸２３６−２６５の推定トランスメンブラン領域にも下
線が引いてある。種々の可溶性ＴＮＦ−ＲのＣ末端には
矢印（↑）がつけてある。
の部分ｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す。ヌ
クレオチドは５’非翻訳領域の始めから番号がつけてあ
る。アミノ酸はシグナルペプチド配列の始めから番号が
つけてある。推定上のシグナルペプチド配列はアミノ酸
−２２ないし−１により表される。成熟ＴＮＦ−Ｒ蛋白
のＮ末端ロイシンは位置１に下線が引いてある。アミノ
酸２３６−２６５の推定トランスメンブラン領域にも下
線が引いてある。種々の可溶性ＴＮＦ−ＲのＣ末端には
矢印（↑）がつけてある。
【図３】第２Ａ−２Ｂ図は、ヒトＴＮＦ−Ｒクローン１
の部分ｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す。ヌ
クレオチドは５’非翻訳領域の始めから番号がつけてあ
る。アミノ酸はシグナルペプチド配列の始めから番号が
つけてある。推定上のシグナルペプチド配列はアミノ酸
−２２ないし−１により表される。成熟ＴＮＦ−Ｒ蛋白
のＮ末端ロイシンは位置１に下線が引いてある。アミノ
酸２３６−２６５の推定トランスメンブラン領域にも下
線が引いてある。種々の可溶性ＴＮＦ−ＲのＣ末端には
矢印（↑）がつけてある。
の部分ｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す。ヌ
クレオチドは５’非翻訳領域の始めから番号がつけてあ
る。アミノ酸はシグナルペプチド配列の始めから番号が
つけてある。推定上のシグナルペプチド配列はアミノ酸
−２２ないし−１により表される。成熟ＴＮＦ−Ｒ蛋白
のＮ末端ロイシンは位置１に下線が引いてある。アミノ
酸２３６−２６５の推定トランスメンブラン領域にも下
線が引いてある。種々の可溶性ＴＮＦ−ＲのＣ末端には
矢印（↑）がつけてある。
【図４】第３Ａ−３Ｃ図は、マウスＴＮＦ−Ｒクローン
１１のｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す。推
定上のシグナルペプチド配列はアミノ酸−２２ないし−
１により表される。成熟ＴＮＦ−Ｒ蛋白のＮ末端バリン
は位置１に下線が引いてある。アミノ酸２３４−２６５
の推定トランスメンブラン領域にも下線が引いてある。
１１のｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す。推
定上のシグナルペプチド配列はアミノ酸−２２ないし−
１により表される。成熟ＴＮＦ−Ｒ蛋白のＮ末端バリン
は位置１に下線が引いてある。アミノ酸２３４−２６５
の推定トランスメンブラン領域にも下線が引いてある。
【図５】第３Ａ−３Ｃ図は、マウスＴＮＦ−Ｒクローン
１１のｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す。推
定上のシグナルペプチド配列はアミノ酸−２２ないし−
１により表される。成熟ＴＮＦ−Ｒ蛋白のＮ末端バリン
は位置１に下線が引いてある。アミノ酸２３４−２６５
の推定トランスメンブラン領域にも下線が引いてある。
１１のｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す。推
定上のシグナルペプチド配列はアミノ酸−２２ないし−
１により表される。成熟ＴＮＦ−Ｒ蛋白のＮ末端バリン
は位置１に下線が引いてある。アミノ酸２３４−２６５
の推定トランスメンブラン領域にも下線が引いてある。
【図６】第３Ａ−３Ｃ図は、マウスＴＮＦ−Ｒクローン
１１のｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す。推
定上のシグナルペプチド配列はアミノ酸−２２ないし−
１により表される。成熟ＴＮＦ−Ｒ蛋白のＮ末端バリン
は位置１に下線が引いてある。アミノ酸２３４−２６５
の推定トランスメンブラン領域にも下線が引いてある。
１１のｃＤＮＡ配列および誘導アミノ酸配列を示す。推
定上のシグナルペプチド配列はアミノ酸−２２ないし−
１により表される。成熟ＴＮＦ−Ｒ蛋白のＮ末端バリン
は位置１に下線が引いてある。アミノ酸２３４−２６５
の推定トランスメンブラン領域にも下線が引いてある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｌ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/574 Ａ 33/574 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ５２３６３５ (32)優先日 1990年５月10日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 エム・パトリシア・ベックマン アメリカ合衆国ワシントン州98370，ポウ ルスボ，ネシカ・ベイ・ロード 15875
Claims (7)
- 【請求項１】以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）から選
択される哺乳類組換えＴＮＦ−Ｒタンパク質であって、
哺乳動物由来の他のタンパク質を実質的に含まない前記
哺乳類組換えＴＮＦ−Ｒタンパク質： （ａ）以下のアミノ酸配列： 【化１】 を有するタンパク質； （ｂ）以下のアミノ酸配列： 【化２】 を有するタンパク質；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列から１つまた
はそれ以上のアミノ酸残基が削除、追加もしくは置換に
よって変化したアミノ酸配列を有し、かつ、ＴＮＦ結合
活性を有するタンパク質。 - 【請求項２】上記タンパク質が（ａ）または（ｂ）から
選択される、請求項１に記載の哺乳類組換えＴＮＦ−Ｒ
タンパク質。 - 【請求項３】以下のアミノ酸配列： 【化３】 を有するマウスＴＮＦ−Ｒタンパク質。
- 【請求項４】請求項１または２に記載の哺乳類組換えＴ
ＮＦ−Ｒタンパク質の有効量を含む、免疫反応を調節す
るための医薬用組成物。 - 【請求項５】請求項１または２に記載の哺乳類組換えＴ
ＮＦ−Ｒタンパク質の有効量を含む、活性ＴＮＦのレベ
ルを低下させるための医薬用組成物。 - 【請求項６】請求項１または２に記載の哺乳類組換えＴ
ＮＦ−Ｒタンパク質を使用することを含む、ＴＮＦもし
くはＴＮＦ−Ｒ分子、またはそれらの相互作用を検出す
るためのアッセイ方法。 - 【請求項７】哺乳類ＴＮＦ−Ｒと免疫反応性の抗体であ
って、前記ＴＮＦ−Ｒは生物学的に活性であって、かつ （ａ）以下のアミノ酸配列： 【化４】 を有するＴＮＦ−Ｒポリペプチド； （ｂ）以下のアミノ酸配列： 【化５】 を有するＴＮＦ−Ｒポリペプチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列から１つまた
はそれ以上のアミノ酸残基が削除、追加もしくは置換に
よって変化したアミノ酸配列を有するＴＮＦ−Ｒポリペ
プチドからなるグループから選択されるものである、前
記抗体。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US40324189A | 1989-09-05 | 1989-09-05 | |
| US40537089A | 1989-09-11 | 1989-09-11 | |
| US42141789A | 1989-10-13 | 1989-10-13 | |
| US405370 | 1990-05-10 | ||
| US523635 | 1990-05-10 | ||
| US421417 | 1990-05-10 | ||
| US07/523,635 US5395760A (en) | 1989-09-05 | 1990-05-10 | DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors |
| US403241 | 1990-05-10 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2235502A Division JP2721745B2 (ja) | 1989-09-05 | 1990-09-05 | 腫瘍壊死因子―αおよび―βレセプター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10191986A true JPH10191986A (ja) | 1998-07-28 |
| JP2960039B2 JP2960039B2 (ja) | 1999-10-06 |
Family
ID=27503488
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2235502A Expired - Lifetime JP2721745B2 (ja) | 1989-09-05 | 1990-09-05 | 腫瘍壊死因子―αおよび―βレセプター |
| JP9225286A Expired - Lifetime JP2960039B2 (ja) | 1989-09-05 | 1997-08-21 | 腫瘍壊死因子−αおよび−βレセプター |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2235502A Expired - Lifetime JP2721745B2 (ja) | 1989-09-05 | 1990-09-05 | 腫瘍壊死因子―αおよび―βレセプター |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (2) | JP2721745B2 (ja) |
| IE (1) | IE63505B1 (ja) |
| IL (1) | IL95572A (ja) |
| MX (1) | MX9203660A (ja) |
| NZ (1) | NZ235148A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7144987B1 (en) | 2000-03-02 | 2006-12-05 | Xencor | Protein based tumor necrosis factor-receptor variants for the treatment of TNF related disorders |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DK0393438T3 (da) | 1989-04-21 | 2005-05-30 | Amgen Inc | TNF-receptor, TNF-bindende proteiner og DNAér, der koder herfor |
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