JPH10191996A - 試料中の微生物由来ａｔｐ濃度の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物細胞及び非微生物細胞混合物を含む試
料から、微生物細胞由来のＡＴＰを選択的に検出する方
法を提供する。 【解決手段】 微生物細胞及び非微生物細胞混合物を含
む試料において、非イオン界面活性剤を混合して非微生
物細胞のＡＴＰを細胞外へ出す工程、試料を遠心分離し
て上済み液を除去し微生物細胞ペレットを形成する工
程、微生物細胞ペレットに緩衝液を加えｐＨ＝６．０〜
８．０としプロテアーゼフリーの可溶性タンパク質、Ａ
ＴＰ加水分解酵素及びＡＴＰ加水分解酵素活性化剤を加
える工程、ＡＴＰ加水分解酵素の阻害剤を加える工程、
ＡＴＰ抽出剤を添加し微生物細胞からＡＴＰを抽出する
工程、及び微生物細胞から放出されたＡＴＰ濃度を生物
発光法を用いて測定する工程を含むことを特徴とする微
生物細胞中のＡＴＰ濃度の測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物細胞及び非
微生物細胞混合物である試料の微生物学的品質検査に関
わり、生物発光法により該試料中の微生物細胞由来ＡＴ
Ｐを簡便かつ短時間で選択的に測定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

【０００３】ホタルルシフェラーゼを用いた生物発光法
は、微生物細胞ＡＴＰの迅速検出法として広く利用され
ている。この方法は、主に微生物細胞及び非微生物細胞
混合物である試料中の微生物細胞由来ＡＴＰを測定する
方法として一般的になってきているが、測定対象である
ＡＴＰは生物界に広く存在するため、目的とする微生物
細胞由来ＡＴＰのみを選択的に検出するには、様々な工
夫が必要である。

【０００４】非微生物細胞を含む試料中の微生物細胞由
来ＡＴＰを選択的に測定する方法として、様々な方法が
開発されている。いずれの方法でも、大量に存在する非
微生物細胞由来ＡＴＰから微生物由来ＡＴＰのみを選択
的に高感度に検出する方法に腐心している。その中で、
非イオン性界面活性剤などにより非微生物細胞由来ＡＴ
Ｐを抽出した後、アピラーゼなどのＡＴＰ加水分解酵素
でこれを分解し、その後微生物細胞由来ＡＴＰを抽出し
て生物発光法で測定する方法は、第１にＡＴＰ測定法の
簡便化、第２に選択的検出感度の向上のために有効な手
段である。しかし一方で、ＡＴＰ加水分解酵素を用いる
ために起こる不都合もある。すなわち、非微生物細胞由
来ＡＴＰを分解した後、試料中に残るＡＴＰ加水分解酵
素は目的とする微生物細胞由来ＡＴＰまでも分解してし
まう恐れがある。そこで、ＡＴＰ加水分解酵素を用いた
方法では、いずれの場合もＡＴＰ加水分解酵素の処理に
工夫を凝らして、現在までに様々な測定法が開発されて
いる。

【０００５】すなわち、米国特許第３７４５０９０号で
は、ＡＴＰ加水分解酵素であるアピラーゼを失活させる
方法をいくつか記述している。化学的方法として酸、塩
基、重金属、有機溶媒、酵素抑制剤の添加、物理的方法
として加熱、短波長放射線の使用が示唆されており、そ
の中で沸騰Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液での加熱失活が試
みられているが、この方法では、目的とする微生物細胞
を含む全てのタンパク質を非特異的かつ不可逆的に変成
させること、及び沸騰Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液による
該試料の希釈のために測定感度は低下する。また、該特
許には酵素活性阻害剤の使用も示唆されているが、具体
的な方法については触れられていない。

【０００６】これとは別に、目的とするＡＴＰの速やか
な分解が起きないように、ＡＴＰ加水分解酵素をごく低
濃度で用いる方法も開発されている（米国特許第４３０
３７５２号）。しかし、この方法ではＡＴＰ加水分解酵
素の使用条件を厳しく制限する必要があり、かつＡＴＰ
加水分解酵素の作用が緩慢であったために、測定バック
グランドとなる非目的ＡＴＰを十分に分解するにはかな
りの時間を要した。

【０００７】特公昭６２−４１２０号には、アピラーゼ
などのＡＴＰ加水分解酵素で非微生物細胞由来ＡＴＰを
加水分解した後、アピラーゼをガラスビーズなどで不動
態化する方法が示されている。しかし、この方法では、
試料に対して微生物細胞の濃縮操作が施されていないこ
とや、タンパク質、乳脂肪などの試料の構成成分による
測定阻害を受けることによって高感度の検出は期待でき
ない。また、アピラーゼの除去あるいは失活が不完全で
あって、微生物細胞からＡＴＰを抽出した後もアピラー
ゼの阻害作用があり正確な測定値が得られないといった
問題がある。このため、測定値のバラツキが大きく、実
用的には１０⁶ ＣＦＵ／ｍｌ（ＣＦＵ；C olony F ormi
ngU nit ）程度の検出感度しか期待できない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】以上のような事実を鑑
み、本発明は、微生物細胞及び非微生物細胞混合物であ
る試料中の微生物細胞由来ＡＴＰの選択的測定法におい
て、ＡＴＰ加水分解酵素を利用し、しかも、目的とする
微生物細胞由来ＡＴＰの分解を起こさないように速やか
にＡＴＰ加水分解酵素を不活性化して、微生物細胞由来
ＡＴＰのみを簡便に、かつ高感度に測定する方法を提供
することにある。

【０００９】本発明者らは、ＡＴＰ加水分解酵素を有効
に働かせて非微生物由来ＡＴＰを分解し、尚かつ加水分
解後には速やかにＡＴＰ加水分解酵素を不活性化する条
件を見出したことにより、目的とする微生物細胞由来の
ＡＴＰのみを選択的かつ高感度に検出することを可能に
した。

【００１０】ＡＴＰ加水分解酵素添加時、緩衝液を加え
ｐＨ＝６．０〜８．０とし、さらにプロテアーゼフリー
の可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵素活性化剤を加
え、ＡＴＰ加水分解酵素の活性レベルを最適とする。Ａ
ＴＰ加水分解酵素は非微生物細胞由来ＡＴＰを分解する
ときには良好に作用する。更に、ＡＴＰ加水分解酵素に
よる非微生物由来ＡＴＰの分解処理を行った後、残った
ＡＴＰ加水分解酵素に、キレート剤、バナジン酸塩、レ
バミソール、ステロイドａ、グルコン酸クロルヘキシジ
ン、及びタンパク質加水分解酵素からなる群から選ばれ
る少なくとも一種の阻害剤を加えてＡＴＰ加水分解酵素
を不活性化し、その後、微生物細胞由来のＡＴＰを抽出
し生物発光法で定量することが微生物細胞由来ＡＴＰの
選択的検出に有効であった。以上の一連の操作の組み合
わせが検出感度を向上させ、測定値のバラツキを抑え、
その信頼性を高める上で効果があることを見出して本発
明を完成させた。

【課題を解決するための手段】本発明は、微生物細胞及
び非微生物細胞混合物を含む試料中のＡＴＰ濃度を測定
する方法であって、非イオン界面活性剤を混合して非微
生物細胞のＡＴＰを細胞外へ出す工程、試料を遠心分離
して上澄み液を除去し微生物細胞ペレットを形成する工
程、微生物細胞ペレットに緩衝液を加えｐＨ＝６．０〜
８．０とし、プロテアーゼフリーの可溶性タンパク質、
ＡＴＰ加水分解酵素及びＡＴＰ加水分解酵素活性化剤を
加える工程、ＡＴＰ加水分解酵素の阻害剤を加える工
程、ＡＴＰ抽出剤を添加し微生物細胞からＡＴＰを抽出
する工程、及び微生物細胞から放出されたＡＴＰ濃度を
生物発光法を用いて測定する工程を含むことを特徴とす
る微生物細胞中のＡＴＰ濃度の測定法に関する。

【００１１】更に本発明は、非イオン界面活性剤を混合
して非微生物細胞のＡＴＰを細胞外へ出す工程におい
て、キレート剤を混合することを特徴とする上記測定法
に関する。

【００１２】更に本発明は、ＡＴＰ加水分解酵素の阻害
剤が、キレート剤、バナジン酸塩、レバミソール、下記
一般式で示される骨格を有するステロイドａ、グルコン
酸クロルヘキシジン、及びタンパク質加水分解酵素から
なる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴と
する上記測定法に関する。

【００１３】

【化２】

【００１４】

【発明の実施の形態】

【００１５】本発明の試験方法を、典型的な微生物細胞
及び非微生物細胞混合物を含む試料であるミルク試料に
ついて詳述する。ただし、これにより本発明の範囲がミ
ルク試料に限定されるものではない。分析に供試される
ミルク試料をまず遠心分離容器に入れ、キレート剤、及
び非イオン界面活性剤を添加する。ここで加えるキレー
ト剤はミルク試料中のカルシウムイオンを捕捉してカゼ
インの沈殿を抑制するために添加するものであって、Ａ
ＴＰ加水分解酵素の活性を阻害するために加えるもので
はない。したがって、カゼインが測定の阻害とならない
場合には、ここでキレート剤を添加する必要はない。ま
た、非イオン界面活性剤は非微生物細胞からのＡＴＰ抽
出剤として働く。

【００１６】混合物の入った遠心分離容器に蓋をし、反
転あるいは旋回して混合する。試料を遠心分離機に入
れ、最小限５分間、１０，０００×ｇ（最小相対遠心
力）で遠心分離すると、３つの層に分離する。最上層は
白色または帯黄白色のクリームおよびミルクタンパク質
である。その下側には中間層である透明液領域があり、
最下層には微生物細胞ペレットがたまる。微生物細胞ペ
レット以外の他のミルク成分を吸引によって除去する
と、微生物細胞ペレットのみが遠心管の底部に残る。こ
の時、先に入れたキレート剤も吸引によって除去され
る。管底部に残った微生物細胞ペレットの大きさはミル
ク試料中の細胞数およびキレート剤と非イオン界面活性
剤のタイプに依存する。また、微生物細胞ペレットは少
量の細胞と会合した他のミルク成分も含んでいる。

【００１７】次に、管底部に残る微生物細胞ペレット
に、ＡＴＰ加水分解酵素含有溶液を加えて再懸濁させ
る。再懸濁させた液は、バックグランドとなる非微生物
細胞由来または遊離のＡＴＰが加水分解されるまでイン
キュベートさせる。ＡＴＰ加水分解酵素含有液には、ｐ
Ｈ＝６．０〜８．０とする緩衝液、プロテアーゼフリー
の可溶性タンパク質、及びＡＴＰ加水分解酵素活性化剤
を添加する。ＡＴＰ加水分解酵素含有溶液を加える工程
は、非微生物細胞由来ＡＴＰ及び遊離ＡＴＰを分解する
ためである。遠心分離操作で大部分の非微生物細胞由来
のＡＴＰは除去されているが、ミルク試料は大量の体細
胞を含むため、遠心分離操作だけで非微生物細胞由来の
ＡＴＰを完全に除去することはできない。そこで、ＡＴ
Ｐ加水分解酵素によりこれらのＡＴＰを加水分解する。
また、ｐＨ＝６．０〜８．０に調整するのは、ＡＴＰ加
水分解酵素を最適の活性とするためであり、プロテアー
ゼフリーの可溶性タンパク質の添加は、ＡＴＰ加水分解
酵素を安定に作用させる働きがある。ＡＴＰ加水分解酵
素活性化剤も、酵素を安定に作用させ測定値のバラツキ
を抑えるために添加している。

【００１８】微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水分解酵素
含有溶液を加える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素の活性
及び反応条件を以下のように制御することが不可欠であ
る。 ａ）ＡＴＰ加水分解酵素の活性値をΔｌｏｇＲＬＵ／分
＝１．０〜６．０とする。 ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素の反応温度を２０〜４０℃とす
る。 ｃ）ＡＴＰ加水分解酵素の反応時間を５分間以上とす
る。 なお、本発明では、ＡＴＰ加水分解酵素の活性値を、Ａ
ＴＰ加水分解酵素によって基質であるＡＴＰを加水分解
する速度をもって表す。従って、酵素活性の測定は被検
液中のＡＴＰ量の減少を経時的に測定することで実施さ
れ、被検液中のＡＴＰ量は、ＡＴＰの鋭敏な定量法であ
るホタルルシフェラーゼを用いた生物発光反応から得ら
れる相対発光量（ＲＬＵ；相対発光量、Relative Light
Unit ）を指標として測定される。本発明では、非連続
的に被検液より一定量を採取してＡＴＰ量を生物発光反
応で測定し、得られた値から１分間当たりの相対発光量
の対数値の減少量（ΔｌｏｇＲＬＵ／分）を計算し、そ
の値をもってＡＴＰ加水分解酵素の活性値とする。

【００１９】微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水分解酵素
を加える工程では、以下の試薬を加えることもできる。 ａ）防腐剤 ｂ）タンパク質ＳＨ基保護剤

【００２０】ＡＴＰ加水分解酵素を作用させインキュベ
ートの終了した再懸濁液に、該酵素を不活性化させる目
的で阻害剤を添加する。この時の阻害剤の濃度は、次の
生物発光法における酵素ルシフェラーゼの活性への影響
が最小であり、かつＡＴＰ加水分解酵素を効果的に不活
性化させる濃度を選んで添加する。

【００２１】阻害剤を添加した再懸濁液に微生物細胞Ａ
ＴＰ抽出剤を加え、微生物細胞からＡＴＰを放出させた
後、ルシフェリン／ルシフェラーゼを含む発光試薬を加
えて生物発光させ、ＡＴＰ量をルミノメーターで定量す
る。

【００２２】本発明のミルク試料とは、生乳、生山羊
乳、生めん羊乳、牛乳、超高温殺菌乳、低温長時間殺菌
乳、殺菌山羊乳、特別牛乳、部分脱脂乳、脱脂乳、加工
乳、液状に戻した粉末ミルク、クリーム、スキムミル
ク、液化されたアイスクリームあるいはアイスミルクあ
るいは関連製品、豆乳、および試料中のミルクあるいは
懸濁液を包含するミルクの生材料あるいはコーヒー等と
の混合液、ミルクの培養液（増菌培養液）等の乳製品を
起源とする全ての液状溶液を含む。本発明の微生物と
は、単細胞の原核生物を意味する。バクテリアあるいは
非真核細胞という用語に入れ換えることもまた本発明の
範囲に属する。なお、真核細胞は、遺伝材料が核により
囲まれている生物体を表わす。

【００２３】本発明の非微生物細胞とは微生物ではない
細胞であり、大部分は体細胞である。体細胞とは、ミル
クを生産する動物、例えばウシに主として由来してミル
ク中に存在する、生物体を構成する全細胞のうち生殖細
胞以外の細胞であり、例えば体液由来の白血球、赤血
球、血小板等の細胞あるいは乳房内部組織等より剥離し
た細胞などを示す。

【００２４】ＡＴＰ（アデノシン−５’−三リン酸）
は、アデニン、Ｄ−リボースおよび３個のリン酸基から
なるヌクレオチドであり、呼吸、発酵および光合成にお
けるリン酸化反応によって生成され、生物エネルギー代
謝において重要である。全ての生細胞は、ＡＴＰを含有
する。

【００２５】本発明の非イオン界面活性剤は、水溶液中
でイオンに解離する基を持たない界面活性剤であり、非
微生物細胞のＡＴＰ抽出剤として作用するものである。
ミルク試料から非微生物細胞を分離除去し、微生物細胞
のみを分離濃縮するために、特に、微生物細胞に作用す
ることなく非微生物細胞よりＡＴＰを抽出する薬剤であ
る。非微生物細胞ＡＴＰ抽出剤の作用として、微生物細
胞ＡＴＰを減少させ、あるいは微生物に障害を与え、あ
るいは微生物の生存を危うくさせる非微生物細胞ＡＴＰ
抽出剤は好ましくない。したがってタンパクの変性作用
が温和でかつ膜可溶化能に優れ、尚かつ凝集するミルク
成分の乳化分散化に寄与し、微生物細胞の分離濃縮を更
に容易にする非微生物細胞ＡＴＰ抽出剤が好ましい。

【００２６】非イオン界面活性剤は大別して３つのグル
ープに分類され、１）高級アルコール、アルキルフェノ
ール、脂肪酸などにエチレングリコールを親水基として
結合させたもの、２）多価アルコールの部分エステル、
高級脂肪酸グリセロールエステルであるモノグリセリ
ド、ソルビトールの脂肪酸エステル、３）ポリプロピレ
ングリコールとポリエチレングリコールの付加重合物な
どが挙げられる。以上の非イオン界面活性剤の中で、本
発明においては、ポリオキシエチレングリコールオクチ
ルフェニルエーテル類であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
あるいはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）を用
いることが好ましく、特にＴｒｉｔｏｎＸ−１００が好
ましい。とりわけ、このような非イオン界面活性剤をキ
レート剤と共にミルク試料に加えることが特に好まし
い。大部分の体細胞は遠心分離の前の処理で溶解され、
遠心分離後には非微生物細胞由来のＡＴＰの影響は軽減
される。非イオン界面活性剤の添加量は、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００を使用した場合、ミルク試料に対し０．１
〜５％であり、好ましくは０．２５〜２．５％である。

【００２７】本発明の非イオン界面活性剤を混合して非
微生物細胞のＡＴＰを細胞外に出す工程において混合さ
れるキレート剤とは、カルシウムイオン、マグネシウム
イオン、カドミウムイオン、ベリリウムイオン、コバル
トイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉛イオン等の二
価金属イオン、及び他の金属イオンと結合する全ての分
子あるいは巨大分子であり、合成あるいは天然の有機化
合物、上記イオンに結合できるタンパク質、炭水化物、
脂質、あるいは生物起源分子の複製品または修飾製品等
である。

【００２８】遠心分離操作の前に添加されるキレート剤
の作用は、ミルク試料中におけるカゼインミセルのサブ
ミセルへの解離である（L. C. Chaplin, J. Dairy Re
s., 51, 251-257 (1984)）。もしキレート剤無しのミル
ク試料を同様にして遠心分離すると、ミルク試料の上澄
液は透明化せず、ミセル状ミルクタンパク質は遠心分離
管の中で浮遊し、あるいは会合して分子量の大きくなっ
たカゼインミセルは沈降して、底部に巨大なペレットを
形成して明瞭な微生物細胞ペレットを形成できない。キ
レート剤は、ミセル構造に寄与するカルシウムイオンと
結合し（S. H. C.Lia, Biochemistry, 11, 1818-1821
(1972)）、カゼインミセルを解離する。したがって、本
発明ではカルシウムイオンと結合するキレート剤が好ま
しい。なお、前述のようにカゼインが測定の阻害となら
ない場合には、ここでキレート剤を添加する必要はな
い。

【００２９】上記キレート剤としては、エチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ、商品名Ｖｅｒｓｅｎｅ）、ビス−
（Ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール−ビ
ス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（トリグリシ
ン、アンモニア三酢酸塩、トリロンＡ）、トランス−
１，２ージアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣＤＴＡ）、
ジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン
酸などのオキシカルボン酸及びその塩、アルギニン、ハ
イポザンチン、４，５−ジヒドロキシベンゼン−１，３
−ジスルホン酸、クラウンエーテルタイプ化合物、及び
これら分子の全ての誘導体及び前駆体を使用することが
できる。

【００３０】本発明のキレート剤は、検出すべき微生物
細胞には作用しないことが非常に重要である。本発明で
特に優れていると判断されたキレート剤は、ニトリロ三
酢酸及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
なお、先の非イオン界面活性剤とキレート剤は、ミルク
試料の検査キットを作成する場合、両方の薬剤を溶解し
た溶液として提供することも可能である。

【００３１】本発明の微生物細胞ペレットとは、遠心分
離後に、主として微生物細胞が沈降して遠心分離管底に
分離されたものをいう。微生物細胞ペレットの大きさは
ミルク試料の細胞数およびキレート化剤および／または
非イオン界面活性剤の種類に依存する。微生物細胞ペレ
ットには少量の細胞と会合した他のミルク成分を含んで
もよい。ミルク試料１．０ｍｌより得られる微生物細胞
ペレットは約１０〜４０μｌであり、外観は白色または
灰色がかった白色である。

【００３２】本発明のＡＴＰ加水分解酵素とは、ＡＴＰ
の末端リン酸基を切断し、ＡＤＰあるいはＡＭＰと無機
リン酸を生じさせる加水分解酵素であり、ＥＣ（酵素番
号）３．６．１群（丸尾・田宮監修「酵素ハンドブッ
ク」、朝倉書店(1982)等参照）に分類される酵素が含ま
れる。例として、アデノシントリホスファターゼ、アピ
ラーゼ（主にジャガイモより抽出・精製される）、及び
ＡＴＰピロホスファターゼなどが挙げられるが、市販品
として入手が容易なアピラーゼを用いることが好まし
い。

【００３３】ＡＴＰ加水分解酵素は、ミルク中に存在す
る非微生物細胞由来ＡＴＰを分解し、微生物細胞由来Ａ
ＴＰをより高感度に検出するための手段として使用す
る。ミルク試料に対してキレート剤及び非イオン界面活
性剤含有溶液を添加し、遠心分離操作を加えることによ
って、ミルク試料から微生物細胞ペレットを分離濃縮す
るが、体細胞などの非微生物細胞はもともと大量に存在
しており、遠心分離では非微生物細胞由来ＡＴＰは除去
しきれず大量に残存している。このため、ＡＴＰ加水分
解酵素含有溶液を添加することで、バックグランドとな
る非微生物細胞由来ＡＴＰを完全に除去することが可能
である。

【００３４】本発明の微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水
分解酵素を加える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素が最も
安定して作用するｐＨ＝６．０〜８．０、好ましくはｐ
Ｈ＝６．５〜７．８となるようにｐＨを調整する。ｐＨ
の調整は、ｐＨが中性領域を示す「蛋白質・酵素の基礎
実験法」（堀尾、山下編著：南江堂 (1981) ）４３２〜
４３５頁記載の緩衝液が使用できる。この中でも、グッ
ドの緩衝液で総括される以下の緩衝液、すなわち、ＭＥ
Ｓ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液、Ｔｒｉ
ｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）系緩衝
液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−
２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＭＯＰＳ（３−
モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ
（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタ
ンスルホン酸）緩衝液等を用いることが好ましい。

【００３５】本発明の微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水
分解酵素を加える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素を安定
化する目的でプロテアーゼフリーの可溶性タンパク質を
添加する。添加する可溶性タンパク質は、パパイン、ト
リプシン、キモトリプシン等のタンパク質に認められる
タンパク質加水分解活性を示さないものであれば、動物
由来、植物由来、微生物由来のいずれのタンパク質を用
いることも可能であるが、アルブミンで総称される以下
の可溶性タンパク質、すなわち、オボアルブミン、ラク
トアルブミン、血清アルブミン、ロイコシン、レグメリ
ン、リシンから選ばれる一種類以上のタンパク質を用い
ることが好ましい。プロテアーゼフリーの可溶性タンパ
ク質の添加量は、ミルク試料１ｍｌに対し０．１０〜５
ｍｇであり、好ましくは０．２５〜２．５ｍｇである。
さらに、微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水分解酵素を加
える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素活性化剤としてカル
シウムイオン、マグネシウムイオンなどを加えてもよ
い。その添加量は、ミルク試料１ｍｌに対し、カルシウ
ムイオンは０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭ
であり、マグネシウムイオンはカルシウムイオンの１０
０分の１〜１０分の１である。

【００３６】上述のＡＴＰ加水分解酵素を加える工程
で、ＡＴＰ加水分解活性値がΔｌｏｇＲＬＵ／分＝１．
０〜６．０、好ましくはΔｌｏｇＲＬＵ／分＝２．０〜
５．０であり、反応温度２０〜４０℃、好ましくは２５
℃〜３５℃、反応時間５分間以上、好ましくは１０分〜
３０分とすることが好ましい。この条件下では、バック
グランドとなる非微生物細胞由来ＡＴＰの分解が充分に
行われるため、従来行われていた非微生物細胞由来ＡＴ
Ｐを完全に除去するための遠心分離−上澄み除去操作を
繰り返す必要がない。この方法によって、微生物細胞ペ
レット中の微生物細胞数の定量操作を著しく簡略化でき
る。また、本条件下では測定バックグランドとなる非微
生物細胞由来ＡＴＰの分解は充分に進み、バックグラン
ド値の低下および安定化を図ることが可能となり、微生
物細胞由来ＡＴＰの検出感度を著しく向上させることが
できる。なお、ＡＴＰ加水分解酵素、プロテアーゼフリ
ーの可溶性タンパク質、ＡＴＰ加水分解酵素活性剤、ｐ
Ｈ調整用緩衝液を混合し同一溶液として加えることも可
能である。

【００３７】微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水分解酵素
を加える工程では、防腐剤、及びタンパク質ＳＨ基保護
剤の添加もＡＴＰ加水分解酵素の活性化に効果のある場
合がある。防腐剤は測定中に混入する微生物の影響を最
小限にするために添加するもので、ペニシリンＧ−Ｎａ
塩、ペニシリンＧ−Ｋ塩、アンピシリン、クロラムフェ
ニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、テトラ
サイクリン、オキシテトラサイクリンなどの抗生物質、
アジ化ナトリウムなどのアジ化物、クレゾールなどのフ
ェノール化合物、乳酸、クエン酸、安息香酸、プロピオ
ン酸、デヒドロ酢酸、オキシ安息香酸、ソルビン酸、な
どの酸などが挙げられる。タンパク質ＳＨ基保護剤は、
ＡＴＰ加水分解酵素を安定して作用させるために添加す
るもので、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプト
エタノール、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など
を使用できるが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が特に
好ましい。

【００３８】微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水分解酵素
を加える工程では、更に、ＡＴＰ加水分解酵素活性を保
持するために、グルコース、フルクトース、アラビノー
ス、キシロース、サッカロース、トレハロース、ラクト
ース、マルトース、キシロビオースなどの糖類、マンニ
トール、キシリトール、ズルシトール、ソルビトール、
リビトール、グルシトールなどの糖アルコール、ＰＥＧ
（ポリエチレングリコール）＃４００、ＰＥＧ＃６００
などの水溶性高分子、グリシン、セリン、プロリン、グ
ルタミン酸、アラニンなどのアミノ酸、トリメチルアミ
ンなどのアミン類、グリセロールなどの多価アルコール
などを添加することもできる。

【００３９】本発明のＡＴＰ加水分解酵素の阻害剤を加
える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素の不活性化のため
に、キレート剤、バナジン酸塩、レバミソール、ステロ
イドａ、グルコン酸クロルヘキシジン、及びタンパク質
加水分解酵素からなる群から選ばれる少なくとも一種の
阻害剤を用いることが好ましい。

【００４０】ＡＴＰ加水分解酵素の不活性化のために用
いられるキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ、商品名Ｖｅｒｓｅｎｅ）、ビス−（Ｏ−ア
ミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢
酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（β−
アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（トリグリシン、アンモ
ニア三酢酸塩、トリロンＡ）、トランス−１，２−ジア
ミノシクロヘキサン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ジエチレント
リアミノペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸などのオキ
シカルボン酸及びその塩、アルギニン、ハイポザンチ
ン、４，５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルホ
ン酸、Ｎ−（アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、
ジピコリン酸、クラウンエーテルタイプ化合物、及びこ
れら分子の全ての誘導体及び前駆体を挙げることができ
る。

【００４１】本発明のキレート剤は、検出すべき微生物
細胞には作用しないことが非常に重要である。また、ル
シフェリン／ルシフェラーゼを利用した生物発光法にも
影響しないキレート剤が好ましい。本発明で特に優れて
いると判断されたキレート剤は、ニトリロ三酢酸、エチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ−（アセトアミ
ド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、及びクエン酸である。

【００４２】ＡＴＰ加水分解酵素の不活性化のために用
いられるバナジン酸塩、レバミソール、ステロイドａ、
グルコン酸クロルヘキシジンは、全て膜ＡＴＰａｓｅの
阻害剤として知られているものである（井村ら編「生化
学ハンドブック」、丸善(1984)等参照）が、本発明で用
いられるＡＴＰ加水分解酵素の不活性化にも有効である
ことが認められた。このうち、バナジン酸塩としては、
メタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウ
ム、メタバナジン酸カルシウムなどが挙げられる。ま
た、レバミソールとしては、レバミソール及びレバミソ
ール塩酸塩が挙げられる。

【００４３】ＡＴＰ加水分解酵素の不活性化のために用
いられるステロイドａは、下記一般式で示される骨格
（card-20(22)-enolide ）を有するステロイドであり、
具体的にはジギトキシン、ギトキシン、Ｇ−ストロファ
ンチン、Ｋ−ストロファントシドなどが挙げられる。

【００４４】

【化３】

【００４５】ＡＴＰ加水分解酵素の不活性化のために用
いられるタンパク質加水分解酵素としては、ＥＣ（酵素
番号）３．４群（丸尾・田宮監修「酵素ハンドブッ
ク」、朝倉書店(1982)等参照）に分類されるペプチド結
合に作用する加水分解酵素を用いることができるが、特
に好ましくは、キモトリプシン、トリプシン、パパイ
ン、フィシン、ブロメラインなどを用いることが望まし
い。

【００４６】本発明のＡＴＰ加水分解酵素の阻害剤を加
える工程で用いられる阻害剤の濃度は、ルシフェラーゼ
の酵素活性に影響を与えず、かつＡＴＰ加水分解酵素を
有効に不活性化する濃度であることが望ましい。具体的
には、各阻害剤は以下に示す濃度であることが望まし
い。 キレート剤；０．０１〜２０ｍＭ、好ましくは０．１〜
１０ｍＭ。 バナジン酸塩；０．０１〜５ｍＭ、好ましくは０．１〜
２ｍＭ。 レバミソール；０．０１〜２０ｍＭ、好ましくは０．１
〜１０ｍＭ。 ステロイドａ；０．１〜２０ｍＭ、好ましくは２〜１０
ｍＭ。 グルコン酸クロルヘキシジン；０．０１〜１％、好まし
くは０．０５〜０．５％ タンパク質加水分解酵素；０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、好ま
しくは０．５〜２ｍｇ／ｍｌ。 なお、二種類以上の阻害剤を混合して用いても良い。

【００４７】本発明のＡＴＰ抽出剤とは、ミルク試料か
ら分離濃縮された微生物細胞に作用し、微生物細胞体内
に存在するＡＴＰを微生物細胞体外へ放出させる目的で
使用される薬剤で、微生物細胞の構造を変化あるいは破
壊させる微生物細胞の溶解剤であって、界面活性剤、
酸、アルカリ、酵素、塩、キレート剤、有機溶媒などの
天然産あるいは合成起源のいかなる細胞膜可溶化剤をも
含む。なお、ＡＴＰ抽出剤が先のＡＴＰ加水分解酵素阻
害剤を含み、同一溶液とすることも可能である。

【００４８】本発明におけるＡＴＰ抽出剤の作用とし
て、引き続き行なわれるＡＴＰ／ルシフェリン／ルシフ
ェラーゼ反応の結果として放出される生物発光を、著し
く減光あるいは消光させる物質、あるいはその条件を有
する薬剤、例えば亜鉛イオン、カルシウムイオンなどの
ような陽イオン、あるいは塩素イオン、ヨウ素イオン、
リン酸イオンなどの陰イオン、あるいは水銀、クロム、
銅、鉛などの重金属を含む薬剤、あるいは著しい酸性・
アルカリ性条件を有する薬剤などは好ましくない。従来
使用されてきたトリクロロ酢酸は酸性が強くあまり良好
なＡＴＰ抽出剤とはいえない。従って、ルシフェラーゼ
に対する変性作用が温和で、かつ膜可溶化能に優れ、発
光の検出に著しい変化を与えないＡＴＰ抽出剤が好まし
い。ＡＴＰ抽出剤として使用できるのは、セチルトリメ
チルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、臭化ドデシル
トリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩
化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなどの第４ア
ンモニウム塩に属するカチオン性界面活性剤、ドデシル
硫酸ナトリウムのようなアニオン性界面活性剤、Ｔｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ
−４０）などの非イオン界面活性剤である。この中で第
４級アンモニウム塩は抽出が速やかであり、ルシフェラ
ーゼ反応への阻害が少なく好ましい。

【００４９】本発明では、ホタルルシフェラーゼによる
ＡＴＰの定量方法（M. A. DeLuca,Advances in Enzymol
ogy, 44, 37-68 (1976)）を、ミルク試料中の微生物細
胞数の定量に利用する。このＡＴＰ定量法は、真核ある
いは原核細胞数のいずれの定量化にも適用できる。試料
中に存在する微生物細胞数の定量は、測定された試料中
のＡＴＰ量と微生物細胞に存在するＡＴＰの平均量との
関係を用いて算出される。

【００５０】ＡＴＰの検出手段として使用するホタルル
シフェラーゼは温度に対して不安定であるために、測定
時の室温がその発光量すなわち測定値に反映し、被検液
中に存在するＡＴＰ量が同一であるにも関わらず測定値
がばらつく。すなわち、同一量のＡＴＰを測定した場
合、２０℃付近で発光量は最大であり、その前後では発
光量が減少する結果が得られている。従って、検出感度
が最大であり、測定結果のバラツキが小さくかつ信頼性
を増すためには、ホタルルシフェラーゼ反応温度および
測定時の室温を３０℃以下、好ましくは１５〜２５℃と
する。

【００５１】

【実施例】以下、実施例によって本発明を説明するが、
本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるもので
はない。

【００５２】（実施例１） １）Neutrient Broth （ＮＢ）液体培地５ｍｌにて３０
℃で一晩振盪培養した以下の５種類の微生物を、滅菌水
で１０倍毎に段階希釈する。 Serattia liquefaciens PB 1707 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Enterobacter spp. Bacillus subtilis ATCC 6633 Staphylococcus aureus ATCC 6538 ２）１．５ｍｌ容の蓋付き遠心分離用チューブに、以下
に示すミルク試料１ｍｌを加える。 ミルク試料；市販の超高温殺菌牛乳 ３）１）の希釈液の各濃度から１０μｌを採取し、２）
のミルク試料に接種して、室温に１０分程度放置する。 ４）以下に示すキレート剤および非イオン界面活性剤含
有水溶液５００μｌを添加し、遠心分離用チューブの蓋
をする。 キレート剤および非イオン界面活性剤含水有溶液組成； ポリスチレンラテックス ０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５％ ＥＤＴＡ ０．１５Ｍ

【００５３】５）混和後、１２，０００×ｇで５分間の
遠心分離を行ない、微生物細胞ペレットと他のミルク成
分とを分離する。 ６）分離した微生物細胞ペレットから、ペレット以外の
他のミルク成分をアスピレーターで吸引除去する。 ７）遠心分離用チューブの底部に残存した微生物細胞ペ
レットに、以下に示すＡＴＰ加水分解酵素含有水溶液１
００μｌを加えて撹拌・懸濁させ、２５℃で１０分間イ
ンキュベートして、非微生物由来ＡＴＰを分解する。 ＡＴＰ加水分解酵素含有水溶液組成； アピラーゼ（ジャガイモ由来、Ｓｉｇｍａ社製Ｇｒａｄｅ ） 酵素活性（ΔｌｏｇＲＬＵ）＝５．０ 血清アルブミン（ウシ由来、ＩＮＴＥＲＧＥＮ社製） １ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ₂ ２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ０．０５ｍＭ ＮａＮ₃ ０．１％ ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ ＤＴＴ １ｍＭ ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０） ２５ｍＭ ８）反応後、以下に示すＡＴＰ加水分解酵素阻害剤含有
水溶液１００μｌを加えて撹拌・懸濁させ、アピラーゼ
を不活性化させる。 ＡＴＰ加水分解酵素阻害剤含有水溶液組成； ＥＤＴＡ ０．２ｍＭ ９）反応後、懸濁液を測定用セルに移し換え、以下に示
すＡＴＰ抽出剤１００μｌを加えて１０秒間反応させ
て、微生物細胞からＡＴＰを放出させる。 ＡＴＰ抽出剤組成； ＣＴＡＢ ０．００７５％ １０）微生物から放出されたＡＴＰを、ルシフェリン／
ホタルルシフェラーゼを含有する発光試薬（東洋インキ
製造（株）製 商品名：菌士郎）１００μｌを添加し、
添加後１０秒間の発光量の積算値を測定する。これを人
工汚染牛乳である試料Ａの相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）
とする。 １１）一方、陽性対照として１）の希釈液の各濃度か
ら、試料Ａに加えたのと同量の１０μｌ、すなわち試料
Ａに含まれる菌数と等量の菌数をルミノメーター用測定
セルに採取してＡＴＰ抽出剤１００μｌを加え、１０秒
間溶菌後、発光試薬（東洋インキ製造（株）製 商品
名：菌士郎）１００μｌを加えて１０秒間の発光量の積
算値を測定する。これを試料Ｂの相対発光量（ｌｏｇＲ
ＬＵ）とする。 １２）試料Ａおよび試料Ｂの菌数は等量である。従っ
て、１）の各濃度の希釈液１００μｌを標準寒天培地に
塗布後、３０℃・４８時間の培養で生育したコロニー数
を計数して、各希釈液の１０μｌ当たりに含まれる菌数
を算出して、これを試料Ａおよび試料Ｂの菌数（ｌｏｇ
ＣＦＵ）とする。

【００５４】各微生物について求めた菌数（ｌｏｇＣＦ
Ｕ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の関係を図１・図２
・図３・図４・図５に示す。試料Ａ（□）及び試料Ｂ
（◇）でともに、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の範
囲で相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との間に直線性があ
り、相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）より菌数（ｌｏｇＣＦ
Ｕ）の定量が可能である。また、人工汚染牛乳である試
料Ａと牛乳を含まない試料Ｂの相対発光量（ｌｏｇＲＬ
Ｕ）と菌数（ｌｏｇＣＦＵ）の間には良好な相関が認め
られ、微生物細胞及び非微生物細胞混合物を含む典型的
な試料である牛乳から、微生物細胞からのＡＴＰのみが
殆ど損なわれることなく測定され、更に菌数（ｌｏｇＣ
ＦＵ）で３から８の範囲で、相対発光量（ｌｏｇＲＬ
Ｕ）の値から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が定量できることが
示されている。

【００５５】（実施例２）以下、実施例２〜８及び比較
例１には、代表的なミルク試料汚染微生物であるStaphy
lococcus aureus ATCC 6538 を供試した結果を示す。実
施例１の８）に示されたＡＴＰ加水分解酵素阻害剤含有
水溶液において、阻害剤として用いたＥＤＴＡの代わり
にＡＤＡを１．０ｍＭ含む水溶液を用い、試料Ａを対象
として、その他の操作は実施例１と全く同様に行って、
菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）と
の関係を求めた。結果を図６に示す。図６中、○は実施
例２の結果を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したも
のである。ＡＴＰ加水分解酵素の阻害剤としてＡＤＡを
用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の範囲
で相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との間に直線性があり、
また、実施例１の試料１との間にも良好な相関が認めら
れ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８の間で、相対発光
量（ｌｏｇＲＬＵ）の値から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が定
量できることが示されている。

【００５６】（実施例３） 実施例１の８）に示されたＡＴＰ加水分解酵素阻害剤含
有水溶液において、阻害剤として用いたＥＤＴＡの代わ
りにクエン酸を５．０ｍＭ含む水溶液を用い、試料Ａを
対象として、その他の操作は実施例１と全く同様に行っ
て、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬ
Ｕ）との関係を求めた。結果を図７に示す。図７中、○
は実施例３の結果を、□は実施例１の試料Ａの結果を示
したものである。ＡＴＰ加水分解酵素の阻害剤としてク
エン酸を用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から
８の範囲で相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との間に直線性
があり、また、実施例１の試料１との間にも良好な相関
が認められ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８の間で、
相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の値から菌数（ｌｏｇＣＦ
Ｕ）が定量できることが示されている。

【００５７】（実施例４）実施例１の８）に示されたＡ
ＴＰ加水分解酵素阻害剤含有水溶液において、阻害剤と
して用いたＥＤＴＡの代わりにメタバナジン酸ナトリウ
ムを０．５ｍＭ含む水溶液を用い、試料Ａを対象とし
て、その他の操作は実施例１と全く同様に行って、菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関
係を求めた。結果を図８に示す。図８中、○は実施例４
の結果を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したもので
ある。ＡＴＰ加水分解酵素の阻害剤としてメタバナジン
酸ナトリウムを用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が
３から８の範囲で相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との間に
直線性があり、また、実施例１の試料１との間にも良好
な相関が認められ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８の
間で、相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の値から菌数（ｌｏ
ｇＣＦＵ）が定量できることが示されている。

【００５８】（実施例５）実施例１の８）に示されたＡ
ＴＰ加水分解酵素阻害剤含有水溶液において、阻害剤と
して用いたＥＤＴＡの代わりにレバミソール塩酸塩を
１．０ｍＭ含む水溶液を用い、試料Ａを対象として、そ
の他の操作は実施例１と全く同様に行って、菌数（ｌｏ
ｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係を求
めた。結果を図９に示す。図９中、○は実施例５の結果
を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したものである。
ＡＴＰ加水分解酵素の阻害剤としてレバミソール塩酸塩
を用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の範
囲で相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との間に直線性があ
り、また、実施例１の試料１との間にも良好な相関が認
められ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８の間で、相対
発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の値から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）
が定量できることが示されている。

【００５９】（実施例６）実施例１の８）に示されたＡ
ＴＰ加水分解酵素阻害剤含有水溶液において、阻害剤と
して用いたＥＤＴＡの代わりにＧ−ストロファンチンを
４．０ｍＭ含む水溶液を用い、試料Ａを対象として、そ
の他の操作は実施例１と全く同様に行って、菌数（ｌｏ
ｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係を求
めた。結果を図１０に示す。図１０中、○は実施例６の
結果を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したものであ
る。ＡＴＰ加水分解酵素の阻害剤としてＧ−ストロファ
ンチンを用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から
８の範囲で相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との間に直線性
があり、また、実施例１の試料１との間にも良好な相関
が認められ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８の間で、
相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の値から菌数（ｌｏｇＣＦ
Ｕ）が定量できることが示されている。

【００６０】（実施例７）実施例１の８）に示されたＡ
ＴＰ加水分解酵素阻害剤含有水溶液において、阻害剤と
して用いたＥＤＴＡの代わりにグルコン酸クロルヘキシ
ジンを０．１％含む水溶液を用い、試料Ａを対象とし
て、その他の操作は実施例１と全く同様に行って、菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関
係を求めた。結果を図１１に示す。図１１中、○は実施
例７の結果を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したも
のである。ＡＴＰ加水分解酵素の阻害剤としてグルコン
酸クロルヘキシジンを用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦ
Ｕ）が３から８の範囲で相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）と
の間に直線性があり、また、実施例１の試料１との間に
も良好な相関が認められ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３か
ら８の間で、相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の値から菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）が定量できることが示されている。

【００６１】（実施例８）実施例１の８）に示されたＡ
ＴＰ加水分解酵素阻害剤含有水溶液において、阻害剤と
して用いたＥＤＴＡの代わりにキモトリプシンを２．０
ｍｇ／ｍｌ含む水溶液を用い、試料Ａを対象として、そ
の他の操作は実施例１と全く同様に行って、菌数（ｌｏ
ｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係を求
めた。結果を図１２に示す。図１２中、○は実施例８の
結果を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したものであ
る。ＡＴＰ加水分解酵素の阻害剤としてキモトリプシン
を用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の範
囲で相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との間に直線性があ
り、また、実施例１の試料１との間にも良好な相関が認
められ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８の間で、相対
発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の値から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）
が定量できることが示されている。

【００６２】（比較例１）実施例１の８）に示されたＡ
ＴＰ加水分解酵素阻害剤含有水溶液の代わりに蒸留水を
用い、試料Ａを対象として、その他の操作は実施例１と
全く同様に行って、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量
（ｌｏｇＲＬＵ）との関係を求めた。結果を図１３に示
す。図１３中、○は比較例１の結果を、□は実施例１の
試料Ａの結果を示したものである。ＡＴＰ加水分解酵素
の阻害剤を用いない場合、目的とする微生物細胞から放
出されたＡＴＰは、共存するＡＴＰ加水分解酵素によっ
て分解され、特に菌数が少ない領域ではルシフェリン／
ルシフェラーゼによる生物発光で測定される相対発光量
（ｌｏｇＲＬＵ）が低下する。このため、菌数（ｌｏｇ
ＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との間に直線性
はなく、実施例の試料１との間にも良好な相関が認めら
れないため、測定法としては不適切であった。

【発明の効果】微生物細胞及び非微生物細胞混合物を含
む試料中の微生物由来ＡＴＰを選択的に測定する方法に
かかる時間を短縮し、操作性及び検出感度を大幅に改善
した。非イオン界面活性剤によって非微生物由来ＡＴＰ
を抽出し、ＡＴＰ加水分解酵素で分解後、ＡＴＰ加水分
解酵素を不活性化し、ＡＴＰ抽出剤で微生物由来ＡＴＰ
を抽出し生物発光法で定量するという一連の測定法の中
で、ＡＴＰ加水分解酵素を簡単な操作で不活性化するこ
とによって、微生物由来ＡＴＰを損なうことなく非微生
物細胞由来ＡＴＰを短時間に分解し、かつ生物発光の減
光も最小にすることができた。遠心分離操作の併用によ
り、ミルク試料中の微生物の検出感度は１０² 〜１０³
ＣＦＵ／ｍｌとなった。遠心分離を伴う従来の方法で
は、非微生物細胞由来ＡＴＰを除くため遠心分離を繰り
返す必要があったが、本発明では１回の遠心分離で良好
な結果が得られるようになり、測定時間が短縮できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】Serattia liquefacience PB 1707を微生物試料
としたときに得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光
量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係図

【図２】Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027を微生物試
料としたときに得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発
光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係図

【図３】Enterobacter spp. を微生物試料としたときに
得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲ
ＬＵ）との関係図

【図４】Bacillus subtilis ATCC 6633 を微生物試料と
したときに得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量
（ｌｏｇＲＬＵ）との関係図

【図５】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を微生物試
料としたときに得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発
光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係図

【図６】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を微生物試
料としたときに得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発
光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係図

【図７】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を微生物試
料としたときに得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発
光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係図

【図８】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を微生物試
料としたときに得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発
光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係図

【図９】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を微生物試
料としたときに得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発
光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係図

【図１０】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を微生物
試料としたときに得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対
発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係図

【図１１】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を微生物
試料としたときに得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対
発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係図

【図１２】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を微生物
試料としたときに得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対
発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係図

【図１３】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を微生物
試料としたときに得られる菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対
発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物細胞及び非微生物細胞混合物を含
   む試料中のＡＴＰ濃度を測定する方法であって、非イオ
   ン界面活性剤を混合して非微生物細胞のＡＴＰを細胞外
   へ出す工程、試料を遠心分離して上澄み液を除去し微生
   物細胞ペレットを形成する工程、微生物細胞ペレットに
   緩衝液を加えｐＨ＝６．０〜８．０とし、プロテアーゼ
   フリーの可溶性タンパク質、ＡＴＰ加水分解酵素及びＡ
   ＴＰ加水分解酵素活性化剤を加える工程、ＡＴＰ加水分
   解酵素の阻害剤を加える工程、ＡＴＰ抽出剤を添加し微
   生物細胞からＡＴＰを抽出する工程、及び微生物細胞か
   ら放出されたＡＴＰ濃度を生物発光法を用いて測定する
   工程を含むことを特徴とする微生物細胞中のＡＴＰ濃度
   の測定法。
2. 【請求項２】 非イオン界面活性剤を混合して非微生物
   細胞のＡＴＰを細胞外へ出す工程において、キレート剤
   を混合することを特徴とする請求項１記載の測定法。
3. 【請求項３】 ＡＴＰ加水分解酵素の阻害剤が、キレー
   ト剤、バナジン酸塩、レバミソール、下記一般式で示さ
   れる骨格を有するステロイドａ、グルコン酸クロルヘキ
   シジン、及びタンパク質加水分解酵素からなる群から選
   ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項１
   または請求項２記載の測定法。 【化１】