JPH10191997A

JPH10191997A - アルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要素

Info

Publication number: JPH10191997A
Application number: JP1791997A
Authority: JP
Inventors: Kentaro Nakamura; 中村　　健太郎; Kaoru Terajima; 薫寺島
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1997-01-16
Filing date: 1997-01-16
Publication date: 1998-07-28

Abstract

(57)【要約】【課題】分析精度が高く、かつ製造が容易なアルカリ
性ホスファターゼ定量用乾式分析要素を提供する。【解決手段】支持体上に、アルカリ性ホスファターゼ
の自己顕色性基質として有効なｐ−ニトロフェニルホス
フェート（ｐ−ＮＰＰ）のアミン塩もしくはアミノアル
コール塩の微粒子を分散状態で含有する乾式分析要素で
あって、そのｐ−ニトロフェニルホスフェートのアミン
塩もしくはアミノアルコール塩の微粒子が非晶質微粒子
であることを特徴とするアルカリ性ホスファターゼ（Ａ
ＬＰ）定量用乾式分析要素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アルカリ性ホスフ
ァターゼ定量用乾式分析要素に関するものであり、さら
に詳しく云えば、支持体上に、アルカリ性ホスファター
ゼの自己顕色性基質として有効なｐ−ニトロフェニルホ
スフェートのアミン塩もしくはアミノアルコール塩の微
粒子を分散状態で含有するアルカリ性ホスファターゼ定
量用の乾式分析要素に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】血清などの生物体液中のアルカリ性ホス
ファターゼ（一般に、ＡＬＰと呼ばれる）の定量は、医
療診断の際に有用な情報を提供するものであり、従来よ
り多くの研究があるが、近年では、ＡＬＰに対して自己
顕色性基質として作用するｐ−ニトロフェニルホスフェ
ート（一般に、ｐ−ＮＰＰと呼ばれる）の塩を使用する
ことが一般的となっている。また、ＡＬＰの定量には、
ｐ−ＮＰＰの塩を溶液で用いる湿式法、そして支持体上
にｐ−ＮＰＰを含有する乾燥状態の層からなる乾式分析
要素を用いる乾式法とが利用される。湿式法と乾式法と
は、それぞれ異なる利点を持つため、適宜使い分けられ
ている。

【０００３】ｐ−ＮＰＰは、従来ではナトリウム塩とし
て用いられていたが、そのナトリウム塩は乾燥状態で保
存安定性が充分でないため、特に乾式分析要素に導入し
た場合に分析精度の信頼性に問題があった。

【０００４】特開昭６０−２３７９９９号公報には、乾
式分析要素に導入するｐ−ＮＰＰのナトリウム塩の不充
分な保存安定性を、そのｐ−ＮＰＰの粉末をサンドグラ
インダー処理するなどの方法によって微粒子化した微粉
末で乾式分析要素内に導入させる方法によって解決する
方法が記載されている。一方、特公平５−２２５１８号
公報には、乾式分析要素に、上記の特開昭６０−２３７
９９９号公報に記載のｐ−ＮＰＰのナトリウム塩の微粒
子の代りに、予め再結晶したｐ−ＮＰＰのアミン塩もし
くはアミノアルコール塩を分散状態で含有させることに
よって、さらに保存安定性が向上したＡＬＰ定量用の乾
式分析要素が得られることを明らかにしている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の特公
平５−２２５１８号公報に記載されたｐ−ＮＰＰのアミ
ン塩もしくはアミノアルコール塩を分散状態で使用する
ＡＬＰ定量用の乾式分析要素に比べて保存安定性が同等
で、一方、分析精度が向上したＡＬＰ定量用の乾式分析
要素を提供することを主な課題とする。本発明はさら
に、上記の特公平５−２２５１８号公報に記載されたｐ
−ＮＰＰのアミン塩もしくはアミノアルコール塩を分散
状態で使用するＡＬＰ定量用の乾式分析要素に比べて保
存安定性が同等で、かつその製造工程が簡易化されたＡ
ＬＰ定量用の乾式分析要素を提供することを主な課題と
する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、支持体上に、
アルカリ性ホスファターゼの自己顕色性基質として有効
なｐ−ニトロフェニルホスフェートのアミン塩もしくは
アミノアルコール塩の微粒子を分散状態で含有する乾式
分析要素であって、そのｐ−ニトロフェニルホスフェー
トのアミン塩もしくはアミノアルコール塩の微粒子が非
晶質微粒子であることを特徴とするアルカリ性ホスファ
ターゼ定量用乾式分析要素にある。上記のｐ−ニトロフ
ェニルホスフェートのアミン塩もしくはアミノアルコー
ル塩の非晶質微粒子は、その９０重量％以上の微粒子の
粒子径が１〜２０μｍの範囲にあることが望ましい。

【０００７】また、本発明で用いるｐ−ニトロフェニル
ホスフェートのアミン塩もしくはアミノアルコール塩の
微粒子は、ｐ−ニトロフェニルホスフェートのアミン塩
もしくはアミノアルコール塩の溶液をスプレードライす
る方法により得られたものであることが望ましい。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明のアルカリ性ホスファター
ゼ定量用乾式分析要素は、その内部にアルカリ性ホスフ
ァターゼの自己顕色性基質として有効なｐ−ニトロフェ
ニルホスフェートのアミン塩もしくはアミノアルコール
塩を非晶質微粒子として導入したこと以外は、従来から
知られているアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析
要素の構成と基本的には同じ構成を持つ。そのような公
知のアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要素の例
としては、前記の特開昭６０−２３７９９９号公報およ
び特公平５−２２５１８号公報に記載の乾式分析要素が
ある。従って、以下の記載においては、本発明の乾式分
析要素の代表的な構成の例についてのみ、説明する。本
発明のアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要素の
代表的な構成としては、透明支持体の上に、緩衝層と展
開層とが積層された構成を挙げることができる。

【０００９】乾式分析要素の支持体の構成、そして支持
体材料は従来より知られており、本発明の分析要素にお
いても、それらの公知の構成と材料から任意に選んで、
利用することができる。支持体は、水不透過性で、かつ
光（特に可視光）透過性であることが好ましい。そのよ
うな特性を示す支持体材料としては、ポリエチレンテレ
フタレートやポリエチレンナフタレートなどのポリエス
テル、ビスフェノールＡのポリカルボネートなどのポリ
カルボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンそしてポ
リスチレンなどのポリオレフィン、セルローストリアセ
テートやセルロースアセテートプロピオネートなどのセ
ルロースエステルを代表とするポリマー材料を挙げるこ
とができる。支持体は、その厚さが通常は約５０μｍ〜
約１ｍｍで、好ましくは約８０μｍ〜約３００μｍを持
つ。支持体表面には、その上に設けられる機能層の確実
な接合を助けるために、表面活性化処理を施してもよ
い。そのような表面活性化処理の例としては、グロー放
電やコロナ放電などの物理的処理、あるいは化学薬品を
用いる化学的処理を挙げることができる。また、表面活
性化処理の代わりに、あるいは表面活性化処理に加え
て、接着性を有するゼラチンなどを塗布して、下塗層を
付設してもよい。

【００１０】緩衝層は、展開層に含まれる基質と、試験
時に展開層に点着される被検試料との間での酵素反応の
円滑な進行を助ける緩衝剤を含有する層であり、通常
は、無機塩（および／または酸や塩基）と、それを支持
するポリマー結合剤そして界面活性剤とから成る層であ
る。一般的に用いられる緩衝剤の例としては、炭酸塩、
ホウ酸塩、燐酸塩、そしてグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝塩
などを挙げることができる。他の利用可能な緩衝剤の例
は、「蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾武一、他著、
南江堂、１９８１年発行）に詳しく記載されている。緩
衝層に用いられるポリマー結合剤としては、吸水して膨
潤する特性を持つ親水性ポリマーが一般的に用いられ
る。そのような親水性ポリマーの例としては、ゼラチン
（例、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、脱イオ
ンゼラチン）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチ
ン）、アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリア
クリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドンなどを挙げることができる。また、上記の膨潤性
ポリマーは、３０℃での吸水時の膨潤率が約１．５〜２
０、好ましくは約２．５〜１５の範囲に有るものである
ことが好ましい。なお、界面活性剤は、公知の非イオン
界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤
などから適宜に選択して使用する。緩衝層は、その厚さ
（乾燥厚さ）が約１μｍ〜約１００μｍの範囲に有るこ
とが好ましく、更に約３μｍ〜約３０μｍの範囲にある
ことが特に好ましい。

【００１１】緩衝層の上には、展開層が設けられる。た
だし、緩衝層上への展開層の接合を確実にするために、
緩衝層の上に、硬化樹脂層と接着層とを配置することが
好ましい。硬化樹脂層は、ゼラチンと非イオン界面活性
剤とを含む塗布物を硬化させて硬膜層とした水透過性層
などが用いられる。接着層は、一般に接着性を有するゼ
ラチンおよび界面活性剤などから成る層であり、硬化樹
脂層の上に、塗布により設けられる。

【００１２】展開層は、上記のように、一般には緩衝層
の上に、硬化樹脂層と接着剤層とを介して設けられる。
展開層は通常、その表面に点着される液体試料を、その
試料中に含まれている被検成分を実質的に偏在させるこ
となく平面（水平）方向に、単位面積当りほぼ一定量と
なるような割合で広げる機能（液体計量作用という）を
有することが好ましい。展開層としては、ろ紙、不織
布、織物生地（例、ブロードやポプリンなどの平織生
地）、編物生地（例、トリコット、ダブルトリコット、
ミラニーズなどの編物生地）、ガラス繊維ろ紙、ブラッ
シュポリマーから形成されるメンブランフィルタ、ポリ
マーミクロビーズなどの微粒子状物からなる三次元格子
状構造物などから形成されたものが利用できる。これら
の内では、特に織物生地や編物生地から調製した展開層
が好ましい。なお、これらの展開層の材料は、予め不純
物（例えば、編物や織物の製造時に使用した油脂類）を
除去しておくことが望ましい。

【００１３】展開層には、本発明の特徴的要件である非
晶質微粒子状のアルカリ性ホスファターゼの自己顕色性
基質として有効なｐ−ニトロフェニルホスフェートのア
ミン塩もしくはアミノアルコール塩が導入される。ｐ−
ニトロフェニルホスフェートのアミン塩もしくはアミノ
アルコール塩としては、たとえば、前記の特公平５−２
２５１８号公報に記載されている各種のアミン塩あるい
はアミノアルコール塩が利用できる。たとえば、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン［＝２−アミノ−２
−ヒドロキシメチル−１，３ープロパンジオール］、ジ
シクロヘキシルアミン、メチルアミン、エチルアミン、
ジプロピルアミン、トリブチルアミン、シクロヘキシル
アミン、ジシクロヘキシルアミン、トリシクロヘキシル
アミン、モノエタノールアミン、ベンジルアミン、ジメ
チルアミン、トリチルアミン、フルフリルアミン、アニ
リン、ジエタノールアミン、そしてモルホリンなどのア
ミンあるいはアミノアルコールとの塩（水溶性塩）を用
いることができる。また、２−アミノ−２−メチルプロ
パン−１，３−ジオール、あるいは２−アミノ−２−エ
チルプロパン−１，３−ジオールなどのアミノアルコー
ルとの塩（メタノール可溶性塩）を用いることができ
る。

【００１４】本発明で用いる自己顕色性基質（ｐ−ニト
ロフェニルホスフェートのアミン塩もしくはアミノアル
コール塩）の非晶質微粒子は、公知のスプレードライヤ
ーを用いて、スプレードライを行なうことにより容易に
得ることができる。スプレードライの操作条件は、公知
の方法に従って適宜決定する。スプレードライに際して
は、特に、得られる非晶質微粒子が、その粒子の９０重
量％以上のものの粒子径が１〜２０μｍの範囲にあるよ
うに操作条件を決定することが望ましい。

【００１５】自己顕色性基質の非晶質微粒子の展開層中
への導入は、たとえば、その非晶質微粒子を溶解しない
か、あるいは殆ど溶解することのない貧溶媒中に、非晶
質微粒子を分散させた分散液を調製し、その分散液を展
開層に滲み込ませる方法（分散液の展開層表面への塗布
や展開層の分散液中への浸漬など）を利用することによ
り容易に実施することができる。そして、分散液が滲み
込んだ展開層を乾燥させることにより目的の展開層を得
ることができる。

【００１６】なお、前述のように、上記の記載では、本
発明の乾式分析要素の構成を、支持体上に緩衝層そして
自己顕色性基質非晶質微粒子（ｐ−ＮＰＰ塩非晶質微粒
子）を分散状態で含有する展開層が形成された分析要素
として説明したが、分析要素は、さまざまな構成とする
ことができる。たとえば、本発明の特徴的要件であるｐ
−ＮＰＰ塩非晶質微粒子は展開層に加えて、あるいは展
開層とは別に、任意に設けられた他の層（親水性層であ
ることが好ましい）に導入してもよい。また、分析要素
には、任意に、吸水性層、反射層、補助的な試薬層など
の各種の機能層を導入してもよいことは勿論である。本
発明の乾式分析要素は、通常、公知の方法に従って、プ
ラスチックあるいは紙などから形成されたマウントに収
容されて分析スライドとされ、その状態で使用される。

【００１７】本発明の分析要素を実際の分析操作（アル
カリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）の定量分析）に使用す
る際は、公知の方法に従って、分析要素の展開層の上
に、水性液体試料（被検液）を、約５μＬ〜約３０μ
Ｌ、好ましくは約８μＬ〜約１５μＬ点着し、次いで、
約２０℃〜約４５℃の範囲の温度でインキュベーション
して酵素反応を進行させて分析要素に発色を起こさせ、
この発色を支持体の側での光反射を利用する比色法を利
用して検出する方法が利用される。

【００１８】

【実施例】

［実施例１］（１）ｐ−ニトロフェニルホスフェート・ジシクロヘキ
シルアンモニウム塩（基質）の非晶質粒子の製造ｐ−ニトロフェニルホスフェート・ジシクロヘキシルア
ンモニウム塩１７．３ｇを１．１リットルの蒸留水に完
全に溶解させて水溶液を調製し、この水溶液を下記の条
件にて噴霧乾燥（スプレードライ）して微粉末を得た。得られた微粉末は球形の微粒子からなっており、その微
粒子の９５％以上が１〜２０μｍの粒子径分布に入って
おり、また平均粒径は６．２μｍであった（粒子径と粒
径分布の測定は、レーザー回折粒度分布測定装置を使用
した）。また、Ｘ線回折スペクトルの結果から、得られ
た微粉末は非晶質であることが確認された。

【００１９】（２）アルカリ性ホスファターゼ定量用乾
式分析要素の製造下記の方法により、支持体上に、緩衝層、硬膜層、接着
層、そして基質粒子含有展開層が設けられた本発明に従
うアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要素を製造
した。１）支持体への緩衝層の形成表面親水化処理された透明なポリエチレンテレフタレー
トシート（支持体、厚さ：１８０μｍ）の該親水化表面
上に下記の組成の緩衝層形成用塗布液を塗布、乾燥して
乾燥厚みが１８μｍの緩衝層を形成した。緩衝層形成用塗布液組成アルカリ処理脱イオンゼラチン２４ｇ水３０４ｇノニルフェノキシ・ポリグリシドール１．２ｇポリ（Ｎ−［ジメチルアミノプロピル］アクリルアミド）２０％水溶液（平均分子量：約１０万）２６．３ｇＮ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン− Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸２ミリモルＺｎ（ＣＨ₃ ＣＯＯ）₂ ・２Ｈ₂ Ｏ１ミリモルＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ２ミリモル上記の成分からなる水溶液に５Ｎ水酸化ナトリウム水溶
液を加えてｐＨを１１．８に調整した。

【００２０】２）緩衝層上への硬膜層の形成緩衝層の表面上に、下記の組成の硬膜層形成用塗布液を
乾燥厚みが２μｍとなるように塗布し、加熱乾燥して硬
膜層を形成した。硬膜層形成用塗布液ゼラチン１２ｇ水２７３ｇノニルフェノキシ・ポリグリシドール０．６ｇ１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン０．７２ｇアセトン２．０ｇ

【００２１】３）硬膜層上への接着層の形成硬膜層の表面上に、下記の組成の接着層形成用塗布液を
乾燥厚みが３μｍとなるように塗布し、乾燥し接着層を
形成した。接着層形成用塗布液ゼラチン１２ｇ水２７５ｇノニルフェノキシ・ポリグリシドール０．６ｇ

【００２２】４）接着層上への展開層の付設接着層の表面上に０．２％ノニルフェニル・ポリグリシ
ドール水溶液を塗布し、この塗布面に、別に用意した３
６ゲージ５０Ｄポリエチレンテレフタレート紡績糸製の
トリコット編物を圧着して展開層を付設した。

【００２３】５）展開層内への基質微粒子の導入（基質
粒子含有展開層の調製）前記１）で得た非晶質基質微粒子を用い、下記組成の基
質塗布液を調製した。基質塗布液組成前記１）で調製した非晶質基質微粒子３．６ｇポリビニルピロリドン（平均分子量：１０万）９６ｇイソプロピルアルコール９９０ｇ基質塗布液を、前記展開層表面上に塗布量が１７５ｍＬ
／ｍ² となるように塗布、乾燥して基質粒子含有展開層
を得た。

【００２４】［比較例１］（１）基質再結晶粒子の製造特公平５−２２５１８号公報に記載の方法に従って、ｐ
−ニトロフェニルホスフェート・ビス［トリス（ヒドロ
キシメチル）アミン］塩を再結晶した。ｐ−ニトロフェ
ニルホスフェート・ビス［トリス（ヒドロキシメチル）
アミン］塩１３．８ｇを４０ｍＬの蒸留水に完全に溶解
させ、水溶液とする。この水溶液にアセトン３００ｍＬ
を良く撹拌しながら加え、約５分経過後、沈殿物を吸引
ろ過により集め、エタノールで数回洗浄する。そして、
更にアセトンで洗浄した後、吸引乾燥して、基質微粒子
を得る。得られた微粉末は針状結晶の微粒子からなって
おり、その微粒子の９５％以上が１〜１００μｍの粒子
径分布に入っており、また平均粒径は３４．３μｍであ
った。

【００２５】（２）アルカリ性ホスファターゼ定量用乾
式分析要素の製造下記の方法により、支持体上に、緩衝層、硬膜層、接着
層、そして基質粒子含有展開層が設けられた比較用のア
ルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要素を製造し
た。１）実施例１に記載の方法により、支持体上に、緩衝
層、硬膜層、接着層、そして展開層が設けられた積層体
を得た。

【００２６】２）展開層内への基質微粒子の導入（基質
粒子含有展開層の調製）前記１）で得た針状結晶基質微粒子を用い、下記組成の
基質塗布液を調製した。基質塗布液組成前記１）で調製した針状結晶基質微粒子１３．８ｇポリビニルピロリドン（平均分子量：１０万）１００ｇエタノール４００ｇアセトン５００ｇイソプロピルアルコール９９０ｇ基質塗布液を、前記展開層表面上に塗布量が１７５ｍＬ
／ｍ² となるように塗布、乾燥して基質粒子含有展開層
を得た。

【００２７】［アルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分
析要素の性能評価］（１）評価方法実施例１と比較例１において製造したアルカリ性ホスフ
ァターゼ定量用乾式分析要素をプラスチックマウントに
収容して分析スライド（ＡＬＰ分析用スライド）の形態
とし、この分析スライドの展開層表面に、ＩＦＣＣ法に
準拠してＡＬＰ活性値が、それぞれ１４０Ｕ／Ｌ、５２
２Ｕ／Ｌ、１２４９Ｕ／Ｌ、２６９６Ｕ／Ｌと検定され
た管理血清を、それぞれ１０μＬ採って点着し、インキ
ュベーションを行なうことにより生成した発色を比色法
により測定した。そして、各管理血清について１０回の
測定を行ない、変動係数ＣＶを測定した。

【００２８】（２）評価結果実施例１の分析要素からの分析スライドと比較例１の分
析要素からの分析スライドについて測定された変動係数
ＣＶを下記の第１表に示す。

【００２９】

【表１】第１表 ──────────────────────────────────── 管理血清実施例１比較例１ ──────────────────────────────────── １４０Ｕ／Ｌ１．９３％２．７０％５２２Ｕ／Ｌ１．３５％２．４９％１２４９Ｕ／Ｌ２．０９％２．８８％２６９６Ｕ／Ｌ２．１３％３．５２％ ────────────────────────────────────

【００３０】第１表の結果から、本発明の分析要素が、
変動係数（ＣＶ）が小さいことから、本発明のアルカリ
性ホスファターゼ定量用乾式分析要素を用いてアルカリ
性ホスファターゼの定量分析を行った場合、分析値の再
現性が良く、高い分析精度の分析結果が得られることが
分る。

【００３１】

【発明の効果】本発明のアルカリ性ホスファターゼ（Ａ
ＬＰ）定量用乾式分析要素を用いてアルカリ性ホスファ
ターゼの定量分析を行った場合、分析値の再現性が良
く、高い分析精度の分析結果が得られる。さらに、本発
明のアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要素に用
いる基質であるｐ−ニトロフェニルホスフェートのアミ
ン塩もしくはアミノアルコール塩の非晶質微粒子は、ｐ
−ニトロフェニルホスフェートのアミン塩もしくはアミ
ノアルコール塩の溶液をスプレードライする方法を利用
することにより容易に製造することができるため、本発
明の乾式分析要素はその製造が容易であると云う利点が
ある。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】支持体上に、アルカリ性ホスファターゼ
の自己顕色性基質として有効なｐ−ニトロフェニルホス
フェートのアミン塩もしくはアミノアルコール塩の微粒
子を分散状態で含有する乾式分析要素であって、そのｐ
−ニトロフェニルホスフェートのアミン塩もしくはアミ
ノアルコール塩の微粒子が非晶質微粒子であることを特
徴とするアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要
素。
【請求項２】ｐ−ニトロフェニルホスフェートのアミ
ン塩もしくはアミノアルコール塩の非晶質微粒子の９０
重量％以上の粒子径が１〜２０μｍの範囲にある請求項
１に記載のアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要
素。
【請求項３】ｐ−ニトロフェニルホスフェートのアミ
ン塩もしくはアミノアルコール塩の非晶質微粒子が、ｐ
−ニトロフェニルホスフェートのアミン塩もしくはアミ
ノアルコール塩の溶液をスプレードライすることによっ
て得られたものである請求項１もしくは２に記載のアル
カリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要素。