JPH0230466B2 - - Google Patents
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- JPH0230466B2 JPH0230466B2 JP56028158A JP2815881A JPH0230466B2 JP H0230466 B2 JPH0230466 B2 JP H0230466B2 JP 56028158 A JP56028158 A JP 56028158A JP 2815881 A JP2815881 A JP 2815881A JP H0230466 B2 JPH0230466 B2 JP H0230466B2
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Description
本発明は過酸化水素検出呈色指示薬組成物を含
む乾式の定量分析フイルムに関し、さらに詳しく
はカチオン性染料形成性過酸化水素検出呈色指示
薬組成物およびアニオン性ポリマーを含む乾式の
定量分析フイルムに関する。また本発明は過酸化
水素検出呈色指示薬組成物を用いる比色定量分析
方法に関し、詳しくはカチオン性染料形成性過酸
化水素検出呈色指示薬組成物とアニオン性ポリマ
ーを併用する比色定量分析方法に関する。 ペルオキシダーゼが触媒しあるいは関与する過
酸化水素を比色法により定量するための乾式の定
量分析フイルム、特に多層構成の定量分析フイル
ムは種々提案されており、実用されているものも
ある。それらのうちには体液中のグルコース、尿
酸、コレステロール、コリンエステラーゼ、クレ
アチン、クレアチニンを乾式に測定するために、
その酸化酵素を作用させて生成した過酸化水素
を、または酵素反応の過程で生成した反応物に酸
化酵素を作用させて生成した過酸化水素を呈色指
示薬と反応させて発色させ、その発色を測定して
比色法により過酸化水素を定量することにより目
的物を定量する方法に用いられる定量分析フイル
ムがある。ことに臨床検査の分野において検査ス
ピードを高め、煩雑な操作を排除し、コストを低
下させるために乾式の定量分析フイルムへの要望
が強く、従来から単層や二層の検査紙タイプの定
量分析フイルムや分析精度が高い多層の定量分析
フイルムが導入され、顕著な発展をとげてきた。 とくに特開昭49−53888においてはじめて開示
された多層一体型定量分析フイルムは従来の単層
や二層の検査紙タイプの定量分析フイルムに比べ
て著しく分析精度が向上しており、この多層一体
型定量分析フイルムにおいてもさらに分析精度の
向上と被測定物質に応じて検出感度の高い過酸化
水素検出指示薬の導入がなされており、その例と
して特開昭51−40191、特開昭53−131089、特開
昭54−29700、特開昭55−124499各明細書に開示
されている過酸化水素検出指示薬や多層分析フイ
ルムの層構成がある。 これらの乾式の定量分析フイルムの過酸化水素
検出指示薬は従来の湿式での定量分析に用いる過
酸化水素検出指示薬に基づいていて、その本質は
同じである。特に臨床検査の分野では、各種の生
体成分を特異的な化学反応で特に特異性の高い酵
素反応を利用して、共通な中間体に経由させ定量
している。この共通の中間体として過酸化水素が
古くから数多くの測定方法において利用されてお
り、また過酸化水素を基質とするヒドロペルオキ
シダーゼ及び関連試薬との組合せで、安価で精度
の高い比色法が数多く開発されている。 ヒドロペルオキシダーゼとしてはカタラーゼ、
ペルオキシダーゼ（POD）が数多く使用され、
特にペルオキシダーゼのペルオキシ反応を利用し
た過酸化水素検出指示薬との併用例は数多くあ
る。過酸化水素検出指示薬としては、(a)還元型色
原体(b)水素供与体（現像薬）とカプラーの組合せ
の２種類に分類される。前者はKeston.A.S.等に
より始められ（Keston、A.S.「Specific
Colorimetric Enzymatics Analytical Reagents
for Glucose」Abstracts of Papers129th
Meeting Am.Chem.Soc.P.31C、April（1956））、
後者はP.Trinder（Ann.Cli.Biochem.、６、24
（1969）およびJ.Clin.Pathol.、22、246（1969））
により開始された。その改良方法として、特公昭
47−33798、特公昭54−16235、特公昭51−37555、
特公昭53−44834、特公昭54−12360、特公昭55−
24789、特公昭54−3394、特開昭52−86392、特開
昭53−26188、特開昭49−50991、特開昭50−
11892、特開昭53−40585、特開昭55−110897、特
開昭54−25892、特開昭55−20471、特開昭55−
101861、特公昭55−2960等ではこれらの還元型色
原体や水素供与体、カプラーの改良が数多く開示
されている。 従来、多層分析フイルムにおいて、過酸化水素
検出呈色指示薬から染料を生成させ、その染料を
固定する方法としてはインスタントカラー写真法
で数多く実施されている高分子第四級アンモニウ
ム塩を用いる酸性染料の媒染法を原理にした生成
染料の固定法がそのまま、あるいは適当に改変し
て用いられている。特開昭51−40191ではカプラ
ーとして１−ナフトール−２−スルホン酸を用い
検出層には媒染剤として第四級アンモニウム塩
（例、ポリビニルピリジン、第四級アンモニウム
塩ポリマー）を用いており、特開昭54−29700に
おいては試薬層と多孔質輻射線ブロツキング層の
間にマイグレーシヨン防止層として同様の媒染剤
を用いる例が開示されている。特開昭53−131089
においては予め形成した検出可能部分を有する非
拡散性物質をアナライトの作用で拡散した拡散性
検出可能部分の受容層に同様な媒染剤を使用する
例が開示されている。 しかし、ポリビニルピリジンや第四級アンモニ
ウム塩を含有する高分子で代表される酸性染料の
媒染剤は二つの大きな欠点を有する。 第一の欠点は特開昭54−29700に記載されてい
る如く、試薬層中に媒染ポリマーを共存させると
著しい検出感度の低下を見る点である。すなわち
塩基性カチオン化合物は酵素類に著しい阻害効果
を及ぼす。 第二の欠点は、媒染効果が発現される位置が生
成染料に結合しているスルホン酸基又はカルボン
酸基又はフエノール性水酸基又はその塩である点
に起因して、生成染料と同様にその染料前駆体も
媒染ポリマーに結合固定されうるので検出感度が
低下する点である。これらの置換基は直接的に染
料の発色共役系と無関係でありまた染料生成反応
で新たに形成される事はあり得ずそれ故その染料
前駆体には必ず媒染効果を発現する置換基が導入
されているからである。反応性染料前駆体がポリ
マーに固定されると、高分子鎖の立体障害により
反応速度、反応率が著しく減少する事は通常高分
子反応における高分子効果として良く知られてお
り、全く同様にして検出感度の低下が生ずる。 本発明の目的は、過酸化水素検出多層分析材料
において生成染料の泳動を防止して精度を高めた
多層分析材料を提供することである。 本発明の他の目的は検出感度を高める為に吸光
度の高いカチオン染料を形成する酸化カツプリン
グ反応試薬組成物を提供することである。 本発明の他の目的はアニオンポリマーから成る
新規な固定剤を提供することである。 本発明の他の目的は酵素反応を実質的に阻害し
ないアニオンポリマーから成る染料固定剤を提供
することである。 本発明の他の目的は過酸化水素検出呈色指示薬
組成物中に含まれる染料色駆体とは全く反応せず
生成された染料とのみ反応して固定化能を有する
特異性を有するアニオンポリマーから成る染料固
定剤を提供することである。 本発明の他の目的は過酸化水素またはその前駆
物質を定量するためにカチオン性染料を形成しう
る過酸化水素検出呈色指示薬組成物とアニオン性
ポリマーを併用して形成されるカチオン性染料を
アニオン性ポリマーに結合させることにより固定
して効率よく高感度に比色定量分析する方法を提
供することである。 本発明は、 (1) 過酸化水素の存在下に化学的相互作用により
カチオン性染料を形成しうる成分を含有するカ
チオン性染料形成性過酸化水素検出呈色指示薬
組成物およびアニオン性ポリマーを含む試薬層
を有する定量分析フイルムであり、その主な実
施態様は、 (2) 前記試薬層が呈色反応層とアニオン性ポリマ
ーを含有する染料固定層から成る(1)に記載の定
量分析フイルム。 (3) 前記試薬層が単一の層である(1)に記載の定量
分析フイルム。 (4) 前記呈色指示薬組成物がペルオキシダーゼ作
用をもつ物質、水素供与体、およびＮ，Ｎ−ジ
置換アニリンを主成分として含有する呈色指示
薬組成物である(1)ないし(3)に記載の定量分析フ
イルム。 (5) 前記アニオン性ポリマーがカルボキシラト
基、スルホナト基、またはホスホナト基を有す
るポリマーである(1)ないし(4)に記載の定量分析
フイルム。 (6) 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換アニリンが一般式〔１〕
で表わされる化合物である(4)または(5)に記載の
定量分析フイルム。 一般式〔１〕においてR1およびR2はそれぞ
れ水素原子、アルキル基、またはアルコキシ基
を表わし、R1とR2は互いに同じでも異なつて
もよい。R3およびR4はアルキル基、アルコキ
シアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノ
アルキル基、シアノアルキル基、ハロゲノアル
キル基またはアシルアミノアルキル基を表わ
し、R3とR4は互いに同じでも異なつてもよい。 (7) 前記水素供与体が一般式〔２〕で表わされる
化合物、４−置換アンチピリン、２−ヒドラゾ
ノベンゾチアゾリン類およびｐ−ハロゲノフエ
ノールからなる群から選ばれた一化合物である
(4)ないし(6)に記載の定量分析フイルム。 一般式〔２〕においてR5およびR6はアルキ
ル基、アルコキシアルキル基、ヒドロキシアル
キル基、シアノアルキル基、ハロゲノアルキル
基またはアシルアミノアルキル基を表わし、
R5とR6は同じでも異なつてもよい。R7は水素
原子、アルキル基、アルコキシ基またはハロゲ
ン原子を表わす。 (8) 前記水素供与体が４−アミノアンチピリンで
ある(4)ないし(6)に記載の定量分析フイルム。 (9) 前記試薬層が支持体と多孔性層の間に設けら
れており、前記多孔性層と前記試薬層が流体接
触した一体に接着されている(1)ないし(7)に記載
の定量分析フイルム。 である。また本発明は、 (10) 被検試料に含まれる過酸化水素または過酸化
水素を生成しうる前駆体を比色定量分析する方
法において、過酸化水素の存在下に化学的相互
作用によりカチオン性染料を形成しうる成分を
含有するカチオン性染料形成性過酸化水素検出
呈色指示薬組成物に被検試料を接触させ、形成
されたカチオン性染料をアニオン性ポリマーに
結合させる工程を含むことを特徴とする比色定
量分析方法であり、その主な実施態様は、 (11) 前記アニオン性ポリマーをあらかじめ前記過
酸化水素検出呈色指示薬組成物と共存させる(10)
に記載の比色定量分析方法。 (12) 前記アニオン性ポリマーを前記カチオン性染
料が形成された後に前記カチオン性染料に接触
させ結合させる(10)に記載の比色定量分析方法。 である。 本発明の定量分析フイルムに用いられる過酸化
水素の存在下に化学的相互作用によりカチオン性
染料を形成しうる成分を含有するカチオン性染料
形成性過酸化水素検出呈色指示薬組成物（以下、
過酸化水素検出呈色指示薬という。）はペルオキ
シダーゼ作用をもつ物質、水素供与体およびＮ，
Ｎ−ジ置換アニリンを主成分とする指示薬組成物
である。 ペルオキシダーゼ作用をもつ物質としては特開
昭50−137192に開示されている諸種の生物から抽
出されたペルオキシダーゼ、合成ペルオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ様作用を示す生物から抽出
された他の化学物質をあげることができ、これら
のうちではペルオキシダーゼが好ましい。 過酸化水素検出呈色指示薬に含まれる水素供与
体としては特開昭49−50991に開示されている４
−置換アンチピリン（４−置換−２，３−ジメチ
ル−１−フエニル−３−ピラゾリン−５−オン）
およびその他の公知の４−置換アンチピリン、特
開昭50−137192に開示されているＮ，Ｎ−ジ置換
オルトーまたはパラーフエニレンジアミンおよび
その他の公知のＮ，Ｎ−ジ置換オルトーまたはパ
ラ−フエニレンジアミン、特開昭55−20471に開
示されている２−ヒドラゾノベンゾチアゾリンお
よびその他の公知の２−ヒドラゾノベンゾチアゾ
リン、特開昭55−148100に開示されているｐ−ハ
ロゲノフエノールおよびその他のｐ−ハロゲノフ
エノール、および前述の一般式〔２〕で表わされ
るＮ，Ｎ−ジ置換−ｐ−フエニレンジアミンのう
ちから選択して用いることができる。 ４−置換アンチピリンの具体例としては４−ア
ミノアンチピリン（CAS Registry Number〔83
−07−８〕）、４−（ジメチルアミノ）アンチピリ
ン（ピラミドン〔58−15−１〕）、４−（エチルア
ミノ）アンチピリン〔15166−10−６〕、４−（メ
チルアミノ）アンチピリン（ノラミドピリン、
〔519−98−２〕）、４−（ナトリウムスルホナトメ
チルアミノ）アンチピリン（スルフアミピリン、
〔129−89−５〕）、４−〔（ナトリウムスルホナトメ
チル）（イソブチル）アミノ〕アンチピリン（ジ
ブピロン、〔1046−17−９〕）、４−〔（ナトリウム
スルホナトメチル）（メチル）アミノ〕アンチピ
リン（メタムピロン、〔5907−38−０〕）、４−イ
ソプロピルアンチピリン（プロピフエナゾン、
〔479−92−５〕）がある。その他に構造類似の化
合物として４−アミノ−２，３−ジメチル−１−
ｐ−トリル−３−ピラゾリン−５−オン〔56430
−10−５〕、４−アミノ−１，３−ジフエニル−
２−メチル−３−ピラゾリン−５−オン〔52744
−73−７〕、がある。その他に２−（ジメチルアミ
ノ）−５−フエニル−２−オキサゾリン−４−オ
ン（トザリノン、〔1046−17−９〕）も用いること
ができる。 一般式〔２〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換−ｐ
−フエニレンジアミンにおける置換基R5および
R6がアルキル基の場合、アルキル基としては炭
素原子数１乃至５の直鎖状または分岐状の低級ア
ルキル基で、その具体例としてはメチル基、エチ
ル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、イソ
プロピル基、イソブチル基、イソアミル基、ｔ−
ブチル基、ネオペンチル基がある。アルコキシア
ルキル基の場合、アルコキシアルキル基としては
炭素原子数１乃至３の低級アルコキシ基が置換し
た炭素原子数１乃至３の低級アルキル基で、その
具体例としてはメトキシメチル基、２−メトキシ
エチル基、１−メトキシエチル基、３−メトキシ
プロピル基、２−メトキシプロピル基、エトキシ
プロピル基、２−エトキシエチル基がある。ヒド
ロキシアルキル基の場合、ヒドロキシアルキル基
としてはヒドロキシル基が置換した炭素原子数１
乃至５の直鎖状または分岐状の低級アルキル基
で、その具体例としてはヒドロキシメチル基、２
−ヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシエチル
基、３−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシ
プロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒド
ロキシペンチル基がある。シアノアルキル基の場
合、シアノアルキル基としてはシアノ基が置換し
た炭素原子数１乃至５の直鎖状または分岐状の低
級アルキル基で、その具体例としてはシアノメチ
ル基、２−シアノエチル基、１−シアノエチル
基、３−シアノプロピル基、２−シアノプロピル
基、５−シアノペンチル基がある。ハロゲノアル
キル基の場合、ハロゲノアルキル基としてはハロ
ゲン原子として弗素、塩素、臭素または沃素原子
が置換した炭素原子数１乃至５の直鎖状または分
岐状の低級アルキル基で、その具体例としてはフ
ルオロメチル基、クロロメチル基、ブロモメチル
基、２−フルオロエチル基、１−クロロメチル
基、２−クロロメチル基、２−ブロモエチル基、
３−クロロプロピル基がある。アシルアミノアル
キル基の場合、アシルアミノアルキル基としては
アシルアミノ基としてアセトアミド基、プロピオ
ンアミド基、ベンズアミド基、トルアミド基、メ
タンスルホンアミド基、エタンスルホンアミド
基、プロパンスルホンアミド基、ベンゼンスルホ
ンアミド基、トルエンスルホンアミド基が置換し
た炭素原子数１乃至５の直鎖状または分岐状の低
級アルキル基で、その具体例としてはアセトアミ
ドメチル基、プロピオンアミドメチル基、ベンズ
アミドメチル基、ｐ−トルアミドメチル基、メタ
ンスルホンアミドメチル基、エタンスルホンアミ
ドメチル基、ベンゼンスルホンアミドメチル基、
ｐ−トルエンスルホンアミドメチル基、２−アセ
トアミドエチル基、２−プロピオンアミドエチル
基、２−ベンズアミドエチル基、２−ｐ−トルア
ミドエチル基、２−メタンスルホンアミドエチル
基、２−（エタンスルホンアミド）エチル基、２
−（ベンゼンスルホンアミド）エチル基、２−（ｐ
−トルエンスルホンアミド）エチル基、３−アセ
トアミドプロピル基、３−ベンズアミドプロピル
基がある。 R5またはR6として好ましい置換基はアルキル
基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル
基、アシルアミノアルキル基、ハロゲノアルキル
基、シアノアルキル基であり、好ましい置換基の
具体例としてメチル基、エチル基、メトキシメチ
ル基、２−メトキシエチル基、エトキシメチル
基、２−エトキシエチル基；ヒドロキシメチル
基、２−ヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシエ
チル基、２−ヒドロキシプロピル基；アセトアミ
ドメチル基、２−アセトアミドエチル基、メタン
スルホンアミドエチルメチル基、２−メタンスル
ホンアミドエチル基；クロロメチル基、２−クロ
ロエチル基；シアノメチル基、２−シアノエチル
基がある。 一般式〔２〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換−ｐ
−フエニレンジアミンにおける置換基R7がアル
キル基の場合、その具体例は前述のR5またはR6
がアルキル基の場合の具体例と同じである。R7
がアルコキシ基の場合、アルコキシ基としては炭
素原子数１乃至５の直鎖状または分岐状の低級ア
ルキル基を有するアルコキシ基で、その具体例と
してはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、
イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ
基、ペンチルオキシ基、イソアミルオキシ基があ
る。R7がハロゲン原子の場合、その具体例とし
て弗素原子、塩素原子、臭素原子、沃素原子があ
る。 R7として好ましい置換基は水素原子、アルキ
ル基、ハロゲン原子であり、アルキル基の具体例
としてメチル基、エチル基、プロピル基、ハロゲ
ン原子の具体例として弗素原子、塩素原子があ
る。 一般式〔２〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換−ｐ
−フエニレンジアミンの具体例としては次の化合
物がある。 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｐ
−フエニレンジアミン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−エトキシエチル）−ｐ−
フエニレンジアミン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−メタンスルホンアミノ
エチル）−３−メチル−４−アミノアニリン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−３
−メチル−４−アミノアニリン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−シアノエチル）−ｐ−フ
エニレンジアミン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−クロロエチル）−ｐ−フ
エニレンジアミン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−エトキシエチル）−ｐ−
フエニレンジアミン Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−クロロ−４−アミノア
ニリン Ｎ，Ｎ−ビス（β−シアノエチル）−ｐ−フエ
ニレンジアミン 水素供与体としては４−置換アンチピリンおよ
び一般式〔２〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換−ｐ
−フエニレンジアミンが好ましく、そのうちで特
に４−アミノアンチピリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−
ｐ−フエニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ
−フエニレンジアミンが好ましい。 一般式〔１〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換アニ
リンにおける置換基R1およびR2がアルキル基ま
たはアルコキシ基の場合、その具体例は前述の一
般式〔２〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換−ｐ−フ
エニレンジアミンにおける置換基R5またはR6が、
それぞれアルキル基またはアルコキシ基の場合の
具体例に同じである。 R3およびR4がアルキル基、アルコキシアルキ
ル基、ヒドロキシアルキル基、シアノアルキル
基、ハロゲノアルキル基またはアシルアミノアル
キル基の場合、その具体例は前述のR5またはR6
が、それぞれアルキル基、アルコキシアルキル
基、ヒドロキシアルキル基、シアノアルキル基、
ハロゲノアルキル基またはアシルアミノアルキル
基の場合の具体例に同じである。R3およびR4が
アミノアルキル基の場合、アミノアルキル基とし
てはアミノ基が置換した炭素原子数１乃至５の直
鎖状または分岐状の低級アルキル基で、その具体
例としてはアミノメチル基、２−アミノエチル
基、１−アミノエチル基、３−アミノプロピル
基、２−アミノプロピル基がある。 R1またはR2として好ましい置換基は水素原子、
アルキル基、アルコキシ基であり、アルキル基の
具体例としてメチル基、エチル基、プロピル基、
アルコキシ基としてメトキシ基、エトキシ基があ
る。 R3およびR4として好ましい置換基はアルキル
基、アルコキシアルキル基、ヒドロキシアルキル
基、シアノアルキル基、ハロゲノアルキル基で、
その具体例としてはメチル基、エチル基、プロピ
ル基；メトキシメチル基、２−メトキシエチル
基、３−メトキシプロピル基、エトキシメチル
基、２−エトキシエチル基；ヒドロキシメチル
基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエ
チル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロ
キシプロピル基；シアノメチル基、２−シアノエ
チル基；クロロメチル基、１−クロロエチル基、
２−クロロエチル基、２−クロロプロピル基、３
−クロロプロピル基、ブロモメチル基、２−ブロ
モメチル基、フルオロメチル基、２−フルオロエ
チル基がある。 一般式〔１〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換アニ
リンの具体例として次の化合物がある。 Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシメチルアニリン Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ア
ニリン Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ア
ニリン Ｎ−メチル−Ｎ−（２−メトキシエチル）アニ
リン Ｎ−エチル−Ｎ−（２−メトキシエチル）アニ
リン Ｎ−エチル−Ｎ−（２−エトキシエチル）アニ
リン Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシメチル）−ｍ−トル
イジン Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−ｍ−
トルイジン Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシプロピル）−ｍ
−トルイジン Ｎ，Ｎ−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−ｍ
−トルイジン Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシメチル−ｍ−トル
イジン Ｎ−エチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ｍ−
トルイジン Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシメチル−ｍ−トル
イジン Ｎ−メチル−Ｎ−メトキシメチル−ｍ−トルイ
ジン Ｎ−エチル−Ｎ−メトキシメチル−ｍ−トルイ
ジン Ｎ−エチル−Ｎ−２−メトキシエチル−ｍ−ト
ルイジン Ｎ−シアノメチル−Ｎ−ヒドロキシメチル−ｍ
−トルイジン Ｎ−メチル−Ｎ−２−クロロエチル−ｍ−トル
イジン Ｎ−エチル−Ｎ−２−クロロエチル−ｍ−トル
イジン Ｎ−２−シアノエチル−Ｎ−２−ヒドロキシエ
チル−ｍ−トルイジン Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシメチル−ｍ−アニ
シジン Ｎ−エチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ｍ−
アニシジン これらの化合物のうちで好ましいＮ，Ｎ−ジ置
換アニリンは次の化合物である。 Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−ｍ−
トルイジン Ｎ−エチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ｍ−
トルイジン Ｎ−２−シアノエチル−Ｎ−２−ヒドロキシエ
チル−ｍ−トルイジン Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン 本発明に用いられる過酸化水素検出呈色指示薬
には過酸化水素の存在下に化学的相互作用により
形成されるカチオン性染料の吸収波長領域の光
（近紫外線、可視光または近赤外線）を吸収して
比色分析を妨害するカチオン性成分化合物を含有
しないことが好ましい。 本発明に用いられるアニオン性ポリマーはポリ
マーの高分子鎖そのもの、または高分子鎖に結合
した原子または原子団の中にアニオン原子または
アニオン原子団を含むポリマーである。アニオン
性ポリマーとしては通常のアニオン性ポリマーの
他に酸型の陽イオン交換樹脂をも用いることがで
き、好ましくは通常のアニオン性ポリマーまたは
陽イオン交換樹脂は水溶性または水により膨潤し
うる性質をもつ（水膨潤性）ポリマーである。ア
ニオン性ポリマーは単独で、または２種以上を組
合せて用いることができる。アニオン性ポリマー
は皮膜形成能を有するものも有しないものもいず
れも用いることができる。皮膜形成能を有しない
アニオン性ポリマーは皮膜形成能を有するバイン
ダーポリマーとともに用いることが好ましい。 アニオン性ポリマーの具体例としてはその高分
子鎖の構成繰返単位（Constitutional Repeating
Unitに対する術語で、以下CRUと略記する。）の
全部またはCRUのうちの特定の割合のものが
（規則的または不規則的な配列いずれでもよい）
アニオン性原子団としてカルボキシラト基（−
COO）、スルホナト基（−SO3）またはホス
ホナト基（−PO32）、またはカウタカチオンを
有する前記アニオン性原子団が結合した構造であ
るようなポリマーまたはコポリマーがある。ここ
でカウンタカチオンとしてはアルカリ金属イオン
（例、Li、Na、K、Cs）、アルカリ土類
金属イオン（例、Mg2、Ca2、Sr2、
Ba2）、アンモニウムイオン（NH4）がある。 前記CRUを含むアニオン性ポリマーの具体例
としては次のものがあげられる。 メチルビニルエーテル−無水マレイン酸共重合
体のアルカリ加水分解物（CRUとしてジリチウ
ム、ジナトリウムまたはジカリウム１，２−ジカ
ルボキシラトエチレンを含むコポリマー） ポリアクリル酸アルカリ金属塩またはアルカリ
土類金属塩 ポリ−Ｎ−（β−スルホ−α，α−ジメチルエ
チル）アクリルアミドのアルカリ金属塩またはア
ルカリ土類金属塩 ポリスチレン−ｐ−スルホン酸のアルカリ金属
塩またはアルカリ土類金属塩 スチレン−ｐ−スルホン酸と親水性ビニルモノ
マーとの共重合体のアルカリ金属塩またはアルカ
リ土類金属塩（親水性ビニルモノマーの例：アク
リル酸、アクリル酸アルキルエステル（例：メチ
ルアクリレート）、アクリル酸ヒドロキシアルキ
ルエステル（例：β−ヒドロキシエチルアクリレ
ート）、アクリルアミド（例：アクリルアミド、
Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルア
クリルアミド、Ｎ−（β−スルホナト−α，α−
ジメチルエチル）アクリルアミド、Ｎ−エチル−
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、アクリルモル
ホリド
む乾式の定量分析フイルムに関し、さらに詳しく
はカチオン性染料形成性過酸化水素検出呈色指示
薬組成物およびアニオン性ポリマーを含む乾式の
定量分析フイルムに関する。また本発明は過酸化
水素検出呈色指示薬組成物を用いる比色定量分析
方法に関し、詳しくはカチオン性染料形成性過酸
化水素検出呈色指示薬組成物とアニオン性ポリマ
ーを併用する比色定量分析方法に関する。 ペルオキシダーゼが触媒しあるいは関与する過
酸化水素を比色法により定量するための乾式の定
量分析フイルム、特に多層構成の定量分析フイル
ムは種々提案されており、実用されているものも
ある。それらのうちには体液中のグルコース、尿
酸、コレステロール、コリンエステラーゼ、クレ
アチン、クレアチニンを乾式に測定するために、
その酸化酵素を作用させて生成した過酸化水素
を、または酵素反応の過程で生成した反応物に酸
化酵素を作用させて生成した過酸化水素を呈色指
示薬と反応させて発色させ、その発色を測定して
比色法により過酸化水素を定量することにより目
的物を定量する方法に用いられる定量分析フイル
ムがある。ことに臨床検査の分野において検査ス
ピードを高め、煩雑な操作を排除し、コストを低
下させるために乾式の定量分析フイルムへの要望
が強く、従来から単層や二層の検査紙タイプの定
量分析フイルムや分析精度が高い多層の定量分析
フイルムが導入され、顕著な発展をとげてきた。 とくに特開昭49−53888においてはじめて開示
された多層一体型定量分析フイルムは従来の単層
や二層の検査紙タイプの定量分析フイルムに比べ
て著しく分析精度が向上しており、この多層一体
型定量分析フイルムにおいてもさらに分析精度の
向上と被測定物質に応じて検出感度の高い過酸化
水素検出指示薬の導入がなされており、その例と
して特開昭51−40191、特開昭53−131089、特開
昭54−29700、特開昭55−124499各明細書に開示
されている過酸化水素検出指示薬や多層分析フイ
ルムの層構成がある。 これらの乾式の定量分析フイルムの過酸化水素
検出指示薬は従来の湿式での定量分析に用いる過
酸化水素検出指示薬に基づいていて、その本質は
同じである。特に臨床検査の分野では、各種の生
体成分を特異的な化学反応で特に特異性の高い酵
素反応を利用して、共通な中間体に経由させ定量
している。この共通の中間体として過酸化水素が
古くから数多くの測定方法において利用されてお
り、また過酸化水素を基質とするヒドロペルオキ
シダーゼ及び関連試薬との組合せで、安価で精度
の高い比色法が数多く開発されている。 ヒドロペルオキシダーゼとしてはカタラーゼ、
ペルオキシダーゼ（POD）が数多く使用され、
特にペルオキシダーゼのペルオキシ反応を利用し
た過酸化水素検出指示薬との併用例は数多くあ
る。過酸化水素検出指示薬としては、(a)還元型色
原体(b)水素供与体（現像薬）とカプラーの組合せ
の２種類に分類される。前者はKeston.A.S.等に
より始められ（Keston、A.S.「Specific
Colorimetric Enzymatics Analytical Reagents
for Glucose」Abstracts of Papers129th
Meeting Am.Chem.Soc.P.31C、April（1956））、
後者はP.Trinder（Ann.Cli.Biochem.、６、24
（1969）およびJ.Clin.Pathol.、22、246（1969））
により開始された。その改良方法として、特公昭
47−33798、特公昭54−16235、特公昭51−37555、
特公昭53−44834、特公昭54−12360、特公昭55−
24789、特公昭54−3394、特開昭52−86392、特開
昭53−26188、特開昭49−50991、特開昭50−
11892、特開昭53−40585、特開昭55−110897、特
開昭54−25892、特開昭55−20471、特開昭55−
101861、特公昭55−2960等ではこれらの還元型色
原体や水素供与体、カプラーの改良が数多く開示
されている。 従来、多層分析フイルムにおいて、過酸化水素
検出呈色指示薬から染料を生成させ、その染料を
固定する方法としてはインスタントカラー写真法
で数多く実施されている高分子第四級アンモニウ
ム塩を用いる酸性染料の媒染法を原理にした生成
染料の固定法がそのまま、あるいは適当に改変し
て用いられている。特開昭51−40191ではカプラ
ーとして１−ナフトール−２−スルホン酸を用い
検出層には媒染剤として第四級アンモニウム塩
（例、ポリビニルピリジン、第四級アンモニウム
塩ポリマー）を用いており、特開昭54−29700に
おいては試薬層と多孔質輻射線ブロツキング層の
間にマイグレーシヨン防止層として同様の媒染剤
を用いる例が開示されている。特開昭53−131089
においては予め形成した検出可能部分を有する非
拡散性物質をアナライトの作用で拡散した拡散性
検出可能部分の受容層に同様な媒染剤を使用する
例が開示されている。 しかし、ポリビニルピリジンや第四級アンモニ
ウム塩を含有する高分子で代表される酸性染料の
媒染剤は二つの大きな欠点を有する。 第一の欠点は特開昭54−29700に記載されてい
る如く、試薬層中に媒染ポリマーを共存させると
著しい検出感度の低下を見る点である。すなわち
塩基性カチオン化合物は酵素類に著しい阻害効果
を及ぼす。 第二の欠点は、媒染効果が発現される位置が生
成染料に結合しているスルホン酸基又はカルボン
酸基又はフエノール性水酸基又はその塩である点
に起因して、生成染料と同様にその染料前駆体も
媒染ポリマーに結合固定されうるので検出感度が
低下する点である。これらの置換基は直接的に染
料の発色共役系と無関係でありまた染料生成反応
で新たに形成される事はあり得ずそれ故その染料
前駆体には必ず媒染効果を発現する置換基が導入
されているからである。反応性染料前駆体がポリ
マーに固定されると、高分子鎖の立体障害により
反応速度、反応率が著しく減少する事は通常高分
子反応における高分子効果として良く知られてお
り、全く同様にして検出感度の低下が生ずる。 本発明の目的は、過酸化水素検出多層分析材料
において生成染料の泳動を防止して精度を高めた
多層分析材料を提供することである。 本発明の他の目的は検出感度を高める為に吸光
度の高いカチオン染料を形成する酸化カツプリン
グ反応試薬組成物を提供することである。 本発明の他の目的はアニオンポリマーから成る
新規な固定剤を提供することである。 本発明の他の目的は酵素反応を実質的に阻害し
ないアニオンポリマーから成る染料固定剤を提供
することである。 本発明の他の目的は過酸化水素検出呈色指示薬
組成物中に含まれる染料色駆体とは全く反応せず
生成された染料とのみ反応して固定化能を有する
特異性を有するアニオンポリマーから成る染料固
定剤を提供することである。 本発明の他の目的は過酸化水素またはその前駆
物質を定量するためにカチオン性染料を形成しう
る過酸化水素検出呈色指示薬組成物とアニオン性
ポリマーを併用して形成されるカチオン性染料を
アニオン性ポリマーに結合させることにより固定
して効率よく高感度に比色定量分析する方法を提
供することである。 本発明は、 (1) 過酸化水素の存在下に化学的相互作用により
カチオン性染料を形成しうる成分を含有するカ
チオン性染料形成性過酸化水素検出呈色指示薬
組成物およびアニオン性ポリマーを含む試薬層
を有する定量分析フイルムであり、その主な実
施態様は、 (2) 前記試薬層が呈色反応層とアニオン性ポリマ
ーを含有する染料固定層から成る(1)に記載の定
量分析フイルム。 (3) 前記試薬層が単一の層である(1)に記載の定量
分析フイルム。 (4) 前記呈色指示薬組成物がペルオキシダーゼ作
用をもつ物質、水素供与体、およびＮ，Ｎ−ジ
置換アニリンを主成分として含有する呈色指示
薬組成物である(1)ないし(3)に記載の定量分析フ
イルム。 (5) 前記アニオン性ポリマーがカルボキシラト
基、スルホナト基、またはホスホナト基を有す
るポリマーである(1)ないし(4)に記載の定量分析
フイルム。 (6) 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換アニリンが一般式〔１〕
で表わされる化合物である(4)または(5)に記載の
定量分析フイルム。 一般式〔１〕においてR1およびR2はそれぞ
れ水素原子、アルキル基、またはアルコキシ基
を表わし、R1とR2は互いに同じでも異なつて
もよい。R3およびR4はアルキル基、アルコキ
シアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノ
アルキル基、シアノアルキル基、ハロゲノアル
キル基またはアシルアミノアルキル基を表わ
し、R3とR4は互いに同じでも異なつてもよい。 (7) 前記水素供与体が一般式〔２〕で表わされる
化合物、４−置換アンチピリン、２−ヒドラゾ
ノベンゾチアゾリン類およびｐ−ハロゲノフエ
ノールからなる群から選ばれた一化合物である
(4)ないし(6)に記載の定量分析フイルム。 一般式〔２〕においてR5およびR6はアルキ
ル基、アルコキシアルキル基、ヒドロキシアル
キル基、シアノアルキル基、ハロゲノアルキル
基またはアシルアミノアルキル基を表わし、
R5とR6は同じでも異なつてもよい。R7は水素
原子、アルキル基、アルコキシ基またはハロゲ
ン原子を表わす。 (8) 前記水素供与体が４−アミノアンチピリンで
ある(4)ないし(6)に記載の定量分析フイルム。 (9) 前記試薬層が支持体と多孔性層の間に設けら
れており、前記多孔性層と前記試薬層が流体接
触した一体に接着されている(1)ないし(7)に記載
の定量分析フイルム。 である。また本発明は、 (10) 被検試料に含まれる過酸化水素または過酸化
水素を生成しうる前駆体を比色定量分析する方
法において、過酸化水素の存在下に化学的相互
作用によりカチオン性染料を形成しうる成分を
含有するカチオン性染料形成性過酸化水素検出
呈色指示薬組成物に被検試料を接触させ、形成
されたカチオン性染料をアニオン性ポリマーに
結合させる工程を含むことを特徴とする比色定
量分析方法であり、その主な実施態様は、 (11) 前記アニオン性ポリマーをあらかじめ前記過
酸化水素検出呈色指示薬組成物と共存させる(10)
に記載の比色定量分析方法。 (12) 前記アニオン性ポリマーを前記カチオン性染
料が形成された後に前記カチオン性染料に接触
させ結合させる(10)に記載の比色定量分析方法。 である。 本発明の定量分析フイルムに用いられる過酸化
水素の存在下に化学的相互作用によりカチオン性
染料を形成しうる成分を含有するカチオン性染料
形成性過酸化水素検出呈色指示薬組成物（以下、
過酸化水素検出呈色指示薬という。）はペルオキ
シダーゼ作用をもつ物質、水素供与体およびＮ，
Ｎ−ジ置換アニリンを主成分とする指示薬組成物
である。 ペルオキシダーゼ作用をもつ物質としては特開
昭50−137192に開示されている諸種の生物から抽
出されたペルオキシダーゼ、合成ペルオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ様作用を示す生物から抽出
された他の化学物質をあげることができ、これら
のうちではペルオキシダーゼが好ましい。 過酸化水素検出呈色指示薬に含まれる水素供与
体としては特開昭49−50991に開示されている４
−置換アンチピリン（４−置換−２，３−ジメチ
ル−１−フエニル−３−ピラゾリン−５−オン）
およびその他の公知の４−置換アンチピリン、特
開昭50−137192に開示されているＮ，Ｎ−ジ置換
オルトーまたはパラーフエニレンジアミンおよび
その他の公知のＮ，Ｎ−ジ置換オルトーまたはパ
ラ−フエニレンジアミン、特開昭55−20471に開
示されている２−ヒドラゾノベンゾチアゾリンお
よびその他の公知の２−ヒドラゾノベンゾチアゾ
リン、特開昭55−148100に開示されているｐ−ハ
ロゲノフエノールおよびその他のｐ−ハロゲノフ
エノール、および前述の一般式〔２〕で表わされ
るＮ，Ｎ−ジ置換−ｐ−フエニレンジアミンのう
ちから選択して用いることができる。 ４−置換アンチピリンの具体例としては４−ア
ミノアンチピリン（CAS Registry Number〔83
−07−８〕）、４−（ジメチルアミノ）アンチピリ
ン（ピラミドン〔58−15−１〕）、４−（エチルア
ミノ）アンチピリン〔15166−10−６〕、４−（メ
チルアミノ）アンチピリン（ノラミドピリン、
〔519−98−２〕）、４−（ナトリウムスルホナトメ
チルアミノ）アンチピリン（スルフアミピリン、
〔129−89−５〕）、４−〔（ナトリウムスルホナトメ
チル）（イソブチル）アミノ〕アンチピリン（ジ
ブピロン、〔1046−17−９〕）、４−〔（ナトリウム
スルホナトメチル）（メチル）アミノ〕アンチピ
リン（メタムピロン、〔5907−38−０〕）、４−イ
ソプロピルアンチピリン（プロピフエナゾン、
〔479−92−５〕）がある。その他に構造類似の化
合物として４−アミノ−２，３−ジメチル−１−
ｐ−トリル−３−ピラゾリン−５−オン〔56430
−10−５〕、４−アミノ−１，３−ジフエニル−
２−メチル−３−ピラゾリン−５−オン〔52744
−73−７〕、がある。その他に２−（ジメチルアミ
ノ）−５−フエニル−２−オキサゾリン−４−オ
ン（トザリノン、〔1046−17−９〕）も用いること
ができる。 一般式〔２〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換−ｐ
−フエニレンジアミンにおける置換基R5および
R6がアルキル基の場合、アルキル基としては炭
素原子数１乃至５の直鎖状または分岐状の低級ア
ルキル基で、その具体例としてはメチル基、エチ
ル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、イソ
プロピル基、イソブチル基、イソアミル基、ｔ−
ブチル基、ネオペンチル基がある。アルコキシア
ルキル基の場合、アルコキシアルキル基としては
炭素原子数１乃至３の低級アルコキシ基が置換し
た炭素原子数１乃至３の低級アルキル基で、その
具体例としてはメトキシメチル基、２−メトキシ
エチル基、１−メトキシエチル基、３−メトキシ
プロピル基、２−メトキシプロピル基、エトキシ
プロピル基、２−エトキシエチル基がある。ヒド
ロキシアルキル基の場合、ヒドロキシアルキル基
としてはヒドロキシル基が置換した炭素原子数１
乃至５の直鎖状または分岐状の低級アルキル基
で、その具体例としてはヒドロキシメチル基、２
−ヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシエチル
基、３−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシ
プロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒド
ロキシペンチル基がある。シアノアルキル基の場
合、シアノアルキル基としてはシアノ基が置換し
た炭素原子数１乃至５の直鎖状または分岐状の低
級アルキル基で、その具体例としてはシアノメチ
ル基、２−シアノエチル基、１−シアノエチル
基、３−シアノプロピル基、２−シアノプロピル
基、５−シアノペンチル基がある。ハロゲノアル
キル基の場合、ハロゲノアルキル基としてはハロ
ゲン原子として弗素、塩素、臭素または沃素原子
が置換した炭素原子数１乃至５の直鎖状または分
岐状の低級アルキル基で、その具体例としてはフ
ルオロメチル基、クロロメチル基、ブロモメチル
基、２−フルオロエチル基、１−クロロメチル
基、２−クロロメチル基、２−ブロモエチル基、
３−クロロプロピル基がある。アシルアミノアル
キル基の場合、アシルアミノアルキル基としては
アシルアミノ基としてアセトアミド基、プロピオ
ンアミド基、ベンズアミド基、トルアミド基、メ
タンスルホンアミド基、エタンスルホンアミド
基、プロパンスルホンアミド基、ベンゼンスルホ
ンアミド基、トルエンスルホンアミド基が置換し
た炭素原子数１乃至５の直鎖状または分岐状の低
級アルキル基で、その具体例としてはアセトアミ
ドメチル基、プロピオンアミドメチル基、ベンズ
アミドメチル基、ｐ−トルアミドメチル基、メタ
ンスルホンアミドメチル基、エタンスルホンアミ
ドメチル基、ベンゼンスルホンアミドメチル基、
ｐ−トルエンスルホンアミドメチル基、２−アセ
トアミドエチル基、２−プロピオンアミドエチル
基、２−ベンズアミドエチル基、２−ｐ−トルア
ミドエチル基、２−メタンスルホンアミドエチル
基、２−（エタンスルホンアミド）エチル基、２
−（ベンゼンスルホンアミド）エチル基、２−（ｐ
−トルエンスルホンアミド）エチル基、３−アセ
トアミドプロピル基、３−ベンズアミドプロピル
基がある。 R5またはR6として好ましい置換基はアルキル
基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル
基、アシルアミノアルキル基、ハロゲノアルキル
基、シアノアルキル基であり、好ましい置換基の
具体例としてメチル基、エチル基、メトキシメチ
ル基、２−メトキシエチル基、エトキシメチル
基、２−エトキシエチル基；ヒドロキシメチル
基、２−ヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシエ
チル基、２−ヒドロキシプロピル基；アセトアミ
ドメチル基、２−アセトアミドエチル基、メタン
スルホンアミドエチルメチル基、２−メタンスル
ホンアミドエチル基；クロロメチル基、２−クロ
ロエチル基；シアノメチル基、２−シアノエチル
基がある。 一般式〔２〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換−ｐ
−フエニレンジアミンにおける置換基R7がアル
キル基の場合、その具体例は前述のR5またはR6
がアルキル基の場合の具体例と同じである。R7
がアルコキシ基の場合、アルコキシ基としては炭
素原子数１乃至５の直鎖状または分岐状の低級ア
ルキル基を有するアルコキシ基で、その具体例と
してはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、
イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ
基、ペンチルオキシ基、イソアミルオキシ基があ
る。R7がハロゲン原子の場合、その具体例とし
て弗素原子、塩素原子、臭素原子、沃素原子があ
る。 R7として好ましい置換基は水素原子、アルキ
ル基、ハロゲン原子であり、アルキル基の具体例
としてメチル基、エチル基、プロピル基、ハロゲ
ン原子の具体例として弗素原子、塩素原子があ
る。 一般式〔２〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換−ｐ
−フエニレンジアミンの具体例としては次の化合
物がある。 Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジアミン Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレンジアミン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｐ
−フエニレンジアミン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−エトキシエチル）−ｐ−
フエニレンジアミン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−メタンスルホンアミノ
エチル）−３−メチル−４−アミノアニリン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−３
−メチル−４−アミノアニリン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−シアノエチル）−ｐ−フ
エニレンジアミン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−クロロエチル）−ｐ−フ
エニレンジアミン Ｎ−エチル−Ｎ−（β−エトキシエチル）−ｐ−
フエニレンジアミン Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−クロロ−４−アミノア
ニリン Ｎ，Ｎ−ビス（β−シアノエチル）−ｐ−フエ
ニレンジアミン 水素供与体としては４−置換アンチピリンおよ
び一般式〔２〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換−ｐ
−フエニレンジアミンが好ましく、そのうちで特
に４−アミノアンチピリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−
ｐ−フエニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ
−フエニレンジアミンが好ましい。 一般式〔１〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換アニ
リンにおける置換基R1およびR2がアルキル基ま
たはアルコキシ基の場合、その具体例は前述の一
般式〔２〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換−ｐ−フ
エニレンジアミンにおける置換基R5またはR6が、
それぞれアルキル基またはアルコキシ基の場合の
具体例に同じである。 R3およびR4がアルキル基、アルコキシアルキ
ル基、ヒドロキシアルキル基、シアノアルキル
基、ハロゲノアルキル基またはアシルアミノアル
キル基の場合、その具体例は前述のR5またはR6
が、それぞれアルキル基、アルコキシアルキル
基、ヒドロキシアルキル基、シアノアルキル基、
ハロゲノアルキル基またはアシルアミノアルキル
基の場合の具体例に同じである。R3およびR4が
アミノアルキル基の場合、アミノアルキル基とし
てはアミノ基が置換した炭素原子数１乃至５の直
鎖状または分岐状の低級アルキル基で、その具体
例としてはアミノメチル基、２−アミノエチル
基、１−アミノエチル基、３−アミノプロピル
基、２−アミノプロピル基がある。 R1またはR2として好ましい置換基は水素原子、
アルキル基、アルコキシ基であり、アルキル基の
具体例としてメチル基、エチル基、プロピル基、
アルコキシ基としてメトキシ基、エトキシ基があ
る。 R3およびR4として好ましい置換基はアルキル
基、アルコキシアルキル基、ヒドロキシアルキル
基、シアノアルキル基、ハロゲノアルキル基で、
その具体例としてはメチル基、エチル基、プロピ
ル基；メトキシメチル基、２−メトキシエチル
基、３−メトキシプロピル基、エトキシメチル
基、２−エトキシエチル基；ヒドロキシメチル
基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエ
チル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロ
キシプロピル基；シアノメチル基、２−シアノエ
チル基；クロロメチル基、１−クロロエチル基、
２−クロロエチル基、２−クロロプロピル基、３
−クロロプロピル基、ブロモメチル基、２−ブロ
モメチル基、フルオロメチル基、２−フルオロエ
チル基がある。 一般式〔１〕で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換アニ
リンの具体例として次の化合物がある。 Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシメチルアニリン Ｎ−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ア
ニリン Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ア
ニリン Ｎ−メチル−Ｎ−（２−メトキシエチル）アニ
リン Ｎ−エチル−Ｎ−（２−メトキシエチル）アニ
リン Ｎ−エチル−Ｎ−（２−エトキシエチル）アニ
リン Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシメチル）−ｍ−トル
イジン Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−ｍ−
トルイジン Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシプロピル）−ｍ
−トルイジン Ｎ，Ｎ−ビス（３−ヒドロキシプロピル）−ｍ
−トルイジン Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシメチル−ｍ−トル
イジン Ｎ−エチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ｍ−
トルイジン Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシメチル−ｍ−トル
イジン Ｎ−メチル−Ｎ−メトキシメチル−ｍ−トルイ
ジン Ｎ−エチル−Ｎ−メトキシメチル−ｍ−トルイ
ジン Ｎ−エチル−Ｎ−２−メトキシエチル−ｍ−ト
ルイジン Ｎ−シアノメチル−Ｎ−ヒドロキシメチル−ｍ
−トルイジン Ｎ−メチル−Ｎ−２−クロロエチル−ｍ−トル
イジン Ｎ−エチル−Ｎ−２−クロロエチル−ｍ−トル
イジン Ｎ−２−シアノエチル−Ｎ−２−ヒドロキシエ
チル−ｍ−トルイジン Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシメチル−ｍ−アニ
シジン Ｎ−エチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ｍ−
アニシジン これらの化合物のうちで好ましいＮ，Ｎ−ジ置
換アニリンは次の化合物である。 Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−ｍ−
トルイジン Ｎ−エチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ｍ−
トルイジン Ｎ−２−シアノエチル−Ｎ−２−ヒドロキシエ
チル−ｍ−トルイジン Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン 本発明に用いられる過酸化水素検出呈色指示薬
には過酸化水素の存在下に化学的相互作用により
形成されるカチオン性染料の吸収波長領域の光
（近紫外線、可視光または近赤外線）を吸収して
比色分析を妨害するカチオン性成分化合物を含有
しないことが好ましい。 本発明に用いられるアニオン性ポリマーはポリ
マーの高分子鎖そのもの、または高分子鎖に結合
した原子または原子団の中にアニオン原子または
アニオン原子団を含むポリマーである。アニオン
性ポリマーとしては通常のアニオン性ポリマーの
他に酸型の陽イオン交換樹脂をも用いることがで
き、好ましくは通常のアニオン性ポリマーまたは
陽イオン交換樹脂は水溶性または水により膨潤し
うる性質をもつ（水膨潤性）ポリマーである。ア
ニオン性ポリマーは単独で、または２種以上を組
合せて用いることができる。アニオン性ポリマー
は皮膜形成能を有するものも有しないものもいず
れも用いることができる。皮膜形成能を有しない
アニオン性ポリマーは皮膜形成能を有するバイン
ダーポリマーとともに用いることが好ましい。 アニオン性ポリマーの具体例としてはその高分
子鎖の構成繰返単位（Constitutional Repeating
Unitに対する術語で、以下CRUと略記する。）の
全部またはCRUのうちの特定の割合のものが
（規則的または不規則的な配列いずれでもよい）
アニオン性原子団としてカルボキシラト基（−
COO）、スルホナト基（−SO3）またはホス
ホナト基（−PO32）、またはカウタカチオンを
有する前記アニオン性原子団が結合した構造であ
るようなポリマーまたはコポリマーがある。ここ
でカウンタカチオンとしてはアルカリ金属イオン
（例、Li、Na、K、Cs）、アルカリ土類
金属イオン（例、Mg2、Ca2、Sr2、
Ba2）、アンモニウムイオン（NH4）がある。 前記CRUを含むアニオン性ポリマーの具体例
としては次のものがあげられる。 メチルビニルエーテル−無水マレイン酸共重合
体のアルカリ加水分解物（CRUとしてジリチウ
ム、ジナトリウムまたはジカリウム１，２−ジカ
ルボキシラトエチレンを含むコポリマー） ポリアクリル酸アルカリ金属塩またはアルカリ
土類金属塩 ポリ−Ｎ−（β−スルホ−α，α−ジメチルエ
チル）アクリルアミドのアルカリ金属塩またはア
ルカリ土類金属塩 ポリスチレン−ｐ−スルホン酸のアルカリ金属
塩またはアルカリ土類金属塩 スチレン−ｐ−スルホン酸と親水性ビニルモノ
マーとの共重合体のアルカリ金属塩またはアルカ
リ土類金属塩（親水性ビニルモノマーの例：アク
リル酸、アクリル酸アルキルエステル（例：メチ
ルアクリレート）、アクリル酸ヒドロキシアルキ
ルエステル（例：β−ヒドロキシエチルアクリレ
ート）、アクリルアミド（例：アクリルアミド、
Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルア
クリルアミド、Ｎ−（β−スルホナト−α，α−
ジメチルエチル）アクリルアミド、Ｎ−エチル−
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、アクリルモル
ホリド
【式】
Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイ
ルピペラジン）、メタアクリル酸ヒドロキシアル
キルエステル（例：β−ヒドロキシエチルメタア
クリレート）、メタアクリルアミド（例：メタア
クリルアミド、メタアクリルモルホリド）） ポリビニルホスホン酸のアルカリ金属塩 Ｍはリチウム、ナトリウムまたはカリウム） カルボキシメチルセルロース カルボキシエチルセルロース アルギン酸およびそのアルカリ金属塩 好ましいアニオンポリマーとして次のものがあ
げられる。 ポリスチレン−ｐ−スルホン酸カリウム スチレン−ｐ−スルホン酸カリウム−アクリル
モルホリドコポリマー スチレン−ｐ−スルホン酸カリウム−アクリル
アミドコポリマー スチレン−ｐ−スルホン酸カリウム−Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミドコポリマー スチレン−ｐ−スルホン酸ナトリウム−Ｎ−エ
チル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドコポリマ
ー ポリ−Ｎ−（β−カリウムスルホナト−α，α
−ジメチルエチル）アクリルアミド Ｎ−（β−カリウムスルホナート−α，α−ジ
メチルエチル）アクリルアミド−β−ヒドロキシ
エチルアクリレート コポリマー Ｎ−（β−カリウムスルホナト−α，α−ジメ
チルエチル）アクリルアミド−Ｎ−エチルアクリ
ルアミド コポリマー アニオン性ポリマーは過酸化水素検出呈色試薬
を含む層に含有させることもでき、またアニオン
性ポリマーを含み他の試薬成分を含まない染料固
定層として過酸化水素検出呈色試薬を含む層と別
個の層として設けることもでき、さらにアニオン
性ポリマーを過酸化水素検出呈色試薬と染料固定
層の両方に含有させることもできる。アニオン性
ポリマーは１種だけを用いれば通常は十分である
が、必要に応じて２種以上を組合せて用いること
もできる。アニオン性ポリマーを過酸化水素検出
呈色試薬を含む層と染料固定層の両方に含有させ
る場合、両方のアニオン性ポリマーは同種のアニ
オン性ポリマーであつても異種のアニオン性ポリ
マーであつてもよい。さらにアニオン性ポリマー
は必要に応じて過酸化水素検出呈色試薬を含む層
または染料固定層以外の層に含有させることもで
きる。 本発明の定量分析フイルムの過酸化水素検出呈
色指示薬とアニオン性ポリマーを含む試薬層、過
酸化水素検出呈色指示薬を含む呈色反応層、およ
びアニオン性ポリマーを含む染料固定層はいずれ
もバインダーポリマーを含有することができる。
バインダーポリマーとしてはゼラチン、カゼイ
ン、アガロース、澱粉、ポリビニルアルコール、
ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポ
リエチレングリコールなど公知の親水性ポリマー
を用いることができ、さらに親水性ポリマーとと
もに公知の硬膜剤（硬化剤または架橋剤）をも用
いることができる。試薬層、呈色反応層または染
料固定層はバインダーポリマーの中にそれぞれ過
酸化水素検出呈色指示薬とアニオン性ポリマーと
の混合物、過酸化水素検出呈色指示薬、またはア
ニオン性ポリマーを分散または溶解させた分散液
または溶液を公知の塗布法により支持体の上に塗
布し乾燥するか、または多孔性支持体の表面およ
び内部に含浸して用いる。試薬層、呈色反応層ま
たは染料固定層が支持体の上に塗布して設けられ
る場合にはその層の厚さはいずれも1μｍから
100μｍ、好ましくは2μｍから50μｍの範囲であ
る。染料固定層がバインダーポリマーを含まない
アニオン性ポリマーのみからなる場合、その層厚
は1μｍから50μｍ、好ましくは3μｍから30μｍの
範囲である。 本発明の定量分析フイルムに用いられている染
料固定化法においては呈色染料形成時に初めて固
定化反応性基が附与される事から原理的には従来
の媒染法の欠点を全く排除している。更に驚くべ
き事には、本発明の固定剤は酵素反応を実質的に
阻害しないので、酵素反応を実施させる過酸化水
素検出呈色指示薬を含む層の中に含有させる事が
可能である。 本発明において、過酸化水素の存在下で過酸化
水素検出呈色指示薬を含む層の中での発色反応
は、水素供与体（ｐ−フエニレンジアミン誘導体
または４−アミノアンチピリンがその代表例）と
芳香族アミンの酸化カツプリング反応によりカチ
オン性染料を生成する公知の方法をもとにしてい
る。この方法は前記のJamesの著書およびJ.
Kosar著「Light−Sensitive Systems（John
Wiley ＆ Sons.、New York、1965年発行）
215〜249ページ等に記載されている方法である。 この反応系では染料前駆体のカプラー、水素供
与体は非イオン性化合物であり、イオン反応に基
くアニオン性ポリマー上への固定化反応へは全く
関与しない。しかし生成したカチオン性染料はア
ニオン性ポリマーに強く染着される。 すなわち、生成した染料になつて初めて固定化
能が附与される。 この原理によれば、染料が生成する以前には固
定化剤は全く作用せず染料前駆体はポリマー分子
の上に固定される事なく過酸化水素検出呈色指示
薬を含む層の中で自由な染料形成反応を進行させ
る事が可能である。 ペルオキシダーゼおよび色原体を含む過酸化水
素検出試験紙等の結合剤として特公昭37−5797に
はアルギン酸ナトリウムの使用が組成物の安定化
に寄与していると開示され、更に特公昭45−1878
にはメチルビニルエーテル−無水マレイン酸共重
合体の酸型及び部分エステル型加水分解物、ポリ
ビニルピロリドン及び３，６−アンヒドロ−Ｄ−
ガラクトースから成る結合剤の存在下では酸化さ
れた時生ずる色を非常に強めると開示されてい
る。特公昭50−39558や特開昭55−120798におい
てもメチルビニルエーテル−無水マレイン酸共重
合体の水／アルコール処理体とポリビニルピロリ
ドンとの共存は同様の効果があると開示されてい
る。 しかしながら本発明の定量分析フイルムの試薬
層においては発色強度の増加は観察されずただ拡
散性が減ずることが見出された。この差異な生成
する染料が塩基性ノニオン性染料（前記特許に開
示の材料）であるかカチオン性染料（本発明）で
あるかの差異に基く現像として説明される。すな
わちノニオン性染料へのプロトン化によるカチオ
ン化によつて色強度が増加した。前記特許明細書
に記載の定量試験紙では全て呈色試薬層が繊維質
の紙等に含浸されており、その層内での泳動は
実質的に不問にされている点にある。すなわち、
従来の試験紙では光学的に不透明である紙等の
担体上に生成した染料を濃測していた系では前記
の現象に基いて精度の上で重大な欠点を有してい
たが、定量試験法ではこの点は無視することがで
きる程度の測定精度で十分であつたため、この欠
点は不問にされていた。 本発明の定量分析フイルムの好ましい実施態様
においては試薬層、呈色反応層または染料固定層
は光学的に透明な一定の厚さの塗布層であり、そ
の機能としてはマイクロキユベツトと同等であ
る。本発明の定量分析フイルムは従来の乾式分析
紙の原理的に有しているる上記欠点を改良して、
より精度の高い分析法の確立をその目的としてい
る。このような定量分析フイルムにおいては、生
成染料の泳動は予期される精度を著しく損うの
で、是非とも除却したい現象でもあつた。本発明
はこの様な観点より数多くのバインダーが検討さ
れ、それ等の内より選択された結果である。 本発明の定量分析フイルムの試薬層における反
応式を、本発明の実施態様に基いて一般式で表わ
すと次のとおりである。 式〔３〕ないし〔６〕においてR1ないしR7は
一般式〔１〕または〔２〕と同じ意味を表わし、
Xはアニオンを表わす。 式〔５〕においてZはアニオン性ポリマーの
−COOまたは−SO3基を含む原子団を、A
はカチオンを表わし、ｎは正の整数を表わす。 本発明の定量分析フイルムは過酸化水素検出呈
色指示薬とアニオン性ポリマーを含む試薬層を少
なくとも一つ有するか、または過酸化水素検出呈
色指示薬を含む呈色反応層とアニオン性ポリマー
を含む染料固定層をそれぞれ少なくとも一つずつ
有する定量分析フイルムであつて、その層構成は
使用目的および要請される定量分析の精度に応じ
て種々の層構成をとることができる。以下、本発
明の実施態様例を示す図面を参照しながら本発明
を説明する。 第１図は過酸化水素検出呈色指示薬とアニオン
性ポリマーを含む試薬組成物を自己支持性の多孔
質支持体の表面および内部に含浸させた試薬含浸
支持体２３からなる定量分析フイルムである。自
己支持性の多孔質支持体としては紙、普通紙、
不織布、メンブランフイルター、多孔性のプラス
チツクフイルムなど公知のフイルム状またはシー
ト状物を用いることができる。特開昭54−
156079、特開昭54−160296、実開昭56−142454、
特開昭57−63452等に開示されているスライド枠
に定量分析フイルムを収めて用いる場合には多孔
質支持体は前記の材料のほかに識物のようにしな
やかな材料をも用いることができる。この定量分
析フイルムをフイルム状またはシート状の支持体
の上に接着して用いることができ、この場合の構
成はこの後に説明する第２図に示される定量分析
フイルムに類似する。 第２図はフイルム状またはシート状の支持体１
０の上に過酸化水素検出呈色指示薬とアニオン性
ポリマーを含む試薬層２０を設けた構成の定量分
析フイルムである。支持体は透明でも不透明でも
よい。 第３図はフイルム状またはシート状の支持体の
上にアニオン性ポリマーを含有する染料固定層２
１と過酸化水素検出呈色指示薬を含む呈色反応層
２２がこの順に設けられている構成の定量分析フ
イルムである。支持体は透明でも不透明でもさし
つかえないが、好ましくは透明支持体である。 第４図から第８図に示す定量分析フイルムにお
いては試薬層、呈色反応層、または染料固定層が
支持体と多孔性層の間に設けられており、多孔性
層と試薬層、呈色反応層、または染料固定層は流
体接触（この定義は前記の特開昭51−40191明細
書などに開示されている。）しており、好ましく
は一体に接着されている構成をもつものである。
多孔性層は多孔性展開層または定面積多孔性層と
して用いられ、いずれも試料液体が点着され、そ
の試料液体を下の層に供給する機能を有するもの
で、好ましくは試料液体を単位面積当りほぼ一定
量になるようにして（多孔性展開層の場合）、ま
たはその形と同じ大きさに展開して一定面積当り
ほぼ一定量になるようにして（定面積多孔性層の
場合）下の層に供給する機能を有するものであ
る。 第４図はフイルム状またはシート状の支持体１
０の上に過酸化水素検出呈色指示薬とアニオン性
ポリマーを含む試薬層２０、および多孔性展開層
３１をこの順に設けた構成の定量分析フイルムで
ある。 第５図はフイルム状またはシート状の支持体１
０の上にアニオン性ポリマーを含む染料固定層２
１、過酸化水素検出呈色指示薬を含む呈色反応層
２２、光反射層４０、および多孔性展開層３１を
この順に設けた構成の定量分析フイルムである。 第４図または第５図に示した定量分析フイルム
の多孔性展開層は特開昭49−53888に開示されて
いるブラツシユポリマー（一般名メンブランフイ
ルター）、珪藻土、微結晶材料（例えば微結晶セ
ルロース（FMCコーポレーシヨンの商標名アビ
セル）などの多孔性微粉体をバインダーポリマー
の中に分散させた多孔性層、ガラスやポリマーの
微小球形ビーズを互いに点接着させた多孔性集合
体層、特開昭55−90859に開示されている水で膨
潤しない有機ポリマーの微小球形ビーズを水不溶
性接着剤で点接着させた凝集三次元格子状粒状構
造物の層などの非繊維等方的多孔性層、特開昭55
−164356に開示されている親水化処理した識物、
特願昭55−140532（特開昭57−66359）に開示され
ている物理的親水化処理（例、グロー放電処理、
プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射、火
陥処理）した識物、紙などの繊維質異方的多孔
性層を用いることができる。非繊維等方的多孔性
層を多孔性展開層として試薬層２０または光反射
層４０の上に設ける方法は前記の特開昭49−
53888、特開昭55−90859等に開示の方法によるこ
とができ、繊維質異方的多孔性展開層を多孔性展
開層として試薬層２０または光反射層４０の上に
設ける方法は前記の特開昭55−164356、特願昭55
−140532（特開昭57−66359）に開示されている方
法によることができる。 定面積多孔性層は実願昭55−120299（実開昭57
−44838）にポーラス層として開示されている層
の素材（例、識物、紙、メンブランフイルター）
および設け方に従つて設けることができる。定面
積多孔性層の素材は多孔性展開層の素材と同じも
のを用いることができるほか、内部が多孔性で水
などの液体を保持でき、かつ孔が一方の表面から
他方の表面に通じているものであれば、広く何で
も用いることができる。定面積多孔性層を試薬層
または光反射層などの上に設ける方法は実願昭55
−120299（実開昭57−44838）に開示の方法や前記
の多孔性展開層を設ける方法と同じ方法によるこ
とができる。 光反射層４０は特開昭49−53888、特開昭51−
40191、特開昭55−164356等に開示されている酸
化チタン微粉末または硫酸バリウム微粉末等の白
色顔料を親水性バインダーポリマーに分散した
層、特開昭49−53888等に開示されている酸化チ
タン微粉末または硫酸バリウム微粉末等の白色顔
料を分散させたブラツシユポリマー層（メンブラ
ンフイルター）、特開昭49−53888等に開示されて
いるブラツシユポリマー層、特開昭55−26428に
開示されている多孔性金属膜からなる水浸透性の
層、特開昭55−26429に開示されている金属粉末
を含む水浸透性の層などを用いることができ、こ
れらの層の設け方もまた前記の特許明細書に開示
の方法によることができる。 第６図は支持体１０の上に過酸化水素検出呈色
指示薬を含む呈色反応層２２、アニオン性ポリマ
ーを含む染料固定層２１、光反射層４０、多孔性
展開層３１をこの順に設けた構成の定量分析フイ
ルムであつて、第５図に示した定量分析フイルム
において呈色反応層と染料固定層との位置関係が
逆転した構成を持つている。過酸化水素検出呈色
指示薬に形成されるカチオン性染料の吸収波長領
域の光を吸収して比色分析を妨害するようなカチ
オン性化合物が含有されないかぎり、呈色反応層
と染料固定層との位置関係は自由に選ぶことがで
きるので、過酸化水素検出呈色指示薬に空気酸化
されるおそれのある成分を含むなどの理由により
呈色反応層を空気にふれないように下側の層に設
けたい場合に効果がある。 第７図は支持体１０の上にアニオン性ポリマー
を含む染料固定層２１、過酸化水素検出呈色指示
薬を含む呈色反応層２２をこの順に設け、その上
に密着させて多孔性でそのサイズが保持しうる水
の量以上の液体試料が供給されるように定められ
た一定面積の多孔性層、すなわち定面積多孔性層
３２を設けた構成の定量分析フイルムである。定
面積多孔性層をもつ定量分析フイルムは特に過酸
化水素の含有量が微少な水性液体試料または過酸
化水素の発生量が微少な前駆物質を含む水性液体
試料の中の過酸化水素の量を定量するのに適して
いる。呈色反応層と定面積多孔性層の間に光反射
層を設けることができる。また呈色反応層と染料
固定層の位置を（第６図に示した定量分析フイル
ムにおける場合と同じく）逆転させることもでき
る。 第８図は支持体１０の上に過酸化水素検出呈色
指示薬とアニオン性ポリマーを含む試薬層２０、
光反射層４０、定面積多孔性層３２をこの順に設
けた構成の定量分析フイルムである。第７図およ
び第８図においては定面積多孔性層が他の層より
小さいように示してあるが、定面積多孔性層は呈
色反応層または試薬層の形およびサイズをこえな
い形およびサイズであればよく、従つて呈色反応
層または試薬層と同じ形およびサイズであつても
さしつかえない。 第３図から第８図に示した定量分析フイルムの
支持体はポリエチレンテレフタレート、セルロー
スエステル（セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテートプロピ
オネートなど）、ポリカルボネート（ビスフエノ
ールＡのポリカルボネートなど）、ポリメチルメ
タアクリレート、ポリスチレンのような種々のポ
リマーのフイルムまたはシートで厚さが約25μｍ
から約0.3mm、好ましくは約50μｍから約0.2mmの
範囲のものを用いることができる。支持体は無色
透明または過酸化水素検出指示薬から生成するカ
チオン性染料が吸収する波長の光に対して透明な
ものを用いることができるほか、顔料（例、酸化
チタン微粉末、硫酸バリウム微粉末、酸化亜鉛微
粉末、カーボンブラツク）等を混入して遮光性に
したものをも用いることができる。遮光性支持体
を用いる場合には、比色測定する際に支持体を剥
離除去するかまたは支持体のない側から反射測光
法により比色測定することができる。遮光性支持
体を用いることにより試薬層、呈色反応層または
染料固定層に光分解しやすい試薬成分を含有させ
る場合に有利である。 本発明の定量分析フイルムの試薬層、呈色反応
層または染料固定層の中には過酸化水素と異なる
被検成分（以下前駆被検成分という。）と化学反
応により過酸化水素を生成することができる試薬
組成物系（以下、過酸化水素生成試薬系という。）
を含むことができる。あるいは過酸化水素生成試
薬系を含む試薬層（以下過酸化水素生成試薬層）
を試薬層、呈色反応層または染料固定層と別個に
設けることもできる。過酸化水素生成試薬系は、
１段階の化学反応で前駆被検成分から過酸化水素
を生成する試薬組成物系と複数段階の素反応が連
続する化学反応で前駆被検成分から過酸化水素を
生成する試薬組成物系のいずれでもよく、過酸化
水素生成試薬系に応じて過酸化水素生成試薬系を
試薬層、呈色反応層または染料固定層の中に含ま
せるか、またはこれらの層とは別個の１層または
複数層の過酸化水素生成試薬層を設けることがで
きる。前駆被検成分と過酸化水素生成試薬系の例
として特開昭50−137192、特開昭50−131588、特
開昭55−124499等に開示されているコレステロー
ルエステル、コレステロール、コレステローレエ
ステラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよび
このいずれかと反応するかまたはこのいずれかを
含む過酸化水素生成試薬系、特開昭49−53888、
特開昭51−40191、特開昭55−124499、特開昭55
−164356等に開示されているグルコース、グルコ
ースオキシダーゼ、およびこのいずれかと反応す
るかまたはこのいずれかを過酸化水素生成試薬
系、特開昭53−24892、特開昭53−24893、特開昭
53−26382等に開示されているトリグリセリド、
グリセリン、リパーゼ、グリセリンキナーゼ、α
−グリセロホスフエートオキシダーゼなど、およ
びこのいずれかと反応するかまたはこのいずれか
を含む過酸化水素生成試薬系、特開昭53−
105292、特開昭54−73096等に開示されている乳
酸塩、乳酸、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ラク
テートオキシダーゼ、およびこのいずれかと反応
するかまたはこのいずれかを含む過酸化水素生成
試薬系、米国特許4062731、特開昭54−50393、特
開昭55−124499等に開示されている尿酸、ウリカ
ーゼ、およびこのいずれかと反応するかまたはこ
のいずれかを含む過酸化水素生成試薬系をあげる
ことができるが、前記の前駆被検成分用の過酸化
水素生成試薬系に限られることなく、他の前駆被
検成分用の過酸化水素生成試薬系をも用いること
ができることはいうまでもない。 第２図乃至第８図の実施態様例に示した場合を
含めて本発明の定量分析フイルムを多層一体型構
造とする場合には前述の特開昭49−53888、特開
昭51−40191、特開昭55−90859、特開昭55−
164356、特願昭55−140532（特開昭57−66359）、
特開昭55−26428、特開昭55−26429、実願昭55−
120299（実開昭57−44838）等に開示されている方
法またはゼラチン−ハロゲン化銀乳剤層を有する
通常のカラー写真感光材料またはインスタント黒
白またはカラー写真感光材料の製造方法として確
立している公知の種々の塗布方法をそのまま、ま
たはわずかに改変して製造することができる。 次に本発明の定量分析フイルムを用いて過酸化
水素を定量する方法を説明す。本発明の定量分析
フイルムを用いての定量分析の際の操作は定量分
析フイルムへの被検試料液の点着と染料固定層に
生ずる着色の光学濃度の測定、および必要に応じ
ての点着後のインクベーシヨンである。被検試料
液の点着およびインクベーシヨンは前述の諸特許
明細書や特開昭53−81292、特開昭53−76044、特
開昭53−76095、特願昭54−154313（特開昭56−
77746）、実願昭55−45527（実開昭56−146241）、
実願昭55−103204（実開昭57−28356）等に開示さ
れている被検試料液点着用の道具または測定装置
を用い、これらに開示されている方法に従つて実
施することができる。第４図乃至第８図に示した
構成の定量分析フイルムを用いる場合には5μ
から50μの範囲内の微少量の被検試料液の点着
で非常な高精度の定量分析を実施できる。一方第
１図乃至第３図に示した定量分析フイルムを用い
る場合には定量分析フイルムを被検試料液の中に
浸してひきあげ、必要に応じてインクベーシヨン
し、ついで比色測定する方法により定量分析する
ことができる。この場合、特開昭51−82685、特
開昭51−144293、実開昭52−134381等に開示され
ている比色測定装置を用いて分析することができ
る。 実施例 １
ルピペラジン）、メタアクリル酸ヒドロキシアル
キルエステル（例：β−ヒドロキシエチルメタア
クリレート）、メタアクリルアミド（例：メタア
クリルアミド、メタアクリルモルホリド）） ポリビニルホスホン酸のアルカリ金属塩 Ｍはリチウム、ナトリウムまたはカリウム） カルボキシメチルセルロース カルボキシエチルセルロース アルギン酸およびそのアルカリ金属塩 好ましいアニオンポリマーとして次のものがあ
げられる。 ポリスチレン−ｐ−スルホン酸カリウム スチレン−ｐ−スルホン酸カリウム−アクリル
モルホリドコポリマー スチレン−ｐ−スルホン酸カリウム−アクリル
アミドコポリマー スチレン−ｐ−スルホン酸カリウム−Ｎ−イソ
プロピルアクリルアミドコポリマー スチレン−ｐ−スルホン酸ナトリウム−Ｎ−エ
チル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドコポリマ
ー ポリ−Ｎ−（β−カリウムスルホナト−α，α
−ジメチルエチル）アクリルアミド Ｎ−（β−カリウムスルホナート−α，α−ジ
メチルエチル）アクリルアミド−β−ヒドロキシ
エチルアクリレート コポリマー Ｎ−（β−カリウムスルホナト−α，α−ジメ
チルエチル）アクリルアミド−Ｎ−エチルアクリ
ルアミド コポリマー アニオン性ポリマーは過酸化水素検出呈色試薬
を含む層に含有させることもでき、またアニオン
性ポリマーを含み他の試薬成分を含まない染料固
定層として過酸化水素検出呈色試薬を含む層と別
個の層として設けることもでき、さらにアニオン
性ポリマーを過酸化水素検出呈色試薬と染料固定
層の両方に含有させることもできる。アニオン性
ポリマーは１種だけを用いれば通常は十分である
が、必要に応じて２種以上を組合せて用いること
もできる。アニオン性ポリマーを過酸化水素検出
呈色試薬を含む層と染料固定層の両方に含有させ
る場合、両方のアニオン性ポリマーは同種のアニ
オン性ポリマーであつても異種のアニオン性ポリ
マーであつてもよい。さらにアニオン性ポリマー
は必要に応じて過酸化水素検出呈色試薬を含む層
または染料固定層以外の層に含有させることもで
きる。 本発明の定量分析フイルムの過酸化水素検出呈
色指示薬とアニオン性ポリマーを含む試薬層、過
酸化水素検出呈色指示薬を含む呈色反応層、およ
びアニオン性ポリマーを含む染料固定層はいずれ
もバインダーポリマーを含有することができる。
バインダーポリマーとしてはゼラチン、カゼイ
ン、アガロース、澱粉、ポリビニルアルコール、
ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポ
リエチレングリコールなど公知の親水性ポリマー
を用いることができ、さらに親水性ポリマーとと
もに公知の硬膜剤（硬化剤または架橋剤）をも用
いることができる。試薬層、呈色反応層または染
料固定層はバインダーポリマーの中にそれぞれ過
酸化水素検出呈色指示薬とアニオン性ポリマーと
の混合物、過酸化水素検出呈色指示薬、またはア
ニオン性ポリマーを分散または溶解させた分散液
または溶液を公知の塗布法により支持体の上に塗
布し乾燥するか、または多孔性支持体の表面およ
び内部に含浸して用いる。試薬層、呈色反応層ま
たは染料固定層が支持体の上に塗布して設けられ
る場合にはその層の厚さはいずれも1μｍから
100μｍ、好ましくは2μｍから50μｍの範囲であ
る。染料固定層がバインダーポリマーを含まない
アニオン性ポリマーのみからなる場合、その層厚
は1μｍから50μｍ、好ましくは3μｍから30μｍの
範囲である。 本発明の定量分析フイルムに用いられている染
料固定化法においては呈色染料形成時に初めて固
定化反応性基が附与される事から原理的には従来
の媒染法の欠点を全く排除している。更に驚くべ
き事には、本発明の固定剤は酵素反応を実質的に
阻害しないので、酵素反応を実施させる過酸化水
素検出呈色指示薬を含む層の中に含有させる事が
可能である。 本発明において、過酸化水素の存在下で過酸化
水素検出呈色指示薬を含む層の中での発色反応
は、水素供与体（ｐ−フエニレンジアミン誘導体
または４−アミノアンチピリンがその代表例）と
芳香族アミンの酸化カツプリング反応によりカチ
オン性染料を生成する公知の方法をもとにしてい
る。この方法は前記のJamesの著書およびJ.
Kosar著「Light−Sensitive Systems（John
Wiley ＆ Sons.、New York、1965年発行）
215〜249ページ等に記載されている方法である。 この反応系では染料前駆体のカプラー、水素供
与体は非イオン性化合物であり、イオン反応に基
くアニオン性ポリマー上への固定化反応へは全く
関与しない。しかし生成したカチオン性染料はア
ニオン性ポリマーに強く染着される。 すなわち、生成した染料になつて初めて固定化
能が附与される。 この原理によれば、染料が生成する以前には固
定化剤は全く作用せず染料前駆体はポリマー分子
の上に固定される事なく過酸化水素検出呈色指示
薬を含む層の中で自由な染料形成反応を進行させ
る事が可能である。 ペルオキシダーゼおよび色原体を含む過酸化水
素検出試験紙等の結合剤として特公昭37−5797に
はアルギン酸ナトリウムの使用が組成物の安定化
に寄与していると開示され、更に特公昭45−1878
にはメチルビニルエーテル−無水マレイン酸共重
合体の酸型及び部分エステル型加水分解物、ポリ
ビニルピロリドン及び３，６−アンヒドロ−Ｄ−
ガラクトースから成る結合剤の存在下では酸化さ
れた時生ずる色を非常に強めると開示されてい
る。特公昭50−39558や特開昭55−120798におい
てもメチルビニルエーテル−無水マレイン酸共重
合体の水／アルコール処理体とポリビニルピロリ
ドンとの共存は同様の効果があると開示されてい
る。 しかしながら本発明の定量分析フイルムの試薬
層においては発色強度の増加は観察されずただ拡
散性が減ずることが見出された。この差異な生成
する染料が塩基性ノニオン性染料（前記特許に開
示の材料）であるかカチオン性染料（本発明）で
あるかの差異に基く現像として説明される。すな
わちノニオン性染料へのプロトン化によるカチオ
ン化によつて色強度が増加した。前記特許明細書
に記載の定量試験紙では全て呈色試薬層が繊維質
の紙等に含浸されており、その層内での泳動は
実質的に不問にされている点にある。すなわち、
従来の試験紙では光学的に不透明である紙等の
担体上に生成した染料を濃測していた系では前記
の現象に基いて精度の上で重大な欠点を有してい
たが、定量試験法ではこの点は無視することがで
きる程度の測定精度で十分であつたため、この欠
点は不問にされていた。 本発明の定量分析フイルムの好ましい実施態様
においては試薬層、呈色反応層または染料固定層
は光学的に透明な一定の厚さの塗布層であり、そ
の機能としてはマイクロキユベツトと同等であ
る。本発明の定量分析フイルムは従来の乾式分析
紙の原理的に有しているる上記欠点を改良して、
より精度の高い分析法の確立をその目的としてい
る。このような定量分析フイルムにおいては、生
成染料の泳動は予期される精度を著しく損うの
で、是非とも除却したい現象でもあつた。本発明
はこの様な観点より数多くのバインダーが検討さ
れ、それ等の内より選択された結果である。 本発明の定量分析フイルムの試薬層における反
応式を、本発明の実施態様に基いて一般式で表わ
すと次のとおりである。 式〔３〕ないし〔６〕においてR1ないしR7は
一般式〔１〕または〔２〕と同じ意味を表わし、
Xはアニオンを表わす。 式〔５〕においてZはアニオン性ポリマーの
−COOまたは−SO3基を含む原子団を、A
はカチオンを表わし、ｎは正の整数を表わす。 本発明の定量分析フイルムは過酸化水素検出呈
色指示薬とアニオン性ポリマーを含む試薬層を少
なくとも一つ有するか、または過酸化水素検出呈
色指示薬を含む呈色反応層とアニオン性ポリマー
を含む染料固定層をそれぞれ少なくとも一つずつ
有する定量分析フイルムであつて、その層構成は
使用目的および要請される定量分析の精度に応じ
て種々の層構成をとることができる。以下、本発
明の実施態様例を示す図面を参照しながら本発明
を説明する。 第１図は過酸化水素検出呈色指示薬とアニオン
性ポリマーを含む試薬組成物を自己支持性の多孔
質支持体の表面および内部に含浸させた試薬含浸
支持体２３からなる定量分析フイルムである。自
己支持性の多孔質支持体としては紙、普通紙、
不織布、メンブランフイルター、多孔性のプラス
チツクフイルムなど公知のフイルム状またはシー
ト状物を用いることができる。特開昭54−
156079、特開昭54−160296、実開昭56−142454、
特開昭57−63452等に開示されているスライド枠
に定量分析フイルムを収めて用いる場合には多孔
質支持体は前記の材料のほかに識物のようにしな
やかな材料をも用いることができる。この定量分
析フイルムをフイルム状またはシート状の支持体
の上に接着して用いることができ、この場合の構
成はこの後に説明する第２図に示される定量分析
フイルムに類似する。 第２図はフイルム状またはシート状の支持体１
０の上に過酸化水素検出呈色指示薬とアニオン性
ポリマーを含む試薬層２０を設けた構成の定量分
析フイルムである。支持体は透明でも不透明でも
よい。 第３図はフイルム状またはシート状の支持体の
上にアニオン性ポリマーを含有する染料固定層２
１と過酸化水素検出呈色指示薬を含む呈色反応層
２２がこの順に設けられている構成の定量分析フ
イルムである。支持体は透明でも不透明でもさし
つかえないが、好ましくは透明支持体である。 第４図から第８図に示す定量分析フイルムにお
いては試薬層、呈色反応層、または染料固定層が
支持体と多孔性層の間に設けられており、多孔性
層と試薬層、呈色反応層、または染料固定層は流
体接触（この定義は前記の特開昭51−40191明細
書などに開示されている。）しており、好ましく
は一体に接着されている構成をもつものである。
多孔性層は多孔性展開層または定面積多孔性層と
して用いられ、いずれも試料液体が点着され、そ
の試料液体を下の層に供給する機能を有するもの
で、好ましくは試料液体を単位面積当りほぼ一定
量になるようにして（多孔性展開層の場合）、ま
たはその形と同じ大きさに展開して一定面積当り
ほぼ一定量になるようにして（定面積多孔性層の
場合）下の層に供給する機能を有するものであ
る。 第４図はフイルム状またはシート状の支持体１
０の上に過酸化水素検出呈色指示薬とアニオン性
ポリマーを含む試薬層２０、および多孔性展開層
３１をこの順に設けた構成の定量分析フイルムで
ある。 第５図はフイルム状またはシート状の支持体１
０の上にアニオン性ポリマーを含む染料固定層２
１、過酸化水素検出呈色指示薬を含む呈色反応層
２２、光反射層４０、および多孔性展開層３１を
この順に設けた構成の定量分析フイルムである。 第４図または第５図に示した定量分析フイルム
の多孔性展開層は特開昭49−53888に開示されて
いるブラツシユポリマー（一般名メンブランフイ
ルター）、珪藻土、微結晶材料（例えば微結晶セ
ルロース（FMCコーポレーシヨンの商標名アビ
セル）などの多孔性微粉体をバインダーポリマー
の中に分散させた多孔性層、ガラスやポリマーの
微小球形ビーズを互いに点接着させた多孔性集合
体層、特開昭55−90859に開示されている水で膨
潤しない有機ポリマーの微小球形ビーズを水不溶
性接着剤で点接着させた凝集三次元格子状粒状構
造物の層などの非繊維等方的多孔性層、特開昭55
−164356に開示されている親水化処理した識物、
特願昭55−140532（特開昭57−66359）に開示され
ている物理的親水化処理（例、グロー放電処理、
プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射、火
陥処理）した識物、紙などの繊維質異方的多孔
性層を用いることができる。非繊維等方的多孔性
層を多孔性展開層として試薬層２０または光反射
層４０の上に設ける方法は前記の特開昭49−
53888、特開昭55−90859等に開示の方法によるこ
とができ、繊維質異方的多孔性展開層を多孔性展
開層として試薬層２０または光反射層４０の上に
設ける方法は前記の特開昭55−164356、特願昭55
−140532（特開昭57−66359）に開示されている方
法によることができる。 定面積多孔性層は実願昭55−120299（実開昭57
−44838）にポーラス層として開示されている層
の素材（例、識物、紙、メンブランフイルター）
および設け方に従つて設けることができる。定面
積多孔性層の素材は多孔性展開層の素材と同じも
のを用いることができるほか、内部が多孔性で水
などの液体を保持でき、かつ孔が一方の表面から
他方の表面に通じているものであれば、広く何で
も用いることができる。定面積多孔性層を試薬層
または光反射層などの上に設ける方法は実願昭55
−120299（実開昭57−44838）に開示の方法や前記
の多孔性展開層を設ける方法と同じ方法によるこ
とができる。 光反射層４０は特開昭49−53888、特開昭51−
40191、特開昭55−164356等に開示されている酸
化チタン微粉末または硫酸バリウム微粉末等の白
色顔料を親水性バインダーポリマーに分散した
層、特開昭49−53888等に開示されている酸化チ
タン微粉末または硫酸バリウム微粉末等の白色顔
料を分散させたブラツシユポリマー層（メンブラ
ンフイルター）、特開昭49−53888等に開示されて
いるブラツシユポリマー層、特開昭55−26428に
開示されている多孔性金属膜からなる水浸透性の
層、特開昭55−26429に開示されている金属粉末
を含む水浸透性の層などを用いることができ、こ
れらの層の設け方もまた前記の特許明細書に開示
の方法によることができる。 第６図は支持体１０の上に過酸化水素検出呈色
指示薬を含む呈色反応層２２、アニオン性ポリマ
ーを含む染料固定層２１、光反射層４０、多孔性
展開層３１をこの順に設けた構成の定量分析フイ
ルムであつて、第５図に示した定量分析フイルム
において呈色反応層と染料固定層との位置関係が
逆転した構成を持つている。過酸化水素検出呈色
指示薬に形成されるカチオン性染料の吸収波長領
域の光を吸収して比色分析を妨害するようなカチ
オン性化合物が含有されないかぎり、呈色反応層
と染料固定層との位置関係は自由に選ぶことがで
きるので、過酸化水素検出呈色指示薬に空気酸化
されるおそれのある成分を含むなどの理由により
呈色反応層を空気にふれないように下側の層に設
けたい場合に効果がある。 第７図は支持体１０の上にアニオン性ポリマー
を含む染料固定層２１、過酸化水素検出呈色指示
薬を含む呈色反応層２２をこの順に設け、その上
に密着させて多孔性でそのサイズが保持しうる水
の量以上の液体試料が供給されるように定められ
た一定面積の多孔性層、すなわち定面積多孔性層
３２を設けた構成の定量分析フイルムである。定
面積多孔性層をもつ定量分析フイルムは特に過酸
化水素の含有量が微少な水性液体試料または過酸
化水素の発生量が微少な前駆物質を含む水性液体
試料の中の過酸化水素の量を定量するのに適して
いる。呈色反応層と定面積多孔性層の間に光反射
層を設けることができる。また呈色反応層と染料
固定層の位置を（第６図に示した定量分析フイル
ムにおける場合と同じく）逆転させることもでき
る。 第８図は支持体１０の上に過酸化水素検出呈色
指示薬とアニオン性ポリマーを含む試薬層２０、
光反射層４０、定面積多孔性層３２をこの順に設
けた構成の定量分析フイルムである。第７図およ
び第８図においては定面積多孔性層が他の層より
小さいように示してあるが、定面積多孔性層は呈
色反応層または試薬層の形およびサイズをこえな
い形およびサイズであればよく、従つて呈色反応
層または試薬層と同じ形およびサイズであつても
さしつかえない。 第３図から第８図に示した定量分析フイルムの
支持体はポリエチレンテレフタレート、セルロー
スエステル（セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテートプロピ
オネートなど）、ポリカルボネート（ビスフエノ
ールＡのポリカルボネートなど）、ポリメチルメ
タアクリレート、ポリスチレンのような種々のポ
リマーのフイルムまたはシートで厚さが約25μｍ
から約0.3mm、好ましくは約50μｍから約0.2mmの
範囲のものを用いることができる。支持体は無色
透明または過酸化水素検出指示薬から生成するカ
チオン性染料が吸収する波長の光に対して透明な
ものを用いることができるほか、顔料（例、酸化
チタン微粉末、硫酸バリウム微粉末、酸化亜鉛微
粉末、カーボンブラツク）等を混入して遮光性に
したものをも用いることができる。遮光性支持体
を用いる場合には、比色測定する際に支持体を剥
離除去するかまたは支持体のない側から反射測光
法により比色測定することができる。遮光性支持
体を用いることにより試薬層、呈色反応層または
染料固定層に光分解しやすい試薬成分を含有させ
る場合に有利である。 本発明の定量分析フイルムの試薬層、呈色反応
層または染料固定層の中には過酸化水素と異なる
被検成分（以下前駆被検成分という。）と化学反
応により過酸化水素を生成することができる試薬
組成物系（以下、過酸化水素生成試薬系という。）
を含むことができる。あるいは過酸化水素生成試
薬系を含む試薬層（以下過酸化水素生成試薬層）
を試薬層、呈色反応層または染料固定層と別個に
設けることもできる。過酸化水素生成試薬系は、
１段階の化学反応で前駆被検成分から過酸化水素
を生成する試薬組成物系と複数段階の素反応が連
続する化学反応で前駆被検成分から過酸化水素を
生成する試薬組成物系のいずれでもよく、過酸化
水素生成試薬系に応じて過酸化水素生成試薬系を
試薬層、呈色反応層または染料固定層の中に含ま
せるか、またはこれらの層とは別個の１層または
複数層の過酸化水素生成試薬層を設けることがで
きる。前駆被検成分と過酸化水素生成試薬系の例
として特開昭50−137192、特開昭50−131588、特
開昭55−124499等に開示されているコレステロー
ルエステル、コレステロール、コレステローレエ
ステラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよび
このいずれかと反応するかまたはこのいずれかを
含む過酸化水素生成試薬系、特開昭49−53888、
特開昭51−40191、特開昭55−124499、特開昭55
−164356等に開示されているグルコース、グルコ
ースオキシダーゼ、およびこのいずれかと反応す
るかまたはこのいずれかを過酸化水素生成試薬
系、特開昭53−24892、特開昭53−24893、特開昭
53−26382等に開示されているトリグリセリド、
グリセリン、リパーゼ、グリセリンキナーゼ、α
−グリセロホスフエートオキシダーゼなど、およ
びこのいずれかと反応するかまたはこのいずれか
を含む過酸化水素生成試薬系、特開昭53−
105292、特開昭54−73096等に開示されている乳
酸塩、乳酸、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ラク
テートオキシダーゼ、およびこのいずれかと反応
するかまたはこのいずれかを含む過酸化水素生成
試薬系、米国特許4062731、特開昭54−50393、特
開昭55−124499等に開示されている尿酸、ウリカ
ーゼ、およびこのいずれかと反応するかまたはこ
のいずれかを含む過酸化水素生成試薬系をあげる
ことができるが、前記の前駆被検成分用の過酸化
水素生成試薬系に限られることなく、他の前駆被
検成分用の過酸化水素生成試薬系をも用いること
ができることはいうまでもない。 第２図乃至第８図の実施態様例に示した場合を
含めて本発明の定量分析フイルムを多層一体型構
造とする場合には前述の特開昭49−53888、特開
昭51−40191、特開昭55−90859、特開昭55−
164356、特願昭55−140532（特開昭57−66359）、
特開昭55−26428、特開昭55−26429、実願昭55−
120299（実開昭57−44838）等に開示されている方
法またはゼラチン−ハロゲン化銀乳剤層を有する
通常のカラー写真感光材料またはインスタント黒
白またはカラー写真感光材料の製造方法として確
立している公知の種々の塗布方法をそのまま、ま
たはわずかに改変して製造することができる。 次に本発明の定量分析フイルムを用いて過酸化
水素を定量する方法を説明す。本発明の定量分析
フイルムを用いての定量分析の際の操作は定量分
析フイルムへの被検試料液の点着と染料固定層に
生ずる着色の光学濃度の測定、および必要に応じ
ての点着後のインクベーシヨンである。被検試料
液の点着およびインクベーシヨンは前述の諸特許
明細書や特開昭53−81292、特開昭53−76044、特
開昭53−76095、特願昭54−154313（特開昭56−
77746）、実願昭55−45527（実開昭56−146241）、
実願昭55−103204（実開昭57−28356）等に開示さ
れている被検試料液点着用の道具または測定装置
を用い、これらに開示されている方法に従つて実
施することができる。第４図乃至第８図に示した
構成の定量分析フイルムを用いる場合には5μ
から50μの範囲内の微少量の被検試料液の点着
で非常な高精度の定量分析を実施できる。一方第
１図乃至第３図に示した定量分析フイルムを用い
る場合には定量分析フイルムを被検試料液の中に
浸してひきあげ、必要に応じてインクベーシヨン
し、ついで比色測定する方法により定量分析する
ことができる。この場合、特開昭51−82685、特
開昭51−144293、実開昭52−134381等に開示され
ている比色測定装置を用いて分析することができ
る。 実施例 １
【表】
上記塗布液を乾燥後の層厚が20μｍになる様に
写真フイルム用無色透明ポリエチレンテレフタレ
ート（PET）支持体（厚さ180μｍ）の上に塗布
した。 酸化チタン層（光反射層）塗布液組成 TiO2微粉末 19.5ｇ ゼラチン 6.8ｇ スルホこはく酸ジオクチルナトリウム 1.0ｇ 水 87ｇ 次いで試薬層に接して乾燥後の層厚が7μｍに
なるようにして酸化チタン層を塗布した。 酸化チタン層の上に接着層として５％ゼラチン
水溶液を乾燥後に1μｍの厚さになるように塗布
した。 最後に接着層の上に厚さ200μｍのクロマトグ
ラフイー用平滑紙を接着層を水で湿らせ圧着し
た。 これにより過酸化水素検出多層定量分析フイル
ムが製造された。 このフイルムを0.5cm2の面積に裁断し、標準的
に調整した各種過酸化水素水溶液を20μずつ最
上層の紙の上に付着させ、37℃で５分後の発色
光学濃度を、支持体を通して反射光学濃度として
測定した。
写真フイルム用無色透明ポリエチレンテレフタレ
ート（PET）支持体（厚さ180μｍ）の上に塗布
した。 酸化チタン層（光反射層）塗布液組成 TiO2微粉末 19.5ｇ ゼラチン 6.8ｇ スルホこはく酸ジオクチルナトリウム 1.0ｇ 水 87ｇ 次いで試薬層に接して乾燥後の層厚が7μｍに
なるようにして酸化チタン層を塗布した。 酸化チタン層の上に接着層として５％ゼラチン
水溶液を乾燥後に1μｍの厚さになるように塗布
した。 最後に接着層の上に厚さ200μｍのクロマトグ
ラフイー用平滑紙を接着層を水で湿らせ圧着し
た。 これにより過酸化水素検出多層定量分析フイル
ムが製造された。 このフイルムを0.5cm2の面積に裁断し、標準的
に調整した各種過酸化水素水溶液を20μずつ最
上層の紙の上に付着させ、37℃で５分後の発色
光学濃度を、支持体を通して反射光学濃度として
測定した。
【表】
比較例 １
比較のために、実施例１の試薬層塗布液よりポ
リスチレン−４−スルホン酸カリウムを除き、他
は実施例１と同様にして過酸化水素検出用多層分
析フイルムを作製した。 実施例１と同様の試験を行つた。
リスチレン−４−スルホン酸カリウムを除き、他
は実施例１と同様にして過酸化水素検出用多層分
析フイルムを作製した。 実施例１と同様の試験を行つた。
【表】
実施例 ２
Ｎ，Ｎ−ジ置換アニリンとして
(1) Ｎ−エチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ｍ
−トルイジン (2) Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−ｍ
−トルイジン (3) Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシプロピル）−
ｍ−トルイジン (4) ２−（Ｎ−エチルアニリノ）エタノール (5) Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン (6) Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン を用いて実施例１と同様にして多層定量分析フイ
ルムを作製した。濃度５×10-4モル／の過酸化
水素水溶液20μを付着させ、37℃で５分後の発
色光学濃度は次のとおりであつた。
−トルイジン (2) Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−ｍ
−トルイジン (3) Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシプロピル）−
ｍ−トルイジン (4) ２−（Ｎ−エチルアニリノ）エタノール (5) Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン (6) Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン を用いて実施例１と同様にして多層定量分析フイ
ルムを作製した。濃度５×10-4モル／の過酸化
水素水溶液20μを付着させ、37℃で５分後の発
色光学濃度は次のとおりであつた。
【表】
実施例 ３
水素供与体としてＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエ
ニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジ置換アニリンとして
Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−ｍ−ト
ルイジンを用いて実施例１と同様にして定量分析
フイルムを作製した。濃度５×10-4モル／の過
酸水素水溶液20μを定量分析フイルムの紙に
付着させ、37℃で５分後の発色濃度をPETフイ
ルムを通して測定したところ、波長740nｍの近
赤外光で光学濃度0.75であつた。 実施例 ４ 定量分析フイルムＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ 厚さ180μｍの写真フイルム用無色透明PETフ
イルムの上にそれぞれ次の組成の過酸化水素検出
指示薬溶液を乾燥後の厚さが20μｍになるように
して塗布、乾燥して試薬層を設けた。
ニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジ置換アニリンとして
Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−ｍ−ト
ルイジンを用いて実施例１と同様にして定量分析
フイルムを作製した。濃度５×10-4モル／の過
酸水素水溶液20μを定量分析フイルムの紙に
付着させ、37℃で５分後の発色濃度をPETフイ
ルムを通して測定したところ、波長740nｍの近
赤外光で光学濃度0.75であつた。 実施例 ４ 定量分析フイルムＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ 厚さ180μｍの写真フイルム用無色透明PETフ
イルムの上にそれぞれ次の組成の過酸化水素検出
指示薬溶液を乾燥後の厚さが20μｍになるように
して塗布、乾燥して試薬層を設けた。
【表】
ついでそれぞれの試薬層の上に実施例１と同様
にして乾燥後の厚さが7μｍの光反射層を設けた。
最後に光反射層の上に厚さ400μｍ、光反射層に
接する側の面積（底面積）50mm2の円形の紙片
（定面積多孔性層として）をのせて定量分析フイ
ルムＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄを完成した。 定量分析フイルムＥ 厚さ180μｍの写真フイルム用の無色透明PET
フイルムの上に次の組成の染料固定層溶液を乾燥
後の厚さが5μｍになるようにして塗布、乾燥し
て染料固定層を設けた。 染料固定層溶液組成 ポリスチレン−ｐ−スルホン酸カリウム ５ｇ ゼラチン ５ｇ サーフアクタント10G １ｇ 水 100ml ついで染料固定層の上に定量分析フイルムＡに
用いたのと同じ組成の過酸化水素検出用指示薬溶
液を乾燥後の厚さが20μｍになるように塗布、乾
燥して呈色反応層を設けた。その後に定量分析フ
イルムＡと同様にして呈色反応層の上に光反射層
（厚さ7μｍ）と紙片（厚さ400μｍ、底面積50
mm2）をのせて定量分析フイルムＥを完成した。 定量分析フイルムＦ 厚さ180μｍの写真フイルム用の無色透明PET
フイルムの上に定量分析フイルムＡに用いたのと
同じ組成の過酸化水素検出用指示薬溶液を乾燥後
の厚さが20μｍになるように塗布、乾燥して呈色
反応層にし、ついで定量分析フイルムＥに用いた
ものと同じ組成の染料固定層溶液を呈色反応層の
上に乾燥後の厚さが5μｍになるように塗布、乾
燥して染料固定層を設けた。その後に定量分析フ
イルムＡと同様にして染料固定層の上に光反射層
（厚さ7μｍ）と紙片（厚さ400μｍ、底面積50
mm2）をのせて定量分析フイルムＦを完成した。 比色測定 前述のようにして得た定量分析フイルムＡ〜
F6種の紙片の上に過酸化水素濃度１×10-3M、
５×10-3Mの過酸化水素水溶液20μを滴下付着
させた。滴下後37℃で６分インクベートした時に
全定量分析フイルムについて、波長600nｍでの
反射光学濃度をPETフイルムを通して測定した。
測定値は次のとおりであつた。
にして乾燥後の厚さが7μｍの光反射層を設けた。
最後に光反射層の上に厚さ400μｍ、光反射層に
接する側の面積（底面積）50mm2の円形の紙片
（定面積多孔性層として）をのせて定量分析フイ
ルムＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄを完成した。 定量分析フイルムＥ 厚さ180μｍの写真フイルム用の無色透明PET
フイルムの上に次の組成の染料固定層溶液を乾燥
後の厚さが5μｍになるようにして塗布、乾燥し
て染料固定層を設けた。 染料固定層溶液組成 ポリスチレン−ｐ−スルホン酸カリウム ５ｇ ゼラチン ５ｇ サーフアクタント10G １ｇ 水 100ml ついで染料固定層の上に定量分析フイルムＡに
用いたのと同じ組成の過酸化水素検出用指示薬溶
液を乾燥後の厚さが20μｍになるように塗布、乾
燥して呈色反応層を設けた。その後に定量分析フ
イルムＡと同様にして呈色反応層の上に光反射層
（厚さ7μｍ）と紙片（厚さ400μｍ、底面積50
mm2）をのせて定量分析フイルムＥを完成した。 定量分析フイルムＦ 厚さ180μｍの写真フイルム用の無色透明PET
フイルムの上に定量分析フイルムＡに用いたのと
同じ組成の過酸化水素検出用指示薬溶液を乾燥後
の厚さが20μｍになるように塗布、乾燥して呈色
反応層にし、ついで定量分析フイルムＥに用いた
ものと同じ組成の染料固定層溶液を呈色反応層の
上に乾燥後の厚さが5μｍになるように塗布、乾
燥して染料固定層を設けた。その後に定量分析フ
イルムＡと同様にして染料固定層の上に光反射層
（厚さ7μｍ）と紙片（厚さ400μｍ、底面積50
mm2）をのせて定量分析フイルムＦを完成した。 比色測定 前述のようにして得た定量分析フイルムＡ〜
F6種の紙片の上に過酸化水素濃度１×10-3M、
５×10-3Mの過酸化水素水溶液20μを滴下付着
させた。滴下後37℃で６分インクベートした時に
全定量分析フイルムについて、波長600nｍでの
反射光学濃度をPETフイルムを通して測定した。
測定値は次のとおりであつた。
【表】
この測定結果から、アニオン性ポリマーを含む
層を持たない定量分析フイルムＡ（比較例）にお
いては、生成した染料が光反射層と紙片に拡散
してしまつたので試薬層の反射光学濃度値が小さ
い。アニオン性ポリマーを含む試薬層を持つ定量
分析フイルムＢ，Ｃ，Ｄ（本発明）においては、
生成した染料が試薬層の中のアニオン性ポリマー
に結合して固定されて光反射層と紙片に拡散し
た染料の量が減少したのでアニオン性ポリマーの
含有量が増大するにつれて試薬層の反射光学濃度
値が増大した。またアニオン性ポリマーを含まな
い呈色反応層に隣接させてアニオン性ポリマーを
含む染料固定層を設けた定量分析フイルムＥ，Ｆ
（本発明）においては呈色反応層の中で生成した
染料が隣接する染料固定層の中に含まれているア
ニオン性ポリマーに結合して固定され、光反射層
と紙片に拡散した染料が著しく減少したので染
料固定層の光学濃度値が増大した。染料固定層は
呈色反応層に関して試料液体から遠い側（定量分
析フイルムＥ）でも近い側（定量分析フイルム
Ｆ）でもいずれでも生成した染料を効果的に固定
できることが明らかになつた。
層を持たない定量分析フイルムＡ（比較例）にお
いては、生成した染料が光反射層と紙片に拡散
してしまつたので試薬層の反射光学濃度値が小さ
い。アニオン性ポリマーを含む試薬層を持つ定量
分析フイルムＢ，Ｃ，Ｄ（本発明）においては、
生成した染料が試薬層の中のアニオン性ポリマー
に結合して固定されて光反射層と紙片に拡散し
た染料の量が減少したのでアニオン性ポリマーの
含有量が増大するにつれて試薬層の反射光学濃度
値が増大した。またアニオン性ポリマーを含まな
い呈色反応層に隣接させてアニオン性ポリマーを
含む染料固定層を設けた定量分析フイルムＥ，Ｆ
（本発明）においては呈色反応層の中で生成した
染料が隣接する染料固定層の中に含まれているア
ニオン性ポリマーに結合して固定され、光反射層
と紙片に拡散した染料が著しく減少したので染
料固定層の光学濃度値が増大した。染料固定層は
呈色反応層に関して試料液体から遠い側（定量分
析フイルムＥ）でも近い側（定量分析フイルム
Ｆ）でもいずれでも生成した染料を効果的に固定
できることが明らかになつた。
第１図乃至第８図は本発明の定量分析フイルム
の実施態様例の断面概念図である。第１図乃至第
８図において番号は次の事項を表わす。 １０……支持体、２０……試薬層、２１……染
料固定層、２２……呈色反応層、２３……試薬含
浸体、３１……多孔性展開層、３２……定面積多
孔性層、４０……光反射層。
の実施態様例の断面概念図である。第１図乃至第
８図において番号は次の事項を表わす。 １０……支持体、２０……試薬層、２１……染
料固定層、２２……呈色反応層、２３……試薬含
浸体、３１……多孔性展開層、３２……定面積多
孔性層、４０……光反射層。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 過酸化水素の存在下に化学的相互作用により
カチオン性染料を形成し得る成分を含有する呈色
指示薬組成物と、高分子鎖そのものまたは高分子
鎖に結合した原子または原子団にアニオン原子ま
たは原子団を含むポリマーとを同じ層に含む、少
なくとも一つの試薬層を有することを特徴とする
定量分析フイルム。 ２ 過酸化水素の存在下に化学的相互作用により
カチオン性染料を形成し得る成分を含有する呈色
指示薬組成物を含む呈色反応層と、高分子鎖その
ものまたは高分子鎖に結合した原子または原子団
にアニオン原子または原子団を含むポリマーを含
み、前記カチオン性染料を固定し得る染料固定層
とから成る、少なくとも一つの試薬層を有してお
り、前記カチオン性染料を形成し得る成分がそれ
自身は非イオン性であることを特徴とする定量分
析フイルム。 ３ 呈色反応層と染料固定層からなる前記試薬層
と、透明支持体とを有し、前記染料固定層は該支
持体と前記呈色反応層との間に設けられている、
特許請求の範囲２の定量分析フイルム。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56028158A JPS57142562A (en) | 1981-02-27 | 1981-02-27 | Quantitative analysis film and colorimetric quantitative analysis |
| GB8205593A GB2095401B (en) | 1981-02-27 | 1982-02-25 | Quantitative analysis film for the assay of h202 |
| DE19823206659 DE3206659A1 (de) | 1981-02-27 | 1982-02-25 | Film fuer die quantitative analyse und verfahren zur kolorimetrischen analyse unter verwendung desselben |
| US06/352,969 US4478942A (en) | 1981-02-27 | 1982-02-26 | Quantitative analysis film and a method for colorimetric analysis using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56028158A JPS57142562A (en) | 1981-02-27 | 1981-02-27 | Quantitative analysis film and colorimetric quantitative analysis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57142562A JPS57142562A (en) | 1982-09-03 |
| JPH0230466B2 true JPH0230466B2 (ja) | 1990-07-06 |
Family
ID=12240940
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56028158A Granted JPS57142562A (en) | 1981-02-27 | 1981-02-27 | Quantitative analysis film and colorimetric quantitative analysis |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4478942A (ja) |
| JP (1) | JPS57142562A (ja) |
| DE (1) | DE3206659A1 (ja) |
| GB (1) | GB2095401B (ja) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5946854A (ja) | 1982-09-10 | 1984-03-16 | Fuji Photo Film Co Ltd | 多層分析材料 |
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| US5183741A (en) * | 1983-10-13 | 1993-02-02 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Integral multilayer element for glucose analysis |
| CA1260387A (en) * | 1984-07-17 | 1989-09-26 | Technicon Instruments Corporation | Polymeric single layer analytical element |
| DE3433946A1 (de) * | 1984-09-15 | 1986-03-27 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Mittel und verfahren zum nachweis von wasserstoffperoxid |
| JPS61124393A (ja) * | 1984-11-20 | 1986-06-12 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | 過酸化水素検出用分析素子 |
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| US4789630A (en) * | 1985-10-04 | 1988-12-06 | Cetus Corporation | Ionic compounds containing the cationic meriquinone of a benzidine |
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