JPH10194977A - 免疫賦活剤 - Google Patents
免疫賦活剤Info
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- JPH10194977A JPH10194977A JP9006519A JP651997A JPH10194977A JP H10194977 A JPH10194977 A JP H10194977A JP 9006519 A JP9006519 A JP 9006519A JP 651997 A JP651997 A JP 651997A JP H10194977 A JPH10194977 A JP H10194977A
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- Japan
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- curdlan
- immunoactivator
- hydrolysate
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- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 副作用のない免疫賦活剤の提供。
【解決手段】 β−１,３−グルコシド結合からなる直
鎖の糖類を有効成分とする免疫賦活剤。
鎖の糖類を有効成分とする免疫賦活剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、副作用がない、食
品の他、飼料および餌料にも、利用可能な免疫賦活剤に
関する。
品の他、飼料および餌料にも、利用可能な免疫賦活剤に
関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、
ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御
に重要な役割を果しており、その主要な機構は、Ｔリン
パ球およびＢリンパ球が、これらの微生物や腫瘍を、抗
原受容体を介して認識することにより刺激を受け、抗原
特異的に活性化し、これらの異物を排除する能力を高め
ることである。常に微生物に曝され、また、細胞が変異
している生体内では、こうしたＴリンパ球およびＢリン
パ球の活性化は常時起こっている。また、抗原特異的な
活性化の他に、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の活性化に
は、菌体成分やレクチン等を認識する受容体を介する抗
原非特異的な活性化がある。抗原特異的および抗原非特
異的のいずれの活性化においても、他からの刺激、すな
わち、共刺激が加わるとＴリンパ球およびＢリンパ球の
活性化はさらに促進される。現在の免疫賦活剤は、免疫
担当細胞を非特異的に活性化することにより、微生物感
染、腫瘍に対する生体の防御機構を高めているが、有効
性において満足しうるものは少なくまた、これらの免疫
賦活剤は、単独で免疫担当細胞を活性化するため、生体
にとって好ましくない免疫応答を誘導し、種々のアレル
ギー反応の増悪をはじめとする副作用を引き起こす。
ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御
に重要な役割を果しており、その主要な機構は、Ｔリン
パ球およびＢリンパ球が、これらの微生物や腫瘍を、抗
原受容体を介して認識することにより刺激を受け、抗原
特異的に活性化し、これらの異物を排除する能力を高め
ることである。常に微生物に曝され、また、細胞が変異
している生体内では、こうしたＴリンパ球およびＢリン
パ球の活性化は常時起こっている。また、抗原特異的な
活性化の他に、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の活性化に
は、菌体成分やレクチン等を認識する受容体を介する抗
原非特異的な活性化がある。抗原特異的および抗原非特
異的のいずれの活性化においても、他からの刺激、すな
わち、共刺激が加わるとＴリンパ球およびＢリンパ球の
活性化はさらに促進される。現在の免疫賦活剤は、免疫
担当細胞を非特異的に活性化することにより、微生物感
染、腫瘍に対する生体の防御機構を高めているが、有効
性において満足しうるものは少なくまた、これらの免疫
賦活剤は、単独で免疫担当細胞を活性化するため、生体
にとって好ましくない免疫応答を誘導し、種々のアレル
ギー反応の増悪をはじめとする副作用を引き起こす。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、免疫賦活作
用が高く、さらに他の免疫賦活物質と併用することによ
り、より強い免疫賦活作用を示し、副作用がなく食品の
他、飼料および餌料にも利用可能な免疫賦活剤を提供す
ることを目的とする。
用が高く、さらに他の免疫賦活物質と併用することによ
り、より強い免疫賦活作用を示し、副作用がなく食品の
他、飼料および餌料にも利用可能な免疫賦活剤を提供す
ることを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、糖類およ
び免疫に関する研究を進める上で、直鎖のβ−１,３グ
ルカンが、リンパ球共刺激作用を示すことを見いだし
た。かかるβ−１,３グルカンは、抗原受容体を介す
る刺激により活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球
の活性をさらに上昇させ、また、菌体成分あるいはレ
クチンを認識する受容体を介する刺激により抗原非特異
的に活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球の活性を
さらに上昇させた。しかし、β−１,３グルカン単独
ではＴリンパ球およびＢリンパ球をほとんど活性化しな
かった。かくして、β−１,３グルカンは、抗原受容体
を介するＴリンパ球およびＢリンパ球の活性化を上昇さ
せることから、生体内で常時起こっている、微生物およ
び腫瘍細胞に対する排除反応を高め、単独でＴリンパ球
およびＢリンパ球を活性しないことから、生体にとって
好ましくない免疫応答を誘導せず、抗原非特異的なＴリ
ンパ球およびＢリンパ球の活性化上昇させることから、
他の免疫賦活剤との併用が有効であり、β−１,３グル
カンが、副作用がなく常用に適した免疫賦活剤であるこ
とを見いだし、本発明を完成するに至った。
び免疫に関する研究を進める上で、直鎖のβ−１,３グ
ルカンが、リンパ球共刺激作用を示すことを見いだし
た。かかるβ−１,３グルカンは、抗原受容体を介す
る刺激により活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球
の活性をさらに上昇させ、また、菌体成分あるいはレ
クチンを認識する受容体を介する刺激により抗原非特異
的に活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球の活性を
さらに上昇させた。しかし、β−１,３グルカン単独
ではＴリンパ球およびＢリンパ球をほとんど活性化しな
かった。かくして、β−１,３グルカンは、抗原受容体
を介するＴリンパ球およびＢリンパ球の活性化を上昇さ
せることから、生体内で常時起こっている、微生物およ
び腫瘍細胞に対する排除反応を高め、単独でＴリンパ球
およびＢリンパ球を活性しないことから、生体にとって
好ましくない免疫応答を誘導せず、抗原非特異的なＴリ
ンパ球およびＢリンパ球の活性化上昇させることから、
他の免疫賦活剤との併用が有効であり、β−１,３グル
カンが、副作用がなく常用に適した免疫賦活剤であるこ
とを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、β−１,３−グルコ
シド結合からなる直鎖の糖類を有効成分とする免疫賦活
剤を提供するものである。用いるβ−１,３−グルコシ
ド結合からなる直鎖の糖類としては、カードラン加水分
解物が挙げられる。特に、酸加水分解物、とりわけ蟻酸
加水分解物またはβ−１,３−グルカナーゼのような酵
素による加水分解物で、数平均分子量が３４０〜４００
０の範囲のものが好ましい。本発明の免疫賦活剤は、副
作用がなく、常用に適しており、免疫力を高めるための
医薬はもとより、食品にも利用できる。
シド結合からなる直鎖の糖類を有効成分とする免疫賦活
剤を提供するものである。用いるβ−１,３−グルコシ
ド結合からなる直鎖の糖類としては、カードラン加水分
解物が挙げられる。特に、酸加水分解物、とりわけ蟻酸
加水分解物またはβ−１,３−グルカナーゼのような酵
素による加水分解物で、数平均分子量が３４０〜４００
０の範囲のものが好ましい。本発明の免疫賦活剤は、副
作用がなく、常用に適しており、免疫力を高めるための
医薬はもとより、食品にも利用できる。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の免疫賦活剤の有効成分で
あるβ−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類と
しては、グルコース分子が分岐せずに、β−１,３−グ
ルコシド結合により結合したオリゴ糖ないしは多糖であ
り、代表的な例としては、アルカリゲネス（Alkaligene
s）属又はアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細
菌が産生する、β−１,３−グルコシド結合を有する多
糖類であるカードランの加水分解物が挙げられる。以
下、カードランの加水分解物を例として本発明を説明す
る。カードランの加水分解物は、自体公知の多糖類の加
水分解法により調製できるが、得られる加水分解物の免
疫賦活活性から、蟻酸、酢酸のような有機酸、塩酸、硫
酸のような無機酸、特に、蟻酸あるいはβ−１,３−グ
ルカナーゼのような酵素で行うことが好ましく、数平均
分子量が、３４０〜４０００の範囲のものが好ましい。
あるβ−１,３−グルコシド結合からなる直鎖の糖類と
しては、グルコース分子が分岐せずに、β−１,３−グ
ルコシド結合により結合したオリゴ糖ないしは多糖であ
り、代表的な例としては、アルカリゲネス（Alkaligene
s）属又はアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細
菌が産生する、β−１,３−グルコシド結合を有する多
糖類であるカードランの加水分解物が挙げられる。以
下、カードランの加水分解物を例として本発明を説明す
る。カードランの加水分解物は、自体公知の多糖類の加
水分解法により調製できるが、得られる加水分解物の免
疫賦活活性から、蟻酸、酢酸のような有機酸、塩酸、硫
酸のような無機酸、特に、蟻酸あるいはβ−１,３−グ
ルカナーゼのような酵素で行うことが好ましく、数平均
分子量が、３４０〜４０００の範囲のものが好ましい。
【０００７】本明細書における数平均分子量は、以下の
条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により
測定したものである。測定装置としては、東ソー（株）
製の高速液体クロマトグラフィー装置を使用した。 検出器：ＲＩ−８０２２ ポンプ：ＣＣＰＭ−ＩＩ カラムオーブン：ＣＯ−８０２０ 脱気装置：ＳＤ−８０２２ オートサンプラー：ＡＳ−８０２０ 測定カラムは、ＴＳＫゲルのカラム（Ｇ−ＯＬＩＧＯ−
ＰＷまたはＧ−３０００ＰＷＸＬ、７.８φmm×３０c
m）を用い、流速０.６〜０.７ml／分、温度４０℃で測
定した。試料の０.０２％水溶液を調製し、その２００
μlを用いた。溶出は純水で行った。一方、分子量既知
のプルラン標準品を同様に測定して較正曲線を作成し、
この較正曲線を基に、東ソー（株）ＧＰＣ−ＬＡＬＬＳ
プログラムとマイクロソフト（株）の計算プログラム
「エクセル」によって分子量分布関数を求め、数平均分
子量として算出した。
条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により
測定したものである。測定装置としては、東ソー（株）
製の高速液体クロマトグラフィー装置を使用した。 検出器：ＲＩ−８０２２ ポンプ：ＣＣＰＭ−ＩＩ カラムオーブン：ＣＯ−８０２０ 脱気装置：ＳＤ−８０２２ オートサンプラー：ＡＳ−８０２０ 測定カラムは、ＴＳＫゲルのカラム（Ｇ−ＯＬＩＧＯ−
ＰＷまたはＧ−３０００ＰＷＸＬ、７.８φmm×３０c
m）を用い、流速０.６〜０.７ml／分、温度４０℃で測
定した。試料の０.０２％水溶液を調製し、その２００
μlを用いた。溶出は純水で行った。一方、分子量既知
のプルラン標準品を同様に測定して較正曲線を作成し、
この較正曲線を基に、東ソー（株）ＧＰＣ−ＬＡＬＬＳ
プログラムとマイクロソフト（株）の計算プログラム
「エクセル」によって分子量分布関数を求め、数平均分
子量として算出した。
【０００８】酸加水分解は、例えば、１〜８５重量％程
度の酸を含有するカードランの０.５〜５.０重量％水溶
液を、７０〜１００℃にて１０分〜３時間加熱すること
により行うことができる。加水分解反応液を水酸化ナト
リウム等のアルカリ剤で中和し、遠心分離して上澄を
得、必要に応じて活性炭処理、透析、溶媒分画、加熱に
よるホルミル基の除去等の自体公知の方法で精製するこ
とにより、所望の加水分解物が得られる。酵素による加
水分解は、例えば、用いる酵素に適したpＨ、温度で所
定時間、カードランの０.５〜３重量％水溶液を酵素処
理することにより行うことができる。ついで、酵素を失
活させた後、遠心分離して上澄を得、必要に応じて活性
炭処理、透析、溶媒分画等の自体公知の方法で精製する
ことにより、所望の加水分解物が得られる。
度の酸を含有するカードランの０.５〜５.０重量％水溶
液を、７０〜１００℃にて１０分〜３時間加熱すること
により行うことができる。加水分解反応液を水酸化ナト
リウム等のアルカリ剤で中和し、遠心分離して上澄を
得、必要に応じて活性炭処理、透析、溶媒分画、加熱に
よるホルミル基の除去等の自体公知の方法で精製するこ
とにより、所望の加水分解物が得られる。酵素による加
水分解は、例えば、用いる酵素に適したpＨ、温度で所
定時間、カードランの０.５〜３重量％水溶液を酵素処
理することにより行うことができる。ついで、酵素を失
活させた後、遠心分離して上澄を得、必要に応じて活性
炭処理、透析、溶媒分画等の自体公知の方法で精製する
ことにより、所望の加水分解物が得られる。
【０００９】得られたカードラン加水分解物は、液体ま
たは固体の状態で、そのまま本発明の免疫賦活剤として
使用できる。また、自体公知の医薬担体または賦形剤あ
るいは食品、飼料、餌料や、それら各々の成分と自体公
知の方法で合して、免疫力を高める医薬、食品、飼料お
よび餌料とすることができる。用いる、医薬担体または
賦形剤あるいは食品、飼料、餌料や、各々の成分は特に
限定するものではなく、当該免疫賦活剤の具体的用途に
応じて当業者が適宜選択できる。また、免疫賦活剤の形
態も特に限定する物ではなく、具体的用途に応じて、種
々の固体や液体の形態とすることができる。本発明の免
疫賦活剤は、医薬として用いる場合、経口投与、非経口
投与いずれでもよく、その投与量は、カードラン加水分
解物の固形分量として１日当たり４mg〜４０gである。
本発明の免疫賦活剤を食品として用いる場合、調味料、
畜肉加工品、水産加工品、農産加工品、ステープル、調
味食品、調理済食品、デザート類、乳油製品、菓子、ス
ナック菓子等の形態で提供することも可能である。
たは固体の状態で、そのまま本発明の免疫賦活剤として
使用できる。また、自体公知の医薬担体または賦形剤あ
るいは食品、飼料、餌料や、それら各々の成分と自体公
知の方法で合して、免疫力を高める医薬、食品、飼料お
よび餌料とすることができる。用いる、医薬担体または
賦形剤あるいは食品、飼料、餌料や、各々の成分は特に
限定するものではなく、当該免疫賦活剤の具体的用途に
応じて当業者が適宜選択できる。また、免疫賦活剤の形
態も特に限定する物ではなく、具体的用途に応じて、種
々の固体や液体の形態とすることができる。本発明の免
疫賦活剤は、医薬として用いる場合、経口投与、非経口
投与いずれでもよく、その投与量は、カードラン加水分
解物の固形分量として１日当たり４mg〜４０gである。
本発明の免疫賦活剤を食品として用いる場合、調味料、
畜肉加工品、水産加工品、農産加工品、ステープル、調
味食品、調理済食品、デザート類、乳油製品、菓子、ス
ナック菓子等の形態で提供することも可能である。
【００１０】
【実施例】つぎに、実施例および試験例を挙げて、本発
明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限
定されるものではない。 実施例１ 酵素によるカードラン加水分解物の調製 カードラン４gを０.０５Ｍ酢酸緩衝液２００mlに分散
し、ヒイロタケ酵素１８ユニット／mlを添加した。これ
を４０℃に昇温し、４時間インキュベートした後沸騰水
浴中に１５分間保持して酵素を失活させた。ついで、冷
却、遠心分離して沈澱部分を除去し、上澄を直径５cmの
高さ３０cmのカラムに詰めた活性炭に吸着させ、１００
０mlの水で洗浄後、さらに４％エタノール２０００mlで
洗浄した。ついで、２０％エタノール２０００mlで吸着
成分を溶出し、これをエバポレーターで濃縮した後、凍
結乾燥した。このものはＨＰＬＣで測定したときの数平
均分子量が３４０（プルラン換算値）であり、そのまま
本発明の免疫賦活剤として使用できるものであった。
明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限
定されるものではない。 実施例１ 酵素によるカードラン加水分解物の調製 カードラン４gを０.０５Ｍ酢酸緩衝液２００mlに分散
し、ヒイロタケ酵素１８ユニット／mlを添加した。これ
を４０℃に昇温し、４時間インキュベートした後沸騰水
浴中に１５分間保持して酵素を失活させた。ついで、冷
却、遠心分離して沈澱部分を除去し、上澄を直径５cmの
高さ３０cmのカラムに詰めた活性炭に吸着させ、１００
０mlの水で洗浄後、さらに４％エタノール２０００mlで
洗浄した。ついで、２０％エタノール２０００mlで吸着
成分を溶出し、これをエバポレーターで濃縮した後、凍
結乾燥した。このものはＨＰＬＣで測定したときの数平
均分子量が３４０（プルラン換算値）であり、そのまま
本発明の免疫賦活剤として使用できるものであった。
【００１１】実施例２ 蟻酸によるカードラン加水分解物の調製 カードラン３０グラムを８５％蟻酸３０００ml中に分散
し、９０℃まで加温して２０分間保持した。ついで、容
器ごと冷水にさらして室温まで冷却し、エバポレーター
で濃縮した後、５Ｎ ＮaＯＨで中和してpＨ７とし、遠
心分離した。上澄はホルミル基を除去するため沸騰水浴
中で１２０分間加熱したが、このとき、pＨが低下した
ので、２Ｎ ＮaＯＨを添加して７に戻した。このものを
ビスキングチューブ中にいれ純水１０リットルに対して
一夜透析し、透析内液を凍結乾燥した。このものをＨＰ
ＬＣで測定したときの数平均分子量はプルラン換算で約
２８００であり、そのまま本発明の免疫賦活剤として使
用できるものであった。
し、９０℃まで加温して２０分間保持した。ついで、容
器ごと冷水にさらして室温まで冷却し、エバポレーター
で濃縮した後、５Ｎ ＮaＯＨで中和してpＨ７とし、遠
心分離した。上澄はホルミル基を除去するため沸騰水浴
中で１２０分間加熱したが、このとき、pＨが低下した
ので、２Ｎ ＮaＯＨを添加して７に戻した。このものを
ビスキングチューブ中にいれ純水１０リットルに対して
一夜透析し、透析内液を凍結乾燥した。このものをＨＰ
ＬＣで測定したときの数平均分子量はプルラン換算で約
２８００であり、そのまま本発明の免疫賦活剤として使
用できるものであった。
【００１２】試験例１ 実施例１で得たカードラン酵素分解物および実施例２で
得たカードラン蟻酸分解物を用いて、マウス脾臓リンパ
球の抗原受容体を介する増殖反応に対するカードラン酵
素分解物、カードラン蟻酸分解物のリンパ球共刺激効果
を検証した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、８週齢）か
ら無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾
臓を押しつぶし、２００メッシュの節に通し脾臓細胞浮
遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装
置により測定した後、細胞数を１×１０7／mlの濃度に
ＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレー
ト１穴当たり５０マイクロリットルを播種した。抗マウ
スイムノグロブリンＭ（anti−ＩgＭ）を２００マイク
ログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した
液、あるいはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴当
たり５０マイクロリットル播種した脾臓細胞浮遊液に加
えて、Ｂリンパ球刺激群、無刺激群とした。Ｔリンパ球
刺激群は、細胞播種前に、抗マウスＣＤ３抗体（anti−
ＣＤ３）を１０マイクログラム／mlの濃度でほう酸緩衝
液に溶解した液を１穴当たり１００マイクロリットル加
え３７℃で３時間放置し、anti−ＣＤ３を各穴に付着さ
せ、３時間後に各穴をＲＰＭl １６４０培地で洗浄後、
ＲＰＭＩ１６４０培地を１穴当たり５０マイクロリット
ル加えた穴に、細胞を播種した。
得たカードラン蟻酸分解物を用いて、マウス脾臓リンパ
球の抗原受容体を介する増殖反応に対するカードラン酵
素分解物、カードラン蟻酸分解物のリンパ球共刺激効果
を検証した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、８週齢）か
ら無菌的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾
臓を押しつぶし、２００メッシュの節に通し脾臓細胞浮
遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装
置により測定した後、細胞数を１×１０7／mlの濃度に
ＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレー
ト１穴当たり５０マイクロリットルを播種した。抗マウ
スイムノグロブリンＭ（anti−ＩgＭ）を２００マイク
ログラム／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した
液、あるいはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴当
たり５０マイクロリットル播種した脾臓細胞浮遊液に加
えて、Ｂリンパ球刺激群、無刺激群とした。Ｔリンパ球
刺激群は、細胞播種前に、抗マウスＣＤ３抗体（anti−
ＣＤ３）を１０マイクログラム／mlの濃度でほう酸緩衝
液に溶解した液を１穴当たり１００マイクロリットル加
え３７℃で３時間放置し、anti−ＣＤ３を各穴に付着さ
せ、３時間後に各穴をＲＰＭl １６４０培地で洗浄後、
ＲＰＭＩ１６４０培地を１穴当たり５０マイクロリット
ル加えた穴に、細胞を播種した。
【００１３】この３群にＲＰＭＩ１６４０培地（対照）
あるいはカードラン酵素分解物を１mg／mlの濃度でＲＰ
ＭＩ１６４０培地に溶解した液、カードラン蟻酸分解物
を１mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液
をそれぞれ１穴当たり１００マイクロリットル加え、３
７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間培養した。培養を
終わる３時間前に臭化３−（４,５−ジメチル−２−チ
アゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム
を５mg／mlの濃度でＲＰＭl １６４０培地に溶解した液
を１穴当たり１０マイクロリットル加え、培養終了時に
２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり５０マ
イクロリットル加え、３７℃で１日放置後、脾臓細胞の
増殖反応をマイクロプレートリーダーで培養液の吸光度
５５０nmを測定することにより求めた。表１にその結果
を示す。
あるいはカードラン酵素分解物を１mg／mlの濃度でＲＰ
ＭＩ１６４０培地に溶解した液、カードラン蟻酸分解物
を１mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液
をそれぞれ１穴当たり１００マイクロリットル加え、３
７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間培養した。培養を
終わる３時間前に臭化３−（４,５−ジメチル−２−チ
アゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム
を５mg／mlの濃度でＲＰＭl １６４０培地に溶解した液
を１穴当たり１０マイクロリットル加え、培養終了時に
２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり５０マ
イクロリットル加え、３７℃で１日放置後、脾臓細胞の
増殖反応をマイクロプレートリーダーで培養液の吸光度
５５０nmを測定することにより求めた。表１にその結果
を示す。
【００１４】
【表１】
【００１５】カードラン酵素分解物、カードラン蟻酸分
解物は抗原受容体を介したＴリンパ球増殖反応およびＢ
リンパ球増殖反応を強力に促進し、カードラン酵素分解
物、カードラン蟻酸分解物の抗原受容体を介したリンパ
球増殖に対する共刺激効果が認められた。また、カード
ラン酵素分解物、カードラン蟻酸分解物は単独ではほと
んどリンパ球増殖反応を促進しなかった。
解物は抗原受容体を介したＴリンパ球増殖反応およびＢ
リンパ球増殖反応を強力に促進し、カードラン酵素分解
物、カードラン蟻酸分解物の抗原受容体を介したリンパ
球増殖に対する共刺激効果が認められた。また、カード
ラン酵素分解物、カードラン蟻酸分解物は単独ではほと
んどリンパ球増殖反応を促進しなかった。
【００１６】試験例２ 実施例１および２で得られたカードラン酵素分解物およ
びカードラン蟻酸分解物を用いて、マウス脾臓リンパ球
抗原非特異的増殖反応に対するカードラン酵素分解物お
よびカードラン蟻酸分解物のリンパ球共刺激効果を検証
した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、８週齢）から無菌
的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾臓を押
しつぶし、２００メッシュの節に通し脾臓細胞浮遊液を
得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置によ
り測定した後、細胞数を１×１０7／mlの濃度にＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレート１穴
当たり５０マイクロリットルを播種した。Ｔリンパ球増
殖刺激物質のコンカナバリンＡ（ＣonＡ）を８マイクロ
グラム／mlの濃度でＲＰＭl １６４０培地に溶解した
液、Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッカライド
（ＬＰＳ）を２００マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭ
Ｉ１６４０培地に溶解した液を、それぞれ１穴当たり５
０マイクロリットル播種した脾臓細胞浮遊液に加えて、
Ｔリンパ球刺激群、Ｂリンパ球刺激群とした。
びカードラン蟻酸分解物を用いて、マウス脾臓リンパ球
抗原非特異的増殖反応に対するカードラン酵素分解物お
よびカードラン蟻酸分解物のリンパ球共刺激効果を検証
した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、８週齢）から無菌
的に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で脾臓を押
しつぶし、２００メッシュの節に通し脾臓細胞浮遊液を
得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置によ
り測定した後、細胞数を１×１０7／mlの濃度にＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレート１穴
当たり５０マイクロリットルを播種した。Ｔリンパ球増
殖刺激物質のコンカナバリンＡ（ＣonＡ）を８マイクロ
グラム／mlの濃度でＲＰＭl １６４０培地に溶解した
液、Ｂリンパ球増殖刺激物質のリポポリサッカライド
（ＬＰＳ）を２００マイクログラム／mlの濃度でＲＰＭ
Ｉ１６４０培地に溶解した液を、それぞれ１穴当たり５
０マイクロリットル播種した脾臓細胞浮遊液に加えて、
Ｔリンパ球刺激群、Ｂリンパ球刺激群とした。
【００１７】この２群にＲＰＭＩ１６４０培地（対照）
あるいはカードラン酵素分解物を１mg／mlの濃度でＲＰ
ＭＩ１６４０培地に溶解した液、カードラン蟻酸分解物
を１mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培養に溶解した液
をそれぞれ１穴当たり１００マイクロリットル加え、３
７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間培養した。培養を
終わる３時間前に臭化３−（４,５−ジメチル−２−チ
アゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム
を５mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液
を１穴当たり１０マイクロリットル加え、培養終了時に
２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり５０マ
イクロリットル加え、３７℃で１日放置後、脾臓細胞の
増殖反応をマイクロプレートリーダーで培養液の吸光度
５５０nmを測定することにより求めた。表２にその結果
を示す。
あるいはカードラン酵素分解物を１mg／mlの濃度でＲＰ
ＭＩ１６４０培地に溶解した液、カードラン蟻酸分解物
を１mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培養に溶解した液
をそれぞれ１穴当たり１００マイクロリットル加え、３
７℃の５％炭酸ガス培養器内で２日間培養した。培養を
終わる３時間前に臭化３−（４,５−ジメチル−２−チ
アゾリル）−２,５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム
を５mg／mlの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した液
を１穴当たり１０マイクロリットル加え、培養終了時に
２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１穴当たり５０マ
イクロリットル加え、３７℃で１日放置後、脾臓細胞の
増殖反応をマイクロプレートリーダーで培養液の吸光度
５５０nmを測定することにより求めた。表２にその結果
を示す。
【００１８】
【表２】
【００１９】カードラン酵素分解物、カードラン蟻酸分
解物は抗原非特異的なＴリンパ球増殖反応および抗原非
特異的なＢリンパ球増殖反応を促進し、カードラン酵素
分解物、カードラン蟻酸分解物の抗原非特異的リンパ球
活性化に対する共刺激効果が認められた。
解物は抗原非特異的なＴリンパ球増殖反応および抗原非
特異的なＢリンパ球増殖反応を促進し、カードラン酵素
分解物、カードラン蟻酸分解物の抗原非特異的リンパ球
活性化に対する共刺激効果が認められた。
【００２０】試験例３ 本試験例では、実施例１で得られたカードラン酵素分解
物を用いて、マウスの免疫応答反応におけるカードラン
酵素分解物の抗体産生促進作用を試験した。１５週齢、
雌性のＣ５７ＢＬ／６マウス（１群６匹）に、生理食塩
水で２×１０8／ｍｌに調製した羊赤血球溶液をマウス
１匹当たり０.５ｍｌ腹腔内投与し、マウスを羊赤血球
で一次免疫した。一次免疫の３日後に生理食塩水で２×
１０9／ｍｌに調製した羊赤血球溶液をマウス１匹当た
り５０μｌ足蹠内投与し、マウスを羊赤血球で二次免疫
した。二次免疫の４日後にマウスの眼底静脈から採血
し、血漿を分離し、抗羊赤血球ＩｇＭ抗体価および抗羊
赤血球ＩｇＧ抗体価をエンザイムイムノアッセイにより
測定した。カードラン酵素分解物は、羊赤血球の一次免
疫当日から連続して５日間毎日、カードラン酵素分解物
を２０ｍｇ／ｍｌの濃度に生理食塩水で調製した溶液を
マウス１匹当たり０.５ｍｌ腹腔内投与した。対照群に
は同様のスケジュールで生理食塩水をマウス１匹当たり
０.５ｍｌ腹腔内投与した。
物を用いて、マウスの免疫応答反応におけるカードラン
酵素分解物の抗体産生促進作用を試験した。１５週齢、
雌性のＣ５７ＢＬ／６マウス（１群６匹）に、生理食塩
水で２×１０8／ｍｌに調製した羊赤血球溶液をマウス
１匹当たり０.５ｍｌ腹腔内投与し、マウスを羊赤血球
で一次免疫した。一次免疫の３日後に生理食塩水で２×
１０9／ｍｌに調製した羊赤血球溶液をマウス１匹当た
り５０μｌ足蹠内投与し、マウスを羊赤血球で二次免疫
した。二次免疫の４日後にマウスの眼底静脈から採血
し、血漿を分離し、抗羊赤血球ＩｇＭ抗体価および抗羊
赤血球ＩｇＧ抗体価をエンザイムイムノアッセイにより
測定した。カードラン酵素分解物は、羊赤血球の一次免
疫当日から連続して５日間毎日、カードラン酵素分解物
を２０ｍｇ／ｍｌの濃度に生理食塩水で調製した溶液を
マウス１匹当たり０.５ｍｌ腹腔内投与した。対照群に
は同様のスケジュールで生理食塩水をマウス１匹当たり
０.５ｍｌ腹腔内投与した。
【００２１】エンザイムイムノアッセイは、羊赤血球を
ホウ酸緩衝液で１×１０8／ｍｌに調製した溶液を、９
６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え５℃で
３日間放置し羊赤血球を各穴に付着させたプレートを用
いて行った。分離した血漿をウシ血清アルブミンを１％
含有するホウ酸緩衝液で１０倍希釈し１穴当たり５０μ
ｌ加え室温で９０分間放置し、血漿の抗羊赤血球抗体を
プレートに付着した羊赤血球と結合させた。洗浄後、ペ
ルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＭ抗体あるいは
抗マウスＩｇＧｌ抗体を加え、プレートに結合させた抗
羊赤血球抗体のＩｇＭ抗体あるいはＩｇＧｌ抗体に結合
させた。洗浄後、過酸化水素０.００６％とオルトフェ
ニレンジアミン０.１％を含有するリン酸緩衝液を１穴
当たり１００μｌ加え３７℃で３０分間反応させ、反応
を１.５Ｎ硫酸で停止し、マイクロプレートリーダーで
吸光度４９２ｎｍを測定することにより血漿抗羊赤血球
ＩｇＭ抗体価あるいはＩｇＧｌ抗体価を求めた。その結
果を表３に示す。
ホウ酸緩衝液で１×１０8／ｍｌに調製した溶液を、９
６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え５℃で
３日間放置し羊赤血球を各穴に付着させたプレートを用
いて行った。分離した血漿をウシ血清アルブミンを１％
含有するホウ酸緩衝液で１０倍希釈し１穴当たり５０μ
ｌ加え室温で９０分間放置し、血漿の抗羊赤血球抗体を
プレートに付着した羊赤血球と結合させた。洗浄後、ペ
ルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＭ抗体あるいは
抗マウスＩｇＧｌ抗体を加え、プレートに結合させた抗
羊赤血球抗体のＩｇＭ抗体あるいはＩｇＧｌ抗体に結合
させた。洗浄後、過酸化水素０.００６％とオルトフェ
ニレンジアミン０.１％を含有するリン酸緩衝液を１穴
当たり１００μｌ加え３７℃で３０分間反応させ、反応
を１.５Ｎ硫酸で停止し、マイクロプレートリーダーで
吸光度４９２ｎｍを測定することにより血漿抗羊赤血球
ＩｇＭ抗体価あるいはＩｇＧｌ抗体価を求めた。その結
果を表３に示す。
【００２２】
【表３】
【００２３】表３から明らかなごとく、カードラン酵素
分解物を投与したマウスの血漿抗羊赤血球ＩｇＭ抗体価
あるいはＩｇＧｌ抗体価はカードラン酵素分解物の投与
により上昇した。カードラン酵素分解物は、Ｔリンパ球
に依存しないＢリンパ球のＩｇＭ抗体産生およびＴリン
パ球に依存したＢリンパ球のＩｇＧｌ抗体産生のいずれ
も上昇させたことから、カードラン酵素分解物のＢリン
パ球賦活作用およびＴリンパ球賦活作用が認められた。
分解物を投与したマウスの血漿抗羊赤血球ＩｇＭ抗体価
あるいはＩｇＧｌ抗体価はカードラン酵素分解物の投与
により上昇した。カードラン酵素分解物は、Ｔリンパ球
に依存しないＢリンパ球のＩｇＭ抗体産生およびＴリン
パ球に依存したＢリンパ球のＩｇＧｌ抗体産生のいずれ
も上昇させたことから、カードラン酵素分解物のＢリン
パ球賦活作用およびＴリンパ球賦活作用が認められた。
【００２４】
【発明の効果】本発明によれば、免疫賦活作用が高く、
他の免疫賦活物質と併用することにより、より強い免疫
賦活作用を示し、副作用がなく、医薬はもとより、食品
の他飼料・餌料にも利用できる免疫賦活剤が提供され
る。
他の免疫賦活物質と併用することにより、より強い免疫
賦活作用を示し、副作用がなく、医薬はもとより、食品
の他飼料・餌料にも利用できる免疫賦活剤が提供され
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 日下 博昭 兵庫県宝塚市安倉南３丁目３番１−202号
Claims (7)
- 【請求項１】 β−１,３−グルコシド結合からなる直
鎖の糖類を有効成分とする免疫賦活剤。 - 【請求項２】 β−１,３−グルコシド結合からなる直
鎖の糖類がカードラン加水分解物である請求項１記載の
免疫賦活剤。 - 【請求項３】 加水分解物が酸加水分解物である請求項
２記載の免疫賦活剤。 - 【請求項４】 酸加水分解に使用する酸が蟻酸である請
求項３記載の免疫賦活剤。 - 【請求項５】 加水分解物がβ−１,３−グルカナーゼ
による加水分解物である請求項２記載の免疫賦活剤。 - 【請求項６】 β−１,３−グルコシド結合からなる直
鎖の糖類の数平均分子量が３４０から４０００の範囲に
ある請求項１〜５いずれか１項記載の免疫賦活剤。 - 【請求項７】 免疫賦活作用がリンパ球共刺激作用であ
る請求項１〜６いずれか１項記載の免疫賦活剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00651997A JP4091136B2 (ja) | 1997-01-17 | 1997-01-17 | 免疫賦活剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00651997A JP4091136B2 (ja) | 1997-01-17 | 1997-01-17 | 免疫賦活剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10194977A true JPH10194977A (ja) | 1998-07-28 |
| JP4091136B2 JP4091136B2 (ja) | 2008-05-28 |
Family
ID=11640652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00651997A Expired - Lifetime JP4091136B2 (ja) | 1997-01-17 | 1997-01-17 | 免疫賦活剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4091136B2 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10309281A1 (de) * | 2003-03-04 | 2004-09-23 | Satia Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines beta-1,3-Glukans mit verbesserten Eigenschaften |
| JP2009148206A (ja) * | 2007-12-20 | 2009-07-09 | Kirin Food-Tech Co Ltd | 樹状細胞活性化用組成物 |
| WO2009068996A3 (en) * | 2007-11-26 | 2009-12-23 | Novartis Ag | Conjugated beta-1,3-linked glucans |
| WO2015053354A1 (ja) | 2013-10-09 | 2015-04-16 | 東レ株式会社 | 免疫賦活化剤 |
| JP2016094586A (ja) * | 2014-11-07 | 2016-05-26 | Ｍｃフードスペシャリティーズ株式会社 | 改質カードラン増粘多糖類 |
| JP2021028322A (ja) * | 2019-08-09 | 2021-02-25 | 国立大学法人東京農工大学 | 生活習慣病予防または改善用組成物 |
| KR20220105355A (ko) * | 2021-01-20 | 2022-07-27 | 전남대학교산학협력단 | 베타글루칸 가수분해물을 포함하는 면역 기능 증진용 식품 조성물 및 이의 제조방법 |
| JP2022537533A (ja) * | 2019-06-14 | 2022-08-26 | 正大制▲薬▼（青▲島▼）有限公司 | β－グルカン組成物およびその用途 |
-
1997
- 1997-01-17 JP JP00651997A patent/JP4091136B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10309281A1 (de) * | 2003-03-04 | 2004-09-23 | Satia Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines beta-1,3-Glukans mit verbesserten Eigenschaften |
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| US9439954B2 (en) | 2007-11-26 | 2016-09-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Conjugated beta-1,3-linked glucans |
| US9439955B2 (en) | 2007-11-26 | 2016-09-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Conjugated β-1,3-linked glucans |
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| KR20160060072A (ko) | 2013-10-09 | 2016-05-27 | 도레이 카부시키가이샤 | 면역 부활화제 |
| WO2015053354A1 (ja) | 2013-10-09 | 2015-04-16 | 東レ株式会社 | 免疫賦活化剤 |
| JPWO2015053354A1 (ja) * | 2013-10-09 | 2017-03-09 | 東レ株式会社 | 免疫賦活化剤 |
| US10556004B2 (en) | 2013-10-09 | 2020-02-11 | Toray Industries, Inc. | Immunopotentiator |
| JP2016094586A (ja) * | 2014-11-07 | 2016-05-26 | Ｍｃフードスペシャリティーズ株式会社 | 改質カードラン増粘多糖類 |
| JP2022537533A (ja) * | 2019-06-14 | 2022-08-26 | 正大制▲薬▼（青▲島▼）有限公司 | β－グルカン組成物およびその用途 |
| US12533373B2 (en) | 2019-06-14 | 2026-01-27 | Qingdao Conson Pharmaceutical Co., Ltd. | β-glucan composition and use therefor |
| JP2021028322A (ja) * | 2019-08-09 | 2021-02-25 | 国立大学法人東京農工大学 | 生活習慣病予防または改善用組成物 |
| KR20220105355A (ko) * | 2021-01-20 | 2022-07-27 | 전남대학교산학협력단 | 베타글루칸 가수분해물을 포함하는 면역 기능 증진용 식품 조성물 및 이의 제조방법 |
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