JPH10201488A - ヒトミオトロフィンクローン、ｈｓａｂｈ０１ - Google Patents
ヒトミオトロフィンクローン、ｈｓａｂｈ０１Info
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- JPH10201488A JPH10201488A JP9351918A JP35191897A JPH10201488A JP H10201488 A JPH10201488 A JP H10201488A JP 9351918 A JP9351918 A JP 9351918A JP 35191897 A JP35191897 A JP 35191897A JP H10201488 A JPH10201488 A JP H10201488A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒト・ミオトロフィン遺伝子の修飾が細胞性
肥大に関する機能不全または疾患の予防、改善または修
正において役割を果たしうる、該遺伝子の同定および特
徴付けが望まれている。 【解決手段】 本発明は、（ａ）配列番号１からなる
ポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を
有するポリヌクレオチド；（ｂ）遺伝暗号の重複性によ
り、配列番号２と同じアミノ酸をコードするポリヌクレ
オチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド
に対して相補性のポリヌクレオチド；および（ｄ）
（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドの少な
くとも連続した１５塩基からなるポリヌクレオチドから
なる群より選択されるメンバーからなる単離ポリヌクレ
オチドを提供するものである。
肥大に関する機能不全または疾患の予防、改善または修
正において役割を果たしうる、該遺伝子の同定および特
徴付けが望まれている。 【解決手段】 本発明は、（ａ）配列番号１からなる
ポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を
有するポリヌクレオチド；（ｂ）遺伝暗号の重複性によ
り、配列番号２と同じアミノ酸をコードするポリヌクレ
オチド；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド
に対して相補性のポリヌクレオチド；および（ｄ）
（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドの少な
くとも連続した１５塩基からなるポリヌクレオチドから
なる群より選択されるメンバーからなる単離ポリヌクレ
オチドを提供するものである。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一部には、新規同
定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；お
よびポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびそれ
らの変種および誘導体の製造方法；ポリペプチドのアゴ
ニストおよびアンタゴニスト；ならびにポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびア
ンタゴニストの使用に関する。詳細には、これらおよび
他の点において、本発明は、以下、本明細書で「ＨＳＡ
ＢＨ０１」と称する、ヒト・ミオトロフィンのポリヌク
レオチドに関する。
定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；お
よびポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびそれ
らの変種および誘導体の製造方法；ポリペプチドのアゴ
ニストおよびアンタゴニスト；ならびにポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよびア
ンタゴニストの使用に関する。詳細には、これらおよび
他の点において、本発明は、以下、本明細書で「ＨＳＡ
ＢＨ０１」と称する、ヒト・ミオトロフィンのポリヌク
レオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】ミオトロフィンは、自発性高血圧ラット
の肥大化心臓および膨張した心筋症のヒト心臓より単離
された可溶性１２キロダルトンのタンパク質である。培
養液中に維持された新生児ラットの筋細胞に加えた場
合、ミオトロフィンは心筋細胞増殖を促進し、筋線維分
節および細隙結合形成の数を増加させる［Senら、J.Bio
l.Chem. ２６５：１６６３５−１６６４３（１９９
０）］。ミオトロフィン遺伝子はラットの種々の組織に
て発現される［Sivasubramanianら、J.Biol.Chem. ２７
１（５）：２８１２−２８１６（１９９６）］。転写物
は、他の組織と比較して脳で最も豊富に存在し、骨格筋
で最も少ないことが判明した。その偏在性に基づき、ミ
オトロフィンタンパク質は種々の組織の基本的機能にて
重要な役割を果たしているかもしれないと示唆されてい
る［Sivasubramanianら、J.Biol.Chem. ２７１（５）：
２８１２−２８１６（１９９６）］。
の肥大化心臓および膨張した心筋症のヒト心臓より単離
された可溶性１２キロダルトンのタンパク質である。培
養液中に維持された新生児ラットの筋細胞に加えた場
合、ミオトロフィンは心筋細胞増殖を促進し、筋線維分
節および細隙結合形成の数を増加させる［Senら、J.Bio
l.Chem. ２６５：１６６３５−１６６４３（１９９
０）］。ミオトロフィン遺伝子はラットの種々の組織に
て発現される［Sivasubramanianら、J.Biol.Chem. ２７
１（５）：２８１２−２８１６（１９９６）］。転写物
は、他の組織と比較して脳で最も豊富に存在し、骨格筋
で最も少ないことが判明した。その偏在性に基づき、ミ
オトロフィンタンパク質は種々の組織の基本的機能にて
重要な役割を果たしているかもしれないと示唆されてい
る［Sivasubramanianら、J.Biol.Chem. ２７１（５）：
２８１２−２８１６（１９９６）］。
【０００３】ラットミオトロフィンタンパク質の一次構
造を分析することで、ミオトロフィンのアンキリン繰返
し体の一と、ＩkＢα／ｒｅｌアンキリン繰返し体の間
の相同性が明らかにされた［Sivasubramanianら、J.Bio
l.Chem. ２７１（５）：２８１２−２８１６（１９９
６）］。推定コンセンサスリン酸化部位が、ミオトロフ
ィンタンパク質にてタンパク質キナーゼCおよびカゼイ
ンキナーゼIIについて同定され、さらにＩｋＢαタンパ
ク質においても観察された。これら相同性の有意性は、
組換えミオトロフィンがＮＦ−ｋＢ／ｒｅｌタンパク質
と相互反応する能力を有することを明らかにするゲルシ
フト分析によりインビトロにて確認された［Sivasubram
anianら、J.Biol.Chem. ２７１（５）：２８１２−２８
１６（１９９６）］。
造を分析することで、ミオトロフィンのアンキリン繰返
し体の一と、ＩkＢα／ｒｅｌアンキリン繰返し体の間
の相同性が明らかにされた［Sivasubramanianら、J.Bio
l.Chem. ２７１（５）：２８１２−２８１６（１９９
６）］。推定コンセンサスリン酸化部位が、ミオトロフ
ィンタンパク質にてタンパク質キナーゼCおよびカゼイ
ンキナーゼIIについて同定され、さらにＩｋＢαタンパ
ク質においても観察された。これら相同性の有意性は、
組換えミオトロフィンがＮＦ−ｋＢ／ｒｅｌタンパク質
と相互反応する能力を有することを明らかにするゲルシ
フト分析によりインビトロにて確認された［Sivasubram
anianら、J.Biol.Chem. ２７１（５）：２８１２−２８
１６（１９９６）］。
【０００４】ＮＦ−ｋＢ／ｒｅｌタンパク質が、その遺
伝子産物が免疫応答、炎症および細胞増殖に重要である
遺伝子の迅速な誘導に関与していることが明らかにされ
た。ＮＦ−ｋＢは、細胞外シグナルに応じて細胞質より
核中に速やかに転座される。ミオトロフィンはこの迅速
な応答システムの構成要素であり、心筋層および他の組
織における肥大特異的遺伝子の発現の調節に関与してい
るかもしれないと考えられる。ヒト・ミオトロフィン遺
伝子の制御が、細胞肥大に関与する機能障害または疾患
の予防、改善または修正にて役割を有するかもしれな
い、ヒト・ミオトロフィン遺伝子の同定および特徴付け
に対する要求があるのは明らかである。
伝子産物が免疫応答、炎症および細胞増殖に重要である
遺伝子の迅速な誘導に関与していることが明らかにされ
た。ＮＦ−ｋＢは、細胞外シグナルに応じて細胞質より
核中に速やかに転座される。ミオトロフィンはこの迅速
な応答システムの構成要素であり、心筋層および他の組
織における肥大特異的遺伝子の発現の調節に関与してい
るかもしれないと考えられる。ヒト・ミオトロフィン遺
伝子の制御が、細胞肥大に関与する機能障害または疾患
の予防、改善または修正にて役割を有するかもしれな
い、ヒト・ミオトロフィン遺伝子の同定および特徴付け
に対する要求があるのは明らかである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】これらの目的および他
の目的に対して、とりわけ、新規なヒト・ミオトロフィ
ンと同定され、またＨＳＡＢＨ０１によりコードされる
ポリペプチドまたはタンパク質と称される、ポリペプチ
ドを提供することが本発明の目的である。さらに、ヒト
・ミオトロフィンをコードするポリヌクレオチドを提供
することも本発明の目的である。
の目的に対して、とりわけ、新規なヒト・ミオトロフィ
ンと同定され、またＨＳＡＢＨ０１によりコードされる
ポリペプチドまたはタンパク質と称される、ポリペプチ
ドを提供することが本発明の目的である。さらに、ヒト
・ミオトロフィンをコードするポリヌクレオチドを提供
することも本発明の目的である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明のこの態様の特に
好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、図１お
よび２に示す配列のヒト・ミオトロフィン配列をコード
する領域を含んでなる。本発明のこの態様によれば、ｍ
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびフラグメントを
含め、ヒト・ミオトロフィンをコードする単離核酸分子
が提供され、本発明のこの態様のさらなる具体例におい
て、生物学的、診断上、臨床上または治療上有用な、変
種、アナログおよび誘導体のフラグメントを含め、その
変種、アナログまたは誘導体が提供される。本発明のこ
の態様の特に好ましい具体例には、天然のヒト・ミオト
ロフィンの対立遺伝子変種がある。
好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、図１お
よび２に示す配列のヒト・ミオトロフィン配列をコード
する領域を含んでなる。本発明のこの態様によれば、ｍ
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびフラグメントを
含め、ヒト・ミオトロフィンをコードする単離核酸分子
が提供され、本発明のこの態様のさらなる具体例におい
て、生物学的、診断上、臨床上または治療上有用な、変
種、アナログおよび誘導体のフラグメントを含め、その
変種、アナログまたは誘導体が提供される。本発明のこ
の態様の特に好ましい具体例には、天然のヒト・ミオト
ロフィンの対立遺伝子変種がある。
【０００７】本発明の別の態様によれば、本発明のポリ
ヌクレオチドに結合し、その発現を誘発または阻害する
化合物をスクリーニングする方法が提供される。本発明
のもう一つの目的は、上記したポリペプチド、ポリペプ
チドフラグメント、変種および誘導体、該変種および誘
導体のフラグメント、ならびに上記のアナログの製造方
法を提供することである。本発明のこの態様の好ましい
具体例において、宿主でのヒト・ミオトロフィンの発現
のための条件下で、外来性のヒト・ミオトロフィンをコ
ードするポリヌクレオチドを細胞中に発現可能な状態で
組み込んだ宿主細胞を培養し；ついで、発現したポリペ
プチドを回収することからなるヒト・ミオトロフィンポ
リペプチドの製造方法が提供される。好ましい具体例に
おいて、ミオトロフィンをコードするポリヌクレオチド
がＨＳＡＢＨ０１である。本発明のもう一つ別の目的に
よれば、とりわけ、研究的、生物学的、臨床的および治
療的な目的に、前記したポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドを利用する生成物、組成物、プロセスおよび方法
が提供される。
ヌクレオチドに結合し、その発現を誘発または阻害する
化合物をスクリーニングする方法が提供される。本発明
のもう一つの目的は、上記したポリペプチド、ポリペプ
チドフラグメント、変種および誘導体、該変種および誘
導体のフラグメント、ならびに上記のアナログの製造方
法を提供することである。本発明のこの態様の好ましい
具体例において、宿主でのヒト・ミオトロフィンの発現
のための条件下で、外来性のヒト・ミオトロフィンをコ
ードするポリヌクレオチドを細胞中に発現可能な状態で
組み込んだ宿主細胞を培養し；ついで、発現したポリペ
プチドを回収することからなるヒト・ミオトロフィンポ
リペプチドの製造方法が提供される。好ましい具体例に
おいて、ミオトロフィンをコードするポリヌクレオチド
がＨＳＡＢＨ０１である。本発明のもう一つ別の目的に
よれば、とりわけ、研究的、生物学的、臨床的および治
療的な目的に、前記したポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドを利用する生成物、組成物、プロセスおよび方法
が提供される。
【０００８】本発明のこの態様のある好ましい具体例に
よれば、とりわけ、ヒト・ミオトロフィンポリペプチド
またはヒト・ミオトロフィンをコードするｍＲＮＡを測
定することにより、細胞でのヒト・ミオトロフィン発現
を評価し；ヒト・ミオトロフィン遺伝子における欠失な
どの遺伝的変異および異常を分析し；ヒト・ミオトロフ
ィンポリペプチドまたはそれによりコードされるポリヌ
クレオチドを生体に投与し、ミオトロフィン機能を改善
し、あるいはミオトロフィン機能不全を治療する、生成
物、組成物および方法が提供される。本発明のさらにも
う一つ別の具体例によれば、ミオトロフィンの発現不足
に関連した症状の治療のために、そのような活性化合物
を用いて、本発明のヒト・ミオトロフィン遺伝子の発現
を刺激する方法が提供される。本発明のもう一つ別の態
様によれば、かかる阻害化合物を用いて、ヒト・ミオト
ロフィンの過剰発現に付随する症状を治療する方法が提
供される。
よれば、とりわけ、ヒト・ミオトロフィンポリペプチド
またはヒト・ミオトロフィンをコードするｍＲＮＡを測
定することにより、細胞でのヒト・ミオトロフィン発現
を評価し；ヒト・ミオトロフィン遺伝子における欠失な
どの遺伝的変異および異常を分析し；ヒト・ミオトロフ
ィンポリペプチドまたはそれによりコードされるポリヌ
クレオチドを生体に投与し、ミオトロフィン機能を改善
し、あるいはミオトロフィン機能不全を治療する、生成
物、組成物および方法が提供される。本発明のさらにも
う一つ別の具体例によれば、ミオトロフィンの発現不足
に関連した症状の治療のために、そのような活性化合物
を用いて、本発明のヒト・ミオトロフィン遺伝子の発現
を刺激する方法が提供される。本発明のもう一つ別の態
様によれば、かかる阻害化合物を用いて、ヒト・ミオト
ロフィンの過剰発現に付随する症状を治療する方法が提
供される。
【０００９】本発明のさらにもう一つ別の態様によれ
ば、タンパク質のＩｋＢファミリーに相同的である、ミ
オトロフィンの少なくとも一つのアンキリン繰返し体の
同種アミノ酸置換を有する、フラグメント、共通フラグ
メントおよび／または配列である、ＨＳＡＢＨ０１また
はそのフラグメントでコードされる非天然の合成、単離
および／または組換えポリペプチドが提供される。本発
明のさらにもう一つ別の態様によれば、リガンドに結合
すること、またはその予期される生物学的特性のために
リガンド結合を変調させることによって、ヒト・ミオト
ロフィン機能の潜在的モジュレーターとして有用であり
うる合成または組換えヒト・ミオトロフィンポリペピチ
ド、その同種置換および誘導体、それに対する抗体、お
よび抗イディオタイプ抗体が提供される。これらの組成
物は診断、治療および／または研究用途に使用すること
ができる。
ば、タンパク質のＩｋＢファミリーに相同的である、ミ
オトロフィンの少なくとも一つのアンキリン繰返し体の
同種アミノ酸置換を有する、フラグメント、共通フラグ
メントおよび／または配列である、ＨＳＡＢＨ０１また
はそのフラグメントでコードされる非天然の合成、単離
および／または組換えポリペプチドが提供される。本発
明のさらにもう一つ別の態様によれば、リガンドに結合
すること、またはその予期される生物学的特性のために
リガンド結合を変調させることによって、ヒト・ミオト
ロフィン機能の潜在的モジュレーターとして有用であり
うる合成または組換えヒト・ミオトロフィンポリペピチ
ド、その同種置換および誘導体、それに対する抗体、お
よび抗イディオタイプ抗体が提供される。これらの組成
物は診断、治療および／または研究用途に使用すること
ができる。
【００１０】本発明のさらにもう一つ別の目的は、ヒト
・ミオトロフィンを阻害または模倣するように設計され
た、合成、単離または組換えポリペプチドまたはそのフ
ラグメントを提供することである。本発明のこの態様ま
たは他の態様の好ましい具体例によれば、ヒト・ミオト
ロフィン配列にハイブリダイズするプローブが提供され
る。本発明のこの態様のさらなる好ましい具体例におい
て、ＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプチドま
たはそのフラグメントに対する抗体が提供される。本発
明のもう一つ別の態様によれば、ヒト・ミオトロフィン
アゴニストが提供される。好ましいアゴニストには、ヒ
ト・ミオトロフィンを模倣し、ミオトロフィン誘発応答
を惹起または増大させる分子がある。
・ミオトロフィンを阻害または模倣するように設計され
た、合成、単離または組換えポリペプチドまたはそのフ
ラグメントを提供することである。本発明のこの態様ま
たは他の態様の好ましい具体例によれば、ヒト・ミオト
ロフィン配列にハイブリダイズするプローブが提供され
る。本発明のこの態様のさらなる好ましい具体例におい
て、ＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプチドま
たはそのフラグメントに対する抗体が提供される。本発
明のもう一つ別の態様によれば、ヒト・ミオトロフィン
アゴニストが提供される。好ましいアゴニストには、ヒ
ト・ミオトロフィンを模倣し、ミオトロフィン誘発応答
を惹起または増大させる分子がある。
【００１１】本発明のさらにもう一つ別の態様によれ
ば、ヒト・ミオトロフィンアンタゴニストが提供され
る。好ましいアンタゴニストには、本発明のヒト・ミオ
トロフィン遺伝子の発現を阻害するものがある。さら
に、好ましいアンタゴニストには、ヒト・ミオトロフィ
ンの１またはそれ以上の効果を阻害するように、ＨＳＡ
ＢＨ０１によりコードされるヒト・ミオトロフィンと結
合するか、または相互作用する分子がある。本発明のさ
らなる態様において、インビトロで細胞に、エクスビボ
で細胞に、そしてインビボで細胞に、あるいは多細胞生
物に投与するための、ＨＳＡＢＨ０１によりコードされ
るヒト・ミオトロフィンポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドあるいはそのフラグメントからなる組成物が提供
される。本発明のこの態様の特に好ましい具体例におい
て、組成物は、疾患の治療に関する宿主生物中でヒト・
ミオトロフィンポリペプチドを発現させるためのＨＳＡ
ＢＨ０１ポリヌクレオチドを含んでなる。この点におい
て、ミオトロフィンの異常内因性活性に付随する機能不
全の治療に関するヒト患者における発現が特に好まし
い。
ば、ヒト・ミオトロフィンアンタゴニストが提供され
る。好ましいアンタゴニストには、本発明のヒト・ミオ
トロフィン遺伝子の発現を阻害するものがある。さら
に、好ましいアンタゴニストには、ヒト・ミオトロフィ
ンの１またはそれ以上の効果を阻害するように、ＨＳＡ
ＢＨ０１によりコードされるヒト・ミオトロフィンと結
合するか、または相互作用する分子がある。本発明のさ
らなる態様において、インビトロで細胞に、エクスビボ
で細胞に、そしてインビボで細胞に、あるいは多細胞生
物に投与するための、ＨＳＡＢＨ０１によりコードされ
るヒト・ミオトロフィンポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドあるいはそのフラグメントからなる組成物が提供
される。本発明のこの態様の特に好ましい具体例におい
て、組成物は、疾患の治療に関する宿主生物中でヒト・
ミオトロフィンポリペプチドを発現させるためのＨＳＡ
ＢＨ０１ポリヌクレオチドを含んでなる。この点におい
て、ミオトロフィンの異常内因性活性に付随する機能不
全の治療に関するヒト患者における発現が特に好まし
い。
【００１２】本発明の他の目的、特徴、利点および態様
は、以下の説明から当業者に明らかとなるであろう。し
かしながら、以下の説明および特定の実施例は、本発明
の好ましい具体例を示すものであり、単なる説明にすぎ
ないことが理解されるであろう。開示された本発明の精
神および観点内での種々の変更および修飾は、以下の説
明を読むこと、本開示の他の部分を読むことにより、当
業者に容易に明らかとなるであろう。
は、以下の説明から当業者に明らかとなるであろう。し
かしながら、以下の説明および特定の実施例は、本発明
の好ましい具体例を示すものであり、単なる説明にすぎ
ないことが理解されるであろう。開示された本発明の精
神および観点内での種々の変更および修飾は、以下の説
明を読むこと、本開示の他の部分を読むことにより、当
業者に容易に明らかとなるであろう。
【００１３】
定義 以下に例示する説明は、本明細書、特に実施例において
頻繁に用いられるある単語の理解を容易にするために提
供されるものである。説明は簡便性のために提供される
のであって、本発明を限定するものではない。ＤＮＡの
「消化」は、ＤＮＡのある配列でのみ作用する制限酵素
などの酵素を用いるＤＮＡの触媒的分裂をいうが、これ
に限定されるものではない。本明細書にいう種々の制限
酵素は市販されており、その反応条件、補因子および使
用についての他の要件は知られており、当業者にとって
慣用的である。解析を目的とする場合、典型的には、１
μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０
μｌの反応緩衝液中、約２ユニットの酵素で消化する。
プラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する
ことを目的とする場合、典型的には５ないし５０μｇの
ＤＮＡを、比例して大きくした容量中、２０ないし２５
０ユニットの酵素で消化する。
頻繁に用いられるある単語の理解を容易にするために提
供されるものである。説明は簡便性のために提供される
のであって、本発明を限定するものではない。ＤＮＡの
「消化」は、ＤＮＡのある配列でのみ作用する制限酵素
などの酵素を用いるＤＮＡの触媒的分裂をいうが、これ
に限定されるものではない。本明細書にいう種々の制限
酵素は市販されており、その反応条件、補因子および使
用についての他の要件は知られており、当業者にとって
慣用的である。解析を目的とする場合、典型的には、１
μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０
μｌの反応緩衝液中、約２ユニットの酵素で消化する。
プラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する
ことを目的とする場合、典型的には５ないし５０μｇの
ＤＮＡを、比例して大きくした容量中、２０ないし２５
０ユニットの酵素で消化する。
【００１４】個々の制限酵素についての適当な緩衝液お
よび基質の量は、以下に述べるような標準的実験室マニ
ュアルに記載されており、それらは供給者によって詳説
されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、条件は、標準的方法、供給者の
指示および反応の詳細な条件に従って変えることができ
る。消化後、当業者に慣用的な周知方法を用いて、反応
物を解析し、フラグメントをアガロースまたはポリアク
リルアミドゲルを介する電気泳動によって精製してもよ
い。「遺伝的因子」は、一般に、ポリペプチドをコード
する領域あるいは複製、転写もしくは翻訳または宿主細
胞におけるポリペプチドの発現に重要な他のプロセスを
調節する領域を含んでなるポリヌクレオチド、あるいは
ポリペプチドをコードする領域、およびそれに作動可能
に連結された、発現を調節する領域の両方を含んでなる
ポリヌクレオチドを意味する。遺伝的因子は、エピソー
ム因子として、即ち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立
した分子として複製されるベクター内に取り込まれてい
てもよい。それらは、真核細胞において、メトトレキセ
ート選択によるトランスフェクトされたＤＮＡの増幅の
間に生じるミニ染色体のようなものの中に取り込まれて
いてもよい。遺伝的因子は、宿主細胞ゲノム内に取り込
まれていてもよいが、それは天然の状態ではなく、むし
ろ、単離、クローニングおよび、とりわけ精製ＤＮＡの
形態の、またはベクターでの宿主細胞への導入などの操
作の後のものである。
よび基質の量は、以下に述べるような標準的実験室マニ
ュアルに記載されており、それらは供給者によって詳説
されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、条件は、標準的方法、供給者の
指示および反応の詳細な条件に従って変えることができ
る。消化後、当業者に慣用的な周知方法を用いて、反応
物を解析し、フラグメントをアガロースまたはポリアク
リルアミドゲルを介する電気泳動によって精製してもよ
い。「遺伝的因子」は、一般に、ポリペプチドをコード
する領域あるいは複製、転写もしくは翻訳または宿主細
胞におけるポリペプチドの発現に重要な他のプロセスを
調節する領域を含んでなるポリヌクレオチド、あるいは
ポリペプチドをコードする領域、およびそれに作動可能
に連結された、発現を調節する領域の両方を含んでなる
ポリヌクレオチドを意味する。遺伝的因子は、エピソー
ム因子として、即ち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立
した分子として複製されるベクター内に取り込まれてい
てもよい。それらは、真核細胞において、メトトレキセ
ート選択によるトランスフェクトされたＤＮＡの増幅の
間に生じるミニ染色体のようなものの中に取り込まれて
いてもよい。遺伝的因子は、宿主細胞ゲノム内に取り込
まれていてもよいが、それは天然の状態ではなく、むし
ろ、単離、クローニングおよび、とりわけ精製ＤＮＡの
形態の、またはベクターでの宿主細胞への導入などの操
作の後のものである。
【００１５】「単離」とは、「人工的」にその天然状態
から変えられること、すなわち、天然物の場合、その本
来的な環境から変化または除去されること、あるいはそ
の両方を意味する。例えば、その自然状態にある生存動
物に自然に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは「単離」されていないが、その天然状態で共
存物質から分離されている同じポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書で用いる用語としての「単
離」である。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単
離という語は、それが天然に存在している染色体および
細胞から分離されていることを意味する。単離の際に、
あるいは単離後に、かかるポリヌクレオチドを、例え
ば、突然変異を誘発し、融合タンパク質を形成するため
に、および宿主中での増殖または発現のために、ＤＮＡ
などの他のポリヌクレオチドに結合させることができ
る。単独で、またはベクターなどの他のポリヌクレオチ
ドと結合した単離ポリヌクレオチドを、培養中または完
全生物における宿主細胞に導入することができる。培養
中または完全生物における宿主細胞へ導入される場合、
かかるＤＮＡは、その語を本明細書において用いる場
合、やはり単離されている。というのも、それらは天然
の形態でなく、あるいは自然環境にあるものではないか
らである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドは、培地などの組成物、処方、ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの、例えば細胞への導入のための溶液、
例えば、天然に存在しない組成物であり、その中に本明
細書で用いる場合の用語としての意味としての単離ポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを保持する、化学反応
または酵素反応のための組成物または溶液中に存在して
もよい。
から変えられること、すなわち、天然物の場合、その本
来的な環境から変化または除去されること、あるいはそ
の両方を意味する。例えば、その自然状態にある生存動
物に自然に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは「単離」されていないが、その天然状態で共
存物質から分離されている同じポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書で用いる用語としての「単
離」である。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単
離という語は、それが天然に存在している染色体および
細胞から分離されていることを意味する。単離の際に、
あるいは単離後に、かかるポリヌクレオチドを、例え
ば、突然変異を誘発し、融合タンパク質を形成するため
に、および宿主中での増殖または発現のために、ＤＮＡ
などの他のポリヌクレオチドに結合させることができ
る。単独で、またはベクターなどの他のポリヌクレオチ
ドと結合した単離ポリヌクレオチドを、培養中または完
全生物における宿主細胞に導入することができる。培養
中または完全生物における宿主細胞へ導入される場合、
かかるＤＮＡは、その語を本明細書において用いる場
合、やはり単離されている。というのも、それらは天然
の形態でなく、あるいは自然環境にあるものではないか
らである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドは、培地などの組成物、処方、ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの、例えば細胞への導入のための溶液、
例えば、天然に存在しない組成物であり、その中に本明
細書で用いる場合の用語としての意味としての単離ポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを保持する、化学反応
または酵素反応のための組成物または溶液中に存在して
もよい。
【００１６】「ライゲーション」とは、ほとんどの場
合、２本鎖ＤＮＡである２個またはそれ以上のポリヌク
レオチドの間でホスホジエステル結合を形成するプロセ
スをいう。ライゲーションの方法は当該分野においてよ
く知られており、ライゲーションについてのプロトコル
は標準的実験室マニュアル、および例えば、Sambrook
ら、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL，第２
版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spri
ng Harbor，New York，(1989) （以下、Sambrookらとい
う）などの文献に記載されている。「オリゴヌクレオチ
ド」とは比較的短いポリヌクレオチドをいう。しばし
ば、その用語は１本鎖デオキシリボヌクレオチドをいう
が、同様に、とりわけ、１本鎖または２本鎖リボヌクレ
オチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび２本鎖ＤＮ
Ａをいうこともできる。１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌ
クレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、自動式オリゴ
ヌクレオチド合成機の使用のごとき、化学的方法により
合成されることがよくある。しかしながら、オリゴヌク
レオチドは、インビトロ組換えＤＮＡ媒介法、細胞およ
び生物におけるＤＮＡ発現による方法を含め、他の種々
の方法により製造することができる。
合、２本鎖ＤＮＡである２個またはそれ以上のポリヌク
レオチドの間でホスホジエステル結合を形成するプロセ
スをいう。ライゲーションの方法は当該分野においてよ
く知られており、ライゲーションについてのプロトコル
は標準的実験室マニュアル、および例えば、Sambrook
ら、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL，第２
版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spri
ng Harbor，New York，(1989) （以下、Sambrookらとい
う）などの文献に記載されている。「オリゴヌクレオチ
ド」とは比較的短いポリヌクレオチドをいう。しばし
ば、その用語は１本鎖デオキシリボヌクレオチドをいう
が、同様に、とりわけ、１本鎖または２本鎖リボヌクレ
オチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび２本鎖ＤＮ
Ａをいうこともできる。１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌ
クレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、自動式オリゴ
ヌクレオチド合成機の使用のごとき、化学的方法により
合成されることがよくある。しかしながら、オリゴヌク
レオチドは、インビトロ組換えＤＮＡ媒介法、細胞およ
び生物におけるＤＮＡ発現による方法を含め、他の種々
の方法により製造することができる。
【００１７】最初、化学的に合成されたＤＮＡは、典型
的には、５’リン酸を欠く状態で得られる。かかるオリ
ゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ分子を形成
するために典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用す
るライゲーション反応によるホスホジエステル結合形成
の基質ではない。かかるオリゴヌクレオチドのライゲー
ションが望ましい場合、キナーゼおよびＡＴＰを用いる
ような標準的方法によりリン酸を付加することができ
る。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの３’末端
は、一般に、遊離のヒドロキシル基を有し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼなどのリガーゼの存在下、別のオリゴヌクレオ
チドなどの、別のポリヌクレオチドの５’リン酸とホス
ホジエステル結合を容易に形成するであろう。よく知ら
れているように、要すれば、ライゲーションの前に他の
ポリヌクレオチド（複数でも可）の５’リン酸を除去す
ることによって、この反応を選択的に阻害できる。
的には、５’リン酸を欠く状態で得られる。かかるオリ
ゴヌクレオチドの５’末端は、組換えＤＮＡ分子を形成
するために典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを使用す
るライゲーション反応によるホスホジエステル結合形成
の基質ではない。かかるオリゴヌクレオチドのライゲー
ションが望ましい場合、キナーゼおよびＡＴＰを用いる
ような標準的方法によりリン酸を付加することができ
る。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの３’末端
は、一般に、遊離のヒドロキシル基を有し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼなどのリガーゼの存在下、別のオリゴヌクレオ
チドなどの、別のポリヌクレオチドの５’リン酸とホス
ホジエステル結合を容易に形成するであろう。よく知ら
れているように、要すれば、ライゲーションの前に他の
ポリヌクレオチド（複数でも可）の５’リン酸を除去す
ることによって、この反応を選択的に阻害できる。
【００１８】「プラスミド」は、宿主細胞の染色体の一
部ではなく、安定して受け継がれる遺伝的因子である。
プラスミドはＤＮＡまたはＲＮＡからなり、直鎖または
環状であってもよい。プラスミドは細胞複製の間にその
複製および安定な遺伝性を確実にする分子をコードして
おり、医学的、農学的、および環境学的に非常に重要な
産物をコードするかもしれない。例えば、プラスミドは
病原菌の毒性を非常に増加させる毒素をコードする。プ
ラスミドはまた抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を
コードすることもできる。プラスミドは、組換え遺伝子
をクローン化および発現するために用いられるベクター
として分子生物学において広く使用されている。プラス
ミドは、一般に、当業者が使いなれた標準的な命名操作
に従い、本明細書では、小文字「ｐ」を前置し、および
／またはつづいて大文字および／または数字で表す。本
明細書に開示されている出発プラスミドは、市販され、
公的に入手可能であるか、または周知の公開された方法
を慣用的に適用することにより利用可能なプラスミドか
ら構築され得る。本発明に従い使用され得る多くのプラ
スミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは、
よく知られており、当業者に容易に利用され得る。さら
に、当業者であれば、本発明での使用に適したかなり多
数の他のプラスミドでも容易に構築し得る。本発明にお
ける、かかるプラスミドならびに他のベクターの特性、
構築および用途は、当業者であれば本明細書から容易に
理解できるはずである。
部ではなく、安定して受け継がれる遺伝的因子である。
プラスミドはＤＮＡまたはＲＮＡからなり、直鎖または
環状であってもよい。プラスミドは細胞複製の間にその
複製および安定な遺伝性を確実にする分子をコードして
おり、医学的、農学的、および環境学的に非常に重要な
産物をコードするかもしれない。例えば、プラスミドは
病原菌の毒性を非常に増加させる毒素をコードする。プ
ラスミドはまた抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を
コードすることもできる。プラスミドは、組換え遺伝子
をクローン化および発現するために用いられるベクター
として分子生物学において広く使用されている。プラス
ミドは、一般に、当業者が使いなれた標準的な命名操作
に従い、本明細書では、小文字「ｐ」を前置し、および
／またはつづいて大文字および／または数字で表す。本
明細書に開示されている出発プラスミドは、市販され、
公的に入手可能であるか、または周知の公開された方法
を慣用的に適用することにより利用可能なプラスミドか
ら構築され得る。本発明に従い使用され得る多くのプラ
スミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは、
よく知られており、当業者に容易に利用され得る。さら
に、当業者であれば、本発明での使用に適したかなり多
数の他のプラスミドでも容易に構築し得る。本発明にお
ける、かかるプラスミドならびに他のベクターの特性、
構築および用途は、当業者であれば本明細書から容易に
理解できるはずである。
【００１９】「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、
一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボ
ヌクレオチドを包含し、それらは非修飾ＲＮＡもしくは
ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。す
なわち、例えば、本明細書で使用されているポリヌクレ
オチドは、とりわけ、１本および２本鎖ＤＮＡ、１本お
よび２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本または２本
鎖ＲＮＡ、および１本および２本鎖領域の混合物である
ＲＮＡ、１本鎖またはより典型的には２本鎖、または１
本および２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲ
ＮＡを含むハイブリッド分子をいう。加えて、本明細書
で使用されているポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤ
ＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる３本鎖領
域をいう。かかる領域の鎖は同じ分子または異なる分子
に由来していてもよい。これらの領域は１個またはそれ
以上の分子の全てを含み得るが、より典型的には幾つか
の分子の一領域のみを含み得る。３重らせん領域の分子
の一つは、オリゴヌクレオチドであることがしばしばで
ある。
一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボ
ヌクレオチドを包含し、それらは非修飾ＲＮＡもしくは
ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。す
なわち、例えば、本明細書で使用されているポリヌクレ
オチドは、とりわけ、１本および２本鎖ＤＮＡ、１本お
よび２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本または２本
鎖ＲＮＡ、および１本および２本鎖領域の混合物である
ＲＮＡ、１本鎖またはより典型的には２本鎖、または１
本および２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲ
ＮＡを含むハイブリッド分子をいう。加えて、本明細書
で使用されているポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤ
ＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方からなる３本鎖領
域をいう。かかる領域の鎖は同じ分子または異なる分子
に由来していてもよい。これらの領域は１個またはそれ
以上の分子の全てを含み得るが、より典型的には幾つか
の分子の一領域のみを含み得る。３重らせん領域の分子
の一つは、オリゴヌクレオチドであることがしばしばで
ある。
【００２０】本明細書で使用されている、「ポリヌクレ
オチド」の語は、１個またはそれ以上の修飾塩基を含有
する上記のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。すなわち、
バックボーンが安定性またはその他の理由で修飾された
ＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書で意図するところの
「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの
普通でない塩基、またはトリチル化塩基などの修飾塩基
を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、２例しか挙げていない
が、本明細書で使用するところのポリヌクレオチドであ
る。当業者に周知の多くの有用な目的に役立つ非常に多
様な修飾がＤＮＡまたはＲＮＡに対してなされているこ
とは明らかであろう。ここで使用されているポリヌクレ
オチドの語は、ポリヌクレオチドのそうした化学的、酵
素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルス
および特に単純型および複雑型細胞を含む細胞に特有の
ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
オチド」の語は、１個またはそれ以上の修飾塩基を含有
する上記のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。すなわち、
バックボーンが安定性またはその他の理由で修飾された
ＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書で意図するところの
「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの
普通でない塩基、またはトリチル化塩基などの修飾塩基
を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、２例しか挙げていない
が、本明細書で使用するところのポリヌクレオチドであ
る。当業者に周知の多くの有用な目的に役立つ非常に多
様な修飾がＤＮＡまたはＲＮＡに対してなされているこ
とは明らかであろう。ここで使用されているポリヌクレ
オチドの語は、ポリヌクレオチドのそうした化学的、酵
素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルス
および特に単純型および複雑型細胞を含む細胞に特有の
ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００２１】本明細書で使用されている「ポリペプチ
ド」は、下記のポリペプチド全てを包含する。ポリペプ
チドの基本的構造はよく知られており、当該分野におけ
る多数のテキストブックおよび他の刊行物に既に記載さ
れている。この点からすると、この語は、本明細書中、
ペプチド結合により直鎖で互いに結合された２個または
それ以上のアミノ酸からなるペプチドまたはタンパク質
をいうものとして使用されている。本明細書で使用され
ている、この語はまた、一般に当該分野で、例えばペプ
チド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと称されている
短鎖、および一般に当該分野でタンパク質と称され、そ
の多くのタイプが存在している長鎖の両方を包含する。
ポリペプチドは、２０天然アミノ酸として一般に称され
る２０アミノ酸以外のアミノ酸を含むことが多く、末端
アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、所定のポリペプチド
において、自然プロセス、例えばプロセッシングおよび
他の翻訳後修飾、または当該分野で公知の化学的修飾技
術により修飾されていてもよい。ポリペプチドにて自然
に生じる一般的修飾でさえ、多すぎるためここで余すと
ころ無く列挙することはできないが、それらは基本的な
テキストおよび詳細な研究論文ならびに多量の研究文献
に詳述されており、当業者にはよく知られている。
ド」は、下記のポリペプチド全てを包含する。ポリペプ
チドの基本的構造はよく知られており、当該分野におけ
る多数のテキストブックおよび他の刊行物に既に記載さ
れている。この点からすると、この語は、本明細書中、
ペプチド結合により直鎖で互いに結合された２個または
それ以上のアミノ酸からなるペプチドまたはタンパク質
をいうものとして使用されている。本明細書で使用され
ている、この語はまた、一般に当該分野で、例えばペプ
チド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと称されている
短鎖、および一般に当該分野でタンパク質と称され、そ
の多くのタイプが存在している長鎖の両方を包含する。
ポリペプチドは、２０天然アミノ酸として一般に称され
る２０アミノ酸以外のアミノ酸を含むことが多く、末端
アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、所定のポリペプチド
において、自然プロセス、例えばプロセッシングおよび
他の翻訳後修飾、または当該分野で公知の化学的修飾技
術により修飾されていてもよい。ポリペプチドにて自然
に生じる一般的修飾でさえ、多すぎるためここで余すと
ころ無く列挙することはできないが、それらは基本的な
テキストおよび詳細な研究論文ならびに多量の研究文献
に詳述されており、当業者にはよく知られている。
【００２２】本発明のポリペプチドにあってもよい既知
修飾には、例を挙げれば、アセチル化、アシル化、ＡＤ
Ｐ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム
部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導
体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホス
ホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、閉環、ジ
スルフィド結合形成、脱メチル化、共有交差結合の形
成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミ
ル化、ガンマ−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リ
ン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化などの、転移ＲＮＡ媒介のタンパク質
へのアミノ酸付加およびユビキチン化がある。
修飾には、例を挙げれば、アセチル化、アシル化、ＡＤ
Ｐ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム
部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導
体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホス
ホチジルイノシトールの共有結合、交差結合、閉環、ジ
スルフィド結合形成、脱メチル化、共有交差結合の形
成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミ
ル化、ガンマ−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアン
カー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リ
ン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化などの、転移ＲＮＡ媒介のタンパク質
へのアミノ酸付加およびユビキチン化がある。
【００２３】かかる修飾は、当業者に周知であり、科学
文献に非常に詳細に記載されている。例えば、いくつか
の特に一般的な修飾、すなわち、糖鎖形成、脂質結合、
硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、
ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化が、例えば、
PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES、第２
版、Ｔ.Ｅ.Ｃreighton，Ｗ.Ｈ.Ｆreeman and Ｃompan
y、ニューヨーク（１９９３）などの最も基本的なテキ
ストに記載されている。この題目に関して、例えば、Ｗ
old,Ｆ.、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION O
F PROTEINS、「翻訳後タンパク質修飾：展望および予
想」、１−１２頁、Ｂ.Ｃ.Ｊohnson編、アカデミック・
プレス、ニューヨーク（１９８３）；Ｓeifterら、「タ
ンパク質修飾および非タンパク質コファクターについて
の分析」、Meth.Ｅnzymol. １８２：６２６−６４６
（１９９０）およびＲattanら、「タンパク質合成：翻
訳後修飾およびエージング」、Ann.N.Y.Acad.Sci.，６
６３：４８−６２（１９９２）で提供されるような、多
くの詳細な報文を利用することができる。
文献に非常に詳細に記載されている。例えば、いくつか
の特に一般的な修飾、すなわち、糖鎖形成、脂質結合、
硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、
ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化が、例えば、
PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES、第２
版、Ｔ.Ｅ.Ｃreighton，Ｗ.Ｈ.Ｆreeman and Ｃompan
y、ニューヨーク（１９９３）などの最も基本的なテキ
ストに記載されている。この題目に関して、例えば、Ｗ
old,Ｆ.、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION O
F PROTEINS、「翻訳後タンパク質修飾：展望および予
想」、１−１２頁、Ｂ.Ｃ.Ｊohnson編、アカデミック・
プレス、ニューヨーク（１９８３）；Ｓeifterら、「タ
ンパク質修飾および非タンパク質コファクターについて
の分析」、Meth.Ｅnzymol. １８２：６２６−６４６
（１９９０）およびＲattanら、「タンパク質合成：翻
訳後修飾およびエージング」、Ann.N.Y.Acad.Sci.，６
６３：４８−６２（１９９２）で提供されるような、多
くの詳細な報文を利用することができる。
【００２４】周知かつ前記にあるとおり、ポリペプチド
は必ずしも完全に線状とは限らない。例えば、ポリペプ
チドは、ユビキチン化の結果として分枝状であってもよ
く、一般に、自然プロセッシング事象および自然には起
こらない人的操作により得られる事象を含む、翻訳後事
象の結果として、分枝の有無にかかわらず、環状であっ
てもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、
非翻訳自然プロセスおよび、同様に完全な合成方法によ
っても合成され得る。
は必ずしも完全に線状とは限らない。例えば、ポリペプ
チドは、ユビキチン化の結果として分枝状であってもよ
く、一般に、自然プロセッシング事象および自然には起
こらない人的操作により得られる事象を含む、翻訳後事
象の結果として、分枝の有無にかかわらず、環状であっ
てもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、
非翻訳自然プロセスおよび、同様に完全な合成方法によ
っても合成され得る。
【００２５】修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およ
びアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチド
のあらゆる場所で起こり得る。事実、ポリペプチドでの
アミノまたはカルボキシル基、あるいはそれら両方の共
有結合の修飾による遮断は、天然および合成ポリペプチ
ドに共通しており、かかる修飾が、同様に本発明のポリ
ペプチドにあってもよい。例えば、プロセッシングの前
に、エシェリキア・コリ（Ｅ.coli）で生成されたポリ
ペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど例外なく、Ｎ−
ホルミルメチオニンである。
びアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチド
のあらゆる場所で起こり得る。事実、ポリペプチドでの
アミノまたはカルボキシル基、あるいはそれら両方の共
有結合の修飾による遮断は、天然および合成ポリペプチ
ドに共通しており、かかる修飾が、同様に本発明のポリ
ペプチドにあってもよい。例えば、プロセッシングの前
に、エシェリキア・コリ（Ｅ.coli）で生成されたポリ
ペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど例外なく、Ｎ−
ホルミルメチオニンである。
【００２６】ポリペプチドに起こる修飾は、ポリペプチ
ドの形成の仕方と相関関係にあることがしばしばであ
る。例えば、宿主においてクローン化遺伝子を発現させ
ることにより生成されたポリペプチドの場合、修飾の性
質および程度の大部分は、宿主細胞翻訳後修飾能力およ
びポリペプチドアミノ酸配列に存在する修飾シグナルに
より決定される。例えば、よく知られているように、糖
鎖形成は、多くの場合、細菌宿主、例えばエシェリキア
・コリでは起こらない。従って、糖鎖形成が望ましい場
合、ポリペプチドを糖鎖形成性宿主、一般に真核細胞で
発現させるべきである。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動
物と同じ翻訳後糖鎖形成を行う。この理由のため、昆虫
細胞発現系が、とりわけ、元来の糖鎖形成のパターンを
有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現するために開
発された。同様の考え方が他の修飾にも適用される。
ドの形成の仕方と相関関係にあることがしばしばであ
る。例えば、宿主においてクローン化遺伝子を発現させ
ることにより生成されたポリペプチドの場合、修飾の性
質および程度の大部分は、宿主細胞翻訳後修飾能力およ
びポリペプチドアミノ酸配列に存在する修飾シグナルに
より決定される。例えば、よく知られているように、糖
鎖形成は、多くの場合、細菌宿主、例えばエシェリキア
・コリでは起こらない。従って、糖鎖形成が望ましい場
合、ポリペプチドを糖鎖形成性宿主、一般に真核細胞で
発現させるべきである。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動
物と同じ翻訳後糖鎖形成を行う。この理由のため、昆虫
細胞発現系が、とりわけ、元来の糖鎖形成のパターンを
有する哺乳動物タンパク質を効率よく発現するために開
発された。同様の考え方が他の修飾にも適用される。
【００２７】同じタイプの修飾が、所定のポリペプチド
のいくつかの部位にて同じまたは様々な程度にて存在し
てもよいことが理解されよう。また、所定のポリペプチ
ドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。一般に、
本明細書にて用いるような、ポリペプチドなる語は、か
かる修飾のすべて、特に、宿主細胞にてポリヌクレオチ
ドを発現させることにより合成されるポリペプチドにて
存在する修飾を包含する。ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドの「変種（複数でも可）」を、本明細書にて用
いる場合、それは、各々、対照標準のポリヌクレオチド
またはポリペプチドとは異なる、ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドをいう。この意味における変種は、下記
およびこの開示のいずれかの部分においてより詳細に記
載されている。
のいくつかの部位にて同じまたは様々な程度にて存在し
てもよいことが理解されよう。また、所定のポリペプチ
ドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。一般に、
本明細書にて用いるような、ポリペプチドなる語は、か
かる修飾のすべて、特に、宿主細胞にてポリヌクレオチ
ドを発現させることにより合成されるポリペプチドにて
存在する修飾を包含する。ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドの「変種（複数でも可）」を、本明細書にて用
いる場合、それは、各々、対照標準のポリヌクレオチド
またはポリペプチドとは異なる、ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドをいう。この意味における変種は、下記
およびこの開示のいずれかの部分においてより詳細に記
載されている。
【００２８】例えば、変種は、ヌクレオチド配列にて、
別の対照標準のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオ
チドを包含する。一般に、相違は対照と変種のヌクレオ
チド配列が全体的に極めて類似し、多くの領域において
同一であるようなものに限られる。変種のヌクレオチド
配列の変化はサイレントであってもよい。すなわち、そ
の変化は、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ
酸を変えなくてもよい。変化がこの型のサイレント変化
に限定される場合、変種は対照標準と同じアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするであろう。また、下
記のごとく、変種のヌクレオチド配列における変化が、
対照標準のポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列を変化させてもよい。かかるヌク
レオチドの変化は、下記のごとく、対照標準の配列によ
りコードされるポリペプチドにてアミノ酸置換、付加、
欠失、融合および切断をもたらすかもしれない。
別の対照標準のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオ
チドを包含する。一般に、相違は対照と変種のヌクレオ
チド配列が全体的に極めて類似し、多くの領域において
同一であるようなものに限られる。変種のヌクレオチド
配列の変化はサイレントであってもよい。すなわち、そ
の変化は、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ
酸を変えなくてもよい。変化がこの型のサイレント変化
に限定される場合、変種は対照標準と同じアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするであろう。また、下
記のごとく、変種のヌクレオチド配列における変化が、
対照標準のポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列を変化させてもよい。かかるヌク
レオチドの変化は、下記のごとく、対照標準の配列によ
りコードされるポリペプチドにてアミノ酸置換、付加、
欠失、融合および切断をもたらすかもしれない。
【００２９】変種はまた、アミノ酸配列にて、別の対照
標準のポリペプチドと異なるポリペプチドを包含する。
一般に、相違は、対照標準と変種の配列が全体的に極め
て類似し、多くの領域において同一であるようなものに
限られる。変種および対照標準のポリペプチドは、アミ
ノ酸配列にて、１個またはそれ以上の置換、付加、欠
失、融合および切断により異なっていてもよく、それら
はいずれの組み合わせにて存在してもよい。
標準のポリペプチドと異なるポリペプチドを包含する。
一般に、相違は、対照標準と変種の配列が全体的に極め
て類似し、多くの領域において同一であるようなものに
限られる。変種および対照標準のポリペプチドは、アミ
ノ酸配列にて、１個またはそれ以上の置換、付加、欠
失、融合および切断により異なっていてもよく、それら
はいずれの組み合わせにて存在してもよい。
【００３０】本明細書にて用いる場合、「融合タンパク
質」は、２種の、しばしば、無関係の融合遺伝子または
そのフラグメントでコードされるタンパク質である。Ｅ
Ｐ-Ａ-０ ４６４ ５３３（対応カナダ国特許２０４５８
６９）は、もう一つ別のヒトタンパク質またはそれの一
部と共に免疫グロブリン分子の不変領域の種々の部分を
含んでなる融合タンパク質を開示する。多くの場合、融
合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を用
いることが、治療および診断における使用について有利
であり、例えば、改良された薬物動態学的性質が得られ
る（ＥＰ-Ａ０２３２ ２６２）。他方、ある用途には、
融合タンパク質が発現され、検出され、次いで精製され
た後、Ｆｃ部分を検出できることが望ましい。したがっ
て、融合タンパク質の成分を、化学的または酵素的切断
しうる結合領域で連結させることが望ましい。これは、
Ｆｃ部分が治療および診断における用途に対する妨害物
であると判明した場合、例えば、融合タンパク質を免疫
化のための抗原として使用すべき場合である。例えば、
薬物の発見において、ｓｈＩＬ５-αなどのヒトタンパ
ク質を、ｈＩＬ-５のアンタゴニストを同定するための
高処理量のスクリーニングアッセイにて用いるためにＦ
ｃ部分と融合させる。D.Bennettら、Journal of Molecu
lar Recognition, 8：52−58（1995）およびK.Johanson
ら、TheJournal of Biological Chemistry，270（1
6）：9459−9471（1995）を参照のこと。
質」は、２種の、しばしば、無関係の融合遺伝子または
そのフラグメントでコードされるタンパク質である。Ｅ
Ｐ-Ａ-０ ４６４ ５３３（対応カナダ国特許２０４５８
６９）は、もう一つ別のヒトタンパク質またはそれの一
部と共に免疫グロブリン分子の不変領域の種々の部分を
含んでなる融合タンパク質を開示する。多くの場合、融
合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を用
いることが、治療および診断における使用について有利
であり、例えば、改良された薬物動態学的性質が得られ
る（ＥＰ-Ａ０２３２ ２６２）。他方、ある用途には、
融合タンパク質が発現され、検出され、次いで精製され
た後、Ｆｃ部分を検出できることが望ましい。したがっ
て、融合タンパク質の成分を、化学的または酵素的切断
しうる結合領域で連結させることが望ましい。これは、
Ｆｃ部分が治療および診断における用途に対する妨害物
であると判明した場合、例えば、融合タンパク質を免疫
化のための抗原として使用すべき場合である。例えば、
薬物の発見において、ｓｈＩＬ５-αなどのヒトタンパ
ク質を、ｈＩＬ-５のアンタゴニストを同定するための
高処理量のスクリーニングアッセイにて用いるためにＦ
ｃ部分と融合させる。D.Bennettら、Journal of Molecu
lar Recognition, 8：52−58（1995）およびK.Johanson
ら、TheJournal of Biological Chemistry，270（1
6）：9459−9471（1995）を参照のこと。
【００３１】かくして、本発明はまた、ヒト・ミオトロ
フィン、またはその部分、および、種々のサブクラスの
免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の
重鎖または軽鎖の不変領域の種々の部分を含んでなる遺
伝子操作された可溶性融合タンパク質にも関する。免疫
グロブリンとして好ましいのは、融合がヒンジ領域で起
こる場合の、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の不変部
分である。個々の具体例において、血餅形成因子Ｘａで
開裂できる開裂配列を組み込むことによってＦｃ部分は
簡単に除去されうる。さらに、本発明は遺伝子操作によ
るこれらの融合タンパク質の製造方法、ならびに診断お
よび治療におけるそれらの使用に関する。本発明のさら
なる態様は、かかる融合タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドにも関する。
フィン、またはその部分、および、種々のサブクラスの
免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の
重鎖または軽鎖の不変領域の種々の部分を含んでなる遺
伝子操作された可溶性融合タンパク質にも関する。免疫
グロブリンとして好ましいのは、融合がヒンジ領域で起
こる場合の、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の不変部
分である。個々の具体例において、血餅形成因子Ｘａで
開裂できる開裂配列を組み込むことによってＦｃ部分は
簡単に除去されうる。さらに、本発明は遺伝子操作によ
るこれらの融合タンパク質の製造方法、ならびに診断お
よび治療におけるそれらの使用に関する。本発明のさら
なる態様は、かかる融合タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドにも関する。
【００３２】「結合分子」は、リガンドを含め、本発明
の遺伝子よりコードされるポリペプチドに特異的に結合
または相互作用する分子をいう。かかる結合分子は本発
明の一部である。結合分子はまた、本発明のポリペプチ
ドに特異的に結合する抗体および抗体誘導試薬などの非
天然物であってもよい。
の遺伝子よりコードされるポリペプチドに特異的に結合
または相互作用する分子をいう。かかる結合分子は本発
明の一部である。結合分子はまた、本発明のポリペプチ
ドに特異的に結合する抗体および抗体誘導試薬などの非
天然物であってもよい。
【００３３】当該分野に知られているごとく、２つのポ
リペプチドの間の「類似性」は、一のポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその保存アミノ酸置換基を、別のポリ
ペプチドの配列と比較することにより決定する。さら
に、かかる配列の２本の鎖の間の対合の同一性によって
決定されるごとき、２つのポリペプチドまたは２つのポ
リヌクレオチド配列の間の配列の関連性の度合いを意味
する「同一性」も当該分野において知られている。同一
性および類似性は共に容易に計算できる（COMPUTATIONA
L MOLECULAR BIOLOGY，Lesk,A.M.編, Oxford Universit
y Press，New York（1988）；BIOCOMPUTING：INFORMATI
CS AND GENOME PROJECTS, Smith,D.W.編,Academic Pres
s, New York（1993）；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE
DATA，PART I，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編，H
umana Press, New Jersey（1994）；SEQUENCE ANALYSIS
IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje, G.,Academic Pre
ss（1987）；およびSEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribsk
ov,M.およびDevereux,J.編, M Stockton Press，New Yo
rk（1991））。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド配列の間の同一性および類似性を測定するための方
法は多数存在するが、「同一性」および「類似性」なる
用語は当業者によく知られている（Carillo,H.およびLi
pton,D.、SIAM J.Applied Math. 48：1073（1988））。
２つの配列間の同一性または類似性を決定するために通
常用いられる方法は、これに限定されないが、GUIDE TO
HUGE COMPUTERS，Martin J.Bishop編，Academic Pres
s，SanDiego（1994）およびCarillo,H.および Lipton,
D.、SIAM J.Applied Math. 48：1073（1988）に開示さ
れている方法を包含する。同一性を測定するための好ま
しい方法は、試験する２つの配列間に最大の対合を与え
るように設計される。同一性および類似性を測定する方
法はコンピュータープログラムに書き込まれている。２
つの配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコ
ンピュータープログラムの方法は、これに限定されない
が、ＧＣＧプログラム・パッケージ（Devereux,J.ら、N
ucleic Acids Research 12（1）：387（1984）、BLAST
P, BLASTNおよびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Bio
l.，215：403（1990））を包含する。
リペプチドの間の「類似性」は、一のポリペプチドのア
ミノ酸配列およびその保存アミノ酸置換基を、別のポリ
ペプチドの配列と比較することにより決定する。さら
に、かかる配列の２本の鎖の間の対合の同一性によって
決定されるごとき、２つのポリペプチドまたは２つのポ
リヌクレオチド配列の間の配列の関連性の度合いを意味
する「同一性」も当該分野において知られている。同一
性および類似性は共に容易に計算できる（COMPUTATIONA
L MOLECULAR BIOLOGY，Lesk,A.M.編, Oxford Universit
y Press，New York（1988）；BIOCOMPUTING：INFORMATI
CS AND GENOME PROJECTS, Smith,D.W.編,Academic Pres
s, New York（1993）；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE
DATA，PART I，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編，H
umana Press, New Jersey（1994）；SEQUENCE ANALYSIS
IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje, G.,Academic Pre
ss（1987）；およびSEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribsk
ov,M.およびDevereux,J.編, M Stockton Press，New Yo
rk（1991））。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド配列の間の同一性および類似性を測定するための方
法は多数存在するが、「同一性」および「類似性」なる
用語は当業者によく知られている（Carillo,H.およびLi
pton,D.、SIAM J.Applied Math. 48：1073（1988））。
２つの配列間の同一性または類似性を決定するために通
常用いられる方法は、これに限定されないが、GUIDE TO
HUGE COMPUTERS，Martin J.Bishop編，Academic Pres
s，SanDiego（1994）およびCarillo,H.および Lipton,
D.、SIAM J.Applied Math. 48：1073（1988）に開示さ
れている方法を包含する。同一性を測定するための好ま
しい方法は、試験する２つの配列間に最大の対合を与え
るように設計される。同一性および類似性を測定する方
法はコンピュータープログラムに書き込まれている。２
つの配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコ
ンピュータープログラムの方法は、これに限定されない
が、ＧＣＧプログラム・パッケージ（Devereux,J.ら、N
ucleic Acids Research 12（1）：387（1984）、BLAST
P, BLASTNおよびFASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Bio
l.，215：403（1990））を包含する。
【００３４】本発明は、とりわけ、以下にさらに詳細に
記載するような、新規ヒト・ミオトロフィンポリヌクレ
オチドおよびそれによりコードされるポリペプチドに関
する。特に、本発明は、新規なヒト・ミオトロフィンの
ポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、図１およ
び２に示すヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を有す
るＨＳＡＢＨ０１に関する。
記載するような、新規ヒト・ミオトロフィンポリヌクレ
オチドおよびそれによりコードされるポリペプチドに関
する。特に、本発明は、新規なヒト・ミオトロフィンの
ポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、図１およ
び２に示すヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を有す
るＨＳＡＢＨ０１に関する。
【００３５】ポリヌクレオチド 本発明の一つの態様によれば、図２の推定アミノ酸配列
を有するヒト・ミオトロフィンポリペプチドをコードす
る単離ポリヌクレオチドが提供される。図１に示すポリ
ヌクレオチド配列などの本明細書に示す情報を用いて、
ヒト・ミオトロフィンをコードする本発明のポリヌクレ
オチドを、出発物質としてのヒト細胞由来のｍＲＮＡを
用いてｃＤＮＡをクローニングするなどの、標準的クロ
ーニングおよびスクリーニング法を用いて得ることがで
きる。本発明の代表例である、図１に示すポリヌクレオ
チドは、ラット・ミオトロフィンのヌクレオチド配列を
用いてヒトＨＳＡ１７２細胞から由来のｃＤＮＡライブ
ラリーにて同定された。
を有するヒト・ミオトロフィンポリペプチドをコードす
る単離ポリヌクレオチドが提供される。図１に示すポリ
ヌクレオチド配列などの本明細書に示す情報を用いて、
ヒト・ミオトロフィンをコードする本発明のポリヌクレ
オチドを、出発物質としてのヒト細胞由来のｍＲＮＡを
用いてｃＤＮＡをクローニングするなどの、標準的クロ
ーニングおよびスクリーニング法を用いて得ることがで
きる。本発明の代表例である、図１に示すポリヌクレオ
チドは、ラット・ミオトロフィンのヌクレオチド配列を
用いてヒトＨＳＡ１７２細胞から由来のｃＤＮＡライブ
ラリーにて同定された。
【００３６】本発明のＨＳＡＢＨ０１は、構造的に、他
種からのミオトロフィンタンパク質に関連付けられる。
ヒトとラットのミオトロフィン配列の間の５２３塩基対
オーバーラップにて９６.４％の同一性がある。ＨＳＡ
ＢＨ０１のｃＤＮＡ配列を図１（配列番号１）に示す。
図１に表されるヒト・ミオトロフィンｃＤＮＡは、比較
的短い５’非翻訳領域、つづいてヌクレオチド６０から
４１６までのオープン・リーディング・フレームで特徴
付けられる。５’非翻訳領域にて付加的に約１５０の塩
基対を有する長いクローンも同定された。その３’非翻
訳領域はポリＡテイルを含有し、かつｍＲＮＡの安定性
の指標である、ＡＴＴＴＡ繰返し部を欠く。
種からのミオトロフィンタンパク質に関連付けられる。
ヒトとラットのミオトロフィン配列の間の５２３塩基対
オーバーラップにて９６.４％の同一性がある。ＨＳＡ
ＢＨ０１のｃＤＮＡ配列を図１（配列番号１）に示す。
図１に表されるヒト・ミオトロフィンｃＤＮＡは、比較
的短い５’非翻訳領域、つづいてヌクレオチド６０から
４１６までのオープン・リーディング・フレームで特徴
付けられる。５’非翻訳領域にて付加的に約１５０の塩
基対を有する長いクローンも同定された。その３’非翻
訳領域はポリＡテイルを含有し、かつｍＲＮＡの安定性
の指標である、ＡＴＴＴＡ繰返し部を欠く。
【００３７】本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの
ごときＲＮＡの形態であってもよく、あるいは、例えば
クローニングにより得られるか、または化学合成法もし
くはその組み合わせにより産生されるｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡを含め、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮ
Ａは２本鎖または１本鎖であってもよい。１本鎖ＤＮＡ
はセンス鎖としても知られているコーディング鎖であっ
てもよく、または、アンチセンス鎖とも称される非コー
ディング鎖であってもよい。ポリペプチドをコードする
コーディング配列は、図１（配列番号１）に示すポリヌ
クレオチドのコーディング配列と同じであってもよい。
そのコーディング配列はまた、遺伝暗号の重複性（縮重
性）の結果として、図２（配列番号２）のポリペプチド
をもコードする、別の配列を有するポリヌクレオチドで
あってもよい。
ごときＲＮＡの形態であってもよく、あるいは、例えば
クローニングにより得られるか、または化学合成法もし
くはその組み合わせにより産生されるｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡを含め、ＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮ
Ａは２本鎖または１本鎖であってもよい。１本鎖ＤＮＡ
はセンス鎖としても知られているコーディング鎖であっ
てもよく、または、アンチセンス鎖とも称される非コー
ディング鎖であってもよい。ポリペプチドをコードする
コーディング配列は、図１（配列番号１）に示すポリヌ
クレオチドのコーディング配列と同じであってもよい。
そのコーディング配列はまた、遺伝暗号の重複性（縮重
性）の結果として、図２（配列番号２）のポリペプチド
をもコードする、別の配列を有するポリヌクレオチドで
あってもよい。
【００３８】図２のポリペプチドをコードする本発明の
ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチド用のコーディン
グ配列自体；成熟ポリペプチド用のコーディング配列お
よび付加的なコーディング配列；および前記した付加的
なコーディング配列を有するか、または有することな
く、付加的な非コーディング配列を有する、成熟ポリペ
プチドのコーディング配列を包含するが、これに限定さ
れるものではない。付加的なコーディング配列として、
例えば、プレタンパク質、プロタンパク質またはプレプ
ロタンパク質配列などのリーダー配列または分泌配列を
コードする配列が挙げられるが、これに限定されるもの
ではない。付加的な非コーディング配列として、例え
ば、転写およびスプライシングを含め、ｍＲＮＡプロセ
ッシングにて役割を果たす、転写され、かつ非翻訳の配
列および、例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安
定性のためのポリアデニル化シグナルなどのイントロン
および非コーディング５’および３’配列を包含する
が、これに限定されない。付加的な官能性を付与するコ
ーディング配列をポリペプチドに組み入れてもよい。か
くして、例えば、ポリペプチドを、融合ポリペプチドの
精製を容易にする、ペプチドなどのマーカー配列に融合
させてもよい。本発明のこの態様のある好ましい具体例
において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,I
nc.）で供給されるようなヘキサヒスチジンペプチドで
ある。Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、86：821-82
4（1989）に記載されているように、例えば、ヘキサヒ
スチジンは融合タンパク質を精製するのに都合がよい。
別の具体例において、ＨＡタグはマーカー配列として役
立つかもしれない。そのＨＡタグはインフルエンザ・赤
血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応するもの
であり、例えば、Wilsonら、Cell 37：767 (1984) に記
載されている。他の多くのそのようなタグが市販されて
いる。
ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチド用のコーディン
グ配列自体；成熟ポリペプチド用のコーディング配列お
よび付加的なコーディング配列；および前記した付加的
なコーディング配列を有するか、または有することな
く、付加的な非コーディング配列を有する、成熟ポリペ
プチドのコーディング配列を包含するが、これに限定さ
れるものではない。付加的なコーディング配列として、
例えば、プレタンパク質、プロタンパク質またはプレプ
ロタンパク質配列などのリーダー配列または分泌配列を
コードする配列が挙げられるが、これに限定されるもの
ではない。付加的な非コーディング配列として、例え
ば、転写およびスプライシングを含め、ｍＲＮＡプロセ
ッシングにて役割を果たす、転写され、かつ非翻訳の配
列および、例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安
定性のためのポリアデニル化シグナルなどのイントロン
および非コーディング５’および３’配列を包含する
が、これに限定されない。付加的な官能性を付与するコ
ーディング配列をポリペプチドに組み入れてもよい。か
くして、例えば、ポリペプチドを、融合ポリペプチドの
精製を容易にする、ペプチドなどのマーカー配列に融合
させてもよい。本発明のこの態様のある好ましい具体例
において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,I
nc.）で供給されるようなヘキサヒスチジンペプチドで
ある。Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、86：821-82
4（1989）に記載されているように、例えば、ヘキサヒ
スチジンは融合タンパク質を精製するのに都合がよい。
別の具体例において、ＨＡタグはマーカー配列として役
立つかもしれない。そのＨＡタグはインフルエンザ・赤
血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応するもの
であり、例えば、Wilsonら、Cell 37：767 (1984) に記
載されている。他の多くのそのようなタグが市販されて
いる。
【００３９】前記によれば、本明細書にて用いられる
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語
は、遺伝暗号の重複性により、本発明のポリペプチド、
特に、図２に示すアミノ酸配列を有するＨＳＡＢＨ０１
によりコードされるポリペプチドをコードするいずれの
配列をも含むポリヌクレオチドを包含する。該用語はま
た、コーディングおよび／または非コーディング配列を
含んでいてもよい、付加的な領域と共に、該ポリペプチ
ドをコードする単一の連続領域または不連続領域（例え
ば、イントロンにより分断されている）を含むポリヌク
レオチドも包含する。さらに本発明は、図２の推定アミ
ノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント、アナロ
グおよび誘導体をコードする、本明細書にて前記したポ
リヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオチドの変
種は、天然の対立遺伝子変種などの天然に存在する変種
であってもよく、あるいは、天然に存在することが知ら
れていない変種であってもよい。かかるポリヌクレオチ
ドの天然に存在しない変種は、ポリヌクレオチド、細胞
または生物に用いる方法を含め、突然変異誘発法により
製造してもよい。
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語
は、遺伝暗号の重複性により、本発明のポリペプチド、
特に、図２に示すアミノ酸配列を有するＨＳＡＢＨ０１
によりコードされるポリペプチドをコードするいずれの
配列をも含むポリヌクレオチドを包含する。該用語はま
た、コーディングおよび／または非コーディング配列を
含んでいてもよい、付加的な領域と共に、該ポリペプチ
ドをコードする単一の連続領域または不連続領域（例え
ば、イントロンにより分断されている）を含むポリヌク
レオチドも包含する。さらに本発明は、図２の推定アミ
ノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント、アナロ
グおよび誘導体をコードする、本明細書にて前記したポ
リヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオチドの変
種は、天然の対立遺伝子変種などの天然に存在する変種
であってもよく、あるいは、天然に存在することが知ら
れていない変種であってもよい。かかるポリヌクレオチ
ドの天然に存在しない変種は、ポリヌクレオチド、細胞
または生物に用いる方法を含め、突然変異誘発法により
製造してもよい。
【００４０】この点で変種には、ヌクレオチド置換、欠
失または付加により前記したポリヌクレオチドと異なる
変種がある。置換、欠失または付加には１個またはそれ
以上のヌクレオチドが関与しているかもしれない。変種
は、コーディング配列または非コーディング配列あるい
はそれらの両方において変化していてもよい。コーディ
ング配列の変化により、同類または非同類アミノ酸置
換、欠失または付加が生じてもよい。この点で本発明の
特に好ましい具体例には、図２（配列番号２）に示すア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド；その変種、アナログ、誘導体およびフラグメ
ント、ならびにその変種、アナログおよび誘導体のフラ
グメントがある。
失または付加により前記したポリヌクレオチドと異なる
変種がある。置換、欠失または付加には１個またはそれ
以上のヌクレオチドが関与しているかもしれない。変種
は、コーディング配列または非コーディング配列あるい
はそれらの両方において変化していてもよい。コーディ
ング配列の変化により、同類または非同類アミノ酸置
換、欠失または付加が生じてもよい。この点で本発明の
特に好ましい具体例には、図２（配列番号２）に示すア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド；その変種、アナログ、誘導体およびフラグメ
ント、ならびにその変種、アナログおよび誘導体のフラ
グメントがある。
【００４１】さらに、この点において、数個、わずか
な、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１個
または０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで
置換、欠失または付加されている、図２のポリペプチド
のアミノ酸配列を有する、ヒト・ミオトロフィン変種、
アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそのフ
ラグメントの変種、アナログおよび誘導体をコードする
ポリヌクレオチドが特に好ましい。これらのうち特に好
ましいのは、ヒト・ミオトロフィンの特性および活性を
変化させないサイレント置換、付加および欠失である。
またこの点において、同類置換が特に好ましい。ＨＳＡ
ＢＨ０１などの置換されていない、図２のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが
最も好ましい。
な、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１個
または０個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで
置換、欠失または付加されている、図２のポリペプチド
のアミノ酸配列を有する、ヒト・ミオトロフィン変種、
アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそのフ
ラグメントの変種、アナログおよび誘導体をコードする
ポリヌクレオチドが特に好ましい。これらのうち特に好
ましいのは、ヒト・ミオトロフィンの特性および活性を
変化させないサイレント置換、付加および欠失である。
またこの点において、同類置換が特に好ましい。ＨＳＡ
ＢＨ０１などの置換されていない、図２のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが
最も好ましい。
【００４２】本発明のさらに好ましい具体例は、ＨＳＡ
ＢＨ０１に対して少なくとも９７％同一であるポリヌク
レオチド、およびかかるポリヌクレオチドに相補的なポ
リヌクレオチドである。さらには、少なくとも９８％の
同一性を有するのものが非常に好ましく、少なくとも９
９％の同一性を有するものが最も好ましい。この点にお
いて、さらに特に好ましい具体例は、図１のｃＤＮＡに
よりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物
学的機能または活性を保持しているポリペプチドをコー
ドしているポリヌクレオチドである。
ＢＨ０１に対して少なくとも９７％同一であるポリヌク
レオチド、およびかかるポリヌクレオチドに相補的なポ
リヌクレオチドである。さらには、少なくとも９８％の
同一性を有するのものが非常に好ましく、少なくとも９
９％の同一性を有するものが最も好ましい。この点にお
いて、さらに特に好ましい具体例は、図１のｃＤＮＡに
よりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物
学的機能または活性を保持しているポリペプチドをコー
ドしているポリヌクレオチドである。
【００４３】本発明はさらに本明細書にて前記した配列
とハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。こ
の点において、本発明は、特に、ストリンジェントな条
件下、本明細書にて前記したポリヌクレオチドとハイブ
リッド形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書に
て用いるような、「ストリンジェントな条件」なる語
は、ハイブリッド形成が、配列間で少なくとも９５％、
好ましくは少なくとも９７％同一である場合にのみ生じ
ることを意味する。本発明のポリヌクレオチドアッセイ
に関してさらに検討するように、例えば、前記した本発
明のポリヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用
のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ヒト
・ミオトロフィンをコードする完全長のｃＤＮＡおよび
ゲノムクローンを単離し、ヒト・ミオトロフィン遺伝子
に対して高度の配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮ
Ａおよびゲノムクローンを単離してもよい。かかるプロ
ーブは、一般に、少なくとも１５個のヌクレオチドを有
してなる。好ましくは、かかるプローブは少なくとも３
０個のヌクレオチドを有するであろうし、少なくとも５
０個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましい
プローブは３０と５０個の範囲にあるヌクレオチドを有
する。
とハイブリッド形成するポリヌクレオチドに関する。こ
の点において、本発明は、特に、ストリンジェントな条
件下、本明細書にて前記したポリヌクレオチドとハイブ
リッド形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書に
て用いるような、「ストリンジェントな条件」なる語
は、ハイブリッド形成が、配列間で少なくとも９５％、
好ましくは少なくとも９７％同一である場合にのみ生じ
ることを意味する。本発明のポリヌクレオチドアッセイ
に関してさらに検討するように、例えば、前記した本発
明のポリヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用
のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ヒト
・ミオトロフィンをコードする完全長のｃＤＮＡおよび
ゲノムクローンを単離し、ヒト・ミオトロフィン遺伝子
に対して高度の配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮ
Ａおよびゲノムクローンを単離してもよい。かかるプロ
ーブは、一般に、少なくとも１５個のヌクレオチドを有
してなる。好ましくは、かかるプローブは少なくとも３
０個のヌクレオチドを有するであろうし、少なくとも５
０個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましい
プローブは３０と５０個の範囲にあるヌクレオチドを有
する。
【００４４】例えば、ヒト・ミオトロフィン遺伝子のコ
ード領域は、既知のＤＮＡ配列を使用してスクリーニン
グしてオリゴヌクレオチド・プローブを合成することに
より単離できる。ついで、本発明の遺伝子の配列と相補
性の配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを用いて
ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラ
リーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバー
がプローブとハイブリダイズするか決定する。本発明の
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書にお
いてポリヌクレオチド・アッセイに関してさらに説明す
るように、ヒト疾患に対する治療および診断の発見のた
めの研究試薬および研究材料として用いることができ
る。
ード領域は、既知のＤＮＡ配列を使用してスクリーニン
グしてオリゴヌクレオチド・プローブを合成することに
より単離できる。ついで、本発明の遺伝子の配列と相補
性の配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを用いて
ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラ
リーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバー
がプローブとハイブリダイズするか決定する。本発明の
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書にお
いてポリヌクレオチド・アッセイに関してさらに説明す
るように、ヒト疾患に対する治療および診断の発見のた
めの研究試薬および研究材料として用いることができ
る。
【００４５】該ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質
に、付加的なアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸が加
わるか、成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わった
（例えば、成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有す
る場合）ポリペプチドをコードすることができる。この
ような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態へのタン
パク質のプロセッシングにおいて役割を果たし、タンパ
ク質を運ぶことを容易にし、タンパク質の半減期を長く
したり、短くしたり、あるいはアッセイまたは生産のた
めのタンパク質の操作を容易にすることができる。イン
シテューで一般的なように、該付加アミノ酸は細胞酵素
により成熟タンパク質からプロセッシングにより除かれ
る。一またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチ
ドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は該ポリペプチ
ドの不活性形でもよい。プロ配列が除かれると、そのよ
うな不活性前駆体は一般に活性化される。プロ配列の幾
らかまたは全体を、活性化の前に除去できる。一般に、
そのような前駆体はプロタンパク質と称される。
に、付加的なアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸が加
わるか、成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸が加わった
（例えば、成熟形態が一つ以上のポリペプチド鎖を有す
る場合）ポリペプチドをコードすることができる。この
ような配列は、とりわけ、前駆体から成熟形態へのタン
パク質のプロセッシングにおいて役割を果たし、タンパ
ク質を運ぶことを容易にし、タンパク質の半減期を長く
したり、短くしたり、あるいはアッセイまたは生産のた
めのタンパク質の操作を容易にすることができる。イン
シテューで一般的なように、該付加アミノ酸は細胞酵素
により成熟タンパク質からプロセッシングにより除かれ
る。一またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチ
ドの成熟形態を有する前駆体タンパク質は該ポリペプチ
ドの不活性形でもよい。プロ配列が除かれると、そのよ
うな不活性前駆体は一般に活性化される。プロ配列の幾
らかまたは全体を、活性化の前に除去できる。一般に、
そのような前駆体はプロタンパク質と称される。
【００４６】総じて、本発明のポリヌクレオチドは成熟
タンパク質、リーダー配列の加わった成熟タンパク質
（プレタンパク質とも称される）、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有す
る成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列と、一
般に、ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセ
ッシング工程の間に除去される１またはそれ以上のプロ
配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタ
ンパク質をコードする。
タンパク質、リーダー配列の加わった成熟タンパク質
（プレタンパク質とも称される）、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない１またはそれ以上のプロ配列を有す
る成熟タンパク質の前駆体、またはリーダー配列と、一
般に、ポリペプチドの活性な成熟形態を生成するプロセ
ッシング工程の間に除去される１またはそれ以上のプロ
配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタ
ンパク質をコードする。
【００４７】ポリペプチド 本発明は、さらに図２（配列番号２）の推定アミノ酸配
列を有するＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプ
チドに関する。ＤＮＡ配列（配列番号１）をLasergene
software package（DNAStar，Madison，ＷＩ）を用いて
この推定タンパク質配列に翻訳した。本発明はまた、こ
れらのポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘
導体にも関する。「フラグメント」、「誘導体」および
「アナログ」なる語は、図２のポリペプチドについて言
う場合、かかるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機
能または活性を保持している、すなわち、ミオトロフィ
ンタンパク質のごとく機能するポリペプチド、または、
たとえそのポリペプチドがミオトロフィンタンパク質と
して機能しなくてもリガンドまたは結合分子に結合する
能力を保持している、ポリペプチドを意味する。かくし
て、アナログは、プロタンパク質部分の開裂により活性
化され、活性成熟ポリペプチドを産生しうるプロタンパ
ク質を包含する。好ましい具体例において、本発明のポ
リペプチドは組換えポリペプチドである。
列を有するＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプ
チドに関する。ＤＮＡ配列（配列番号１）をLasergene
software package（DNAStar，Madison，ＷＩ）を用いて
この推定タンパク質配列に翻訳した。本発明はまた、こ
れらのポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘
導体にも関する。「フラグメント」、「誘導体」および
「アナログ」なる語は、図２のポリペプチドについて言
う場合、かかるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機
能または活性を保持している、すなわち、ミオトロフィ
ンタンパク質のごとく機能するポリペプチド、または、
たとえそのポリペプチドがミオトロフィンタンパク質と
して機能しなくてもリガンドまたは結合分子に結合する
能力を保持している、ポリペプチドを意味する。かくし
て、アナログは、プロタンパク質部分の開裂により活性
化され、活性成熟ポリペプチドを産生しうるプロタンパ
ク質を包含する。好ましい具体例において、本発明のポ
リペプチドは組換えポリペプチドである。
【００４８】図２のポリペプチドのフラグメント、誘導
体またはアナログは、（ｉ）１個またはそれ以上のアミ
ノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましく
は、保存アミノ酸残基）で置換されており、かかる置換
アミノ酸残基は遺伝暗号によりコードされているもので
あっても、なくてもよいもの；（ｉｉ）１個またはそれ
以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの；（ｉｉｉ）成
熟ポリペプチドが別の化合物、例えば、ポリペプチドの
半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリ
コール）と融合しているもの；または（ｉｖ）付加的な
アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているもの、例え
ば、リーダーもしくは分泌配列または成熟ポリペプチド
の精製用に利用される配列またはプロタンパク質配列で
あってもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナ
ログは、本明細書の教示から当業者に自明であると考え
られる。
体またはアナログは、（ｉ）１個またはそれ以上のアミ
ノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましく
は、保存アミノ酸残基）で置換されており、かかる置換
アミノ酸残基は遺伝暗号によりコードされているもので
あっても、なくてもよいもの；（ｉｉ）１個またはそれ
以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの；（ｉｉｉ）成
熟ポリペプチドが別の化合物、例えば、ポリペプチドの
半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリ
コール）と融合しているもの；または（ｉｖ）付加的な
アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているもの、例え
ば、リーダーもしくは分泌配列または成熟ポリペプチド
の精製用に利用される配列またはプロタンパク質配列で
あってもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナ
ログは、本明細書の教示から当業者に自明であると考え
られる。
【００４９】この点において、本発明の特に好ましい具
体例には、図２に示す配列番号２のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフ
ラグメント、ならびに該フラグメントの変種、アナログ
および誘導体である。さらに、この点において本発明の
特に好ましい具体例は、ヒト・ミオトロフィンの活性／
機能を保持しているポリペプチドである。好ましい変種
には、同類アミノ酸置換によってＨＳＡＢＨ０１により
コードされるポリペプチドから変化している変種があ
る。かかる置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を
同様の特性の別のアミノ酸で置換したものである。同類
アミノ酸置換として認められる典型的なものは、脂肪族
アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの
間での相互の置換；ヒドロキシル残基であるＳｅｒおよ
びＴｈｒの相互置換、酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌ
ｕの交換、アミド残基であるＡｓｎおよびＧｌｎの間の
置換、塩基性残基であるＬｙｓおよびＡｒｇの交換、な
らびに芳香族残基であるＰｈｅおよびＴｙｒの間の置換
である。
体例には、図２に示す配列番号２のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフ
ラグメント、ならびに該フラグメントの変種、アナログ
および誘導体である。さらに、この点において本発明の
特に好ましい具体例は、ヒト・ミオトロフィンの活性／
機能を保持しているポリペプチドである。好ましい変種
には、同類アミノ酸置換によってＨＳＡＢＨ０１により
コードされるポリペプチドから変化している変種があ
る。かかる置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を
同様の特性の別のアミノ酸で置換したものである。同類
アミノ酸置換として認められる典型的なものは、脂肪族
アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの
間での相互の置換；ヒドロキシル残基であるＳｅｒおよ
びＴｈｒの相互置換、酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌ
ｕの交換、アミド残基であるＡｓｎおよびＧｌｎの間の
置換、塩基性残基であるＬｙｓおよびＡｒｇの交換、な
らびに芳香族残基であるＰｈｅおよびＴｙｒの間の置換
である。
【００５０】さらにこの点において特に好ましいのは、
数個、わずかな、５ないし１０、１ないし５、１ないし
３、２、１個または０個のアミノ酸残基が、いずれかの
組み合わせで置換、欠失または付加されている、図２の
配列番号２のアミノ酸配列を有する変種、アナログ、誘
導体およびフラグメント、ならびに該フラグメントの変
種、アナログおよび誘導体である。これらのうち特に好
ましいのは、ヒト・ミオトロフィンの性質および活性を
変化させないサイレント置換、付加および欠失である。
またこの点において、同類置換が特に好ましい。最も好
ましいのは、置換されていない図２のアミノ酸配列を有
するポリペプチドである。本発明のポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドは、好ましくは、単離形態にて提供さ
れ、好ましくは、等質性になるまで精製される。
数個、わずかな、５ないし１０、１ないし５、１ないし
３、２、１個または０個のアミノ酸残基が、いずれかの
組み合わせで置換、欠失または付加されている、図２の
配列番号２のアミノ酸配列を有する変種、アナログ、誘
導体およびフラグメント、ならびに該フラグメントの変
種、アナログおよび誘導体である。これらのうち特に好
ましいのは、ヒト・ミオトロフィンの性質および活性を
変化させないサイレント置換、付加および欠失である。
またこの点において、同類置換が特に好ましい。最も好
ましいのは、置換されていない図２のアミノ酸配列を有
するポリペプチドである。本発明のポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドは、好ましくは、単離形態にて提供さ
れ、好ましくは、等質性になるまで精製される。
【００５１】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分を、ペプチド合成により対応する完全長のポリペ
プチドの製造に使用してもよい；従って、フラグメント
を完全長のポリペプチドの製造のための中間体として使
用してもよい。本発明のポリヌクレオチドのフラグメン
トまたは部分を用いて本発明の完全長のポリヌクレオチ
ドを合成してもよい。フラグメントは、「自立してい
る」、すなわち、他のアミノ酸またはポリペプチドの一
部でなく、または、それらに融合しておらず、あるい
は、かかるフラグメントが大きなポリペプチド中に含ま
れていてその一部分または領域となっていてもよい。大
きなポリペプチド中に含まれている場合、現在議論中の
フラグメントは、最も好ましくは単一の連続した領域を
形成する。しかしながら、いくつかのフラグメントが、
単一のより大きなポリペプチド中に含まれていてもよ
い。例えば、ある好ましい具体例は、宿主中での発現の
ために設計された前駆体ポリペプチド中に含まれてい
て、ＨＳＡＢＨ０１コードのフラグメントのアミノ末端
に融合した異種プレおよびプロ−ポリペプチド領域、お
よび、該フラグメントのカルボキシル末端に融合した付
加的な領域を有している、本発明のＨＳＡＢＨ０１によ
りコードされるポリペプチドのフラグメントに関する。
従って、本明細書の意図する１つの態様において、フラ
グメントは、ＨＳＡＢＨ０１によりコードされる融合ポ
リペプチドまたは融合タンパク質の一部または部分をい
う。
は部分を、ペプチド合成により対応する完全長のポリペ
プチドの製造に使用してもよい；従って、フラグメント
を完全長のポリペプチドの製造のための中間体として使
用してもよい。本発明のポリヌクレオチドのフラグメン
トまたは部分を用いて本発明の完全長のポリヌクレオチ
ドを合成してもよい。フラグメントは、「自立してい
る」、すなわち、他のアミノ酸またはポリペプチドの一
部でなく、または、それらに融合しておらず、あるい
は、かかるフラグメントが大きなポリペプチド中に含ま
れていてその一部分または領域となっていてもよい。大
きなポリペプチド中に含まれている場合、現在議論中の
フラグメントは、最も好ましくは単一の連続した領域を
形成する。しかしながら、いくつかのフラグメントが、
単一のより大きなポリペプチド中に含まれていてもよ
い。例えば、ある好ましい具体例は、宿主中での発現の
ために設計された前駆体ポリペプチド中に含まれてい
て、ＨＳＡＢＨ０１コードのフラグメントのアミノ末端
に融合した異種プレおよびプロ−ポリペプチド領域、お
よび、該フラグメントのカルボキシル末端に融合した付
加的な領域を有している、本発明のＨＳＡＢＨ０１によ
りコードされるポリペプチドのフラグメントに関する。
従って、本明細書の意図する１つの態様において、フラ
グメントは、ＨＳＡＢＨ０１によりコードされる融合ポ
リペプチドまたは融合タンパク質の一部または部分をい
う。
【００５２】本発明のポリペプチドフラグメントの典型
例として、長さが約５ないし１５個、１０ないし２０
個、１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし
７５個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０な
いし１００個、７５ないし１００個、９０ないし１１５
個、１００ないし１２５個、および１１０ないし１１３
個のアミノ酸のものを挙げることができる。これに関連
して、「約」とは、特に列挙した範囲、ならびに数個、
わずかな、５、４、３、２、１個のアミノ酸残基の分だ
け大きいまたは小さい範囲であって、上限または下限、
あるいはそれらの両方の範囲を包含する。例えば、この
内容においては、約４０ないし９０個のアミノ酸は、４
０プラスまたはマイナス数個、わずかな、５、４、３、
２、１個のアミノ酸残基から、９０プラスまたはマイナ
ス数個、わずかな、５、４、３、２、１個のアミノ酸残
基までのポリペプチドフラグメントを意味し、すなわ
ち、最大４０マイナス数個のアミノ酸から９０プラス数
個のアミノ酸、最小４０プラス数個のアミノ酸から９０
マイナス数個のアミノ酸の範囲である。この点において
好ましくは、上限または下限、あるいはそれらの両方の
範囲において、列挙した範囲プラスまたはマイナス５個
程度のアミノ酸である。上限または下限、あるいはそれ
らの両方の範囲において、列挙した範囲プラスまたはマ
イナス３個程度のアミノ酸が特に非常に好ましい。上限
または下限、あるいはそれらの両方の範囲において、列
挙した範囲プラスまたはマイナス１個程度のアミノ酸、
または列挙した範囲に付加または欠失のないものが特に
非常に好ましい。この点において、約５ないし１５個、
１０ないし２０個、１５ないし４０個、３０ないし５５
個、４１ないし７５個、４１ないし８０個、４１ないし
９０個、５０ないし１００個、７５ないし１００個、９
０ないし１１５個、１００ないし１２５個、および１１
０ないし１１３個のアミノ酸の長さのフラグメントが、
すべてのうちで最も好ましい。
例として、長さが約５ないし１５個、１０ないし２０
個、１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし
７５個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０な
いし１００個、７５ないし１００個、９０ないし１１５
個、１００ないし１２５個、および１１０ないし１１３
個のアミノ酸のものを挙げることができる。これに関連
して、「約」とは、特に列挙した範囲、ならびに数個、
わずかな、５、４、３、２、１個のアミノ酸残基の分だ
け大きいまたは小さい範囲であって、上限または下限、
あるいはそれらの両方の範囲を包含する。例えば、この
内容においては、約４０ないし９０個のアミノ酸は、４
０プラスまたはマイナス数個、わずかな、５、４、３、
２、１個のアミノ酸残基から、９０プラスまたはマイナ
ス数個、わずかな、５、４、３、２、１個のアミノ酸残
基までのポリペプチドフラグメントを意味し、すなわ
ち、最大４０マイナス数個のアミノ酸から９０プラス数
個のアミノ酸、最小４０プラス数個のアミノ酸から９０
マイナス数個のアミノ酸の範囲である。この点において
好ましくは、上限または下限、あるいはそれらの両方の
範囲において、列挙した範囲プラスまたはマイナス５個
程度のアミノ酸である。上限または下限、あるいはそれ
らの両方の範囲において、列挙した範囲プラスまたはマ
イナス３個程度のアミノ酸が特に非常に好ましい。上限
または下限、あるいはそれらの両方の範囲において、列
挙した範囲プラスまたはマイナス１個程度のアミノ酸、
または列挙した範囲に付加または欠失のないものが特に
非常に好ましい。この点において、約５ないし１５個、
１０ないし２０個、１５ないし４０個、３０ないし５５
個、４１ないし７５個、４１ないし８０個、４１ないし
９０個、５０ないし１００個、７５ないし１００個、９
０ないし１１５個、１００ないし１２５個、および１１
０ないし１１３個のアミノ酸の長さのフラグメントが、
すべてのうちで最も好ましい。
【００５３】本発明の特に好ましい具体例には、ヒト・
ミオトロフィンの平滑末端の変異体がある。平滑末端の
変異体は、アミノ末端を含む連続した一連の残基（すな
わち、連続領域、一部または部分）またはカルボキシル
末端を含む連続した一連の残基の欠失、あるいは両平滑
末端の変異体のような、２つの連続した一連の残基の欠
失、すなわち、アミノ末端における欠失およびカルボキ
シル末端における欠失を除く、図２のアミノ酸配列を有
するＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプチド、
またはその変種または誘導体を包含する。また、本発明
のこの態様において、ヒト・ミオトロフィンの構造的ま
たは機能的属性により特徴付けられるフラグメントが好
ましい。この点において本発明の好ましい具体例は、Ｉ
ｋＢ／ｒｅｌアンキリンに対して相同的なアンキリン繰
返し体を有してなるフラグメントを包含する。
ミオトロフィンの平滑末端の変異体がある。平滑末端の
変異体は、アミノ末端を含む連続した一連の残基（すな
わち、連続領域、一部または部分）またはカルボキシル
末端を含む連続した一連の残基の欠失、あるいは両平滑
末端の変異体のような、２つの連続した一連の残基の欠
失、すなわち、アミノ末端における欠失およびカルボキ
シル末端における欠失を除く、図２のアミノ酸配列を有
するＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプチド、
またはその変種または誘導体を包含する。また、本発明
のこの態様において、ヒト・ミオトロフィンの構造的ま
たは機能的属性により特徴付けられるフラグメントが好
ましい。この点において本発明の好ましい具体例は、Ｉ
ｋＢ／ｒｅｌアンキリンに対して相同的なアンキリン繰
返し体を有してなるフラグメントを包含する。
【００５４】さらに好ましい領域はヒト・ミオトロフィ
ンの活性を媒介する領域である。この点において、類似
活性または改善された活性または望ましくない活性の減
少したものを含め、ヒト・ミオトロフィンの化学的、生
物学的活性または他の活性を有するフラグメントが最も
好ましい。この点において、ＩｋＢα／ｒｅｌおよびＮ
Ｆ−ｋＢの他の阻害剤などの関連するポリペプチドの活
性領域に対して配列または位置、あるいは両方が相同的
である領域を含むフラグメントが非常に好ましい。
ンの活性を媒介する領域である。この点において、類似
活性または改善された活性または望ましくない活性の減
少したものを含め、ヒト・ミオトロフィンの化学的、生
物学的活性または他の活性を有するフラグメントが最も
好ましい。この点において、ＩｋＢα／ｒｅｌおよびＮ
Ｆ−ｋＢの他の阻害剤などの関連するポリペプチドの活
性領域に対して配列または位置、あるいは両方が相同的
である領域を含むフラグメントが非常に好ましい。
【００５５】本発明はまた、とりわけ、前記したフラグ
メントをコードするポリヌクレオチド、該フラグメント
をコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成する
ポリヌクレオチド、特にストリンジェントな条件下でハ
イブリッド形成するもの、および該フラグメントをコー
ドするポリヌクレオチドを増幅するためのＰＣＲプライ
マーなどのポリヌクレオチドに関する。これらの点にお
いて、好ましいポリヌクレオチドは、前記のような好ま
しいフラグメントに対応するポリヌクレオチドである。
メントをコードするポリヌクレオチド、該フラグメント
をコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成する
ポリヌクレオチド、特にストリンジェントな条件下でハ
イブリッド形成するもの、および該フラグメントをコー
ドするポリヌクレオチドを増幅するためのＰＣＲプライ
マーなどのポリヌクレオチドに関する。これらの点にお
いて、好ましいポリヌクレオチドは、前記のような好ま
しいフラグメントに対応するポリヌクレオチドである。
【００５６】ベクター、宿主細胞、発現 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、
本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞お
よび組換え法による本発明のポリペプチドの製造にも関
する。宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチドを取
り込ませ、本発明のポリペプチドを発現させることがで
きる。例えば、感染、トランスダクション、トランスフ
ェクション、トランスベクションおよび形質転換といっ
たよく知られた方法を用いて、ポリヌクレオチドを宿主
細胞中に導入してもよい。ポリヌクレオチドを単独また
は他のポリヌクレオチドと一緒に導入してもよい。他の
ポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドと別個に
導入するか、同時に導入するか、あるいは結合させて導
入してもよい。
本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞お
よび組換え法による本発明のポリペプチドの製造にも関
する。宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチドを取
り込ませ、本発明のポリペプチドを発現させることがで
きる。例えば、感染、トランスダクション、トランスフ
ェクション、トランスベクションおよび形質転換といっ
たよく知られた方法を用いて、ポリヌクレオチドを宿主
細胞中に導入してもよい。ポリヌクレオチドを単独また
は他のポリヌクレオチドと一緒に導入してもよい。他の
ポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドと別個に
導入するか、同時に導入するか、あるいは結合させて導
入してもよい。
【００５７】かくして、例えば、本発明のポリヌクレオ
チドを、例えば、哺乳動物細胞において同時トランスフ
ェクションおよび選択のための標準的方法を用いて、選
択可能マーカーをコードするもう１つ別のポリペプチド
で宿主細胞中にトランスフェクションしてもよい。この
場合、一般に、ポリヌクレオチドは宿主細胞ゲノム中に
安定に取り込まれるであろう。
チドを、例えば、哺乳動物細胞において同時トランスフ
ェクションおよび選択のための標準的方法を用いて、選
択可能マーカーをコードするもう１つ別のポリペプチド
で宿主細胞中にトランスフェクションしてもよい。この
場合、一般に、ポリヌクレオチドは宿主細胞ゲノム中に
安定に取り込まれるであろう。
【００５８】別法として、ポリヌクレオチドを、宿主に
おける増殖用の選択可能マーカーを有するベクターに結
合させてもよい。前記した方法により、ベクター構築物
を宿主細胞中に導入してもよい。一般に、プラスミドベ
クターは、リン酸カルシウム沈殿物のごとき沈殿物中、
あるいは荷電脂質との複合体中のＤＮＡとして導入され
る。さらに、エレクトロポレーションを用いてポリヌク
レオチドを宿主に導入してもよい。ベクターがウイルス
である場合、それをインビトロでパッケージし、または
パッケージ細胞中に導入し、そのパッケージウイルスを
細胞中に形質導入してもよい。本発明のこの態様によれ
ば、ポリヌクレオチドを製造し、ポリヌクレオチドを細
胞に導入するのに適当な多種の方法は当業者によく知ら
れた、慣用的なものである。かかる方法は、詳細に、Sa
mbrookらに詳細に記載されており、これらの方法を詳述
する多くの実験室マニュアルを説明している。
おける増殖用の選択可能マーカーを有するベクターに結
合させてもよい。前記した方法により、ベクター構築物
を宿主細胞中に導入してもよい。一般に、プラスミドベ
クターは、リン酸カルシウム沈殿物のごとき沈殿物中、
あるいは荷電脂質との複合体中のＤＮＡとして導入され
る。さらに、エレクトロポレーションを用いてポリヌク
レオチドを宿主に導入してもよい。ベクターがウイルス
である場合、それをインビトロでパッケージし、または
パッケージ細胞中に導入し、そのパッケージウイルスを
細胞中に形質導入してもよい。本発明のこの態様によれ
ば、ポリヌクレオチドを製造し、ポリヌクレオチドを細
胞に導入するのに適当な多種の方法は当業者によく知ら
れた、慣用的なものである。かかる方法は、詳細に、Sa
mbrookらに詳細に記載されており、これらの方法を詳述
する多くの実験室マニュアルを説明している。
【００５９】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えばプラスミドベクター、１本鎖または２本鎖のファ
ージベクター、１本鎖または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮ
Ａウイルスベクターであってもよい。かかるベクター
は、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するためのよく知
られた方法によって、ポリヌクレオチド、好ましくはＤ
ＮＡとして細胞中に導入される。ファージおよびウイル
スベクターの場合、感染およびトランスダクションにつ
いての周知方法によって、ベクターはまた、パッケージ
または封入ウイルスとして細胞中に導入されていてもよ
く、好ましくは導入されている。ウイルスベクターは複
製可能であってもよく、複製欠損であってもよい。後者
の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補的宿主細胞にお
いてのみ起こるであろう。ベクターには、ある態様にお
いて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
発現用ベクターが好ましい。一般に、かかるベクター
は、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結
された宿主中での発現に効果的なシス−作用性制御領域
を含んでなる。適当なトランス−作用性因子は、宿主に
より供給されるか、相補的ベクターにより供給される
か、または宿主中に導入した後のベクター自身によって
供給されるかである。
例えばプラスミドベクター、１本鎖または２本鎖のファ
ージベクター、１本鎖または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮ
Ａウイルスベクターであってもよい。かかるベクター
は、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するためのよく知
られた方法によって、ポリヌクレオチド、好ましくはＤ
ＮＡとして細胞中に導入される。ファージおよびウイル
スベクターの場合、感染およびトランスダクションにつ
いての周知方法によって、ベクターはまた、パッケージ
または封入ウイルスとして細胞中に導入されていてもよ
く、好ましくは導入されている。ウイルスベクターは複
製可能であってもよく、複製欠損であってもよい。後者
の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補的宿主細胞にお
いてのみ起こるであろう。ベクターには、ある態様にお
いて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
発現用ベクターが好ましい。一般に、かかるベクター
は、発現されるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結
された宿主中での発現に効果的なシス−作用性制御領域
を含んでなる。適当なトランス−作用性因子は、宿主に
より供給されるか、相補的ベクターにより供給される
か、または宿主中に導入した後のベクター自身によって
供給されるかである。
【００６０】この点における好ましい具体例において、
ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は
誘導可能な発現であってもよく、またはある型の細胞に
おいてのみ起こる発現であってもよく、または誘導可能
および細胞特異的の両方であってもよい。誘導可能なベ
クターの中でも、温度および栄養添加物などの操作容易
な環境因子によって発現を誘導することのできるベクタ
ーが、特に好ましい。原核細胞および真核細胞宿主にお
いて使用される構成的および誘導可能な発現ベクターを
含め、本発明のこの態様に適する種々のベクターは当業
者によく知られており、慣用的に使用されている。遺伝
子操作された宿主細胞は通常の栄養培地で培養すること
ができ、そのような培地は、とりわけプロモーターの活
性化、形質転換体の選択、または遺伝子の増幅に関し
て、適宜修飾されていてもよい。温度、ｐＨなどの、発
現のために選択される宿主細胞で予め使用された培養条
件は、一般に、本発明のポリペプチドの発現に適してお
り、それは当業者に明らかであろう。
ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異的発現は
誘導可能な発現であってもよく、またはある型の細胞に
おいてのみ起こる発現であってもよく、または誘導可能
および細胞特異的の両方であってもよい。誘導可能なベ
クターの中でも、温度および栄養添加物などの操作容易
な環境因子によって発現を誘導することのできるベクタ
ーが、特に好ましい。原核細胞および真核細胞宿主にお
いて使用される構成的および誘導可能な発現ベクターを
含め、本発明のこの態様に適する種々のベクターは当業
者によく知られており、慣用的に使用されている。遺伝
子操作された宿主細胞は通常の栄養培地で培養すること
ができ、そのような培地は、とりわけプロモーターの活
性化、形質転換体の選択、または遺伝子の増幅に関し
て、適宜修飾されていてもよい。温度、ｐＨなどの、発
現のために選択される宿主細胞で予め使用された培養条
件は、一般に、本発明のポリペプチドの発現に適してお
り、それは当業者に明らかであろう。
【００６１】多種の発現ベクターを用いて、本発明のポ
リペプチドを発現させることができる。かかるベクター
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵
母エピソーム、酵母染色体因子、バキュロウイルス、パ
ポーバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデ
ノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイ
ルス、アルファーウイルスおよびレトロウイルスから由
来のベクター、およびプラスミドおよびバクテリオファ
ージ遺伝的因子から由来のベクターなどのその組み合わ
せに由来のベクター、コスミドおよびファージミドを包
含する。この点における発現のために、一般に、宿主中
でポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチドを維
持、増殖または発現するのに適したベクターを用いるこ
とができる。
リペプチドを発現させることができる。かかるベクター
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵
母エピソーム、酵母染色体因子、バキュロウイルス、パ
ポーバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデ
ノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイ
ルス、アルファーウイルスおよびレトロウイルスから由
来のベクター、およびプラスミドおよびバクテリオファ
ージ遺伝的因子から由来のベクターなどのその組み合わ
せに由来のベクター、コスミドおよびファージミドを包
含する。この点における発現のために、一般に、宿主中
でポリペプチドを発現するためのポリヌクレオチドを維
持、増殖または発現するのに適したベクターを用いるこ
とができる。
【００６２】種々のよく知られた慣用的方法のいずれに
よっても、適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入すること
ができる。一般に、発現させるＤＮＡ配列を、そのＤＮ
Ａ配列および発現ベクターを１種またはそれ以上の制限
エンドヌクレアーゼで開裂させ、ついで、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて制限フラグメントを一緒に結合させる
ことにより、発現ベクターに結合させる。この目的に用
いることのできる制限的開裂およびライゲーションの操
作は当業者によく知られており、慣用的なものである。
この点における、および別法を用いて発現ベクターを構
築するための適当な操作も当業者によく知られており、
慣用的なものであり、Sambrookらに詳細に記載されてい
る。
よっても、適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入すること
ができる。一般に、発現させるＤＮＡ配列を、そのＤＮ
Ａ配列および発現ベクターを１種またはそれ以上の制限
エンドヌクレアーゼで開裂させ、ついで、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて制限フラグメントを一緒に結合させる
ことにより、発現ベクターに結合させる。この目的に用
いることのできる制限的開裂およびライゲーションの操
作は当業者によく知られており、慣用的なものである。
この点における、および別法を用いて発現ベクターを構
築するための適当な操作も当業者によく知られており、
慣用的なものであり、Sambrookらに詳細に記載されてい
る。
【００６３】発現ベクター中のＤＮＡ配列を、例えば、
ｍＲＮＡ転写を指令するプロモーターを含め、適当な発
現制御配列（複数でも可）に作動可能に連結する。かか
るプロモーターの代表例は、ファージ・ラムダＰＬプロ
モーター、エシェリキア・コリのｌａｃ、ｔｒｐおよび
ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモー
ターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターを包
含するが、それらは周知プロモーターのほんの例示に過
ぎない。本発明のこの態様にて有用な多数の他のプロモ
ーターはよく知られており、本明細書の記載および実施
例で説明されるようにして当業者であれば慣用的に使用
することができる。一般に、発現構築物は、転写開始部
位および停止部位、および、転写領域に翻訳のためのリ
ボソーム結合部位を有するであろう。構築物により発現
される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳されるべ
きポリペプチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧを、およ
び終わりの部分に適宜位置する終止コドンを含むであろ
う。
ｍＲＮＡ転写を指令するプロモーターを含め、適当な発
現制御配列（複数でも可）に作動可能に連結する。かか
るプロモーターの代表例は、ファージ・ラムダＰＬプロ
モーター、エシェリキア・コリのｌａｃ、ｔｒｐおよび
ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモー
ターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターを包
含するが、それらは周知プロモーターのほんの例示に過
ぎない。本発明のこの態様にて有用な多数の他のプロモ
ーターはよく知られており、本明細書の記載および実施
例で説明されるようにして当業者であれば慣用的に使用
することができる。一般に、発現構築物は、転写開始部
位および停止部位、および、転写領域に翻訳のためのリ
ボソーム結合部位を有するであろう。構築物により発現
される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳されるべ
きポリペプチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧを、およ
び終わりの部分に適宜位置する終止コドンを含むであろ
う。
【００６４】加えて、構築物は、発現を調節ならびに発
生させる制御領域を含んでいてもよい。一般に、多くの
通常なされる操作に従って、かかる領域は、転写を調節
することにより作動するであろう。例えば、とりわけ、
レプレッサー結合部位およびエンハンサーが挙げられ
る。一般に、増殖および発現のためのベクターは選択可
能なマーカーを有する。選択可能なマーカー遺伝子は形
質転換された宿主細胞を選択するための表現型特徴を提
供する。好ましいマーカーは、真核細胞を培養するため
のジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性のも
の、およびエシェリキア・コリおよび他の細菌を培養す
るためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝
子を包含するが、これに限定されるものではない。かか
るマーカーはまた、増幅に適していてもよい。また、ベ
クターがこの目的のための別のマーカーを有していても
よい。
生させる制御領域を含んでいてもよい。一般に、多くの
通常なされる操作に従って、かかる領域は、転写を調節
することにより作動するであろう。例えば、とりわけ、
レプレッサー結合部位およびエンハンサーが挙げられ
る。一般に、増殖および発現のためのベクターは選択可
能なマーカーを有する。選択可能なマーカー遺伝子は形
質転換された宿主細胞を選択するための表現型特徴を提
供する。好ましいマーカーは、真核細胞を培養するため
のジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性のも
の、およびエシェリキア・コリおよび他の細菌を培養す
るためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝
子を包含するが、これに限定されるものではない。かか
るマーカーはまた、増幅に適していてもよい。また、ベ
クターがこの目的のための別のマーカーを有していても
よい。
【００６５】所望のポリペプチドの宿主中での発現に適
した種々の周知方法を用いて、本明細書にて記載した適
当なＤＮＡ配列、ならびに適当なプロモーター、および
他の適当な制御配列を含むベクターを、適当な宿主中に
導入してもよい。適当な宿主の代表例は、エシェリキア
・コリ、ストレプトマイセス（Streptomyces）およびサ
ルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）
細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ドロソ
フィラ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ（Spodop
tera）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよ
びボウエス（Bowes）メラノーマ細胞などの動物細胞を
包含する。多種の発現構築物の宿主が周知であり、当業
者は本開示により本発明のこの態様に従ってポリペプチ
ドの発現のための宿主を容易に選択することができる。
より詳細には、本発明はまた、発現構築物などの組換え
構築物であって、１種またはそれ以上の前記した配列を
含んでなる組換え構築物を包含する。構築物は、本発明
のかかる配列がその中に挿入されたプラスミドまたはウ
イルスベクターなどのベクターからなる。配列は順方向
または逆方向に挿入することができる。この点におい
て、ある種の好ましい具体例において、構築物はさら
に、例えば、該配列に作動可能に連結されたプロモータ
ーを含め、調節配列を含んでなる。多数の適当なベクタ
ーおよびプロモーターが当業者に知られており、本発明
の使用に適した多数の市販のベクターがある。
した種々の周知方法を用いて、本明細書にて記載した適
当なＤＮＡ配列、ならびに適当なプロモーター、および
他の適当な制御配列を含むベクターを、適当な宿主中に
導入してもよい。適当な宿主の代表例は、エシェリキア
・コリ、ストレプトマイセス（Streptomyces）およびサ
ルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）
細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ドロソ
フィラ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ（Spodop
tera）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよ
びボウエス（Bowes）メラノーマ細胞などの動物細胞を
包含する。多種の発現構築物の宿主が周知であり、当業
者は本開示により本発明のこの態様に従ってポリペプチ
ドの発現のための宿主を容易に選択することができる。
より詳細には、本発明はまた、発現構築物などの組換え
構築物であって、１種またはそれ以上の前記した配列を
含んでなる組換え構築物を包含する。構築物は、本発明
のかかる配列がその中に挿入されたプラスミドまたはウ
イルスベクターなどのベクターからなる。配列は順方向
または逆方向に挿入することができる。この点におい
て、ある種の好ましい具体例において、構築物はさら
に、例えば、該配列に作動可能に連結されたプロモータ
ーを含め、調節配列を含んでなる。多数の適当なベクタ
ーおよびプロモーターが当業者に知られており、本発明
の使用に適した多数の市販のベクターがある。
【００６６】市販されている以下のベクターを例示とし
て提供する。細菌に使用するのに好ましいベクターに
は、Qiagenから市販されている、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９；Stratageneから市販されている、
ｐＢＳベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベ
クター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐ
ＮＨ４６Ａ；ならびに、Pharmaciaから市販されてい
る、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３
−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５がある。好ましい真核
細胞ベクターには、Stratageneから市販のｐＷＬＮＥ
Ｏ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳ
Ｇ；ならびに、Pharmaciaから市販のｐＳＶＫ３、ｐＢ
ＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。これらのベクタ
ーは、多くの市販されている、および、本発明のこの態
様により使用するために当業者によく知られたベクター
を例示するためにのみ列挙する。例えば、宿主中におけ
る本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導
入、維持、増殖または発現に適する他のプラスミドまた
はベクターを本発明のこの態様に使用してもよいことが
理解されよう。
て提供する。細菌に使用するのに好ましいベクターに
は、Qiagenから市販されている、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９；Stratageneから市販されている、
ｐＢＳベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベ
クター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐ
ＮＨ４６Ａ；ならびに、Pharmaciaから市販されてい
る、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３
−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５がある。好ましい真核
細胞ベクターには、Stratageneから市販のｐＷＬＮＥ
Ｏ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳ
Ｇ；ならびに、Pharmaciaから市販のｐＳＶＫ３、ｐＢ
ＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。これらのベクタ
ーは、多くの市販されている、および、本発明のこの態
様により使用するために当業者によく知られたベクター
を例示するためにのみ列挙する。例えば、宿主中におけ
る本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導
入、維持、増殖または発現に適する他のプラスミドまた
はベクターを本発明のこの態様に使用してもよいことが
理解されよう。
【００６７】プロモーター領域は、制限部位、または、
候補プロモーターフラグメント；すなわち、プロモータ
ーを含んでいるかもしれないフラグメントを導入するた
めの部位の下流の、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットのごとき、
プロモーター領域を欠くレポーター転写ユニットを含む
ベクターを用いて、所望の遺伝子から選択することがで
きる。周知のように、プロモーター含有フラグメントを
ベクター中にＣＡＴ遺伝子の上流の制限部位で導入する
ことにより、ＣＡＴ活性を生じさせ、それを標準的ＣＡ
Ｔアッセイにより検出することができる。この目的に適
するベクターはよく知られており、容易に入手できる。
かかるベクターとして、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ
７の２種類が挙げられる。かくして、本発明のポリヌク
レオチドの発現用のプロモーターはよく知られていて容
易に入手できるプロモーターだけでなく、レポーター遺
伝子を用いて上記方法により容易に得ることのできるプ
ロモーターも包含する。
候補プロモーターフラグメント；すなわち、プロモータ
ーを含んでいるかもしれないフラグメントを導入するた
めの部位の下流の、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットのごとき、
プロモーター領域を欠くレポーター転写ユニットを含む
ベクターを用いて、所望の遺伝子から選択することがで
きる。周知のように、プロモーター含有フラグメントを
ベクター中にＣＡＴ遺伝子の上流の制限部位で導入する
ことにより、ＣＡＴ活性を生じさせ、それを標準的ＣＡ
Ｔアッセイにより検出することができる。この目的に適
するベクターはよく知られており、容易に入手できる。
かかるベクターとして、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ
７の２種類が挙げられる。かくして、本発明のポリヌク
レオチドの発現用のプロモーターはよく知られていて容
易に入手できるプロモーターだけでなく、レポーター遺
伝子を用いて上記方法により容易に得ることのできるプ
ロモーターも包含する。
【００６８】本発明に係るポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの発現に適した既知細菌プロモーターには、エ
シェリキア・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモータ
ー、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモータ
ー、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモ
ーターがある。この点において適当な既知の真核細胞プ
ロモーターには、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、Ｒｏｕｓサルコーマウイルス（「ＲＳ
Ｖ」）のごときレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、
ならびにマウス・メタロチオネイン−Ｉプロモーターな
どのメタロチオネインプロモーターがある。宿主細胞中
での発現に適するベクターおよびプロモーターの選択は
周知操作であり、発現ベクターの構築、宿主中へのベク
ターの導入および宿主における発現のための必須方法
は、当業者にとって日常的なものである。本発明は、前
記の構築物を含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は、哺
乳動物細胞のごとき高等真核細胞、酵母細胞のごとき下
等真核細胞、または細菌細胞のごとき原核細胞であって
もよい。
ペプチドの発現に適した既知細菌プロモーターには、エ
シェリキア・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモータ
ー、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモータ
ー、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモ
ーターがある。この点において適当な既知の真核細胞プ
ロモーターには、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶ
チミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４
０プロモーター、Ｒｏｕｓサルコーマウイルス（「ＲＳ
Ｖ」）のごときレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、
ならびにマウス・メタロチオネイン−Ｉプロモーターな
どのメタロチオネインプロモーターがある。宿主細胞中
での発現に適するベクターおよびプロモーターの選択は
周知操作であり、発現ベクターの構築、宿主中へのベク
ターの導入および宿主における発現のための必須方法
は、当業者にとって日常的なものである。本発明は、前
記の構築物を含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は、哺
乳動物細胞のごとき高等真核細胞、酵母細胞のごとき下
等真核細胞、または細菌細胞のごとき原核細胞であって
もよい。
【００６９】構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カル
シウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン
により媒介されるトランスフェクション、陽イオン性脂
質により媒介されるトランスフェクション、エレクトロ
ポレーション、形質導入、感染または他の方法により、
行うことができる。かかる方法は、多くの標準的実験室
マニュアルに記載されている。宿主中の構築物を常法で
使用して、組換え配列によりコードされた遺伝子産物を
製造することができる。別法として、慣用的ペプチド合
成装置により本発明ポリペプチドを合成的に製造するこ
ともできる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞中で
発現させることができる。さらに、無細胞翻訳系を利用
して、本発明のＤＮＡ構築物から由来のＲＮＡを用い
て、かかるタンパク質を製造することもできる。原核宿
主および真核宿主とともに使用に適するクローニングお
よび発現ベクターは、Sambrookらにより記載されてい
る。
シウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン
により媒介されるトランスフェクション、陽イオン性脂
質により媒介されるトランスフェクション、エレクトロ
ポレーション、形質導入、感染または他の方法により、
行うことができる。かかる方法は、多くの標準的実験室
マニュアルに記載されている。宿主中の構築物を常法で
使用して、組換え配列によりコードされた遺伝子産物を
製造することができる。別法として、慣用的ペプチド合
成装置により本発明ポリペプチドを合成的に製造するこ
ともできる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞中で
発現させることができる。さらに、無細胞翻訳系を利用
して、本発明のＤＮＡ構築物から由来のＲＮＡを用い
て、かかるタンパク質を製造することもできる。原核宿
主および真核宿主とともに使用に適するクローニングお
よび発現ベクターは、Sambrookらにより記載されてい
る。
【００７０】一般に、組換え発現ベクターは、複製開始
点、下流の構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来
のプロモーター、およびベクターに曝露した後のベクタ
ー含有細胞の単離を可能にする選択可能マーカーを含
む。適当なプロモーターには、とりわけ、３−ホスホグ
リセレートキナーゼ（「ＰＧＫ」）などの糖分解酵素、
α−ファクター、酸ホスファターゼ、および熱ショック
タンパク質をコードする遺伝子由来のプロモーターがあ
る。選択可能マーカーは、エシェリキア・コリのアンピ
シリン耐性遺伝子およびスタフィロコッカス・セレビシ
エ（S.cerevisiae）のｔｒｐ１遺伝子を包含する。高等
真核生物により本発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａの転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入する
ことにより増大させることができる。エンハンサーは、
通常、約１０ないし３００ｂｐのＤＮＡのシス−作用性
エレメントであり、所定の宿主細胞型中でのプロモータ
ーの転写活性を増大させるように作用する。エンハンサ
ーの例は、複製開始点の後期側１００ないし２７０ｂｐ
に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイル
ス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側
にあるポリオーマエンハンサー、ならびにアデノウイル
スエンハンサーを包含する。
点、下流の構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来
のプロモーター、およびベクターに曝露した後のベクタ
ー含有細胞の単離を可能にする選択可能マーカーを含
む。適当なプロモーターには、とりわけ、３−ホスホグ
リセレートキナーゼ（「ＰＧＫ」）などの糖分解酵素、
α−ファクター、酸ホスファターゼ、および熱ショック
タンパク質をコードする遺伝子由来のプロモーターがあ
る。選択可能マーカーは、エシェリキア・コリのアンピ
シリン耐性遺伝子およびスタフィロコッカス・セレビシ
エ（S.cerevisiae）のｔｒｐ１遺伝子を包含する。高等
真核生物により本発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａの転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入する
ことにより増大させることができる。エンハンサーは、
通常、約１０ないし３００ｂｐのＤＮＡのシス−作用性
エレメントであり、所定の宿主細胞型中でのプロモータ
ーの転写活性を増大させるように作用する。エンハンサ
ーの例は、複製開始点の後期側１００ないし２７０ｂｐ
に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイル
ス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側
にあるポリオーマエンハンサー、ならびにアデノウイル
スエンハンサーを包含する。
【００７１】一般に、本発明のポリペプチドの異種構造
配列をコードする本発明のポリヌクレオチドを、発現用
プロモーターに作動可能に連結されるように標準的方法
を用いてベクター中に挿入する。転写開始部位がリボソ
ーム結合部位に対して５’付近に位置するようにポリヌ
クレオチドを配置する。リボソーム結合部位は、発現さ
れるポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５’
にある。一般に、通常、ＡＵＧである開始コドンから始
まり、リボソーム結合部位と開始コドンの間に位置する
他のオープン・リーディング・フレームはないであろ
う。また、一般に、ポリペプチド末端に翻訳終止コドン
が存在し、転写される領域の３’末端に適宜散在するポ
リアデニル化シグナルおよび転写終止シグナルが存在す
るであろう。適当な分泌シグナルを、小胞体ルーメン、
周辺腔または細胞外環境中への翻訳タンパク質の分泌の
ために、発現されるポリペプチド中に組み込ませてもよ
い。シグナルは、ポリペプチドに対して内在性のもので
あってもよく、あるいは異種的であってもよい。
配列をコードする本発明のポリヌクレオチドを、発現用
プロモーターに作動可能に連結されるように標準的方法
を用いてベクター中に挿入する。転写開始部位がリボソ
ーム結合部位に対して５’付近に位置するようにポリヌ
クレオチドを配置する。リボソーム結合部位は、発現さ
れるポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５’
にある。一般に、通常、ＡＵＧである開始コドンから始
まり、リボソーム結合部位と開始コドンの間に位置する
他のオープン・リーディング・フレームはないであろ
う。また、一般に、ポリペプチド末端に翻訳終止コドン
が存在し、転写される領域の３’末端に適宜散在するポ
リアデニル化シグナルおよび転写終止シグナルが存在す
るであろう。適当な分泌シグナルを、小胞体ルーメン、
周辺腔または細胞外環境中への翻訳タンパク質の分泌の
ために、発現されるポリペプチド中に組み込ませてもよ
い。シグナルは、ポリペプチドに対して内在性のもので
あってもよく、あるいは異種的であってもよい。
【００７２】ポリペプチドは、融合タンパク質のごとき
修飾形態で発現させることができ、分泌シグナルのみな
らず付加的な異種機能領域を含んでいてもよい。かくし
て、例えば、付加的アミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸
の領域をポリペプチドのＮ−末端に付加して、宿主細胞
における精製またはその後の取り扱いおよび保存の間の
安定性および維持性を改善してもよい。また、一の領域
をポリペプチドに付加し、精製を容易にしてもよい。か
かる領域は、最終的なポリペプチドの調製の前に除去す
ることができる。ペプチド部分をポリペプチドに付加
し、とりわけ、分泌または外分泌を引き起こし、安定性
を改善し、精製を容易にすることは、当業者によく知ら
れている日常的方法である。本発明に係るポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの増殖、維持または発現に適し
た原核宿主は、エシェリキア・コリ（Escherichia col
i）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）および
サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimuriu
m）を包含する。シュードモナス（Pseudomonas）、スト
レプトマイセス（Streptomyces）およびスタフィロコッ
カス（Staphylococcus）の様々な種もまた、この点にお
いて適当な宿主である。さらに、この点において、当業
者に知られている他の多くの宿主も使用可能である。
修飾形態で発現させることができ、分泌シグナルのみな
らず付加的な異種機能領域を含んでいてもよい。かくし
て、例えば、付加的アミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸
の領域をポリペプチドのＮ−末端に付加して、宿主細胞
における精製またはその後の取り扱いおよび保存の間の
安定性および維持性を改善してもよい。また、一の領域
をポリペプチドに付加し、精製を容易にしてもよい。か
かる領域は、最終的なポリペプチドの調製の前に除去す
ることができる。ペプチド部分をポリペプチドに付加
し、とりわけ、分泌または外分泌を引き起こし、安定性
を改善し、精製を容易にすることは、当業者によく知ら
れている日常的方法である。本発明に係るポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの増殖、維持または発現に適し
た原核宿主は、エシェリキア・コリ（Escherichia col
i）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）および
サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimuriu
m）を包含する。シュードモナス（Pseudomonas）、スト
レプトマイセス（Streptomyces）およびスタフィロコッ
カス（Staphylococcus）の様々な種もまた、この点にお
いて適当な宿主である。さらに、この点において、当業
者に知られている他の多くの宿主も使用可能である。
【００７３】限定するものではないが、一の代表例とし
て、細菌を用いるための有用な発現ベクターは、選択可
能なマーカーと、周知のクローニングベクターｐＢＲ３
２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的エレメントを有し
てなる市販プラスミドから由来の細菌の複製開始点とか
らなり得る。かかる市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ２
２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,Swede
n）およびＧＥＭ１（Promega Biotec, Madison,WI,US
A）を包含する。これらベクターにおいて、ｐＢＲ３２
２「骨格」部分を適当なプロモーターおよび発現すべき
構造配列と組み合わせる。適当な宿主株を形質転換した
後、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させる。選択
したプロモーターが誘導可能である場合には、適当な手
段（例えば、温度シフトまたは化学誘導剤に曝露）によ
りそれを誘導し、細胞をさらなる期間培養する。次い
で、典型的には、細胞を遠心分離により集め、物理的ま
たは化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物をさら
に精製に供する。
て、細菌を用いるための有用な発現ベクターは、選択可
能なマーカーと、周知のクローニングベクターｐＢＲ３
２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的エレメントを有し
てなる市販プラスミドから由来の細菌の複製開始点とか
らなり得る。かかる市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ２
２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,Swede
n）およびＧＥＭ１（Promega Biotec, Madison,WI,US
A）を包含する。これらベクターにおいて、ｐＢＲ３２
２「骨格」部分を適当なプロモーターおよび発現すべき
構造配列と組み合わせる。適当な宿主株を形質転換した
後、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させる。選択
したプロモーターが誘導可能である場合には、適当な手
段（例えば、温度シフトまたは化学誘導剤に曝露）によ
りそれを誘導し、細胞をさらなる期間培養する。次い
で、典型的には、細胞を遠心分離により集め、物理的ま
たは化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物をさら
に精製に供する。
【００７４】凍結−融解のサイクリング、超音波処理、
機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、慣用的方
法により、タンパク質発現に使用する微生物細胞を破壊
することができる。かかる方法は当業者によく知られて
いる。同様に、種々の哺乳動物細胞培養系を発現に使用
することができる。哺乳動物発現系の例は、Ｃ１２７、
３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨ
Ｋ細胞系ならびにGluzmanら、Cell，23：175（1981）に
記載されたサル・腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７細胞系を
包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当
なプロモーターおよびエンハンサー、および必要なリボ
ソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナ
ーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および発現
に必要とされる５’隣接非転写配列からなるであろう。
好ましい具体例において、ＳＶ４０スプライス部位およ
びＳＶ４０ポリアデニル化部位から由来のＤＮＡ配列
が、必須の非転写遺伝的エレメントとして用いられる。
機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、慣用的方
法により、タンパク質発現に使用する微生物細胞を破壊
することができる。かかる方法は当業者によく知られて
いる。同様に、種々の哺乳動物細胞培養系を発現に使用
することができる。哺乳動物発現系の例は、Ｃ１２７、
３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨ
Ｋ細胞系ならびにGluzmanら、Cell，23：175（1981）に
記載されたサル・腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７細胞系を
包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当
なプロモーターおよびエンハンサー、および必要なリボ
ソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナ
ーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および発現
に必要とされる５’隣接非転写配列からなるであろう。
好ましい具体例において、ＳＶ４０スプライス部位およ
びＳＶ４０ポリアデニル化部位から由来のＤＮＡ配列
が、必須の非転写遺伝的エレメントとして用いられる。
【００７５】ＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペ
プチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸
抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作
用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよ
びレクチンクロマトグラフィーを含むよく知られた方法
により、組換え細胞培養物から回収し、精製することが
できる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィ
ー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。単離または精製の
間にポリペプチドが変性する場合、タンパク質の再生す
るためのよく知られた方法を用いて活性コンフォメーシ
ョンを再生することができる。本発明のポリペプチド
は、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動
物細胞を含め、原核細胞または真核細胞宿主から組換え
技術により生成できる。組換え体産生法に用いる宿主に
よっては、本発明のポリペプチドは糖鎖形成されていて
も、糖鎖形成されていなくてもよい。加えて、本発明の
ポリペプチドは、ある場合には、宿主が介在する工程の
結果として、最初の修飾されたメチオニン残基を含みう
る。ＨＳＡＢＨ０１などのヒト・ミオトロフィンポリヌ
クレオチドおよびそれによりコードされるポリペプチド
を、本発明に従って、種々の用途、特にヒト・ミオトロ
フィンの化学的および生物学的特性を用いる用途に使用
することができる。さらなる用途は、細胞、組織および
器官の障害の診断および治療に関する。本発明のこれら
の態様を以下の議論によってさらに説明する。
プチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸
抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作
用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよ
びレクチンクロマトグラフィーを含むよく知られた方法
により、組換え細胞培養物から回収し、精製することが
できる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィ
ー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。単離または精製の
間にポリペプチドが変性する場合、タンパク質の再生す
るためのよく知られた方法を用いて活性コンフォメーシ
ョンを再生することができる。本発明のポリペプチド
は、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動
物細胞を含め、原核細胞または真核細胞宿主から組換え
技術により生成できる。組換え体産生法に用いる宿主に
よっては、本発明のポリペプチドは糖鎖形成されていて
も、糖鎖形成されていなくてもよい。加えて、本発明の
ポリペプチドは、ある場合には、宿主が介在する工程の
結果として、最初の修飾されたメチオニン残基を含みう
る。ＨＳＡＢＨ０１などのヒト・ミオトロフィンポリヌ
クレオチドおよびそれによりコードされるポリペプチド
を、本発明に従って、種々の用途、特にヒト・ミオトロ
フィンの化学的および生物学的特性を用いる用途に使用
することができる。さらなる用途は、細胞、組織および
器官の障害の診断および治療に関する。本発明のこれら
の態様を以下の議論によってさらに説明する。
【００７６】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断試薬として用いるための相補
的ポリヌクレオチドの検出のためのヒト・ミオトロフィ
ンポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に伴うヒ
ト・ミオトロフィンの検出は、疾患の診断、または疾患
に対する感受性に付加および定義することができる診断
用装置を提供することである。ヒト・ミオトロフィン遺
伝子またはこの遺伝子の変異体は、種々の方法により、
ＤＮＡレベルで検出することができる。診断のための核
酸を、血液、尿、唾液、生検および剖検材料などの患者
の細胞から得てもよい。ゲノムＤＮＡを検出用に直接使
用してもよく、または分析前にＰＣＲを用いることによ
り酵素的に増幅してもよい（Saikiら、Nature，324：16
3−166（1986））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同じように
使用してもよい。一例として、ＨＳＡＢＨ０１核酸配列
の一部に相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ヒト・ミ
オトロフィンの発現および変異を同定および分析するこ
とができる。例えば、正常な遺伝子型との比較にて増幅
産物の大きさが変化することにより、欠失および挿入を
検出することができる。増幅したＤＮＡを放射性標識し
たＨＳＡＢＨ０１ ＲＮＡまたは放射性標識したＨＳＡ
ＢＨ０１アンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイゼーシ
ョンさせることにより、点突然変異を同定することがで
きる。好ましくは、ＲＮａｓｅ Ａ消化または融点温度
の相違により、対合した配列と誤対合の２本鎖を識別す
ることができる。
的ポリヌクレオチドの検出のためのヒト・ミオトロフィ
ンポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に伴うヒ
ト・ミオトロフィンの検出は、疾患の診断、または疾患
に対する感受性に付加および定義することができる診断
用装置を提供することである。ヒト・ミオトロフィン遺
伝子またはこの遺伝子の変異体は、種々の方法により、
ＤＮＡレベルで検出することができる。診断のための核
酸を、血液、尿、唾液、生検および剖検材料などの患者
の細胞から得てもよい。ゲノムＤＮＡを検出用に直接使
用してもよく、または分析前にＰＣＲを用いることによ
り酵素的に増幅してもよい（Saikiら、Nature，324：16
3−166（1986））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同じように
使用してもよい。一例として、ＨＳＡＢＨ０１核酸配列
の一部に相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ヒト・ミ
オトロフィンの発現および変異を同定および分析するこ
とができる。例えば、正常な遺伝子型との比較にて増幅
産物の大きさが変化することにより、欠失および挿入を
検出することができる。増幅したＤＮＡを放射性標識し
たＨＳＡＢＨ０１ ＲＮＡまたは放射性標識したＨＳＡ
ＢＨ０１アンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイゼーシ
ョンさせることにより、点突然変異を同定することがで
きる。好ましくは、ＲＮａｓｅ Ａ消化または融点温度
の相違により、対合した配列と誤対合の２本鎖を識別す
ることができる。
【００７７】直接的ＤＮＡ配列決定により、対照標準の
遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明ら
かとなりうる。加えて、クローン化されたＤＮＡセグメ
ントをプローブとして用い、特定のＤＮＡセグメントを
検出してもよい。ＰＣＲまたは他の増幅方法を適宜用い
ることにより、かかる方法の感度を非常に向上させるこ
とができる。例えば、配列決定用プライマーを、２本鎖
ＰＣＲ産物またはＰＣＲ変法により得られた１本鎖鋳型
分子とともに使用する。放射性標識されたヌクレオチド
を用いる慣用的操作により、または蛍光タグを用いる自
動式配列決定法により配列決定を行う。変性剤と共にま
たは無しで、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度
の変化を検出することにより、ＤＮＡ配列の相違に基づ
く遺伝的試験を行うことができる。高分解能ゲル電気泳
動により、小規模な配列の欠失および挿入を可視化する
ことができる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、そ
の特異的融点または部分的融解温度によって、異なるＤ
ＮＡフラグメントの移動がゲル中の異なる位置で遅延す
る、変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別することができ
る（例えば、Myersら、Science，230：1242（1985）を
参照のこと）。
遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明ら
かとなりうる。加えて、クローン化されたＤＮＡセグメ
ントをプローブとして用い、特定のＤＮＡセグメントを
検出してもよい。ＰＣＲまたは他の増幅方法を適宜用い
ることにより、かかる方法の感度を非常に向上させるこ
とができる。例えば、配列決定用プライマーを、２本鎖
ＰＣＲ産物またはＰＣＲ変法により得られた１本鎖鋳型
分子とともに使用する。放射性標識されたヌクレオチド
を用いる慣用的操作により、または蛍光タグを用いる自
動式配列決定法により配列決定を行う。変性剤と共にま
たは無しで、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度
の変化を検出することにより、ＤＮＡ配列の相違に基づ
く遺伝的試験を行うことができる。高分解能ゲル電気泳
動により、小規模な配列の欠失および挿入を可視化する
ことができる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、そ
の特異的融点または部分的融解温度によって、異なるＤ
ＮＡフラグメントの移動がゲル中の異なる位置で遅延す
る、変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別することができ
る（例えば、Myersら、Science，230：1242（1985）を
参照のこと）。
【００７８】特定位置での配列の変化はまた、ＲＮase
およびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイまたは
化学的開裂法により明らかとなる（例えば、Cottonら、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：4397−4401（1985））。
かくして、ハイブリダイゼーション、ＲＮase保護、化
学的開裂、直接的ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用
（例えば、制限フラグメント長多型性（「ＲＦＬ
Ｐ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングな
どの方法により、特定のＤＮＡ配列の検出を行うことが
できる。
およびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイまたは
化学的開裂法により明らかとなる（例えば、Cottonら、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：4397−4401（1985））。
かくして、ハイブリダイゼーション、ＲＮase保護、化
学的開裂、直接的ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用
（例えば、制限フラグメント長多型性（「ＲＦＬ
Ｐ」））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングな
どの方法により、特定のＤＮＡ配列の検出を行うことが
できる。
【００７９】本発明のさらなる態様によれば、とりわ
け、糖尿病性腎障害および高血圧誘発腎障害などの細胞
肥大、良性前立腺肥大、再発狭窄症、アテローム性動脈
硬化症、動脈瘤および発作に関連する疾患または障害、
特にうっ血性心不全、拡張した心筋症および高血圧など
の心臓肥大に関連する疾患に対する感受性を診断または
測定する方法が提供される。ヒト・ミオトロフィン遺伝
子の検出は、とりわけ、糖尿病性腎障害および高血圧誘
発腎障害などの細胞肥大、良性前立腺肥大、再発狭窄
症、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤および発作に関連
する疾患または障害、特にうっ血性心不全、拡張した心
筋症および高血圧などの心臓肥大に関連する疾患に対す
る感受性の指標であってもよい；前記した核酸配列はか
かる感受性を確認するためのアッセイにて用いることが
できる。。
け、糖尿病性腎障害および高血圧誘発腎障害などの細胞
肥大、良性前立腺肥大、再発狭窄症、アテローム性動脈
硬化症、動脈瘤および発作に関連する疾患または障害、
特にうっ血性心不全、拡張した心筋症および高血圧など
の心臓肥大に関連する疾患に対する感受性を診断または
測定する方法が提供される。ヒト・ミオトロフィン遺伝
子の検出は、とりわけ、糖尿病性腎障害および高血圧誘
発腎障害などの細胞肥大、良性前立腺肥大、再発狭窄
症、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤および発作に関連
する疾患または障害、特にうっ血性心不全、拡張した心
筋症および高血圧などの心臓肥大に関連する疾患に対す
る感受性の指標であってもよい；前記した核酸配列はか
かる感受性を確認するためのアッセイにて用いることが
できる。。
【００８０】本発明は、疾患または障害、特に、とりわ
け、糖尿病性腎障害および高血圧誘発腎障害などの細胞
肥大、良性前立腺肥大、再発狭窄症、アテローム性動脈
硬化症、動脈瘤および発作に関連する疾患または障害、
およびうっ血性心不全、拡張した心筋症および高血圧な
どの心臓肥大に関連する疾患の診断方法であって、図１
（配列番号１）の配列を有するポリヌクレオチドの発現
レベルの異常な減少または増加を、患者から由来の試料
より決定することからなる方法を提供する。ポリヌクレ
オチドの発現の減少または増加は、例えば、ＰＣＲ、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノザンブロッティングおよ
び他のハイブリダイゼーション法などのポリヌクレオチ
ド定量のための当該分野でよく知られた方法を用いて測
定できる。より慣用的なゲル電気泳動法およびＤＮＡ配
列決定法に加えて、突然変異をインシテュ分析により検
出することもできる。
け、糖尿病性腎障害および高血圧誘発腎障害などの細胞
肥大、良性前立腺肥大、再発狭窄症、アテローム性動脈
硬化症、動脈瘤および発作に関連する疾患または障害、
およびうっ血性心不全、拡張した心筋症および高血圧な
どの心臓肥大に関連する疾患の診断方法であって、図１
（配列番号１）の配列を有するポリヌクレオチドの発現
レベルの異常な減少または増加を、患者から由来の試料
より決定することからなる方法を提供する。ポリヌクレ
オチドの発現の減少または増加は、例えば、ＰＣＲ、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノザンブロッティングおよ
び他のハイブリダイゼーション法などのポリヌクレオチ
ド定量のための当該分野でよく知られた方法を用いて測
定できる。より慣用的なゲル電気泳動法およびＤＮＡ配
列決定法に加えて、突然変異をインシテュ分析により検
出することもできる。
【００８１】染色体アッセイ 本発明の配列はまた、染色体同定についても価値があ
る。該配列を特異的に標的とし、個々のヒト染色体上の
特定の位置でハイブリダイゼーションさせることができ
る。さらには、染色体上の特定の部位を同定することに
対する要求がある。染色体位置をマーキングするため
の、実際の配列データ（反復多型性）に基づいた染色体
マーキング試薬は、現在ほとんど手に入らない。本発明
によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、その配列を疾
患に関係した遺伝子と相関付ける重要な第一工程であ
る。簡単には、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好まし
くは１５−２５ｂｐ）を調製することによって、配列を
染色体に対してマッピングできる。一つ以上のエクソン
に広がるプライマーは増幅工程を混乱させ得るため、
３’非翻訳領域のコンピューター解析を用いて、ゲノム
ＤＮＡ中に一つ以上のエクソンが広がっていないプライ
マーを迅速に選択する。ついで、これらのプライマーを
個々のヒト染色体を含有する体細胞雑種のＰＣＲスクリ
ーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子
を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを有するで
あろう。
る。該配列を特異的に標的とし、個々のヒト染色体上の
特定の位置でハイブリダイゼーションさせることができ
る。さらには、染色体上の特定の部位を同定することに
対する要求がある。染色体位置をマーキングするため
の、実際の配列データ（反復多型性）に基づいた染色体
マーキング試薬は、現在ほとんど手に入らない。本発明
によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、その配列を疾
患に関係した遺伝子と相関付ける重要な第一工程であ
る。簡単には、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好まし
くは１５−２５ｂｐ）を調製することによって、配列を
染色体に対してマッピングできる。一つ以上のエクソン
に広がるプライマーは増幅工程を混乱させ得るため、
３’非翻訳領域のコンピューター解析を用いて、ゲノム
ＤＮＡ中に一つ以上のエクソンが広がっていないプライ
マーを迅速に選択する。ついで、これらのプライマーを
個々のヒト染色体を含有する体細胞雑種のＰＣＲスクリ
ーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子
を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを有するで
あろう。
【００８２】体細胞雑種のＰＣＲマッピングは、個々の
ＤＮＡを個々の染色体に帰属させるための迅速な方法で
ある。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーに用
いると、サブローカリゼーションは特定の染色体からの
フラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプ
ールで同様の方法にて達成することができる。同様に、
染色体への地図作成に用いることができる他のマッピン
グ法は、in situハイブリダイゼーション、標識された
フロー−ソーティド（flow-sorted）染色体でのプレス
クリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリ
ーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ
選択を包含する。ｃＤＮＡクローンを中期染色体スプレ
ッドに対して蛍光in situハイブリダイゼーション（Ｆ
ＩＳＨ）に付し、正確な染色体位置を１工程で知ること
ができる。この方法は、５０ないし６０塩基の短いｃＤ
ＮＡを用いることができる。この方法の報文として、Ve
rmaら、HUMAN CHROMOSOMES：A MANUAL OF BASIC TECHNI
QUES，Pergamon press，New York （1988）を参照のこ
と。
ＤＮＡを個々の染色体に帰属させるための迅速な方法で
ある。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーに用
いると、サブローカリゼーションは特定の染色体からの
フラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプ
ールで同様の方法にて達成することができる。同様に、
染色体への地図作成に用いることができる他のマッピン
グ法は、in situハイブリダイゼーション、標識された
フロー−ソーティド（flow-sorted）染色体でのプレス
クリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリ
ーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ
選択を包含する。ｃＤＮＡクローンを中期染色体スプレ
ッドに対して蛍光in situハイブリダイゼーション（Ｆ
ＩＳＨ）に付し、正確な染色体位置を１工程で知ること
ができる。この方法は、５０ないし６０塩基の短いｃＤ
ＮＡを用いることができる。この方法の報文として、Ve
rmaら、HUMAN CHROMOSOMES：A MANUAL OF BASIC TECHNI
QUES，Pergamon press，New York （1988）を参照のこ
と。
【００８３】この方法をいかにして行うのかという一例
として、ヒト・ミオトロフィン ＤＮＡを消化し、QIAEX
II ＤＮＡ精製キット（Qiagen，Inc.，Chatsworth，Ｃ
Ａ）を用いて精製し、Super Cos１ コスミドベクター
（Stratagene，La Jolla，ＣＡ）に連結する。Qiagen P
lasmid Purification Kit（Qiagen，Inc，Chatsworth，
ＣＡ）を用いてＤＮＡを精製し、BioNick Labeling Kit
（GibcoBRL，Life Technologies Inc.，Gaithersburg，
ＭＤ）を用いてビオチン−ｄＡＴＰの存在下でニックト
ランスレーションにより１ｍｇを標識する。GENE-TECT
Detection System（Clontech Laboratories，Inc. Palo
Alto，ＣＡ）を用いてビオチン化を検出する。ONCOR L
ight Hybridization Kit（Oncor，Gaithersburg，Ｍ
Ｄ）を用いてin situハイブリダイゼーションをスライ
ド上で行って、中期染色体上の単一コピー配列を検出す
る。２０％ＦＣＳ、３％ ＰＨＡおよびペニシリン／ス
トレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ １６４０中で正
常ドナーの末梢血を３日間培養し、１０-7Ｍメトトレキ
セートで１７時間同調させ、補足物不含ＲＰＭＩで２回
洗浄する。細胞を１０-3Ｍチミジンとともに７時間イン
キュベーションする。コルセミド（０.５μｇ／ｍｌ）
とともに２０分のインキュベーション後、細胞を中期で
捕捉し、つづいて７５ｍＭ ＫＣｌ中３７℃で１５分
間、低張溶解を行う。ついで、細胞ペレットを遠心分離
し、Carnoy’sの固定液（メタノール：酢酸（３：
１））中で固定する。
として、ヒト・ミオトロフィン ＤＮＡを消化し、QIAEX
II ＤＮＡ精製キット（Qiagen，Inc.，Chatsworth，Ｃ
Ａ）を用いて精製し、Super Cos１ コスミドベクター
（Stratagene，La Jolla，ＣＡ）に連結する。Qiagen P
lasmid Purification Kit（Qiagen，Inc，Chatsworth，
ＣＡ）を用いてＤＮＡを精製し、BioNick Labeling Kit
（GibcoBRL，Life Technologies Inc.，Gaithersburg，
ＭＤ）を用いてビオチン−ｄＡＴＰの存在下でニックト
ランスレーションにより１ｍｇを標識する。GENE-TECT
Detection System（Clontech Laboratories，Inc. Palo
Alto，ＣＡ）を用いてビオチン化を検出する。ONCOR L
ight Hybridization Kit（Oncor，Gaithersburg，Ｍ
Ｄ）を用いてin situハイブリダイゼーションをスライ
ド上で行って、中期染色体上の単一コピー配列を検出す
る。２０％ＦＣＳ、３％ ＰＨＡおよびペニシリン／ス
トレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ １６４０中で正
常ドナーの末梢血を３日間培養し、１０-7Ｍメトトレキ
セートで１７時間同調させ、補足物不含ＲＰＭＩで２回
洗浄する。細胞を１０-3Ｍチミジンとともに７時間イン
キュベーションする。コルセミド（０.５μｇ／ｍｌ）
とともに２０分のインキュベーション後、細胞を中期で
捕捉し、つづいて７５ｍＭ ＫＣｌ中３７℃で１５分
間、低張溶解を行う。ついで、細胞ペレットを遠心分離
し、Carnoy’sの固定液（メタノール：酢酸（３：
１））中で固定する。
【００８４】１滴の懸濁液をスライドに添加し、その懸
濁液を風乾することにより中期スプレッドを調製する。
ブロッキング・ヒト・胎盤ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）を含
む１０ｍｌのハイブリダイゼーション混合物（５０％ホ
ルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％デキストラン硫酸）に懸
濁させた１００ｎｇのプローブを添加することによりハ
イブリダイゼーションを行う。プローブ混合物を７０℃
の水浴で１０分間変性させ、３７℃で１時間インキュベ
ーションし、予備加温した（３７℃）スライド上に置
く。それは予め７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ中７０
℃で変性させ、エタノール種で脱水し、４℃に冷却して
おいたものである。スライドを加湿チャンバ中３７℃で
１６時間インキュベーションする。スライドを５０％ホ
ルムアミド／２ＸＳＳＣで１０分間４１℃で洗浄し、２
ＸＳＳＣで３７℃で７分間洗浄する。製造者のプロトコ
ルに従って、スライドをＦＩＴＣ−アビジン（Oncor，G
aithersburg，ＭＤ）とともにインキュベーションする
ことによりハイブリダイゼーションプローブを検出す
る。マウンティング培地に懸濁させたヨウ化プロプリデ
ィウムで染色体を対比染色する。スライドをLeitz ORTH
OPLAN ２−エピ蛍光顕微鏡を用いて可視化し、Imagenet
ics ComputerおよびMacIntoshプリンターを用いて５つ
のコンピューター映像を得る。
濁液を風乾することにより中期スプレッドを調製する。
ブロッキング・ヒト・胎盤ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）を含
む１０ｍｌのハイブリダイゼーション混合物（５０％ホ
ルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％デキストラン硫酸）に懸
濁させた１００ｎｇのプローブを添加することによりハ
イブリダイゼーションを行う。プローブ混合物を７０℃
の水浴で１０分間変性させ、３７℃で１時間インキュベ
ーションし、予備加温した（３７℃）スライド上に置
く。それは予め７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ中７０
℃で変性させ、エタノール種で脱水し、４℃に冷却して
おいたものである。スライドを加湿チャンバ中３７℃で
１６時間インキュベーションする。スライドを５０％ホ
ルムアミド／２ＸＳＳＣで１０分間４１℃で洗浄し、２
ＸＳＳＣで３７℃で７分間洗浄する。製造者のプロトコ
ルに従って、スライドをＦＩＴＣ−アビジン（Oncor，G
aithersburg，ＭＤ）とともにインキュベーションする
ことによりハイブリダイゼーションプローブを検出す
る。マウンティング培地に懸濁させたヨウ化プロプリデ
ィウムで染色体を対比染色する。スライドをLeitz ORTH
OPLAN ２−エピ蛍光顕微鏡を用いて可視化し、Imagenet
ics ComputerおよびMacIntoshプリンターを用いて５つ
のコンピューター映像を得る。
【００８５】配列が正確な染色体位置にマッピングされ
ると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデ
ータと相関させることができる。かかるデータは、例え
ば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（Joh
ns Hopkins University Welch Medical Libraryからオ
ンラインで利用可能）に見られる。ついで、同じ染色体
領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関連を連関分
析（物理的に近接した遺伝子の同時遺伝）を介して同定
する。感染した個体と感染していない個体間のｃＤＮＡ
またはゲノム配列の相違を決定することが必要である。
感染した個体の一部または全部において変異が観察され
るが、正常な個体においては変異が観察されない場合に
は、その変異がその疾患の病因である可能性がある。現
在の物理的マッピングおよび遺伝学的マッピング法の分
解では、疾患に関連した染色体領域と正確に位置決めさ
れるｃＤＮＡは、１メガ塩基のマッピング分解および２
０ｋｂ当たり１遺伝子と仮定して５０ないし５００個の
潜在的病因遺伝子のうちの１つとすることができる。
ると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデ
ータと相関させることができる。かかるデータは、例え
ば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（Joh
ns Hopkins University Welch Medical Libraryからオ
ンラインで利用可能）に見られる。ついで、同じ染色体
領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関連を連関分
析（物理的に近接した遺伝子の同時遺伝）を介して同定
する。感染した個体と感染していない個体間のｃＤＮＡ
またはゲノム配列の相違を決定することが必要である。
感染した個体の一部または全部において変異が観察され
るが、正常な個体においては変異が観察されない場合に
は、その変異がその疾患の病因である可能性がある。現
在の物理的マッピングおよび遺伝学的マッピング法の分
解では、疾患に関連した染色体領域と正確に位置決めさ
れるｃＤＮＡは、１メガ塩基のマッピング分解および２
０ｋｂ当たり１遺伝子と仮定して５０ないし５００個の
潜在的病因遺伝子のうちの１つとすることができる。
【００８６】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、細胞および組織中のヒト・ミオトロフィ
ンタンパク質レベルを検出するための診断アッセイに関
する。かかるアッセイは定量的または定性的であっても
よい。かくして、例えば、正常対照組織試料と比較して
ヒト・ミオトロフィンタンパク質の過剰発現を検出する
ための本発明の診断アッセイを用いて、とりわけ、糖尿
病性腎障害および高血圧誘発腎障害などの細胞肥大、良
性前立腺肥大、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化症、
動脈瘤および発作に関連する疾患／障害、特にうっ血性
心不全、拡張した心筋症および高血圧などの心臓肥大に
関連する疾患の存在を検出することができる。宿主由来
の試料中の本発明のヒト・ミオトロフィンタンパク質の
ごときタンパク質のレベルを決定するのに用いることの
できるアッセイ法は当業者によく知られている。かかる
アッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセ
イ、ウェスタンブロット分析および酵素結合イムノソル
ベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を包含する。これらのう
ち、ＥＬＩＳＡが好ましいことが多い。ＥＬＩＳＡアッ
セイは、最初にヒト・ミオトロフィンに特異的な抗体、
好ましくはモノクローナル抗体を調製することからな
る。加えて、一般に、モノクローナル抗体に結合するレ
ポーター抗体を調製する。レポーター抗体は、放射性試
薬、蛍光試薬または酵素試薬のごとき検出可能試薬に結
合する。本明細書の実施例では、ホースラディッシュ・
ペルオキシダーゼ酵素に結合している。
ンタンパク質レベルを検出するための診断アッセイに関
する。かかるアッセイは定量的または定性的であっても
よい。かくして、例えば、正常対照組織試料と比較して
ヒト・ミオトロフィンタンパク質の過剰発現を検出する
ための本発明の診断アッセイを用いて、とりわけ、糖尿
病性腎障害および高血圧誘発腎障害などの細胞肥大、良
性前立腺肥大、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化症、
動脈瘤および発作に関連する疾患／障害、特にうっ血性
心不全、拡張した心筋症および高血圧などの心臓肥大に
関連する疾患の存在を検出することができる。宿主由来
の試料中の本発明のヒト・ミオトロフィンタンパク質の
ごときタンパク質のレベルを決定するのに用いることの
できるアッセイ法は当業者によく知られている。かかる
アッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセ
イ、ウェスタンブロット分析および酵素結合イムノソル
ベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を包含する。これらのう
ち、ＥＬＩＳＡが好ましいことが多い。ＥＬＩＳＡアッ
セイは、最初にヒト・ミオトロフィンに特異的な抗体、
好ましくはモノクローナル抗体を調製することからな
る。加えて、一般に、モノクローナル抗体に結合するレ
ポーター抗体を調製する。レポーター抗体は、放射性試
薬、蛍光試薬または酵素試薬のごとき検出可能試薬に結
合する。本明細書の実施例では、ホースラディッシュ・
ペルオキシダーゼ酵素に結合している。
【００８７】ＥＬＩＳＡを行うために、試料を宿主から
取り出し、試料中のタンパク質に結合する固体支持体、
例えば、ポリスチレン皿上でインキュベーションする。
ついで、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質
とともにインキュベーションすることにより、皿上の遊
離タンパク質結合部位を被覆する。ついで、モノクロー
ナル抗体を皿中でインキュベーションし、その間にモノ
クローナル抗体は、ポリスチレン皿に結合しているミオ
トロフィンタンパク質に結合する。未結合モノクローナ
ル抗体をバッファーで洗い流す。ホースラディッシュ・
ペルオキシダーゼに連結したレポーター抗体を皿中に入
れ、レポーター抗体とヒト・ミオトロフィンタンパク質
に結合しているモノクローナル抗体との結合を生じさせ
る。ついで、未結合レポーター抗体を洗い流す。つい
で、発色基質を含め、ペルオキシダーゼ活性のための試
薬を皿に添加する。１次抗体および２次抗体を介してヒ
ト・ミオトロフィンに結合し、固定されているペルオキ
シダーゼは、着色反応生成物を生成する。所定の時間に
発色した量は試料中のヒト・ミオトロフィンタンパク質
量を示す。典型的には、標準曲線と比較することにより
定量的結果が得られる。競合アッセイはまた、固体支持
体に結合するヒト・ミオトロフィンに特異的な抗体、Ｈ
ＳＡＢＨ０１によりコードされる標識したヒト・ミオト
ロフィンおよび宿主由来の試料を、固体支持体上を通す
ことで用いられる。固体支持体に結合した標識の検出量
を試料中のヒト・ミオトロフィン量と相関させることが
できる。
取り出し、試料中のタンパク質に結合する固体支持体、
例えば、ポリスチレン皿上でインキュベーションする。
ついで、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質
とともにインキュベーションすることにより、皿上の遊
離タンパク質結合部位を被覆する。ついで、モノクロー
ナル抗体を皿中でインキュベーションし、その間にモノ
クローナル抗体は、ポリスチレン皿に結合しているミオ
トロフィンタンパク質に結合する。未結合モノクローナ
ル抗体をバッファーで洗い流す。ホースラディッシュ・
ペルオキシダーゼに連結したレポーター抗体を皿中に入
れ、レポーター抗体とヒト・ミオトロフィンタンパク質
に結合しているモノクローナル抗体との結合を生じさせ
る。ついで、未結合レポーター抗体を洗い流す。つい
で、発色基質を含め、ペルオキシダーゼ活性のための試
薬を皿に添加する。１次抗体および２次抗体を介してヒ
ト・ミオトロフィンに結合し、固定されているペルオキ
シダーゼは、着色反応生成物を生成する。所定の時間に
発色した量は試料中のヒト・ミオトロフィンタンパク質
量を示す。典型的には、標準曲線と比較することにより
定量的結果が得られる。競合アッセイはまた、固体支持
体に結合するヒト・ミオトロフィンに特異的な抗体、Ｈ
ＳＡＢＨ０１によりコードされる標識したヒト・ミオト
ロフィンおよび宿主由来の試料を、固体支持体上を通す
ことで用いられる。固体支持体に結合した標識の検出量
を試料中のヒト・ミオトロフィン量と相関させることが
できる。
【００８８】抗体 ＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプチド、その
フラグメントまたは他の誘導体、またはそのアナログ、
またはそれらを発現する細胞を、それらに対する抗体を
製造するための免疫原として使用することができる。こ
れらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクロ
ーナル抗体であってよい。本発明は、キメラ、単鎖およ
びヒト化抗体ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａ
ｂ発現ライブラリーの生成物も包含する。当該分野で知
られた種々の操作をかかる抗体およびフラグメントの製
造に用いてもよい。本発明のＨＳＡＢＨ０１によりコー
ドされるポリペプチドに拮抗して生成される抗体は、ポ
リペプチドを動物、好ましくはヒト以外の動物に直接注
射することにより得ることができる。そのようにして得
られた抗体はポリペプチド自体と結合する。このよう
に、ポリペプチドのフラグメントだけをコードする配列
であっても、完全に無傷のポリペプチドに結合する抗体
を得るのに用いることができる。ついで、かかる抗体を
用いて、ポリペプチドを発現する組織からそのポリペプ
チドを単離することができる。
フラグメントまたは他の誘導体、またはそのアナログ、
またはそれらを発現する細胞を、それらに対する抗体を
製造するための免疫原として使用することができる。こ
れらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクロ
ーナル抗体であってよい。本発明は、キメラ、単鎖およ
びヒト化抗体ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａ
ｂ発現ライブラリーの生成物も包含する。当該分野で知
られた種々の操作をかかる抗体およびフラグメントの製
造に用いてもよい。本発明のＨＳＡＢＨ０１によりコー
ドされるポリペプチドに拮抗して生成される抗体は、ポ
リペプチドを動物、好ましくはヒト以外の動物に直接注
射することにより得ることができる。そのようにして得
られた抗体はポリペプチド自体と結合する。このよう
に、ポリペプチドのフラグメントだけをコードする配列
であっても、完全に無傷のポリペプチドに結合する抗体
を得るのに用いることができる。ついで、かかる抗体を
用いて、ポリペプチドを発現する組織からそのポリペプ
チドを単離することができる。
【００８９】モノクローナル抗体を調製する場合、連続
細胞培養系により産生される抗体を提供するいずれの方
法も用いることができる。例えば、ハイブリドーマ法
（Kohler,G.およびMilstein,C.、Nature，256：495-497
（1975））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドー
マ法（Kozborら、Immunology Today，4：72（1983））
およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、MONOCLONAL
ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY，７７-９６頁、Alan
R.Liss,Inc,（1985））が挙げられる。さらに、単鎖抗
体の製造について記載されている方法（米国特許第４,
９４６,７７８号）を用いて、本発明の免疫原性ポリペ
プチド生成物に対する単鎖抗体を製造することができ
る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳
動物を含む他の生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペ
プチド産物に対するヒト化抗体を発現させてもよい。
細胞培養系により産生される抗体を提供するいずれの方
法も用いることができる。例えば、ハイブリドーマ法
（Kohler,G.およびMilstein,C.、Nature，256：495-497
（1975））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドー
マ法（Kozborら、Immunology Today，4：72（1983））
およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、MONOCLONAL
ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY，７７-９６頁、Alan
R.Liss,Inc,（1985））が挙げられる。さらに、単鎖抗
体の製造について記載されている方法（米国特許第４,
９４６,７７８号）を用いて、本発明の免疫原性ポリペ
プチド生成物に対する単鎖抗体を製造することができ
る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳
動物を含む他の生物を用いて、本発明の免疫原性ポリペ
プチド産物に対するヒト化抗体を発現させてもよい。
【００９０】アフィニティークロマトグラフィーにより
単離および／または精製する場合、前記した抗体を用い
て、ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定
してもよく、あるいは抗体を固体支持体に結合させるこ
とにより本発明のポリペプチドを精製してもよい。ま
た、ＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプチドま
たはそのフラグメントに対する抗体を用いて、とりわ
け、糖尿病性腎障害および高血圧誘発腎障害などの細胞
肥大、良性前立腺肥大、再発狭窄症、アテローム性動脈
硬化症、動脈瘤および発作に関連する疾患、特にうっ血
性心不全、拡張した心筋症および高血圧などの心臓肥大
に関連する疾患を阻害することができる。
単離および／または精製する場合、前記した抗体を用い
て、ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定
してもよく、あるいは抗体を固体支持体に結合させるこ
とにより本発明のポリペプチドを精製してもよい。ま
た、ＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプチドま
たはそのフラグメントに対する抗体を用いて、とりわ
け、糖尿病性腎障害および高血圧誘発腎障害などの細胞
肥大、良性前立腺肥大、再発狭窄症、アテローム性動脈
硬化症、動脈瘤および発作に関連する疾患、特にうっ血
性心不全、拡張した心筋症および高血圧などの心臓肥大
に関連する疾患を阻害することができる。
【００９１】ヒト・ミオトロフィン結合分子およびアッ
セイ ＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプチドをこれ
に相互作用するタンパク質を単離するために使用するこ
とができる；この相互作用は阻害のための標的となり得
る。ＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプチドと
他の因子の間のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害
剤は、ヒト・ミオトロフィン活性の調節のための医薬品
の開発に用いることができる。かくして、本発明は、ヒ
ト・ミオトロフィンに結合する分子の同定方法も提供す
る。分子をヒト・ミオトロフィンに結合させるタンパク
質をコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方
法、例えば、リガンドパニング（panning）およびＦＡ
ＣＳソーティングにより、同定することができる。かか
る方法は多くの実験室用マニュアル、例えば、Coligan
ら、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY １，第５章（１
９９１）に記載されている。
セイ ＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプチドをこれ
に相互作用するタンパク質を単離するために使用するこ
とができる；この相互作用は阻害のための標的となり得
る。ＨＳＡＢＨ０１によりコードされるポリペプチドと
他の因子の間のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害
剤は、ヒト・ミオトロフィン活性の調節のための医薬品
の開発に用いることができる。かくして、本発明は、ヒ
ト・ミオトロフィンに結合する分子の同定方法も提供す
る。分子をヒト・ミオトロフィンに結合させるタンパク
質をコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方
法、例えば、リガンドパニング（panning）およびＦＡ
ＣＳソーティングにより、同定することができる。かか
る方法は多くの実験室用マニュアル、例えば、Coligan
ら、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY １，第５章（１
９９１）に記載されている。
【００９２】例えば、酵母２ハイブリッドシステムが、
転写活性化因子の活性を復元するのに用いる、インビボ
での第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との
間の相互作用を検出するための方法を提供する。この方
法は、米国特許第５,２８３,１７３号に開示されてお
り；試薬はClontechおよびStratageneから市販されてい
る。簡単には、ＨＳＡＢＨ０１ ｃＤＮＡをＧａｌ４転
写因子ＤＮＡ結合領域に融合させ、酵母細胞中で発現さ
せる。問題の細胞から得られたｃＤＮＡライブラリーメ
ンバーをＧａｌ４のトランス活性化領域に融合させる。
ヒト・ミオトロフィンと相互作用可能なタンパク質を発
現するｃＤＮＡクローンは、Ｇａｌ４活性の復元および
Ｇａｌ４−ｌａｃＺなどのレポーター遺伝子の発現のト
ランス活性化をもたらす。
転写活性化因子の活性を復元するのに用いる、インビボ
での第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との
間の相互作用を検出するための方法を提供する。この方
法は、米国特許第５,２８３,１７３号に開示されてお
り；試薬はClontechおよびStratageneから市販されてい
る。簡単には、ＨＳＡＢＨ０１ ｃＤＮＡをＧａｌ４転
写因子ＤＮＡ結合領域に融合させ、酵母細胞中で発現さ
せる。問題の細胞から得られたｃＤＮＡライブラリーメ
ンバーをＧａｌ４のトランス活性化領域に融合させる。
ヒト・ミオトロフィンと相互作用可能なタンパク質を発
現するｃＤＮＡクローンは、Ｇａｌ４活性の復元および
Ｇａｌ４−ｌａｃＺなどのレポーター遺伝子の発現のト
ランス活性化をもたらす。
【００９３】別法は、ＨＳＡＢＨ０１によりコードされ
る組換えポリペプチドを用いてλgt１１、λＺＡＰ（St
ratagene）または同等のｃＤＮＡ発現ライブラリーをス
クリーニングすることからなる。組換えタンパク質また
はそのフラグメントをＦＬＡＧ、ＨＳＶまたはＧＳＴな
どの小さなペプチドタグに融合させる。ペプチドタグは
心筋クレアチンキナーゼなどのキナーゼについての都合
のよいリン酸化部位を有しており、あるいはそれらをビ
オチン化できる。ＨＳＡＢＨ０１コードの組換えポリペ
プチドを32［Ｐ］または標識されていないＰを用いてリ
ン酸化し、ストレプトアビジンまたはそのタグに対する
抗体で検出することができる。λgt１１ｃＤＮＡ発現ラ
イブラリーを問題の細胞から作成し、ＨＳＡＢＨ０１コ
ードの組換えポリペプチドとともにインキュベートし、
洗浄し、これらのポリペプチドと相互作用するｃＤＮＡ
クローンを単離する。かかる方法は当業者に慣用的なも
のである。例えば、Sambrookらを参照のこと。
る組換えポリペプチドを用いてλgt１１、λＺＡＰ（St
ratagene）または同等のｃＤＮＡ発現ライブラリーをス
クリーニングすることからなる。組換えタンパク質また
はそのフラグメントをＦＬＡＧ、ＨＳＶまたはＧＳＴな
どの小さなペプチドタグに融合させる。ペプチドタグは
心筋クレアチンキナーゼなどのキナーゼについての都合
のよいリン酸化部位を有しており、あるいはそれらをビ
オチン化できる。ＨＳＡＢＨ０１コードの組換えポリペ
プチドを32［Ｐ］または標識されていないＰを用いてリ
ン酸化し、ストレプトアビジンまたはそのタグに対する
抗体で検出することができる。λgt１１ｃＤＮＡ発現ラ
イブラリーを問題の細胞から作成し、ＨＳＡＢＨ０１コ
ードの組換えポリペプチドとともにインキュベートし、
洗浄し、これらのポリペプチドと相互作用するｃＤＮＡ
クローンを単離する。かかる方法は当業者に慣用的なも
のである。例えば、Sambrookらを参照のこと。
【００９４】もう一つの方法は、哺乳動物発現ライブラ
リーをスクリーニングすることである。この方法におい
ては、ｃＤＮＡを哺乳動物プロモーターとポリアデニル
化部位の間のベクターにクローンし、ＣＯＳまたは２９
３細胞にて一時的にトランスフェクションされる。４８
時間後、結合タンパク質を、固定かつ洗浄した細胞を標
識したＨＳＡＢＨ０１によりコードされるヒト・ミオト
ロフィンと一緒にインキュベーションすることで検出す
る。好ましい具体例においては、ヒト・ミオトロフィン
をヨウ素化し、結合したヒト・ミオトロフィンの検出を
オートラジオグラフィーを介して検出する。Simsら、Sc
ience，241：585-589（1988）およびMcMahanら、EMBO
J.，10：2821-2832（1991）を参照のこと。このよう
に、問題の結合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む
ｃＤＮＡプールを選択し、各プールをさらに分割し、つ
づいて一時的なトランスフェクション、結合およびオー
トラジオグラフィーのサイクルにより問題のｃＤＮＡを
単離することができる。別法として、完全なｃＤＮＡラ
イブラリーを哺乳動物細胞にトランスフェクションし、
プレートに結合したヒト・ミオトロフィンを含む皿上で
細胞をパニングすることによって問題のｃＤＮＡを単離
できる。洗浄後に結合している細胞を溶解させ、プラス
ミドＤＮＡを単離し、細菌中で増幅し、単一のｃＤＮＡ
クローンが得られるまでトランスフェクションおよびパ
ニングのサイクルを繰り返す。Seedら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA，84：3365（1987） およびAruffoら、EMB
O J.，6：3313（1987）を参照のこと。結合タンパク質
が分泌される場合、結合または中和アッセイが一時的に
トランスフェクションされた細胞からの上清をアッセイ
するために確立されると、類似するプール方法によりそ
のｃＤＮＡを得ることができる。上清をスクリーニング
する一般的方法は、Wongら、Science，228：810-815（1
985）に開示されている。
リーをスクリーニングすることである。この方法におい
ては、ｃＤＮＡを哺乳動物プロモーターとポリアデニル
化部位の間のベクターにクローンし、ＣＯＳまたは２９
３細胞にて一時的にトランスフェクションされる。４８
時間後、結合タンパク質を、固定かつ洗浄した細胞を標
識したＨＳＡＢＨ０１によりコードされるヒト・ミオト
ロフィンと一緒にインキュベーションすることで検出す
る。好ましい具体例においては、ヒト・ミオトロフィン
をヨウ素化し、結合したヒト・ミオトロフィンの検出を
オートラジオグラフィーを介して検出する。Simsら、Sc
ience，241：585-589（1988）およびMcMahanら、EMBO
J.，10：2821-2832（1991）を参照のこと。このよう
に、問題の結合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む
ｃＤＮＡプールを選択し、各プールをさらに分割し、つ
づいて一時的なトランスフェクション、結合およびオー
トラジオグラフィーのサイクルにより問題のｃＤＮＡを
単離することができる。別法として、完全なｃＤＮＡラ
イブラリーを哺乳動物細胞にトランスフェクションし、
プレートに結合したヒト・ミオトロフィンを含む皿上で
細胞をパニングすることによって問題のｃＤＮＡを単離
できる。洗浄後に結合している細胞を溶解させ、プラス
ミドＤＮＡを単離し、細菌中で増幅し、単一のｃＤＮＡ
クローンが得られるまでトランスフェクションおよびパ
ニングのサイクルを繰り返す。Seedら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA，84：3365（1987） およびAruffoら、EMB
O J.，6：3313（1987）を参照のこと。結合タンパク質
が分泌される場合、結合または中和アッセイが一時的に
トランスフェクションされた細胞からの上清をアッセイ
するために確立されると、類似するプール方法によりそ
のｃＤＮＡを得ることができる。上清をスクリーニング
する一般的方法は、Wongら、Science，228：810-815（1
985）に開示されている。
【００９５】もう一つの別法は、細胞からのヒト・ミオ
トロフィンと直接相互作用するタンパク質を単離するこ
とである。ヒト・ミオトロフィンとＧＳＴまたは小さい
ペプチドタグとの融合タンパク質を製造し、ビーズ上に
固定化する。問題の細胞からの生合成的に標識された、
または標識されていないタンパク質抽出物を調製し、ビ
ーズとインキュベートし、バッファーで洗浄する。ヒト
・ミオトロフィンと相互作用するタンパク質はビーズか
ら特異的に溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析す
る。結合相手の一次アミノ酸配列データをマイクロシー
クエンシングによって得る。所望により、細胞性タンパ
ク質のチロシンリン酸化などの機能的応答を誘発する物
質で細胞を処理できる。かかる物質の一例は、成長因子
またはインターロイキン−２などのサイトカインであ
る。もう一つの別の方法はイムノアフィニティー精製法
である。ＨＳＡＢＨ０１によりコードされた組換えミオ
トロフィンを標識または標識していない細胞抽出物とイ
ンキュベートし、抗ミオトロフィン抗体で免疫沈降させ
る。その免疫沈降物をプロテインＡ−セファロースで回
収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する。標識されていない
タンパク質をビオチン化により標識化し、ストレプトア
ビジンを含むＳＤＳゲル上で検出する。結合相手のタン
パク質をマイクロシークエンシングにより解析する。さ
らに、当業者に知られている標準的生化学的精製工程を
マイクロシークエンシングの前に使用してもよい。
トロフィンと直接相互作用するタンパク質を単離するこ
とである。ヒト・ミオトロフィンとＧＳＴまたは小さい
ペプチドタグとの融合タンパク質を製造し、ビーズ上に
固定化する。問題の細胞からの生合成的に標識された、
または標識されていないタンパク質抽出物を調製し、ビ
ーズとインキュベートし、バッファーで洗浄する。ヒト
・ミオトロフィンと相互作用するタンパク質はビーズか
ら特異的に溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析す
る。結合相手の一次アミノ酸配列データをマイクロシー
クエンシングによって得る。所望により、細胞性タンパ
ク質のチロシンリン酸化などの機能的応答を誘発する物
質で細胞を処理できる。かかる物質の一例は、成長因子
またはインターロイキン−２などのサイトカインであ
る。もう一つの別の方法はイムノアフィニティー精製法
である。ＨＳＡＢＨ０１によりコードされた組換えミオ
トロフィンを標識または標識していない細胞抽出物とイ
ンキュベートし、抗ミオトロフィン抗体で免疫沈降させ
る。その免疫沈降物をプロテインＡ−セファロースで回
収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する。標識されていない
タンパク質をビオチン化により標識化し、ストレプトア
ビジンを含むＳＤＳゲル上で検出する。結合相手のタン
パク質をマイクロシークエンシングにより解析する。さ
らに、当業者に知られている標準的生化学的精製工程を
マイクロシークエンシングの前に使用してもよい。
【００９６】さらにもう一つの別法は、ペプチドライブ
ラリーを結合相手についてスクリーニングすることに関
する。組換えタグ付きまたはＨＳＡＢＨ０１によりコー
ドされた標識化ミオトロフィンを用いて、ヒト・ミオト
ロフィンと相互作用するペプチドまたはホスホペプチド
ライブラリーからペプチドを選択する。そのペプチドを
配列決定し、相互作用するタンパク質にて見いだされる
コンセンサスペプチド配列を同定する。当業者に知られ
ているこれらの方法または他の方法によって同定された
ヒト・ミオトロフィンの結合相手、ならびに前記した推
定結合相手を、本発明のアッセイ方法において用いるこ
とができる。ミオトロフィン／結合相手の複合体の存在
についてのアッセイは、例えば、酵母２ハイブリッドシ
ステム、ＥＬＩＳＡまたはその複合体に特異的な抗体を
用いるイムノアッセイによってなされる。ミオトロフィ
ン／結合相手の相互作用の形成を妨害または阻害する試
験物質の存在下、複合体の減少量をその試験物質を欠い
ている対照と比較して測定する。
ラリーを結合相手についてスクリーニングすることに関
する。組換えタグ付きまたはＨＳＡＢＨ０１によりコー
ドされた標識化ミオトロフィンを用いて、ヒト・ミオト
ロフィンと相互作用するペプチドまたはホスホペプチド
ライブラリーからペプチドを選択する。そのペプチドを
配列決定し、相互作用するタンパク質にて見いだされる
コンセンサスペプチド配列を同定する。当業者に知られ
ているこれらの方法または他の方法によって同定された
ヒト・ミオトロフィンの結合相手、ならびに前記した推
定結合相手を、本発明のアッセイ方法において用いるこ
とができる。ミオトロフィン／結合相手の複合体の存在
についてのアッセイは、例えば、酵母２ハイブリッドシ
ステム、ＥＬＩＳＡまたはその複合体に特異的な抗体を
用いるイムノアッセイによってなされる。ミオトロフィ
ン／結合相手の相互作用の形成を妨害または阻害する試
験物質の存在下、複合体の減少量をその試験物質を欠い
ている対照と比較して測定する。
【００９７】遊離ヒト・ミオトロフィンまたは結合相手
に関するアッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡまたは特異的
抗体を用いるイムノアッセイによって、または放射性標
識されたＨＳＡＢＨ０１でコードされたヒト・ミオトロ
フィンを細胞または細胞膜とインキュベーションし、つ
づいて遠心またはフィルター分離工程を行うことによっ
てなされる。ミオトロフィン／結合相手の相互作用の形
成を妨害または阻害する試験物質の存在下、遊離のミオ
トロフィンまたは遊離の結合相手の増加量をその試験物
質を欠いている対照と比較して測定する。本発明のポリ
ペプチドを用いて、細胞中または無細胞調製物中のミオ
トロフィン結合分子のヒト・ミオトロフィン結合許容量
を評価することもできる。
に関するアッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡまたは特異的
抗体を用いるイムノアッセイによって、または放射性標
識されたＨＳＡＢＨ０１でコードされたヒト・ミオトロ
フィンを細胞または細胞膜とインキュベーションし、つ
づいて遠心またはフィルター分離工程を行うことによっ
てなされる。ミオトロフィン／結合相手の相互作用の形
成を妨害または阻害する試験物質の存在下、遊離のミオ
トロフィンまたは遊離の結合相手の増加量をその試験物
質を欠いている対照と比較して測定する。本発明のポリ
ペプチドを用いて、細胞中または無細胞調製物中のミオ
トロフィン結合分子のヒト・ミオトロフィン結合許容量
を評価することもできる。
【００９８】アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明のＨＳＡＢＨ０１によりコードされるヒト・ミオ
トロフィンは、ヒト・ミオトロフィンの活性化を亢進
（アゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合
物をスクリーニングする方法にて用いてもよい。一般
に、かかるスクリーニング法は、ＨＳＡＢＨ０１により
コードされるポリペプチドを発現する適当な細胞を得る
ことからなる。かかる細胞は、哺乳動物、酵母、ドロソ
フィラまたはエシェリキア・コリからの細胞を包含す
る。特に、本発明のポリヌクレオチドを用いて細胞をト
ランスフェクションし、それによりヒト・ミオトロフィ
ンを発現させる。ついで、レセプターを発現する細胞を
試験化合物と接触させ、結合、機能応答の刺激または阻
害を観察する。
イおよび分子 本発明のＨＳＡＢＨ０１によりコードされるヒト・ミオ
トロフィンは、ヒト・ミオトロフィンの活性化を亢進
（アゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合
物をスクリーニングする方法にて用いてもよい。一般
に、かかるスクリーニング法は、ＨＳＡＢＨ０１により
コードされるポリペプチドを発現する適当な細胞を得る
ことからなる。かかる細胞は、哺乳動物、酵母、ドロソ
フィラまたはエシェリキア・コリからの細胞を包含す
る。特に、本発明のポリヌクレオチドを用いて細胞をト
ランスフェクションし、それによりヒト・ミオトロフィ
ンを発現させる。ついで、レセプターを発現する細胞を
試験化合物と接触させ、結合、機能応答の刺激または阻
害を観察する。
【００９９】かかるスクリーニング法は、トランスフェ
クションされる黒色素胞を用いて、本発明のＨＳＡＢＨ
０１を発現させることからなる。かかるスクリーニング
法はＰＣＴ ＷＯ９２／０１８１０に記載されている。
一の具体例においては、この方法を、ポリペプチドをコ
ードする黒色素胞細胞をミオトロフィン・リガンドおよ
びスクリーニングすべき化合物の両方と接触させること
により、本発明のポリペプチドの活性化を阻害する化合
物についてスクリーニングするのに用いる。ミオトロフ
ィン・リガンドにより得られるシグナルが阻害されると
いうことは、化合物が該ポリペプチドについての潜在的
アンタゴニストであり、すなわち、該ポリペプチドの活
性化を阻害することを示す。その方法はまた、かかる細
胞をスクリーニングすべき化合物と接触させ、そのよう
な化合物がシグナルを発するかどうかどうか、すなわ
ち、該ポリペプチドを活性化するかどうかを測定するこ
とにより、ポリペプチドを活性化する化合物をスクリー
ニングするのに用いることができる。
クションされる黒色素胞を用いて、本発明のＨＳＡＢＨ
０１を発現させることからなる。かかるスクリーニング
法はＰＣＴ ＷＯ９２／０１８１０に記載されている。
一の具体例においては、この方法を、ポリペプチドをコ
ードする黒色素胞細胞をミオトロフィン・リガンドおよ
びスクリーニングすべき化合物の両方と接触させること
により、本発明のポリペプチドの活性化を阻害する化合
物についてスクリーニングするのに用いる。ミオトロフ
ィン・リガンドにより得られるシグナルが阻害されると
いうことは、化合物が該ポリペプチドについての潜在的
アンタゴニストであり、すなわち、該ポリペプチドの活
性化を阻害することを示す。その方法はまた、かかる細
胞をスクリーニングすべき化合物と接触させ、そのよう
な化合物がシグナルを発するかどうかどうか、すなわ
ち、該ポリペプチドを活性化するかどうかを測定するこ
とにより、ポリペプチドを活性化する化合物をスクリー
ニングするのに用いることができる。
【０１００】他のスクリーニング法は、ポリペプチドの
活性化により誘起される細胞外ｐＨ変化を測定するシス
テムにて、ＨＳＡＢＨ０１コードのポリペプチドを発現
する細胞（例えば、トランスフェクションされたＣＨＯ
細胞）を使用することからなる。（例えば、Science，2
46：181-296（１９８９）を参照のこと）。この方法に
おいては、化合物を本発明のポリペプチドを発現する細
胞と接触させてもよい。ついで、別のメッセンジャー応
答、例えば、シグナル・トランスダクションまたはｐＨ
変化を測定し、その潜在的化合物がこのタンパク質の活
性を活性化するか、または阻害するかを測定する。もう
一つ別のスクリーニング法は、ヒト・ミオトロフィンを
コードするＨＳＡＢＨ０１ ＲＮＡをXenopus 卵母細胞
に導入し、そのタンパク質を一時的に発現させることか
らなる。ついで、その卵母細胞をミオトロフィン・リガ
ンドおよびスクリーニングすべき化合物と接触させる。
ついで、このタンパク質の活性化を阻害すると思われる
化合物についてスクリーニングする場合には、ミオトロ
フィンの活性化の阻害を、カルシウム、プロトンまたは
他のイオンなどのシグナルを検出することによって測定
する。
活性化により誘起される細胞外ｐＨ変化を測定するシス
テムにて、ＨＳＡＢＨ０１コードのポリペプチドを発現
する細胞（例えば、トランスフェクションされたＣＨＯ
細胞）を使用することからなる。（例えば、Science，2
46：181-296（１９８９）を参照のこと）。この方法に
おいては、化合物を本発明のポリペプチドを発現する細
胞と接触させてもよい。ついで、別のメッセンジャー応
答、例えば、シグナル・トランスダクションまたはｐＨ
変化を測定し、その潜在的化合物がこのタンパク質の活
性を活性化するか、または阻害するかを測定する。もう
一つ別のスクリーニング法は、ヒト・ミオトロフィンを
コードするＨＳＡＢＨ０１ ＲＮＡをXenopus 卵母細胞
に導入し、そのタンパク質を一時的に発現させることか
らなる。ついで、その卵母細胞をミオトロフィン・リガ
ンドおよびスクリーニングすべき化合物と接触させる。
ついで、このタンパク質の活性化を阻害すると思われる
化合物についてスクリーニングする場合には、ミオトロ
フィンの活性化の阻害を、カルシウム、プロトンまたは
他のイオンなどのシグナルを検出することによって測定
する。
【０１０１】別のスクリーニング法は、ＨＳＡＢＨ０１
コードのポリペプチド（ホスホリパーゼＣまたはＤに結
合しているポリペプチド）を発現させることからなる。
そのような細胞の代表例として、内皮細胞、平滑筋細胞
および胚腎細胞が挙げられるが、これに限定されるもの
ではない。スクリーニングは、前記したように、該タン
パク質の活性化または該タンパク質の活性化の阻害をホ
スホリパーゼ第２シグナルから検出することによりなさ
れる。別法は、標識されたリガンドの、該タンパク質を
含有する細胞への結合の阻害を測定することにより、ア
ンタゴニストである、すなわち本発明のポリペプチドの
活性化を阻害する化合物についてスクリーニングするこ
とからなる。そのような方法は、細胞が該タンパク質を
発現するように、真核細胞をヒト・ミオトロフィンをコ
ードするＨＳＡＢＨ０１ ＤＮＡでトランスフェクショ
ンすることからなる。ついで、その細胞を、標識された
形態の既知リガンドの存在下で化合物と接触させる。リ
ガンドは、例えば、放射活性により標識化することがで
きる。ヒト・ミオトロフィンに結合した標識化リガンド
の量を、例えば、トランスフェクションした細胞に付随
する放射活性を測定することにより決定する。化合物が
ミオトロフィン・タンパク質に結合すると、標識化リガ
ンドと、該タンパク質との結合は、標識化リガンドの減
少により測定されるように阻害される。本発明のレセプ
ターに対するアゴニストまたはアンタゴニストを検出す
る別の方法は、米国特許第５４８２８３５号に記載の酵
母に基づく方法である。
コードのポリペプチド（ホスホリパーゼＣまたはＤに結
合しているポリペプチド）を発現させることからなる。
そのような細胞の代表例として、内皮細胞、平滑筋細胞
および胚腎細胞が挙げられるが、これに限定されるもの
ではない。スクリーニングは、前記したように、該タン
パク質の活性化または該タンパク質の活性化の阻害をホ
スホリパーゼ第２シグナルから検出することによりなさ
れる。別法は、標識されたリガンドの、該タンパク質を
含有する細胞への結合の阻害を測定することにより、ア
ンタゴニストである、すなわち本発明のポリペプチドの
活性化を阻害する化合物についてスクリーニングするこ
とからなる。そのような方法は、細胞が該タンパク質を
発現するように、真核細胞をヒト・ミオトロフィンをコ
ードするＨＳＡＢＨ０１ ＤＮＡでトランスフェクショ
ンすることからなる。ついで、その細胞を、標識された
形態の既知リガンドの存在下で化合物と接触させる。リ
ガンドは、例えば、放射活性により標識化することがで
きる。ヒト・ミオトロフィンに結合した標識化リガンド
の量を、例えば、トランスフェクションした細胞に付随
する放射活性を測定することにより決定する。化合物が
ミオトロフィン・タンパク質に結合すると、標識化リガ
ンドと、該タンパク質との結合は、標識化リガンドの減
少により測定されるように阻害される。本発明のレセプ
ターに対するアゴニストまたはアンタゴニストを検出す
る別の方法は、米国特許第５４８２８３５号に記載の酵
母に基づく方法である。
【０１０２】本発明はまた、ヒト・ミオトロフィンへの
結合能を有することが不明なリガンドが、かかるタンパ
ク質に結合できるかどうかを測定する方法を提供する。
この方法は、リガンドのコードされたタンパク質への結
合を可能とする条件下、ＨＳＡＢＨ０１ ｃＤＮＡを発
現する哺乳動物細胞をリガンドと接触させ、そのタンパ
ク質に結合するリガンドの存在を検出し、それによりそ
のリガンドがヒト・ミオトロフィンに結合するかどうか
を決定することからなる。アゴニストおよび／またはア
ンタゴニストを決定するために前記したシステムはま
た、ミオトロフィンに結合するリガンドを決定するのに
も用いることができる。潜在的ヒト・ミオトロフィンポ
リペプチドアンタゴニストとして、例えば、抗体、また
はある場合には、第２メッセンジャー応答を誘起しない
が、該タンパク質に結合する、すなわち、該タンパク質
の活性を妨げる、オリゴヌクレオチドが挙げられる。
結合能を有することが不明なリガンドが、かかるタンパ
ク質に結合できるかどうかを測定する方法を提供する。
この方法は、リガンドのコードされたタンパク質への結
合を可能とする条件下、ＨＳＡＢＨ０１ ｃＤＮＡを発
現する哺乳動物細胞をリガンドと接触させ、そのタンパ
ク質に結合するリガンドの存在を検出し、それによりそ
のリガンドがヒト・ミオトロフィンに結合するかどうか
を決定することからなる。アゴニストおよび／またはア
ンタゴニストを決定するために前記したシステムはま
た、ミオトロフィンに結合するリガンドを決定するのに
も用いることができる。潜在的ヒト・ミオトロフィンポ
リペプチドアンタゴニストとして、例えば、抗体、また
はある場合には、第２メッセンジャー応答を誘起しない
が、該タンパク質に結合する、すなわち、該タンパク質
の活性を妨げる、オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１０３】潜在的アンタゴニストはまた、アンチセン
ス法を用いて調製されたアンチセンス構築物も包含す
る。アンチセンス法を用いて、３重ヘリックス形成によ
り、またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ（いずれの
方法もポリペプチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合をベ
ースとしている）により遺伝子発現を制御することがで
きる。例えば、ポリヌクレオチド配列の５’コーディン
グ部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードしてお
り、約１０ないし４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドを設計するのに用いられる。ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、転写に関する遺伝子の領域に
相補的であるように設計され（３重ヘリックス − Lee
ら、Nucl.Acids Res.，6：3073（1979）；Cooneyら、Sc
ience，241：456（1988）；およびDervanら、Science，
251：1360（1991）を参照のこと）、それにより該タン
パク質の転写および製造を阻害する。アンチセンスＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、インビボにてｍＲＮＡとハイ
ブリッド形成し、ｍＲＮＡ分子の該タンパク質への翻訳
を遮断する（アンチセンス − Okano、J.Neurochem.，5
6：560（1991）；Oligodeoxynucleotides as Antisense
Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Ra
ton，ＦＬ（1988）を参照のこと）。前記したオリゴヌ
クレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが
インビボにて発現されてヒト・ミオトロフィンの生成を
阻害するように、細胞にデリバリーすることができる。
ス法を用いて調製されたアンチセンス構築物も包含す
る。アンチセンス法を用いて、３重ヘリックス形成によ
り、またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ（いずれの
方法もポリペプチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合をベ
ースとしている）により遺伝子発現を制御することがで
きる。例えば、ポリヌクレオチド配列の５’コーディン
グ部分は、本発明の成熟ポリペプチドをコードしてお
り、約１０ないし４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドを設計するのに用いられる。ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、転写に関する遺伝子の領域に
相補的であるように設計され（３重ヘリックス − Lee
ら、Nucl.Acids Res.，6：3073（1979）；Cooneyら、Sc
ience，241：456（1988）；およびDervanら、Science，
251：1360（1991）を参照のこと）、それにより該タン
パク質の転写および製造を阻害する。アンチセンスＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、インビボにてｍＲＮＡとハイ
ブリッド形成し、ｍＲＮＡ分子の該タンパク質への翻訳
を遮断する（アンチセンス − Okano、J.Neurochem.，5
6：560（1991）；Oligodeoxynucleotides as Antisense
Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Ra
ton，ＦＬ（1988）を参照のこと）。前記したオリゴヌ
クレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが
インビボにて発現されてヒト・ミオトロフィンの生成を
阻害するように、細胞にデリバリーすることができる。
【０１０４】ミオトロフィンタンパク質は哺乳動物宿主
中に遍在しており、多くの病因を含め、多数の生物学的
機能に関与している。従って、一方でミオトロフィンを
刺激し、他方でミオトロフィンの機能を阻害しうる化合
物および薬剤を見いだすことが望まれている。ヒト・ミ
オトロフィンについてのアゴニストは、ミオトロフィン
活性に関係する細胞肥大の実験における研究手段として
用いることができる。ヒト・ミオトロフィンについての
アンタゴニストは、とりわけ、糖尿病性腎障害および高
血圧誘発腎障害などの細胞肥大、良性前立腺肥大、再発
狭窄症、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤および発作に
関連する疾患または障害、特にうっ血性心不全、拡張し
た心筋症および高血圧などの心臓肥大に関連する疾患に
対する種々の治療および予防目的に用いられる。
中に遍在しており、多くの病因を含め、多数の生物学的
機能に関与している。従って、一方でミオトロフィンを
刺激し、他方でミオトロフィンの機能を阻害しうる化合
物および薬剤を見いだすことが望まれている。ヒト・ミ
オトロフィンについてのアゴニストは、ミオトロフィン
活性に関係する細胞肥大の実験における研究手段として
用いることができる。ヒト・ミオトロフィンについての
アンタゴニストは、とりわけ、糖尿病性腎障害および高
血圧誘発腎障害などの細胞肥大、良性前立腺肥大、再発
狭窄症、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤および発作に
関連する疾患または障害、特にうっ血性心不全、拡張し
た心筋症および高血圧などの心臓肥大に関連する疾患に
対する種々の治療および予防目的に用いられる。
【０１０５】加えて、本発明は、過剰なヒト・ミオトロ
フィン活性に関係した異常な状態を治療する方法であっ
て、前記した阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許
容される担体と共に、リガンドのヒト・ミオトロフィン
への結合を遮断することで活性化を阻害するか、または
第２シグナルを阻害し、それにより異常な状態を緩和す
るのに効果的な量にて対象に投与することからなる方法
を提供する。本発明はまた、ヒト・ミオトロフィンの発
現不足およびその活性に関係した異常な状態を治療する
方法であって、前記した本発明のポリペプチドを活性化
する化合物（アゴニスト）を治療上有効量、医薬上許容
される担体と共に対象に投与し、それにより異常な状態
を緩和することからなる方法を提供する。
フィン活性に関係した異常な状態を治療する方法であっ
て、前記した阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許
容される担体と共に、リガンドのヒト・ミオトロフィン
への結合を遮断することで活性化を阻害するか、または
第２シグナルを阻害し、それにより異常な状態を緩和す
るのに効果的な量にて対象に投与することからなる方法
を提供する。本発明はまた、ヒト・ミオトロフィンの発
現不足およびその活性に関係した異常な状態を治療する
方法であって、前記した本発明のポリペプチドを活性化
する化合物（アゴニスト）を治療上有効量、医薬上許容
される担体と共に対象に投与し、それにより異常な状態
を緩和することからなる方法を提供する。
【０１０６】組成物およびキット 本発明のＨＳＡＢＨ０１などのポリヌクレオチドまたは
それによりコードされるポリペプチド、およびかかるポ
リペプチドを活性化または阻害する化合物を、適当な医
薬担体と組み合わせて用いることができる。そのような
組成物は、医薬上許容される量のポリペプチドまたは組
成物と、医薬上許容される担体または賦形剤とからな
る。かかる担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノールおよびその組み合わ
せを包含するが、これに限定されるものではない。処方
は投与方法に適していなければならない。投与方法によ
る適当な担体の選択は当業者によって慣用的になされ
る。本発明はさらに、１またはそれ以上の前記した本発
明の組成物の成分を充填した１またはそれ以上の容器か
らなる医薬パックおよびキットに関する。
それによりコードされるポリペプチド、およびかかるポ
リペプチドを活性化または阻害する化合物を、適当な医
薬担体と組み合わせて用いることができる。そのような
組成物は、医薬上許容される量のポリペプチドまたは組
成物と、医薬上許容される担体または賦形剤とからな
る。かかる担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノールおよびその組み合わ
せを包含するが、これに限定されるものではない。処方
は投与方法に適していなければならない。投与方法によ
る適当な担体の選択は当業者によって慣用的になされ
る。本発明はさらに、１またはそれ以上の前記した本発
明の組成物の成分を充填した１またはそれ以上の容器か
らなる医薬パックおよびキットに関する。
【０１０７】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物を単独で、ある
いは治療化合物などの他の化合物と組み合わせて用いて
もよい。医薬組成物は、例えば、とりわけ、局所的、経
口的、経肛門的、経膣的、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮
下、経鼻内または皮内経路による投与を含め、効果的か
つ都合のよい方法で投与してもよい。一般に、組成物
を、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与する。
大抵の場合、一日に付き約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない
量で組成物が投与されるであろう。好ましくは、大抵の
場合、投与量は、一日当たり約１０μｇ／ｋｇ体重ない
し約１ｍｇ／ｋｇ体重である。最適用量は、症状、重篤
度、投与経路、合併症などを考慮して、各治療様式につ
いての標準的方法および症状により決定されることが理
解されよう。
いは治療化合物などの他の化合物と組み合わせて用いて
もよい。医薬組成物は、例えば、とりわけ、局所的、経
口的、経肛門的、経膣的、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮
下、経鼻内または皮内経路による投与を含め、効果的か
つ都合のよい方法で投与してもよい。一般に、組成物
を、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与する。
大抵の場合、一日に付き約８ｍｇ／ｋｇ体重を越えない
量で組成物が投与されるであろう。好ましくは、大抵の
場合、投与量は、一日当たり約１０μｇ／ｋｇ体重ない
し約１ｍｇ／ｋｇ体重である。最適用量は、症状、重篤
度、投与経路、合併症などを考慮して、各治療様式につ
いての標準的方法および症状により決定されることが理
解されよう。
【０１０８】遺伝子治療 ヒト・ミオトロフィンポリヌクレオチド、そによりコー
ドされるポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニスト
およびアンタゴニストを、しばしば「遺伝子治療」と呼
ばれる治療様式において、かかるポリペプチドを発現さ
せることにより、本発明にて使用することができる。か
くして、例えば、患者からの細胞を、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａなどのポリヌクレオチドで操作し、ポリペプチドをエ
クスビボでコードしてもよい。次いで、その操作された
細胞をそのポリペプチドで治療すべき患者に与えてもよ
い。この具体例において、例えば、本発明のポリペプチ
ドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミド
ベクターの使用により、細胞をエクスビボで操作しても
よい。かかる方法は当該分野においてよく知られてお
り、本発明におけるそれらの使用は本明細書の教示から
明らかである。
ドされるポリペプチド、ポリペプチドであるアゴニスト
およびアンタゴニストを、しばしば「遺伝子治療」と呼
ばれる治療様式において、かかるポリペプチドを発現さ
せることにより、本発明にて使用することができる。か
くして、例えば、患者からの細胞を、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａなどのポリヌクレオチドで操作し、ポリペプチドをエ
クスビボでコードしてもよい。次いで、その操作された
細胞をそのポリペプチドで治療すべき患者に与えてもよ
い。この具体例において、例えば、本発明のポリペプチ
ドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミド
ベクターの使用により、細胞をエクスビボで操作しても
よい。かかる方法は当該分野においてよく知られてお
り、本発明におけるそれらの使用は本明細書の教示から
明らかである。
【０１０９】同様に、当該分野において知られた方法に
より、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞を
インビボで処理してもよい。例えば、本発明のポリヌク
レオチドを、上記のように、複製欠損レトロウイルスベ
クター中での発現のために操作してもよい。ついで、レ
トロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチ
ドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラス
ミドベクターで形質導入したパッケージング細胞中に導
入し、そのパッケージング細胞が問題の遺伝子を含有す
る感染性ウイルス粒子を産生するようにしてもよい。こ
れらの産生細胞を、インビボでの細胞の操作およびイン
ビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与しても
よい。本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの
方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明ら
かである。
より、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞を
インビボで処理してもよい。例えば、本発明のポリヌク
レオチドを、上記のように、複製欠損レトロウイルスベ
クター中での発現のために操作してもよい。ついで、レ
トロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチ
ドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラス
ミドベクターで形質導入したパッケージング細胞中に導
入し、そのパッケージング細胞が問題の遺伝子を含有す
る感染性ウイルス粒子を産生するようにしてもよい。こ
れらの産生細胞を、インビボでの細胞の操作およびイン
ビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与しても
よい。本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの
方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明ら
かである。
【０１１０】本明細書において前記したレトロウイルス
プラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モロ
ニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス
肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイ
ルス、ギボンサル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイル
ス、アデノウイルス、ミエロ増殖性肉腫ウイルス（Myel
oproliferative Sarcoma Virus）および哺乳動物腫瘍ウ
イルスを包含するが、これらに限定されない。好ましい
具体例において、レトロウイルスプラスミドベクターは
モロニーネズミ白血病ウイルス由来のものである。かか
るベクターは、ポリペプチド発現のための１個またはそ
れ以上のプロモーターを含む。用いることのできる適当
なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プ
ロモーター；およびMillerら、Biotechniques，7：980-
990（1989）に記載されたヒトサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーターを包含するが、これに限定され
ない。ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびβ−
アクチンプロモーターを包含するが、これに限定されな
い真核細胞プロモーターなどの細胞プロモーターもまた
用いることができる。使用できる付加的なウイルス性プ
ロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジン
キナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パーボウ
イルスプロモーターを包含するが、これらに限定されな
い。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる
教示から当業者に明らかであろう。
プラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モロ
ニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス
肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイ
ルス、ギボンサル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイル
ス、アデノウイルス、ミエロ増殖性肉腫ウイルス（Myel
oproliferative Sarcoma Virus）および哺乳動物腫瘍ウ
イルスを包含するが、これらに限定されない。好ましい
具体例において、レトロウイルスプラスミドベクターは
モロニーネズミ白血病ウイルス由来のものである。かか
るベクターは、ポリペプチド発現のための１個またはそ
れ以上のプロモーターを含む。用いることのできる適当
なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プ
ロモーター；およびMillerら、Biotechniques，7：980-
990（1989）に記載されたヒトサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーターを包含するが、これに限定され
ない。ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびβ−
アクチンプロモーターを包含するが、これに限定されな
い真核細胞プロモーターなどの細胞プロモーターもまた
用いることができる。使用できる付加的なウイルス性プ
ロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジン
キナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パーボウ
イルスプロモーターを包含するが、これらに限定されな
い。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる
教示から当業者に明らかであろう。
【０１１１】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろう。
使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス主要
後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモータ
ー；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーのごとき異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス
（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロ
チオネインプロモーターのごとき誘導可能プロモータ
ー；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのごと
きウイルス性チミジンキナーゼプロモーター；レトロウ
イルス性ＬＴＲ（本明細書で前記した修飾レトロウイル
スＬＴＲを包含する）；β−アクチンプロモーター；お
よびヒト成長ホルモンプロモーターを包含するが、これ
らに限定されない。プロモーターは、ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を制御する元来のプロモーターであって
もよい。
列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろう。
使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス主要
後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモータ
ー；またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーのごとき異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス
（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロ
チオネインプロモーターのごとき誘導可能プロモータ
ー；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモータ
ー；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモータ
ー；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのごと
きウイルス性チミジンキナーゼプロモーター；レトロウ
イルス性ＬＴＲ（本明細書で前記した修飾レトロウイル
スＬＴＲを包含する）；β−アクチンプロモーター；お
よびヒト成長ホルモンプロモーターを包含するが、これ
らに限定されない。プロモーターは、ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を制御する元来のプロモーターであって
もよい。
【０１１２】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
てパッケージング細胞系に形質導入し、産生細胞系を形
成する。トランスフェクションされてもよいパッケージ
ング細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ
−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７
−Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ
＋ｅｎｖＡｍ１２、およびMiller,A.、Human Gene Ther
apy，1：5-14（1990）に記載されたＤＡＮ細胞系を包含
するが、これらに限定されない。当該分野で知られてい
るいずれかの手段によりベクターをパッケージング細胞
中に形質導入してもよい。かかる手段は、エレクトロポ
レーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ4沈殿を包含
するが、これらに限定されない。別法において、レトロ
ウイルスプラスミドベクターをリポソーム中に封入し、
あるいは脂質と結合させ、ついで、宿主に投与してもよ
い。
てパッケージング細胞系に形質導入し、産生細胞系を形
成する。トランスフェクションされてもよいパッケージ
ング細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ
−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７
−Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ
＋ｅｎｖＡｍ１２、およびMiller,A.、Human Gene Ther
apy，1：5-14（1990）に記載されたＤＡＮ細胞系を包含
するが、これらに限定されない。当該分野で知られてい
るいずれかの手段によりベクターをパッケージング細胞
中に形質導入してもよい。かかる手段は、エレクトロポ
レーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ4沈殿を包含
するが、これらに限定されない。別法において、レトロ
ウイルスプラスミドベクターをリポソーム中に封入し、
あるいは脂質と結合させ、ついで、宿主に投与してもよ
い。
【０１１３】産生細胞系は、ポリペプチドをコードする
核酸配列（複数でも可）を含む、感染性レトロウイルス
ベクター粒子を産生するであろう。かかるレトロウイル
スベクター粒子を用いて、インビトロまたはインビボの
いずれかにおいて真核細胞に形質導入してもよい。形質
導入された真核細胞はポリペプチドをコードする核酸配
列（複数でも可）を発現するであろう。形質導入されう
る真核細胞は、胚幹細胞、胚カルシノーマ細胞、ならび
に造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチ
ノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含する
が、これらに限定されない。
核酸配列（複数でも可）を含む、感染性レトロウイルス
ベクター粒子を産生するであろう。かかるレトロウイル
スベクター粒子を用いて、インビトロまたはインビボの
いずれかにおいて真核細胞に形質導入してもよい。形質
導入された真核細胞はポリペプチドをコードする核酸配
列（複数でも可）を発現するであろう。形質導入されう
る真核細胞は、胚幹細胞、胚カルシノーマ細胞、ならび
に造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチ
ノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含する
が、これらに限定されない。
【０１１４】
【実施例】本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明す
る。実施例は、特定の具体例を参照することにより本発
明を説明するためにのみ提供される。これらの例示は本
発明の特定の態様を説明するものであるが、開示した発
明の範囲を限定または制限するものではない。本明細書
中の特定の用語は、上記の定義において説明されてい
る。すべての実施例は標準的方法を用いて行われ、特記
しないかぎり、それらの方法は当業者によく知られてお
り、通常的なものである。以下の実施例の通常的方法
は、例えばSambrookらの標準的な実験室マニュアルに記
載されているようにして行うことができる。下記の実施
例に示すすべての部分または量は、特記しないかぎり、
重量である。特記しないかぎり、下記実施例におけるフ
ラグメントのサイズ分離は、Sambrookおよび他の多くの
文献、例えば、Goeddel et al., Nucleic Acids Res.,
1980, 8:4057に記載されたようなアガロースおよびポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）といった標準
的方法を用いて行う。特記しないかぎり、連結は、標準
的緩衝液、インキュベーション温度および時間、連結す
べきほぼ等モル量のＤＮＡフラグメントおよびＤＮＡ
０.５μgあたり約１０ユニットのＴ4 ＤＮＡリガーゼ
（リガーゼ）を用いて行われる。
る。実施例は、特定の具体例を参照することにより本発
明を説明するためにのみ提供される。これらの例示は本
発明の特定の態様を説明するものであるが、開示した発
明の範囲を限定または制限するものではない。本明細書
中の特定の用語は、上記の定義において説明されてい
る。すべての実施例は標準的方法を用いて行われ、特記
しないかぎり、それらの方法は当業者によく知られてお
り、通常的なものである。以下の実施例の通常的方法
は、例えばSambrookらの標準的な実験室マニュアルに記
載されているようにして行うことができる。下記の実施
例に示すすべての部分または量は、特記しないかぎり、
重量である。特記しないかぎり、下記実施例におけるフ
ラグメントのサイズ分離は、Sambrookおよび他の多くの
文献、例えば、Goeddel et al., Nucleic Acids Res.,
1980, 8:4057に記載されたようなアガロースおよびポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）といった標準
的方法を用いて行う。特記しないかぎり、連結は、標準
的緩衝液、インキュベーション温度および時間、連結す
べきほぼ等モル量のＤＮＡフラグメントおよびＤＮＡ
０.５μgあたり約１０ユニットのＴ4 ＤＮＡリガーゼ
（リガーゼ）を用いて行われる。
【０１１５】実施例１ 正常な心臓と肥大化心臓でのミ
オトロフィンｍＲＮＡレベルの比較 正常な心臓と肥大化心臓におけるミオトロフィンｍＲＮ
Ａのレベルをノーザン・ブロット分析で比較する。ポリ
Ａ＋ｍＲＮＡを標準的操作に従って正常な心臓および病
気の心臓から単離する。ついで、変性ホルムアミド／
１.２％アガロースゲル上の電気泳動により分画し、正
に荷電したナイロン膜上にブロットする。その膜を適当
なハイブリダイゼーション条件を用いて32Ｐで放射性標
識したミオトロフィンｃＤＮＡでプローブし、つづいて
ストリンジェントな洗浄に付す。得られたシグナルをリ
ン光影像法により定量する。また同様のプロトコルを用
いてたの組織におけるミオトロフィンのレベルを評価す
る。例えば、ミオトロフィン発現の基底レベルを、ノー
ザン・ブロット分析、ならびに成長因子およびサイトカ
インを含め、種々の因子のその発現の制御能により、種
々の他の血管細胞にて試験することができる。
オトロフィンｍＲＮＡレベルの比較 正常な心臓と肥大化心臓におけるミオトロフィンｍＲＮ
Ａのレベルをノーザン・ブロット分析で比較する。ポリ
Ａ＋ｍＲＮＡを標準的操作に従って正常な心臓および病
気の心臓から単離する。ついで、変性ホルムアミド／
１.２％アガロースゲル上の電気泳動により分画し、正
に荷電したナイロン膜上にブロットする。その膜を適当
なハイブリダイゼーション条件を用いて32Ｐで放射性標
識したミオトロフィンｃＤＮＡでプローブし、つづいて
ストリンジェントな洗浄に付す。得られたシグナルをリ
ン光影像法により定量する。また同様のプロトコルを用
いてたの組織におけるミオトロフィンのレベルを評価す
る。例えば、ミオトロフィン発現の基底レベルを、ノー
ザン・ブロット分析、ならびに成長因子およびサイトカ
インを含め、種々の因子のその発現の制御能により、種
々の他の血管細胞にて試験することができる。
【０１１６】実施例２：ミオトロフィンのＮＦ−ｋＢの
活性に対する効果 ミオトロフィン過少発現のＮＦ−ｋＢに対する効果を、
ＮＦ−ｋＢ作動性プロモーターの制御下にあるルシフェ
ラーゼ（luciferase）リポーター遺伝子を用いて測定す
る。ＨＳＡＢＨ０１を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ
３＋（Invitrogen、San Diego、CA）のＥｃｏＲＩ
（５’）ＸｈｏＩ（３’）部位中にクローンする。つい
で、ＩＬ−８コアプロモーター作動性ルシフェラーゼ遺
伝子を安定してトランスフェクションしたＵ９３７ヒト
白血病細胞系にｐｃＤＮＡ３ｍｙｏをトランスフェクシ
ョンする。ミオトロフィン過剰発現の効果をルシフェラ
ーゼ活性を測定することでモニターする。
活性に対する効果 ミオトロフィン過少発現のＮＦ−ｋＢに対する効果を、
ＮＦ−ｋＢ作動性プロモーターの制御下にあるルシフェ
ラーゼ（luciferase）リポーター遺伝子を用いて測定す
る。ＨＳＡＢＨ０１を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ
３＋（Invitrogen、San Diego、CA）のＥｃｏＲＩ
（５’）ＸｈｏＩ（３’）部位中にクローンする。つい
で、ＩＬ−８コアプロモーター作動性ルシフェラーゼ遺
伝子を安定してトランスフェクションしたＵ９３７ヒト
白血病細胞系にｐｃＤＮＡ３ｍｙｏをトランスフェクシ
ョンする。ミオトロフィン過剰発現の効果をルシフェラ
ーゼ活性を測定することでモニターする。
【０１１７】実施例３：培養細胞におけるミオトロフィ
ン過剰発現の効果 培養した細胞を、リン酸カルシウム沈降法を用い、実施
例３に記載のｐｃＤＮＡ３ｍｙｏベクターでトランスフ
ェクションする。４８時間後、肥大の指標である細胞の
大きさおよび面積を当業者に周知の方法に従って評価す
る。
ン過剰発現の効果 培養した細胞を、リン酸カルシウム沈降法を用い、実施
例３に記載のｐｃＤＮＡ３ｍｙｏベクターでトランスフ
ェクションする。４８時間後、肥大の指標である細胞の
大きさおよび面積を当業者に周知の方法に従って評価す
る。
【０１１８】実施例４：ミオトロフィン過剰発現の心筋
細胞におけるＮＦ−ｋＢの活性化に対する効果 対照およびミオトロフィン発現細胞を電気泳動移動度シ
フトアッセイによりＮＦ−ｋＢについて評価する。核お
よび細胞質抽出物を当該分野にて周知の方法に従って各
細胞より調製する。核（活性）ＮＦ−ｋＢをコンセンサ
スＮＦ−ｋＢＤＮＡ結合モチーフを含有する32Ｐ標識化
オリゴヌクレオチドを用いて測定する。シフトしたバン
ドの存在は、活性化ＮＦ−ｋＢの指標である。
細胞におけるＮＦ−ｋＢの活性化に対する効果 対照およびミオトロフィン発現細胞を電気泳動移動度シ
フトアッセイによりＮＦ−ｋＢについて評価する。核お
よび細胞質抽出物を当該分野にて周知の方法に従って各
細胞より調製する。核（活性）ＮＦ−ｋＢをコンセンサ
スＮＦ−ｋＢＤＮＡ結合モチーフを含有する32Ｐ標識化
オリゴヌクレオチドを用いて測定する。シフトしたバン
ドの存在は、活性化ＮＦ−ｋＢの指標である。
【０１１９】実施例５：肥大実験 本発明者らはさらに肺高血圧の低酸素性チャンバーモデ
ル、右心室性肥大のモデルより得られた心臓にて、ＨＳ
ＡＢＨ０１（またはヒト・ミオトロフィン／Ｖ−１）ｃ
ＤＮＡが心室性肥大において高レベルのミオトロフィン
／Ｖ−１ ｍＲＮＡを検出することを確認した。これら
の肥大心臓由来のＲＮＡに対するヒトｃＤＮＡプローブ
を用いて行うミオトロフィン／Ｖ−１発現のノーザン・
ブロット分析は、ミオトロフィン／Ｖ−１発現が心室性
肥大と相関していることを示唆する。他の研究者により
報告されているラット・ミオトロフィン／Ｖ−１（Adih
aryら、１９９６；Sivasubramanianら、１９９６）につ
いて多重バンドが検出された。優勢な４.３ｋｂバンド
を用い、ＲＮＡローディング変化を標準化するために、
ＧＡＰＤＨハイブリダイゼーションシグナル強度に対す
るミオトロフィン／Ｖ−１ハイブリダイゼーションシグ
ナル強度の割合として表されるミオトロフィン／Ｖ−１
レベルは、低酸素症で、対照の０.４６ ０.０３４から
７日後の１.０ ０.０２４、そして１４日後の１.１２
０.０８２に増加した。心臓性肥大におけるミオトロ
フィン発現を特徴付ける先のすべての報告を、左心室肥
大のモデルに用いた。そのデータはミオトロフィン／Ｖ
−１発現が右心室性肥大のモデルの肥大度と相関してい
ることを示し、右または左心室が関与しているかどうか
の指標である肥大工程ににおけるミオトロフィン／Ｖ−
１の役割を示唆する。
ル、右心室性肥大のモデルより得られた心臓にて、ＨＳ
ＡＢＨ０１（またはヒト・ミオトロフィン／Ｖ−１）ｃ
ＤＮＡが心室性肥大において高レベルのミオトロフィン
／Ｖ−１ ｍＲＮＡを検出することを確認した。これら
の肥大心臓由来のＲＮＡに対するヒトｃＤＮＡプローブ
を用いて行うミオトロフィン／Ｖ−１発現のノーザン・
ブロット分析は、ミオトロフィン／Ｖ−１発現が心室性
肥大と相関していることを示唆する。他の研究者により
報告されているラット・ミオトロフィン／Ｖ−１（Adih
aryら、１９９６；Sivasubramanianら、１９９６）につ
いて多重バンドが検出された。優勢な４.３ｋｂバンド
を用い、ＲＮＡローディング変化を標準化するために、
ＧＡＰＤＨハイブリダイゼーションシグナル強度に対す
るミオトロフィン／Ｖ−１ハイブリダイゼーションシグ
ナル強度の割合として表されるミオトロフィン／Ｖ−１
レベルは、低酸素症で、対照の０.４６ ０.０３４から
７日後の１.０ ０.０２４、そして１４日後の１.１２
０.０８２に増加した。心臓性肥大におけるミオトロ
フィン発現を特徴付ける先のすべての報告を、左心室肥
大のモデルに用いた。そのデータはミオトロフィン／Ｖ
−１発現が右心室性肥大のモデルの肥大度と相関してい
ることを示し、右または左心室が関与しているかどうか
の指標である肥大工程ににおけるミオトロフィン／Ｖ−
１の役割を示唆する。
【０１２０】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人：マリー・シー・チャボット−フレッチャ
ー、カレン・エム・アンダーソン （ｉｉ）発明の名称： ヒト・ミオトロフィンクロー
ン、ＨＳＡＢＨ０１ （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名： スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名： スウェードランド・ロード７０９番、
ピー・オー・ボックス１５３９ （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスケット、３.５インチ、１.４４
Ｍｂ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ４８６ （Ｃ）オペレーティングシステム：ウィンドウ・フォー
・ワークグループ （Ｄ）ソフトウェア：マイクロソフト・ワード （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ウィリアム・ティー・ハン （Ｂ）登録番号：３４,３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５００２６ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０ ２７０ ５２１９ （Ｂ）テレファックス番号：６１０ ２７０ ４０２６
ー、カレン・エム・アンダーソン （ｉｉ）発明の名称： ヒト・ミオトロフィンクロー
ン、ＨＳＡＢＨ０１ （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛名： スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名： スウェードランド・ロード７０９番、
ピー・オー・ボックス１５３９ （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア州 （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスケット、３.５インチ、１.４４
Ｍｂ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ４８６ （Ｃ）オペレーティングシステム：ウィンドウ・フォー
・ワークグループ （Ｄ）ソフトウェア：マイクロソフト・ワード （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ウィリアム・ティー・ハン （Ｂ）登録番号：３４,３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５００２６ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０ ２７０ ５２１９ （Ｂ）テレファックス番号：６１０ ２７０ ４０２６
【０１２１】（２） 配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５８８ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： GGCACGAGCC ACCGCCTCCT CATCTTCTGC CCGGCCAACC GGCCTGCCCC 50 GCTGCAGTGA TGTGCGACAA GGAGTTCATG TGGGCCCTGA AAAACGGAGA 100 CTTGGATGAG GTGAAAGACT ATGTGGCCAA GGGAGAAGAT GTCAACCGGA 150 CACTAGAAGG TGGAAGGAAA CCTCTTCATT ATGCAGCAGA TTGTGGGCAG 200 CTTGAAATCC TGGAATTTCT GCTGCTGAAA GGAGCAGATA TTAATGCTCC 250 AGATAAACAT CATATTACTC CTCTTCTGTC TGCTGTCTAT GAGGGTCATG 300 TTTCCTGTGT GAAATTGCTT CTGTCAAAGG GTGCTGATAA GACTGTGAAA 350 GGCCCAGATG GACTGACCGC CTTTGAAGCC ACTGACAACC AGGCAATCAA 400 AGCTCTTCTC CAGTGATGGA TGGATGGACT GATAACTCCG GAAGAATGAC 450 TCTCCTGTGG CCTCACACTG CTGCCTGTCT GTCTGTCACT CTCTATCTGC 500 CAGCTTCTTC AGCTAAATAC TTTAAGAGGG GTGAGGGGAG AGAGAAATTC 550 ATAACAAATC CGACTACCAG AAAAAAAAAA AAAAAAAA 588
【０１２２】（２） 配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１８ （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Cys Asp Lys Glu Phe Met Trp Ala Leu Lys Asn Gly Asp Leu 1 5 10 15 Asp Glu Val Lys Asp Tyr Val Ala Lys Gly Glu Asp Val Asn Arg 20 25 30 Thr Leu Glu Gly Gly Arg Lys Pro Leu His Tyr Ala Ala Asp Cys 35 40 45 Gly Gln Leu Glu Ile Leu Glu Phe Leu Leu Leu Lys Gly Ala Asp 50 55 60 Ile Asn Ala Pro Asp Lys His His Ile Thr Pro Leu Leu Ser Ala 65 70 75 Val Tyr Glu Gly His Val Ser Cys Val Lys Leu Leu Leu Ser Lys 80 85 90 Gly Ala Asp Lys Thr Val Lys Gly Pro Asp Gly Leu Thr Ala Phe 95 100 105 Glu Ala Thr Asp Asn Gln Ala Ile Lys Ala Leu Leu Gln 110 115
【図１】 ヒト・ミオトロフィン（本明細書中、ＨＳＡ
ＢＨ０１とも称される）の核酸配列（配列番号１）を示
す。
ＢＨ０１とも称される）の核酸配列（配列番号１）を示
す。
【図２】 ＨＳＡＢＨ０１によりコードされる推定アミ
ノ酸配列（配列番号２）を示す。
ノ酸配列（配列番号２）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 16/24 16/24 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 マリー・シー・チャボット−フレッチャー アメリカ合衆国19460ペンシルベニア州フ ェニックスビル、ゲイ・ストリート902番
Claims (18)
- 【請求項１】（ａ）配列番号１からなるポリヌクレオチ
ドに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌク
レオチド； （ｂ）遺伝暗号の重複性により、配列番号２と同じアミ
ノ酸をコードするポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して
相補性のポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
の少なくとも連続した１５塩基からなるポリヌクレオチ
ド からなる群より選択されるメンバーからなる単離ポリヌ
クレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１に示すヌクレオチドからなる
請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 配列番号１に示すヌクレオチド６０−４
１６からなる請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項６】 配列番号２のアミノ酸からなるポリペプ
チドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項７】 請求項２に記載のＤＮＡからなるベクタ
ー。 - 【請求項８】 請求項７に記載のベクターからなる宿主
細胞。 - 【請求項９】 請求項８記載の宿主細胞からそのＤＮＡ
によってコードされるポリペプチドを発現させることを
特徴とするポリペプチドの製造法。 - 【請求項１０】 ポリペプチドを発現する細胞の製造法
であって、細胞がベクター中に含まれるヒトｃＤＮＡに
よりコードされるポリペプチドを発現するように、該細
胞を請求項７に記載のベクターで形質転換またはトラン
スフェクションすることからなる方法。 - 【請求項１１】 請求項１に記載のポリヌクレオチドに
よりコードされるポリペプチド。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載のポリペプチドに対
するアゴニスト。 - 【請求項１３】 請求項１１に記載のポリペプチドに対
する抗体。 - 【請求項１４】 請求項１１に記載のポリペプチドに対
するアンタゴニスト。 - 【請求項１５】 ミオトロフィンを阻害する必要のある
患者の治療方法であって、請求項１４に記載のアンタゴ
ニストの治療上有効量を該患者に投与することからなる
治療方法。 - 【請求項１６】 請求項１１に記載のポリペプチドの発
現に関与する疾患または該疾患に対する感受性の診断方
法であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列にお
ける突然変異を測定することからなる方法。 - 【請求項１７】 宿主から由来のサンプル中の請求項１
１に記載のポリペプチドの存在について分析することか
らなる診断方法。 - 【請求項１８】 請求項１１に記載のポリペプチドに結
合し、その活性を活性化または阻害する化合物の同定方
法であって、 該ポリペプチド、すなわち、化合物が該ポリペプチドに
結合することに応じて検出可能なシグナルを提供する能
力を有する第２成分に関与するポリペプチドを発現する
細胞を、該ポリペプチドへの結合を可能とする条件下で
スクリーニングすべき化合物と接触させ、 該化合物とポリペプチドとの相互作用より生じるシグナ
ルの有無を検出することにより、該化合物がポリペプチ
ドに結合し、その活性を活性化するか阻害するかどうか
を測定することからなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3067796P | 1996-11-13 | 1996-11-13 | |
| US60/030677 | 1996-11-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10201488A true JPH10201488A (ja) | 1998-08-04 |
Family
ID=21855422
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9351918A Withdrawn JPH10201488A (ja) | 1996-11-13 | 1997-11-13 | ヒトミオトロフィンクローン、ｈｓａｂｈ０１ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6030811A (ja) |
| EP (1) | EP0843009A3 (ja) |
| JP (1) | JPH10201488A (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5284932A (en) * | 1990-09-07 | 1994-02-08 | The Cleveland Clinic Foundation | Process for purifying and characterizing myotrophia, a novel peptide that regulates myocardial growth |
| JP2863303B2 (ja) * | 1990-11-27 | 1999-03-03 | 三菱化学株式会社 | 新規蛋白質 |
-
1997
- 1997-11-07 US US08/965,904 patent/US6030811A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-11-10 EP EP97309001A patent/EP0843009A3/en not_active Withdrawn
- 1997-11-13 JP JP9351918A patent/JPH10201488A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6030811A (en) | 2000-02-29 |
| EP0843009A2 (en) | 1998-05-20 |
| EP0843009A3 (en) | 2001-05-02 |
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