JPH10201498A

JPH10201498A - ヒトウェルナー症候群の原因遺伝子の変異の検出方法

Info

Publication number: JPH10201498A
Application number: JP9011268A
Authority: JP
Inventors: Takehisa Matsumoto; 武久松本; Makoto Goto; 眞後藤; Yasuhiro Furuichi; 泰宏古市
Original assignee: EIJIIN KENKYUSHO KK
Current assignee: EIJIIN KENKYUSHO KK
Priority date: 1997-01-24
Filing date: 1997-01-24
Publication date: 1998-08-04

Abstract

(57)【要約】【課題】ウェルナー症の原因となる遺伝子の変異の検
出方法の提供。【解決手段】配列番号１で表される塩基配列の第733
〜734番目、第1620番目若しくは第4146番目の位置又は
配列番号２で表される塩基配列の第42番目の位置の塩基
を含むＤＮＡ断片を増幅し、得られる増幅断片に、配列
番号１又は２で表される塩基配列に基づいて前記位置の
塩基が３’末端となるように合成しかつ該塩基を変異さ
せたオリゴヌクレオチドＡ及び該塩基の隣りの配列が
５’末端となるように合成したオリゴヌクレオチドＸを
ハイブリダイズさせ、オリゴヌクレオチドＡとＸとを連
結することを特徴とするヒトウェルナー症候群の原因遺
伝子の変異の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ウェルナー症の原
因となる遺伝子の変異の検出方法、並びに該検出方法に
使用するオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー並
びに該遺伝子の変異の検出用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】ウェルナー症候群（ウェルナー早老症又
はウェルナー症と称されることもある）は、老化と密接
に関連する複雑な病状を呈する常染色体劣性遺伝病であ
る。ウェルナー症候群は、若年期に白髪化、ハゲ、皮膚
の退縮等の一般的な老人に見られる特徴を示すほか、糖
尿病、心疾患、ガン、白内障、骨粗鬆症等を多発し、特
に、白内障及び骨粗鬆症に関しては、全ての患者が発症
するという特徴を有することが知られている。白内障、
骨粗鬆症などは健常人が高齢化する場合に遭遇する病気
であることから、ウェルナー症候群に起因する早老の結
果、これらの病気が若年期に現れると考えられている。

【０００３】ウェルナー症候群患者由来の皮膚細胞（繊
維芽細胞）を培養すると、その分裂寿命（細胞分裂でき
る回数）は、同年令の健常人からの線維芽細胞の分裂寿
命に比べて著しく短く（すなわち分裂回数としては少な
く）なっていることが実験的に知られている。これらの
事実は、ウェルナー症候群に関わる遺伝子（ウェルナー
症遺伝子又はＷＳ遺伝子と称されることもある）が本来
的にヒトの老化過程をコントロールしており、この遺伝
子に何らかの突然変異が生じてウェルナー症候群を発症
させていることが示唆される。

【０００４】従って、原因遺伝子が究明され、かつ、そ
の突然変異部位が明らかにされることにより、ウェルナ
ー症候群の遺伝子診断が可能となる。最近、Yuら（Scie
nce, 272, 258-262, 1996; Oshima, Human Molecular G
enetics,5, 1909-1913,1996)は、ウエルナー症候群患者
ではRecQタイプのヘリカーゼ遺伝子（ＷＳヘリカーゼ遺
伝子）に13種類の変異があることを見いだした。しか
し、これらの変異以外にも変異部位の存在が予想され
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ウェルナー
症の原因となる遺伝子の変異の検出方法、並びに該検出
方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ及びプライ
マー並びに該遺伝子の変異の検出用キットを提供するこ
とを目的とする。

【０００６】

【課題を解決しようとするための手段】本発明者は、上
記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、ウェルナー症
候群の原因遺伝子からさらに新たな４箇所の変異部位を
見いだし、その変異部位を検出し得ることに成功し、本
発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、配列番号１で表され
る塩基配列の第733〜734番目、第1620番目若しくは第41
46番目の位置又は配列番号２で表される塩基配列の第42
番目の位置の塩基を含むＤＮＡ断片を増幅し、得られる
増幅断片に、配列番号１又は２で表される塩基配列に基
づいて前記位置の塩基が３’末端となるように合成した
オリゴヌクレオチドＢ又は該３’末端の塩基を変異させ
たオリゴヌクレオチドＡ、及び該３’末端の隣りの塩基
が５’末端となるように合成したオリゴヌクレオチドＸ
をハイブリダイズさせ、オリゴヌクレオチドＡ又はＢと
オリゴヌクレオチドＸとを連結することを特徴とするヒ
トウェルナー症候群の原因遺伝子の変異の検出方法であ
る。オリゴヌクレオチドＡとしては配列番号11〜14で表
されるいずれかの塩基配列を含むものが挙げられ、オリ
ゴヌクレオチドＢとしては配列番号15〜18で表されるい
ずれかの塩基配列を含むものが挙げられ、オリゴヌクレ
オチドＸとしては配列番号19〜22で表されるいずれかの
塩基配列を含むものが挙げられる。

【０００８】さらに、本発明は、ヒトウェルナー症候群
の原因遺伝子の変異部位を含む領域とハイブリダイズす
ることができるオリゴヌクレオチドをプライマーの一つ
として用いて該変異部位を含む領域を増幅することを特
徴とするヒトウェルナー症候群の原因遺伝子の変異の検
出方法である。ここで、変異としては配列番号１で表さ
れる塩基配列の第733〜734番目、第1620番目若しくは第
4146番目の位置又は配列番号２で表される塩基配列の第
42番目の位置の塩基が欠失し、置換し、又は他の塩基が
挿入したものが挙げられる。また、オリゴヌクレオチド
としては、配列番号23〜25で表される塩基配列を含むも
のが挙げられる。

【０００９】さらに、本発明は、配列番号１又は２で表
される塩基配列に基づいて配列番号１で表される塩基配
列の第733〜734番目、第1620番目若しくは第4146番目の
位置又は配列番号２で表される塩基配列の第42番目の位
置の塩基が３’末端となるように合成しかつ該塩基を変
異（例えば欠失、置換又は他の塩基の挿入）させた配列
を含む、ヒトウェルナー症候群の原因遺伝子の変異の検
出用オリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチド
としては、配列番号11〜14で表されるいずれかの塩基配
列を含むものが挙げられる。

【００１０】さらに、本発明は、配列番号１又は２で表
される塩基配列に基づいて配列番号１で表される塩基配
列の第733〜734番目、第1620番目若しくは第4146番目の
位置又は配列番号２で表される塩基配列の第42番目の位
置の塩基が３’末端となるように合成した配列を含む、
ヒトウェルナー症候群の原因遺伝子の変異の検出用オリ
ゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドとして
は、配列番号15〜18で表されるいずれかの塩基配列を含
むものが挙げられる。

【００１１】さらに、本発明は、配列番号１又は２で表
される塩基配列に基づいて配列番号１で表される塩基配
列の第735番目、第1621番目若しくは第4147番目の位置
又は配列番号２で表される塩基配列の第43番目の位置の
塩基が５’末端となるように合成された、ヒトウェルナ
ー症候群の原因遺伝子の変異の検出用オリゴヌクレオチ
ドである。該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号19
〜22で表されるいずれかの塩基配列を含むものが挙げら
れる。

【００１２】さらに、本発明は、配列番号１で表される
塩基配列の第733〜734番目、第1620番目若しくは第4146
番目の位置又は配列番号２で表される塩基配列の第42番
目の位置の塩基が変異（例えば欠失、置換又は他の塩基
の挿入）したものを含むＤＮＡとハイブリダイズするこ
とができるオリゴヌクレオチドプライマーである。該オ
リゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号23〜25
で表される塩基配列を含むものが挙げられる。

【００１３】さらに、本発明は、前記オリゴヌクレオチ
ド又はこれに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、ヒト
ウェルナー症候群の原因遺伝子の変異の検出用オリゴヌ
クレオチドプローブである。さらに、本発明は、前記プ
ライマー及び／又は前記プローブを含む、ヒトウェルナ
ー症候群の原因遺伝子の変異の検出用キットである。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
近年、ポジショナルクローニングの手法により、ウェル
ナー症の原因となる遺伝子（以下「ＷＳ遺伝子」とい
う）が同定された（Yu et al.,Science 272,258-262,19
96）。本発明者は、ＷＳ遺伝子の塩基配列を解析した結
果、ウェルナー症候群の発症に関与する遺伝子の突然変
異部位を明らかにし、該突然変異部位を検出すること
で、ウェルナー症候群の診断が可能であることを見出し
た。すなわち、ＷＳ遺伝子の変異の同定に先立ち、正常
のＷＳ遺伝子の塩基配列及び遺伝子構造の解析をＰ１フ
ァージＤＮＡを用いて行った。そして、ウェルナー症患
者及び健常人の末梢血のリンパ球細胞からゲノムＤＮＡ
を抽出し、健常人と患者の遺伝子配列を直接比較・解析
することにより、ウェルナー症患者に特異的な変異を同
定した。その結果、ウェルナー症候群と臨床診断された
患者由来のサンプルのほとんどについて変異を検出する
ことが可能となった。

【００１５】本発明のＷＳ遺伝子の検出は、例えば以下
の一連の操作により行うことができる。 I. ウェルナー症患者由来の細胞株の樹立及びゲノムＤ
ＮＡの調製 (1) ＥＢＶによるヒトＢ細胞のトランスフォーメーショ
ン末梢血液のＢリンパ球は、Epstein-Barrウイルス(EBV)
によってトランスフォームすると継続して分裂する細胞
株になる。この細胞は安定したゲノムＤＮＡの供給源と
なる。ＥＢＶとしては、B95-8 （マーモセット由来リン
パ球系細胞）の培養上清を使用することができる。

【００１６】健常人又はＷＳ患者の末梢血液細胞を分離
後、ＥＢＶの存在下で培養すると、１〜２週間後に細胞
のクラスターが出現する。これを継続して培養し、トラ
ンスフォーム細胞株を樹立する（Miller, G. In Virolo
gy, B.N.Fields and K.M.Knipe, eds. (New York: Rave
n Press), pp. 1921-1958)。

【００１７】(2) 血液および細胞からのゲノムＤＮＡの
抽出ゲノムＤＮＡは、血液から精製された白血球又はそのト
ランスフォームしたＢ細胞から、通常のフェノール法、
例えばMolecular Cloning (Sanbrook, Fritschand Mani
atis, Cold Spring Harbor 出版) に記載された方法に
より抽出することができる。

【００１８】II. ＷＳ遺伝子を含むＰ１ファージクロー
ンの解析Ｐ１ファージシステムは、大腸菌を宿主とするためクロ
ーン化ＤＮＡの回収が容易であり、また組み込まれたＤ
ＮＡが安定であるという利点、さらに、ＳＰ６及びＴ７
プロモーター配列（ＳＰ６及びＴ７プロモーターによ
り、contig作製やwalkingの際インサートＤＮＡの両末
端の塩基配列を読むことができる）が配置されていると
いう利点を有する。また、宿主である大腸菌に感染した
ファージＤＮＡは、感染後は通常のプラスミドとして取
り扱える上に、通常のコロニーハイブリダイゼーション
法が利用できるという優れた特徴を持っている。従っ
て、本発明では、ＷＳ遺伝子配列及びイントロン／エク
ソン構造を迅速に高精度に解析するシステムとしてＰ１
ファージを選択する。なお、Ｐ１ファージクローンから
のＤＮＡの回収と精製は、Smollerら［Chromosoma 100,
487-494 (1991)］によって記載された方法により行
う。

【００１９】III. ＷＳ遺伝子のイントロン／エクソン
構造の解析ＷＳ遺伝子のイントロン／エクソン構造（エクソンと、
その両端のイントロンの近位端とが含まれる構造）は、
ＰＣＲをもとにした塩基配列決定法によって決定され
る。前述のYuらが発表したＷＳ遺伝子のｃＤＮＡの塩基
配列（Science 272,258-262,1996）を元に、ＰＣＲに使
用するプライマーを設計し、合成する。

【００２０】ＰＣＲは、Ｐ１ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし
て、上記合成したプライマー、４種類の蛍光標識ダイデ
オキシヌクレオチド-5'-三リン酸及び Taqポリメラーゼ
を含む反応系で行う。この反応では、無作為に蛍光色素
の入ったＤＮＡ断片が合成され、それをシークエンサー
で解析することで、最終的に連続した塩基配列を決定す
ることができる。なお、ＤＮＡの塩基配列の決定は、Ap
plied Biosystem 社製の自動ＤＮＡシークエンサー (mo
del ABI 377)等を用いて行うことができる。そして、得
られた塩基配列とＷＳ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列とを
照らし合わせ、Mount (S. M. Mount, Nucleic Acid Re
s., 10: 459-472, 1982) の報告を元にイントロン／エ
クソン連結部位の塩基配列を同定し、イントロン／エク
ソン構造を決定する。その結果、ＷＳ遺伝子は35個のエ
クソンより構成され、図１に示すような構造を持つこと
が判明した。

【００２１】IV. 塩基配列の直接比較法による変異の同
定上記イントロン／エクソンの塩基配列を決定し、健常者
由来のＰ１ファージクローンと患者ＤＮＡとの間でその
配列を比較することにより、ウェルナー症患者由来のＤ
ＮＡにおける変異部位を同定する。塩基配列の決定は、
Hattori ら［Electrophoresis 13, 560-565 (1992)］に
より記載されたＰＣＲをベースにした方法により行う。
すなわち、市販のキット、例えばPerkin Elmer社製の蛍
光ダイデオキシターミネーターを含有する PRISM Seque
nceing Kitを用いて反応を行い、Applied Biosystem 社
製のオートシークエンサー (モデル ABI 377) 等で塩基
配列を読み取り、附属の Macintoshコンピューターによ
りデータの解析を行い、変異部位を同定する。

【００２２】その結果、変異部位は、配列番号１で表さ
れる塩基配列の第733〜734番目、第1620番目又は第4146
番目の位置の塩基であり、その変異は、第733〜734番目
についてはＡＡが欠失し、第1620番目についてはＴがＡ
に置換し、第4146番目についてはＡが付加したものであ
ることがわかった。また、配列番号２で表される塩基配
列の第42番目の塩基にも変異が生じ、ＴがＡに置換して
いることがわかった。

【００２３】ここで、配列番号１で表される塩基配列を
有するＤＮＡは、前記III により解析されたイントロン
／エクソン構造のエクソン部分であり、ＷＳ遺伝子のｃ
ＤＮＡに相当する配列である。一方、配列番号２で表さ
れる塩基配列を有するＤＮＡは、前記III により解析さ
れたイントロン／エクソン構造（図１）のうち、第29番
目のエクソンと第30番目のエクソンとの間のイントロン
配列を含む配列であり、その42番目の塩基は、前記第29
番目のエクソン（配列番号１で表される塩基配列の第36
91番目）から７塩基上流に位置するもの（この位置に変
異が生じている）である。

【００２４】V. ＯＬＡ法による変異の検出本発明では、変異の検出はＯＬＡ（Ologomaer Ligation
Assay）により行うことができる。まず、検出の対象と
なる部位、すなわち配列番号１で表される塩基配列の第
733〜734番目（「検出部位10」とする）、第1620番目
（「検出部位９」とする）又は第4146番目（「検出部位
５」とする）の塩基、あるいは配列番号２で表される塩
基配列の第42番目（「検出部位８」とする）の塩基を含
むＤＮＡ断片を合成する。ＤＮＡ断片は、上記各検出部
位から上流及び下流に適当な間隔をおいてプライマーを
設計し、ＰＣＲを行うことにより合成される（図２(1)
）。

【００２５】各検出部位からプライマーまでの距離は任
意に設定することができるが、好ましくは、100 〜200b
p となるように設定する。また、プライマーのヌクレオ
チド数については特に限定されないが、20〜30塩基のも
のが好ましい。本発明に使用されるプライマーとして
は、例えば検出部位５を含む断片を増幅するには、配列
番号３で表される塩基配列を有するプライマーと配列番
号４で表される塩基配列を有するプライマーとの組合せ
が挙げられ、同様に、検出部位８を含む断片については
配列番号５と６、検出部位９を含む断片については配列
番号７と８、検出部位10を含む断片については配列番号
９と10で表される塩基配列を有するプライマーの組合せ
が挙げられる。このようにして合成されたプライマーを
用いて、検体となるゲノムＤＮＡをテンプレートとして
ＰＣＲ反応を行う（図２(2) ）。

【００２６】一方、配列番号１又は２で表される塩基配
列をもとに、前記検出部位が３’末端となるように18〜
30個の長さのオリゴヌクレオチドを合成し、かつ、その
３’末端に前記IVで同定した変異に対応する変異を導入
する（オリゴヌクレオチドＡという）。また、前記検出
部位の隣の塩基、すなわち配列番号１で表される塩基配
列の第735番目、第1621番目若しくは第4147番目の位置
又は配列番号２で表される塩基配列の第43番目の位置の
塩基が５’末端となるように18〜30個のオリゴヌクレオ
チド（オリゴヌクレオチドＸという）を合成する（図２
(3) ）。なお、変異は、正常な配列から公知の手法によ
り、例えば点突然変異誘発キット（In vitro Mutagenes
isキット, 宝酒造社製）を用いて導入してもよく、変異
が導入されたときの配列を設計して化学合成してもよ
い。このようにして合成されたオリゴヌクレオチドＡと
しては配列番号11〜14で表されるものが挙げられ、オリ
ゴヌクレオチドＸとしては配列番号19〜22で表されるも
のが挙げられる。配列番号11〜14で表される塩基配列の
オリゴヌクレオチドは、それぞれ検出部位５、８、９、
10の塩基が３’末端となるように合成したものであり、
配列番号19〜22で表される塩基配列のオリゴヌクレオチ
ドは、それぞれ検出部位５、８、９、10の塩基の隣の塩
基が５’となるように合成したものである。

【００２７】この際、オリゴヌクレオチドＡの５’末端
はビオチンで標識しておく。また、オリゴヌクレオチド
Ｘの３’末端はジゴキシゲニン-11-ダイデオキシUTP で
標識し、５’末端は燐酸基を付加しておく（図２(2)
）。

【００２８】次に、前記ＰＣＲ反応産物に、前記オリゴ
ヌクレオチドＡ及びＸをアニーリングさせ（図２(3)
）、オリゴヌクレオチドＡとＸとを連結させる（図２
(4) ）。検体のＤＮＡに目的とする突然変異が存在する
場合は、オリゴヌクレオチドＡ及びＸがＰＣＲ反応産物
にアニーリングする結果両者が結合でき、その両端にそ
れぞれビオチン及びジゴキシゲニンを持つものが作られ
る。従って、この産物をストレプトアビジンでコートし
たプレートにまいた後、アルカリフォスファターゼ標識
した抗ジゴキシゲニン抗体を反応させることによって、
呈色反応が生じて突然変異を検出することができる（図
２(5) ，左側）。

【００２９】これに対し、検体のＤＮＡに突然変異が存
在しない場合は、オリゴヌクレオチドＡとＸとが連結す
ることができない。従って、ビオチンで標識されたオリ
ゴヌクレオチドの他端にはジゴキシゲニンが存在しない
ため、アルカリフォスファターゼ標識した抗ジゴキシゲ
ニン抗体が結合することはできず、呈色反応は起こらな
い（図２，右側）（Delahunty et al., Am. J. Hum. Ge
net. 58, 1239-1246.,1996)。

【００３０】ここで、ウェルナー症は劣性遺伝病である
ため、二本鎖ＤＮＡにホモ変異を有する場合にウェルナ
ー症が発症すると考えられる。従って、検体のＤＮＡが
ホモ変異を有するか否かを確認する必要がある。

【００３１】そこで、オリゴヌクレオチドＡとオリゴヌ
クレオチドＸとの結合実験と並行して、前記検出部位が
変異していない正常な配列を有するオリゴヌクレオチド
（オリゴヌクレオチドＢとする）をオリゴヌクレオチド
Ａと同様に合成し、オリゴヌクレオチドＢとオリゴヌク
レオチドＸとの結合実験を行う。オリゴヌクレオチドＢ
としては、例えば配列番号15〜18で表されるものが挙げ
られ、それぞれ検出部位５、８、９、10の塩基が５’末
端となるように合成したもの（変異は導入していない）
である。

【００３２】その結果、オリゴヌクレオチドＡとＸとの
結合実験によって呈色反応が生じ、オリゴヌクレオチド
ＢとＸとの結合実験によって呈色反応が生じなかった場
合に、検体ＤＮＡはウェルナー症に関与するホモ変異を
起こしているものと判定することができる（図３(1)
）。なお、オリゴヌクレオチドＡとオリゴヌクレオチ
ドＸとの結合実験及びオリゴヌクレオチドＢとオリゴヌ
クレオチドＸとの結合実験のいずれの場合でも呈色反応
が生じた場合はヘテロ変異であると判定され（図３(2)
）、オリゴヌクレオチドＢとオリゴヌクレオチドＸと
の結合実験にのみ呈色反応が生じた場合は正常ＤＮＡで
あると判定される（図３(3) ）。

【００３３】VI. MASA法による変異の検出本発明では、変異の検出をＭＡＳＡ法により行うことも
できる。ＭＡＳＡ法とは、約20塩基前後の配列を有する
合成オリゴヌクレオチドであって変異ＤＮＡに特異的な
ものを調製し、該オリゴヌクレオチド、鋳型となるゲノ
ムＤＮＡ及びTaq ポリメラーゼを用いてＰＣＲを行うこ
とで変異アレルを特異的に増幅し、ゲル電気泳動にてバ
ンドとして検出する方法である。

【００３４】前記検出部位５、８、９又は10を含むＤＮ
Ａを増幅させるため、一組のプライマー（５’側センス
プライマー及び３’側アンチセンスプライマー）を合成
する。例えば、３’側アンチセンスプライマーについて
はＷＳ遺伝子の変異部位とは異なる領域とハイブリダイ
ズすることができるように合成し、５’側センスプライ
マーについては検出部位を含む領域とハイブリダイズす
ることができるように合成する。ここで、５’側センス
プライマーは、変異を含むもの及び変異を含まないもの
の両者を合成し、変異を含むプライマーについては変異
部位が該プライマーの３’末端となるように設計し合成
したものが好ましい。

【００３５】例えば、検出部位８を検出する場合は、
３’側アンチセンスプライマーとしては配列番号23で表
されるものが挙げられ、５’側センスプライマーとして
は、変異を含むものについては配列番号24、変異を含ま
ないものについては配列番号25で表されるものが挙げら
れる。

【００３６】本発明において「ハイブリダイズすること
ができる」とは、ＰＣＲの反応条件を厳密に設定したと
きに、変異を有するＤＮＡ断片（異常アレル）はプライ
マーがハイブリダイズすることができて効率良く増幅さ
れるが、変異のないＤＮＡ断片（正常アレル）はプライ
マーがハイブリダイズすることができずに増幅効率が非
常に悪くなるような条件をいう。この条件で上記プライ
マー、検体ゲノムＤＮＡ（25〜50 ng)及びTaq ポリメラ
ーゼを用いてＰＣＲを行う。例えば、95℃で５分間の加
熱を１回行った後、94℃で30秒間の加熱、50℃で30秒間
の加熱、及び72℃で30秒間の加熱を１サイクルとしてこ
れを40サイクル行う。その後さらに、72℃で４分間の加
熱を１回行う。

【００３７】その結果、変異を有する検体ＤＮＡは、変
異を有するプライマーとハイブリダイズすることができ
るため増幅が効率よく行われ、電気泳動を行った場合
に、ゲル上に陽性バンドとして検出される。これに対
し、正常の検体ＤＮＡは、変異を有するプライマーとハ
イブリダイズすることができないため増幅が行われず、
ゲル上にバンドは現れない。

【００３８】VII. ＷＳ遺伝子の変異の検出用キット本発明では、前記ＷＳ遺伝子の変異の検出に使用したオ
リゴヌクレオチドをＷＳ遺伝子の変異の検出用キットに
含めることができる。

【００３９】(1) ＯＬＡ法による検出用配列番号１で表される塩基配列の第733〜734番目、第16
20番目若しくは第4146番目の位置又は配列番号２で表さ
れる塩基配列の第42番目の位置の塩基を含むＤＮＡに基
づいて前記位置の塩基が３’末端となるように合成しか
つ該塩基を変異させたオリゴヌクレオチド（オリゴヌク
レオチドＡ）、例えば配列番号11〜14で表されるいずれ
かの塩基配列を含むもの、又は該オリゴヌクレオチドに
相補的なオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプラ
イマーとしてキットに含まれる。なお、本発明のキット
は、これらのオリゴヌクレオチドにオリゴヌクレオチド
Ｂ（例えば配列番号15〜18）及びオリゴヌクレオチドＸ
（例えば配列番号19〜22）が含まれてもよい。

【００４０】(2) ＭＡＳＡ法による検出用配列番号１で表される塩基配列の第733〜734番目、第16
20番目若しくは第4146番目の位置又は配列番号２で表さ
れる塩基配列の第42番目の位置の塩基を含むＤＮＡとハ
イブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド、例
えば配列番号23〜25で表されるいずれかの塩基配列を含
むものがオリゴヌクレオチドプライマーとしてキットに
含まれる。なお、本発明のキットには、これらのオリゴ
ヌクレオチドと、変異部位とは異なる領域とハイブリダ
イズすることができるオリゴヌクレオチドが含まれても
よい。

【００４１】本発明のオリゴヌクレオチドプライマー又
はオリゴヌクレオチドプローブをＷＳ遺伝子の変異の検
出用試薬として使用する場合は、これらのオリゴヌクレ
オチドをサザン又はノーザンブロット法のためのプロー
ブとして使用する。なお、オリゴヌクレオチドプローブ
は、ＤＮＡプローブであってもＲＮＡプローブであって
もよい。

【００４２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されな
い。〔実施例１〕ウェルナー症患者由来の細胞株の樹立及び
ゲノムＤＮＡの調製多数のウェルナー症候群（ＷＳ）患者の血液サンプルか
ら、ゲノムＤＮＡを調製した。

【００４３】(1) EBV トランスフォーメーションによる
Ｂリンパ球の確立健常人又はＷＳ患者の末梢血液細胞をリンパ球分離用試
薬 (Organo Teknika社製) で分離後、低濃度（200ng/m
l) のシクロスポリンＡ（Sandoz社）と EBVの存在下で
１〜２週間培養した。その結果、培地に細胞のクラスタ
ーが出現したので、これを継続して培養し、トランスフ
ォーム細胞株とした。

【００４４】(2) 細胞サンプルの収集とゲノムＤＮＡ調
製ヒト血液リンパ球からのゲノムＤＮＡ調製には、Molecu
lar Cloning (Sanbrook, Fritsch and Maniatis, Cold
Spring Harbor 出版) に記載された方法により行った。

【００４５】まず、新鮮な血液（10ml）を、80mlの 0.3
2M Sucrose、10mMの Tris-HCl buffer (pH 7.5)、5mM M
gCl₂及び 1％ Triton X-100 を含む溶液と混合して溶
血し、氷上に20分間静置後、遠心（2500rpm）し、リン
パ球を含むペレット画分を得た。また、トランスフォー
ムしたＢ細胞からのゲノムＤＮＡの調製は、培養した細
胞浮遊液を遠心し、細胞を含むペレット分画を得ること
により行った。これらのペレットを 2.25 mlの 0.075 M
NaCl 及び 0.025 M EDTA を含む溶液に懸濁し、0.25ml
の2mg/mlプロテイナーゼ K、５％ SDS及び 10mM Tris-H
Cl buffer (pH8.0)を加え、37℃で一晩インキュベート
した。この後、5ml からなる１容のフェノールと、１容
のクロロホルム−イソアミルアルコール（24:1）の混液
とを加え、静かに回しながらゲノムＤＮＡの抽出を行っ
た。遠心後（3,000rpm, 10分）上清画分を分取し、フェ
ノール／クロロホルムによる抽出を繰り返した。

【００４６】遠心分離により得られる上清に、10％容の
3M酢酸ナトリウム液（pH 5.2）を加え、更に 2.5倍容の
エタノールを加え、ゲノムＤＮＡを析出させた。綿状の
ＤＮＡをガラスパスツールピペットで巻取り、10mM Tri
s-HCl (pH 8.0)及び 0.2 mMEDTAを含む 1.25ml のバッ
ファーに溶かした。

【００４７】〔実施例２〕ＷＳ遺伝子を含むＰ１クロー
ンの解析純度の高いＰ１ＤＮＡは CsCl 密度勾配遠心法で分離精
製し、ＷＳ遺伝子のエクソン−イントロン構造の解析及
び遺伝子配列の解読の材料に用いた。

【００４８】(1) IPTG刺激による大腸菌体内Ｐ１コピー
数の増大・誘導法Ｐ１ファージクローンからのＤＮＡの回収・精製は、Sm
oller ら〔Chromosoma100, 487-494 (1991)〕によって
報告された方法に変更を加えて行った。単一Ｐ１ファー
ジクローンを含む大腸菌 (E. coli NS3529) コロニーを
最終濃度25μg/mlのカナマイシンを含む33mlのＬＢ培養
液中に懸濁し、37℃で一晩振盪培養した。翌日、同濃度
のカナマイシンを含む１L のＬＢ培養液中へ移し、1.5
時間振盪培養後、最終濃度0.5 mMとなるようにIPTGを加
え、引き続き５時間振盪培養した。

【００４９】(2) CsCl密度勾配遠心法によるＰ１ＤＮＡ
の精製Ｐ１ＤＮＡは、(1) に記載した方法により得られた菌体
から、通常のアルカリ-SDS法［Birnboim and Doly, Nuc
leic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979)］により調製
し、CsCl密度勾配遠心法により精製した。

【００５０】冷却遠心分離 (3,500rpm×15分) により回
収した菌体に、50mlの 50mM Sucrose-10mM EDTA-25mM T
ris-HCl (pH 8.0)と、50mg/ml のlysozyme溶液を1.5 ml
加え、穏やかに室温で５分インキュベートした。引き続
き、100ml の0.2M NaOH-1% SDS溶液を加え、穏やかに氷
上で５分インキュベートした。さらに、75mlの3M KAc-1
1.5% 氷酢酸を加え、穏やかに氷上で５分インキュベー
トした。冷却遠心分離(4,000 rpm×15分）により上清を
回収し、そこに最終濃度50μg/mlとなるようにRNase 溶
液を加え、37℃で１時間インキュベート後、同量の2-pr
opanolを加え -20℃で１時間放置した。冷却遠心分離
(6,000rpm×15分) 後、デカンテーションにより上清を
除去し、Ｐ１ＤＮＡを含む沈殿を70％EtOHで洗浄後完全
に風乾させた。６mlの10mM Tris-HCl-1mM EDTA (pH 8.
0) を加えて沈殿を溶解させ、そこに６g のCsClを加え
て十分に溶解させ、さらに 10mg/mlエチジウムブロミド
を 100μl 加え、-20 ℃で20分放置した。冷却遠心分離
(6,000rpm×10分) 後、上清を回収し、22℃で100,000r
pm×４時間以上の超高速遠心によりＰ１ＤＮＡをバクテ
リアゲノムと分離した。UV照射下Ｐ１ＤＮＡを含むバン
ドを回収後、イソアミルアルコールでエチジウムブロミ
ドを除き、また、２度の透析によりCsClを除き、Ｐ１Ｄ
ＮＡを精製した。透析バッファーとして10mM Tris-HCl-
1.25mM EDTA (pH8.0)を用いた。これらのＰ１ＤＮＡ
は、ＷＳ遺伝子のエキソン−イントロン構造の解析及び
遺伝子配列の解読の材料に使用した。

【００５１】〔実施例３〕ＷＳ遺伝子のイントロン／エ
クソン構造の解析３μg のＰ１ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、Yuらが発表し
たＷＳ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を元に設定したプラ
イマー、４種類の蛍光標識ダイデオキシヌクレオチド-
5'-三リン酸、及び Taqポリメラーゼを加えた反応系で
ＰＣＲを行った。反応は、96℃で５分の加熱を１回行っ
た後、96℃で30秒、50℃で15秒及び60℃で４分の反応を
１サイクルとしてこれを25サイクル行った。

【００５２】得られた反応産物についてＤＮＡの塩基配
列の決定を行った。配列決定は、Applied Biosystem 社
製の自動ＤＮＡシークエンサー (model ABI 377)を用い
て行った。得られた塩基配列とＷＳ遺伝子のｃＤＮＡの
塩基配列とを照らし合わせ、Mount (S. M. Mount, Nucl
eic Acid Res., 10: 459-472, 1982) の報告を元にイン
トロン／エクソン連結部位の塩基配列を同定し、イント
ロン／エクソン構造を決定した。その結果、ＷＳ遺伝子
は、図１で表されるイントロン／エクソン構造を有する
ものであることがわかった。

【００５３】〔実施例４〕塩基配列の直接比較法による
変異の同定実施例３で明らかになったイントロン／エクソン構造の
塩基配列について、健常人由来のＰ１ＤＮＡと患者ＤＮ
Ａとの間で比較を行った。実施例１(2) に示す方法によ
り精製濃縮されたＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、増幅に使
用したプライマー、４種類の蛍光標識ダイデオキシヌク
レオチド-5'-三リン酸、及び Taqポリメラーゼを加えた
反応系でＰＣＲを行った。ＤＮＡの塩基配列は、Applie
d Biosystem 社製の自動ＤＮＡシークエンサー (model
ABI 377)を用いて決定した。決定した検体のＤＮＡ塩基
配列とＰ１ＤＮＡの塩基配列とを比較することにより、
変異を同定した。

【００５４】その結果、変異部位を新たに４か所同定し
た（図１，Mut.５、Mut.８、Mut.９及びMut.10）。変異
部位であるMut.5 は配列番号１で表される塩基配列の第
4146番目にＡが付加したものであり、Mut.8 は配列番号
２で表される塩基配列の第42番目のＴがＡに置換したも
のであり、Mut.9 は配列番号１で表される塩基配列の第
1620番目のＴがＡに置換したものであり、Mut.10は配列
番号１で表される塩基配列の第733〜734 番目のＡＡが
欠失したものであった。

【００５５】〔実施例５〕OLA 法による変異の検出実施例４で変異部位が同定されたことにより、ウェルナ
ー症患者はこれらの変異を有することが予想される。そ
こで、これらの変異部位を検出部位として、以下の試験
を行った。まず、ＰＣＲを行ったときに前記Mut.5 、
８、９及び10（図１）のそれぞれの変異部位を含む断片
が増幅されるように、当該変異を挟む一組のプライマー
を調製した（表１）。

【００５６】

【表１】

【００５７】次に、健常人又はウェルナー症患者の血液
から、常法（Molecular Cloning: Sanbrook, Fritsch a
nd Maniatis, Cold Spring Harbor 出版) により検体と
なるゲノムＤＮＡを調製した。このＤＮＡ20〜40 ng を
含む20μl の溶液中（10mM Tris-HCl(pH8.3), 50mM KC
l, 1.5mM MgCl₂, 0.2mM dNTPs, 0.4 μM プライマー,25
mU/μg Taq Polymerase) でＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ
断片を増幅した。ＰＣＲは、96℃で５分の加熱を１回行
った後、96℃で30秒、48℃で30秒及び72℃で30秒加熱す
る反応を１サイクルとしてこれを40サイクル繰り返し、
最後に72℃で４分間加熱した。

【００５８】この反応液のうち15μl に40μl の0.1％T
riton X-100を加え、この液10μlと等量のライゲーショ
ン溶液（2 μl の10倍濃度T-ligation buffer,0.05μl
の5 mMオリゴヌクレオチドＡ又はオリゴヌクレオチド
Ｂ，0.05μl の5 mMオリゴヌクレオチドＸ，0.05μl の
5 U/μl Ampligase (Epi centre Technologies 社
製），7.85μl の精製水を含む）を混和してライゲーシ
ョン反応を行った。オリゴヌクレオチドＡ、オリゴヌク
レオチドＢ及びオリゴヌクレオチドＸの配列は表２に示
す。

【００５９】

【表２】

【００６０】この時、オリゴヌクレオチドＡは変異を有
するＤＮＡの塩基配列に相補し、オリゴヌクレオチドＢ
は正常なＤＮＡの塩基配列に相補するように設定してお
いた。ライゲーション反応は、94℃で１分間加熱を１回
行なった後、94℃で20秒間の加熱及び56℃〜64℃で２分
間加熱するサイクルを１サイクルとして10サイクル行っ
た。

【００６１】反応終了後、この反応液に10μl の反応停
止液（0.1 M EDTA, 0.1% Triton X-100）を加えた。25
μg/mlのストレプトアビジンでコートした後、0.1% BSA
/PBSでブロックした96ウェルのプレートに、ウェルあた
り上記の溶液を全量（30μl)加え、室温にて45分間振盪
した。

【００６２】ウェルを0.1 N NaOH/0.05% Tween 20 混合
液で２回洗浄後、0.1 M Tris-HCl (pH 8)/150 mM NaCl/
0.05% Tween 20混合液で２回洗浄した。アルカリフォス
ファターゼで標識した抗ジゴキシゲニン抗体をウェルに
加え、室温にて25〜60分間振盪した。ウェルを0.1 M Tr
is-HCl (pH 8)/150 mM NaCl/0.05% Tween 20混合液で６
回洗浄した。ウェルにELISA Amplification System（Gi
bco BRL社製）のアルカリフォスファターゼ基質と反応
増強剤を順次加えて、それぞれ10分間室温に置いた後
に、25μl の反応停止液（0.6M HCl又は0.3 M H₂SO₄)を
加え、呈色反応を終了させた。その結果、患者由来のＤ
ＮＡを用いた場合は呈色反応が認められ、健常人由来の
ＤＮＡを用いた場合は呈色反応は生じなかった。

【００６３】〔実施例６〕MASA法による変異の検出変異部分を含むＤＮＡを増幅させるため、プライマーの
一つが検出部位を含むように１組のプライマーを調製し
た。一方の側のプライマーは検出部位を含まない領域の
塩基配列に基づいて合成し、他方の側のプライマーは検
出部位を変異させたものと変異させないものとを設計し
たものであって該検出部位が３’末端になるように合成
した。これらのプライマーとして表３に示すものを使用
した。

【００６４】

【表３】

【００６５】次に、上記プライマー、鋳型となる検体ゲ
ノムＤＮＡ（25〜50ng) 及び Taqポリメラーゼを含む25
μl の反応液中でＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、変
異アレルは効率良く増幅されるが正常アレルは増幅効率
が非常に悪いように厳密に設定した。すなわち、95℃で
５分間加熱を１回行った後、94℃で30秒間の加熱、50℃
で30秒間の加熱及び72℃で30秒間の加熱を１サイクルと
してこれを40サイクル行った。その後、さらに72℃で４
分間加熱した。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を
行った。その結果、電気泳動ゲル上にはＤＮＡに変異Ｄ
ＮＡが含まれる場合にのみ陽性バンドとして検出できた
（図４）。

【００６６】図４において、Ｍは分子量マーカー（HaeI
IIで消化したφX174 DNA) 、レーン１は健常人ＤＮＡを
鋳型にして変異検出用センスプライマーを用いたＰＣＲ
産物、レーン２は健常人ＤＮＡを鋳型にして正常塩基配
列検出用センスプライマーを用いたＰＣＲ産物、レーン
３は患者ＤＮＡを鋳型にして変異検出用センスプライマ
ーを用いたＰＣＲ産物、レーン４は患者ＤＮＡを鋳型に
して正常塩基配列検出用センスプライマーを用いたＰＣ
Ｒ産物の電気泳動結果を示す。矢印は、バンドとして見
られるＰＣＲ産物の位置を示す

【００６７】

【発明の効果】本発明により、ウェルナー症の原因とな
る遺伝子の変異の検出方法並びに該検出方法に使用する
オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーが提供され
る。ヒトのウェルナー症の原因遺伝子の変異を検出する
ことは、ウェルナー症の診断に有用であり、この症候群
の発病及び作用メカニズムを解明するための研究にも有
用である。また、本発明のプローブ及びプライマーは、
ウェルナー症候群診断プローブとして、あるいは細胞生
物学的、免疫学的、生化学的、分子生物学的研究等のた
めの試薬として有用である。

【００６８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：５１８９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列： TGTGCGCCGG GGAGGCGCCG GCTTGTACTC GGCAGCGCGG GAATAAAGTT TGCTGATTTG 60 GTGTCTAGCC TGGATGCCTG GGTTGCAGCC CTGCTTGTGG TGGCGCTCCA CAGTCATCCG 120 GCTGAAGAAG ACCTGTTGGA CTGGATCTTC TCGGGTTTTC TTTCAGATAT TGTTTTGTAT 180 TTACCCATGA AGACATTGTT TTTTGGACTC TGCAAATAGG ACATTTCAAA GATGAGTGAA 240 AAAAAATTGG AAACAACTGC ACAGCAGCGG AAATGTCCTG AATGGATGAA TGTGCAGAAT 300 AAAAGATGTG CTGTAGAAGA AAGAAAGGCA TGTGTTCGGA AGAGTGTTTT TGAAGATGAC 360 CTCCCCTTCT TAGAATTCAC TGGATCCATT GTGTATAGTT ACGATGCTAG TGATTGCTCT 420 TTCCTGTCAG AAGATATTAG CATGAGTCTA TCAGATGGGG ATGTGGTGGG ATTTGACATG 480 GAGTGGCCAC CATTATACAA TAGAGGGAAA CTTGGCAAAG TTGCACTAAT TCAGTTGTGT 540 GTTTCTGAGA GCAAATGTTA CTTGTTCCAC GTTTCTTCCA TGTCAGTTTT TCCCCAGGGA 600 TTAAAAATGT TGCTTGAAAA TAAAGCAGTT AAAAAGGCAG GTGTAGGAAT TGAAGGAGAT 660 CAGTGGAAAC TTCTACGTGA CTTTGATATC AAATTGAAGA ATTTTGTGGA GTTGACAGAT 720 GTTGCCAATA AAAAGCTGAA ATGTACAGAG ACCTGGAGCC TTAACAGTCT GGTTAAACAC 780 CTCTTAGGTA AACAGCTCCT GAAAGACAAG TCTATCCGCT GTAGCAATTG GAGTAAATTT 840 CCTCTCACTG AGGACCAGAA ACTGTATGCA GCCACTGATG CTTATGCTGG TTTTATTATT 900 TACCGAAATT TAGAGATTTT GGATGATACT GTGCAAAGGT TTGCTATAAA TAAAGAGGAA 960 GAAATCCTAC TTAGCGACAT GAACAAACAG TTGACTTCAA TCTCTGAGGA AGTGATGGAT 1020 CTGGCTAAGC ATCTTCCTCA TGCTTTCAGT AAATTGGAAA ACCCACGGAG GGTTTCTATC 1080 TTACTAAAGG ATATTTCAGA AAATCTATAT TCACTGAGGA GGATGATAAT TGGGTCTACT 1140 AACATTGAGA CTGAACTGAG GCCCAGCAAT AATTTAAACT TATTATCCTT TGAAGATTCA 1200 ACTACTGGGG GAGTACAACA GAAACAAATT AGAGAACATG AAGTTTTAAT TCACGTTGAA 1260 GATGAAACAT GGGACCCAAC ACTTGATCAT TTAGCTAAAC ATGATGGAGA AGATGTACTT 1320 GGAAATAAAG TGGAACGAAA AGAAGATGGA TTTGAAGATG GAGTAGAAGA CAACAAATTG 1380 AAAGAGAATA TGGAAAGAGC TTGTTTGATG TCGTTAGATA TTACAGAACA TGAACTCCAA 1440 ATTTTGGAAC AGCAGTCTCA GGAAGAATAT CTTAGTGATA TTGCTTATAA ATCTACTGAG 1500 CATTTATCTC CCAATGATAA TGAAAACGAT ACGTCCTATG TAATTGAGAG TGATGAAGAT 1560 TTAGAAATGG AGATGCTTAA GCATTTATCT CCCAATGATA ATGAAAACGA TACGTCCTAT 1620 GTAATTGAGA GTGATGAAGA TTTAGAAATG GAGATGCTTA AGTCTTTAGA AAACCTCAAT 1680 AGTGGCACGG TAGAACCAAC TCATTCTAAA TGCTTAAAAA TGGAAAGAAA TCTGGGTCTT 1740 CCTACTAAAG AAGAAGAAGA AGATGATGAA AATGAAGCTA ATGAAGGGGA AGAAGATGAT 1800 GATAAGGACT TTTTGTGGCC AGCACCCAAT GAAGAGCAAG TTACTTGCCT CAAGATGTAC 1860 TTTGGCCATT CCAGTTTTAA ACCAGTTCAG TGGAAAGTGA TTCATTCAGT ATTAGAAGAA 1920 AGAAGAGATA ATGTTGCTGT CATGGCAACT GGATATGGAA AGAGTTTGTG CTTCCAGTAT 1980 CCACCTGTTT ATGTAGGCAA GATTGGCCTT GTTATCTCTC CCCTTATTTC TCTGATGGAA 2040 GACCAAGTGC TACAGCTTAA AATGTCCAAC ATCCCAGCTT GCTTCCTTGG ATCAGCACAG 2100 TCAGAAAATG TTCTAACAGA TATTAAATTA GGTAAATACC GGATTGTATA CGTAACTCCA 2160 GAATACTGTT CAGGTAACAT GGGCCTGCTC CAGCAACTTG AGGCTGATAT TGGTATCACG 2220 CTCATTGCTG TGGATGAGGC TCACTGTATT TCTGAGTGGG GGCATGATTT TAGGGATTCA 2280 TTCAGGAAGT TGGGCTCCCT AAAGACAGCA CTGCCAATGG TTCCAATCGT TGCACTTACT 2340 GCTACTGCAA GTTCTTCAAT CCGGGAAGAC ATTGTACGTT GCTTAAATCT GAGAAATCCT 2400 CAGATCACCT GTACTGGTTT TGATCGACCA AACCTGTATT TAGAAGTTAG GCGAAAAACA 2460 GGGAATATCC TTCAGGATCT GCAGCCATTT CTTGTCAAAA CAAGTTCCCA CTGGGAATTT 2520 GAAGGTCCAA CAATCATCTA CTGTCCTTCT AGAAAAATGA CACAACAAGT TACAGGTGAA 2580 CTTAGGAAAC TTAATCTATC CTGTGGAACA TACCATGCGG GCATGAGTTT TAGCACAAGG 2640 AAAGACATTC ATCATAGGTT TGTAAGAGAT GAAATTCAGT GTGTCATAGC TACCATAGCT 2700 TTTGGAATGG GCATTAATAA AGCTGACATT CGCCAAGTCA TTCATTACGG TGCTCCTAAG 2760 GACATGGAAT CATATTATCA GGAGATTGGT AGAGCTGGTC GTGATGGACT TCAAAGTTCT 2820 TGTCACGTCC TCTGGGCTCC TGCAGACATT AACTTAAATA GGCACCTTCT TACTGAGATA 2880 CGTAATGAGA AGTTTCGATT ATACAAATTA AAGATGATGG CAAAGATGGA AAAATATCTT 2940 CATTCTAGCA GATGTAGGAG ACAAATCATC TTGTCTCATT TTGAGGACAA ACAAGTACAA 3000 AAAGCCTCCT TGGGAATTAT GGGAACTGAA AAATGCTGTG ATAATTGCAG GTCCAGATTG 3060 GATCATTGCT ATTCCATGGA TGACTCAGAG GATACATCCT GGGACTTTGG TCCACAAGCA 3120 TTTAAGCTTT TGTCTGCTGT GGACATCTTA GGCGAAAAAT TTGGAATTGG GCTTCCAATT 3180 TTATTTCTCC GAGGATCTAA TTCTCAGCGT CTTGCCGATC AATATCGCAG GCACAGTTTA 3240 TTTGGCACTG GCAAGGATCA AACAGAGAGT TGGTGGAAGG CTTTTTCCCG TCAGCTGATC 3300 ACTGAGGGAT TCTTGGTAGA AGTTTCTCGG TATAACAAAT TTATGAAGAT TTGCGCCCTT 3360 ACGAAAAAGG GTAGAAATTG GCTTCATAAA GCTAATACAG AATCTCAGAG CCTCATCCTT 3420 CAAGCTAATG AAGAATTGTG TCCAAAGAAG TTTCTTCTGC CTAGTTCGAA AACTGTATCT 3480 TCGGGCACCA AAGAGCATTG TTATAATCAA GTACCAGTTG AATTAAGTAC AGAGAAGAAG 3540 TCTAACTTGG AGAAGTTATA TTCTTATAAA CCATGTGATA AGATTTCTTC TGGGAGTAAC 3600 ATTTCTAAAA AAAGTATCAT GGTACAGTCA CCAGAAAAAG CTTACAGTTC CTCACAGCCT 3660 GTTATTTCGG CACAAGAGCA GGAGACTCAG ATTGTGTTAT ATGGCAAATT GGTAGAAGCT 3720 AGGCAGAAAC ATGCCAATAA AATGGATGTT CCCCCAGCTA TTCTGGCAAC AAACAAGATA 3780 CTGGTGGATA TGGCCAAAAT GAGACCAACT ACGGTTGAAA ACGTAAAAAG GATTGATGGT 3840 GTTTCTGAAG GCAAAGCTGC CATGTTGGCC CCTCTGTTGG AAGTCATCAA ACATTTCTGC 3900 CAAACAAATA GTGTTCAGAC AGACCTCTTT TCAAGTACAA AACCTCAAGA AGAACAGAAG 3960 ACGAGTCTGG TAGCAAAAAA TAAAATATGC ACACTTTCAC AGTCTATGGC CATCACATAC 4020 TCTTTATTCC AAGAAAAGAA GATGCCTTTG AAGAGCATAG CTGAGAGCAG GATTCTGCCT 4080 CTCATGACAA TTGGCATGCA CTTATCCCAA GCGGTGAAAG CTGGCTGCCC CCTTGATTTG 4140 GAGCGAGCAG GCCTGACTCC AGAGGTTCAG AAGATTATTG CTGATGTTAT CCGAAACCCT 4200 CCCGTCAACT CAGATATGAG TAAAATTAGC CTAATCAGAA TGTTAGTTCC TGAAAACATT 4260 GACACGTACC TTATCCACAT GGCAATTGAG ATCCTTAAAC ATGGTCCTGA CAGCGGACTT 4320 CAACCTTCAT GTGATGTCAA CAAAAGGAGA TGTTTTCCCG GTTCTGAAGA GATCTGTTCA 4380 AGTTCTAAGA GAAGCAAGGA AGAAGTAGGC ATCAATACTG AGACTTCATC TGCAGAGAGA 4440 AAGAGACGAT TACCTGTGTG GTTTGCCAAA GGAAGTGATA CCAGCAAGAA ATTAATGGAC 4500 AAAACGAAAA GGGGAGGTCT TTTTAGTTAA GCTGGCAATT ACCAGAACAA TTATGTTTCT 4560 TGCTGTATTA TAAGAGGATA GCTATATTTT ATTTCTGAAG AGTAAGGAGT AGTATTTTGG 4620 CTTAAAAATC ATTCTAATTA CAAAGTTCAC TGTTTATTGA AGAACTGGCA TCTTAAATCA 4680 GCCTTCCGCA ATTCATGTAG TTTCTGGGTC TTCTGGGAGC CTACGTGAGT ACATCACCTA 4740 ACAGAATATT AAATTAGACT TCCTGTAAGA TTGCTTTAAG AAACTGTTAC TGTCCTGTTT 4800 TCTAATCTCT TTATTAAAAC AGTGTATTTG GAAAATGTTA TGTGCTCTGA TTTGATATAG 4860 ATAACAGATT AGTAGTTACA TGGTAATTAT GTGATATAAA ATATTCATAT ATTATCAAAA 4920 TTCTGTTTTG TAAATGTAAG AAAGCATAGT TATTTTACAA ATTGTTTTTA CTGTCTTTTG 4980 AAGAAGTTCT TAAATACGTT GTTAAATGGT ATTAGTTGAC CAGGGCAGTG AAAATGAAAC 5040 CGCATTTTGG GTGCCATTAA ATAGGGAAAA AACATGTAAA AAATGTAAAA TGGAGACCAA 5100 TTGCACTAGG CAAGTGTATA TTTTGTATTT TATATACAAT TTCTATTATT TTTCAAGTAA 5160 TAAAACAATG TTTTTCATAC TGAATATTA 5189

【００６９】配列番号：２配列の長さ：２１０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 配列： TCTTTTAAGT ACACTTTAAA AAGTGTTGTT TCTTTGTTTT TTGTTCAGAT TGTGTTATAT 60 GGCAAATTGG TAGAAGCTAG GCAGAAACAT GCCAATAAAA TGGATGTTCC CCCAGCTATT 120 CTGGCAACAA ACAAGATACT GGTGGATATG GCCAAAATGA GGTAAACTAT CTTTTGCATG 180 TGTTCTCATT TATTTCCTTC TAACAAAATA 210

【００７０】配列番号：３配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TGAATTTTTC GGTAAAGCTG GGTG 24

【００７１】配列番号：４配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TTCATCAAGT CATTAAGGGT GCAG 24

【００７２】配列番号：５配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： ATTGTTTCTT AAGCTAAGAG TCTG 24

【００７３】配列番号：６配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： AGAGATAAGC ATCGCAGCAG GGGG 24

【００７４】配列番号：７配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TGTTCATTCT TCTCTCTCTC CCTT 24

【００７５】配列番号：８配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： ATTAGTATAT TACCTCTAAC CCAT 24

【００７６】配列番号：９配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TAAGAAATAC TCAAGGTCAA TGTG 24

【００７７】配列番号：１０配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： ATTTAACATT CAGATAGAAA GTAC 24

【００７８】配列番号：１１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CCCCCTTGAT TTGGAGCGAA 20

【００７９】配列番号：１２配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： AAAAAGTGTT GTTTCTTTGT TTTTA 25

【００８０】配列番号：１３配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： ATGAAAACGA TACGTCCTAA 20

【００８１】配列番号：１４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TGACAGATGT TGCCAATAAA 20

【００８２】配列番号：１５配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： CCCCCTTGAT TTGGAGCGA 19

【００８３】配列番号：１６配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： AAAAAGTGTT GTTTCTTTGT TTTTT 25

【００８４】配列番号：１７配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： ATGAAAACGA TACGTCCTAT ２０

【００８５】配列番号：１８配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： ACAGATGTTG CCAATAAAAA 20

【００８６】配列番号：１９配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GCAGGCCTGA CTCCAGAG 18

【００８７】配列番号：２０配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTTCAGATTG TGTTATATGG CA 22

【００８８】配列番号：２１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTAATTGAGA GTGATGAAGA 20

【００８９】配列番号：２２配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GGTAAAAGCA ATATATATAT AATTTT 26

【００９０】配列番号：２３配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： AGAGATAAGC ATCGCAGCAG GGGG 24

【００９１】配列番号：２４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： GTGTTGTTTC TTTGTTTTTA 20

【００９２】配列番号：２５配列の長さ：１４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列： TTTCTTTGTT TTTT 14

【図面の簡単な説明】

【図１】ＷＳ遺伝子のイントロン／エクソン構造および
変異部位を示す模式図である。

【図２】ＯＬＡ法による遺伝子の検出の概要を示す図で
ある。

【図３】ＯＬＡ法による遺伝子の検出の概要を示す図で
ある。

【図４】アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表される塩基配列の第733
〜734番目、第1620番目若しくは第4146番目の位置又は
配列番号２で表される塩基配列の第42番目の位置の塩基
を含むＤＮＡ断片を増幅し、得られる増幅断片に、配列
番号１又は２で表される塩基配列に基づいて前記位置の
塩基が３’末端となるように合成したオリゴヌクレオチ
ドＢ又は該３’末端の塩基を変異させたオリゴヌクレオ
チドＡ、及び該３’末端の隣りの塩基が５’末端となる
ように合成したオリゴヌクレオチドＸをハイブリダイズ
させ、オリゴヌクレオチドＡ又はＢとオリゴヌクレオチ
ドＸとを連結することを特徴とするヒトウェルナー症候
群の原因遺伝子の変異の検出方法。
【請求項２】オリゴヌクレオチドＡが、配列番号11〜
14で表されるいずれかの塩基配列を含むものである請求
項１記載の検出方法。
【請求項３】オリゴヌクレオチドＢが、配列番号15〜
18で表されるいずれかの塩基配列を含むものである請求
項１記載の検出方法。
【請求項４】オリゴヌクレオチドＸが、配列番号19〜
22で表されるいずれかの塩基配列を含むものである請求
項１記載の検出方法。
【請求項５】ヒトウェルナー症候群の原因遺伝子の変
異部位を含む領域とハイブリダイズすることができるオ
リゴヌクレオチドをプライマーの一つとして用いて該変
異部位を含む領域を増幅することを特徴とするヒトウェ
ルナー症候群の原因遺伝子の変異の検出方法。
【請求項６】変異が、配列番号１で表される塩基配列
の第733〜734番目、第1620番目若しくは第4146番目の位
置又は配列番号２で表される塩基配列の第42番目の位置
の塩基が欠失し、置換し、又は他の塩基が挿入したもの
である請求項５記載の検出方法。
【請求項７】オリゴヌクレオチドが、配列番号23〜25
で表される塩基配列を含むものである請求項５記載の検
出方法。
【請求項８】配列番号１又は２で表される塩基配列に
基づいて配列番号１で表される塩基配列の第733〜734番
目、第1620番目若しくは第4146番目の位置又は配列番号
２で表される塩基配列の第42番目の位置の塩基が３’末
端となるように合成しかつ該塩基を変異させた配列を含
む、ヒトウェルナー症候群の原因遺伝子の変異の検出用
オリゴヌクレオチド。
【請求項９】変異が、欠失し、置換し、又は他の塩基
が挿入したものである請求項８記載のオリゴヌクレオチ
ド。
【請求項１０】オリゴヌクレオチドが、配列番号11〜
14で表されるいずれかの塩基配列を含むものである請求
項８記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】配列番号１又は２で表される塩基配列
に基づいて配列番号１で表される塩基配列の第733〜734
番目、第1620番目若しくは第4146番目の位置又は配列番
号２で表される塩基配列の第42番目の位置の塩基が３’
末端となるように合成した配列を含む、ヒトウェルナー
症候群の原因遺伝子の変異の検出用オリゴヌクレオチ
ド。
【請求項１２】オリゴヌクレオチドが、配列番号15〜
18で表されるいずれかの塩基配列を含むものである請求
項11記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】配列番号１又は２で表される塩基配列
に基づいて配列番号１で表される塩基配列の第735番
目、第1621番目若しくは第4147番目の位置又は配列番号
２で表される塩基配列の第43番目の位置の塩基が５’末
端となるように合成した配列を含む、ヒトウェルナー症
候群の原因遺伝子の変異の検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】オリゴヌクレオチドが、配列番号19〜
22で表されるいずれかの塩基配列を含むものである請求
項13記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】配列番号１で表される塩基配列の第73
3〜734番目、第1620番目若しくは第4146番目の位置又は
配列番号２で表される塩基配列の第42番目の位置の塩基
が変異したものを含むＤＮＡとハイブリダイズすること
ができるオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１６】変異が、欠失し、置換し、又は他の塩
基が挿入したものである請求項15記載のオリゴヌクレオ
チドプライマー。
【請求項１７】オリゴヌクレオチドが、配列番号23〜
25で表される塩基配列を含むものである請求項15記載の
プライマー。
【請求項１８】請求項８〜14のいずれか１項に記載の
オリゴヌクレオチド又は該オリゴヌクレオチドに相補的
なオリゴヌクレオチドを含む、ヒトウェルナー症候群の
原因遺伝子の変異の検出用オリゴヌクレオチドプロー
ブ。
【請求項１９】請求項15〜17のいずれか１項に記載の
プライマー及び／又は請求項18記載のプローブを含む、
ヒトウェルナー症候群の原因遺伝子の変異の検出用キッ
ト。