JPH10203992A - ベルトレティア抽出物を含有してなる化粧用組成物、薬用組成物、及び、細胞培養液用組成物 - Google Patents

ベルトレティア抽出物を含有してなる化粧用組成物、薬用組成物、及び、細胞培養液用組成物

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JPH10203992A
JPH10203992A JP9242206A JP24220697A JPH10203992A JP H10203992 A JPH10203992 A JP H10203992A JP 9242206 A JP9242206 A JP 9242206A JP 24220697 A JP24220697 A JP 24220697A JP H10203992 A JPH10203992 A JP H10203992A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 皮膚細胞、特に繊維芽細胞のビタミンC取込
みの改善が望まれる部位への塗布に好適に使用される新
規の化粧用又は薬用組成物、特に皮膚科用組成物、及
び、ヒト皮膚培養細胞におけるコラーゲンVII合成促
進、及び/又は、上記細胞のビタミンC取込み促進をす
ることができる細胞培養液用組成物を提供する。 【解決手段】 ベルトレティア抽出物を含有してなる、
コラーゲンVII合成促進及び/又は皮膚細胞のビタミ
ンC取込み促進をすることができる化粧用組成物、コラ
ーゲンVII合成欠乏による症状の治療に使用するため
の薬用組成物、並びに、ヒト皮膚培養細胞におけるコラ
ーゲンVII合成促進、及び/又は、前記細胞のビタミ
ンC取込み促進をすることができる細胞培養液用組成
物。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、化粧又は製薬分
野、特に皮膚科学分野におけるベルトレティア(Ber
tholletia)抽出物の新規使用に関する。更
に、細胞培養培地、特にヒト皮膚細胞を培養する培地で
の該抽出物の新規使用に関する。
【0002】
【従来の技術】ベルトレティアはサガリバナ科に属し、
ベルトレティア・エクセルサ(Bertholleti
a excelsa)とベルトレティア・ノビリス(B
ertholletia nobilis)という2つ
の非常に似通った種を含む属である。これらは南アメリ
カ、特にブラジルの熱帯地方で見られる樹木である。高
さは30〜40メートルに達する。一般にはブラジルク
ルミ又はブラジルクリノキと呼ばれている。この2種類
の木の実は類似点が多く、実際に混同されることがあ
る。これらは食用である。これらについては、特にパウ
ル・H.メンシエ(Paul H.Mensier)
著、パウル・レシェバリエ(Paul Lecheva
liers)社出版、パリ、1957年の「ディクショ
ネア・デ・ユイル・ベジタル(Dictionnari
e des Huiles Vegetale)(植物
油辞典)」で記述されている。
【0003】アマゾンでは、ベルトレティア・エクセル
サの幹の樹皮は、特にサポニンを含有するため、肝臓の
病気を抑制する煎じ薬として使用されている。その実か
ら採れる油脂は石鹸の製造に使用できる(R.E.シュ
ルツ(R.E.Schultes)ら、「ザ・ヒーリン
グ・フォレスト(The healing fores
t)」、ディスコリヅ・プレス(Discorides
Press)、ポートランド、オレゴン、米国、19
90、2巻、225〜226頁)。
【0004】本発明者は、ベルトレティアの抽出物は、
コラーゲンVII合成に対する活性と細胞内へのビタミ
ンC輸送に対する効果を有するため、化粧又は製薬分
野、特に皮膚科学分野において極めて有用であることを
見いだした。周知のように、皮膚は本質的にコラーゲン
Iを含有する。コラーゲンIは、真皮中で最も数の多い
細胞である繊維芽細胞により合成される蛋白質である。
この蛋白質は支持的役割を果たし、真皮の生物力学的性
質、特にその張り、及び、その構造の維持に関して役割
を持っている(E.U.クカルツ(E.U.KUCHA
RZ)、「ザ・コラーゲン:バイオケミストリー・アン
ド・パトフィジオロジー(The collagen
s:Biochemistry and pathop
hysiology)」、シュプリンガー・フェルラー
ク、ベルリン、1992)。また、老人は若者よりも真
皮の繊維芽細胞におけるコラーゲン分泌量が少ないこと
が分かっている(M.デュマス(M.DUMAS)ら、
Mech.Ageing Dev.、1994、73
巻、179〜187頁)。従って、年齢と共に、皮膚の
流動学的性質や日々受ける圧力に対する応答が衰える。
皮膚はたるみ、伸びに対する応答が乏しくなり、張りを
失い、皺が深くなる。
【0005】同じく周知のように、コラーゲンIVは表
皮−真皮接合部の主要コラーゲンである。この課題に関
する参考文献としては、ブリッガマンR.A.(Bri
ggaman R.A.)著、「バイオケミカル・コン
ポジション・オブ・ザ・エピダーマル−ダーマル・ジャ
ンクション・アンド・アザー・ベイスメント・メンブラ
ン」、J.Invest.Dermatol.、198
2、78巻、1〜6頁、及び、P.フェランド(P.V
erande)著、「ラ・ジォクショ・デルモエピデル
ミク(La jonction dermoepide
rmique)」、エセルム・イン・セミネール・エセ
ルム(Inserm in Seminarie In
serm)、1991年、214巻、83〜100頁が
ある。
【0006】このコラーゲンIVは稠密層に存在するも
ので、細胞の固着に関与し、表皮ケラチン細胞により合
成される。基底板は、表皮ケラチン細胞につながるアン
カリングフィラメントとコラーゲン繊維(コラーゲンI
及びIII)からなる真皮の細胞外マトリックスをつな
ぎとめるものである。この基底板はコラーゲンIVから
なり、2つの皮膚の仕切りの機能的な界面維持に必要で
ある。また、コラーゲンIVは瘢痕化の過程において重
要な役割を果たし、良質な瘢痕組織の形成を可能にす
る。
【0007】VII型コラーゲンは、基底膜に会合して
いる、表皮と真皮をつなぐアンカリングフィラメントの
主要構成要素である。R.バーゲソン(R.BURGE
SON)、タイプVII・コラーゲン、アンカーリング
・フィブリルズ、アンド・エピダーモリシス・ブロー
サ、J.Invest.Dermatol.、101
巻、252〜255巻(1993年)に記載されている
ように、基底表皮ケラチン細胞と、少量ではあるが、真
皮の繊維芽細胞とがコラーゲンVIIを合成する。最近
の研究では、レチノイン酸を局部に塗布すると、化学線
曝露により老化した皮膚においてアンカリングフィラメ
ントの数が増加することが分かっている。
【0008】Y.Q.チェン、A.モービール、J.リ
ーナネン、S.ソルバーグ、J.ユイト(Y.Q.CH
EN,A.MAUVIEL,J.RYYNAEN,S.
SOLLBERG,J.UITTO)、「タイプVII
・コラーゲン・ジーン・イクスプレッション・バイ・ヒ
ューマン・スキン・フィブロブラスツ・アンド・ケラチ
ノサイツ・イン・カルチャー:インフルエンス・オブ・
ドナー・エイジ・アンド・サイトカイン・レスポンシ
ズ」、J.Invest.Dermatol.、102
巻、(2)、205〜209巻(1994年)によれ
ば、皮膚がもろくなったり表皮の修復能が減少するとい
った皮膚の老化の兆候は、老人におけるコラーゲンVI
I合成の減少に起因する可能性がある。
【0009】本発明者は、全く驚くべきことに、ベルト
レティア抽出物が健常人表皮ケラチン細胞の培養株によ
るコラーゲンVII分泌に対して効果を有することを見
いだした。この発見から、特に表皮−真皮接合を促進す
る観点から、コラーゲンVII合成の促進が望ましい部
位への塗布に好適に使用される新規の化粧用又は薬用組
成物、特に皮膚科用組成物の開発が実現した。この特性
は、局部的な化粧用又は皮膚科用組成物の開発に極めて
有用であることを証明した。このような組成物を用いる
と、特に張りを失ってたるんだ皮膚の表皮−真皮接合を
促進することが可能となり、また表皮溶解性水疱等の表
皮−真皮接合部の欠陥に起因する病状を治療することが
できる。更に、ベルトレティア抽出物は驚くべきこと
に、皮膚細胞、特に繊維芽細胞のビタミンC取込み(す
なわち輸送)を大きく改善できることをも見いだした。
【0010】ところで、周知のようにビタミンC即ちL
−アスコルビン酸は、哺乳類の細胞において種々のレベ
ルで: −その還元電位の低さ故の、特にミトコンドリア呼吸鎖
が絶えず作りだす過酸化物に対する細胞の保護機構にお
いて作用する酸化防止剤、及び、 −I型及びIII型コラーゲン合成に必須のヒドロキシ
ラーゼ等の酵素の補助因子として関与する。 従って、ビタミンCは、細胞の持ついくつかの生体内機
能において極めて重要であり、このことから、細胞外媒
質から細胞質内へのビタミンC輸送の重要性が理解され
る。しかし、ヒト細胞、特に皮膚細胞はこの分子を合成
しない。食料により供給され、腸で吸収されて、血液が
全組織に輸送する。血漿内濃度は通常約25μMであ
る。高い親和性を有する蛋白質輸送体が、蛋白質の濃度
勾配に逆らって細胞内にビタミンCを取り入れる。
【0011】後者の発見により、皮膚細胞、特に繊維芽
細胞のビタミンC取込みの改善が望まれる部位への塗布
に好適に使用される新規の化粧用又は薬用組成物、特に
皮膚科用組成物の開発が可能となった。
【0012】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述の現状
に鑑み、皮膚細胞、特に繊維芽細胞のビタミンC取込み
の改善が望まれる部位への塗布に好適に使用される新規
の化粧用又は薬用組成物、特に皮膚科用組成物、並び
に、ヒト皮膚培養細胞におけるコラーゲンVII合成促
進、及び/又は、上記細胞のビタミンC取込み促進をす
ることができる細胞培養液用組成物を提供することを目
的とする。
【0013】
【課題を解決するための手段】本発明は、コラーゲンV
II合成促進及び/又は皮膚細胞のビタミンC取込み促
進をすることができる、ベルトレティア抽出物を含有し
てなる化粧用組成物である。本発明はまた、コラーゲン
VII合成欠乏による症状の治療に使用するための、ベ
ルトレティア抽出物を含有してなる薬用組成物であり、
更に、皮膚細胞のビタミンC取込み不足による症状の治
療に使用するための、ベルトレティア抽出物を含有して
なる薬用組成物でもある。本発明は、更に、ヒト皮膚培
養細胞におけるコラーゲンVII合成促進、及び/又
は、前記細胞のビタミンC取込み促進をすることができ
る、ベルトレティア抽出物を含有してなる細胞培養液用
組成物でもある。
【0014】従って、本質的な特徴の1つによれば、本
発明は、コラーゲンVII合成促進及び/又は皮膚細
胞、特に繊維芽細胞のビタミンC取込み促進を目的とす
る化粧剤としてのベルトレティア抽出物、好ましくはベ
ルトレティア・エクセルサ抽出物の使用に関する。上記
化粧剤は、化粧学的に許容される媒体を含有する化粧用
組成物に配合することができ、上記抽出物はこれに溶解
又は懸濁される。
【0015】第一の特徴によると、化粧剤がコラーゲン
VII合成の促進を目的とする場合、上記組成物は表皮
−真皮接合の改善が望まれる部位への塗布に好適に使用
される。この使用は、特にしわ防止製品、又は、皮膚の
化学線老化、即ち放射線、特に太陽の放射する紫外線に
よる老化を抑制する製品への使用を含む。一般に、上記
第一の特徴によると、上記本発明の化粧用組成物は、肌
引き締め用製品、特にゆるんだ皮膚や張りを失った皮膚
に用いる製品として好適に使用される。
【0016】第二の特徴によると、上記化粧用組成物は
また、皮膚細胞のビタミンC取込みの改善を目的とする
ことができる。この効果は、細胞代謝の改善、特に種々
のコラーゲン及びエラスチンの細胞内合成の活性化につ
ながる。従って、ベルトレティア抽出物、好ましくはベ
ルトレティア・エクセルサ抽出物は、ビタミンC取込み
を促進することにより、特にその張りと弾力性を保持又
は増加させ、しわの出現を遅らせて皮膚の状態を改善す
る。
【0017】以上二つの特徴のいずれかにおけるある態
様によると、ビタミンC又はアスコルビン酸誘導体を更
に含有し、局所使用を目的とする組成物に、上記化粧剤
を配合する。
【0018】本発明は更に、表皮−真皮接合部の欠陥、
特にコラーゲンVII合成の欠乏による症状の治療を目
的とする薬用組成物の製造のための上記ベルトレティア
抽出物の使用に関する。上記症状の例として、例えば、
表皮水疱症が挙げられる。
【0019】本発明の別の態様によると、ベルトレティ
ア抽出物は、皮膚細胞、特に繊維芽細胞のビタミンC取
込み不足による症状の治療を目的とする薬用組成物、特
に皮膚科用組成物の製造に用いられる。上記薬用組成物
は、好ましくは薬学的に許容される媒体を含有するもの
で、上記ベルトレティア抽出物はこれに溶解又は懸濁さ
れる。
【0020】ある有利な様態によると、上記薬用組成物
は、ビタミンC又はアスコルビン酸誘導体を更に含有す
る。このような組成物に含有されるベルトレティア抽出
物は、ビタミンCが欠乏する細胞の同化合物取込みを改
善する効果を持つ。
【0021】ある態様によると、本発明の関与する種々
の化粧用又は薬用組成物において、上記ベルトレティア
抽出物は、この植物の樹皮の抽出物であり、好ましくは
ベルトレティア・エクセルサの幹の抽出物である。
【0022】別の様態によると、ベルトレティア抽出物
は、ベルトレティアの果実すなわち木の実の抽出物であ
る。好ましくはベルトレティア・エクセルサの木の実の
果皮の抽出物が用いられる。
【0023】好ましくは、ベルトレティア抽出物は以下
で示す方法により得られるが、決してこれらのみに限定
されるものではない。最初の抽出は、水、好ましくは1
〜4個の炭素原子を有するアルコール、好ましくは1〜
2個の炭素原子を有する塩素系溶媒、好ましくは3〜6
個の炭素原子を有する有機エステル、及び、これらの溶
媒の混合物を基礎とする混合溶媒からなる群より好適に
選択される極性溶媒を用いて、上記植物の樹皮又は木の
実、好ましくは幹の樹皮又は木の実の果皮において行
う。
【0024】上記最初の抽出に用いる溶媒は、水、メタ
ノール、エタノール、メタノール/水の混合物又はエタ
ノール/水の混合物、クロロホルム及びジクロロメタン
からなる群より選択されるのがより好ましい。更に好ま
しくは上記溶媒は、水、メタノール、エタノール又はこ
れらの溶媒の混合物である。
【0025】本発明の最も好ましい抽出物は、ベルトレ
ティア、更に好ましくはベルトレティア・エクセルサの
木の実の果皮からの水抽出物である。
【0026】上記抽出溶媒に対する樹皮又は木の実、好
ましくは木の実の果皮の比率は特に限定されず、通常は
1:5〜1:20重量部である。上記抽出は、一般に室
温から使用溶媒の沸点までの温度で行う。
【0027】上記最初の抽出は、大気圧下で2〜4時間
還流させて行うのが好ましい。また、上記抽出溶媒中で
2〜4時間の低温浸漬により行うのも好ましい。抽出終
了後、抽出物を含む溶媒相をろ過し、減圧下で濃縮及び
/又は蒸発・乾燥させて、本発明における最初のベルト
レティア粗抽出物を得る。この粗抽出物は、当業者に周
知の種々の方法により精製することができる。
【0028】ベルトレティア、特にベルトレティア・エ
クセルサの抽出物は、サポニンを多く含有する。また、
上記抽出物、特にベルトレティア・エクセルサの木の実
の果皮の抽出物は、水やメタノール等の使用する極性抽
出溶媒の種類に関わらず、タンニン、中でもエラジタン
ニン及びガロタンニンを含有する。
【0029】サポニンを、本発明におけるベルトレティ
ア抽出物に多く含有させることを望む場合には、以下に
示す方法が用いられるが、決してこれに限定されるもの
ではない。上記最初の抽出により得られた抽出物を蒸発
乾燥させ、残滓をメタノールに溶解させる。この溶液を
アセトンに注ぎ込み、生じた沈殿物をろ過により回収す
る。好ましくは、この沈殿物を乾燥後、脱塩水を用いて
透析を行う。最後に抽出物を凍結乾燥することにより、
サポニンを多く含有する本発明のベルトレティア乾燥抽
出物が得られる。上述した抽出過程は、特にベルトレテ
ィア・エクセルサ種に適用できる。
【0030】上記特徴のいずれにおいても、ベルトレテ
ィア抽出物、好ましくはベルトレティア・エクセルサ抽
出物は、目的組成物の全重量に対して0.0001〜1
重量%の濃度で用いられるのが好ましい。より好ましく
は、目的組成物の全重量に対して0.01〜0.25重
量%の濃度である。
【0031】また上記特徴のいずれにおいても、本発明
による組成物は、マデカシン酸(madecassic
acid)、アシアチン酸(asiatic aci
d)、マデカソサイド(madecassosid
e)、アシアチコサイド(asiaticosid
e)、α−1−プロテイナーゼ阻害剤、レチノイン酸等
のコラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、リジン、
プロリン、2−オキソグルタレート、ジンセノサイドR
0 (ginsenosideR0 )、ビタミンD及びそ
の誘導体、エクジステロイド特にβ−エクジソン、並び
に、ビタミンEからなる群より選択される有効物質を更
に含有することが好ましい。
【0032】最後の特徴によると、本発明は更に、コラ
ーゲンVII合成の促進、又は、培養細胞、特にヒト皮
膚細胞、中でも繊維芽細胞及び表皮ケラチン細胞のビタ
ミンC取込みの改善を目的とする、ベルトレティア抽出
物を有効量用いた組成物による上記培養細胞の培養方法
に関する。上記本発明の培養細胞の培養方法は、人工皮
膚製造の際に適用されるのがより好ましい。上記細胞
は、基質に固定化されるとより素早く細胞外マトリック
スを再構成し、表皮−真皮接合部の出現が促進される。
【0033】上記方法の実施の最良の形態では、培養液
に対して0.1〜10μg/mlの濃度のベルトレティ
ア抽出物を含有させて、培養細胞を処理する。
【0034】
【発明の実施の形態】本発明の他の目的、特徴及び利点
については、いくつかの実施例についての以下の記述か
ら明らかになるが、本発明はこれら実施例にのみ限定さ
れるものではない。実施例においては、他に記載がなけ
れば、百分率は重量百分率で、抽出物の量は乾燥重量で
表される。
【0035】実施例1 サポニンを多く含有する、ベルトレティア・エクセルサ
の幹の樹皮からのメタノール抽出物の製造 ベルトレティア・エクセルサの幹の樹皮をすりつぶして
粉末状にし、得られた粉末49gを500mlのメタノ
ール中で2時間浸漬させた。この混合物を全て3時間還
流し、放置冷却後にガラスフィルターにてろ過を行っ
た。得られたろ液が本発明による最初の抽出物であり、
以下においては抽出物I1 とする。この最初の抽出物を
蒸発乾固し、14.7gの残滓を100mlのメタノー
ルに溶解させた。この溶液を500mlのアセトンに注
ぎ込み、得られた沈殿物をろ過した。次に、この沈殿物
を水酸化カリウム等の固形状脱水剤で乾燥させて、1.
33gの乾燥した抽出物を得た。次いで830mgのこ
の抽出物を4日間、9mlの脱塩水により透析したの
ち、凍結乾燥を行い、サポニンを多く含有する本発明の
抽出物(抽出物I2 とする)182mgを得た。
【0036】実施例2 ブラジリアン・ベルトレティア・エクセルサの木の実の
果皮からのメタノール抽出物の製造 市販されているブラジリアン・ベルトレティア・エクセ
ルサの木の実の果皮を集めてあらくすりつぶしたあと、
粉砕した。得られた粉末状の果皮100gを30分間の
還流下、1リットルのメタノールで連続的に3回抽出し
た。孔径0.45μmのろ紙を用いてそれぞれの抽出液
をろ過し、3つの抽出液を合わせた。合わせた抽出液を
回転式蒸発器を用いて濃縮し、乾燥した膜を得た。この
膜を水で振盪し溶解させ、得られる乳状液を凍結乾燥し
た。これにより、サポニンを多く含有する本発明の果皮
の抽出物(抽出物I3 とする)を5g得た。この抽出物
の収率は5%であった。
【0037】実施例3 水抽出物の製造 上述の粉末状の果皮を、沸騰水で30分間かけて三度抽
出し、3つの抽出液を合わせて孔径0.45μmのろ紙
でろ過し、凍結乾燥させて光沢のある褐色の薄片を得
た。最初の粉末/溶媒比は1/10であった。抽出収率
は8%であった。
【0038】実施例4 コラーゲンVII合成促進の証明 以下の試験は、実施例2で得られた抽出物I3 を用いて
行った。以下の試験は、遮光下で行った。 1.試験手順 a)表皮ケラチン細胞の由来 外科手術により得た健康な皮膚の検体から、培養健常人
表皮ケラチン細胞(NHK)を製作した。本試験は、顔
の美容成形による44歳白人女性由来の細胞株(名称は
HK44歳)を用いて行った。美容成形による56歳白
人女性由来の、名称HK56歳という他の細胞株を用い
て、結果を確認した。 b)培養条件 上記表皮ケラチン細胞を、完全に血清を含まない培地
(名称SFMc、ギブコ(GIBCO))で培養した。
上記細胞を一次培養から一度、継代培養(名称P1)を
行った。
【0039】c)処理条件 ウェル当たりNHKが30000個の割合で96穴培養
プレートのSFMcに、上記細胞を接種した。培養した
のち細胞の良好な接着に必要な24時間経過後、表皮ケ
ラチン細胞の増殖を制限するために、上記培地を2%に
希釈したSFMcと取り替えた。実施例2により得られ
た抽出物(表Iでの名称I3 )の保存DMSO溶液を、
1、2.5及び5mg/mlの濃度で使用前に速やかに
製作し、試験培地に最終濃度が0.1v/v%(すなわ
ち抽出物の濃度は1、2.5及び5μg/ml)で添加
した。コントロールには、抽出物の賦形剤であるDMS
Oを0.1v/v%で添加した。XTT生存度試験及び
顕微鏡による細胞観察のいずれによっても、抽出物が1
0μg/ml以下の濃度では、細胞毒性を示さなかった
(ベーリンガーXTTキット(BOEHRINGER
XTT Kit)、参照1465015)。
【0040】上記細胞を処理培地と72時間接触させ
た。この時間は、以前の速度論研究において最適なコラ
ーゲンVII合成に必要とされた時間である。培養上澄
み液を取り除き、分泌コラーゲンVIIの定量分析を行
った。細胞内蛋白質に対するコラーゲンVIIの分泌量
比を決定するために、ウェルに残留している細胞シート
で蛋白質を定量分析した。3つの濃度とコントロール実
験それぞれに対して、6つの培養ウェルを用意した。
【0041】d)コラーゲンVIIのELISA定量分
析 ELISA法によるコラーゲンVIIの定量分析手順
は、コラーゲンIの定量分析において用いたもの(M.
デュマス、C.ショーダン、F.ボンテ、A.メーベッ
ク、「イン・ビトロ・バイオシンセシス・オブ・タイプ
・I・アンド・III・コラーゲンズ・バイ・ヒューマ
ン・ダーマル・フィブロブラスツ・フロム・ドナーズ・
オブ・インクリーシング・エイジ、メカニズムス・オブ
・エイジング・アンド・デベロプメント、1994年、
73巻、179〜187頁)を適用した。以下の修正を
加えた。 −第一抗体:抗ヒトVII型コラーゲンモノクロナール
マウス抗体、イソタイプIgG1(ライフ・テクノロジ
ーズ、参照12073−011)。 −第二抗体:アルカリフォスファターゼと結合した抗全
マウスIgGヤギ抗体(エテルシム(Interchi
m)、参照115−056−062)。
【0042】e)結果と統計的説明 検量線を作成するために、市販のヒトVII型コラーゲ
ン不存在下で表皮ケラチン細胞によるコラーゲンVII
分泌の結果を、定量分析のコントロール抽出物の値を差
し引いた吸光度単位(OD−ブランク)で表した。この
値は、ウェル(72時間培養)内の細胞蛋白質量当たり
に合わせた。抽出物の活性度を以下の促進百分率により
評価した: 〔(処理NHKのコラーゲンVII−コントロールNH
KのコラーゲンVII)/コントロールNHKのコラー
ゲンVII〕×100 処理培養及びコントロール培養で得た結果を、不対のス
テューデント試験を用いて比較した。有意性の基準をp
<0.05とした。
【0043】結果と結論 異なる培養での測定値の平均に基いた結果を以下の表1
に示した。
【0044】
【表1】
【0045】以上の結果より、ベルトレティア・エクセ
ルサ抽出物I3 は、アンカリングフィラメントの主要構
成要素であるコラーゲンVIIの合成を極めて強力に促
進することが分かる。故にベルトレティア抽出物は、化
粧用若しくは薬用組成物、又は、表皮−真皮接合部の改
善を目的とする細胞培養液に好適に用いられる。
【0046】実施例5アスコルビン酸輸送に対する効果の証明 5.1.材料と方法 a.繊維芽細胞の由来 培養健常人繊維芽細胞(NHF)を、外科手術により得
た健康な皮膚の検体から外植片法により得た。本試験
は、顔の美容成形による53歳白人女性由来の繊維芽細
胞株を用いて行った。 b.培養条件 2mmol/lのL−グルタミンを添加したE199培
地(Gibco(ギブコ))(E199c)に、10%
v/vのウシ胎児血清(ギブコ)(FCS)を添加し、
上記繊維芽細胞を培養した。初代培養段階の繊維芽細胞
株を使用した。 c.抽出物の保存溶液の調整 実施例2で得られたベルトレティア・エクセルサの木の
実の果皮からのメタノール抽出物I3 について、その溶
解賦形剤と比較することによって、遮光下で試験を行っ
た。抽出物の保存ジメチルスルホキシド(DMSO)溶
液を、5、2.5及び1mg/mlの濃度で使用前に速
やかに用意した。細胞培地に濃度0.1v/v%で各保
存溶液を添加し、細胞の目的濃度を5、2.5及び1μ
g/mlとする。ミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲ
ナーゼ活性の測定に基づいたXTT試験によると、上述
の濃度ではNHFにおいて細胞毒性を示さなかった。
【0047】d.繊維芽細胞処理条件 ウェル当たり130000個のNHFをマイクロタイタ
ープレート(24ウェル、ファルコン(FALCO
N))中の10%FCSを添加したE199c培地に接
種した。培養24時間後、上記培地をFCSを含有しな
いE199c培地と交換し、そこへ試験抽出物を指定の
濃度で添加するか、又は、この抽出物の賦形剤のみを添
加した(0.1v/v%のDMSO)。細胞内の機能に
及ぼすDMSO固有の効果が存在しないことを実証する
ために、DMSOを含有しないコントロールをさらに準
備した。培養48時間後、標識ビタミンCのナトリウム
塩(14C−L−アスコルビン酸ナトリウム)を用いてビ
タミンCの細胞内輸送に関する実験を行った。
【0048】e.繊維芽細胞への14C−L−アスコルビ
ン酸輸送の実験条件 ウェルを無血清のE199c培地を用いて37℃で洗浄
し、使用前に速やかに用意した14C−アスコルビン酸ナ
トリウム(アマーシャム(Amersham)参照:C
F620、比放射活性は14.1Ci/μmol)15
0μmol/lを含有する同培地0.5mlを添加し
た。プレートを37℃で2時間培養したのちに、培養液
を除去し、細胞シートを無血清培地で洗浄して細胞外の
放射能を全て取り除いた。60%メタノールを500μ
l/ウェル添加することにより繊維芽細胞の形質膜を透
過性にし細胞内の物質を放出させた。細胞内14C−アス
コルビン酸塩を含有している500μlの回収液は10
倍に濃縮し、HPLCにより分析した。
【0049】f.蛋白質の定量分析 細胞を透過性にした各ウェルの細胞シートに関して、
0.1M水酸化ナトリウムに溶解させたBCA(ビシコ
ニニン酸、シグマ(Sigma))法により蛋白質を定
量分析した。ウシ血清アルブミン(シグマ)の検量線を
用いて、570nmで測定したODから蛋白質のng量
を得た。この値により蛋白質のμg当たりのアスコルビ
ン酸塩の量を得ることが出来る。 g.HPLCによる14C−アスコルビン酸塩の定量分析 細胞内の14C−アスコルビン酸塩は、最初の14Cアスコ
ルビン酸ナトリウムと保持時間が同一であるため、これ
により確認することが出来る。その定量は、放射能検出
器(バートホールド(Berthold))を用いて、
対応するピークを積分することによって行った。カラム
としては、同じ固定相を充填したガードカラムにより保
護されたシリカ−NH2 カラムを使用した。溶出液は、
pH5.95のリン酸緩衝液の75%(v/v)グラジ
エントグレードのアセトニトリル(メルク(Merc
k))であった。細胞内外にある全放射活性は約95%
であった。
【0050】h.結果及び統計的説明14 C−アスコルビン酸塩(14C−Ascと略記)の細胞
内の量を、培養2時間後の蛋白質μg当たりのpmol
で表す。抽出物の活性(%)を表す際の補足的計算は以
下のようにして行った。
【0051】
【数1】
【0052】処理及びコントロール培養について得られ
た結果を、不対ステュ−デントt試験により比較した。
得られたp値を以下の表に示した。p=0.05を有意
性の基準に設定した。
【0053】5.2.結果 3種類の濃度で、6つのコントロール培養及び6つの処
理培養を試験して、メタノール抽出物I3 の性質を実証
した。抽出物を可溶する賦形剤DMSOが、測定パラメ
ーターに対する固有の影響を持たないことを前もって証
明した。 a.14C−アスコルビン酸塩輸送に対するDMSOの影
響 アスコルビン酸に対するDMSOの影響を以下の表2に
示す。表2は、14C−アスコルビン酸塩の細胞内含量を
表す。
【0054】
【表2】
【0055】結論:0.1%v/vのDMSOは14C−
アスコルビン酸塩の細胞内含量を有意には変更しない。
【0056】b.14C−アスコルビン酸塩輸送に対する
抽出物I3 の影響 以下の表3には抽出物I3 のDMSO溶液で処理した場
合の結果を示す。表3は、14C−アスコルビン酸塩の細
胞内含量を表す。
【0057】
【表3】
【0058】結論 この実験より、抽出物I3 で処理した細胞での14C−ア
スコルビン酸塩細胞内含量の増加は明らかである(表
3)。濃度が1μg/mlの時にはこの増加は相当なも
のであり(+55%)、統計的に有意である(p=0.
005)。抽出物I3 は濃度が2.5及び5μg/ml
の場合にも14C−アスコルビン酸塩細胞内含量を有意に
(それぞれp=0.003とp=0.001)増加させ
(それぞれ52%と78%)、最大の効果は5μg/m
lの時である。以上から、ベルトレティア抽出物は、繊
維芽細胞のビタミンC取込みを非常に容易に促進する。
【0059】実施例6皮膚のたるみに効く化粧用ケア組成物 ベルトレティア・エクセルサの木の実の果皮のメタノール抽出物 (実施例2) 0.2g アシアチコサイド 3g パルミチン酸ビタミンA 0.01g パルソールMCX(Parsol MCX)(登録商標) 5g 小麦蛋白質抽出物 2g O/W型乳液の香料含有賦形剤 合計100g この組成物は皮膚のたるみを修正し、張りを回復した。
六週間胸部に毎日塗布すると、組織を引き締め魅力的な
外観になった。
【0060】実施例7顔用しわ防止引き締めゲル ベルトレティア・エクセルサ抽出物(実施例1) 0.3g パルミチン酸ビタミンA 0.06g 酢酸ビタミンE 0.1g 乳酸 1.5g グリコール酸 0.2g エタノール 5g ゲル状賦形剤 合計100g このゲルは首と額にマッサージをしながら、完全に浸透
するまで局所塗布した。六週間後にはしわが減少し張り
を取り戻した。きめが細かくなり顔が明るくなった。
【0061】実施例8基礎化粧品 ベルトレティア・エクセルサの木の実の果皮の水抽出物 (実施例3) 0.3g センテラ・アシアチカ抽出物 0.2g 小麦セラミド 0.2g 小麦蛋白質 3g 液状着色賦形剤 合計100g この基礎化粧品は、即効性の引き締め効果を持ち、緩み
がちな部分に深く作用した。
【0062】実施例9皮膚科用乳液 ベルトレティア・エクセルサ抽出物(実施例1) 0.5g パルミチン酸アスコルビル 0.5g 香料を含有しない乳化賦形剤 合計100g この皮膚科用調製品は表皮水疱症の治療する部位に局部
塗布することができる。臨床的に改善の兆候が明らかに
現れた。しかし、この組成物は、処方された場合で、厳
格な医療指示下にある場合にのみ使用を限定しなければ
ならなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI //(C12N 5/06 C12R 1:91) (71)出願人 597132698 25 rue des Peuplier s,92752 Nanterre, Fra nce

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 コラーゲンVII合成促進及び/又は皮
    膚細胞のビタミンC取込み促進をすることができる、ベ
    ルトレティア抽出物を含有してなる化粧用組成物。
  2. 【請求項2】 ベルトレティア抽出物は、ベルトレティ
    ア・エクセルサ抽出物である請求項1記載の化粧用組成
    物。
  3. 【請求項3】 皮膚細胞のコラーゲンVII合成促進の
    ために使用される請求項1又は2記載の化粧用組成物。
  4. 【請求項4】 皮膚細胞のビタミンC取込み促進のため
    に使用される請求項1又は2記載の化粧用組成物。
  5. 【請求項5】 ビタミンC又はアスコルビン酸誘導体を
    更に含有し、局所使用される請求項1、2、3又は4記
    載の化粧用組成物。
  6. 【請求項6】 ベルトレティア抽出物を、組成物の全重
    量に対して、0.0001〜1重量%の濃度で含有する
    請求項1、2、3、4又は5記載の化粧用組成物。
  7. 【請求項7】 ベルトレティア抽出物を、組成物の全重
    量に対して、0.01〜0.25重量%の濃度で含有す
    る請求項6記載の化粧用組成物。
  8. 【請求項8】 コラーゲンVII合成欠乏による症状の
    治療に使用するための、ベルトレティア抽出物を含有し
    てなる薬用組成物。
  9. 【請求項9】 ベルトレティア抽出物は、ベルトレティ
    ア・エクセルサ抽出物である請求項8記載の薬用組成
    物。
  10. 【請求項10】 表皮水疱症の治療に使用するための請
    求項8又は9記載の薬用組成物。
  11. 【請求項11】 皮膚細胞のビタミンC取込み不足によ
    る症状の治療に使用するための、ベルトレティア抽出物
    を含有してなる薬用組成物。
  12. 【請求項12】 ベルトレティア抽出物は、ベルトレテ
    ィア・エクセルサ抽出物である請求項11記載の化粧用
    組成物。
  13. 【請求項13】 ビタミンC又はアスコルビン酸誘導体
    を更に含有する請求項8、9、10、11又は12記載
    の薬用組成物。
  14. 【請求項14】 ベルトレティア抽出物を、組成物の全
    重量に対して0.0001〜1重量%の濃度で含有する
    請求項8、9、10、11、12又は13記載の薬用組
    成物。
  15. 【請求項15】 ベルトレティア抽出物を、組成物の全
    重量に対して0.01〜0.25重量%の濃度で含有す
    る請求項14記載の薬用組成物。
  16. 【請求項16】 ヒト皮膚培養細胞におけるコラーゲン
    VII合成促進、及び/又は、前記細胞のビタミンC取
    込み促進をすることができる、ベルトレティア抽出物を
    含有してなる細胞培養液用組成物。
  17. 【請求項17】 ヒト皮膚培養細胞は、人工皮膚製造の
    ためのものである請求項16記載の細胞培養液用組成
    物。
  18. 【請求項18】 ベルトレティア抽出物を、0.1μg
    /ml〜10μg /ml含有する請求項16又は17記
    載の細胞培養液用組成物。
  19. 【請求項19】 ヒト皮膚培養細胞の培養培地に、請求
    項16記載の細胞培養液用組成物を使用する、前記細胞
    におけるコラーゲンVII合成促進、及び/又は、前記
    細胞のビタミンC取込み促進を行うヒト皮膚細胞の培養
    方法。
  20. 【請求項20】 ベルトレティア抽出物は、水、1〜4
    個の炭素原子を有するアルコール、1〜2個の炭素原子
    を有する塩素系溶媒、3〜6個の炭素原子を有する有機
    エステル、及び、これらの混合溶媒からなる群より選択
    される極性溶媒により抽出されたものである請求項1、
    2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
    13、14、15、16、17又は18記載の組成物。
  21. 【請求項21】 極性溶媒は、水、メタノール、エタノ
    ール、及び、これらの混合溶媒からなる群より選択され
    るものである請求項20記載の製造方法。
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