JPH10511380A

JPH10511380A - 化粧または医薬用、特に皮膚科学組成物、およびＳｍｅｌｏｐｈｙｌｌｕｍｃａｐｅｎｓｅ抽出物を含む培地

Info

Publication number: JPH10511380A
Application number: JP8520260A
Authority: JP
Inventors: ボンテ，フレデリック; デュマ，マルク; ラボー，カトリーヌ; マシオ，ジョルジュ
Original assignee: エルベエムアッシュ、ルシェルシュ
Priority date: 1994-12-23
Filing date: 1995-12-22
Publication date: 1998-11-04
Also published as: FR2728465A1; FR2728465B1; US5807555A; EP0799049A1; WO1996020000A1

Abstract

(57)【要約】化粧または医薬用、特に皮膚科学用組成物の調製に、または培地の活性成分または添加剤として有用なSmelophy llum capense抽出物。このSmelophyllum capense抽出物はコラーゲン合成、特に皮膚老化を抑制し、または人工皮膚または真皮を調製し、皺の形成を防止し、または皺の深さを減少させ、または皮膚の引き締めを促進する。

Description

【発明の詳細な説明】化粧または医薬用、特に皮膚科学組成物、および Smelophyllum capense抽出物を含む培地本発明は、本質的に化粧または医薬用、特に皮膚科学用組成物、およびSmelop hyllum capense抽出物を含む培地に関する。更に具体的には、本発明は、化粧または医薬用、特に皮膚科学用組成物であって、特にコラーゲン合成を促進し、かつ特に皮膚老化の作用を制御し、皮膚の引き締め(skin firming)を行ない、コラーゲンの欠乏に伴う様々な病変を癒し、もしくは治療することを目的とする組成物を製造するための、または細胞もしくは組織培養培地、具体的には皮膚細胞、特に線維芽細胞の大量培養のための活性成分または添加剤の一つとしてのSmelophyllum capense抽出物の使用、並びにそれらの適用を含んでなる化粧または医薬組成物または培地に関する。 Smelophyllum capense植物は、約１，７００種の植物のグループがあるSapind aceae 科に属する。この科の植物は、界面活性剤としておよび魚毒として長期間に亙って用いられてきたサポニンを含んでいる。 Smelophyllum capense植物は、余り高くなく、高さが３〜４メートルの樹木であり、特に南アフリカの南部の森林に特有な状態で見られる（R.B．Drumont著「南アフリカの樹木(Trees of Southern Africa)」、C．Struik Publisher、ケープタウン、１９８４年、５３１頁を参照されたい）。今やSmelophyllum capense抽出物は、化粧品、特にスキンケア用化粧品に極めて重要であることを見いだした。特に、Smelophyllum capense抽出物に関し、コラーゲン、特にＩ型コラーゲン（以後「コラーゲンＩ」と略記する）の合成について意外な活性を見いだした。皮膚は、本質的には真皮の主要細胞である線維芽細胞によって合成されるタンパク質であるコラーゲンＩを含んでいる。このタンパク質は、真皮のレオロジー的性質に対して補助的役割を果たしかつ関与しており、特にこれはその堅さおよびその構造の維持に関与している（E.U．KUCHARZ著「コラーゲン：生化学および病態生理学(The collagens: Biochemistry and pathophysiology)」、Springer Ve rlag、ベルリン、１９９２年）。更に、かなりの年輩者の真皮の線維芽細胞は、若年被験者の線維芽細胞よりコラーゲンの分泌が少ないことが示されている（M ．DUMAS et al.，Mech．Aging Dev.，(1994)73，179-187）。従って、年齢と共に、レオロジー性の減少および毎日受ける抑制に対するその応答の減少が生じる。皮膚は伸びて、引っ張りに対して余りよく反応せず、その緊張をゆるめ、形状が皺になる。このことから、コラーゲンの合成時にSmelophyllum capense抽出物を作用させることにより、皺または皮膚支持体の組織の弛みなどの皮膚の老化の影響を制御し、または治癒を高めるのにこれらの抽出物が特に有用となる。本発明の主な目的は、皮膚老化の影響の防止または治療、並びに皮膚の引き締めに良好な効果を有するまたは治癒を高めるための化粧または医薬、特に皮膚科学用組成物の新規な処方物を提供することからなる新たな技術的問題を解決することである。本発明のもう一つの主な目的は、工業的規模で、特に化粧または医薬工業に用いられる特に簡単かつ満足な方法でこの新しい技術的問題を解決することである。従って、第一の局面によれば、本発明は、特に皮膚の保護のためのSmelophyll um capense抽出物の化粧用薬剤としての使用に関する。本発明の一態様によれば、Smelophyllum capense抽出物は、化粧または医薬用、特に皮膚科学用組成物であって、特にコラーゲン合成、特にコラーゲンＩの合成を促進し、特に皮膚の治癒を高め、皮膚の表面の生物力学および外観を改良し、皮膚を引き締め、皮膚老化の影響を制御し、またはコラーゲンの欠乏に伴う様々な病状を治療することを目的とする組成物の製造に用いられる。有利な一態様によれば、Smelophyllum capense抽出物は、皮膚の老化防止作用（anti-aging effect）を有する組成物、特に皺の出現を防止しまたは皺の深さを減少させることを目的とした皺防止剤（anti-wrinkles）の製造に用いられる。特定の一態様によれば、前記のSmelophyllum capense抽出物は、好ましくは植物の樹皮から、更に好ましくはこの植物の根の樹皮からメタノールまたは水−エタノール混合物から有利に選択される低級アルコールのような極性溶媒で抽出することによって得られる。特に、Smelophyllus capense抽出物は、一例として以後に記載され、制限するものではない方法に従って得ることができる。樹皮、好ましくは植物の根の樹皮からの第一の抽出は、水、好ましくは１〜４個の炭素原子を有するアルコール、好ましくは１〜２個の炭素原子を有する塩素化溶媒、好ましくは３〜６個の炭素原子を有する有機エステル、または前記溶媒の任意の混合物を基剤とする混合溶媒からなる群から有利に選択される極性溶媒を用いて行なわれる。更に好ましくは、第一の抽出の溶媒は、水、メタノール、エタノール、メタノール−水混合物、またはエタノール−水混合物、クロロホルム、ジクロロメタンからなる群から選択される。更に一層好ましくは、水、メタノール、エタノールまたはそれらの混合物から選択される。樹皮対抽出剤の比率は決定的なものではなく、通常は１：５〜１：２０重量部である。抽出は、一般には周囲温度と抽出に用いられる溶媒の沸点との間の温度で行なわれる。好ましくは第一の抽出は、大気圧下にて還流下にて２〜４時間の時間行なうのが好ましい。更に、これは、抽出の溶媒中で低温で２〜４時間の液浸の前に行なうのが有利である。抽出が終了したならば、抽出物を含む溶媒相を濾過した後、濃縮しおよび／または減圧下にて蒸発乾燥する。このようにして、本発明による第一の粗製のSmel ophyllum capense抽出物が得られる。この粗製抽出物は、当業者に周知の様々な方法によって精製することができる。第二の局面によれば、本発明は、活性成分として好ましくは化粧品として許容可能な賦形剤中に分散したSmelophyllum capense抽出物の化粧上有効量を含むことを特徴とする化粧用組成物にも関する。特定の一態様によれば、この化粧用組成物は、コラーゲンの合成、特にコラーゲンＩの合成を促進し、特に皮膚老化の影響を制御し、または皮膚を引き締めることを目的とするものである。このような組成物は、例えば、皺の出現の防止または皺の深さを減少させるための組成物として有利に用いることができる。第三の局面によれば、本発明は、コラーゲンの合成、特にコラーゲンＩの合成を促進する医薬、特に皮膚科学用組成物であって、活性成分として薬学上許容可能な賦形剤中に分散したSmelophyllum capense抽出物の薬学上有効量を含むことを特徴とする組成物にも関する。特定の態様によれば、前記組成物は、皮膚の治癒を向上させ、またはコラーゲンの欠乏に伴う各種の病状を治療することを目的とする。第四の局面によれば、本発明は、化粧または医薬用、特に皮膚科治療の方法であって、化粧または医薬用治療のため、Smelophyllum capense抽出物、特に化粧または薬学上許容可能な賦形剤中に分散したものの化粧または薬学上有効量を適用することを特徴とする方法をも包含する。現在、特に有利な化粧または医薬用途は、上記の説明、並びに実施例および請求の範囲に関する下記の説明から得られる。同じことは、抽出物の濃縮に関して適用される。前記局面のいずれかにおいて、Smelophyllum capense抽出物は、最終組成物の総重量に対して０．０００１重量％〜１重量％の濃度で用いるのが好ましい。この濃度は、最終組成物の総重量に対して０．０１重量％〜０．２５重量％であるのが好ましい。また、上記局面のいずれか一つにおいて、本発明による組成物は、アスコルビン酸、マデカス酸（madecassic acid）、アシアト酸（asiatic acid）、マデカソシド（madecassoside）、アシアティコシド（asiaticoside）、α−１−プロテアーゼインヒビター、コラーゲナーゼインヒビター、例えばレチノイン酸、エラスターゼインヒビター、リシン、プロリン、２−オキソグルタレート、およびジンセノシド（ginsenoside）Ｒ₀からなる群から選択される活性物質を更に含むのが好ましい。第五の局面によれば、本発明は、細胞または組織の培地用の、特に皮膚細胞、特に線維芽細胞の大量培養のための活性成分の一つまたは添加剤の一つとしてSm elophyllum capense抽出物の使用にも関する。この使用は、人工皮膚または真皮の調製に関するのが有利である。また、この局面において、本発明は、コラーゲンの合成、特にコラーゲンＩの合成を促進するために、Smelophyllum capense抽出物の有効濃度での培養における線維芽細胞の処理方法に関する。従って、例えば当業者に周知の技術による細胞培養による人工皮膚、特に人工真皮を調製するためのこの培養に関しては、人工皮膚または真皮は、特に生物力学的特性に関して極めて良好な性質の本発明の方法によって得られる。この培養法の使用の好ましい実施態様によれば、線維芽細胞を、培養時に０．３μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌ培地の濃度のSmelophyllum capense抽出物で処理する。もう一つの有利な変形によれば、アスコルビン酸またはその誘導体の一つを、非細胞毒性濃度、特に０．００１ｍＭ〜０．５ｍＭで培地に添加することができる。更にもう一つの有利な変形によれば、下記の物質、すなわちＬ−グルタミン、Ｌ−リシン、５−ヒドロキシ−Ｌ−リシン、Ｌ−プロリンおよび４−ヒドロキシ −Ｌ−プロリンの一つまたは二つ以上を培地に添加することができ、これらの物質のそれぞれ一つは２〜１０ｍＭの濃度で含まれることが可能である。本発明の他の目的、特徴および利点を、本発明の幾つかの実際に好ましい態様に関して行なった下記の説明並びに下記の実施例から当業者に明らかにする。これらの例において、総ての百分率は、特に断らない限り重量で示している。例１ Smelophyllum capense の根の樹皮のメタノール抽出物の調製粉末状にしたSmelophyllum capenseの根の樹皮を、南アフリカ産のこの植物の乾燥した根の樹皮を粉砕することによって調製する。次に、この粉末２００ｇを、メタノール２リットル中で２時間浸漬する。全体を３時間還流した後、放冷し、焼結ガラス上で濾過する。濾液を蒸発乾燥する。４４．６ｇの量の残渣を、メタノール３５０ｍｌに溶解させる。この溶液にジエチルエーテル１．７５リットルを加えて、沈澱させた後、濾過する。次に、沈澱をＰ₂Ｏ₅のような固形脱水剤上で乾燥する。次いで、この沈澱約２７ｇを脱イオン水２７０ｍｌに対して４日間透析した後、凍結乾燥する。抽出物Ｉ₁と称する本発明による抽出物１３．６ｇが得られる。例２例１によって調製したSmelophyllum capenseの根の樹皮のメタノール抽出物（抽出物Ｉ₁の、ヒト線維芽細胞の培養によるコラーゲンの合成に対する活性の証明線維芽細胞の培養健康な成人真皮の線維芽細胞の培養を、美容整形の際に６０才の婦人から得た顔の皮膚の試料を用いる外植による方法を用いることによって行なう。線維芽細胞を、Ｌ−グルタミン(Gibco)２ｍＭおよびウシ胎児血清(Gibco)１０％（ｖ／ｖ）を補足したＥ１９９(Gibco)培地で、３７℃で加湿した５％ＣＯ₂雰囲気で集密(confluence)まで培養する。コラーゲン含量を測定するため、集密状態の主要培養物をｐＨ７．２のリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）に１％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡを溶解したもので採集した後、細胞を前記と同じ培地の存在下にて９６ウェル微量培養プレート(Falcon)に１０⁴個の線維芽細胞／ウェルの濃度で播種する。播種から２４時間後に、培地を取り除き、血清を全く含まずＬ−アスコルビン酸２５μＭをナトリウム塩として加えたことを除き、前記の培地と同じ組成を有する培地に置き換える。更に、この新たな培地は、処理した培養物またはコントロール培養物により試験を行なう生成物（抽出物Ｉ₁）を含んでおり、または含まない。次いで、インキュベーションを、３７℃で更に４８時間行なう。試験を行なう生成物（抽出物Ｉ₁）をＤＭＳＯに溶解した後、培地に配合した（培地中のＤＭＳＯの最終濃度は０．１％（ｖ／ｖ）である）。細胞の生育力インキュベーション期間を終了したならば、培地を取り除き、ＭＴＴ細胞の生育力試験をDenizot F．et al.，J．Immunol．Methods，(1986)89，271-277の文献記載に従って行なった。細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌのテトラゾリウム塩（３− ［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイドまたはＭＴＴ）をフェノールレッド(Gibco)を含まないＥ１９９培地に溶解したもの１００μｌを用いて、３７℃で３時間インキュベーションする。次いで、イソプロパノール１００μｌをそれぞれのウェルに加えて、生細胞によって成形される暗色のホルマザンブルー誘導体を溶解する。５４０ｎｍの吸光度の水準を測定する。コラーゲンの測定血清を含まない培地で混合物または個々の成分と４８時間インキュベーションした後に細胞によって分泌されるＩ型コラーゲンの量をDumas M．et al.，Mech. Ageing Dev.，(1994)73，179-187の公表内容およびGrimaud J.P．et al．著、酵素分析の方法(Methods of Enzymatic Analysis)（Bermeyer，H.U.監修）、VCH Publishers、ワインハイム（１９８６年）、１８６〜２０１頁の公表内容で以前に記載されたＥＬＩＳＡ試験によって測定する。血清を含まないインキュベーション培地および氷中で超音波によって均質化したままの細胞を合わせて、プラスチック製免疫プレート(NUNC)のウェルに移し、＋４℃で２４時間インキュベーションして、分泌したコラーゲンを付着させる。プロテアーゼインヒビター（エチルマレイミド、フェニルメチルスルホニルフルオライド、エチレンジアミン四酢酸塩、それぞれ最終濃度１ｍＭ）を、この期間中に加える。次に、プレートをＰＢＳで再挿入する。それぞれのプレート処理後に、同様な洗浄段階を行なう。血清アルブミンと共に４℃で２４時間インキュベーションして非特異結合を回避した後、ウサギ抗ヒトＩ型コラーゲン抗体(Institut Pasteur、リオン、フランス）を２２℃で１．５時間かけて加え、結合した抗体を、アルカリ性ホスファターゼ(Interchim、モントルシオン、フランス）と抱合したヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。アルカリ性ホスファターゼによってパラニトロフェニルホスフェート(Sigma)から形成されるパラ−ニトロフェノールの吸光度を、４０５ｎｍで測定する。光学濃度を、精製したヒトＩ型コラーゲン(Institut Jacques Boy、フランス）を用いて設定した標準曲線を用いてコラーゲンのナノグラムに転換する。統計学コラーゲンの水準（平均±ＳＤ、標準偏差、ｎ＝６）を、有意水準ｐ＜０．０５のStudent 試験によって未処理細胞（培地＋Ｌ−アスコルビン酸塩＋ＤＭＳＯ）について測定したものと比較する。結果コラーゲンＩ合成の促進率Ａを、コントロール培養物（試験を行なう生成物を収容しない）Ｃ₀および処理した培養物Ｃ_tに分泌されるコラーゲンＩの量を比較することによって下記の式から計算する。結果の全体を、下記の表Ｉに示す。表Ｉの検討は、第一に、処理した培養物中の細胞の生育力の水準は、コントロール培養物の生育力と比較して有意に変化しなかったことを示している。従って、抽出物Ｉ₁は、細胞毒性を持たない。この表において、線維芽細胞によって分泌されるコラーゲンＩの量は、ｎｇ／１００００細胞／４８時間で表している。表Ｉから、Smelophyllum capenseのメタノール抽出物は、線維芽細胞によるコラーゲンＩの合成の有意な促進活性を生じたことが分かるであろう。特にDumas M．et al.，Mech．Ageing Dev．(1994)73，179-187 の公表内容から、コラーゲンＩの量は皮膚老化中に減少することが知られている。従って、Smelophyllum capense抽出物は、皮膚老化の抑制を目的とするまたは皺の治療の際に見られるコラーゲンの局所合成における増加を伴う生成物、または皮膚の治癒の向上に寄与するために用いることができる。従って、Smelophyllum capense抽出物は、前記定義のような化粧または医薬用、特に皮膚科学用組成物において、活性薬剤としてコラーゲンの合成を促進するそれらの特性により有利に用いることができる。化粧用組成物の各種処方物を、下記に示す。例３皮膚引き締め用マッサージゲル例１のSmelophyllum capenseの根の樹皮抽出物Ｉ₁ ０．１ｇエタノール２５ｇグリセリン２ｇプロピレングリコール２ｇ Carbopol 940（商品名）１．２５ｇ保存剤を含み、場合により香りがあっても良い水性賦形剤１００．００ｇのための十分量水性賦形剤の一部をCarbopolと共に用いて別にゲルを調製し、水性賦形剤の他の部分を用いて、他の成分と混合し、得られた溶液にゲルを加えて、マッサージゲルを形成するゲル化した組成物を形成する。このマッサージゲル組成物は、胸部に週３回２か月間用いることができる。例４皮膚引き締め用ボディーケアローション例１のSmelophyllum capenseの根の樹皮抽出物Ｉ₁ ０．５ｇ可溶化剤（Cremophor RH4O（商品名））２ｇヒアルロン酸１ｇ保存剤を含み、場合により香りがあっても良い水性賦形剤１００．００ｇのための十分量抽出物を最初に可溶化剤に溶解した後、水性賦形剤に加え、これにヒアルロン酸を加える。得られたローションを用いて、胃および大腿部のような弛みの生じやすい部分の治療に３週間用いることができる。例５皺防止（anti-wrinkle）エマルジョン例１のSmelophyllum capenseの根の樹皮抽出物Ｉ₁ ０．１０ｇ芳香付与して乳化した賦形剤１００．００ｇのための十分量例６治療組成物例１によるSmelophyllum capenseの根の樹皮抽出物Ｉ₁ ０．５ｇ乳化した賦形剤、油中水型１００．００ｇのための十分量例７引き締めおよび潤色用クリーム例１のSmelophyllum capenseの根の樹皮抽出物Ｉ₁ ０．０５ｇアシアティコシド（Asiaticoside）０．１ｇアスコルビルホスフェート（マグネシウム塩）０．０５ｇ植物グリコセラミド０．０５ｇビタミンＡパルミテート０．０１ｇ保存剤０．０５ｇ乳化した賦形剤１００．００ｇのための十分量このクリームを１日２回つけると、引き締めおよび弾性の性質、並びに皮膚バリヤーの特性および若い皮膚の活力が回復する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マシオ，ジョルジュフランス国ランス、アンパース、デュ、ルバン、１

Claims

【特許請求の範囲】１． Smelophyllum capense抽出物の化粧用薬剤、特に皮膚の保護のための薬剤としての使用。２．化粧または医薬用、特に皮膚科学用組成物であって、コラーゲン、特にコラーゲンＩの合成を促進し、かつ特に皮膚の治癒を高め、皮膚の表面の生物力学および外観を向上させ、皮膚を引き締め、皮膚老化の影響を制御し、またはコラーゲンの欠乏に伴う様々な病状を治療することを目的とする組成物を製造するためのSmelophyllum capense抽出物の使用。３．前記組成物が、皮膚の老化防止作用を有する組成物、特に皺防止剤であって、皺の出現を防止し、皺の深さを減少させることを目的としたものであることを特徴とする、請求の範囲第１項または２項記載の使用。４．前記抽出物が、樹皮抽出物、特にSmelophyllum capenseの根の樹皮抽出物であることを特徴とする、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の使用。５．前記のSmelophyllum capense抽出物が、有利にはメタノールまたは水− エタノール混合物、好ましくは植物の樹皮、更に好ましくはこの植物の根の樹皮から有利に選択される低級アルコールのような極性溶媒を用いる抽出によって得られることを特徴とする、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の使用。６．活性成分として、化粧用に受容可能な賦形剤に分散したSmelophyllum c apense抽出物の化粧上有効量を含んでなることを特徴とする、化粧用組成物。７．コラーゲン合成、特にコラーゲンＩの合成を促進する医薬組成物、特に皮膚科学用組成物であって、活性成分として薬学上許容可能な賦形剤に分散したSmelophyllum capense抽出物の薬学上有効量を含んでなることを特徴とする、組成物。８． Smelophyllum capense抽出物の濃度が、前記組成物の総重量に対して０．０００１重量％〜１重量％、好ましくは０．０１重量％〜０．２５重量％であることを特徴とする、請求の範囲第６または７項に記載の組成物。９．前記抽出物が植物の樹皮、特に植物の根の樹皮から得られることを特徴とする、請求の範囲第６〜８項のいずれか１項に記載の組成物。１０．前記Smelophyllum capense抽出物が、メタノールまたは水−エタノール混合物から有利に選択される低級アルコールのような極性溶媒で抽出することによって得られることを特徴とする、請求の範囲第６〜９項のいずれか１項に記載の組成物。１１．アスコルビン酸、マデカス酸、アシアト酸、マデカソシド、アシアティコシド、α−１−プロテアーゼインヒビター、コラーゲナーゼインヒビター、例えばレチノイン酸、エラスターゼインヒビター、リシン、プロリン、２−オキソグルタレート、およびジンセノシドＲ₀からなる群から選択される活性物質を更に含むことを特徴とする、請求の範囲第６〜１０項のいずれか１項に記載の組成物。１２．化粧または医薬用処理のために、Smelophyllum capense抽出物、特に化粧または薬学上許容可能な賦形剤に分散したものの化粧または薬学上有効量を適用することを含むことを特徴とする、化粧または薬学的処理、特に皮膚科学的処理の方法。１３． Smelophyllum capense抽出物が、前記組成物の総重量に対して０．０００１％〜１％、好ましくは０．０１重量％〜０．２５重量％のSmelophyllum c apense 抽出物濃度を有する組成物に存在することを特徴とする、請求の範囲第１２項に記載の方法。１４．コラーゲンの合成、特にコラーゲンＩの合成を促進し、皮膚治癒を高め、皮膚老化の影響を制御し、皺の出現を防止し、または皺の深さを減少させ、または皮膚を引き締めるための化粧用処理であることを特徴とする、請求の範囲第１２または１３項に記載の方法。１５．細胞または組織の培地用の、特に皮膚細胞、特に線維芽細胞の大量培養のための、例えば人工皮膚または真皮の調製のための、活性成分または添加剤の一つとしてのSmelophyllum capense抽出物の使用。１６．コラーゲン、特にコラーゲンＩの合成を促進するためSmelophyllum c apense 抽出物の有効濃度を用いる培養における線維芽細胞の処理法。１７．線維芽細胞を０．３μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌ培地の濃度のSmelop hyllum capense抽出物で処理することを特徴とする、請求の範囲第１６項に記載の方法。１８．アスコルビン酸またはその誘導体の一つを、非細胞毒性濃度、特に０．００１ｍＭ〜０．５ｍＭで、培地に加えることを特徴とする、請求の範囲第１６または１７項に記載の方法。１９．次の物質：Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、５−ヒドロキシ−Ｌ−リシン、Ｌ−プロリンおよび４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの一つもしくは二つ以上を培地に加え、上記物質のそれぞれが２〜１０ｍＭの濃度で存在することが可能であることを特徴とする、請求の範囲第１６〜１８項のいずれか１項に記載の方法。