JPH10210974A - エステラーゼ遺伝子及びその利用 - Google Patents
エステラーゼ遺伝子及びその利用Info
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- JPH10210974A JPH10210974A JP8344075A JP34407596A JPH10210974A JP H10210974 A JPH10210974 A JP H10210974A JP 8344075 A JP8344075 A JP 8344075A JP 34407596 A JP34407596 A JP 34407596A JP H10210974 A JPH10210974 A JP H10210974A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】農薬等の中間体である光学活性なシクロペンテ
ノロン類の工業的に有利な製造方法の開発が望まれてお
り、例えば、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−置換シ
クロペント−２−エン−１−オンの有機カルボン酸エス
テルに作用して、これを不斉加水分解し、その（Ｓ）−
体であるシクロペンテノロン類を産生する能力を有する
優れた微生物を遺伝子工学的手法により作製するため
に、上記のようなエステラーゼをコードする遺伝子の探
索が切望されている。 【解決手段】一般式 化１ 【化１】 （式中、Ｒ1は炭素原子１〜１０個のアルキル基、炭素
原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子２〜１０個の
アルキニル基又は炭素原子１〜４個のハロアルキル基を
表す。）で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボ
ン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｓ）−体の一般式
化１で示されるシクロペンテノロン類を産生する能力を
有するエステラーゼをコードし、かつ、配列番号１で示
される塩基配列にハイブリダイズすることを特徴とする
エステラーゼ遺伝子およびその利用。
ノロン類の工業的に有利な製造方法の開発が望まれてお
り、例えば、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−置換シ
クロペント−２−エン−１−オンの有機カルボン酸エス
テルに作用して、これを不斉加水分解し、その（Ｓ）−
体であるシクロペンテノロン類を産生する能力を有する
優れた微生物を遺伝子工学的手法により作製するため
に、上記のようなエステラーゼをコードする遺伝子の探
索が切望されている。 【解決手段】一般式 化１ 【化１】 （式中、Ｒ1は炭素原子１〜１０個のアルキル基、炭素
原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子２〜１０個の
アルキニル基又は炭素原子１〜４個のハロアルキル基を
表す。）で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボ
ン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｓ）−体の一般式
化１で示されるシクロペンテノロン類を産生する能力を
有するエステラーゼをコードし、かつ、配列番号１で示
される塩基配列にハイブリダイズすることを特徴とする
エステラーゼ遺伝子およびその利用。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エステラーゼ遺伝
子及びその利用に関する。
子及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般式 化４
【０００３】
【化４】
【０００４】（式中、Ｒ1は炭素原子１〜１０個のアル
キル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子
２〜１０個のアルキニル基又は炭素原子１〜４個のハロ
アルキル基を表す。）で示されるシクロペンテノロン類
は、優れた殺虫活性を有するいわゆる合成ピレスロイド
と呼ばれる一群のエステル系化合物の重要なアルコール
成分として有用である。例えば、４−ヒドロキシ−３−
メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エ
ン−１−オンの２、２、３、３−テトラメチルシクロプ
ロパンカルボン酸とのエステルである下記式 化５で示
される化合物は極めて強いノックダウン効力及び致死効
力を有する優れた殺虫剤である（例えば、特公昭５０−
１５８４３）。
キル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子
２〜１０個のアルキニル基又は炭素原子１〜４個のハロ
アルキル基を表す。）で示されるシクロペンテノロン類
は、優れた殺虫活性を有するいわゆる合成ピレスロイド
と呼ばれる一群のエステル系化合物の重要なアルコール
成分として有用である。例えば、４−ヒドロキシ−３−
メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エ
ン−１−オンの２、２、３、３−テトラメチルシクロプ
ロパンカルボン酸とのエステルである下記式 化５で示
される化合物は極めて強いノックダウン効力及び致死効
力を有する優れた殺虫剤である（例えば、特公昭５０−
１５８４３）。
【０００５】
【化５】
【０００６】一般式 化４で示されるシクロペンテノロ
ン類は、その４位に不斉炭素を有するために２種の光学
異性体が存在する。該光学異性体をアルコール成分とし
て有する合成ピレスロイドにおいては、そのアルコール
成分における光学異性の差によって殺虫効果に大きな差
を生じることが知られており、例えば、上記一般式化５
で示される化合物において、（Ｓ）−４−ヒドロキシ−
３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２
−エン−１−オンからなるエステルは、対応する（Ｒ）
−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニ
ル）シクロペント−２−エン−１−オンからなるエステ
ルに比し、その殺虫効力が数倍優れていることが明らか
になっている。
ン類は、その４位に不斉炭素を有するために２種の光学
異性体が存在する。該光学異性体をアルコール成分とし
て有する合成ピレスロイドにおいては、そのアルコール
成分における光学異性の差によって殺虫効果に大きな差
を生じることが知られており、例えば、上記一般式化５
で示される化合物において、（Ｓ）−４−ヒドロキシ−
３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２
−エン−１−オンからなるエステルは、対応する（Ｒ）
−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニ
ル）シクロペント−２−エン−１−オンからなるエステ
ルに比し、その殺虫効力が数倍優れていることが明らか
になっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】このため、合成ピレス
ロイドのアルコール中間体として重要である一般式 化
４で示されるシクロペンテノロン類の光学異性体を工業
的にも有利に分離取得する方法の開発が望まれており、
また、そのために、例えば、該シクロペンテノロン類の
有機カルボン酸エステルに作用して、これを不斉加水分
解する能力を有する優れたエステラーゼを産生する微生
物を遺伝子工学的手法により作製するために、上記のよ
うなエステラーゼをコードする遺伝子の探索も強く望ま
れている。
ロイドのアルコール中間体として重要である一般式 化
４で示されるシクロペンテノロン類の光学異性体を工業
的にも有利に分離取得する方法の開発が望まれており、
また、そのために、例えば、該シクロペンテノロン類の
有機カルボン酸エステルに作用して、これを不斉加水分
解する能力を有する優れたエステラーゼを産生する微生
物を遺伝子工学的手法により作製するために、上記のよ
うなエステラーゼをコードする遺伝子の探索も強く望ま
れている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは、シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エス
テルに作用して、これを不斉加水分解し、高い光学純度
の（Ｓ）−体のシクロペンテノロン類を産生する能力を
有するエステラーゼ遺伝子を見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、 １）一般式 化６
明者らは、シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エス
テルに作用して、これを不斉加水分解し、高い光学純度
の（Ｓ）−体のシクロペンテノロン類を産生する能力を
有するエステラーゼ遺伝子を見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、 １）一般式 化６
【０００９】
【化６】
【００１０】（式中、Ｒ1は炭素原子１〜１０個のアル
キル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子
２〜１０個のアルキニル基又は炭素原子１〜４個のハロ
アルキル基を表す。）で示されるシクロペンテノロン類
の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｓ）−
体のシクロペンテノロン類を産生する能力を有するエス
テラーゼをコードし、かつ、配列番号１で示される塩基
配列にハイブリダイズすることを特徴とするエステラー
ゼ遺伝子（以下、本発明遺伝子と記す。）、 ２）配列番号１で示される塩基配列とのホモロジーが９
０％以上であることを特徴とする前項１記載のエステラ
ーゼ遺伝子。 ３）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有することを特徴とする前項１記載のエステラ
ーゼ遺伝子、 ４）配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴
とする前項１記載のエステラーゼ遺伝子、 ５）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を
含有することを特徴とするプラスミド（以下、本発明プ
ラスミドと記す。）、 ６）前項５記載のプラスミドにより形質転換されたこと
を特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記
す。）、 ７）形質転換体が微生物であることを特徴とする前項６
記載の形質転換体、 ８）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を
有する微生物が産生することを特徴とするエステラーゼ
（以下、本発明エステラーゼと記す。）、 ９）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を
有する微生物が前項６記載の形質転換体であることを特
徴とする前項８記載のエステラーゼ、 １０）前項６記載の形質転換体を培養することにより、
一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類の有機カ
ルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｓ）−体の一般
式 化６で示されるシクロペンテノロン類を産生する能
力を有するエステラーゼを産生することを特徴とするエ
ステラーゼの製造方法（以下、本発明製造方法と記
す。）、 １１）前項８記載のエステラーゼを一般式 化６で示さ
れるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに
作用させて、該エステルを不斉加水分解して、（Ｓ）−
体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類とそ
の対掌体のエステルに分割することを特徴とする一般式
化６で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方法
（以下、本発明光学分割方法と記す。）、 １２）一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類が
４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）
シクロペント−２−エン−１−オンである前項１１記載
の光学分割方法、 １３）一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類が
４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）
シクロペント−２−エン−１−オンである前項１１記載
の光学分割方法、を提供するものである。
キル基、炭素原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子
２〜１０個のアルキニル基又は炭素原子１〜４個のハロ
アルキル基を表す。）で示されるシクロペンテノロン類
の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｓ）−
体のシクロペンテノロン類を産生する能力を有するエス
テラーゼをコードし、かつ、配列番号１で示される塩基
配列にハイブリダイズすることを特徴とするエステラー
ゼ遺伝子（以下、本発明遺伝子と記す。）、 ２）配列番号１で示される塩基配列とのホモロジーが９
０％以上であることを特徴とする前項１記載のエステラ
ーゼ遺伝子。 ３）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有することを特徴とする前項１記載のエステラ
ーゼ遺伝子、 ４）配列番号１で示される塩基配列を有することを特徴
とする前項１記載のエステラーゼ遺伝子、 ５）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を
含有することを特徴とするプラスミド（以下、本発明プ
ラスミドと記す。）、 ６）前項５記載のプラスミドにより形質転換されたこと
を特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記
す。）、 ７）形質転換体が微生物であることを特徴とする前項６
記載の形質転換体、 ８）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を
有する微生物が産生することを特徴とするエステラーゼ
（以下、本発明エステラーゼと記す。）、 ９）前項１、２、３又は４記載のエステラーゼ遺伝子を
有する微生物が前項６記載の形質転換体であることを特
徴とする前項８記載のエステラーゼ、 １０）前項６記載の形質転換体を培養することにより、
一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類の有機カ
ルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｓ）−体の一般
式 化６で示されるシクロペンテノロン類を産生する能
力を有するエステラーゼを産生することを特徴とするエ
ステラーゼの製造方法（以下、本発明製造方法と記
す。）、 １１）前項８記載のエステラーゼを一般式 化６で示さ
れるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに
作用させて、該エステルを不斉加水分解して、（Ｓ）−
体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類とそ
の対掌体のエステルに分割することを特徴とする一般式
化６で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方法
（以下、本発明光学分割方法と記す。）、 １２）一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類が
４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）
シクロペント−２−エン−１−オンである前項１１記載
の光学分割方法、 １３）一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類が
４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロピニル）
シクロペント−２−エン−１−オンである前項１１記載
の光学分割方法、を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明遺伝子は、一般式 化６で示されるシクロペンテ
ノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、
（Ｓ）−体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロ
ン類を産生する能力を有するエステラーゼをコードし、
かつ、配列番号１で示される塩基配列にハイブリダイズ
するエステラーゼ遺伝子である。尚、本発明でいうエス
テラーゼとは、リパーゼを含む広義のエステラーゼを意
味している。ここで一般式 化６で示されるシクロペン
テノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解
し、（Ｓ）−体の一般式 化６で示されるシクロペンテ
ノロン類を産生する能力とは、例えば、４−ヒドロキシ
−３−メチル−２−メチルシクロペントー２−エン−１
−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−エチル−２
−シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ
−３−メチル−２−（２−プロペニル）−２−シクロペ
ント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチ
ル−２−（２、４−ペンタジエニル）−２−シクロペン
ト−２−エン−１−オン、（±）−４−ヒドロキシ−３
−メチル−２−（１−メチル−２−プロピニル）−２−
シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−
３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２
−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−
（１−メチル−２−プロピニル）シクロペント−２−エ
ン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−
（２，２，２−トリフルオロエチル）シクロペント−２
−エン−１−オン等のシクロペンテノロン類の有機カル
ボン酸エステルを不斉加水分解し、対応する（Ｓ）−体
のシクロペンテノロン類を産生する能力を意味する。一
般式 化６で示されるシクロペンテノロン類において、
Ｒ1で示される炭素原子１〜１０個のアルキル基とは、
例えば、メチル基、エチル基、ペンチル基、デシル基等
をあげることができ、炭素原子２〜１０個のアルケニル
基としては、例えば、２−プロペニル基、１−メチル−
２−プロペニル基、２，４−ペンタジエニル基、２−ヘ
プテニル基、２−デセニル基等をあげることができ、炭
素原子２〜１０個のアルキニル基としては、例えば、２
−プロピニル基、１−メチル−２−プロピニル基、２ー
ヘプチニル基、２−デシニル基等をあげることができ、
炭素原子１〜４個のハロアルキル基としては、例えば、
２，２，２，−トリフルオロエチル、４，４，４−トリ
フルオロブチル基等をあげることができる。尚、前記有
機カルボン酸エステルに於いて、有機カルボン酸として
は、例えば、炭素原子１〜１０個の飽和又は不飽和の脂
肪酸、ピレスロイド酸等をあげることができる。また、
「配列番号１で示される塩基配列にハイブリダイズす
る」遺伝子とは、配列番号１で示される塩基配列を有す
るＤＮＡをプローブとして、例えば、「クローニングと
シークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８
９、農村文化社発行）等に記載されるサザンハイブリダ
イゼーション方法によって視覚的に検出可能であるよう
な遺伝子を意味し、配列番号１で示される塩基配列を有
するＤＮＡ又はそのＤＮＡにおける１若しくは複数の塩
基が付加、欠失又は置換された塩基配列からなるＤＮＡ
等である。例えば、95℃、1分という条件の熱処理や、
0．5M NaOH、1．5M NaClという条件のアルカリ処理によ
り、二本鎖からなるDNAを相補的な一本鎖DNAに解離させ
た後、例えば、氷上に1分放置するという条件の放熱や
0．5M Tris・HCl（pH7．0）、3．0M NaClという条件の
中和処理により前記一本鎖DNAに対して相補性を有する
一本鎖DNAや一本鎖RNAを会合させ、再び二本鎖状態（ハ
イブリダイズした状態）になり、このようなＤＮＡは、
通常、配列番号１で示される塩基配列と高いホモロジー
（活性部位や構造等に強く関与する領域か否かによって
も異なるが、例えば、全体として９０％程度以上のホモ
ロジー）を有するような塩基配列を有する遺伝子であ
る。ホモロジーは、PearsonとLipmanが開発したホモロ
ジー検索プログラムを用いて計算することができる（Pe
arson and Lipman, (1988), Proc.Natl.Academic.Sci U
SA, 85, 2444）。また、Genetyx-Mac（ソフトウエア開
発（株）製）に含まれているこのプログラムを用いても
計算することができる。また、日本ＤＮＡデータバンク
（ＤＤＢＪ）のWorldWideWebサービスにあるホモロジー
サーチ・プログラム(fasta)を用いることもできる。こ
のような本発明遺伝子のより具体的な例としては、例え
ば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有するエステラーゼ遺伝子をあげることができ
る。もちろん、配列番号１で示される塩基配列を有する
エステラーゼ遺伝子も本発明遺伝子としてあげることが
できる。
本発明遺伝子は、一般式 化６で示されるシクロペンテ
ノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、
（Ｓ）−体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロ
ン類を産生する能力を有するエステラーゼをコードし、
かつ、配列番号１で示される塩基配列にハイブリダイズ
するエステラーゼ遺伝子である。尚、本発明でいうエス
テラーゼとは、リパーゼを含む広義のエステラーゼを意
味している。ここで一般式 化６で示されるシクロペン
テノロン類の有機カルボン酸エステルを不斉加水分解
し、（Ｓ）−体の一般式 化６で示されるシクロペンテ
ノロン類を産生する能力とは、例えば、４−ヒドロキシ
−３−メチル−２−メチルシクロペントー２−エン−１
−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−エチル−２
−シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ
−３−メチル−２−（２−プロペニル）−２−シクロペ
ント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチ
ル−２−（２、４−ペンタジエニル）−２−シクロペン
ト−２−エン−１−オン、（±）−４−ヒドロキシ−３
−メチル−２−（１−メチル−２−プロピニル）−２−
シクロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−
３−メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２
−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−
（１−メチル−２−プロピニル）シクロペント−２−エ
ン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−
（２，２，２−トリフルオロエチル）シクロペント−２
−エン−１−オン等のシクロペンテノロン類の有機カル
ボン酸エステルを不斉加水分解し、対応する（Ｓ）−体
のシクロペンテノロン類を産生する能力を意味する。一
般式 化６で示されるシクロペンテノロン類において、
Ｒ1で示される炭素原子１〜１０個のアルキル基とは、
例えば、メチル基、エチル基、ペンチル基、デシル基等
をあげることができ、炭素原子２〜１０個のアルケニル
基としては、例えば、２−プロペニル基、１−メチル−
２−プロペニル基、２，４−ペンタジエニル基、２−ヘ
プテニル基、２−デセニル基等をあげることができ、炭
素原子２〜１０個のアルキニル基としては、例えば、２
−プロピニル基、１−メチル−２−プロピニル基、２ー
ヘプチニル基、２−デシニル基等をあげることができ、
炭素原子１〜４個のハロアルキル基としては、例えば、
２，２，２，−トリフルオロエチル、４，４，４−トリ
フルオロブチル基等をあげることができる。尚、前記有
機カルボン酸エステルに於いて、有機カルボン酸として
は、例えば、炭素原子１〜１０個の飽和又は不飽和の脂
肪酸、ピレスロイド酸等をあげることができる。また、
「配列番号１で示される塩基配列にハイブリダイズす
る」遺伝子とは、配列番号１で示される塩基配列を有す
るＤＮＡをプローブとして、例えば、「クローニングと
シークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８
９、農村文化社発行）等に記載されるサザンハイブリダ
イゼーション方法によって視覚的に検出可能であるよう
な遺伝子を意味し、配列番号１で示される塩基配列を有
するＤＮＡ又はそのＤＮＡにおける１若しくは複数の塩
基が付加、欠失又は置換された塩基配列からなるＤＮＡ
等である。例えば、95℃、1分という条件の熱処理や、
0．5M NaOH、1．5M NaClという条件のアルカリ処理によ
り、二本鎖からなるDNAを相補的な一本鎖DNAに解離させ
た後、例えば、氷上に1分放置するという条件の放熱や
0．5M Tris・HCl（pH7．0）、3．0M NaClという条件の
中和処理により前記一本鎖DNAに対して相補性を有する
一本鎖DNAや一本鎖RNAを会合させ、再び二本鎖状態（ハ
イブリダイズした状態）になり、このようなＤＮＡは、
通常、配列番号１で示される塩基配列と高いホモロジー
（活性部位や構造等に強く関与する領域か否かによって
も異なるが、例えば、全体として９０％程度以上のホモ
ロジー）を有するような塩基配列を有する遺伝子であ
る。ホモロジーは、PearsonとLipmanが開発したホモロ
ジー検索プログラムを用いて計算することができる（Pe
arson and Lipman, (1988), Proc.Natl.Academic.Sci U
SA, 85, 2444）。また、Genetyx-Mac（ソフトウエア開
発（株）製）に含まれているこのプログラムを用いても
計算することができる。また、日本ＤＮＡデータバンク
（ＤＤＢＪ）のWorldWideWebサービスにあるホモロジー
サーチ・プログラム(fasta)を用いることもできる。こ
のような本発明遺伝子のより具体的な例としては、例え
ば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩
基配列を有するエステラーゼ遺伝子をあげることができ
る。もちろん、配列番号１で示される塩基配列を有する
エステラーゼ遺伝子も本発明遺伝子としてあげることが
できる。
【００１２】本発明遺伝子は、例えば、バークホルデリ
ア（Burkholderia）属に属する微生物から通常の方法
（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大
学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）等に記
載される方法）によって調製された染色体DNAを鋳型と
し、かつ配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ
の一部（例えば、配列番号１で示される塩基配列の5'末
端側配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオ
チドと配列番号１で示される塩基配列の3'末端側塩基配
列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの
組み合わせ、または、配列番号１で示される塩基配列の
5'末端側配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌク
レオチドと配列番号１で示される塩基配列の3 ' 末端側
配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチド
の組み合わせ）をプライマーとして用いるＰＣＲ法によ
り取得することができる。また、例えば、バークホルデ
リア（Burkholderia）属に属する微生物から通常の方法
（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大
学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）等に記
載される方法）によって調製された染色体DNAをラムダ
ファージやプラスミドなどに挿入して作成された遺伝子
ライブラリーを、配列番号２で示されたアミノ酸配列を
コードする塩基配列、望ましくは配列番号１に示される
塩基配列に含まれる15塩基以上のDNA断片をプローブと
して、コロニーハイブリダーゼーションや、プラークハ
イブリダイゼーションなどの方法によっても取得するこ
とができる。本発明遺伝子が調製される微生物として
は、上記の微生物の中でもバークホルデリア・セパシア
（Burkholderia cepacia）を特に好ましくあげることが
でき、さらに具体的にはBurkholderia cepacia SC-20株
があげられる。尚、上記にあるBurkholderia cepacia S
C-20株は、本発明者が自然界から見出した微生物であ
り、下記の菌学的性質を有する（表１及び２）。
ア（Burkholderia）属に属する微生物から通常の方法
（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大
学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）等に記
載される方法）によって調製された染色体DNAを鋳型と
し、かつ配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ
の一部（例えば、配列番号１で示される塩基配列の5'末
端側配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオ
チドと配列番号１で示される塩基配列の3'末端側塩基配
列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの
組み合わせ、または、配列番号１で示される塩基配列の
5'末端側配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌク
レオチドと配列番号１で示される塩基配列の3 ' 末端側
配列に相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチド
の組み合わせ）をプライマーとして用いるＰＣＲ法によ
り取得することができる。また、例えば、バークホルデ
リア（Burkholderia）属に属する微生物から通常の方法
（例えば、「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大
学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）等に記
載される方法）によって調製された染色体DNAをラムダ
ファージやプラスミドなどに挿入して作成された遺伝子
ライブラリーを、配列番号２で示されたアミノ酸配列を
コードする塩基配列、望ましくは配列番号１に示される
塩基配列に含まれる15塩基以上のDNA断片をプローブと
して、コロニーハイブリダーゼーションや、プラークハ
イブリダイゼーションなどの方法によっても取得するこ
とができる。本発明遺伝子が調製される微生物として
は、上記の微生物の中でもバークホルデリア・セパシア
（Burkholderia cepacia）を特に好ましくあげることが
でき、さらに具体的にはBurkholderia cepacia SC-20株
があげられる。尚、上記にあるBurkholderia cepacia S
C-20株は、本発明者が自然界から見出した微生物であ
り、下記の菌学的性質を有する（表１及び２）。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【表２】
【００１５】以上の菌学的性質を、バージェイズ・マニ
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第
１巻（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology V
ol.1(1984))、バージェイズ・マニュアル・オブ・デタ
ミネティブ・バクテリオロジー第９版（Bergey's Manua
l of Determinative Bacteriology,Ninth edition(199
4))、ZhaoらのInt. J. Syst. Bacteriol. 45,p.600,(19
95)及びYabuuchiらのMicrobiol. Immunol.,36,p.1251,
(1992)の記載と対比すると、バークホルデリア・セパシ
ア（Burkholderia cepacia）と一致している。
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー第
１巻（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology V
ol.1(1984))、バージェイズ・マニュアル・オブ・デタ
ミネティブ・バクテリオロジー第９版（Bergey's Manua
l of Determinative Bacteriology,Ninth edition(199
4))、ZhaoらのInt. J. Syst. Bacteriol. 45,p.600,(19
95)及びYabuuchiらのMicrobiol. Immunol.,36,p.1251,
(1992)の記載と対比すると、バークホルデリア・セパシ
ア（Burkholderia cepacia）と一致している。
【００１６】また、鋳型としてE.coli JM109/pAL108株
の菌体から調製したDNAを用い、かつプライマーとして
配列番号１で示される塩基配列を有するDNAの一部（例
えば、配列番号１で示される塩基配列の5'末端側配列に
相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドと配列
番号１で示される塩基配列の3'末端側塩基配列に相当す
る約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み合わ
せ、または、配列番号１で示される塩基配列の5'末端側
配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチド
と配列番号１で示される塩基配列の3 ' 末端側配列に相
補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み合
わせ）を用いるＰＣＲ法により取得することができる。
尚、上記にあるE.coli JM109/pAL108株は、本発明遺伝
子を含有するプラスミドpAL108（本発明プラスミド）を
エシェリヒア・コリ(Escherchia coli）JM109株に導入
した形質転換体微生物（本発明形質転換体）は、FERM-B
P 5739として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
（受理日：平成８年１１月７日）されている。
の菌体から調製したDNAを用い、かつプライマーとして
配列番号１で示される塩基配列を有するDNAの一部（例
えば、配列番号１で示される塩基配列の5'末端側配列に
相補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドと配列
番号１で示される塩基配列の3'末端側塩基配列に相当す
る約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み合わ
せ、または、配列番号１で示される塩基配列の5'末端側
配列に相当する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチド
と配列番号１で示される塩基配列の3 ' 末端側配列に相
補する約14塩基程度以上のオリゴヌクレオチドの組み合
わせ）を用いるＰＣＲ法により取得することができる。
尚、上記にあるE.coli JM109/pAL108株は、本発明遺伝
子を含有するプラスミドpAL108（本発明プラスミド）を
エシェリヒア・コリ(Escherchia coli）JM109株に導入
した形質転換体微生物（本発明形質転換体）は、FERM-B
P 5739として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
（受理日：平成８年１１月７日）されている。
【００１７】取得された本発明遺伝子を、例えば、形質
転換させる宿主細胞において通常用いられるベクタ−に
通常の遺伝子工学的手法を用いて組み込むことにより本
発明プラスミドを容易に構築できる。具体的には、例え
ば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、用いる
ベクターとしては、pUC119（宝酒造（株）製）、pBlues
criptII （ストラタジーン クローニング システム製）
等をあげることができる。構築された本発明プラスミド
により宿主細胞を形質転換させる方法は、形質転換させ
る宿主細胞に応じて通常用いられる方法であればよく、
例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、
「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コー
ルド・スプリング・ハーバー、1989年）等に記載される
通常の方法をあげることができる。尚、形質転換体を選
抜するには、例えば、まず本発明プラスミドにより形質
転換させた宿主細胞をトリブチリン含有ＬＢプレートで
培養し、クリアゾーンを形成するものを選択する。次に
選択された形質転換体を培養して得られた培養物を、一
般式 化６に示されるシクロペンテノロン類の有機カル
ボン酸エステルに作用させ、反応生成物を分析すること
により、（Ｓ）−体の一般式 化６に示されるシクロペ
ンテノロン類を高い光学純度で生成する形質転換体を選
抜すればよい。より具体的には、例えば、（ＲＳ）−４
−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シ
クロペント−２−エン−１−オンの酢酸エステル0.5gと
50mMリン酸緩衝液(pH7.0)8.0mlを100mlのサンプル瓶に
入れ、撹拌子で撹拌させながら40℃、10分間予熱する。
これに1.0mlの上記培養物を加え、撹拌子で撹拌させな
がら40℃で反応を行う。30分間後、該反応液を50μlを
回収し、1mlのエタノールを添加することにより反応を
停止する。ブランクは、培養物の代わりに精製水を用い
て同様な方法で試験する。分解率は、ガスクロマトグラ
フィーで計測する。分析用のカラムは、10% シリコン D
C-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度150℃、インジェクシ
ョン温度170℃、ディテクション温度170℃、検出器はFI
Dの条件で、GC-14A（（株）島津製作所製）を用いて分
析する。酵素力価は、1分間に、1μmolの（Ｓ）−４−
ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シク
ロペント−２−エン−１−オンを遊離する酵素量を1uni
tとする。さらに反応液をメチルイソブチルケトンで抽
出した後、該抽出物についてＨＰＬＣ分析により、
（Ｓ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ペニル）シクロペント−２−エン−１−オンの光学純度
を測定する。分析には、（株）住化分析センター製OA-4
100 (4.0mmI.D. x 25cm)光学異性体分析カラムを使用す
る。溶出液は、Hexane と1,2-dichloroethane とethano
l を100:20:1の割合で混合したものを用いることができ
る。流速は1.0ml/minで、230nmの吸光度を指標にして光
学異性体比を分析すればよい。さらに詳細に、選抜され
た形質転換体から該形質転換体が保有するプラスミドを
調製した後、調製されたプラスミドについて、例えば
「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コー
ルド・スプリング・ハーバー、1989年）等に記載される
通常の方法によリ制限酵素地図を作製し、目的とする本
発明遺伝子が含まれているか否かを、塩基配列の解析、
サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダ
イゼーション等の方法で確認することもできる。
転換させる宿主細胞において通常用いられるベクタ−に
通常の遺伝子工学的手法を用いて組み込むことにより本
発明プラスミドを容易に構築できる。具体的には、例え
ば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、用いる
ベクターとしては、pUC119（宝酒造（株）製）、pBlues
criptII （ストラタジーン クローニング システム製）
等をあげることができる。構築された本発明プラスミド
により宿主細胞を形質転換させる方法は、形質転換させ
る宿主細胞に応じて通常用いられる方法であればよく、
例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、
「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コー
ルド・スプリング・ハーバー、1989年）等に記載される
通常の方法をあげることができる。尚、形質転換体を選
抜するには、例えば、まず本発明プラスミドにより形質
転換させた宿主細胞をトリブチリン含有ＬＢプレートで
培養し、クリアゾーンを形成するものを選択する。次に
選択された形質転換体を培養して得られた培養物を、一
般式 化６に示されるシクロペンテノロン類の有機カル
ボン酸エステルに作用させ、反応生成物を分析すること
により、（Ｓ）−体の一般式 化６に示されるシクロペ
ンテノロン類を高い光学純度で生成する形質転換体を選
抜すればよい。より具体的には、例えば、（ＲＳ）−４
−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シ
クロペント−２−エン−１−オンの酢酸エステル0.5gと
50mMリン酸緩衝液(pH7.0)8.0mlを100mlのサンプル瓶に
入れ、撹拌子で撹拌させながら40℃、10分間予熱する。
これに1.0mlの上記培養物を加え、撹拌子で撹拌させな
がら40℃で反応を行う。30分間後、該反応液を50μlを
回収し、1mlのエタノールを添加することにより反応を
停止する。ブランクは、培養物の代わりに精製水を用い
て同様な方法で試験する。分解率は、ガスクロマトグラ
フィーで計測する。分析用のカラムは、10% シリコン D
C-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度150℃、インジェクシ
ョン温度170℃、ディテクション温度170℃、検出器はFI
Dの条件で、GC-14A（（株）島津製作所製）を用いて分
析する。酵素力価は、1分間に、1μmolの（Ｓ）−４−
ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シク
ロペント−２−エン−１−オンを遊離する酵素量を1uni
tとする。さらに反応液をメチルイソブチルケトンで抽
出した後、該抽出物についてＨＰＬＣ分析により、
（Ｓ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ペニル）シクロペント−２−エン−１−オンの光学純度
を測定する。分析には、（株）住化分析センター製OA-4
100 (4.0mmI.D. x 25cm)光学異性体分析カラムを使用す
る。溶出液は、Hexane と1,2-dichloroethane とethano
l を100:20:1の割合で混合したものを用いることができ
る。流速は1.0ml/minで、230nmの吸光度を指標にして光
学異性体比を分析すればよい。さらに詳細に、選抜され
た形質転換体から該形質転換体が保有するプラスミドを
調製した後、調製されたプラスミドについて、例えば
「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コー
ルド・スプリング・ハーバー、1989年）等に記載される
通常の方法によリ制限酵素地図を作製し、目的とする本
発明遺伝子が含まれているか否かを、塩基配列の解析、
サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダ
イゼーション等の方法で確認することもできる。
【００１８】このようにして本発明形質転換体を得て、
該形質転換体を培養することにより本発明エステラーゼ
を産生させることができる（本発明製造方法）。形質転
換体が微生物である場合、該形質転換体は、一般微生物
における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機
ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養され
る。炭素源としては、グルコース、グリセロール、デキ
ストリン、シュークロース、有機酸、動植物油、糖蜜等
が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、
酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ
・リカー（Corn Steep Liquor ）、綿実粉、乾燥酵母、
カザミノ酸、硝酸ナトリウム、尿素などの有機または無
機窒素源等が挙げられる。有機ないし無機塩としては、
カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、
コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸物、酢酸塩、炭酸塩類
およびリン酸塩類、具体的には、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウ
ム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素一カ
リウム、リン酸水素二カリウム等を挙げることができ
る。培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行
い、固体培養、液体培養（試験管振盪式培養、往復式振
盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter ）培
養、培養タンク等）いずれも可能である。特に、ジャー
ファーメンターを用いる場合、無菌空気を導入する必要
があり、通常、培養液量の約0.1 〜約2 倍/ 分の通気条
件を用いる。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜
変更できるが、例えば、約15℃〜約40℃の範囲の培養温
度、約6.0〜約8.0の培地pHで培養することが好ましい。
培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約
1〜約5日間が望ましい。
該形質転換体を培養することにより本発明エステラーゼ
を産生させることができる（本発明製造方法）。形質転
換体が微生物である場合、該形質転換体は、一般微生物
における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機
ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養され
る。炭素源としては、グルコース、グリセロール、デキ
ストリン、シュークロース、有機酸、動植物油、糖蜜等
が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、
酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ
・リカー（Corn Steep Liquor ）、綿実粉、乾燥酵母、
カザミノ酸、硝酸ナトリウム、尿素などの有機または無
機窒素源等が挙げられる。有機ないし無機塩としては、
カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、
コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸物、酢酸塩、炭酸塩類
およびリン酸塩類、具体的には、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウ
ム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素一カ
リウム、リン酸水素二カリウム等を挙げることができ
る。培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行
い、固体培養、液体培養（試験管振盪式培養、往復式振
盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter ）培
養、培養タンク等）いずれも可能である。特に、ジャー
ファーメンターを用いる場合、無菌空気を導入する必要
があり、通常、培養液量の約0.1 〜約2 倍/ 分の通気条
件を用いる。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜
変更できるが、例えば、約15℃〜約40℃の範囲の培養温
度、約6.0〜約8.0の培地pHで培養することが好ましい。
培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約
1〜約5日間が望ましい。
【００１９】本発明エステラーゼは、 １）分子量（SDSポリアクリルアミド電気泳動）約４万
ダルトンであり、 ２）少なくとも約１５℃〜約６０℃程度、好ましくは約
２５℃〜約４０℃程度の範囲において反応可能であり、 ３）pH約４〜約９程度、好ましくはpH約６〜約８程度の
範囲において反応可能であり、 ４）一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類の有
機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｓ）−体の
一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類を産生す
る能力を有し、 ５）例えば、バークホルデリア（Burkholderia）属に属
する微生物（特に好ましい微生物としては、バークホル
デリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、さらに具
体的にはBurkholderia cepacia SC-20株等の非形質転換
体を培養することにより得ることもできる。もちろん、
前記の如く本発明遺伝子を含有するプラスミドにより形
質転換された形質転換体を培養することによっても得る
ことができる。本発明エステラーゼは、それ自体を含有
する培養物の形で酵素反応に利用してもよいが、該培養
物から分離して粗酵素や精製酵素等の形で酵素反応に利
用してもよい。このような分離の方法としては、例え
ば、超音波処理、ガラスビーズやアルミナを用いる磨砕
処理、フレンチプレス処理、リゾチーム等の酵素処理等
により菌体を破砕し、得られた破砕物から硫安などを用
いる塩析、有機溶媒やポリエチレングリコール等の有機
ポリマーによる沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマ
トグラフィー、電気泳動等により分画する通常の方法を
あげることができる。必要に応じて、これらの方法を組
み合わせて用いることができる。さらにまた、本発明エ
ステラーゼを共有結合、イオン結合、吸着などにより担
体に結合させる担体結合法、高分子の網目構造のなかに
閉じ込める包括法等の固定化の方法によって不溶化し、
容易に分離可能な状態に加工した固定化物の形で酵素反
応に利用することもできる。
ダルトンであり、 ２）少なくとも約１５℃〜約６０℃程度、好ましくは約
２５℃〜約４０℃程度の範囲において反応可能であり、 ３）pH約４〜約９程度、好ましくはpH約６〜約８程度の
範囲において反応可能であり、 ４）一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類の有
機カルボン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｓ）−体の
一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類を産生す
る能力を有し、 ５）例えば、バークホルデリア（Burkholderia）属に属
する微生物（特に好ましい微生物としては、バークホル
デリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、さらに具
体的にはBurkholderia cepacia SC-20株等の非形質転換
体を培養することにより得ることもできる。もちろん、
前記の如く本発明遺伝子を含有するプラスミドにより形
質転換された形質転換体を培養することによっても得る
ことができる。本発明エステラーゼは、それ自体を含有
する培養物の形で酵素反応に利用してもよいが、該培養
物から分離して粗酵素や精製酵素等の形で酵素反応に利
用してもよい。このような分離の方法としては、例え
ば、超音波処理、ガラスビーズやアルミナを用いる磨砕
処理、フレンチプレス処理、リゾチーム等の酵素処理等
により菌体を破砕し、得られた破砕物から硫安などを用
いる塩析、有機溶媒やポリエチレングリコール等の有機
ポリマーによる沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマ
トグラフィー、電気泳動等により分画する通常の方法を
あげることができる。必要に応じて、これらの方法を組
み合わせて用いることができる。さらにまた、本発明エ
ステラーゼを共有結合、イオン結合、吸着などにより担
体に結合させる担体結合法、高分子の網目構造のなかに
閉じ込める包括法等の固定化の方法によって不溶化し、
容易に分離可能な状態に加工した固定化物の形で酵素反
応に利用することもできる。
【００２０】本発明エステラーゼは、例えば、一般式
化６で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方法に
利用できる。即ち、本発明エステラーゼを、一般式 化
６で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エ
ステルに作用させて、該エステルを不斉加水分解して、
（Ｓ）−体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロ
ン類とその対掌体のエステルとに分割する方法に利用で
き、かかる分割方法に於いて、通常は、ラセミのエステ
ルが原料として用いられる。具体的には、例えば、４−
ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シク
ロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−
メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エ
ン−１−オンをあげることができる。反応温度は、例え
ば、約15℃〜約60℃、好ましくは、約25℃〜約40℃を、
反応pHは、例えば約4〜約9、好ましくは、約6〜約8を、
反応時間は、例えば、約5分間〜約96時間を挙げること
ができる。反応液からの（Ｓ）−体の一般式 化６で示
されるシクロペンテノロン類とその対掌体のエステルの
回収は、一般に知られている任意の方法で行うことがで
きる。例えば、溶媒抽出、分別蒸留、カラムクロマトグ
ラフィーなどの操作を、適宜採用することができる。具
体的には、反応液をエーテル、酢酸エチル、ベンゼンなど
の有機溶媒で抽出し、この抽出物を分別蒸留し、（Ｓ）−
体のシクロペンテノロン類とその対掌体のエステルを分
離取得するか、抽出物をシリカゲルのクロマトグラフィ
ーにかけ、分離し、抽出することによっても得ることが
できる。
化６で示されるシクロペンテノロン類の光学分割方法に
利用できる。即ち、本発明エステラーゼを、一般式 化
６で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボン酸エ
ステルに作用させて、該エステルを不斉加水分解して、
（Ｓ）−体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロ
ン類とその対掌体のエステルとに分割する方法に利用で
き、かかる分割方法に於いて、通常は、ラセミのエステ
ルが原料として用いられる。具体的には、例えば、４−
ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロペニル）シク
ロペント−２−エン−１−オン、４−ヒドロキシ−３−
メチル−２−（２−プロピニル）シクロペント−２−エ
ン−１−オンをあげることができる。反応温度は、例え
ば、約15℃〜約60℃、好ましくは、約25℃〜約40℃を、
反応pHは、例えば約4〜約9、好ましくは、約6〜約8を、
反応時間は、例えば、約5分間〜約96時間を挙げること
ができる。反応液からの（Ｓ）−体の一般式 化６で示
されるシクロペンテノロン類とその対掌体のエステルの
回収は、一般に知られている任意の方法で行うことがで
きる。例えば、溶媒抽出、分別蒸留、カラムクロマトグ
ラフィーなどの操作を、適宜採用することができる。具
体的には、反応液をエーテル、酢酸エチル、ベンゼンなど
の有機溶媒で抽出し、この抽出物を分別蒸留し、（Ｓ）−
体のシクロペンテノロン類とその対掌体のエステルを分
離取得するか、抽出物をシリカゲルのクロマトグラフィ
ーにかけ、分離し、抽出することによっても得ることが
できる。
【００２１】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定され
るものではない。
するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定され
るものではない。
【００２２】実施例１ （染色体DNA の調製） バークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia) S
C-20株 を、LB培地（Bacto tryptone(Difco Laboratori
es Incorporated製） 10g、Bacto yeast extract(Difco
Laboratories Incorporated 製） 5g、NaCl 5g/ L)
で、30℃、12時間培養した後、遠心分離（6000rpm 、10
min ）により集菌し、菌体を回収した。回収された菌体
を1mg/mlの塩化リゾチーム（生化学工業(株)製）、25μ
g/mlのRNaseA（シグマ アルドリッチ ジャパン（株）
製）を含むTEN バッファー（10mM Tris-HCl(pH8.0)、1m
M EDTA-NaOH(pH8.0) 、10mM NaCl 、以下TENと略）に懸
濁し、３７℃、20分間インキュベートした。その後、終
濃度が1%(w/v）になるようにドデシル硫酸ナトリウム
を加え、55℃、10分間インキュベートした。次に、等量
のTE飽和フェノールを加え、ゆっくりとかき混ぜた後、
遠心分離（10,000rpm、10min ）し、上層を回収した。
回収された上層に、等量のTE(10mM Tris-HCl(pH8.0),1m
M EDTA(pH8.0)、以下TEと略）飽和フェノール・クロロ
ホルム溶液を加え、ゆっくりかき混ぜた後、遠心分離
（10,000rpm 、10min ）し、上層を回収した。回収され
た上層に、1/10倍容量の3M酢酸アンモニウム溶液を加え
た後、2 倍容量のエタノールを加え、析出してくるDNA
をガラス棒で巻き取った。このDNA を70% (v/v）エタノ
ールでリンスし、次に80% (v/v）エタノール、100%エタ
ノールで再度リンスした後、風乾した。得られたDNA
を、25μg/mlのRNaseA（シグマ アルドリッチ ジャパン
（株）製）、20μg/mlのPrteinase K （ベーリンガー・
マンハイム製）を含むTEN バッファーに懸濁し、37℃、
12時間インキュベートした。これに、等量のTE飽和フェ
ノール・クロロホルム溶液を加え、ゆっくりかき混ぜた
後、遠心分離（10,000rpm 、10min ）し、上層を回収し
た。1/10倍容量の3M酢酸アンモニウム液を加えた後、2
倍容量のエタノールを加え、析出してくるＤＮＡをガラ
ス棒で巻き取った。このＤＮＡを70% (v/v）エタノール
でリンスし、次に80% (v/v）エタノール、100%エタノー
ルで再度リンスした後、風乾した。得られたDNA を、25
μg/mlのRNaseAを加えた10mlTEバッファーに溶解した
後、2LのTEバッファーに対して２回透析を行った。この
ようにして100ml の培養液から約1.6mg の染色体DNA を
得た。
C-20株 を、LB培地（Bacto tryptone(Difco Laboratori
es Incorporated製） 10g、Bacto yeast extract(Difco
Laboratories Incorporated 製） 5g、NaCl 5g/ L)
で、30℃、12時間培養した後、遠心分離（6000rpm 、10
min ）により集菌し、菌体を回収した。回収された菌体
を1mg/mlの塩化リゾチーム（生化学工業(株)製）、25μ
g/mlのRNaseA（シグマ アルドリッチ ジャパン（株）
製）を含むTEN バッファー（10mM Tris-HCl(pH8.0)、1m
M EDTA-NaOH(pH8.0) 、10mM NaCl 、以下TENと略）に懸
濁し、３７℃、20分間インキュベートした。その後、終
濃度が1%(w/v）になるようにドデシル硫酸ナトリウム
を加え、55℃、10分間インキュベートした。次に、等量
のTE飽和フェノールを加え、ゆっくりとかき混ぜた後、
遠心分離（10,000rpm、10min ）し、上層を回収した。
回収された上層に、等量のTE(10mM Tris-HCl(pH8.0),1m
M EDTA(pH8.0)、以下TEと略）飽和フェノール・クロロ
ホルム溶液を加え、ゆっくりかき混ぜた後、遠心分離
（10,000rpm 、10min ）し、上層を回収した。回収され
た上層に、1/10倍容量の3M酢酸アンモニウム溶液を加え
た後、2 倍容量のエタノールを加え、析出してくるDNA
をガラス棒で巻き取った。このDNA を70% (v/v）エタノ
ールでリンスし、次に80% (v/v）エタノール、100%エタ
ノールで再度リンスした後、風乾した。得られたDNA
を、25μg/mlのRNaseA（シグマ アルドリッチ ジャパン
（株）製）、20μg/mlのPrteinase K （ベーリンガー・
マンハイム製）を含むTEN バッファーに懸濁し、37℃、
12時間インキュベートした。これに、等量のTE飽和フェ
ノール・クロロホルム溶液を加え、ゆっくりかき混ぜた
後、遠心分離（10,000rpm 、10min ）し、上層を回収し
た。1/10倍容量の3M酢酸アンモニウム液を加えた後、2
倍容量のエタノールを加え、析出してくるＤＮＡをガラ
ス棒で巻き取った。このＤＮＡを70% (v/v）エタノール
でリンスし、次に80% (v/v）エタノール、100%エタノー
ルで再度リンスした後、風乾した。得られたDNA を、25
μg/mlのRNaseAを加えた10mlTEバッファーに溶解した
後、2LのTEバッファーに対して２回透析を行った。この
ようにして100ml の培養液から約1.6mg の染色体DNA を
得た。
【００２３】実施例２ （染色体DNA ライブラリの作
製） 得られた染色体DNA 50μg を制限酵素EcoRIで37℃、1
時間分解した。一方、発現ベクターであるpUC19（宝酒
造（株）製）を制限酵素EcoRIで37℃、1 時間分解した
後、アルカリンフォスファターゼ処理を行った。これら
を、ライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用いて
ライゲーションを行った。ライゲーションは、16℃で終
夜かけて行った。ライゲーション終了後、ライゲーショ
ン溶液を大腸菌JM109株コンピタント・セル（東洋紡績
（株）製）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、
37℃、２時間、ＳＯＣ培地（Bacto tryptone(Difco Lab
oratories Incorporated 社製） 20g、Bacto yeast ext
ract(Difco Laboratories Incorporated製）10g、 1M N
aCl 10ml, 1M KCl 2.5ml, 1M MgSO4 10ml, 1M MgCl210m
l, 2M Glucose 10ml /L (pH=7.4)）で培養した後、20ml
の50mg/Lのアンピシリンを含むＬＢ培地で37℃、終夜培
養した。得られた培養液を、isopropyl thio-β-D-gala
ctoside（以下IPTGと略） 1mMとトリブチリン1.0%とア
ンピシリン50mg/Lを含有するＬＢ培地に塗布して、37℃
で培養した。２〜３日培養した後、クリアゾーンを形成
する２９株を選抜した。選抜された形質転換体からプラ
スミドを調製し、制限酵素で挿入断片を調べたところ、
3.5kbのEcoRI断片が挿入された形質転換体を得ることが
できた。この得られたプラスミドをpAL101と命名した。
製） 得られた染色体DNA 50μg を制限酵素EcoRIで37℃、1
時間分解した。一方、発現ベクターであるpUC19（宝酒
造（株）製）を制限酵素EcoRIで37℃、1 時間分解した
後、アルカリンフォスファターゼ処理を行った。これら
を、ライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用いて
ライゲーションを行った。ライゲーションは、16℃で終
夜かけて行った。ライゲーション終了後、ライゲーショ
ン溶液を大腸菌JM109株コンピタント・セル（東洋紡績
（株）製）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、
37℃、２時間、ＳＯＣ培地（Bacto tryptone(Difco Lab
oratories Incorporated 社製） 20g、Bacto yeast ext
ract(Difco Laboratories Incorporated製）10g、 1M N
aCl 10ml, 1M KCl 2.5ml, 1M MgSO4 10ml, 1M MgCl210m
l, 2M Glucose 10ml /L (pH=7.4)）で培養した後、20ml
の50mg/Lのアンピシリンを含むＬＢ培地で37℃、終夜培
養した。得られた培養液を、isopropyl thio-β-D-gala
ctoside（以下IPTGと略） 1mMとトリブチリン1.0%とア
ンピシリン50mg/Lを含有するＬＢ培地に塗布して、37℃
で培養した。２〜３日培養した後、クリアゾーンを形成
する２９株を選抜した。選抜された形質転換体からプラ
スミドを調製し、制限酵素で挿入断片を調べたところ、
3.5kbのEcoRI断片が挿入された形質転換体を得ることが
できた。この得られたプラスミドをpAL101と命名した。
【００２４】実施例３ （制限酵素解析と塩基配列の解
析） 実施例２により得られたプラスミドpAL101を制限酵素で
解析を行い、制限酵素地図を作製した（図１参照）。さ
らにpAL101に含有される本発明遺伝子についてPRISM ki
t （（株）パーキンエルマージャパン製）と自動塩基配
列解析装置373A（（株）パーキンエルマージャパン製）
を用いてその塩基配列を解析した。尚、得られた塩基配
列はGenetyx-Mac/ATSQ（ソフトウエア開発（株）製）
と、Genetyx-Mac （ソフトウエア開発（株）製）で解析
した。解析して得られたエステラーゼの塩基配列は、配
列番号１に示す通りであった。
析） 実施例２により得られたプラスミドpAL101を制限酵素で
解析を行い、制限酵素地図を作製した（図１参照）。さ
らにpAL101に含有される本発明遺伝子についてPRISM ki
t （（株）パーキンエルマージャパン製）と自動塩基配
列解析装置373A（（株）パーキンエルマージャパン製）
を用いてその塩基配列を解析した。尚、得られた塩基配
列はGenetyx-Mac/ATSQ（ソフトウエア開発（株）製）
と、Genetyx-Mac （ソフトウエア開発（株）製）で解析
した。解析して得られたエステラーゼの塩基配列は、配
列番号１に示す通りであった。
【００２５】実施例４ （サブクローニング） 実施例２により得られたプラスミドpAL101に存在する3.
5kbのEcoRI断片を短縮した各種のプラスミドを構築し
た。これらのプラスミドを実施例２に準じた方法により
大腸菌JM109株コンピタント・セル（東洋紡績（株）
製）に導入し形質転換を行なった後、形質転換された大
腸菌をトリブチリン含有ＬＢ培地で培養した。クリアゾ
ーンの生成を検出することにより、本発明エステラーゼ
の生産に関らない遺伝子部分を削減したプラスミドpAL1
08を構築した。尚、pAL108には1.7kbのSphI断片が挿入
されていた。
5kbのEcoRI断片を短縮した各種のプラスミドを構築し
た。これらのプラスミドを実施例２に準じた方法により
大腸菌JM109株コンピタント・セル（東洋紡績（株）
製）に導入し形質転換を行なった後、形質転換された大
腸菌をトリブチリン含有ＬＢ培地で培養した。クリアゾ
ーンの生成を検出することにより、本発明エステラーゼ
の生産に関らない遺伝子部分を削減したプラスミドpAL1
08を構築した。尚、pAL108には1.7kbのSphI断片が挿入
されていた。
【００２６】実施例５ （エステラーゼの光学選択性
１） 実施例３及び４により得られた形質転換体を、各々50mg
/Lのアンピシリンと1mMのIPTGを含む100mlのＬＢ培地
で、37℃、16時間培養した後、遠心分離（6000rpm 、10
min ）により集菌し、菌体を回収した。得られた菌体を
20mlの200mMリン酸緩衝液に懸濁し、該懸濁液を1gの（R
S）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロぺ
ニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エステ
ルに作用させ、生成した（Ｓ）−４−ヒドロキシ−３−
メチル−２−（２−プロぺニル）シクロペント−２−エ
ン−１−オンを分析した。尚、（Ｓ）−４−ヒドロキシ
−３−メチル−２−（２−プロぺニル）シクロペント−
２−エン−１−オンの分析は、下記のように行なった。
（RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ペニル）シクロペント−２−エン−１−オンのメチルエ
ステル0.5gと50mMリン酸緩衝液(pH7.0)8.0mlを100mlの
サンプル瓶に入れ、撹拌子で撹拌させながら40℃、10分
間予熱した。これに1.0mlの上記培養物を加え、撹拌子
で撹拌させながら40℃で反応を行った。30分間後、該反
応液を50μlを回収し、1mlのエタノールを添加すること
により反応を停止させた。ブランクは、培養物の代わり
に精製水を用いて同様な方法で試験した。分解率は、ガ
スクロマトグラフィーで計測した。分析用のカラムは、
10% シリコン DC-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度150
℃、インジェクション温度170℃、ディテクション温度1
70℃、検出器はFIDの条件で、GC-14A（（株）島津製作
所製）を用いて分析した。酵素力価は、1分間に、1μmo
lの（RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−
プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オンを遊離
する酵素量を1unitとする。さらに反応液をメチルイソ
ブチルケトンで抽出した後、該抽出物についてＨＰＬＣ
分析により光学純度を測定した。分析には、（株）住化
分析センター製OA-4100 (4.0mmI.D. x 25cm)光学異性体
分析カラムを使用した。溶出液は、ヘキサンと1,2-ジク
ロロエタンとエタノールを100:20:1の割合で混合したも
のを用いることができる。流速は1.0ml/minで、230nmの
吸光度を指標にして光学異性体比を分析した。上記の分
析結果に基づき、加水分解率、光学選択性を算出し、表
３に示した。表３から明らかなように、1.7kb SphI断片
が挿入された形質転換体である大腸菌JM109/pAL108株が
（RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ぺニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エス
テルを不斉加水分解し、（Ｓ）−４−ヒドロキシ−３−
メチル−２−（２−プロぺニル）シクロペント−２−エ
ン−１−オンを産生する能力を有するエステラーゼを産
生することを確認できた。
１） 実施例３及び４により得られた形質転換体を、各々50mg
/Lのアンピシリンと1mMのIPTGを含む100mlのＬＢ培地
で、37℃、16時間培養した後、遠心分離（6000rpm 、10
min ）により集菌し、菌体を回収した。得られた菌体を
20mlの200mMリン酸緩衝液に懸濁し、該懸濁液を1gの（R
S）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロぺ
ニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エステ
ルに作用させ、生成した（Ｓ）−４−ヒドロキシ−３−
メチル−２−（２−プロぺニル）シクロペント−２−エ
ン−１−オンを分析した。尚、（Ｓ）−４−ヒドロキシ
−３−メチル−２−（２−プロぺニル）シクロペント−
２−エン−１−オンの分析は、下記のように行なった。
（RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ペニル）シクロペント−２−エン−１−オンのメチルエ
ステル0.5gと50mMリン酸緩衝液(pH7.0)8.0mlを100mlの
サンプル瓶に入れ、撹拌子で撹拌させながら40℃、10分
間予熱した。これに1.0mlの上記培養物を加え、撹拌子
で撹拌させながら40℃で反応を行った。30分間後、該反
応液を50μlを回収し、1mlのエタノールを添加すること
により反応を停止させた。ブランクは、培養物の代わり
に精製水を用いて同様な方法で試験した。分解率は、ガ
スクロマトグラフィーで計測した。分析用のカラムは、
10% シリコン DC-QF-1 2.6m長を用い、カラム温度150
℃、インジェクション温度170℃、ディテクション温度1
70℃、検出器はFIDの条件で、GC-14A（（株）島津製作
所製）を用いて分析した。酵素力価は、1分間に、1μmo
lの（RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−
プロペニル）シクロペント−２−エン−１−オンを遊離
する酵素量を1unitとする。さらに反応液をメチルイソ
ブチルケトンで抽出した後、該抽出物についてＨＰＬＣ
分析により光学純度を測定した。分析には、（株）住化
分析センター製OA-4100 (4.0mmI.D. x 25cm)光学異性体
分析カラムを使用した。溶出液は、ヘキサンと1,2-ジク
ロロエタンとエタノールを100:20:1の割合で混合したも
のを用いることができる。流速は1.0ml/minで、230nmの
吸光度を指標にして光学異性体比を分析した。上記の分
析結果に基づき、加水分解率、光学選択性を算出し、表
３に示した。表３から明らかなように、1.7kb SphI断片
が挿入された形質転換体である大腸菌JM109/pAL108株が
（RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ぺニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エス
テルを不斉加水分解し、（Ｓ）−４−ヒドロキシ−３−
メチル−２−（２−プロぺニル）シクロペント−２−エ
ン−１−オンを産生する能力を有するエステラーゼを産
生することを確認できた。
【００２７】実施例６ （エステラーゼの光学選択性
２） （RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ピニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エス
テルを基質として、実施例４と同様な検討を行った結果
を、表４に示す。
２） （RS）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ピニル）シクロペント−２−エン−１−オンの酢酸エス
テルを基質として、実施例４と同様な検討を行った結果
を、表４に示す。
【００２８】
【表３】
【００２９】
【表４】
【００３０】
【発明の効果】本発明により、一般式 化６で示される
シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用
して、これを不斉加水分解し、高い光学純度の（Ｓ）−
体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類を産
生する能力をするエステラーゼをコードする遺伝子を提
供することが可能になった。
シクロペンテノロン類の有機カルボン酸エステルに作用
して、これを不斉加水分解し、高い光学純度の（Ｓ）−
体の一般式 化６で示されるシクロペンテノロン類を産
生する能力をするエステラーゼをコードする遺伝子を提
供することが可能になった。
【００３１】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１１７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 生物名：Burkholderia cepacia 株名：SC-20 配列 ATG ATC CCC AAC CGC GCA TCA TCC CGG CAG CCG TCG ACC GAT CCC GCA 48 CTC GCC GAG CGC GTC GAT GCG GTA CTG TCC CGT CAA CTC GAA ACA CAT 96 CGC CTC GTT GGT GTG GTC GTC CTG ATC GCA CGC GAC GGC GAA CTC GTC 144 TAT CGC CGC GCG GCC GGG TTC GCC GAT CGC GAA GCG CGC ACG CCG ATG 192 CGC GAG GAC ACG CTG TTC AGG CTC GCA TCG GTG ACG AAG CCG ATC GTC 240 TCG GCG GCC GCG ATG GCG CTC GTC GCG CAA CAC AAG CTG TCG CTC GAC 288 GAC GAC GTC ACG CGC TGG CTG CCC GAG TTC CGC CCG GCG CTG CGC GAC 336 GGC AGC GTG CCG GTG ATC AGG GTG CGC CAC CTG CTC ACG CAC ACG GCC 384 GGC CTC GGC TAT CGC TTC ACG GAA GCC GAC GCG ACC GGC CCC TAT GCG 432 CGC GCG GGC GCC TCC GAC GGG CTC GAT GCC GCA TCG ATC ACG CTC GCC 480 GAA AAC CTG CGC AGG ATC GCG AGC GTG CCG CTG CAG TTC GCG CCG GGA 528 ACC GGC TGG AAC TAT TCG CTT TCC ATC GAC GTG GTC GGC GCG CTG ATC 576 GAG GCC GTC AGC GGG CTG CCG CTC GCC GAC GCC ATC GAC ACG CTC GTG 624 CTC CGC CCG CTC GGC GCC CGC GAC ACG GGA TTC GTC GCA CGC GAC GCC 672 GCG CGG CTC GCG ACG CCC TAC GTC AAC GAC ACA CCG CAA CCG CAC CGG 720 CTC GCC GAA AAC GAG ACC GTA CCC ATC TTC GAC GGA ACC GTC GGC GTG 768 ACG TAT TCG CCG TCG CGC GCG CTC GAC GCG GAT GCG TTC CCG TCG GGC 816 GGC GCC GGG ATG GTC GGC ACC GCC GGC GAC GTG CTG AAC CTG CTG GAC 864 ACG CTG CGC GCG GGC GGC GGT TCG CTG CTG CCG GCC GAC CTG GTC GAC 912 GAG ATG GGC CGC GCC CAC ACC GGC AAC CTC GAA TTG CCC GAC CTG CCC 960 GGC GCG GGG TTC GGA ATC GGG TTC TCG GTA TTG CGC GAC CCG CTC GCG 1008 GCG GCA TCG CCG GAG TCG GTG GGC ACG TGG CGC TGG GGC GGC GTG TAC 1056 GGG CAT TCG TGG TTC GTC GAC CGC GCC CGG GGG CTC ACC GTC GTG TCG 1104 CTG TCG AAC ACG CTT TAC GAA GGG ATG AAC GGC CAG TAC ACG ATC GAT 1152 CTG CGC GAC GCG ATC TAC GGC GCC GGC 1179
【００３２】配列番号：２ 配列の長さ：３９３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源： 生物名：Burkholderia cepacia 株名：SC-20 配列 1 5 10 15 Met Ile Pro Asn Arg Ala Ser Ser Arg Gln Pro Ser Thr Asp Pro Ala 20 25 30 Leu Ala Glu Arg Val Asp Ala Val Leu Ser Arg Gln Leu Glu Thr His 35 40 45 Arg Leu Val Gly Val Val Val Leu Ile Ala Arg Asp Gly Glu Leu Val 50 55 60 Tyr Arg Arg Ala Ala Gly Phe Ala Asp Arg Glu Ala Arg Thr Pro Met 65 70 75 80 Arg Glu Asp Thr Leu Phe Arg Leu Ala Ser Val Thr Lys Pro Ile Val 85 90 95 Ser Ala Ala Ala Met Ala Leu Val Ala Gln His Lys Leu Ser Leu Asp 100 105 110 Asp Asp Val Thr Arg Trp Leu Pro Glu Phe Arg Pro Ala Leu Arg Asp 115 120 125 Gly Ser Val Pro Val Ile Arg Val Arg His Leu Leu Thr His Thr Ala 130 135 140 Gly Leu Gly Tyr Arg Phe Thr Glu Ala Asp Ala Thr Gly Pro Tyr Ala 145 150 155 160 Arg Ala Gly Ala Ser Asp Gly Leu Asp Ala Ala Ser Ile Thr Leu Ala 165 170 175 Glu Asn Leu Arg Arg Ile Ala Ser Val Pro Leu Gln Phe Ala Pro Gly 180 185 190 Thr Gly Trp Asn Tyr Ser Leu Ser Ile Asp Val Val Gly Ala Leu Ile 195 200 205 Glu Ala Val Ser Gly Leu Pro Leu Ala Asp Ala Ile Asp Thr Leu Val 210 215 220 Leu Arg Pro Leu Gly Ala Arg Asp Thr Gly Phe Val Ala Arg Asp Ala 225 230 235 240 Ala Arg Leu Ala Thr Pro Tyr Val Asn Asp Thr Pro Gln Pro His Arg 245 250 255 Leu Ala Glu Asn Glu Thr Val Pro Ile Phe Asp Gly Thr Val Gly Val 260 265 270 Thr Tyr Ser Pro Ser Arg Ala Leu Asp Ala Asp Ala Phe Pro Ser Gly 275 280 285 Gly Ala Gly Met Val Gly Thr Ala Gly Asp Val Leu Asn Leu Leu Asp 290 295 300 Thr Leu Arg Ala Gly Gly Gly Ser Leu Leu Pro Ala Asp Leu Val Asp 305 310 315 320 Glu Met Gly Arg Ala His Thr Gly Asn Leu Glu Leu Pro Asp Leu Pro 325 330 335 Gly Ala Gly Phe Gly Ile Gly Phe Ser Val Leu Arg Asp Pro Leu Ala 340 345 350 Ala Ala Ser Pro Glu Ser Val Gly Thr Trp Arg Trp Gly Gly Val Tyr 355 360 365 Gly His Ser Trp Phe Val Asp Arg Ala Arg Gly Leu Thr Val Val Ser 370 375 380 Leu Ser Asn Thr Leu Tyr Glu Gly Met Asn Gly Gln Tyr Thr Ile Asp 385 390 393 Leu Arg Asp Ala Ile Tyr Gly Ala Gly
【図１】図１は、本発明プラスミドであるpAL101,pAL10
8の制限酵素地図を表す図である。
8の制限酵素地図を表す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (13)
- 【請求項１】一般式 化１ 【化１】 （式中、Ｒ1は炭素原子１〜１０個のアルキル基、炭素
原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子２〜１０個の
アルキニル基又は炭素原子１〜４個のハロアルキル基を
表す。）で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボ
ン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｓ）−体の一般式
化１で示されるシクロペンテノロン類を産生する能力を
有するエステラーゼをコードし、かつ、配列番号１で示
される塩基配列にハイブリダイズすることを特徴とする
エステラーゼ遺伝子。 - 【請求項２】配列番号１で示される塩基配列とのホモロ
ジーが９０％以上であることを特徴とする請求項１記載
のエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項３】配列番号２で示されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有することを特徴とする請求項１記載
のエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項４】配列番号１で示される塩基配列を有するこ
とを特徴とする請求項１記載のエステラーゼ遺伝子。 - 【請求項５】請求項１、２、３又は４記載のエステラー
ゼ遺伝子を含有することを特徴とするプラスミド。 - 【請求項６】請求項５記載のプラスミドにより形質転換
されたことを特徴とする形質転換体。 - 【請求項７】形質転換体が微生物であることを特徴とす
る請求項６記載の形質転換体。 - 【請求項８】請求項１、２、３又は４記載のエステラー
ゼ遺伝子を有する微生物が産生することを特徴とするエ
ステラーゼ。 - 【請求項９】請求項１、２、３又は４記載のエステラー
ゼ遺伝子を有する微生物が請求項６記載の形質転換体で
あることを特徴とする請求項８記載のエステラーゼ。 - 【請求項１０】請求項６記載の形質転換体を培養するこ
とにより、一般式 化２ 【化２】 （式中、Ｒ1は炭素原子１〜１０個のアルキル基、炭素
原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子２〜１０個の
アルキニル基又は炭素原子１〜４個のハロアルキル基を
表す。）で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボ
ン酸エステルを不斉加水分解し、（Ｓ）−体の一般式
化２で示されるシクロペンテノロン類を産生する能力を
有するエステラーゼを産生することを特徴とするエステ
ラーゼの製造方法。 - 【請求項１１】請求項８記載のエステラーゼを一般式
化３ 【化３】 （式中、Ｒ1は炭素原子１〜１０個のアルキル基、炭素
原子２〜１０個のアルケニル基、炭素原子２〜１０個の
アルキニル基又は炭素原子１〜４個のハロアルキル基を
表す。）で示されるシクロペンテノロン類の有機カルボ
ン酸エステルに作用させて、該エステルを不斉加水分解
して、（Ｓ）−体の一般式 化３で示されるシクロペン
テノロン類とその対掌体のエステルに分割することを特
徴とする一般式 化３で示されるシクロペンテノロン類
の光学分割方法。 - 【請求項１２】一般式 化３で示されるシクロペンテノ
ロン類が４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ペニル）シクロペント−２−エン−１−オンである請求
項１１記載のシクロペンテノロン類光学分割方法。 - 【請求項１３】一般式 化３で示されるシクロペンテノ
ロン類が４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（２−プロ
ピニル）シクロペント−２−エン−１−オンである請求
項１１記載のシクロペンテノロン類光学分割方法。
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