JPH10227794A - 粒子を使用する被検物質の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】赤血球などの判定を妨げる物質を含む血液試料
等の試料においても、試料中の被検物質の有無の判定を
妨害を受けることなく短時間に行うことが可能であり、
しかもその判定の信頼性が高い被検物質の測定方法を提
供する。 【構成】試料中の被検物質に対する特異的結合物質が固
定されて該特異的結合物質により被覆された面を有する
担体の該面に試料を接触させる工程、前記面に接触させ
た試料を除去する工程、被検物質に対する特異的結合物
質であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一
又は異なる特異的結合物質が固定された粒子を試料を除
去した前記面に接触させる工程、及び前記粒子を前記面
に沿って移動させる工程を含んでなり、前記面における
粒子の分布状態から被検物質の有無を判定することを特
徴とするものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検物質に対する
特異的結合物質を固定した粒子を用いて試料中の被検物
質を測定する方法に関し、特に血液試料等の試料中に含
まれる微量の被検物質までも妨害物質の影響を受けずに
短時間且つ簡便に測定を行うことが可能な被検物質の測
定方法に関する。本発明は、臨床検査分野等の生命科学
分野において有用である。

【０００２】

【従来の技術】抗原と抗体、糖とレクチン、ヌクレオチ
ド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖、リガンドとレセ
プター等の特異的な親和性を有する物質間の反応を利用
した試料中に含まれる微量の被検物質の測定方法は種々
のものが知られている。

【０００３】中でも、抗原と抗体の間の抗原抗体反応
（免疫反応）を利用した免疫学的測定方法は広く実施さ
れている。この免疫学的測定方法のうち間接凝集反応測
定法は簡易かつ安価な方法であることから汎用されてい
る。

【０００４】この間接凝集反応測定法は、被検物質に対
する抗体（被検物質が抗体の場合は抗原を使用すること
も可能）を結合した粒子（ラテックス粒子若しくはゼラ
チン粒子等の高分子粒子又は赤血球等）と被検物質を含
むと推定される試料を、マイクロタイタープレート等の
底面がＵ字状又はＶ字状になった測定容器内で混合し、
反応させて、生じた被検物質を介した粒子間の凝集像を
観察することにより、試料中の被検物質の存在の有無を
判定するものである。

【０００５】図６は、この間接凝集反応測定法により試
料中の被検物質の測定を行なった場合の凝集像を示した
ものである。試料中に被検物質が存在しない（陰性）場
合、抗体（又は抗原）を結合した粒子は凝集を起こさな
いので重力によりそのまま沈降し、Ｕ字状又はＶ字状等
の測定容器の内壁面に沿って転がり落ちて（滑り落ち
て）測定容器の底面中央部に集まる。従って、陰性の場
合、測定容器の上方から見ると、測定容器の底面中央部
に粒子が収束した像が観察される（図６のＡ）。一方、
試料中に被検物質が存在する（陽性）場合、抗体（又は
抗原）が結合した粒子は被検物質を介して三次元的な凝
集を起こして凝集塊を生成する。この凝集塊は、凝集を
起こしていない粒子に比べると測定容器の内壁面上を転
がり難く（滑り落ち難く）、転がり速度（滑り落ち速
度）が小さいので、測定容器の内壁面に広がった状態で
止まる。従って、陽性の場合、測定容器の上方から見る
と、粒子が測定容器底面に広がった状態、即ち「ボタ
ン」状の凝集像が観察でき（図６のＢ）、試料中に被検
物質が存在することが確認できる。

【０００６】しかしながら、この間接凝集反応測定法
は、試料中の被検物質の存在の有無、つまり陽性又は陰
性かを測定容器底面の粒子による円形の像の大小によっ
て判定するものである。したがって、被検物質の濃度が
低い試料の場合、測定容器底面中央部には被検物質を介
して凝集した粒子と被検物質とは結合していない粒子の
両方が混在していて、且つ凝集像の円が小さいので、陰
性の場合との判別が困難であった。そして、この被検物
質の濃度が低い試料の場合の判定の困難さゆえ、低濃度
の被検物質を測定することができず、また時間をかけて
凝集像を十分形成させてから判定しようとするため測定
に要する時間が長くなり、通常測定時間は１時間以上で
あった。

【０００７】また、間接凝集反応測定法では、被検物質
以外の試料中の成分を介して、抗体（又は抗原）を結合
した粒子が凝集したり、或いは抗体（又は抗原）を結合
した粒子が測定容器の内壁面に結合して、試料中に被検
物質が存在しない（陰性）にもかかわらずあたかも被検
物質が存在する（陽性）ような凝集像を示す場合があっ
た（非特異的凝集反応）。このように陰性の試料を陽性
と誤って判定する可能性があるということは、臨床検査
による疾病の診断においては重大な問題となっていた。

【０００８】これに対し、特開昭64-69954号公報には、
検体試料中の被検物質である抗原又は抗体に対応する抗
体又は抗原を内壁に固定させた測定容器に検体試料を加
え、同時に又は次いでこの検体試料を洗浄することなく
測定容器に固定させたものと同一の抗体又は抗原或いは
特異的結合の類縁体を固定させた不溶性担体粒子を測定
容器に加え、発現する凝集反応の有無により検体試料中
の被検物質である抗原又は抗体の有無を判定する免疫学
的測定方法が開示されている。この測定方法において検
体試料中に被検物質である抗原（又は抗体）が存在しな
い（陰性）場合の測定容器内の状態を上方から見ると、
図６のＡに示した凝集像と同様の像が観察される。ま
た、検体試料中に被検物質である抗原（又は抗体）が存
在する（陽性）場合に測定容器内の状態を上方から見る
と、図６のＢに示した凝集像と同様の像が観察される。

【０００９】上記特開昭64-69954号公報に記載の測定方
法は、低濃度の被検物質を測定することができ、地帯現
象を抑制でき、かつ短時間で明瞭な凝集像が得られる方
法であるが、試料中の被検物質の存在の有無を測定容器
底面の粒子による円形の像の大小によって判定するもの
であるので、被検物質の濃度が著しく低い試料の場合に
は陰性の場合との判別が困難であるとの問題は避け得な
いものであった。

【００１０】また、特開平2-124464号公報には、被測定
物質（被検物質）に特異的に結合するか又はこれと競合
する物質（抗体又は抗原等）を磁性粒子に固定化した磁
性マーカー粒子とサンプル溶液（試料）とを混合し、こ
の反応溶液に対し測定容器の所定の壁面領域の外側に配
置した磁石を作用させ、これにより所定の壁面領域に集
められた磁性マーカー粒子の分布状態に基づいてサンプ
ル中の被測定物質を測定する免疫学的測定方法が開示さ
れている。この測定方法においてサンプル中に被測定物
質が存在しない（陰性）場合に測定容器内の状態を上方
から見ると、図６のＡに示した凝集像と同様の像が観察
され、サンプル中に被測定物質が存在する（陽性）場合
に測定容器内の状態を上方から見ると図６のＢに示した
凝集像と同様の像が観察される。

【００１１】この特開平2-124464号公報に記載の測定方
法によれば、磁性粒子を磁石により測定容器底面に引き
寄せて磁性粒子の沈降速度を増大させることにより、測
定容器底面の凝集像の形成を短時間で行わせ、判定に要
する時間を短縮することができる。しかし、やはり試料
中の被検物質の存在の有無を測定容器底面の粒子による
円形の像の大小によって判定するものであるので、被検
物質の濃度が低い試料の場合には陰性の場合との判別が
困難であるとの点では変わりのないものであった。

【００１２】また、従来の間接凝集反応測定法、特開昭
64-69954号公報に記載の測定方法及び特開平2-124464号
公報に記載の測定方法は、いずれも試料中の被検物質の
存在の有無を測定容器底面の粒子による円形の像の大小
によって判定するものであるので、試料が血液（全血試
料）である場合、血液試料中の赤血球も粒子と共に重力
により測定容器の内壁面上を転がり落ちて（滑り落ち
て）しまい、その血液試料中の被検物質の測定を行なう
と、粒子の分布状態がその試料中に含まれる赤血球によ
り遮られて確認できず、陽性、陰性の判定が困難になる
という問題が存在した。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、特異的結合反応を利用して試料中の被検物質を目視
又は機器を用いて測定する際に、赤血球などの判定を妨
げる物質を含む血液試料や糞便等の試料においても、被
検物質の存在の有無の判定を妨害を受けることなく短時
間に行うことが可能であり、しかもその判定の信頼性が
高い測定方法を提供することである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の被検
物質に対する特異的結合物質が固定されて該特異的結合
物質により被覆された面を有する担体の該面に試料を接
触させる工程、前記面に接触させた試料を除去する工
程、被検物質に対する特異的結合物質であって前記担体
に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結
合物質が固定された粒子を試料を除去した前記面に接触
させる工程、及び前記粒子を前記面に沿って移動させる
工程を含んでなり、前記面における粒子の分布状態から
被検物質の有無を判定することを特徴とする、試料中の
被検物質の測定方法（第１の測定方法）である。

【００１５】また、本発明は、試料中の被検物質に対す
る特異的結合物質が固定されて該特異的結合物質により
被覆された面を有する担体の該面に、被検物質に対する
特異的結合物質であって前記担体に固定された特異的結
合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された粒
子及び試料を混合した後の混合物を接触させる工程、前
記面に接触させた粒子及び試料の混合物を除去する工
程、更に被検物質に対する特異的結合物質であって前記
担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特異
的結合物質が固定された粒子を前記面に接触させる工
程、及び前記粒子を前記面に沿って移動させる工程を含
んでなり、前記面における粒子の分布状態から被検物質
の有無を判定することを特徴とする、試料中の被検物質
の測定方法（第２の測定方法）である。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明において測定を行う被検物
質としては、タンパク質、糖質、脂質、核酸のような有
機物質、無機物質等の生体関連物質であればいずれのも
のでもよい。具体的には、ＨＢｓ抗原、抗ＨＢｓ抗体、
ＨＢｅ抗原、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗ＨＣＶ抗
体、抗ＨＩＶ抗体、抗ＡＴＬＶ抗体等のウイルス関連の
抗原又は抗体；大腸菌Ｏ１５７抗原、抗トレポネーマ・
パリダム（ＴＰ）抗体、抗マイコプラズマ抗体、抗スト
レプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）等の細菌関連の抗原又は
抗体；免疫グロブリンＧ(IgG）、免疫グロブリンＡ(Ig
A) 、免疫グロブリンＭ(IgM) 、若しくは免疫グロブリ
ンＥ(IgE) 等の免疫グロブリン；Ｃ反応性タンパク質
（CRP)、α1-酸性糖タンパク質、ハプトグロビン、補体
Ｃ3 、補体Ｃ4 、リウマトイド因子等の炎症マーカー；
α−フェトプロテイン、ＣＥＡ、ＣＡ19-9等の腫瘍マー
カー；ヒト胎盤絨毛性ゴナドトロピン等のホルモン；ア
レルゲン、アレルゲン特異IgE 抗体等のアレルギー関連
の抗原又は抗体；抗トロンビンＩＩＩ(ATIII) 等の血液
凝固系関連物質；フィブリン体分解物(FDP) 、Ｄダイマ
ー等の線溶系関連物質；ＡＢＯ式血液型抗体、不規則抗
体等の血液型関連の抗原又は抗体；ウイルスのＤＮＡ又
はＲＮＡ；細菌のＤＮＡ又はＲＮＡ；ヒト等の動物若し
くは植物のＤＮＡ又はＲＮＡ；リポタンパク質(a) 等の
他の疾病に関連した物質又は薬物等を例示することがで
きる。

【００１７】本発明において、試料とは、前記の被検物
質が存在する可能性があり、且つその被検物質の存在の
有無の確認又は場合によっては定量を行おうとする液状
のものをいう。例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血
漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体
液；ヒト若しくは動物の脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、
筋肉、又は神経組織等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の
抽出液又は懸濁液；細胞或いは菌体の抽出液；植物の抽
出液等が挙げられる。

【００１８】本発明において、被検物質に対する特異的
結合物質（以下、単に特異的結合物質という。）とは被
検物質に対し親和性を有する物質をいい、被検物質との
特異的な相互作用により該被検物質に非共有結合的に安
定に結合する物質をいう。例えば、特異的結合物質は、
被検物質が抗原の場合にはその抗体であり、被検物質が
抗体の場合にはその抗原又はその抗体に対する抗体であ
り、被検物質がヌクレオチド鎖の場合にはそれと相補的
なヌクレオチド鎖である。また、被検物質がリガンドの
場合にはそのレセプターである。粒子に固定する特異的
結合物質と、担体に固定する特異的結合物質は、被検物
質を介しての結合が可能であれば、それぞれ同一でも異
なってもよい。

【００１９】本発明に用いられる粒子としては、一般に
間接凝集反応に用いられる粒子でよい。例えば、リポソ
−ム、ラテックス粒子、ゼラチン粒子、ポリアクリルア
ミド粒子、マイクロカプセル、エマルジョン等の有機高
分子粒子、ガラスビ−ズ、シリカビ−ズ、ベントナイト
等の無機高分子粒子、他の人工粒子、及び赤血球等を挙
げることができる。

【００２０】また、粒子として磁性粒子を用いることも
できる。この磁性粒子は、少なくとも外部から磁石を作
用させている間は磁化する粒子であればよい。この磁性
粒子としては、例えば、鉄、コバルト、ニッケル等の強
磁性金属、これらの強磁性金属を含む合金、非磁性体中
に強磁性金属又は強磁性金属を含む合金を含有するも
の、強磁性金属中又は強磁性金属を含む合金中に非磁性
体を含有するもの等の強磁性体を単独で粒子状に成形し
た粒子、強磁性体を核としてその表面をポリスチレン、
シリカゲル、ゼラチン、ポリアクリルアミド等の高分子
物質で被覆した粒子、ポリスチレン、シリカゲル、ゼラ
チン、ポリアクリルアミド等の高分子物質の粒子を核と
して強磁性体を被覆した粒子、赤血球、リポソーム又は
マイクロカプセル等の閉じた袋状の物質に強磁性体を封
入した粒子等を挙げることができる。なお、この磁性粒
子は、外部から磁石を作用させている間は磁化し、外部
からの磁石の遮断により速やかに減磁する性質を持つも
のであることが特に好ましく、そのような磁性粒子とし
ては、例えば、強磁性体である酸化鉄(III) (Fe2O3)を
粒子内に分散させた磁性粒子である「Dynabeads M-450
uncoated（商品名）（ダイナル社製）」が挙げられる。

【００２１】更に、粒子としては、色素を被覆するか又
は色素を粒子中に分散若しくは封入させることにより着
色したものを使用してもよい。

【００２２】粒子の粒子径は、好ましくは0.01〜100 μ
ｍであり、特に好ましくは 0.5〜10μｍである。また、
粒子の比重は、分散媒中で沈降する比重であれば良く、
例えば比重１〜１０のものが好ましい。

【００２３】本発明においては、特異的結合物質を固定
した粒子を用いるが、特異的結合物質を粒子に固定する
には、特異的結合物質を前記の粒子の表面に、疎水結
合、親水吸着等の物理的吸着法、共有結合等の化学的結
合法又はこれらの方法の併用などにより行うことができ
る。

【００２４】特異的結合物質の粒子への固定を物理的吸
着法により行う場合は、公知の方法に従って、該特異的
結合物質と粒子とを緩衝液等の溶液中で混合し接触させ
ることにより行うことができる。例えば、特異的結合物
質と粒子を緩衝液等の溶液中で混合し撹拌することによ
り接触させ、約２℃〜約40℃で約10分〜約１日間吸着反
応を行わせた後、得られた粒子を緩衝液等で洗浄すれば
よい。

【００２５】また、特異的結合物質の粒子への固定を架
橋試薬による化学的結合法によって行う場合は、日本臨
床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第53号 臨床検査
のためのイムノアッセイ−技術と応用−」, 臨床病理刊
行会, 1983年、日本生化学会編「新生化学実験講座１
タンパク質IV」, 東京化学同人, 1991年等に記載の公知
の方法に従い、特異的結合物質と粒子をグルタルアルデ
ヒド、カルボジイミド、イミドエステル、マレイミド等
の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、特異的結合物質
と粒子のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオー
ル基、アルデヒド基、水酸基等の官能基を架橋試薬と反
応させることにより固定することができる。例えば、粒
子を含む緩衝液等にグルタルアルデヒド、カルボジイミ
ド、イミドエステル、マレイミド等の二価性の架橋試薬
を加え、撹拌し反応させる。次にこれに特異的結合物質
を加え、撹拌して反応させる。場合によっては、その後
これに透析、ゲルろ過などの処理により架橋試薬を除く
か若しくは架橋反応の反応停止剤を添加すること等によ
り反応を停止させる。そして、得られた粒子を緩衝液等
で洗浄すればよい。

【００２６】また、特異的結合物質の粒子への固定量を
変更することにより、試料中の被検物質の濃度の高低に
応じて容易に感度を変更することができる。例えば、粒
子に特異的結合物質を固定する際に、高濃度の特異的結
合物質を用いれば固定量が多くなって感度を高めること
ができる。

【００２７】必要があれば非特異的反応を抑制するた
め、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイ
ン又はその塩などの各種タンパク質、脱脂粉乳等を特異
的結合物質を固定した粒子に接触させること等の公知の
方法により、該粒子をマスキングしてもよい。例えば、
マスキングは特異的結合物質を固定した粒子をウシ血清
アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン又はその塩
などの各種タンパク質などを含む緩衝液等に加え静置
し、該粒子の表面を各種タンパク質等でコーティングす
ることにより行うことができる。

【００２８】本発明において、担体としては、特異的結
合物質を固定することにより該特異的結合物質により被
覆された面を有する担体を使用する。担体としては特異
的結合物質により被覆された面を有しており、該面に試
料等の溶液（液体）を接触させることができる限りいず
れの形状、構造でもよく、例えば、容器や、板状体など
が挙げられる。

【００２９】担体として容器を用いる場合、溶液収納部
分である凹部の形状は半球状、円筒形状、直方体形状等
いずれの形状でもよく、その凹部の内壁面を特異的結合
物質により被覆すればよい。凹部の形状が円筒形状、直
方体形状等の平底面を有する形状である場合には、その
平底面を特異的結合物質により被覆するのが好ましい。
容器は凹部が複数存在していてもよい。容器としては、
平底面を有する凹部を少なくとも一つ備えた容器であっ
て、その平底面が特異的結合物質により被覆されている
のが好ましい。平底面を有する凹部を少なくとも一つ備
えた容器としては、例えば、平底マイクロプレート、ト
レイ等が挙げられる。

【００３０】担体として板状体を使用する場合、板状体
の表面形状は円形、長方形、正方形等いずれの形状であ
ってもよく、その表面を特異的結合物質により被覆すれ
ばよい。また、板状体の表面に溝を作って該溝に試料等
の溶液を導入することにより溶液が表面から流れ落ちる
のを防ぐこともできる。

【００３１】担体の材質は、特異的結合物質を物理的又
は化学的に固定できるものであれば何ら制限されず、例
えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリア
クリレート、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレ
ン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート等が挙げら
れる。

【００３２】本発明においては、担体の面に特異的結合
物質を固定する場合、該面が部分的に該特異的結合物質
により被覆されるように固定するのが好ましい。これ
は、試料中に被検物質が存在する場合、即ち陽性の場合
に特異的結合物質で被覆した部分と被覆していない部分
の像の比較によって陽性であることの判断がより明確と
なり、陽性と陰性の判別、つまり試料中の被検物質の有
無の判別が容易になるからである。ここで、「部分的」
とは、特異的結合物質が偏在しており、面全体にわたっ
て特異的結合物質により被覆されていないことをいう。
特異的結合物質により被覆された部分の形状及び面積
は、試料中の被検物質の存在の有無を判定することがで
きる限り特に制限はない。部分的被覆の例としては、担
体の面の片側半分を被覆したり、担体の面に帯状に被覆
したりする場合が挙げられる。

【００３３】また、担体の面を特異的結合物質により部
分的に被覆する場合、その被覆部分は複数存在していて
もよく、例えば、試料中の複数の被検物質を測定するた
めに、担体の面にそれぞれの被検物質に対する特異的結
合物質による被覆部分を設けることができる。

【００３４】図１は、本発明において担体として用いる
平底マイクロプレートであって、各ウェルの平底面の片
側半分が特異的結合物質により被覆されているものを示
したものである。図１のＡは平底マイクロプレートの斜
視図であり（斜線部は前記特異的結合物質により被覆さ
れた部分である。）、図１のＢは平底マイクロプレート
の平面図である（斜線部は前記特異的結合物質により被
覆された部分である。）。

【００３５】図２は、底面が長方形の直方体型透明容器
であって、特異的結合物質により帯状に被覆されている
部分（以下、帯状被覆部分という。）を有する底面を有
するものを示したものである。図２のＡは該容器の斜視
図であり（斜線部は前記特異的結合物質により被覆され
た部分である。）、図２のＢは該容器の平面図である
（斜線部は前記特異的結合物質により被覆された部分で
ある。）。

【００３６】図３は、表面形状が長方形の板状体であっ
て、異なる２種類の特異的結合物質による帯状被覆部分
を有する表面を有するものを示したものである。図３の
Ａは、該板状体の斜視図（斜線部は、それぞれ異なる特
異的結合物質により被覆された部分である。）であり、
図３のＢは該板状体の平面図である（斜線部は、それぞ
れ異なる特異的結合物質により被覆された部分であ
る。）。

【００３７】図４は、表面形状が長方形の板状体であっ
て該表面に断面形状が矩形の溝が設けられており、該溝
の底面に異なる２種類の特異的結合物質による帯状被覆
部分を形成したものを示したものである。図４のＡは、
そのような板状体の斜視図（斜線部は、それぞれ異なる
特異的結合物質により被覆された部分である。）であ
り、図４のＢはそのような板状体の平面図である（斜線
部は、それぞれ異なる特異的結合物質により被覆された
部分である。）。また、溝の帯状被覆部分側に板を載せ
ること等によりカバーすると（図４のＡ参照）、カバー
されていない側の溝に滴下された試料は毛細管現象で帯
状被覆部分の方向に移動するので好ましい。

【００３８】特異的結合物質の担体の面への固定化は、
疎水結合、親水吸着等の物理的吸着法又は架橋試薬によ
る化学的結合法によって行うことができる。物理的吸着
法による場合は、公知の方法に従い、緩衝液等に溶解し
た特異的結合物質と担体の面とを接触させることにより
行うことができる。例えば、担体が容器の場合、緩衝液
等に溶解した特異的結合物質を該容器の凹部に入れて静
置することにより接触させ、約２℃〜約40℃で約10分〜
約１日間吸着反応を行わせた後、凹部の液を吸引除去
し、緩衝液等で洗浄すればよい。

【００３９】また、架橋試薬による化学的結合法により
行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特
集第53号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応
用−」, 臨床病理刊行会, 1983年、日本生化学会編「新
生化学実験講座１ タンパク質IV」, 東京化学同人, 19
91年等に記載の公知の方法に従い、被検物質に対する特
異的結合物質と担体をグルタルアルデヒド、カルボジイ
ミド、イミドエステル、マレイミド等の二価性の架橋試
薬と混合、接触させ、特異的結合物質と担体のそれぞれ
のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド
基、水酸基等と反応させることにより固定することがで
きる。例えば、担体が容器の場合、該容器の凹部にグル
タルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル、マ
レイミド等の二価性の架橋試薬を加え、静置して反応さ
せる。次いでこれに特異的結合物質を加えて静置するこ
とにより反応させる。場合によっては、その後これに架
橋反応の反応停止剤を添加すること等により反応を停止
させる。そして、緩衝液等で洗浄を行う。

【００４０】また、本発明において、担体の面を部分的
に被覆する方法としては、例えば、面の特異的結合物質
により被覆したい部分にのみ特異的結合物質及び／又は
架橋試薬を滴下して上記方法により固定化を行なう方
法、面の特異的結合物質により被覆したい部分の周囲を
プラスチック板等で囲ってこの囲まれた部分に特異的結
合物質及び／又は架橋試薬を滴下して上記固定化を行な
う方法、或いはスポンジ等の吸収体に特異的結合物質及
び／又は架橋試薬を吸収させ、面の特異的結合物質によ
り被覆したい部分に置いて接触させたり又は塗布して上
記固定化を行なう方法などが挙げられる。

【００４１】また、特異的結合物質の担体の面への固定
量を変更することにより、試料中の被検物質の濃度の高
低に応じて容易に感度を変更することができる。例え
ば、担体に特異的結合物質を固定する際に、高濃度の特
異的結合物質を用いれば固定量が多くなって感度を高め
ることができる。

【００４２】更に、必要があれば非特異的反応を抑制す
るため、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カ
ゼイン若しくはその塩などの各種タンパク質、脱脂粉乳
等を特異的結合物質を固定した担体に接触させること等
の公知の方法により、特異的結合物質を固定した担体を
マスキングしてもよい。例えば、担体が容器である場合
には、特異的結合物質を固定した該容器の凹部にウシ血
清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン又はその
塩などの各種タンパク質などを含む緩衝液等を加えて静
置し、特異的結合物質を固定した容器の凹部の表面を各
種タンパク質等でコーティングした後、凹部の液を吸引
除去することにより行うことができる。

【００４３】本発明による第１の測定方法においては、
まず、上記のように特異的結合物質を固定して該特異的
結合物質により被覆した面を有する担体の該面に被検物
質の存在が疑われる試料を接触させる。

【００４４】担体が例えば上記したような容器の場合に
は、該容器の凹部に試料を添加することにより容器の内
壁面と試料とを接触させることができる。また、担体が
例えば上記したような板状体の場合には、該板状体の表
面に試料を滴下したりすることにより接触させればよ
い。

【００４５】試料は、例えば希釈液により希釈して担体
に接触させることができる。試料の希釈液としては、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸
緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等の各種緩衝液又は生理
食塩水等を用いることができる。なお、この緩衝液のpH
については、pH４〜12の範囲内にあることが好ましい。

【００４６】また、試料の希釈液には、ウシ血清アルブ
ミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン、又はその塩など
の各種タンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各
種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血
清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤、非イオン性界
面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性
剤などの各種界面活性剤等の添加剤を適宜加えて用いる
ことができる。

【００４７】そして、これらの添加剤を加える際の濃度
は特に限定されるものではないが、0.001 〜10％(w/v)
が好ましく、特に0.01〜５％(w/v) が好ましい。

【００４８】また、界面活性剤としては、ソルビタン脂
肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセ
リン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂
肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エ
ステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン
フィトステロール、ポリオキシエチレンフィトスタノー
ル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポ
リオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油、ポリオキシ
エチレンラノリン等の非イオン性界面活性剤、酢酸ベタ
インなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレンアル
キルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げ
ることができる。

【００４９】上記のように、担体の面に試料を接触させ
た後、この面に接触させた試料を除去する。この担体の
特異的結合物質が被覆された面に接触させた試料の除去
は、吸水性材料よりなる試料吸収体を担体の面上の試料
に接触させて試料を吸収させたり、ピペットなどで担体
の面上の試料を吸い取ったり、又は担体を裏返して試料
を下に落とすこと等により行うことができる。

【００５０】なお、吸水性材料よりなる試料吸収体を担
体の面上の試料に接触させて試料を吸収させたり、ピペ
ットなどで担体の面上の試料を吸い取って面に接触させ
た試料の除去を行う場合には、試料が特異的結合物質が
被覆された部分の上を移動するように、面の特異的結合
物質が被覆された部分の水平方向から試料を吸収させた
り、吸い取ることが好ましい。このようにした場合に
は、より高感度に被検物質を測定することができる。

【００５１】この吸水性材料よりなる試料吸収体として
は、ろ紙、ペーパータオル若しくはティッシュペーパー
などの紙類、レーヨン若しくはポリエステルなどの化学
繊維、布、不織布又は綿等の液体を吸収する性質を持つ
材料よりなるものを用いることができる。なお、この試
料吸収体の形状、大きさについては特に制限はない。こ
のように面に接触させた試料を除去すると、試料が血液
試料（全血試料）の場合、除去により血液試料中の赤血
球は担体の面における特異的結合物質による被覆部分上
より除去される。これに対して、血液試料中の被検物質
は担体の面に固定された特異的結合物質に結合して残
る。そして更にこの結合した被検物質に特異的結合物質
が固定された粒子が結合するので、この結合した粒子の
分布状態を赤血球に遮られずに明確に確認することがで
きるものである。

【００５２】なお、面に接触させた試料を除去した後
に、上記の試料の希釈液又は緩衝液等でこの担体の面を
洗浄しても良い。

【００５３】上記のように、面に接触させた試料を除去
した後に、被検物質に対する特異的結合物質であって前
記担体に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特
異的結合物質が固定された粒子を試料を除去した担体の
面に接触させる。なお、試料中の複数の被検物質を測定
する場合には、それぞれの被検物質に対する特異的結合
物質を固定した粒子を接触させる。

【００５４】また、特異的結合物質を固定した粒子のか
わりに、被検物質又はその類縁体を固定させた粒子を用
いても良い。ここで、被検物質の類縁体とは、被検物質
の一部分、被検物質に別の物質が結合したもの、被検物
質の構造の一部分が置換されたもの等であって、被検物
質の特異的結合物質と結合する部分の構造を有し、特異
的結合物質に結合することができる物質のことである。

【００５５】また、粒子は、例えば適当な分散媒に分散
して担体に接触させることができる。粒子の分散媒とし
ては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等の各種緩衝
液又は生理食塩水等を用いることができる。なお、この
緩衝液のpHについては、pH４〜12の範囲内にあることが
好ましい。

【００５６】また、この粒子の分散媒には、上記の試料
の希釈液の項で記載した添加剤をそれぞれ適宜加えて用
いることができる。そして、これらの添加剤を加える際
の濃度は特に限定されるものではないが、0.001 〜10％
(w/v) が好ましく、特に0.01〜５％(w/v) が好ましい。

【００５７】上記のように、担体の面に粒子を接触させ
た後、粒子を担体の特異的結合物質により被覆された面
に沿って移動させる。この面に沿って粒子を移動させる
ことは、磁石を作用させることにより行ったり、担体を
傾けること等により行うことができる。

【００５８】磁石を作用させることにより粒子を移動さ
せる場合、粒子は上記の磁性粒子を使用する。そして、
この磁性粒子が特異的結合物質により被覆された面に沿
って移動するように磁石を作用させる。

【００５９】なお、担体の面上の磁性粒子の分布状態に
より陽性又は陰性の判定を行なうことができる限り、担
体の面に磁性粒子を接触させる前又は接触させている間
に磁石を作用させてもよい。

【００６０】担体の面全体が特異的結合物質により被覆
されている場合には、磁性粒子をその面に沿って移動さ
せることができる位置であれば、どこに磁石を配置して
もよく、例えば、面が平面である場合には、その同一平
面上に磁石を配置すればよい。

【００６１】また、担体の面が部分的に特異的結合物質
により被覆されている場合には、磁性粒子を移動させた
い方向に移動させることができる位置であればどこに磁
石を配置してもよく、例えば、移動させたい方向やその
周辺に配置すればよい。より具体的には、例えば、面の
片側半分を特異的結合物質により被覆した担体を用いた
場合、面の特異的結合物質により被覆されていない部分
から被覆されている部分の方向（図１の矢印方向）に磁
性粒子が移動するように磁石を配置するのが好ましい。

【００６２】また、面が特異的結合物質により帯状に被
覆されている担体を用いた場合は、面の特異的結合物質
により被覆されていない部分からその帯状被覆部分を通
って特異的結合物質により被覆されていない部分の方向
（図２〜４の矢印方向）に磁性粒子が移動するように磁
石を配置するのが好ましい。

【００６３】磁石としては、磁場を発生して磁性粒子を
磁化するものであればいずれのものでもよく、永久磁
石、電磁石等を用いればよい。また、磁束密度は、用い
る磁性粒子と担体の面との相互作用に依存するが、通
常、５〜100 ガウスである。

【００６４】試料に被検物質が存在する場合、該被検物
質は担体に固定された特異的結合物質に結合する。この
場合磁性粒子に磁石を作用させると、該磁性粒子は磁石
に吸引されて担体の面に沿って該磁石の方向に移動する
が、その過程で面に固定された特異的結合物質に結合し
た被検物質に出会うと、該磁性粒子は被検物質及びこれ
に結合している特異的結合物質を介して担体に結合して
移動を停止するか又は移動が著しく遅くなる。

【００６５】面の特異的結合物質が固定されていない領
域では、磁性粒子の移動は該粒子と面との相互作用及び
磁場の強さに依存して磁石の方向にすみやかに移動す
る。一方、面の特異的結合物質が固定されている領域で
は、該面に固定されている特異的結合物質に被検物質が
結合している場合と結合していない場合とでは磁性粒子
の移動速度に大きな差を生じる。

【００６６】即ち、試料中に被検物質が存在しない場
合、面に固定されている特異的結合物質は被検物質を結
合しないので、磁性粒子は親和性を示さず、特異的結合
物質が固定されていない領域と同様にすみやかに磁石の
方向に移動する。従って、試料中に被検物質が存在しな
い場合、磁性粒子は磁石に近い位置、即ち担体の面の端
部に集まる。

【００６７】一方、試料中に被検物質が存在する場合、
面に固定されている特異的結合物質は被検物質を結合す
るので、磁性粒子は被検物質及び特異的結合物質を介し
て担体に結合して移動が停止又は著しく遅くなる。従っ
て、試料中に被検物質が存在する場合、磁性粒子はその
面の特異的結合物質で被覆された部分に集まる。

【００６８】なお、担体として容器を使用した場合、容
器に添加された磁性粒子はその比重により容器の凹部の
下方に沈降する。この際、容器の上部から底面方向に磁
石を作用させることにより磁性粒子の沈降を促進しても
よい。

【００６９】担体の特異的結合物質被覆面に沿って移動
するように磁性粒子に磁石を作用させる場合、磁性粒子
と被検物質が結合していない該面との相互作用は弱く、
その移動速度はほぼ磁場の強さに依存する。従って、大
きな移動速度を必要とする場合、すなわち短時間で測定
結果を求めるときには強い磁場を発生する磁石を使用す
ればよい。また、電磁石を用いて磁場の強さを調節しな
がら測定を行うことも可能である。

【００７０】担体を傾けることにより移動させる場合、
粒子が担体の特異的結合物質により被覆された面に沿っ
て移動するように担体を傾ける。なお、担体を傾ける角
度は、粒子が重力によって担体の特異的結合物質により
被覆された面に沿って移動するような角度であればよ
く、90゜以下の角度を適宜選択すればよいが、25゜から
90゜の間の角度が好ましく、特に45゜から65゜の間の角
度が好ましい。

【００７１】また、担体の面上の粒子の分布状態により
陽性又は陰性の判定を行なうことができる限り、担体の
面に粒子を接触させる前又は接触させている間に担体を
傾けてもよい。

【００７２】担体の面全体が特異的結合物質により被覆
されている場合には、担体を傾ける方向はいずれの方向
でもよい。

【００７３】また、担体の面が部分的に特異的結合物質
により被覆されている場合には、粒子が担体の特異的結
合物質により被覆されている部分の上を移動するような
方向に担体を傾けて、重力により粒子を移動させればよ
い。例えば、移動させたい方向を下にして担体を配置す
ればよい。より具体的には、例えば、面の片側半分を特
異的結合物質により被覆した担体を用いた場合、面の特
異的結合物質により被覆されていない部分から被覆され
ている部分の方向（図１の矢印方向）に粒子が移動する
よう担体を傾ける（この場合図１の矢印方向に傾ければ
よい）。

【００７４】また、面が特異的結合物質により帯状に被
覆されている担体を用いた場合は、面の特異的結合物質
により被覆されていない部分からその帯状被覆部分を通
って特異的結合物質により被覆されていない部分の方向
（図２〜４の矢印方向）に粒子が移動するように担体を
傾ける（この場合図２〜４の矢印方向に傾ければよ
い）。

【００７５】試料に被検物質が存在する場合、該被検物
質は担体に固定された特異的結合物質に結合する。この
場合に粒子が担体の特異的結合物質により被覆された面
に沿って移動するように担体を傾けると、該粒子は重力
により担体の面に沿って傾きの下方向に移動するが、そ
の過程で面に固定された特異的結合物質に結合した被検
物質に出会うと、該粒子は被検物質及びこれに結合して
いる特異的結合物質を介して担体に結合して移動を停止
するか又は移動が著しく遅くなる。

【００７６】面の特異的結合物質が固定されていない領
域では、粒子の移動は該粒子と面との相互作用及び担体
を傾ける角度に依存し、該粒子は傾きの下方向にすみや
かに移動する。一方、面の特異的結合物質が固定されて
いる領域では、該面に固定されている特異的結合物質に
被検物質が結合している場合と結合していない場合とで
は粒子の移動速度に大きな差を生じる。

【００７７】即ち、試料中に被検物質が存在しない場
合、面に固定されている特異的結合物質は被検物質を結
合しないので、粒子は親和性を示さず、特異的結合物質
が固定されていない領域と同様にすみやかに傾きの下方
向に移動する。従って、試料中に被検物質が存在しない
場合、粒子は担体の下方向の端部に集まる。一方、試料
中に被検物質が存在する場合、面に固定されている特異
的結合物質は被検物質を結合するので、粒子は被検物質
及び特異的結合物質を介して担体に結合して移動が停止
又は著しく遅くなる。従って、試料中に被検物質が存在
する場合、粒子はその面の特異的結合物質で被覆された
部分に集まる。

【００７８】担体を傾けて粒子を担体の特異的結合物質
被覆面に沿って移動させる場合、粒子と被検物質が結合
していない該面との相互作用は弱く、その移動速度は担
体を傾ける角度にほぼ依存する。従って、大きな移動速
度を必要とする場合、すなわち短時間で測定結果を求め
るときには担体を傾ける角度を大きくすればよい。ま
た、担体を傾ける角度を経時的に変化させても良い。更
に、板状体の担体を用いる場合、その板状体を湾曲させ
板状体の角度を変化させることにより、粒子が移動する
速度を変化させても良い。

【００７９】上記のように、粒子を担体の特異的結合物
質により被覆された面に沿って移動させた後、この面に
おける粒子の分布状態から被検物質の有無を判定する。
この担体の面上の粒子の分布状態、即ち像は、容易に肉
眼により、あるいは吸光度測定やパターン認識によるマ
イクロプレートリーダー等の光学的読み取り装置により
確認することができる。

【００８０】図１のＣは、平底マイクロプレートを用い
て被検物質が存在する試料（陽性の試料）について測定
を行なった場合のウェルを上方からみた図であり、図１
のＤは、平底マイクロプレートを用いて被検物質が存在
しない試料（陰性の試料）について測定を行なった場合
のウェルを上方からみた図である。陽性の場合、ウェル
の平底面の特異的結合物質で被覆されていない部分から
移動してきた粒子は特異的結合物質被覆部分にトラップ
される。

【００８１】図２のＣは、底面が長方形の直方体型の透
明容器を用いて被検物質が存在する試料（陽性の試料）
について測定を行なった場合の該容器を上方からみた図
であり、図２のＤは、底面が長方形の直方体型の透明容
器を用いて被検物質が存在しない試料（陰性の試料）に
ついて測定を行なった場合の該容器を上方からみた図で
ある。陽性の場合、底面の特異的結合物質で被覆されて
いない部分から移動してきた粒子は帯状被覆部分にトラ
ップされる。

【００８２】図３のＣは、長方形の板状体を用いて２種
類の被検物質が存在する試料（それぞれの被検物質が陽
性の試料）について測定を行なった場合の該板状体を上
方からみた図であり、図３のＤは、長方形の板状体を用
いて被検物質が存在しない試料（陰性の試料）について
測定を行なった場合の該板状体を上方からみた図であ
る。陽性の場合、表面の特異的結合物質で被覆されてい
ない部分から移動してきた粒子はそれぞれの被検物質に
対応する帯状被覆部分にトラップされる。

【００８３】図４のＣは、表面に溝が設けられた長方形
の板状体を用いて２種類の被検物質が存在する試料（そ
れぞれの被検物質が陽性の試料）について測定を行なっ
た場合の該板状体を上方からみた図であり、図４のＤ
は、かかる板状体を用いて被検物質が存在しない試料
（陰性の試料）について測定を行なった場合の該板状体
を上方からみた図である。陽性の場合、溝の底面の特異
的結合物質で被覆されていない部分から移動してきた粒
子はそれぞれの被検物質に対応する帯状被覆部分にトラ
ップされる。

【００８４】また、特異的結合物質のかわりに、被検物
質又はその類縁体を固定した粒子を用いる場合、第１の
測定方法により得られる陽性又は陰性の粒子の分布状態
と逆の結果が得られる。

【００８５】本発明による第２の測定方法においては、
特異的結合物質を固定して該特異的結合物質により被覆
した面を有する担体の該面に、特異的結合物質が固定さ
れた粒子及び試料を混合した後の混合物をこの担体の面
に接触させる。その後、この面に接触させた粒子及び試
料の混合物を除去する。そして、更に特異的結合物質が
固定された粒子をこの面に接触させる。次に、この粒子
を面に沿って移動させ、この面における粒子の分布状態
から被検物質の有無を判定する。

【００８６】この第２の測定方法によれば、試料中に被
検物質が存在する即ち陽性の場合においては、粒子は試
料中の被検物質と結合するので、粒子及び試料の混合物
を担体の面に接触させた時に、粒子は被検物質を介して
この面に固定された特異的結合物質と結合する。そし
て、粒子及び試料の混合物をこの面から除去し、更に粒
子をこの面に接触させて面に沿って移動させると、この
粒子は先に担体の面に被検物質を介して結合した粒子に
遮られて移動が停止又は著しく遅くなり、粒子はその面
の特異的結合物質で被覆された部分に集まることとな
る。

【００８７】一方、試料中に被検物質が存在しない即ち
陰性の場合においては、粒子は被検物質を結合しないの
で、粒子及び試料の混合物を担体の面に接触させた時
に、粒子はこの面に予め固定されていた特異的結合物質
とは結合しない。よって、粒子及び試料の混合物をこの
面から除去し、更に粒子をこの面に接触させて面に沿っ
て移動させても、粒子はこの面の上を素通りしてしまい
速やかに磁石の方向又は傾きの下方向に移動して、磁石
に近い位置即ち担体の面の端部又は担体の下方向の担部
に集まることとなる。従って、この第２の測定方法によ
れば、第１の測定方法により得られる陽性又は陰性の粒
子の分布状態と同じ結果が得られる。

【００８８】なお、本測定方法は、確認試験に使用する
ことができる。確認試験とは、即ち測定で陽性像が得ら
れた場合に、それが真に被検物質の存在によるものか、
又は非特異的凝集反応によるものかを確認する方法であ
る。

【００８９】

【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【００９０】〔実施例１〕 （血液試料中のＨＢｓ抗原の測定） (1) 抗ＨＢｓ抗体固定板状体の作製 アクリル樹脂押出板（幅２５ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚
さ１ｍｍ）〔アクリサンデー社製〕の上に２枚のアクリ
ル押出板（幅１０ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚さ０．５ｍ
ｍ）〔アクリサンデー社製〕を５ｍｍの間隔をおいて溶
剤で貼り合わせて、図５に示された表面に溝（幅５ｍ
ｍ、奥行き４０ｍｍ、高さ０．５ｍｍ）が設けられた板
状体を作製した。この板状体の溝の底面の左端から５ｍ
ｍより１０ｍｍの部分に抗ＨＢｓ抗体溶液（シノテスト
社製、５μｇ／mlの濃度でpH７の10mMリン酸緩衝液に溶
解したもの）20μl をピペットを用いて載せて接触さ
せ、37℃で３時間静置した。次いで、この溶液をピペッ
トで吸引除去後、0.5%(W/V)カゼインを含むトリス緩衝
液（pH7.5,50mM）（以下、これを希釈液Ａという）0.3m
lをここに加えて、４℃で一晩放置し、これをピペット
で吸引除去した。そして、この板状体の左端の上にアク
リル樹脂押出板（幅２５ｍｍ、奥行き２５ｍｍ、厚さ１
ｍｍ）〔アクリサンデー社製〕を溶剤で貼り合わせるこ
とにより、図５に示したように板状体にカバーをした。
このようにして、溝の底面に特異的結合物質（抗ＨＢｓ
抗体）による帯状被覆部分が形成された板状体を作製し
た。

【００９１】(2) 抗ＨＢｓ抗体固定粒子の作製 粒子（磁性粒子）〔Dynabeads M-450 uncoated、ダイナ
ル社製、粒径：4.5 μｍ、粒径のＣ．Ｖ．５％以下、比
重1.5、濃度３％(w/v) 〕１mlと抗ＨＢｓ抗体溶液（シ
ノテスト社製、pH7.0 の10mMリン酸緩衝液に濃度 0.1mg
／mlで溶解したもの）１mlを混合し、37℃で30分間反応
させた。ここに希釈液Ａを約20倍量加えてマスキングを
行なった。次いで、得られた粒子を希釈液Ａにて洗浄
し、粒子を濃度が約 0.1％(w/v) となるように希釈液Ａ
に再分散させた。このようにして、抗ＨＢｓ抗体固定粒
子分散液を調製した。

【００９２】(3) ＨＢｓ抗原の測定 ＨＢｓ抗原陽性血液100μlを上記(1) で作製した抗ＨＢ
ｓ抗体固定板状体の溝のカバーされた部分とカバーされ
ていない部分の境目付近にピペットを用いて載せて帯状
被覆部分に接触させた。ティッシュペーパー（商品名：
キムワイプ、十條キンバリー社製）を３ｃｍ×３ｃｍ×
４ｍｍ（厚さ）に折り畳んで作製した試料吸収体を抗Ｈ
Ｂｓ抗体固定板状体の帯状被覆部分が形成された側の端
部（図５のＡにおける板状体の左端側面）に接触させ、
この帯状被覆部分に接触させたＨＢｓ抗原陽性血液を吸
収させて除去した。次に、上記(2)で作製した抗ＨＢｓ
抗体固定粒子分散液をこの抗ＨＢｓ抗体固定板状体の溝
のカバーされた部分とカバーされていない部分の境目付
近にピペットを用いて載せて帯状被覆部分に接触させ
た。その後、この板状体の帯状被覆部分が形成された側
面方向に磁石を設置することにより、抗ＨＢｓ抗体固定
粒子が移動するように板状体の溝の底面の抗ＨＢｓ抗体
が固定されていない部分から溝の底面の抗ＨＢｓ抗体が
固定されている部分方向（図５の矢印方向）に磁束密度
40〜60ガウスの磁場を発生させた。磁場を発生させてか
ら３分間以内に図５のＣに示すような粒子の像が認めら
れた。陰性血液を試料として用いて測定した場合には粒
子の像は認められなかった。

【００９３】〔実施例２〕 （血液試料中の抗ＨＢｓ抗体の測定） (1) ＨＢｓ抗原固定板状体の作製 アクリル樹脂押出板（幅２５ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚
さ１ｍｍ）〔アクリサンデー社製〕の上に２枚のアクリ
ル押出板（幅１０ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚さ０．５ｍ
ｍ）〔アクリサンデー社製〕を５ｍｍの間隔をおいて溶
剤で貼り合わせて、図５に示された表面に溝（幅５ｍ
ｍ、奥行き４０ｍｍ、高さ０．５ｍｍ）が設けられた板
状体を作製した。この板状体の溝の底面の左端から５ｍ
ｍより１０ｍｍの部分にＨＢｓ抗原溶液（明治乳業社
製、５μｇ／mlの濃度でpH７の10mMリン酸緩衝液に溶解
したもの）20μl をピペットを用いて載せて接触させ、
37℃で３時間静置した。次いで、この溶液をピペットで
吸引除去後、前記の希釈液Ａ 0.3mlをここに加えて、４
℃で一晩放置し、これをピペットで吸引除去した。そし
て、この板状体の左端の上にアクリル樹脂押出板（幅２
５ｍｍ、奥行き２５ｍｍ、厚さ１ｍｍ）〔アクリサンデ
ー社製〕を溶剤で貼り合わせることにより、図５に示し
たように板状体にカバーをした。このようにして、溝の
底面に特異的結合物質（ＨＢｓ抗原）による帯状被覆部
分が形成された板状体を作製した。

【００９４】(2) ＨＢｓ抗原固定粒子の作製 粒子（Dynabeads M-450 uncoated 、ダイナル社製、粒
径：4.5 μｍ、粒径のＣ．Ｖ．５％以下、比重1.5、濃
度３％(w/v) ）１mlとＨＢｓ抗原溶液（明治乳業社製、
pH7.2 の10mMリン酸緩衝液に40μｇ／mlの濃度で溶解し
たもの）１mlを混合し、37℃で30分間反応させた。ここ
に希釈液Ａを約20倍量加えてマスキングを行なった。次
いで、得られた粒子を希釈液Ａにて洗浄し、粒子を濃度
が約 0.1％(w/v) となるように希釈液Ａに再分散させ
た。このようにして、ＨＢｓ抗原固定粒子分散液を調製
した。

【００９５】(3) 抗ＨＢｓ抗体の測定 抗ＨＢｓ抗体陽性血液100μｌを上記(1) で作製したＨ
Ｂｓ抗原固定板状体の溝のカバ−された部分とカバ−さ
れていない部分の境目付近にピペットを用いて載せて帯
状被覆部分に接触させた。ティッシュペーパー（商品
名：キムワイプ、十條キンバリー社製）を３ｃｍ×３ｃ
ｍ×４ｍｍ（厚さ）に折り畳んで作製した試料吸収体を
ＨＢｓ抗原固定板状体の帯状被覆部分が形成された側の
端部（図５のＡにおける板状体の左端側面）に接触さ
せ、この帯状被覆部分に接触させた抗ＨＢｓ抗体陽性血
液を吸収させて除去した。次に、上記(2) で作製したＨ
Ｂｓ抗原固定粒子分散液をこのＨＢｓ抗原固定板状体の
溝のカバーされた部分とカバーされていない部分の境目
付近にピペットを用いて載せて帯状被覆部分に接触させ
た。その後、これを板状体の帯状被覆部分が形成された
側面方向を下にして（図５の矢印方向が下になるように
して）、板状体の溝の底面のＨＢｓ抗原が固定されてい
ない部分から溝の底面のＨＢｓ抗原が固定されている部
分方向（図５の矢印方向）にＨＢｓ抗原固定粒子が移動
するように、約60°の角度でＨＢｓ抗原固定板状体を傾
けた。斜めに傾けてから３分間以内に図５のＣに示すよ
うな粒子の像が認められた。陰性血液を試料として用い
て測定した場合には粒子の像は認められなかった。

【００９６】〔実施例３〕 （大腸菌Ｏ１５７の測定） (1) 抗大腸菌Ｏ１５７抗体固定板状体の作製 アクリル樹脂押出板（幅２５ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚
さ１ｍｍ）〔アクリサンデー社製〕の上に２枚のアクリ
ル押出板（幅１０ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚さ０．５ｍ
ｍ）〔アクリサンデー社製〕を５ｍｍの間隔をおいて溶
剤で貼り合わせて、図５に示された表面に溝（幅５ｍ
ｍ、奥行き４０ｍｍ、高さ０．５ｍｍ）が設けられた板
状体を作製した。この板状体の溝の底面の左端から５ｍ
ｍより１０ｍｍの部分に抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体溶
液〔Kirkegaard ＆ Perry Laboratories社製、５μｇ／
mlの濃度でpH７の10mMリン酸緩衝液に溶解したもの〕20
μl をピペットを用いて載せて接触させ、37℃で３時間
静置した。次いで、この溶液をピペットで吸引除去後、
前記の希釈液Ａ 0.3mlをここに加えて、４℃で一晩放置
し、これをピペットで吸引除去した。そして、この板状
体の左端の上にアクリル樹脂押出板（幅２５ｍｍ、奥行
き２５ｍｍ、厚さ１ｍｍ）〔アクリサンデー社製〕を溶
剤で貼り合わせることにより、図５に示したように板状
体にカバーをした。このようにして、溝の底面に特異的
結合物質（抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体）による帯状被
覆部分が形成された板状体を作製した。

【００９７】(2) 抗大腸菌Ｏ１５７抗体固定粒子の作製 粒子（磁性粒子）（Dynabeads M-450 uncoated 、ダイ
ナル社製、粒径：4.5μｍ、粒径のＣ．Ｖ．５％以下、
比重1.5、濃度３％(w/v) ）１mlと抗大腸菌Ｏ１５７：
Ｈ７抗体溶液〔Kirkegaard ＆ Perry Laboratories社
製、pH7.0の10mMリン酸緩衝液に濃度0.1mg／mlで溶解し
たもの〕１mlを混合し、37℃で30分間反応させた。ここ
に希釈液Ａを約20倍量加えてマスキングを行なった。次
いで、得られた粒子を希釈液Ａにて洗浄し、粒子を濃度
が約 0.1％(w/v) となるように希釈液Ａに再分散させ
た。このようにして、抗大腸菌Ｏ１５７抗体固定粒子分
散液を調製した。

【００９８】(3) 大腸菌Ｏ１５７の測定 大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７〔Kirkegaard ＆ Perry Laborato
ries社製〕を糞便懸濁液に添加し調製した試料100μｌ
を上記(1) で作製した抗大腸菌Ｏ１５７抗体固定板状体
の溝のカバ−された部分とカバ−されていない部分の境
目付近にピペットを用いて載せて帯状被覆部分に接触さ
せた。ティッシュペーパー（商品名：キムワイプ、十條
キンバリー社製）を３ｃｍ×３ｃｍ×４ｍｍ（厚さ）に
折り畳んで作製した試料吸収体を抗大腸菌Ｏ１５７抗体
固定板状体の帯状被覆部分が形成された側の端部（図５
のＡにおける板状体の左端側面）に接触させ、この帯状
被覆部分に接触させた前記の試料を吸収させて除去し
た。次に、上記(2) で作製した抗大腸菌Ｏ１５７抗体固
定粒子分散液をこの抗大腸菌Ｏ１５７抗体固定板状体の
溝のカバーされた部分とカバーされていない部分の境目
付近にピペットを用いて載せて帯状被覆部分に接触させ
た。その後、この板状体の帯状被覆部分が形成された側
面方向に磁石を設置することにより、抗大腸菌Ｏ１５７
抗体固定粒子が移動するように板状体の溝の底面の抗大
腸菌Ｏ１５７抗体が固定されていない部分から溝の底面
の抗大腸菌Ｏ１５７抗体が固定されている部分方向（図
５の矢印方向）に磁束密度40〜60ガウスの磁場を発生さ
せた。磁場を発生させてから３分間以内に図５のＣに示
すような粒子の像が認められた。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７
を添加していない糞便懸濁液を試料として用いて測定し
た場合には粒子の像は認められなかった。

【００９９】〔実施例４〕 （血液試料中のＨＢｓ抗原の確認試験(1)）ＨＢｓ抗原
陽性血液100μlを実施例１の(1) で作製した抗ＨＢｓ抗
体固定板状体の溝のカバーされた部分とカバーされてい
ない部分の境目付近にピペットを用いて載せて帯状被覆
部分に接触させた。ティッシュペーパー（商品名：キム
ワイプ、十條キンバリー社製）を３ｃｍ×３ｃｍ×４ｍ
ｍ（厚さ）に折り畳んで作製した試料吸収体を抗ＨＢｓ
抗体固定板状体の帯状被覆部分が形成された側の端部
（図５のＡにおける板状体の左端側面）に接触させ、こ
の帯状被覆部分に接触させたＨＢｓ抗原陽性血液を吸収
させて除去した。次に、抗ＨＢｓ抗体液（シノテスト社
製、希釈液Ａに濃度0.1mg/mlで溶解したもの）を前記の
ＨＢｓ抗原陽性血液を吸収除去した抗ＨＢｓ抗体固定板
状体の溝のカバーされた部分とカバーされていない部分
の境目付近にピペットを用いて載せて帯状被覆部分に接
触させた。ティッシュペーパー（商品名：キムワイプ、
十條キンバリー社製）を３ｃｍ×３ｃｍ×４ｍｍ（厚
さ）に折り畳んで作製した試料吸収体を抗ＨＢｓ抗体固
定板状体の帯状被覆部分が形成された側の端部（図５の
Ａにおける板状体の左端側面）に接触させ、この帯状被
覆部分に接触させた抗ＨＢｓ抗体液を吸収させて除去し
た。更に、実施例１の(2)で作製した抗ＨＢｓ抗体固定
粒子分散液をこの抗ＨＢｓ抗体固定板状体の溝のカバー
された部分とカバーされていない部分の境目付近にピペ
ットを用いて載せて帯状被覆部分に接触させた。その
後、この板状体の帯状被覆部分が形成された側面方向に
磁石を設置することにより、抗ＨＢｓ抗体固定粒子が移
動するように板状体の溝の底面の抗ＨＢｓ抗体が固定さ
れていない部分から溝の底面の抗ＨＢｓ抗体が固定され
ている部分方向（図５の矢印方向）に磁束密度40〜60ガ
ウスの磁場を発生させた。磁場を発生させてから３分後
に、この板状体の面上の粒子の分布状態を確認したとこ
ろ、図５のＣに示すような粒子の像は認められなかっ
た。これにより、試料中に真にＨＢｓ抗原が存在するこ
とが確認できた。

【０１００】〔実施例５〕 （血液試料中のＨＢｓ抗原の確認試験(2)）ＨＢｓ抗原
陽性血液100μlを実施例１の(1) で作製した抗ＨＢｓ抗
体固定板状体の溝のカバーされた部分とカバーされてい
ない部分の境目付近にピペットを用いて載せて帯状被覆
部分に接触させた。ティッシュペーパー（商品名：キム
ワイプ、十條キンバリー社製）を３ｃｍ×３ｃｍ×４ｍ
ｍ（厚さ）に折り畳んで作製した試料吸収体を抗ＨＢｓ
抗体固定板状体の帯状被覆部分が形成された側の端部
（図５のＡにおける板状体の左端側面）に接触させ、こ
の帯状被覆部分に接触させたＨＢｓ抗原陽性血液を吸収
させて除去した。次に、実施例１の(2)で作製した抗Ｈ
Ｂｓ抗体固定粒子分散液に抗ＨＢｓ抗体を0.1mg/mlにな
るように添加し、前記抗ＨＢｓ抗体添加抗ＨＢｓ抗体固
定粒子分散液を前記のＨＢｓ抗原陽性血液を吸収除去し
た抗ＨＢｓ抗体固定板状体の溝のカバーされた部分とカ
バーされていない部分の境目付近にピペットを用いて載
せて帯状被覆部分に接触させた。その後、この板状体の
帯状被覆部分が形成された側面方向に磁石を設置するこ
とにより、抗ＨＢｓ抗体固定粒子が移動するように板状
体の溝の底面の抗ＨＢｓ抗体が固定されていない部分か
ら溝の底面の抗ＨＢｓ抗体が固定されている部分方向
（図５の矢印方向）に磁束密度40〜60ガウスの磁場を発
生させた。磁場を発生させてから３分後に、この板状体
の面上の粒子の分布状態を確認したところ、図５のＣに
示すような粒子の像は認められなかった。これにより、
試料中に真にＨＢｓ抗原が存在することが確認できた。

【０１０１】

【発明の効果】本発明の測定方法によれば、特異的結合
反応を利用して試料中の被検物質を目視又は機器を用い
て測定する際に、赤血球などの判定を妨げる物質を含む
血液試料等の試料においても、妨害を受けることなく確
実に被検物質の存在の有無を判定することができる。ま
た、本発明の測定方法によれば、試料中の被検物質の有
無を、従来のように容器底面に集まった粒子の円形の像
の大小ではなく、粒子が担体の面の端部に集まるか或い
は担体の面の特異的結合物質で被覆された部分に集まる
かにより判定することから、被検物質濃度が低い場合で
あってもその判定が容易である。したがって高感度に試
料中の被検物質の測定をすることができる。しかも非特
異的凝集反応が生じた場合においても誤った判定を与え
ることはない。そして、本発明の測定方法によれば、粒
子及び／又は担体の面への特異的結合物質の固定量を変
更することにより感度を容易に変更することができるの
で効率がよい。従って、被検物質の濃度が低い場合にお
いても被検物質の有無を容易に判定することができる。
更に、本発明の測定方法によれば、短時間で、具体的に
は被検物質の種類にもよるが、通常、20秒〜10分程度で
試料中の被検物質の有無の判定を行なうことができ、例
えば、ＨＢｓ抗原の場合、１ng／ml程度の濃度であって
も３分間以内で測定が可能である。更に、本発明の測定
方法によれば、試料中の複数の被検物質の測定を同時に
行なうことができる。また、本発明の測定方法によれ
ば、確認試験を簡便に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】各ウェルの平底面の片側半分が特異的結合物質
により被覆された平底マイクロプレートを示す図であ
る。

【図２】底面が特異的結合物質により帯状に被覆されて
いる直方体型の透明容器を示す図である。

【図３】表面が特異的結合物質により帯状に被覆されて
いる板状体を示す図である。

【図４】表面に溝が設けられ、該溝の底面が特異的結合
物質により帯状に被覆されている板状体を示す図であ
る。

【図５】表面に溝が設けられ、該溝の底面が特異的結合
物質により帯状に被覆されている板状体を示す図であ
る。

【図６】間接凝集反応測定法により試料中の被検物質の
測定を行った場合の凝集像を示す図である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の被検物質に対する特異的結合物
   質が固定されて該特異的結合物質により被覆された面を
   有する担体の該面に試料を接触させる工程、前記面に接
   触させた試料を除去する工程、被検物質に対する特異的
   結合物質であって前記担体に固定された特異的結合物質
   と同一又は異なる特異的結合物質が固定された粒子を試
   料を除去した前記面に接触させる工程、及び前記粒子を
   前記面に沿って移動させる工程を含んでなり、前記面に
   おける粒子の分布状態から被検物質の有無を判定するこ
   とを特徴とする、試料中の被検物質の測定方法。
2. 【請求項２】 試料中の被検物質に対する特異的結合物
   質が固定されて該特異的結合物質により被覆された面を
   有する担体の該面に、被検物質に対する特異的結合物質
   であって前記担体に固定された特異的結合物質と同一又
   は異なる特異的結合物質が固定された粒子及び試料を混
   合した後の混合物を接触させる工程、前記面に接触させ
   た粒子及び試料の混合物を除去する工程、更に被検物質
   に対する特異的結合物質であって前記担体に固定された
   特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定
   された粒子を前記面に接触させる工程、及び前記粒子を
   前記面に沿って移動させる工程を含んでなり、前記面に
   おける粒子の分布状態から被検物質の有無を判定するこ
   とを特徴とする、試料中の被検物質の測定方法。
3. 【請求項３】 面が該特異的結合物質により部分的に被
   覆されている、請求項１又は２に記載の試料中の被検物
   質の測定方法。
4. 【請求項４】 担体が平底面を有する凹部を少なくとも
   一つ備えた容器であって、該平底面が特異的結合物質に
   より被覆されている、請求項１〜３のいずれか１項に記
   載の試料中の被検物質の測定方法。
5. 【請求項５】 担体が板状体であって、その表面が特異
   的結合物質により被覆されている、請求項１〜３のいず
   れか１項に記載の試料中の被検物質の測定方法。
6. 【請求項６】 前記被検物質が抗原であり、前記特異的
   結合物質が抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に
   記載の試料中の被検物質の測定方法。
7. 【請求項７】 前記被検物質が抗体であり、前記特異的
   結合物質が抗原又は前記抗体に対する抗体である、請求
   項１〜５のいずれか１項に記載の試料中の被検物質の測
   定方法。
8. 【請求項８】 吸水性材料よりなる試料吸収体を前記面
   に接触させた試料に接触させて該試料を除去する、請求
   項１〜７のいずれか１項に記載の試料中の被検物質の測
   定方法。
9. 【請求項９】 磁石を作用させることにより前記粒子を
   前記面に沿って移動させる、請求項１〜８のいずれか１
   項に記載の試料中の被検物質の測定方法。
10. 【請求項１０】 担体を傾けることにより前記粒子を前
    記面に沿って移動させる、請求項１〜８のいずれか１項
    に記載の試料中の被検物質の測定方法。