JPH10229880A - γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素をコードするＤ ＮＡ配列 - Google Patents
γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素をコードするＤ ＮＡ配列Info
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- JPH10229880A JPH10229880A JP9034612A JP3461297A JPH10229880A JP H10229880 A JPH10229880 A JP H10229880A JP 9034612 A JP9034612 A JP 9034612A JP 3461297 A JP3461297 A JP 3461297A JP H10229880 A JPH10229880 A JP H10229880A
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- aminobutyric acid
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンを基質として
効率的にγ−シアノ−α−アミノ酪酸を生成することが
でき、しかも耐熱性にも優れたγ−シアノ−α−アミノ
酪酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列と、このＤＮＡ配
列が発現するγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素、並
びにこのγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素の製造法
を提供する。 【解決手段】 Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンまたはＬ
−ホモシスチンとシアン化物からγ−シアノ−α−アミ
ノ酪酸を生成し、あるいはＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリ
ンと硫化物から含硫アミノ酸を生成するγ−シアノ−α
−アミノ酪酸合成酵素をコードする配列番号１のＤＮＡ
配列と、このＤＮＡ配列が発現するγ−シアノ−α−ア
ミノ酪酸合成酵素、並びにこのγ−シアノ−α−アミノ
酪酸合成酵素の製造法。
効率的にγ−シアノ−α−アミノ酪酸を生成することが
でき、しかも耐熱性にも優れたγ−シアノ−α−アミノ
酪酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列と、このＤＮＡ配
列が発現するγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素、並
びにこのγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素の製造法
を提供する。 【解決手段】 Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンまたはＬ
−ホモシスチンとシアン化物からγ−シアノ−α−アミ
ノ酪酸を生成し、あるいはＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリ
ンと硫化物から含硫アミノ酸を生成するγ−シアノ−α
−アミノ酪酸合成酵素をコードする配列番号１のＤＮＡ
配列と、このＤＮＡ配列が発現するγ−シアノ−α−ア
ミノ酪酸合成酵素、並びにこのγ−シアノ−α−アミノ
酪酸合成酵素の製造法。
Description
【０００１】
【発明の技術分野】この発明は、γ−シアノ−α−アミ
ノ酪酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列、このＤＮＡ配
列が発現するγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素、並
びにこの酵素の製造法に関するものである。さらに詳し
くは、この発明は、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンを基
質としてγ−シアノ−α−アミノ酪酸を生成する熱安定
性に優れたγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素を遺伝
子工学的に大量かつ均一に製造するのに有用な新規のＤ
ＮＡ配列と、このＤＮＡ配列が発現するγ−シアノ−α
−アミノ酪酸合成酵素、並びにこの酵素の製造方法に関
するものである。
ノ酪酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列、このＤＮＡ配
列が発現するγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素、並
びにこの酵素の製造法に関するものである。さらに詳し
くは、この発明は、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンを基
質としてγ−シアノ−α−アミノ酪酸を生成する熱安定
性に優れたγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素を遺伝
子工学的に大量かつ均一に製造するのに有用な新規のＤ
ＮＡ配列と、このＤＮＡ配列が発現するγ−シアノ−α
−アミノ酪酸合成酵素、並びにこの酵素の製造方法に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来より、γ−シアノ−α−アミノ酪酸
を生成するための酵素として、クロモバクテリウム（Ch
romobacterium ）属に属する細菌（C.violaceum ) より
単離して得られるγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素
の存在が知られている（Biochemistry, 12, p5369-537
7, 1973）。
を生成するための酵素として、クロモバクテリウム（Ch
romobacterium ）属に属する細菌（C.violaceum ) より
単離して得られるγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素
の存在が知られている（Biochemistry, 12, p5369-537
7, 1973）。
【０００３】これら従来のγ−シアノ−α−アミノ酪酸
合成酵素は、Ｌ−ホモシスチンに反応性が高いため、基
質としてＬ−ホモシスチンを用い、これをシアン化物と
反応させてγ−シアノ−α−アミノ酪酸を生成する。し
かしながら、Ｌ−ホモシスチンを基質として用いた場合
には、シアンを含む副産物が生成し、反応効率の低下や
γ−シアノ−α−アミノ酪酸の精製に影響が出るなどの
問題を有していた。
合成酵素は、Ｌ−ホモシスチンに反応性が高いため、基
質としてＬ−ホモシスチンを用い、これをシアン化物と
反応させてγ−シアノ−α−アミノ酪酸を生成する。し
かしながら、Ｌ−ホモシスチンを基質として用いた場合
には、シアンを含む副産物が生成し、反応効率の低下や
γ−シアノ−α−アミノ酪酸の精製に影響が出るなどの
問題を有していた。
【０００４】これに対して、基質としてＯ−アセチル−
Ｌ−ホモセリンを用いた場合には、シアンを含む副産物
を生成することなくγ−シアノ−α−アミノ酪酸を生成
することができるが、上記の従来酵素は、Ｏ−アセチル
−Ｌ−ホモセリンに対する反応性が低く（Ｌ−ホモシス
チンに対する反応性を１００％とすると、Ｏ−アセチル
−Ｌ−ホモセリンに対するそれは５％）、効率的にγ−
シアノ−α−アミノ酪酸を生成することが不可能であっ
た。
Ｌ−ホモセリンを用いた場合には、シアンを含む副産物
を生成することなくγ−シアノ−α−アミノ酪酸を生成
することができるが、上記の従来酵素は、Ｏ−アセチル
−Ｌ−ホモセリンに対する反応性が低く（Ｌ−ホモシス
チンに対する反応性を１００％とすると、Ｏ−アセチル
−Ｌ−ホモセリンに対するそれは５％）、効率的にγ−
シアノ−α−アミノ酪酸を生成することが不可能であっ
た。
【０００５】また、従来酵素の場合には、３０℃で３時
間安定であると記載されており（前記文献）、高温での
安定性が好ましいものではなかったため、γ−シアノ−
α−アミノ酪酸を合成する際の反応温度を制限しなけれ
ばならないという問題点も有していた。これに対して、
この発明の発明者等は、バチルス（Bacillus）属に属す
る細菌、さらに具体的には、バチルス・ステアロサーモ
フィルス（B.stearothermophilus）に属する菌株から新
規のγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素を単離し、既
に特許出願している（特願平７−１７１１７１号）。こ
の新規のγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素は、Ｏ−
アセチル−Ｌ−ホモセリンに作用性が高く（Ｏ−アセチ
ル−Ｌ−ホモセリンに対する作用性を１００％とした場
合に、Ｌ−ホモシスチンに対しては６．６％）、このＯ
−アセチル−Ｌ−ホモセリンを基質としてシアン化物と
反応させると、副産物を生じることなく効率的にγ−シ
アノ−α−アミノ酪酸を生成することができる。また、
前記の従来酵素は、３０℃で３時間安定であるのに対し
て、この発明の合成酵素は、６０℃まで安定であり、安
定性の点でも従来酵素に比べ、はるかに優れている。
間安定であると記載されており（前記文献）、高温での
安定性が好ましいものではなかったため、γ−シアノ−
α−アミノ酪酸を合成する際の反応温度を制限しなけれ
ばならないという問題点も有していた。これに対して、
この発明の発明者等は、バチルス（Bacillus）属に属す
る細菌、さらに具体的には、バチルス・ステアロサーモ
フィルス（B.stearothermophilus）に属する菌株から新
規のγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素を単離し、既
に特許出願している（特願平７−１７１１７１号）。こ
の新規のγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素は、Ｏ−
アセチル−Ｌ−ホモセリンに作用性が高く（Ｏ−アセチ
ル−Ｌ−ホモセリンに対する作用性を１００％とした場
合に、Ｌ−ホモシスチンに対しては６．６％）、このＯ
−アセチル−Ｌ−ホモセリンを基質としてシアン化物と
反応させると、副産物を生じることなく効率的にγ−シ
アノ−α−アミノ酪酸を生成することができる。また、
前記の従来酵素は、３０℃で３時間安定であるのに対し
て、この発明の合成酵素は、６０℃まで安定であり、安
定性の点でも従来酵素に比べ、はるかに優れている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】この発明者等が先に発
明した新規のγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素は、
上記のとおりのバチルス（Bacillus）属に属する細菌を
培養し、菌体が産生する酵素を培地から回収し、精製す
ることによって製造されていた。しかしながらこの方法
では、バチルス属に属する細胞のγ−シアノ−α−アミ
ノ酪酸合成酵素の生産量が著しく低く、しかも産生され
たγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素の濃度が低いた
めに精製工程が非常に煩雑であった。そして、このよう
な生産量の低さと製造工程の煩雑さによって、製品コス
トが非常に高いものとなっていた。
明した新規のγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素は、
上記のとおりのバチルス（Bacillus）属に属する細菌を
培養し、菌体が産生する酵素を培地から回収し、精製す
ることによって製造されていた。しかしながらこの方法
では、バチルス属に属する細胞のγ−シアノ−α−アミ
ノ酪酸合成酵素の生産量が著しく低く、しかも産生され
たγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素の濃度が低いた
めに精製工程が非常に煩雑であった。そして、このよう
な生産量の低さと製造工程の煩雑さによって、製品コス
トが非常に高いものとなっていた。
【０００７】この発明は、上記のγ−シアノ−α−アミ
ノ酪酸合成酵素を遺伝子工学的に大量かつ効率的に製造
することを可能とする遺伝子工学材料を提供することを
目的としている。またこの発明は、上記の材料を用いて
製造されるγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素を提供
すること、およびその製造方法を提供することを目的と
してもいる。
ノ酪酸合成酵素を遺伝子工学的に大量かつ効率的に製造
することを可能とする遺伝子工学材料を提供することを
目的としている。またこの発明は、上記の材料を用いて
製造されるγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素を提供
すること、およびその製造方法を提供することを目的と
してもいる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン
またはＬ−ホモシスチンとシアン化物からγ−シアノ−
α−アミノ酪酸を生成し、あるいはＯ−アセチル−Ｌ−
ホモセリンと硫化物から含硫アミノ酸を生成するγ−シ
アノ−α−アミノ酪酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列
を提供する。
を解決するものとして、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン
またはＬ−ホモシスチンとシアン化物からγ−シアノ−
α−アミノ酪酸を生成し、あるいはＯ−アセチル−Ｌ−
ホモセリンと硫化物から含硫アミノ酸を生成するγ−シ
アノ−α−アミノ酪酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列
を提供する。
【０００９】このＤＮＡ配列の具体例は、配列番号１の
塩基配列またはその変異配列を有するＤＮＡ配列であ
る。またこの発明は、上記のＤＮＡ配列を保持する組換
えプラスミド、詳しくは、配列番号１のＤＮＡ配列を保
持する組換えプラスミドｐＧＣＢ１０および組換えプラ
スミドｐＧＣＢ２０を提供する。
塩基配列またはその変異配列を有するＤＮＡ配列であ
る。またこの発明は、上記のＤＮＡ配列を保持する組換
えプラスミド、詳しくは、配列番号１のＤＮＡ配列を保
持する組換えプラスミドｐＧＣＢ１０および組換えプラ
スミドｐＧＣＢ２０を提供する。
【００１０】さらにこの発明は、上記のＤＮＡ配列で形
質転換された微生物、詳しくは、組換えプラスミドｐＧ
ＣＢ１０またはｐＧＣＢ２０で形質転換された大腸菌を
提供する。さらにまたこの発明は、上記のＤＮＡ配列が
発現するγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素、詳しく
は、配列番号２のアミノ酸配列またはその一部配列を有
するγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素を提供する。
質転換された微生物、詳しくは、組換えプラスミドｐＧ
ＣＢ１０またはｐＧＣＢ２０で形質転換された大腸菌を
提供する。さらにまたこの発明は、上記のＤＮＡ配列が
発現するγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素、詳しく
は、配列番号２のアミノ酸配列またはその一部配列を有
するγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素を提供する。
【００１１】そしてこの発明は、上記の形質転換微生物
を培養し、この微生物が産生したγ−シアノ−α−アミ
ノ酪酸合成酵素を培地から回収することを特徴とするγ
−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素の製造法をも提供す
る。
を培養し、この微生物が産生したγ−シアノ−α−アミ
ノ酪酸合成酵素を培地から回収することを特徴とするγ
−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素の製造法をも提供す
る。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、実施例を示し、この発明の
ＤＮＡ配列の同定、これを保持する組換えプラスミドと
この組換えプラスミドによる形質転換菌の作成、並びに
形質転換菌を用いたγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵
素の製造について詳しく説明する。もちろんこの発明は
以下の例によって限定されるものではない。 実施例１：γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素遺伝子
を含むＤＮＡ断片の調製 （１）バチルス・ステアロサーモフイルスＣＮ３の染色
体ＤＮＡの調製 バチルス・ステアロサーモフィルス（Baci11us stearot
hermophi1us）ＣＮ３（工業技術院生命工学工業技術研
究所寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−4773) を200mlの培地
に植菌し、50℃で一晩振盪培養した後、遠心分離により
集菌した。菌体を19mlのＴＥＮ緩衝液（10mM Tris-HCl
[pH8.0], 1mM EDTA, 100mM NaCl）に懸濁し、7.5mgのリ
ゾチームと５mgのアクロモペプチダーゼを加えて、37℃
で60分間ゆるやかに振盪した。
ＤＮＡ配列の同定、これを保持する組換えプラスミドと
この組換えプラスミドによる形質転換菌の作成、並びに
形質転換菌を用いたγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵
素の製造について詳しく説明する。もちろんこの発明は
以下の例によって限定されるものではない。 実施例１：γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素遺伝子
を含むＤＮＡ断片の調製 （１）バチルス・ステアロサーモフイルスＣＮ３の染色
体ＤＮＡの調製 バチルス・ステアロサーモフィルス（Baci11us stearot
hermophi1us）ＣＮ３（工業技術院生命工学工業技術研
究所寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−4773) を200mlの培地
に植菌し、50℃で一晩振盪培養した後、遠心分離により
集菌した。菌体を19mlのＴＥＮ緩衝液（10mM Tris-HCl
[pH8.0], 1mM EDTA, 100mM NaCl）に懸濁し、7.5mgのリ
ゾチームと５mgのアクロモペプチダーゼを加えて、37℃
で60分間ゆるやかに振盪した。
【００１３】次に、10％ＳＤＳ溶液0.53mlと１mgのプロ
テイナーゼＫを加え、37℃で60分間振盪した。これに、
ＴＥ溶液で飽和したフェノ一ル10mlを加え、ゆるやかに
撹拌した後、遠心分離（12,000rpm, 5min）し、上清を
回収した。この上清に、フェノール・クロロホルム・イ
ソアミルアルコール（５：４：１）を等量加え、ゆるや
かに撹拌した後、遠心分離（12,000rpm, 5min）し、上
清を回収した。さらに、この上清にクロロホルムを等量
加え、ゆるやかに撹拌した後、遠心分離（12,000rpm, 5
min）し、上清を回収した。この上清に２倍量の冷エタ
ノ一ルをゆっくり加え、ガラス棒により繊維状のＤＮＡ
を巻き取り、70％、80％、90％のエタノ一ルに順次、数
分ずつ浸漬して洗浄した後、ＴＥ緩衝液（10mM Tris-HC
l[pH8.0], 1mM EDTA）２mlに溶解した。
テイナーゼＫを加え、37℃で60分間振盪した。これに、
ＴＥ溶液で飽和したフェノ一ル10mlを加え、ゆるやかに
撹拌した後、遠心分離（12,000rpm, 5min）し、上清を
回収した。この上清に、フェノール・クロロホルム・イ
ソアミルアルコール（５：４：１）を等量加え、ゆるや
かに撹拌した後、遠心分離（12,000rpm, 5min）し、上
清を回収した。さらに、この上清にクロロホルムを等量
加え、ゆるやかに撹拌した後、遠心分離（12,000rpm, 5
min）し、上清を回収した。この上清に２倍量の冷エタ
ノ一ルをゆっくり加え、ガラス棒により繊維状のＤＮＡ
を巻き取り、70％、80％、90％のエタノ一ルに順次、数
分ずつ浸漬して洗浄した後、ＴＥ緩衝液（10mM Tris-HC
l[pH8.0], 1mM EDTA）２mlに溶解した。
【００１４】この溶液にＲＮase(10mg/ml:株式会杜ニッ
ポンジーン社製）５μlを加え37℃で60分処理し、バチ
ルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３の染色体ＤＮＡ溶
液として以下の実験に用いた。なお、ＤＮＡ濃度は469
μg/mlであった。 （２）プローブの調製 精製γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素のＮ末端およ
び内部アミノ酸配列をエドマン分解法により決定した。
このアミノ酸配列から対応する合成オリゴヌクレオチド
を作成し、これをプライマーにして（１）で得られた染
色体ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断
片をシークエンスしたところ、プライマーに相当するア
ミノ酸配列とその他の内部アミノ酸配列が存在したの
で、このＤＮＡ断片をγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成
酵素遺伝子の一部と判断した。確認したＤＮＡ配列より
40bpのオリゴヌクレオチドを合成し、これを３'-オリゴ
ラベリングシステム（アマシャム社製）を用いてフルオ
レセインでラベルし、プローブとして以下の実験に用い
た。 （３）サザンハイブリダイゼーション （１）で調製した染色体ＤＮＡを、各種制限酵素を用い
て完全消化し、1.5％アガロース電気泳動で泳動後、サ
ザンブロット法によりHybond-Ｎ＋メンブレン（アマシ
ャム社製）にトランスファーした。このメンブレンを80
℃の乾燥機中で２時間乾燥させてＤＮＡを固定した。こ
のメンブレンに対して、３'-オリゴラベリングシステム
(アマシャム社製) を用いて（２）で調製したプローブ
をハイブリダイズさせた。方法は以下の通り行った。
ポンジーン社製）５μlを加え37℃で60分処理し、バチ
ルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３の染色体ＤＮＡ溶
液として以下の実験に用いた。なお、ＤＮＡ濃度は469
μg/mlであった。 （２）プローブの調製 精製γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素のＮ末端およ
び内部アミノ酸配列をエドマン分解法により決定した。
このアミノ酸配列から対応する合成オリゴヌクレオチド
を作成し、これをプライマーにして（１）で得られた染
色体ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断
片をシークエンスしたところ、プライマーに相当するア
ミノ酸配列とその他の内部アミノ酸配列が存在したの
で、このＤＮＡ断片をγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成
酵素遺伝子の一部と判断した。確認したＤＮＡ配列より
40bpのオリゴヌクレオチドを合成し、これを３'-オリゴ
ラベリングシステム（アマシャム社製）を用いてフルオ
レセインでラベルし、プローブとして以下の実験に用い
た。 （３）サザンハイブリダイゼーション （１）で調製した染色体ＤＮＡを、各種制限酵素を用い
て完全消化し、1.5％アガロース電気泳動で泳動後、サ
ザンブロット法によりHybond-Ｎ＋メンブレン（アマシ
ャム社製）にトランスファーした。このメンブレンを80
℃の乾燥機中で２時間乾燥させてＤＮＡを固定した。こ
のメンブレンに対して、３'-オリゴラベリングシステム
(アマシャム社製) を用いて（２）で調製したプローブ
をハイブリダイズさせた。方法は以下の通り行った。
【００１５】１４４cm2 のメンブレンを３'-オリゴラベ
リングシステム (アマシャム社製)記載のハイブリダイ
ゼーションバッファー48mlに浸し、65℃で30分間振盪水
浴でプレハイブリダイゼーションを行った。プレハイブ
リダイゼーションを行ったバッファーに（２）で調製し
たプローブを20μl加え、引き続き65℃で２時間振盪水
浴でハイブリダイゼーションを行った。次いで、メンブ
レンを充分量の５×SSC(75mM クエン酸ナトリウム、750
mM 塩化ナトリウム[pH7.O])−0.1％(W/V)ＳＤＳ溶液に
浸し、室温で５分間振盪後、新しい５×SSC−0.1％(W/
V)ＳＤＳ溶液に入れ替え、さらに室温で５分間振盪し
た。次いで、メンブレンを充分量の0.2×SSC(３mM クエ
ン酸ナトリウム、30mM 塩化ナトリウム［pH7.0])−0.1
％(W/V)ＳＤＳ溶液に浸し、42℃で15分間振盪後、新し
い0.2×SSC−0.1％(W/V) ＳＤＳ溶液に入れ替え、さら
に42℃で15分間振盪した。その後の操作は、３'-オリゴ
ラベリングシステム (アマシャム社製) 記載の方法に従
い、メンブレンをブロッキングした後、ＨＲＰ（ホース
ラディッシュパーオキシダーゼ）標識抗フルオレセイン
抗体を結合させた。さらに、メンブレンに検出液をか
け、ＨＲＰと検出試薬との反応により生ずる化学発光
を、Hyperfilm−ＥＣＬ（アマシャム社製) に感光させ
た。以上の方法により、検出された断片のサイズからγ
−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素遺伝子周辺の制限酵
素地図を作成した。この遺伝子地図から、この酵素遺伝
子の全域を含むと思われる４kbpのＦbaＩ−ＦbaＩ断片
をクロ−ニングした。 （４）染色体ＤＮＡ断片の調製 （１）で調製した染色体ＤＮＡ20μgを制限酵素ＦbaＩ
（宝酒造社製）を用いて消化後、１％濃度のアガロース
ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色後、
４kbpの染色体ＤＮＡ断片に対応するゲルの位置を切り
出して、ＥＡＳＹＴＲＡＰver.2 （宝酒造社製）を用い
て目的ＤＮＡ断片を回収した。 実施例２：組換えプラスミドの作成 ｐＵＣ１９（宝酒造社製）３μgを制限酵素ＢamＨＩで
完全消化し、アルカリフォスファターゼ処理をした後、
１％ゲル濃度のアガロースゲル電気泳動を行った。泳動
後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、 2.7kbpの
直鎖状プラスミドＤＮＡ断片をゲルと一緒に切り出し、
ＥＡＳＹＴＲＡＰver.2 （宝酒造社製）を用いてプラス
ミドＤＮＡを回収した。
リングシステム (アマシャム社製)記載のハイブリダイ
ゼーションバッファー48mlに浸し、65℃で30分間振盪水
浴でプレハイブリダイゼーションを行った。プレハイブ
リダイゼーションを行ったバッファーに（２）で調製し
たプローブを20μl加え、引き続き65℃で２時間振盪水
浴でハイブリダイゼーションを行った。次いで、メンブ
レンを充分量の５×SSC(75mM クエン酸ナトリウム、750
mM 塩化ナトリウム[pH7.O])−0.1％(W/V)ＳＤＳ溶液に
浸し、室温で５分間振盪後、新しい５×SSC−0.1％(W/
V)ＳＤＳ溶液に入れ替え、さらに室温で５分間振盪し
た。次いで、メンブレンを充分量の0.2×SSC(３mM クエ
ン酸ナトリウム、30mM 塩化ナトリウム［pH7.0])−0.1
％(W/V)ＳＤＳ溶液に浸し、42℃で15分間振盪後、新し
い0.2×SSC−0.1％(W/V) ＳＤＳ溶液に入れ替え、さら
に42℃で15分間振盪した。その後の操作は、３'-オリゴ
ラベリングシステム (アマシャム社製) 記載の方法に従
い、メンブレンをブロッキングした後、ＨＲＰ（ホース
ラディッシュパーオキシダーゼ）標識抗フルオレセイン
抗体を結合させた。さらに、メンブレンに検出液をか
け、ＨＲＰと検出試薬との反応により生ずる化学発光
を、Hyperfilm−ＥＣＬ（アマシャム社製) に感光させ
た。以上の方法により、検出された断片のサイズからγ
−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素遺伝子周辺の制限酵
素地図を作成した。この遺伝子地図から、この酵素遺伝
子の全域を含むと思われる４kbpのＦbaＩ−ＦbaＩ断片
をクロ−ニングした。 （４）染色体ＤＮＡ断片の調製 （１）で調製した染色体ＤＮＡ20μgを制限酵素ＦbaＩ
（宝酒造社製）を用いて消化後、１％濃度のアガロース
ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色後、
４kbpの染色体ＤＮＡ断片に対応するゲルの位置を切り
出して、ＥＡＳＹＴＲＡＰver.2 （宝酒造社製）を用い
て目的ＤＮＡ断片を回収した。 実施例２：組換えプラスミドの作成 ｐＵＣ１９（宝酒造社製）３μgを制限酵素ＢamＨＩで
完全消化し、アルカリフォスファターゼ処理をした後、
１％ゲル濃度のアガロースゲル電気泳動を行った。泳動
後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、 2.7kbpの
直鎖状プラスミドＤＮＡ断片をゲルと一緒に切り出し、
ＥＡＳＹＴＲＡＰver.2 （宝酒造社製）を用いてプラス
ミドＤＮＡを回収した。
【００１６】次いで、実施例１（４）で調製した染色体
ＤＮＡ断片と上記プラスミドＤＮＡとの混合物をエタノ
一ル沈殿し、沈殿物を70％エタノ一ルで洗浄、真空乾燥
後、ＴＥ緩衝液４μlに溶解した。これにＤＮＡ Ligati
on Kit Ver.2 のＩ液（宝酒造社製）を等量加え、16℃
で３時間反応させ、染色体ＤＮＡ断片とプラスミドベク
ターを結合させて組換えプラスミドを作成した。 実施例３：γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素遺伝子
のクロ−ニング（Ｉ） 実施例２で作成した組換えプラスミドを含む反応液を用
いて大腸菌の形質転換を行った。コンピテントセルＪＭ
109（宝酒造社製）100μl に実施例２で調製した反応液
を加えて、氷中で30分間放置後、42℃で45秒間保ち、再
び氷中に１分間放置した後、ＳＯＣ培地 900μlを加
え、37℃で60分間培養した。この培養液をＬＢプレート
(最終濃度で、50μg/mlアンピシリン、100μg/mlＸ-ga
l、60μg/mlＩＰＴＧ入り) に塗布して、37℃で一晩培
養した。プレートに生じた白コロニーをＬＢプレート
（最終濃度で、50μg/mlアンピシリン、100μg/mlＸ-ga
l、60μg/mlＩＰＴＧ入り) にのせたHybond−Ｎ＋メン
ブレン (アマシャム社製) に爪楊枝を用いて接種し37℃
で一晩培養した。このメンブレンを、プレートから剥が
して、0.5M NaOHに浸した２枚のＷhatman−３ＭＭ濾紙
の上に、コロニーの接種面を上にして15分放置し、菌を
溶菌させるとともに、ＤＮＡをメンブレンに固定した。
次いで、メンブレンを充分量の２×SSC(30mM クエン酸
ナトリウム、300mM塩化ナトリウム［pH7.0]）溶液で20
分間振盪し、さらに新しい２×SSC 溶液を入れ替えて20
分間振盪した後、メンブレンを濾紙上で風乾した。この
メンブレンに対して、実施例１（２）で調製したプロー
ブを用い、実施例１（３）で行った方法に準じてコロニ
ーハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを得
た。この陽性クローンからアルカリ法でプラスミドを調
製し、各種制限酵素で分析したところ、４kbpのＦbaＩ
−ＦbaＩの断片を含むプラスミドであることが判明し
た。このブラスミドをｐＧＣＢ10と命名した（図１参
照）。また、このｐＧＣＢ10が導入された形質転換大腸
菌を、Ｅ. coli ＪＭ109/ｐＧＣＢ10と命名した。ｐＧ
ＣＢ10に挿入されたＤＮＡ断片をシークエンスした結
果、配列番号１に示したとおりの1302bpからなるγ−シ
アノ−α−アミノ酪酸合成酵素のオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）が確認された。また、このＯＲＦの
塩基配列から、このＤＮＡ配列がコードするγ−シアノ
−α−アミノ酪酸合成酵素のアミノ酸配列は、配列番号
２のとおりであると推定された。 実施例４：γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素遺伝子
のクロ−ニング（II） 実施例３で決定したバチルス・ステアロサーモフィルス
ＣＮ３のγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素遺伝子の
塩基配列より、ＯＲＦを挟むように、上流と下流にそれ
ぞれ制限酵素ＸmaＩとＰstＩサイトをデザインした合成
オリゴヌクレオチドを作成し、これをプライマーとして
実施例１（１）で得られた染色体ＤＮＡをＰＣＲ増幅し
た。
ＤＮＡ断片と上記プラスミドＤＮＡとの混合物をエタノ
一ル沈殿し、沈殿物を70％エタノ一ルで洗浄、真空乾燥
後、ＴＥ緩衝液４μlに溶解した。これにＤＮＡ Ligati
on Kit Ver.2 のＩ液（宝酒造社製）を等量加え、16℃
で３時間反応させ、染色体ＤＮＡ断片とプラスミドベク
ターを結合させて組換えプラスミドを作成した。 実施例３：γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素遺伝子
のクロ−ニング（Ｉ） 実施例２で作成した組換えプラスミドを含む反応液を用
いて大腸菌の形質転換を行った。コンピテントセルＪＭ
109（宝酒造社製）100μl に実施例２で調製した反応液
を加えて、氷中で30分間放置後、42℃で45秒間保ち、再
び氷中に１分間放置した後、ＳＯＣ培地 900μlを加
え、37℃で60分間培養した。この培養液をＬＢプレート
(最終濃度で、50μg/mlアンピシリン、100μg/mlＸ-ga
l、60μg/mlＩＰＴＧ入り) に塗布して、37℃で一晩培
養した。プレートに生じた白コロニーをＬＢプレート
（最終濃度で、50μg/mlアンピシリン、100μg/mlＸ-ga
l、60μg/mlＩＰＴＧ入り) にのせたHybond−Ｎ＋メン
ブレン (アマシャム社製) に爪楊枝を用いて接種し37℃
で一晩培養した。このメンブレンを、プレートから剥が
して、0.5M NaOHに浸した２枚のＷhatman−３ＭＭ濾紙
の上に、コロニーの接種面を上にして15分放置し、菌を
溶菌させるとともに、ＤＮＡをメンブレンに固定した。
次いで、メンブレンを充分量の２×SSC(30mM クエン酸
ナトリウム、300mM塩化ナトリウム［pH7.0]）溶液で20
分間振盪し、さらに新しい２×SSC 溶液を入れ替えて20
分間振盪した後、メンブレンを濾紙上で風乾した。この
メンブレンに対して、実施例１（２）で調製したプロー
ブを用い、実施例１（３）で行った方法に準じてコロニ
ーハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを得
た。この陽性クローンからアルカリ法でプラスミドを調
製し、各種制限酵素で分析したところ、４kbpのＦbaＩ
−ＦbaＩの断片を含むプラスミドであることが判明し
た。このブラスミドをｐＧＣＢ10と命名した（図１参
照）。また、このｐＧＣＢ10が導入された形質転換大腸
菌を、Ｅ. coli ＪＭ109/ｐＧＣＢ10と命名した。ｐＧ
ＣＢ10に挿入されたＤＮＡ断片をシークエンスした結
果、配列番号１に示したとおりの1302bpからなるγ−シ
アノ−α−アミノ酪酸合成酵素のオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）が確認された。また、このＯＲＦの
塩基配列から、このＤＮＡ配列がコードするγ−シアノ
−α−アミノ酪酸合成酵素のアミノ酸配列は、配列番号
２のとおりであると推定された。 実施例４：γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素遺伝子
のクロ−ニング（II） 実施例３で決定したバチルス・ステアロサーモフィルス
ＣＮ３のγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素遺伝子の
塩基配列より、ＯＲＦを挟むように、上流と下流にそれ
ぞれ制限酵素ＸmaＩとＰstＩサイトをデザインした合成
オリゴヌクレオチドを作成し、これをプライマーとして
実施例１（１）で得られた染色体ＤＮＡをＰＣＲ増幅し
た。
【００１７】増幅ＤＮＡ断片をＸmaＩとＰstＩとで消化
後、アガロースゲル電気泳動で精製し、同制限酵素で処
理・精製した発現用ベクターｐＫＫ223-3(ファルマシア
社製) に連結して、大腸菌ＪＭ109 株に導入した。ここ
で得られた組換えプラスミドをｐＧＣＢ20、これを導入
した大腸菌をＥ. coli ＪＭ109/ｐＧＣＢ20と命名した
（図２および図３参照）。 実施例５：Ｅ. coli ＪＭ109/ｐＧＣＢ10によるγ−シ
アノ−α−アミノ酪酸合成酵素の製造Ｅ . coli ＪＭ109/ｐＧＣＢ10をアンピシリン（50μg/m
l）の入ったＬＢ培地５mlに接種し、37℃で一晩培養し
た前々培養液3.6ml をアンピシリン（50μg/ml）の入っ
たＬＢ培地180m1に接種し、37℃で10時間培養した。こ
の前培養液160 mlをアンピシリン（50μg/ml）、ピリド
キサールリン酸（0.1mM）の入った２×ＹＴ培地８Ｌに
接種し、37℃で13時間培養後、集菌した。集菌した菌体
をリン酸カリウム緩衝液（20mM, pH7.5, 0.1mMジチオス
レイトールおよび0.01mMピリドキサールリン酸含有) で
洗浄した後、同緩衝液約200mlに懸濁した。超音波破砕
装置で菌体を破砕し、15,000rpm で15分間遠心分離し
て、上清を回収した。この上清について、60℃で20分間
の熱処理後、11,000rpm で15分間遠心分離して、上清を
回収した。この上清をO.１mMジチオスレイトール、O.01
mMピリドキサールリン酸を含む20mMリン酸カリウム緩衝
液(pH7.5) で透析後、あらかじめ同緩衝液で平衡化した
ＤＥＡＥ−セルロファインＡ-500カラム（直径2.2×高
さ10.7cm) に通して酵素を吸着させ、0.1mM ジチオスレ
イトール、O.01mMピリドキサールリン酸を含む100mM リ
ン酸カリウム緩衝液(pH7.5) で洗浄後、同緩衝液から0.
1mM ジチオスレイトール、0.01mMピリドキサールリン
酸、0.4M KClを含む100mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.
5) へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて活性画
分を集めた。次いで、得られた活性画分に硫酸アンモニ
ウムを60％飽和になるように添加し、一晩放置したの
ち、析出した沈殿物を遠心分離により除き、得られた上
清に再度硫酸アンモニウムを90％飽和になるように添加
して一晩放置し、遠心分離により沈殿物を得た。
後、アガロースゲル電気泳動で精製し、同制限酵素で処
理・精製した発現用ベクターｐＫＫ223-3(ファルマシア
社製) に連結して、大腸菌ＪＭ109 株に導入した。ここ
で得られた組換えプラスミドをｐＧＣＢ20、これを導入
した大腸菌をＥ. coli ＪＭ109/ｐＧＣＢ20と命名した
（図２および図３参照）。 実施例５：Ｅ. coli ＪＭ109/ｐＧＣＢ10によるγ−シ
アノ−α−アミノ酪酸合成酵素の製造Ｅ . coli ＪＭ109/ｐＧＣＢ10をアンピシリン（50μg/m
l）の入ったＬＢ培地５mlに接種し、37℃で一晩培養し
た前々培養液3.6ml をアンピシリン（50μg/ml）の入っ
たＬＢ培地180m1に接種し、37℃で10時間培養した。こ
の前培養液160 mlをアンピシリン（50μg/ml）、ピリド
キサールリン酸（0.1mM）の入った２×ＹＴ培地８Ｌに
接種し、37℃で13時間培養後、集菌した。集菌した菌体
をリン酸カリウム緩衝液（20mM, pH7.5, 0.1mMジチオス
レイトールおよび0.01mMピリドキサールリン酸含有) で
洗浄した後、同緩衝液約200mlに懸濁した。超音波破砕
装置で菌体を破砕し、15,000rpm で15分間遠心分離し
て、上清を回収した。この上清について、60℃で20分間
の熱処理後、11,000rpm で15分間遠心分離して、上清を
回収した。この上清をO.１mMジチオスレイトール、O.01
mMピリドキサールリン酸を含む20mMリン酸カリウム緩衝
液(pH7.5) で透析後、あらかじめ同緩衝液で平衡化した
ＤＥＡＥ−セルロファインＡ-500カラム（直径2.2×高
さ10.7cm) に通して酵素を吸着させ、0.1mM ジチオスレ
イトール、O.01mMピリドキサールリン酸を含む100mM リ
ン酸カリウム緩衝液(pH7.5) で洗浄後、同緩衝液から0.
1mM ジチオスレイトール、0.01mMピリドキサールリン
酸、0.4M KClを含む100mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.
5) へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて活性画
分を集めた。次いで、得られた活性画分に硫酸アンモニ
ウムを60％飽和になるように添加し、一晩放置したの
ち、析出した沈殿物を遠心分離により除き、得られた上
清に再度硫酸アンモニウムを90％飽和になるように添加
して一晩放置し、遠心分離により沈殿物を得た。
【００１８】この沈殿物を30％飽和硫酸アンモニウム、
0.1mM ジチオスレイトール、0.01mMピリドキサールリン
酸を含む20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5) に溶解し、
あらかじめ同緩衝液で平衡化したブチルトヨバール650
Ｍカラム (直径２×高さ7.9cm)に通して酵素を吸着さ
せ、同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から 0.1mMジチオ
スレイトール、0.01mMピリドキサールリン酸を含む20mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.5) へのグラジエント溶出法
で酵素を溶出させて活性画分を集めた。この活性画分を
セントリプレップ10（グレースジャパン株式会社製）で
遠心脱塩濃縮し、電気泳動的に均一な最終精製酵素を得
た。得られたγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素につ
いて、分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）、最適温度、温度安定性、最適ｐＨ、ｐＨ安定性お
よび基質特異性を調べたところ、先願（特願平７−１７
１１７１号）のγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素と
の間に差は認められなかった。 実施例６：Ｅ. coli ＪＭ109/ｐＧＣＢ20によるγ−シ
アノ−α−アミノ酪酸合成酵素の製造Ｅ . coli ＪＭ109/ｐＧＣＢ20をアンピシリン（50μg/m
l）の入ったＬＢ培地10mlに接種し、37℃で一晩培養し
た前々培養液4mlをアンピシリン（50μg/ml）の入った
ＬＢ培地180mlに接種し、37℃で10時間培養した。この
前培養液160ml をアンピシリン（50μg/ml）、ピリドキ
サールリン酸(0.1mM) の入ったＬＢ培地８Ｌに接種し、
37℃で４時間培養後、IPTGを最終1mMになるように添加
し、さらに３時間培養した後、集菌した。集菌した菌体
をリン酸カリウム緩衡液（20mM、pH7.5、 0.1mM ジチオ
スレイトールおよび0.01mMピリドキサールリン酸含有）
で洗浄した後、同緩衝液約80mlに懸濁した。超音波破砕
装置で菌体を破砕し、15,000rpm で15分間遠心分離し
て、上清を回収した。この上清について、60℃で20分間
の熱処理後、11,000rpm で15分間遠心分離して、上清を
回収した。この上清を0.1mM ジチオスレイトール、0.01
mMピリドキサールリン酸を含む20mMリン酸カリウム緩衝
液(pH7.5) で透析後、あらかじめ同緩衝液で平衡化した
ＤＥＡＥ−セルロファインＡ-500カラム (直径4.2×高
さ15cm) に通して酵素を吸着させ、0.1mMジチオスレイ
トール、0.01mMピリドキサールリン酸を含む100mM リン
酸カリウム緩衝液(pH7.5) で洗浄後、同緩衝液から0.1m
M ジチオスレイトール、0.01mMピリドキサールリン酸、
0.4M KClを含む 100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5) へ
のグラジエン卜溶出法で酵素を溶出させて活性画分を集
めた。
0.1mM ジチオスレイトール、0.01mMピリドキサールリン
酸を含む20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5) に溶解し、
あらかじめ同緩衝液で平衡化したブチルトヨバール650
Ｍカラム (直径２×高さ7.9cm)に通して酵素を吸着さ
せ、同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から 0.1mMジチオ
スレイトール、0.01mMピリドキサールリン酸を含む20mM
リン酸カリウム緩衝液(pH7.5) へのグラジエント溶出法
で酵素を溶出させて活性画分を集めた。この活性画分を
セントリプレップ10（グレースジャパン株式会社製）で
遠心脱塩濃縮し、電気泳動的に均一な最終精製酵素を得
た。得られたγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素につ
いて、分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）、最適温度、温度安定性、最適ｐＨ、ｐＨ安定性お
よび基質特異性を調べたところ、先願（特願平７−１７
１１７１号）のγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素と
の間に差は認められなかった。 実施例６：Ｅ. coli ＪＭ109/ｐＧＣＢ20によるγ−シ
アノ−α−アミノ酪酸合成酵素の製造Ｅ . coli ＪＭ109/ｐＧＣＢ20をアンピシリン（50μg/m
l）の入ったＬＢ培地10mlに接種し、37℃で一晩培養し
た前々培養液4mlをアンピシリン（50μg/ml）の入った
ＬＢ培地180mlに接種し、37℃で10時間培養した。この
前培養液160ml をアンピシリン（50μg/ml）、ピリドキ
サールリン酸(0.1mM) の入ったＬＢ培地８Ｌに接種し、
37℃で４時間培養後、IPTGを最終1mMになるように添加
し、さらに３時間培養した後、集菌した。集菌した菌体
をリン酸カリウム緩衡液（20mM、pH7.5、 0.1mM ジチオ
スレイトールおよび0.01mMピリドキサールリン酸含有）
で洗浄した後、同緩衝液約80mlに懸濁した。超音波破砕
装置で菌体を破砕し、15,000rpm で15分間遠心分離し
て、上清を回収した。この上清について、60℃で20分間
の熱処理後、11,000rpm で15分間遠心分離して、上清を
回収した。この上清を0.1mM ジチオスレイトール、0.01
mMピリドキサールリン酸を含む20mMリン酸カリウム緩衝
液(pH7.5) で透析後、あらかじめ同緩衝液で平衡化した
ＤＥＡＥ−セルロファインＡ-500カラム (直径4.2×高
さ15cm) に通して酵素を吸着させ、0.1mMジチオスレイ
トール、0.01mMピリドキサールリン酸を含む100mM リン
酸カリウム緩衝液(pH7.5) で洗浄後、同緩衝液から0.1m
M ジチオスレイトール、0.01mMピリドキサールリン酸、
0.4M KClを含む 100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5) へ
のグラジエン卜溶出法で酵素を溶出させて活性画分を集
めた。
【００１９】次いで、得られた活性画分に硫酸アンモニ
ウムを60％飽和になるように添加し、一晩放置したの
ち、析出した沈殿物を遠心分離により除き、得られた上
清に再度硫酸アンモニウムを90％飽和になるように添加
して一晩放置し、遠心分離により沈殿物を得た。この沈
殿物を30％飽和硫酸アンモニウム、0.1mM ジチオスレイ
トール、0.01mMピリドキサールリン酸を含む20mMリン酸
カリウム緩衝液(pH7.5)に溶解し、あらかじめ同緩衝液
で平衡化したブチルトヨパール650 Ｍカラム (直径２×
高さ6.6cm)に通して酵素を吸着させ、同緩衝液で洗浄し
た後、同緩衝液から0.1mM ジチオスレイトール、0.O1mM
ピリドキサールリン酸を含む20mMリン酸カリウム緩衝液
(pH7.5) へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて活
性画分を集めた。この活性画分をセントリプレップ10
(グレースジャパン株式会社製) で遠心脱塩濃縮し、電
気泳動的に均一な最終精製酵素を得た。得られたγ−シ
アノ−α−アミノ酪酸合成酵素について、分子量（ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、最適温度、温
度安定性、最適ｐＨ、ｐＨ安定性および基質特異性を調
べたところ、先願（特願平７−１７１１７１号）のγ−
シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素との間に差は認められ
なかった。
ウムを60％飽和になるように添加し、一晩放置したの
ち、析出した沈殿物を遠心分離により除き、得られた上
清に再度硫酸アンモニウムを90％飽和になるように添加
して一晩放置し、遠心分離により沈殿物を得た。この沈
殿物を30％飽和硫酸アンモニウム、0.1mM ジチオスレイ
トール、0.01mMピリドキサールリン酸を含む20mMリン酸
カリウム緩衝液(pH7.5)に溶解し、あらかじめ同緩衝液
で平衡化したブチルトヨパール650 Ｍカラム (直径２×
高さ6.6cm)に通して酵素を吸着させ、同緩衝液で洗浄し
た後、同緩衝液から0.1mM ジチオスレイトール、0.O1mM
ピリドキサールリン酸を含む20mMリン酸カリウム緩衝液
(pH7.5) へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて活
性画分を集めた。この活性画分をセントリプレップ10
(グレースジャパン株式会社製) で遠心脱塩濃縮し、電
気泳動的に均一な最終精製酵素を得た。得られたγ−シ
アノ−α−アミノ酪酸合成酵素について、分子量（ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、最適温度、温
度安定性、最適ｐＨ、ｐＨ安定性および基質特異性を調
べたところ、先願（特願平７−１７１１７１号）のγ−
シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素との間に差は認められ
なかった。
【００２０】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンを基質として効
率的にγ−シアノ−α−アミノ酪酸を生成することがで
き、しかも耐熱性にも優れたγ−シアノ−α−アミノ酪
酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列と、このＤＮＡ配列
が発現するγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素、並び
にこのγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素の製造法が
提供される。これにより、上記のγ−シアノ−α−アミ
ノ酪酸合成酵素を遺伝子工学的に大量かつ効率的に製造
することが可能となる。
よって、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンを基質として効
率的にγ−シアノ−α−アミノ酪酸を生成することがで
き、しかも耐熱性にも優れたγ−シアノ−α−アミノ酪
酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列と、このＤＮＡ配列
が発現するγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素、並び
にこのγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素の製造法が
提供される。これにより、上記のγ−シアノ−α−アミ
ノ酪酸合成酵素を遺伝子工学的に大量かつ効率的に製造
することが可能となる。
【００２１】
配列番号：１ 配列の長さ：1302 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：バチルス・ステアロサーモフィルス (Baci11us
stearothermophi1us) 株名：ＣＮ３ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1302 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATGAGCAATG AACAAACTTT CCGCCCGGAG ACGCTCGCCA TCCACGCCGG GCAAAAACCG 60 GATGCGGAAA CGGGCGCGCG GGCGGTGCCG ATTTACCAAA CAAGCTCGTA TGTATTCCGC 120 GACAGCGAGC ATGCGGCCAA TTTGTTTGGC TTGAAAGAGG AAGGGTTTAT TTACACGCGC 180 ATTATGAACC CGACAAACGA TGTCTTGGAA AAACGGATCG CGGCGCTTGA AGGCGGCATT 240 GGAGCGCTTG CGCTGTCATC GGGGCAGGCG GCGGTGTTTT ATTCGATCAT CAACATCGCC 300 TCGGCGGGCG ATGAAATCGT CTCGTCGTCG TCCATTTACG GCGGAACGTA CAACTTGTTC 360 GCCCATACGC TGCGCAAGTT CGGCATTACG GTGAAGTTTG TCGATCCGTC CGATCCGGAA 420 AACTTTGAGC GGGCGATCAC CGACAAAACG AAAGCGTTGT TTGCGGAAAC GATCGGCAAC 480 CCGAAAAACG ATGTGCTCGA CATCGAAGCG GTGGCCGACA TCGCCCATCG CCATGCCATT 540 CCGCTCATCG TCGACAACAC GGTGGCCAGT CCATACTTAT TGCGGCCGAT TGAATTCGGC 600 GCCGATATCG TCGTCCACTC AGCGACGAAG TTCATCGGCG GGCACGGCAA TTCGATCGGC 660 GGTGTGATTG TGGACAGCGG CAAGTTCGAC TGGAAAGGGA GCGGCAAGTT TCCGGAGTTC 720 ACCGAGCCAG ACCCAAGCTA CCACGGGTTG GTGTATGTGG ACGCCGTCGG CGAAGCGGCG 780 TACATCACGA AAGCACGCAT TCAGCTCTTG CGCGACTTAG GAGCGGCACT GTCGCCGTTT 840 AATGCGTTTT TGCTTTTGCA AGGATTAGAG ACGCTTCACT TGCGGATGCA GCGTCATAGC 900 GAAAATGCGC TCGCTGTTGC TAAGTTTTTA GAAGAGGAAG AAGCCGTCGA ATCGGTCAAC 960 TACCCAGGGC TTCCGAGCCA TCCGTCGCAT GAACTGGCGA AAAAGTATTT GCCGAATGGG 1020 CAGGGCGCGA TCGTCACGTT TGAAATCAAA GGCGGCGTCG AAGCCGGGAA AAAATTGATC 1080 GACTCGGTGA AGCTGTTCTC GCATTTGGCC AACATCGGCG ATTCGAAATC GCTCATCATC 1140 CACCCAGCCA GCACGACGCA TGAGCAGCTG ACCCCGGAAG AACAGCTGTC CGCCGGCGTC 1200 ACCCCAGGCC TTGTGCGTCT GTCTGTCGGC ACCGAAGCGA TCGACGATAT TTTGGACGAC 1260 TTGCGCCAAG CCATTCGCCA AAGCCAGACG GTGGGGGTGA AG 1302 配列番号：２ 配列の長さ：434 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Met Ser Asn Glu Gln Thr Phe Arg Pro Glu Thr Leu Ala Ile His Ala 1 5 10 15 Gly Gln Lys Pro Asp Ala Glu Thr Gly Ala Arg Ala Val Pro Ile Tyr 20 25 30 Gln Thr Ser Ser Tyr Val Phe Arg Asp Ser Glu His Ala Ala Asn Leu 35 40 45 Phe Gly Leu Lys Glu Glu Gly Phe Ile Tyr Thr Arg Ile Met Asn Pro 50 55 60 Thr Asn Asp Val Leu Glu Lys Arg Ile Ala Ala Leu Glu Gly Gly Ile 65 70 75 80 Gly Ala Leu Ala Leu Ser Ser Gly Gln Ala Ala Val Phe Tyr Ser Ile 85 90 95 Ile Asn Ile Ala Ser Ala Gly Asp Glu Ile Val Ser Ser Ser Ser Ile 100 105 110 Tyr Gly Gly Thr Tyr Asn Leu Phe Ala His Thr Leu Arg Lys Phe Gly 115 120 125 Ile Thr Val Lys Phe Val Asp Pro Ser Asp Pro Glu Asn Phe Glu Arg 130 135 140 Ala Ile Thr Asp Lys Thr Lys Ala Leu Phe Ala Glu Thr Ile Gly Asn 145 150 155 160 Pro Lys Asn Asp Val Leu Asp Ile Glu Ala Val Ala Asp Ile Ala His 165 170 175 Arg His Ala Ile Pro Leu Ile Val Asp Asn Thr Val Ala Ser Pro Tyr 180 185 190 Leu Leu Arg Pro Ile Glu Phe Gly Ala Asp Ile Val Val His Ser Ala 195 200 205 Thr Lys Phe Ile Gly Gly His Gly Asn Ser Ile Gly Gly Val Ile Val 210 215 220 Asp Ser Gly Lys Phe Asp Trp Lys Gly Ser Gly Lys Phe Pro Glu Phe 225 230 235 240 Thr Glu Pro Asp Pro Ser Tyr His Gly Leu Val Tyr Val Asp Ala Val 245 250 255 Gly Glu Ala Ala Tyr Ile Thr Lys Ala Arg Ile Gln Leu Leu Arg Asp 260 265 270 Leu Gly Ala Ala Leu Ser Pro Phe Asn Ala Phe Leu Leu Leu Gln Gly 275 280 285 Leu Glu Thr Leu His Leu Arg Met Gln Arg His Ser Glu Asn Ala Leu 290 295 300 Ala Val Ala Lys Phe Leu Glu Glu Glu Glu Ala Val Glu Ser Val Asn 305 310 315 320 Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Ser His Glu Leu Ala Lys Lys Tyr 325 330 335 Leu Pro Asn Gly Gln Gly Ala Ile Val Thr Phe Glu Ile Lys Gly Gly 340 345 350 Val Glu Ala Gly Lys Lys Leu Ile Asp Ser Val Lys Leu Phe Ser His 355 360 365 Leu Ala Asn Ile Gly Asp Ser Lys Ser Leu Ile Ile His Pro Ala Ser 370 375 380 Thr Thr His Glu Gln Leu Thr Pro Glu Glu Gln Leu Ser Ala Gly Val 385 390 395 400 Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Thr Glu Ala Ile Asp Asp 405 410 415 Ile Leu Asp Asp Leu Arg Gln Ala Ile Arg Gln Ser Gln Thr Val Gly 420 425 430 Val Lys
stearothermophi1us) 株名：ＣＮ３ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1302 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATGAGCAATG AACAAACTTT CCGCCCGGAG ACGCTCGCCA TCCACGCCGG GCAAAAACCG 60 GATGCGGAAA CGGGCGCGCG GGCGGTGCCG ATTTACCAAA CAAGCTCGTA TGTATTCCGC 120 GACAGCGAGC ATGCGGCCAA TTTGTTTGGC TTGAAAGAGG AAGGGTTTAT TTACACGCGC 180 ATTATGAACC CGACAAACGA TGTCTTGGAA AAACGGATCG CGGCGCTTGA AGGCGGCATT 240 GGAGCGCTTG CGCTGTCATC GGGGCAGGCG GCGGTGTTTT ATTCGATCAT CAACATCGCC 300 TCGGCGGGCG ATGAAATCGT CTCGTCGTCG TCCATTTACG GCGGAACGTA CAACTTGTTC 360 GCCCATACGC TGCGCAAGTT CGGCATTACG GTGAAGTTTG TCGATCCGTC CGATCCGGAA 420 AACTTTGAGC GGGCGATCAC CGACAAAACG AAAGCGTTGT TTGCGGAAAC GATCGGCAAC 480 CCGAAAAACG ATGTGCTCGA CATCGAAGCG GTGGCCGACA TCGCCCATCG CCATGCCATT 540 CCGCTCATCG TCGACAACAC GGTGGCCAGT CCATACTTAT TGCGGCCGAT TGAATTCGGC 600 GCCGATATCG TCGTCCACTC AGCGACGAAG TTCATCGGCG GGCACGGCAA TTCGATCGGC 660 GGTGTGATTG TGGACAGCGG CAAGTTCGAC TGGAAAGGGA GCGGCAAGTT TCCGGAGTTC 720 ACCGAGCCAG ACCCAAGCTA CCACGGGTTG GTGTATGTGG ACGCCGTCGG CGAAGCGGCG 780 TACATCACGA AAGCACGCAT TCAGCTCTTG CGCGACTTAG GAGCGGCACT GTCGCCGTTT 840 AATGCGTTTT TGCTTTTGCA AGGATTAGAG ACGCTTCACT TGCGGATGCA GCGTCATAGC 900 GAAAATGCGC TCGCTGTTGC TAAGTTTTTA GAAGAGGAAG AAGCCGTCGA ATCGGTCAAC 960 TACCCAGGGC TTCCGAGCCA TCCGTCGCAT GAACTGGCGA AAAAGTATTT GCCGAATGGG 1020 CAGGGCGCGA TCGTCACGTT TGAAATCAAA GGCGGCGTCG AAGCCGGGAA AAAATTGATC 1080 GACTCGGTGA AGCTGTTCTC GCATTTGGCC AACATCGGCG ATTCGAAATC GCTCATCATC 1140 CACCCAGCCA GCACGACGCA TGAGCAGCTG ACCCCGGAAG AACAGCTGTC CGCCGGCGTC 1200 ACCCCAGGCC TTGTGCGTCT GTCTGTCGGC ACCGAAGCGA TCGACGATAT TTTGGACGAC 1260 TTGCGCCAAG CCATTCGCCA AAGCCAGACG GTGGGGGTGA AG 1302 配列番号：２ 配列の長さ：434 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Met Ser Asn Glu Gln Thr Phe Arg Pro Glu Thr Leu Ala Ile His Ala 1 5 10 15 Gly Gln Lys Pro Asp Ala Glu Thr Gly Ala Arg Ala Val Pro Ile Tyr 20 25 30 Gln Thr Ser Ser Tyr Val Phe Arg Asp Ser Glu His Ala Ala Asn Leu 35 40 45 Phe Gly Leu Lys Glu Glu Gly Phe Ile Tyr Thr Arg Ile Met Asn Pro 50 55 60 Thr Asn Asp Val Leu Glu Lys Arg Ile Ala Ala Leu Glu Gly Gly Ile 65 70 75 80 Gly Ala Leu Ala Leu Ser Ser Gly Gln Ala Ala Val Phe Tyr Ser Ile 85 90 95 Ile Asn Ile Ala Ser Ala Gly Asp Glu Ile Val Ser Ser Ser Ser Ile 100 105 110 Tyr Gly Gly Thr Tyr Asn Leu Phe Ala His Thr Leu Arg Lys Phe Gly 115 120 125 Ile Thr Val Lys Phe Val Asp Pro Ser Asp Pro Glu Asn Phe Glu Arg 130 135 140 Ala Ile Thr Asp Lys Thr Lys Ala Leu Phe Ala Glu Thr Ile Gly Asn 145 150 155 160 Pro Lys Asn Asp Val Leu Asp Ile Glu Ala Val Ala Asp Ile Ala His 165 170 175 Arg His Ala Ile Pro Leu Ile Val Asp Asn Thr Val Ala Ser Pro Tyr 180 185 190 Leu Leu Arg Pro Ile Glu Phe Gly Ala Asp Ile Val Val His Ser Ala 195 200 205 Thr Lys Phe Ile Gly Gly His Gly Asn Ser Ile Gly Gly Val Ile Val 210 215 220 Asp Ser Gly Lys Phe Asp Trp Lys Gly Ser Gly Lys Phe Pro Glu Phe 225 230 235 240 Thr Glu Pro Asp Pro Ser Tyr His Gly Leu Val Tyr Val Asp Ala Val 245 250 255 Gly Glu Ala Ala Tyr Ile Thr Lys Ala Arg Ile Gln Leu Leu Arg Asp 260 265 270 Leu Gly Ala Ala Leu Ser Pro Phe Asn Ala Phe Leu Leu Leu Gln Gly 275 280 285 Leu Glu Thr Leu His Leu Arg Met Gln Arg His Ser Glu Asn Ala Leu 290 295 300 Ala Val Ala Lys Phe Leu Glu Glu Glu Glu Ala Val Glu Ser Val Asn 305 310 315 320 Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Ser His Glu Leu Ala Lys Lys Tyr 325 330 335 Leu Pro Asn Gly Gln Gly Ala Ile Val Thr Phe Glu Ile Lys Gly Gly 340 345 350 Val Glu Ala Gly Lys Lys Leu Ile Asp Ser Val Lys Leu Phe Ser His 355 360 365 Leu Ala Asn Ile Gly Asp Ser Lys Ser Leu Ile Ile His Pro Ala Ser 370 375 380 Thr Thr His Glu Gln Leu Thr Pro Glu Glu Gln Leu Ser Ala Gly Val 385 390 395 400 Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Thr Glu Ala Ile Asp Asp 405 410 415 Ile Leu Asp Asp Leu Arg Gln Ala Ile Arg Gln Ser Gln Thr Val Gly 420 425 430 Val Lys
【図１】γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素遺伝子の
全域を含む４kbp のＤＮＡ断片をｐＵＣ１９に連結した
組換えプラスミド（ｐＧＣＢ10）の作成工程図である。
全域を含む４kbp のＤＮＡ断片をｐＵＣ１９に連結した
組換えプラスミド（ｐＧＣＢ10）の作成工程図である。
【図２】ＰＣＲ法で増幅したγ−シアノ−α−アミノ酪
酸合成酵素遺伝子を、ｐＫＫ223-3 に連結した組換えプ
ラスミド（ｐＧＣＢ20）の作成工程図である。
酸合成酵素遺伝子を、ｐＫＫ223-3 に連結した組換えプ
ラスミド（ｐＧＣＢ20）の作成工程図である。
【図３】ＰＣＲ法で増幅したγ−シアノ−α−アミノ酪
酸合成酵素遺伝子を、ｐＫＫ223-3 に連結した組換えプ
ラスミド（ｐＧＣＢ20）の構造および塩基配列を示す図
である。
酸合成酵素遺伝子を、ｐＫＫ223-3 に連結した組換えプ
ラスミド（ｐＧＣＢ20）の構造および塩基配列を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 小村 啓悟 広島県福山市南松永町２−179−２ (72)発明者 古谷 祐治 広島県深安郡神辺町十三軒屋20−９ (72)発明者 小林 達彦 京都府京都市左京区浄土寺下馬場町97 ロ イヤルセンタービル307号 (72)発明者 清水 昌 京都府京都市中京区西ノ京伯楽町14
Claims (11)
- 【請求項１】 Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンまたはＬ
−ホモシスチンとシアン化物からγ−シアノ−α−アミ
ノ酪酸を生成し、あるいはＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリ
ンと硫化物から含硫アミノ酸を生成するγ−シアノ−α
−アミノ酪酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 配列番号１の塩基配列またはその変異配
列を有する請求項１のＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 請求項１または２のＤＮＡ配列を保持す
る組換えプラスミド。 - 【請求項４】 請求項２のＤＮＡ配列を保持する組換え
プラスミドｐＧＣＢ１０。 - 【請求項５】 請求項２のＤＮＡ配列を保持する組換え
プラスミドｐＧＣＢ２０。 - 【請求項６】 請求項１または２のＤＮＡ配列で形質転
換された微生物。 - 【請求項７】 組換えプラスミドｐＧＣＢ１０で形質転
換された大腸菌。 - 【請求項８】 組換えプラスミドｐＧＣＢ２０で形質転
換された大腸菌。 - 【請求項９】 請求項１または２のＤＮＡ配列が発現す
るγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素。 - 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸配列またはその
一部配列を有する請求項９のγ−シアノ−α−アミノ酪
酸合成酵素。 - 【請求項１１】 請求項６の微生物を培養し、この微生
物が産生したγ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素を培
地から回収することを特徴とするγ−シアノ−α−アミ
ノ酪酸合成酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9034612A JPH10229880A (ja) | 1997-02-19 | 1997-02-19 | γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素をコードするＤ ＮＡ配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9034612A JPH10229880A (ja) | 1997-02-19 | 1997-02-19 | γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素をコードするＤ ＮＡ配列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10229880A true JPH10229880A (ja) | 1998-09-02 |
Family
ID=12419205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9034612A Pending JPH10229880A (ja) | 1997-02-19 | 1997-02-19 | γ−シアノ−α−アミノ酪酸合成酵素をコードするＤ ＮＡ配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10229880A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2370214A (en) * | 2000-12-19 | 2002-06-26 | Bagir Co | An item of apparel |
-
1997
- 1997-02-19 JP JP9034612A patent/JPH10229880A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2370214A (en) * | 2000-12-19 | 2002-06-26 | Bagir Co | An item of apparel |
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|---|---|---|---|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040210 |
|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060704 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061107 |