JPH10237095A - 蛋白質の安定化剤、安定化方法および組成物 - Google Patents

蛋白質の安定化剤、安定化方法および組成物

Info

Publication number
JPH10237095A
JPH10237095A JP9038206A JP3820697A JPH10237095A JP H10237095 A JPH10237095 A JP H10237095A JP 9038206 A JP9038206 A JP 9038206A JP 3820697 A JP3820697 A JP 3820697A JP H10237095 A JPH10237095 A JP H10237095A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
polymer
meth
acrylate
stabilizer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP9038206A
Other languages
English (en)
Inventor
Hidejiro Sakaki
秀次郎 榊
Kenshirou Shiyudou
健志郎 首藤
Satoshi Yamada
智 山田
Ryota Ando
亮太 安藤
Yasuyoshi Koinuma
康美 鯉沼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NOF Corp
Original Assignee
NOF Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NOF Corp filed Critical NOF Corp
Priority to JP9038206A priority Critical patent/JPH10237095A/ja
Publication of JPH10237095A publication Critical patent/JPH10237095A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】蛋白質の安定化に優れた安定化剤、蛋白質安定
化方法および安定化剤を含む組成物を提供する。 【解決手段】グリコシルエチル（メタ）アクリレートを
含む成分を重合した重合体を有効成分とする蛋白質の安
定化剤、安定化方法および該安定化剤を用いた蛋白質組
成物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床、臨床診断あ
るいはメディカルデバイスなどで用いられる各種蛋白質
の安定化剤、安定化方法に関するものである。さらには
その安定化剤を用いた蛋白質組成物に関する。更に詳し
くは、アルブミン製剤、血液凝固因子製剤、免疫グロブ
リン製剤などの血漿製剤に含まれる蛋白質の安定化剤、
臨床診断で用いられる酵素、抗体（あるいは抗原）、標
識抗体（あるいは標識抗原）などの安定化剤、コンタク
トレンズの洗浄等に用いられる加水分解酵素などの安定
化剤、安定化方法および安定化された蛋白質組成物に関
する。
【０００２】
【従来の技術】臨床に用いられるアルブミン製剤、血液
凝固因子製剤、免疫グロブリン製剤などの血漿製剤は、
新鮮凍結血漿、または期限切れ保存血液から回収された
血漿を原料とし、溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態で
保存され、有効期限は１〜５年となっている。その中で
免疫グロブリン製剤の静注用製剤は、ヒト免疫グロブリ
ンの中からＩｇＧだけを取り出して、静脈注射を可能に
した製剤であり、ＩｇＧをそのまま抽出すると会合体を
形成して機能しづらくなり、アナフィラキシー・ショッ
クの原因となる。そこで従来より、蛋白質分解酵素であ
るペプシンあるいはプラスミンでヒト免疫グロブリンの
分子を分解する方法、ヒト免疫グロブリンの分子のＣ領
域はそのままにしてＶ領域との結合部位を化学変性させ
る方法、ヒト免疫グロブリンの分子をｐＨ４の溶液で処
理する方法あるいはヒト免疫グロブリンをイオン交換樹
脂で処理する方法が知られている。しかしながら、酵素
処理する方法は補体結合部位（Ｃ領域）が分かれるため
半減期が短くなり、化学変性させる方法は注射直後には
天然のＩｇＧより免疫力がやや落ちる問題があり、ｐＨ
４の溶液で処理する方法や、イオン交換樹脂で処理する
方法は汎用性にやや欠ける問題がある（’９５年 医療
用医薬品データブック 下巻、富士経済（１９９５
年））。
【０００３】また、臨床診断に用いられる抗体（あるい
は抗原）または、標識抗体（あるいは標識抗原）など
は、溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態でその活性（抗
体活性、抗原性、酵素活性など）を保持するために、サ
ッカロース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡと略す。）な
どを添加する方法が一般に知られている。また特に凍結
乾燥をする際に、あるいは凍結乾燥状態でその活性（抗
体活性、抗原性、酵素活性など）を保持するために、サ
ッカロース、ＢＳＡ、ゼラチンなどを添加する方法が知
られている。しかしながら、上記の各種添加剤を用いる
方法は２５℃以上、数カ月以上では、その抗体活性、抗
原性あるいは酵素活性が低下するなどの問題があった。
【０００４】また、アクリジニウム誘導体で標識された
抗体または抗原を水溶液中シクロデキストリン類を存在
させることにより安定化する方法が開示されている（特
開平７−２７８１８４号公報）。更に、クリスタリンを
生理活性蛋白質の溶液に含有させることにより生理活性
蛋白質を安定化する方法が開示されている（特開平７−
２３６４８３号公報）。
【０００５】更に、コンタクトレンズの洗浄に用いられ
る加水分解酵素溶液に安定化剤として、１）ゼラチンお
よび／またはカゼイン、２）多価アルコールおよび／ま
たは糖類の一種またはそれ以上、および３）エチルアル
コールを添加する方法が開示されている（特開昭４１−
１５２号公報）。しかし、前記の開示された技術では、
蛋白質の安定化においてその効果は必ずしも十分ではな
い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の第１の目的
は、臨床、臨床診断あるいはメディカルデバイスなどで
用いられる各種蛋白質、例えばアルブミン製剤、血液凝
固因子製剤、免疫グロブリン製剤などの血漿蛋白質、臨
床診断で用いられる酵素、抗体（あるいは抗原）、標識
抗体（あるいは標識抗原）など、コンタクトレンズの洗
浄に用いられる加水分解酵素などを、その保存状態を問
わず、溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態で安定化する
安定化剤を提供することにある。本発明の第２の目的
は、前記の安定化剤を用いた蛋白質の安定化方法を提供
することにある。また、本発明の第３の目的は、前記安
定化剤を用いた蛋白質組成物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意検討
した結果、特定なグリコシルエチル（メタ）アクリレー
ト基を含有する単量体を重合した重合体が、蛋白質を安
定化させることの知見を得て、本発明を完成した。すな
わち、本発明は次の（１）〜（５）である。 （１）グリコシルエチル（メタ）アクリレートを含む成
分を重合した重合体を有効成分とする蛋白質の安定化
剤。 （２）グリコシルエチル（メタ）アクリレートを含む成
分を重合した重合体と蛋白質とを同一系内に共存させる
ことを特徴とする蛋白質の安定化方法。 （３）グリコシルエチル（メタ）アクリレートを含む成
分を重合した重合体を有効成分とする安定化剤と蛋白質
とを含んでなる蛋白質組成物。 （４）（Ａ）グリコシルエチル（メタ）アクリレートを
含む成分を重合してなる重合体１．０×１０-4〜８０重
量％、（Ｂ）蛋白質１．０×１０-14〜２０重量％、お
よび、（Ｃ）緩衝液０〜９９．９８重量％、を含んでな
る安定化した蛋白質組成物。 （５）前記の蛋白質が血漿製剤蛋白質、標識免疫学的活
性物質、または酵素である蛋白質組成物。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明に用いられる安定化剤の原
料であるグリコシルエチル（メタ）アクリレートは、下
記の一般式［１］に示されるものである。
【化１】 （ただし、Ｒは水素原子またはメチル基であり、Ｇは、
グルコース残基を示す。） 一般式［１］のＧのグルコース残基は、Ｄ−グルコース
あるいはＬ−グルコース由来の残基でもよく、また混合
物でもよい。またα−型またはβ−型のＤ−グルコピラ
ノース型でもよい。入手性からは、市販品を用いてもよ
い。市販品の例としては、グリコシルエチルメタクリレ
ート（日本精化（株）社製、ＧＥＭＡ）が挙げられ、構
造としては、下記の式［２］で表される。
【化２】 入手性の点から、グリコシルエチルメタクリレートが特
に好ましい。
【０００９】本発明でのグリコシルエチル（メタ）アク
リレートを含む成分を重合した重合体（以下、重合体Ａ
と表す。）すなわち安定化剤は、前記式［１］のグリコ
シルエチル（メタ）アクリレート（以下、単量体ａと表
す。）を単独重合してもよく、また単量体ａと共重合可
能な他の単量体（単量体ｂと表す。）と共重合してもよ
い。この重合体Ａを構成する単量体ａに基づく構成単位
の含量は、重合体Ａ中１〜１００モル％が好ましく、特
に５モル％以上が好ましい。前記配合割合が１モル％未
満の場合には、蛋白質の安定化効果が得られ難いので好
ましくない。また重合体Ａは、重合温度、重合開始剤の
使用量、重合度調整剤の使用の有無などによっても異な
るが、好ましくは１，０００〜１，０００，０００、特
に好ましくは、２，０００〜５００，０００の重合体で
ある。
【００１０】前記重合体Ａを調製するには、例えば、重
合開始剤の存在下、単量体ａを単独重合するか、あるい
は単量体ａと共重合可能な他の単量体ｂとを共重合させ
る方法などにより得ることができる。単量体ｂとして
は、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アク
リル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）
アクリル酸ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸イソブチ
ル、（メタ）アクリル酸ペンチル、（メタ）アクリル酸
ヘキシル、（メタ）アクリル酸ヘプチル、（メタ）アク
リル酸オクチル、（メタ）アクリル酸トリデシルなどの
（メタ）アクリル酸アルキルエステル；２−ヒドロキシ
エチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル
（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸ヒドロ
キシアルキルエステル；（メタ）アクリレート；スチレ
ン、α−メチルスチレン、メチル核置換スチレン、クロ
ロ核置換スチレンなどのスチレン系単量体；塩化ビニ
ル、塩化ビニリデンなどのハロゲン系単量体；エチレ
ン、プロピレン、イソブチレンなどのオレフィン系単量
体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエス
テル系単量体；エチルビニルエーテル、ｎ−ブチルビニ
ルエーテルなどのビニルエーテル系単量体；ジエチルイ
タコネート、ジ−ｎ−ブチルイタコネートなどの二価カ
ルボン酸エステル系単量体が挙げられる。好ましくは、
メタクリル酸エステル、スチレンなどが挙げられる。
【００１１】また、前記重合開始剤としては、通常のラ
ジカル重合開始剤であれば特に限定されるものではない
が、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、
過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボ
ネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエ
ート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペ
ルオキシジイソブチレート、過硫酸塩、過硫酸一亜硫酸
水素塩などが挙げられる。ラジカル重合開始剤の使用量
としては全単量体１００重量部に対して０．０１〜１０
重量部が好ましく、特に好ましくは０．１〜５重量部で
ある。
【００１２】また前記重合条件は、好ましくは３０〜８
０℃、特に好ましくは４０〜７０℃において２〜７２時
間重合させるのが望ましい。この際、重合反応をより円
滑に行なうために溶媒を用いてもよい。該溶媒として
は、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノー
ル、ｔ−ブタノール、ベンゼン、メチルエチルケトン
（ＭＥＫ）、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラ
ヒドロフラン、クロロホルムおよびこれらの混合物など
を挙げることができる。
【００１３】本発明の蛋白質の安定化剤すなわち安定化
方法に用いる重合体Ａの形状は、粉末状態であっても、
懸濁液状態であっても溶液状態であってもよく、好まし
くは蛋白質を変性させることのない、リン酸緩衝液、酢
酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、各種生理食塩
水などの溶解液あるいは懸濁液が挙げられる。これらの
溶液にジメチルスルホオキシド、テトラヒドロフランあ
るいはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒を
０．０１〜２０重量％添加しても良い。特に好ましくは
リン酸緩衝液、各種生理食塩水などの溶解液が挙げられ
る。
【００１４】本発明において、対象となる蛋白質として
は、特に限定されないが、後述する血漿製剤蛋白質、標
識免疫学的活性物質、酵素等がより好ましく挙げられ
る。
【００１５】本発明の安定化方法における「同一系内に
共存させる」の意味は、前記の重合体Ａと蛋白質との混
合が溶液状態でも粉末状態でもよいことを示す。例え
ば、溶液状態の蛋白質と重合体Ａの溶液あるいは重合体
Ａの粉末を公知の方法で混合して均一の溶液としてもよ
い。また、溶液状態の蛋白質と重合体Ａの溶液あるいは
重合体Ａの粉末を混合した後に、凍結乾燥などにより粉
末状態としてもよい。
【００１６】また、本発明の蛋白質組成物は、前記安定
化剤と蛋白質を含んでなるものであり、具体的には、
（Ａ）グリコシルエチル（メタ）アクリレートを含む成
分を重合してなる重合体を有効成分する安定化剤１．０
×１０-4〜８０重量％、（Ｂ）蛋白質１．０×１０-14
〜２０重量％および、（Ｃ）緩衝液０〜９９．９８重量
％を含んでなる安定化された蛋白質組成物である。その
組成物は、該当する安定化剤、蛋白質を、公知の方法で
配合するか、あるいは該当する安定化剤の溶液、蛋白質
の溶液を配合することによって得られる。本発明の蛋白
質組成物に用いられる重合体Ａの濃度は、蛋白質の濃度
および状態にもよるが、溶液の場合は、１．０×１０-4
重量％〜８０重量％である。好ましくは粘性も高くなら
ず取り扱いやすい１．０×１０-3重量％〜４０重量％で
ある。重合体が水溶液の場合、重合体の濃度が８０重量
％より多くなると、水溶液の粘度が高くなり、取り扱い
難くなるので、好ましくない。１．０×１０-4重量％よ
り少ないと濃度が薄くなりすぎて、蛋白質安定化の効果
が少なくなるので好ましくない。
【００１７】前記の蛋白質の濃度は、その種類及び用途
によって依存するが、通常１．０×１０-14〜２０重量
％であり、好ましくは、１．０×１０-8〜１０重量％、
更に好ましくは、１．０×１０-7〜５重量％である。
【００１８】本発明で用いる蛋白質は、血漿製剤蛋白
質、標識免疫学的活性物質及び酵素が好ましい。本発明
で用いる血漿製剤蛋白質は、アルブミン製剤、血液凝固
因子製剤、免疫グロブリン製剤などに含まれる蛋白質を
示す。血液凝固因子製剤としては、第VIII因子製剤、第
IX因子製剤、第Ｉ因子製剤、アンチトロンビンIII製
剤、第II因子製剤、第III因子製剤、第IV因子製剤、第
Ｖ因子製剤、第VII因子製剤、第Ｘ因子製剤、第XI因子
製剤、第XII因子製剤などが挙げられ、また、免疫グロ
ブリン製剤としては筋注用製剤および静注用製剤などが
挙げられる。
【００１９】本発明で用いる免疫学的活性物質とは、前
記の血漿製剤に含まれる免疫グロブリンを除いて、例え
ば、次の〜の免疫学的活性物質が具体例として挙げ
られる。 Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、リューマチ因子（Ｒ
Ｆ）、トランスフェリン等の血漿蛋白質あるいはこれら
血漿蛋白質に対する抗体。 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、トリヨードサイロニ
ン（Ｔ3）、サイロキシン（Ｔ4）、チロキシン結合蛋白
質（ＴＢＧ）、サイログロブリン、インスリン、エスト
リオール（Ｅ3）、絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、
ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）等のホルモンあるい
はこれらホルモンに対する抗体。 癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β2−マイクログロブリ
ン、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）等の腫瘍関連物質
あるいはこれら腫瘍関連物質に対する抗体。 ＨＢS抗原、ＨＢS抗体、ＨＢe抗原、ＨＢe抗体等のウ
イルス肝炎の抗原または抗体あるいは、これらウイルス
肝炎の抗原または抗体に対する抗体または抗原。 ムンプス、ヘルペス、麻疹、風疹、サイトメガロ等の
ウイルス、抗エイズ抗体等の各種生体成分に対する抗体
または抗原。 フェノバルビタール、アセトアミノフェノン、サリチ
ル酸、シクロスポリン等の各種薬剤に対する抗体。 酵素あるいは酵素に対する抗体。 前記の抗体はＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）’フラグ
メントまたは還元型抗体であってもよい。
【００２０】本発明における標識免疫学的活性物質と
は、前記免疫学的活性物質に酵素、蛍光物質、発光物質
などを化学結合的に結合させたものを示す。標識される
酵素は特に限定されないが、アセチルコリンエステラー
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ペ
ニシリナーゼ、ペルオキシダーゼ、リゾチームなどが挙
げられ、好ましくは、酵素免疫測定法にて汎用的に用い
られるアルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【００２１】また標識される蛍光物質は特に限定される
ものではないが、フルオレセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザ
ン、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン、スルホ
ローダミン１０１酸クロリド、４−クロロ−７−スルホ
ベンゾフラザンアンモニウム塩、Ｎ−（９−アクリジニ
ル）マレイミドなどが挙げられる。好ましくは、免疫学
的活性物質の遊離のアミノ基と混ぜるだけで反応するフ
ルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、４−ク
ロロ−７−ニトロベンゾフラザン、スルホローダミン１
０１酸クロリドなどが挙げられる。
【００２２】更にまた、標識される発光物質としては、
免疫学的活性物質の遊離のアミノ基と容易に反応する１
０−メチル−９−｛４−［２−（スクシンイミジルオキ
シカルボニル）エチル］フェニルオキシカルボニル｝ア
クリジニウムフルオロサルフェートなども用いることが
可能である。
【００２３】本発明で用いる酵素としては、特に限定さ
れないが、例えば、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解
酵素、脱離酵素、異性化酵素、合成酵素などが挙げられ
る。特に好ましくは、臨床診断あるいはメディカルデバ
イスなどに用いられる加水分解酵素の一種であるグリコ
シル加水分解酵素（糖加水分解酵素）、エステル加水分
解酵素であるコレステロールエステラーゼ、アルカリフ
ォスファターゼ、あるいは酸化還元酵素の一種である過
酸化酵素の西洋わさび過酸化酵素（ｈｏｒｅｓｅｒａｄ
ｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｓｉｄａｚｅ）などが挙げられ
る。これらの中で臨床診断に用いる際は、好ましくは、
コレステロールエステラーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、あるいは西洋わさび過
酸化酵素などが挙げられる。本発明で用いる加水分解酵
素としては、具体的には、カルボヒドラーゼ、エステラ
ーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、ハロゲナーゼ、ホス
ファターゼなどが挙げられる。一般に、市販品を利用で
きる。例えばビオプラーゼ（ナガセ生化学工業（株）
製、商品名、ペプチド分解酵素）、リパーゼサイケン
（ナガセ生化学工業（株）製、商品名、エステル加水分
解酵素）などが挙げられる。また酵素の起源は限定され
ず、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などあらゆる起源
のものが使用できる。
【００２４】これらの中で、コンタクトレンズの洗浄あ
るいは皮膚の美白などに用る際は、好ましくは、蛋白質
分解酵素、例えばビオプラーゼ（ナガセ生化学工業
（株）製、商品名、ペプチド分解酵素）などが挙げられ
る。蛋白質の含量は、１．０×１０-14〜２０重量％で
あり、１．０×１０-14重量％より少ないと蛋白質の活
性が低くなる場合があり、２０重量％より多いと重合体
Ａの含量を増やすことになり、その際に粘度が高く取り
扱い難くなるので好ましくない。緩衝液は、０〜９９．
９８重量％であり、水溶液でも、水溶性の少量の溶剤を
含んでもよい。
【００２５】
【発明の効果】本発明の蛋白質の安定化剤は、グリコシ
ルエチル（メタ）アクリレートである単量体を含む成分
を重合した重合体であり、その安定化剤を添加するだけ
で容易に蛋白質の活性が保持されて長期安定化が図れ
る。また、本発明の安定化剤を蛋白質、すなわち血漿製
剤蛋白質、標識免疫学的活性物質あるいは酵素と配合し
た蛋白質組成物は、各々の活性が高く保持されており、
長期安定化が可能となる。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
する。実施例、比較例に用いた重合体を次の合成例によ
り合成した。
【００２７】合成例１−１ 総単量体濃度が１．０ｍｏｌ／ｌ及び重合開始剤は単量
体に対して１ｍｏｌ％となるように、表１に示したグリ
コシルエチルメタクリレート（日本精化（株）社製、以
下ＧＥＭＡと称す）５．８４６ｇ（２０．０ｍｍｏｌ）
を重合用ガラス反応管に秤取し、これに重合開始剤とし
て２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）
０．０３２８ｇ（０．２ｍｍｏｌ）、重合溶媒としてメ
タノ−ル２０ｍＬを加えた。反応管内を充分にアルゴン
置換した後、密封した。これを２４時間６０℃に加温す
ることにより、重合反応を行なった。反応混合物を氷冷
した後、４００ｍＬのメチルエチルケトン（以下ＭＥＫ
と称す）に滴下することにより重合体を沈澱させた。こ
れを瀘別し、充分にＭＥＫで洗浄した後、減圧乾燥して
白色粉末状の重合体を３．２７６ｇ得た。重合率は５
６．０％であった。分子量は重合体の緩衝溶液をゲルパ
ーミエーションクロマトグラフィー（以下ＧＰＣと略
す）を用いて分析することにより測定した結果、ポリエ
チレングリコール換算で数平均分子量が６９，０００で
あった。この重合体を重合体Ｂとする。
【００２８】合成例１−２ ＧＥＭＡとスチレン（以下、Ｓｔと表す）の単量体仕込
みモル比がＧＥＭＡ／Ｓｔ＝７０／３０、総単量体濃度
が１．０ｍｏｌ／ｌ及び重合開始剤は単量体に対して１
ｍｏｌ％となるように、ＧＥＭＡを４．０９２ｇ（１
４．０ｍｍｏｌ），Ｓｔを０．６２５ｇ（６．０ｍｍｏ
ｌ）を重合用ガラス反応管に秤取し、これに重合開始剤
としてＡＩＢＮ０．０３２８ｇ（０．２ｍｍｏｌ）、重
合溶媒としてメタノ−ル２０ｍＬを加えた。反応管内を
充分にアルゴン置換した後、密封した。これを２４時間
６０℃で加温して重合反応を行なった。反応混合物を氷
冷した後、４００ｍＬのＭＥＫに滴下して重合体を沈澱
させた。これを瀘別し、充分にＭＥＫで洗浄した後、減
圧乾燥して白色粉末状の重合体を２．６０４ｇ得た。重
合率は５５．２％であった。分子量はポリマ−の緩衝溶
液をＧＰＣを用いて分析することにより測定した結果、
ポリエチレングリコール換算で数平均分子量５６，００
０であった。モル組成比は、1Ｈ−ＮＭＲ分析の結果よ
り、ＧＥＭＡ／Ｓｔ＝７３．８／２６．２であった。こ
の重合体を重合体Ｃとする。結果を表１に示した。
【００２９】
【表１】
【００３０】参考例１；抗体固定化プレートの調製 タイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６；ＮＵＮ
Ｃ社）の各ウェルに１００ｍＭ−リン酸水素二ナトリウ
ム／リン酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶
解した５．０μｇ／ｍＬの抗ヒト免疫グロブリンＧを１
００μＬ加えて、４℃で１２時間インキュベートした。
インキュベート終了後、各ウェルを、１５０ｍＭ−Ｎａ
Ｃｌを添加した１０ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム／リ
ン酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で３回洗浄
した。５．０重量％ウシ血清アルブミンを添加した１０
ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．５）溶液を各ウェルに３００μＬ加
えて、２５℃、２時間インキュベートした。インキュベ
ート終了後、各ウェルの溶液をデカンテーションにより
除去した。その後、−８０℃のフリーザーにて凍結させ
た後に乾燥させて凍結乾燥済み抗体固定化プレートを調
製した。
【００３１】実施例１−１：血漿製剤蛋白質の安定化試
験１ １００ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した、５μｇ／ｍ
Ｌヒト免疫グロブリンＧ溶液に合成例１−１で合成した
重合体を２．０重量％となるように添加した。その後に
４０℃でインキュベートした。なお、添加した日を０日
後とした。
【００３２】０日後、２週間後、１カ月後、２カ月後、
３カ月後および４カ月後の各ヒト免疫グロブリンＧ溶液
を、参考例１で調製した抗体固定化プレートの８ウェル
に１００μＬ／ウェルになるように添加した後に、２５
℃、１時間インキュベートした。インキュベート終了
後、各ウェルを、１５０ｍＭ−ＮａＣｌを添加した１０
ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．５）で３回洗浄した。その後、５．
０重量％ウシ血清アルブミン、１５０ｍＭ−ＮａＣｌを
添加した１０ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム／リン酸二
水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で１００００倍希
釈した西洋わさび過酸化酵素（ホースラデッシュペルオ
キシダーゼ＝Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄ
ａｓｅ）標識抗ヒト免疫グロブリンＧを各ウェルに１０
０μＬ加えて、２５℃、１時間インキュベートした。イ
ンキュベート終了後、各ウェルを、１５０ｍＭ−ＮａＣ
ｌを添加した１０ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム／リン
酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で３回洗浄し
た。「ＯＰＤ錠」（＝ｏ−フェニレンジアミン、和光純
薬工業の商品名）１錠を０．００６％の過酸化水素を含
むリン酸／クエン酸緩衝液１２ｍＬに溶解した溶液を、
１００μＬ／ウェル添加した後、２５℃、１０分間イン
キュベートした後に、２Ｎの硫酸溶液を５０μＬ／ウェ
ル加えた後に、マイクロプレートリーダ（東ソー社製商
品名「［ＭＰＲ−Ａ４ｉ」）を用いて、各ウェルの４９
２ｎｍの吸光度を測定し、０日後の吸光度を１００％と
して、各日後の吸光度（％）を求めた。なお、配合を表
２に示し、測定結果を表３に示した。
【００３３】
【表２】
【００３４】実施例１−２：血漿製剤蛋白質の安定化試
験２ 実施例１−１で用いた合成例１−１の重合体の代わり
に、合成例１−２で合成した重合体を用いた以外は実施
例１−１と同様にして試験を行った。測定結果を表３に
示した。
【００３５】比較例１−１ 実施例１−１で用いた合成例１−１で合成した重合体の
代わりに、２重量％のＢＳＡを添加した以外は、実施例
１−１と同様にして試験を行った。測定結果を表３に示
した。
【００３６】比較例１−２ １００ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した、５μｇ／ｍ
Ｌヒト免疫グロブリンＧ溶液に何も添加しなかった以外
は実施例１−１と同様にして試験を行った。測定結果は
表３に示した。
【００３７】実施例２−１；標識抗体免疫学的活性物質
の安定化試験１ １０ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．５）で１００００倍希釈した西
洋わさび過酸化酵素（ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏ
ｘｉｄａｓｅ）標識抗ヒト免疫グロブリンＧ溶液に合成
例１−１で合成した重合体を２．０重量％となるように
添加した。その後に４０℃インキュベートした。なお、
添加した日を０日後とした。
【００３８】参考例１で調製した抗体固定化プレートの
８ウェルに、１．０μｇ／ｍＬのヒト免疫グロブリンＧ
を１００μＬ／ウェルになるように添加した後に、２５
℃、１時間インキュベートした。インキュベート終了
後、各ウェルを、１５０ｍＭ−ＮａＣｌを添加した１０
ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．５）で３回洗浄した。洗浄終了後更
に、０日後、３日後、１週間後、２週間後、３週間後、
４週間後の２００００倍希釈した西洋わさび過酸化酵素
（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標
識抗ヒト免疫グロブリンＧ溶液を、８ウェルに１００μ
Ｌ／ウェルになるように添加した後に、２５℃、２時間
インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェル
を、１５０ｍＭ−ＮａＣｌを添加した１０ｍＭ−リン酸
水素二ナトリウム／リン酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で３回洗浄した。「ＯＰＤ錠」（和光純薬工
業（株）社製の商品名）１錠を０．００６％の過酸化水
素を含むリン酸／クエン酸緩衝液１２ｍＬに溶解した溶
液を、１００μＬ／ウェル添加した後、２５℃、１０分
間インキュベートした後に、２Ｎの硫酸溶液を５０μＬ
／ウェル加えた後に、マイクロプレートリーダ（東ソー
（株）社製商品名「ＭＰＲ−Ａ４ｉ」）を用いて、各ウ
ェルの４９２ｎｍの吸光度を測定し、０日後の吸光度を
１００％として、各日後の吸光度（％）を求めた。配合
を表２に示し、測定結果を表４に示した。
【００３９】実施例２−２：標識抗体免疫学的活性物質
の安定化試験２ 実施例２−１で用いた合成例１−１で合成した重合体の
代わりに、合成例１−２で合成した重合体を用いた以外
は実施例２−１と同様にして試験を行った。測定結果を
表４に示した。
【００４０】比較例２−１ 実施例２−１で用いた合成例１−１で合成した重合体の
代わりに、２重量％のＢＳＡを添加した以外は、実施例
２−１と同様にして試験を行った。測定結果を表４に示
した。
【００４１】比較例２−２ １００ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水素ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した、５μｇ／ｍ
Ｌヒト免疫グロブリンＧ溶液に何も添加しなかった以外
は実施例２−１と同様にして試験を行った。測定結果を
表４に示した。
【００４２】実施例３−１；酵素の安定化１−１ １００ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−塩化マグネシウムを添
加した１０ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水
素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した５ｆｍｏ
ｌ（フェムトモル＝１０-15モル）／ｍＬ（１０-15ｍｏ
ｌ／ｍＬ）のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液に合成例１
−１で合成した重合体を２．０重量％となるように添加
した。その後に４０℃インキュベートした。なお、添加
した日を０日後とした。
【００４３】０日後、３日後、１週間後、２週間後、３
週間後および４週間後の各β−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶
液０．４ｍＬに１００ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−塩化マ
グネシウムを添加した１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム
／リン酸二水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
した５０ｍｍｏｌ／Ｌの２−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトシド溶液０．２ｍＬを加えて、３０℃，１０分
間インキュベートした。インキュベート終了後、０．１
ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム２ｍＬを加えた後に、日本分
光製ＵＶ／ＶＩＳ測定機「Ｕｂｅｓｔ−５０］を用い
て、４２０ｎｍの吸光度を測定した。０日後の吸光度を
１００％として、各日後の吸光度（％）を求めた。測定
結果を表５に示した。
【００４４】実施例３−２；酵素の安定化１−２ 実施例３−１で用いた合成例１−１の重合体の代わり
に、合成例１−２で合成した重合体を用いた以外は実施
例３−１と同様にして試験を行った。測定結果を表５に
示した。
【００４５】比較例３−１ 実施例３−１で用いた合成例１−１で合成した重合体の
代わりに、２重量％のＢＳＡを添加した以外は、実施例
３−１と同様にして試験を行った。測定結果を表５に示
した。
【００４６】比較例３−２ １００ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−塩化マグネシウムを添
加した１０ｍＭ−リン酸水素二ナトリウム／リン酸二水
素ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した５ｆｍｏ
ｌ（フェムトモル＝１０-15モル）／ｍＬのβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ溶液に何も添加しなかった以外は実施例
３−１と同様にして試験を行った。測定結果を表５に示
した。
【００４７】参考例２；蛋白質付着レンズの調製 人工涙液（アルブミン０．６ｇ，グロブリン０．３ｇ、
リゾチーム０．２ｇ、ムチン０．１ｇを生理食塩水に溶
解させ１００ｍＬとした）にコンタクトレンズ（セイコ
ー社製コンタクトレンズ 「スーパーＥＸ１」）を浸
し、６５℃に加熱して蛋白質を付着させた。
【００４８】実施例４−１ 生理食塩水に溶解した４．０ｍｇ／ｍＬのビオプラーゼ
（ナガセ生化学工業（株）製、商品名、ペプチド分解酵
素）溶液に合成例１−１で合成した重合体を２．０重量
％となるように添加した。その後に４０℃にてインキュ
ベートした。なお、添加した日を０日後とした。０日
後、１カ月後、２カ月後、３カ月後、４カ月後の各ビオ
プラーゼ溶液の蛋白質分解酵素活性は、カゼイン−フォ
リン法により測定した。０日後の活性を１００％として
各月後の活性を求めた。配合を表２に示し、測定結果を
表６に示した。
【００４９】実施例５−１ また、前記０日後、１カ月後、２カ月後、３カ月後、４
カ月後の各ビオプラーゼ溶液に参考例２で調製した蛋白
質付着レンズを入れ、静置した状態で洗浄した。洗浄効
果は目視にて行い、次の評価により判定した。 ───────────────────────── 評価；内容 ───────────────────────── 良好；付着蛋白質がほとんど除かれている場合 不良；付着蛋白質がほとんど除かれていない場合 ───────────────────────── 測定結果を表７に示した。
【００５０】実施例４−２、５−２ 実施例４−１で用いた合成例１−１の重合体の代わり
に、合成例１−２で合成した重合体を用いた以外は実施
例４−１、および５−１と同様にして試験を行った。測
定結果を表６および７に示した。
【００５１】比較例４−１、５−１ 実施例４−１で用いた合成例２−１で合成した重合体の
代わりに、２．０重量％のＢＳＡを添加した以外は実施
例４−１および５−１と同様にして試験を行った。測定
結果を表６および７に示した。
【００５２】比較例４−２、５−２ 生理食塩水に溶解した４．０ｍｇ／ｍＬのビオプラーゼ
（ナガセ生化学工業（株）製、商品名、ペプチド分解酵
素）溶液に何も添加しなかった以外は実施例４−１、５
−１と同様にして試験を行った。測定結果を表６および
７に示した。
【００５３】
【表３】
【００５４】以上の結果、本発明の実施例は比較例に比
べ蛋白質の安定性が優れていることがわかる。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】グリコシルエチル（メタ）アクリレートを
    含む成分を重合した重合体を有効成分とする蛋白質の安
    定化剤。
  2. 【請求項２】グリコシルエチル（メタ）アクリレートを
    含む成分を重合した重合体と蛋白質とを同一系内に共存
    させることを特徴とする蛋白質の安定化方法。
  3. 【請求項３】グリコシルエチル（メタ）アクリレートを
    含む成分を重合した重合体である安定化剤と蛋白質とを
    含んでなる蛋白質組成物。
  4. 【請求項４】（Ａ）グリコシルエチル（メタ）アクリレ
    ートを含む成分を重合してなる重合体を有効成分とする
    安定化剤１．０×１０-4〜８０重量％、（Ｂ）蛋白質
    １．０×１０-14〜２０重量％、および、（Ｃ）緩衝液
    ０〜９９．９８重量％、を含んでなる安定化した蛋白質
    組成物。
  5. 【請求項５】蛋白質が血漿製剤蛋白質である請求項４記
    載の蛋白質組成物。
  6. 【請求項６】蛋白質が標識免疫学的活性物質である請求
    項４記載の蛋白質組成物。
  7. 【請求項７】蛋白質が酵素である請求項４記載の蛋白質
    組成物。
JP9038206A 1997-02-21 1997-02-21 蛋白質の安定化剤、安定化方法および組成物 Pending JPH10237095A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP9038206A JPH10237095A (ja) 1997-02-21 1997-02-21 蛋白質の安定化剤、安定化方法および組成物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP9038206A JPH10237095A (ja) 1997-02-21 1997-02-21 蛋白質の安定化剤、安定化方法および組成物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH10237095A true JPH10237095A (ja) 1998-09-08

Family

ID=12518862

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP9038206A Pending JPH10237095A (ja) 1997-02-21 1997-02-21 蛋白質の安定化剤、安定化方法および組成物

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPH10237095A (ja)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gocke et al. Association between polyarteritis and Australia antigen
US4485177A (en) Creatinine specific antibody
JPH03210476A (ja) 抗原抗体反応検出法、及び抗体及び酵素の固定法
Dube et al. Agalactosyl IgG in inflammatory bowel disease: correlation with C-reactive protein.
Loos Biosynthesis of the collagen-like C1q molecule and its receptor functions for Fc and polyanionic molecules on macrophages
WO2018216628A1 (ja) タンパク質安定化剤及びタンパク質安定化試薬
US4882423A (en) Substance-conjugated complement component C1q
CN111239415B (zh) 鉴定响应于用于自身免疫性疾病的治疗的受试者的方法以及用于治疗该疾病的组合物
JP3782851B2 (ja) 蛋白質の安定化方法および組成物
CN113267635B (zh) 一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒及用于检测脂联素的试剂盒
JP2727112B2 (ja) 安定なペルオキシダーゼ組成物及び安定な抗体組成物
US20130273048A1 (en) Stabilizing agent and blocking agent
JPS58111754A (ja) クレアチニンの免疫学的測定法及びそのための試薬
JP4145403B2 (ja) 免疫学的活性物質測定用高分子／酵素結合体
JP3825502B2 (ja) 修飾蛋白質の製造法及びコンタクトレンズ用汚れ除去剤
JPS63292061A (ja) 完全無傷なプラコラーゲンペプチド（３型）およびプロコラーゲン（３型）の選択的な免疫学的測定法
JPH10237094A (ja) 蛋白質の安定化剤、安定化方法および組成物
JPH022935A (ja) アンジオテンシンの測定法
JPWO2016021678A1 (ja) 蛋白質安定化剤及び蛋白質安定化方法
JP7419891B2 (ja) タンパク質安定化剤を含有するタンパク質含有製剤および臨床検査試薬
GB2089980A (en) Method for assaying superoxide dismutase
Woods et al. Effect of thrombin on the molecular weights of N-terminal fragments of human fibrinogen
JP2508915B2 (ja) 抗ＳＳＡ／ＲｏおよびＳＳＢ／Ｌａ抗体測定用抗原、その製造法ならびに抗ＳＳＡ／ＲｏおよびＳＳＢ／Ｌａ抗体の測定法
Brandchaft et al. Extraction of Gross surface antigens from AKR mouse lymphoma cells with potassium chloride
JPH09124740A (ja) 免疫学的活性物質・酵素共重合体および免疫学的活性物質測定試薬