JPH10248561A - 熱安定性耐溶媒性エステル分解酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 温度および有機溶媒に対して安定な光学異性
体選択性を有し、（Ｒ，Ｓ）-２-ベンジルコハク酸また
はその誘導体のジエステルを光学選択的に加水分解し得
る能力を有するエステル分解酵素を提供すること。 【解決手段】 土壌より分離したBacillus brevis 042-
24株培養上清より、熱安定で耐溶媒性の新規なエステル
分解酵素を精製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本願発明は、熱安定で耐溶媒
性のエステル分解酵素に関する。また本願発明は、熱安
定で耐溶媒性のエステル分解酵素の産生方法およびこの
エステル分解酵素を産生する微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、生理作用を有する多くの化合物
は、その光学異性体の混合物として使用されている。し
かし、望ましい活性は、一方の光学異性体のみに存在す
る場合が多い。さらに、他方の光学異性体が、所望の活
性を有さずかえって生体に対して毒性を有する場合があ
ることも知られている。従って、有効かつ安全な医薬ま
たは生理活性化合物を提供するためには、光学純度の高
い化合物の製造方法を開発することが強く要望されてい
る。

【０００３】（Ｓ）-２-ベンジルコハク酸は、血糖低下
作用およびインスリン分泌作用を有する糖尿病の治療剤
の合成中間体として有用な化合物である（特開平５-３
１０６９３号公報）。この化合物を製造するための効率
的かつ工業的な製法が望まれており、現在までにいくつ
かの試みがなされている。例えば、ラセミ体の２-ベン
ジルコハク酸を光学活性な１-フェニルエチルアミンで
光学分割し、（Ｓ）-２-ベンジルコハク酸を生産する方
法（Arkiv Kemi Mineral God, 26B,No.11 (1948)）や、
２-ベンジリデンコハク酸からの不斉合成方法（Tetrahe
dron Letters, 32, 3671-3672 (1991)）などが報告され
ている。

【０００４】また、酵素を利用する方法として、ラセミ
体の２-ベンジルコハク酸ジエチルに、α-キモトリプシ
ンを作用させ不斉加水分解することによる（Ｓ）-２-ベ
ンジルコハク酸を製造する方法（Journal of the Ameri
can Chemical Society,3495-3502 (1968)）などが報告
されている。

【０００５】しかし、これらの方法は、低光学純度、ま
たは合成工程の煩雑さから大量生産が容易でないなどの
問題を含むものであった。

【０００６】このような観点から、光学活性２-ベンジ
ルコハク酸を極めて高い光学純度で効率よく製造する方
法およびその方法において使用される酵素が強く要望さ
れている。

【０００７】さらに、光学異性体の分離反応において
は、各種有機溶媒中に高濃度に溶解させた出発物質を、
比較的高温で反応させる場合もあるので、熱安定で耐溶
媒性の酵素が望まれる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本願発明は上記の問題
を解決するためのものである。本願発明の目的は、光学
異性体選択性を有する熱安定で耐溶媒性のエステル分解
酵素を産生する微生物を単離すること、および微生物を
培養することにより熱安定で耐溶媒性のエステル分解酵
素を産生することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本願発明によれば、以下
の性質： （１）pH７、50℃、１時間の処理で95%以上活性が残存
する； （２）pH７、50%トルエン中、50℃、１時間の処理で90%
以上活性が残存する； （３）ゲル濾過での分子量が約105,000である； （４）エステル分解活性を有する；を有するエステル分
解酵素が提供される。好ましい実施態様においては、前
記のエステル分解酵素は、（Ｒ，Ｓ）-２-ベンジルコハ
ク酸ジメチルを光学選択的に加水分解し得る能力を有す
る。

【００１０】好ましい実施態様においては、前記のエス
テル分解酵素は、（Ｒ、Ｓ）-２-ベンジルコハク酸ジメ
トキシエチルを光学選択的に加水分解し得る能力を有す
る。

【００１１】好ましい実施態様においては、前記のエス
テル分解酵素は、p-ニトロフェニルブチレートに対する
基質特異性を有する。好ましい実施態様においては、前
記のエステル分解酵素は、Bacillus brevis042-24株に
よって産生される。また本願発明によれば、Bacillus b
revis 042-24株を培養する工程を含む、前記のエステル
分解酵素の製造方法が提供される。さらに本願発明によ
れば、前記のエステル分解酵素を産生する、Bacillus b
revis 042-24株が提供される。なおさらに本願発明によ
れば、（Ｒ，Ｓ）-２-ベンジルコハク酸またはその誘導
体のジエステルと、前記のエステル分解酵素とを反応さ
せる工程；および生成した光学活性２-ベンジルコハク
酸またはその誘導体のジエステルと光学活性２-ベンジ
ルコハク酸またはその誘導体のモノエステルとを分離す
る工程、を包含する、方法が提供される。

【００１２】

【発明の実施の形態】本明細書で用いられる用語「エス
テル分解酵素」は、エステルを加水分解する酵素をい
う。従って、エステル分解酵素には、リパーゼ、エステ
ラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、プロテアー
ゼなどの酵素が包含される。

【００１３】本願発明において、エステル分解酵素の熱
安定性とは、40℃、より好ましくは45℃、最も好ましく
は50℃での１時間の処理で失活しないことをいう。また
本願発明のエステル分解酵素は、耐溶媒性である。耐溶
媒性とは、（例えば、pH７、50%トルエン中、50℃、１
時間の処理で90%以上活性が残存する） をいう。さらに
本願発明のエステル分解酵素は、約105,000の分子量を
有する。分子量は、ポリアクリルアミド電気泳動または
ゲル濾過によって測定され得る。

【００１４】エステル分解酵素の活性は、例えば酵素を
基質としてのp-ニトロフェニルブチレートと反応させ、
生成するp-ニトロフェノールを比色的に定量することに
より測定し得る。本願発明のエステル分解酵素には、光
学異性体選択性を有するエステル分解酵素が含まれる。
特に好ましくは、（Ｒ，Ｓ）-２-ベンジルコハク酸また
はその誘導体のジエステルを光学選択的に加水分解し得
る能力を有する酵素が挙げられる。

【００１５】本願発明の酵素の起源は限定しないが、微
生物由来の酵素が、入手が容易であるので、好適に使用
され得る。微生物としては、好ましくは、Bacillus bre
visに分類される細菌が挙げられる。

【００１６】微生物の単離は、土壌などの自然界から得
た微生物または各種の既に分離されている微生物のエス
テル分解酵素についてのスクリーニング、およびそれに
続く微生物の産生するエステル分解酵素の特徴付けによ
り行われる。

【００１７】スクリーニングは、ノイゲンＨＣ（第一工
業製薬製）で乳化したトリブチリンを含む寒天培地に種
々の微生物を加え、この寒天培地上で微生物を生育させ
た場合、クリアーゾーンを形成するか否かにより簡便に
実施される。酵素の特徴付けは例えば、熱安定性、pH安
定性、対溶媒性、基質特異性、光学異性体選択性などに
ついて行われる。

【００１８】また本願発明のエステル分解酵素をコード
する遺伝子を単離し、その遺伝子を発現させて、エステ
ル分解酵素を産生し得る。エステル分解酵素をコードす
る遺伝子の単離は、例えば本願発明のエステル分解酵素
産生株であるBacillus brevis 042-24株から調製したゲ
ノムDNAを挿入したライブラリーを作製し、精製したタ
ンパク質のアミノ酸配列情報をもとに設計した標識プロ
ーブを用いたスクリーニング、または発現する活性を指
標にしたスクリーニングなどにより実施し得る。エステ
ル分解酵素遺伝子の発現は、例えば単離したDNAフラグ
メントを汎用多コピーベクター、または強力なプロモー
ターを含む発現ベクターなどに挿入した後、適合性の微
生物に導入し、導入された微生物を培養することにより
実施し得る。発現に使用される宿主としては、一般に組
換えDNA技術で使用される宿主が使用可能であるが、産
生株と同じグラム陽性細菌（例えばBacillus subtili
s）を使用すれば、効率の良い分泌生産が期待される。

【００１９】微生物（形質転換体を含む）を用いて本願
発明の酵素を得る場合、本願発明で使用される微生物の
培養は、公知の方法に準じて行い得る。通常用いられる
固体培地、液体培地のいずれも使用可能であるが、産生
酵素の回収効率を考慮すると、液体培地が好ましい。ま
た、上記微生物の培養培地に使用される炭素源として
は、微生物が資化できる任意の炭素源が用いられ得る。
例えば、デンプン、デキストリン、スクロースまたはグ
ルコースなどが、工業的に安価に利用できることから好
ましい、また、窒素源としては、酵母エキス、カゼイ
ン、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキスなどの
天然窒素源や硫安、塩安、尿素などの無機窒素化合物が
用いられ得る。

【００２０】さらに、微生物の良好な生育および酵素生
産を考慮すると、炭素源の濃度は１〜20%、窒素源の濃
度は0.2〜10%、培養時間は16〜48時間程度が好ましい。
通気撹拌あるいは振盪培養のいずれの培養形態も適用可
能である。

【００２１】このようにして培養した後、培養物を遠心
分離または濾過することによって、微生物細胞を含まな
い上清が得られる。この上清から通常の手段、例えば、
限外濾過による濃縮、塩析または溶媒沈澱による沈澱に
より、熱安定性および耐溶媒性エステル分解酵素を含む
画分が得られる。この画分に更に沈澱、濾過、透析また
は遠心分離などの処理を行って、粗酵素が得られる。更
にこの粗酵素を、凍結乾燥、等電点沈澱、電気泳動、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、晶出などの通常の酵素の精製手段を適宜組み合わ
せることによって、比活性の向上した粗酵素および精製
酵素が得られる。

【００２２】本明細書において「２-ベンジルコハク酸
またはその誘導体」とは、一般式：

【００２３】

【化４】

【００２４】により示される化合物を意味する。ここ
で、Ｒ₃は、水素原子またはハロゲン原子であるか、あ
るいは水酸基またはハロゲン原子で置換されているかま
たは置換されていない炭素数１〜２０の、直鎖、分枝、
あるいは環状の飽和または不飽和炭化水素基である。Ｒ
₃は、好ましくは水素原子またはトリフロロメチル基で
あるが、これに限定されない。

【００２５】本明細書中において「（Ｒ，Ｓ）-２-ベン
ジルコハク酸またはその誘導体のジエステル」とは、
（Ｒ）-２-ベンジルコハク酸またはその誘導体のジエス
テルおよび（Ｓ）-ベンジルコハク酸またはその誘導体
のジエステルのラセミ混合物を意味する。ラセミ混合物
は、必ずしも（Ｒ）体と（Ｓ）体の混合比が１：１でな
くてもよい。

【００２６】本発明の方法は、（Ｒ，Ｓ）-２-ベンジル
コハク酸またはその誘導体のジエステルに、微生物由来
のエステル加水分解活性を有する酵素を作用させて、
（Ｒ）または（Ｓ）-２-ベンジルコハク酸またはその誘
導体のジエステルのいずれか一方を光学選択的に加水分
解することにより、（Ｒ，Ｓ）-２-ベンジルコハク酸ま
たはその誘導体のジエステルを２-ベンジルコハク酸ま
たはその誘導体のジエステルと２-ベンジルコハク酸ま
たはその誘導体のモノエステルとの混合物に変換し、こ
れらの化合物の化学的特性または物理的特性の差異を利
用してそれぞれを分取することに基づく。

【００２７】本発明に用いられる酵素反応基質は、一般
式：

【００２８】

【化５】

【００２９】により示される２-ベンジルコハク酸また
はその誘導体のジエステルである。ここで、Ｒ₁、Ｒ
₂は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、水酸基、また
はアルコキシル基で置換されているかまたは置換されて
いない直鎖、分枝、あるいは環状の飽和または不飽和炭
化水素基であり、Ｒ₃は、水素原子またはハロゲン原子
であるか、あるいはハロゲン原子、水酸基、またはアル
コキシル基で置換されているかまたは置換されていない
直鎖、分枝、あるいは環状の飽和または不飽和炭化水素
基である。Ｒ₁からＲ₃の炭素数は、１〜２０、好ましく
は１〜９、より好ましくは１〜４である。Ｒ₃は、好ま
しくは、水素原子またはトリフロロメチル基であるが、
これに限定されない。

【００３０】本発明の酵素反応基質となる（Ｒ，Ｓ）-
２-ベンジルコハク酸またはその誘導体のジエステル
は、用いる酵素の基質特異性、酵素反応溶媒への溶解
性、酵素反応後の分離の容易性などから適宜選択され
る。２-ベンジルコハク酸ジメチル、２-ベンジルコハク
酸ジエチル、あるいは２-ベンジルコハク酸ジメトキシ
エチルが特に好ましく用いられ得、これらは公知のエス
テル化の方法により２-ベンジルコハク酸から容易に合
成し得る。例えば、（Ｒ，Ｓ）-２-ベンジルコハク酸
に、メタノールあるいは、エタノール、メトキシエタノ
ールなどを硫酸などの酸の存在下で反応させることによ
り得られる。（Ｒ，Ｓ）-２-ベンジルコハク酸は、当該
分野で公知の方法により製造し得、例えば、２-ベンジ
ル-２-エトキシカルボニルコハク酸ジエチルをけん化
し、脱炭酸することにより合成する方法（Liebigs Anna
hlen, 256, 95 (1890)）により製造し得る。他の（Ｒ，
Ｓ）-２-ベンジルコハク酸またはその誘導体のジエステ
ルも上記と同様の方法により製造し得る。

【００３１】本発明に用いられる微生物由来の酵素は、
（Ｒ，Ｓ）-２-ベンジルコハク酸またはその誘導体のジ
エステルを光学選択的に加水分解し、光学活性な２-ベ
ンジルコハク酸またはその誘導体のジエステルおよび光
学活性な２-ベンジルコハク酸またはその誘導体のモノ
エステルを産生する能力を有するものであればいずれで
あっても使用し得る。好ましくは、（Ｒ）-２-ベンジル
コハク酸またはその誘導体のジエステルを光学選択的に
（Ｒ）-２-ベンジルコハク酸またはその誘導体のモノエ
ステルに加水分解する酵素が用いられるが、これに限定
されない。

【００３２】さらに、上記の酵素の活性を含有する精製
酵素、微生物菌体、微生物菌体培養液、および微生物菌
体の処理物なども使用され得る。

【００３３】本発明の酵素反応は、（Ｒ，Ｓ）-２-ベン
ジルコハク酸またはその誘導体のジエステルを含む水ま
たは緩衝液に、前記酵素剤、または微生物および培養物
より採取したエステル分解酵素を添加し、撹拌すること
により行う。

【００３４】酵素反応は、ｐＨを調整して行い得る。酵
素反応のための至適なｐＨを保持するために、例えばリ
ン酸緩衝液などの緩衝液が使用され得る。反応液のｐＨ
は、５〜９、好ましくは６〜８である。

【００３５】用いる酵素の量は特に限定されないが、
（Ｒ，Ｓ）-２-ベンジルコハク酸またはその誘導体のジ
エステルに対し、０.１〜１０ｇ／基質ｍｏｌ程度が好
ましい範囲である。

【００３６】反応温度は、１０℃〜５０℃、好ましくは
２０℃〜４０℃である。反応時間は、用いる酵素の量、
反応温度、反応ｐＨ等で変動するが、通常１〜２４時間
程度である。

【００３７】反応終了後、生成した光学活性２-ベンジ
ルコハク酸またはその誘導体のモノエステルと光学活性
２-ベンジルコハク酸またはその誘導体のジエステルと
を、溶媒抽出法、カラムクロマトグラフ法など通常用い
られる分離操作で分取する。溶媒抽出法では、ｎ-ヘキ
サンやヘプタン、酢酸エチル、シクロヘキサン、イソオ
クタン、イソプロピルエーテル、t-ブチルメチルエーテ
ルを用いる場合、光学活性２-ベンジルコハク酸または
その誘導体のジエステルを反応液から９８％以上の回収
率で回収することが可能である。

【００３８】分取した光学活性２-ベンジルコハク酸ジ
エステルを、酸、塩基等を用いる化学的加水分解法、過
剰のメタノール中でのエステル交換反応、または任意の
加水分解酵素を用いる酵素法により加水分解し、酸性条
件下で結晶化し、さらにイソプロピルアルコール（２５
〜３５Ｖｏｌ％）水で再結晶化することにより、容易に
光学活性２-ベンジルコハク酸を得ることができる。

【００３９】一方、加水分解反応によって生成した光学
活性２-ベンジルコハク酸またはその誘導体のモノエス
テルは酵素反応液から光学活性２-ベンジルコハク酸ま
たはその誘導体のジエステルを溶媒抽出法で除去した
後、水層を酸性条件にすることにより、ｎ-ヘキサンや
ヘプタン、酢酸エチル、イソプロピルエーテル等の溶媒
を用いて、９８％以上の回収率で回収し得る。回収した
光学活性２-ベンジルコハク酸またはその誘導体のモノ
エステルを常法により再びエステル化し、光学活性２-
ベンジルコハク酸またはその誘導体のジエステルに変換
した後、アルカリ性条件下で加熱することによりラセミ
化するか、あるいは光学活性２-ベンジルコハク酸また
はその誘導体のモノエステルを加水分解し、アルカリ性
条件下で加熱することによりラセミ化して、再び基質と
して利用できる。

【００４０】また、酵素反応を反応率２０〜４０％で停
止させ、光学活性２-ベンジルコハク酸またはその誘導
体のモノエステルを上記の方法で溶媒抽出した後、上記
のような加水分解法により加水分解し、酸性条件下で結
晶化し、次いでイソプロピルアルコール（２５〜３５Ｖ
ｏｌ％）水で再結晶化することにより、容易に光学活性
（Ｒ）-２-ベンジルコハク酸を得ることができる。

【００４１】本願発明者らは、光学異性体選択性を有す
る熱安定で耐溶媒性のエステル分解酵素を産生する新規
な微生物を分離し、その微生物を培養して培養上清から
目的とする酵素を精製して、本願発明を完成するに至っ
た。

【００４２】

【実施例】以下、実施例で本願発明をさらに詳しく説明
する。微生物の単離、酵素の精製、酵素の特徴付けにつ
いて説明するが、本願発明はこれらの実施例に限定され
るものではない。

【００４３】（実施例１：微生物の単離および同定）兵
庫県下で採取した土壌サンプルを滅菌水で希釈し、トリ
ブチリン10 mg/mlおよびノイゲンＨＣ５mg/mlを含むLB
寒天培地上で培養した。エステル分解活性を有する微生
物を、コロニーの周囲に形成されるクリアーゾーンを指
標にして分離した。得られた微生物の菌学的性質を調べ
たところ、以下のとおりであった。

【００４４】「Ａ」形 態 （１）細胞の形 ；かん状 （２）細胞の大きさ；0.5×1.5〜4.0μm （３）運動性の有無；＋ （４）胞子の有無 ；＋（卵円形） （５）グラム染色 ；＋ （６）抗酸性染色 ；− 「Ｂ」各培地における生育状態 （１）標準寒天平板培養；半透明白色、やや扁平、縁は
樹枝状、スムーズ （２）標準寒天斜面培養；半透明白色、スムーズ （３）標準液体培養 ；全体に混濁 （４）標準ゼラチン穿刺培養；上層部のみ混濁 （５）リトマスミルク ；沈殿、上部ペプトン化 「Ｃ」生理学的性質 （１）硝酸塩の還元；＋ （２）脱窒反応；− （３）メチルレッド試験；− （４）アセチルメチルカルビノールの生成；− （５）インドールの生成；− （６）硫化水素の生成；− （７）澱粉の加水分解；＋ （８）クエン酸の利用；− （９）無機窒素源の利用；硝酸塩：−、アンモニウム
塩：− （１０）色素の生成；− （１１）ウレアーゼ活性；− （１２）オキシダーゼ活性；− （１３）カタラーゼ活性；＋ （１４）生育の範囲 ｐＨ；9.0 ＋、5.7 −、5.5 −、5.0 − 温度；10℃ −、40℃ ＋、45℃ −、50℃ − （１５）酸素に対する態度；好気性 （１６）ジオキシアセトンの生成；− （１７）馬尿酸の分解；− （１８）アミノ酸の分解；リジン − アルギニン −
オルニチン − （１９）フェニルアラニンの脱アミノ；− （２０）温度抵抗性（85℃、10分）；− （２１）塩化ナトリウムの耐性；2.0% ＋、5.0% −、
7.0% −、10% - （２２）サブロウ寒天培地の生育；− （２３）0.001%リゾチーム培地の生育；− （２４）チロシン分解；＋ （２５）クエン酸・アンモニウム寒天でのアルカリ生
産；− （２６）カゼインの分解性；＋ （２７）ゼラチンの分解 性；＋ （２８）嫌気性培地における発育性；− （２９）マッコンキー培地生育性；− （３０）レシチナーゼ反応；− （３１）ＶＰ培地におけるアルカリ産生能；− （３２）糖類の利用と酸生成 L-アラビノース：− D-キシロース：− D-グルコース：＋ D-マンノース：＋ D-フラクトース：＋ D-ガラクトース：− 麦芽糖：＋ ショ糖：＋ 乳 糖：− トレハロース：＋ D-ソルビット：− D-マンニット：− イノシット：− グリセリン：＋ デンプン：＋ メリビオース：− サリシン：＋ エタノール：− （３３）エスクリン加水分解；＋ （３４）グルコン酸の酸化；− 上記の菌学的性質をBergey's Manual of Systematic B
acteriology第２巻第３節に従って検討したところ、属
はBacillus、種はbrevisに分類される細菌と同定され、
Bacillus brevis 042-24株と命名した。本菌株はFERM B
P-5827の寄託番号で工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されている。

【００４５】（実施例２：酵素の精製）p-ニトロフェニ
ルブチレート（以下、pNPBと略記する）を基質とした酵
素活性は以下のように測定した。1.5 mLの0.5 mM pNPB
溶液に、0.5 mLの10mMリン酸緩衝液（pH 7.0）に溶解し
た酵素液を加え、37℃で10分間インキュベートした。反
応液に２mLの１mM炭酸ナトリウム溶液２mLを加えた後、
400 nmの吸光度を測定した。pH 7.0、37℃で１分間に１
μmolのp-ニトロフェノールを生成する酵素活性を１単
位とした。

【００４６】(1) 粗酵素剤の調製 可溶性澱粉1.0%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.5%、
pH7.0を含む培地２Lに、前培養しておいたBacillus bre
vis 042-24株の培養液２mLを植菌し、30℃、24時間、50
0 rpmで培養した。培養液を遠心分離（8,000 rpm、20
分）した後、培養上清をUF膜（ダイセル化学）で1/10に
濃縮した。濃縮液に可溶性デンプンを１%になるように
添加した後、凍結乾燥して、粗酵素剤を得た。

【００４７】(2) 塩析 粗酵素剤10 gを、300 mLの20 mMリン酸緩衝液（pH 7.
0）に溶解した後、これに硫安を20%になるように添加し
て、４℃で30分間放置した。放置後、遠心分離（17,000
rpm、30分）により沈澱を分離し、この沈澱を30 mLの2
0 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）に溶解した後、脱イオン水
に対し一晩透析した。透析後、内液から不溶物を遠心分
離（17,000 rpm、30分）およびメンブランフィルター
（0.45μm）で除去した。

【００４８】(3) DEAE-Toyopearl pak 650Mカラムクロ
マトグラフィー 塩析で得られた液を、20 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）で
平衡化したDEAE-Toyopearl pak 650Mのカラム（22×200
mm、東ソー(株)）に供した。カラムを同緩衝液で洗浄
後、流速３mL/分の塩勾配（０から1.0 M NaCl、20 mMリ
ン酸緩衝液（pH 7.0））で溶出された、番号45〜52の活
性画分をプールした。

【００４９】(4) TSKgel G3000SWゲル濾過クロマトグラ
フィー 上記プールを、20 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）で平衡化
したTSKgel G3000SWのカラム（7.8×300 mm、東ソー
(株)）に供した。溶出は、同緩衝液により、流速0.8 mL
/分で実施した。溶出された番号16〜21の活性画分をプ
ールして精製酵素液とした。

【００５０】以上の精製結果を表１に示す。

【００５１】

【表１】

【００５２】（実施例３: 精製酵素の特徴付け） (1) 分子量 精製酵素を、300 mM NaClを含む20 mMリン酸緩衝液（pH
7.0）で平衡化したTSKgel G3000SWカラム（7.8×300 m
m、東ソー(株)）に供し、同緩衝液を用いて流速0.6 mL
／分でゲル濾過を行った。同様に標準タンパク質（キモ
トリプシノーゲンＡ(分子量25,000)、オバルブミン（分
子量43,000）、アルドラーゼ（分子量158,000）、カタ
ラーゼ（分子量232,000）、フェリチン（分子量440,00
0））のゲル濾過を行い、流速パターンから分子量を求
めた。図１に示すように、本酵素の分子量は約105,000
であった。

【００５３】(2) 至適pHおよびpH安定性 至適pHを、各pHのBriton-Robinsonの広域緩衝液（pH
２、３、４、５、６、７、８、９、10、11）を用いて、
pNPBを基質として酵素活性を測定することにより求め
た。図２Ａに示す結果から、本酵素はpH８で最高の活性
を示した。

【００５４】pH安定性を、精製酵素液0.1 mLに、各pHの
Briton-Robinsonの広域緩衝液を加え、30℃で１時間処
理した後、pNBPを基質として酵素活性を測定することに
より求めた。図２Ｂに示す結果から、本酵素は、pH４以
上で安定であり、pH11でもほぼ100%の活性を示した。

【００５５】(3) 至適温度、熱安定性および耐溶媒性 至適温度を、pH 7.0の条件下、各温度（20、30、35、4
0、45、50、55、60、70℃）でpNPBを基質として酵素活
性を測定することにより求めた。図３Ａに示す結果か
ら、本酵素は、55℃で最高の活性を示した。

【００５６】熱安定性を、精製酵素液（pH 7.0）を各温
度で１時間処理した後、10 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）
で適当な濃度に希釈して、pNPBを基質として酵素活性を
測定することにより求めた。図３Ｂに示す結果から、本
酵素は、50℃まで安定であったが、60℃において完全に
失活した。

【００５７】また耐溶媒性を、精製酵素液（pH 7.0)
を、50％トルエン中、50℃で１時間処理した後、10 mM
リン酸緩衝駅（pH 7.0）で適当な濃度に希釈して、pNPB
を基質として酵素活性を測定することにより求めたとこ
ろ、90％以上の活性が残存していた。

【００５８】(4) 金属イオンおよび酵素阻害剤の影響 酵素に対する金属イオンおよび酵素阻害剤の影響を、各
種金属イオンまたは酵素阻害剤剤を反応液に濃度が２mM
になるように添加して、pNPBを基質として酵素活性を測
定することにより調べた。表２に、阻害剤無添加の場合
の酵素活性に対する相対活性を示す。本酵素は、Cu²⁺、
Cd²⁺、Ag⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Sn²⁺、Pb²⁺、Hg
²⁺などの金属イオンおよびセリン酵素阻害剤であるPMS
F、DFP、p-APMSFなどにより強い阻害を受けた。一方、K
⁺およびSH基保護剤である2-メルカプトエタノール、DTT
の添加は、酵素活性の増加を生じた。以上から、本酵素
は、活性中心にセリンおよびSH基を有すると考えられ
る。

【００５９】

【表２】

【００６０】(5) 基質特異性 本酵素の９種のp-ニトロフェノールの脂肪酸エステルに
対する加水分解活性を測定した。表３の結果より、本酵
素はpNPBに対して最も高い活性を示したが、より短いま
たはより長い脂肪酸側鎖を有するエステルには低い活性
を示した。また、p-ニトロフェニルラウレートより長い
エステルに対しては、活性を示さなかった。

【００６１】また、本酵素は、Succinyl-Ala-Ala-Pro-P
he-p-nitroanilide（Sigma社製）のアミド結合にも高い
加水分解活性を有した。

【００６２】

【表３】

【００６３】(6)光学特異性 反応液中の２-ベンジルコハク酸のジエステル、２-ベン
ジルコハク酸のモノエステル、または２-ベンジルコハ
ク酸の定量および光学純度の測定は、以下の分析条件に
より、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により
行った。

【００６４】（ＨＰＬＣ分析条件） カラム：キラルセルＯＤ 0.46ｃｍφ×25ｃｍ（ウオー
ターズ社製） 移動相：ヘキサン・イソプロパノール・トリフルオロ酢
酸（９５：５：０.１） 流速 １ｍＬ／分 検出 ＵＶ ２２０ｎｍ 蒸留水１０００ｍｌに、２-ベンジルコハク酸ジメチル
２３６ｇ（１ｍｏｌ）を添加し、１Ｎ-ＫＯＨで反応液
のｐＨを７に調整した後、実施例２で得られた精製酵素
２ｇを加え、１０Ｎ-ＫＯＨで反応液のｐＨを７に調整
しながら、３０℃で２４時間撹拌した。

【００６５】反応終了後、反応液をロータリーエバポレ
ーターで３００ｍｌまで濃縮し、酢酸エチル５００ｍｌ
を加え２-ベンジルコハク酸ジメチルを抽出した。この
抽出液を、弱塩基性水で洗浄後、ロータリーエバポレー
ターで酢酸エチルを留去し、（Ｓ）-２-ベンジルコハク
酸ジメチルを得た。１Ｎ-ＮａＯＨを加え、６０℃で加
水分解を行い、酸性条件下で結晶化させ、次いでイソプ
ロピルアルコール（２５〜３５Ｖｏｌ％）水で再結晶化
させることにより、光学純度９９％ e.e. の（Ｓ）-２-
ベンジルコハク酸が７９ｇ得られた（収率３８％）。

【００６６】上記と同様な酵素反応を行い、反応時間１
５時間、反応率４０％で反応を停止させた。生成した
（Ｒ）-２-ベンジルコハク酸モノメチルは（Ｓ）-２-ベ
ンジルコハク酸ジメチルを抽出除去した後、酸性条件下
で、酢酸エチルを用いて抽出した。次にロータリーエバ
ポレーターで酢酸エチルを留去し、得られた（Ｒ）-２-
ベンジルコハク酸モノメチルに１Ｎ-ＮａＯＨを加え、
６０℃で加水分解を行い、酸性条件下で結晶化させ、さ
らにイソプロピルアルコール（２５〜３５Ｖｏｌ％）水
で再結晶化することにより、光学純度９９％ e.e. の光
学活性（Ｒ）-２-ベンジルコハク酸６２ｇを得た（収率
２８％）。

【００６７】また、上記と同様の方法により、（Ｒ，
Ｓ）-２-ベンジルコハク酸ジメトキシエチルを反応させ
たところ、それぞれ光学純度９９％ e.e. の（Ｓ）-２-
ベンジルコハク酸ジメトキシエチルおよび（Ｒ）-２-ベ
ンジルコハク酸ジメトキシエチルが４５％および４０％
の収率で得られた。

【００６８】

【発明の効果】以上説明したように、本願発明方法によ
れば、 （Ｒ，Ｓ）-２-ベンジルコハク酸またはその誘
導体のジエステルを光学選択的に加水分解し得る能力を
有し、高い熱安定性および耐溶媒性を有する新規なエス
テル分解酵素を提供することができた。

【図面の簡単な説明】

【図１】ゲル濾過法による分子量の測定を示すグラフで
ある。

【図２】Ａは至適pHを示すグラフであり、ＢはpH安定性
を示すグラフである。

【図３】Ａは至適温度を示すグラフであり、Ｂは熱安定
性を示すグラフである。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の性質： （１）pH７、50℃、１時間の処理で95%以上活性が残存
   する； （２）pH７、50%トルエン中、50℃、１時間の処理で90%
   以上活性が残存する； （３）ゲル濾過での分子量が約105,000である； （４）エステル分解活性を有する；を有する、エステル
   分解酵素。
2. 【請求項２】 以下の式： 【化１】 で表される（Ｒ，Ｓ）-２-ベンジルコハク酸ジメチルを
   光学選択的に加水分解し得る能力を有する、請求項１に
   記載のエステル分解酵素。
3. 【請求項３】 以下の式： 【化２】 で表される（Ｒ、Ｓ）-２-ベンジルコハク酸ジメトキシ
   エチルを光学選択的に加水分解し得る能力を有する、請
   求項２に記載のエステル分解酵素。
4. 【請求項４】p-ニトロフェニルブチレートに対する基質
   特異性を有する、請求項１に記載のエステル分解酵素。
5. 【請求項５】Bacillus brevis 042-24株によって産生さ
   れる、請求項１に記載のエステル分解酵素。
6. 【請求項６】Bacillus brevis 042-24株を培養する工程
   を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のエステル分解
   酵素の製造方法。
7. 【請求項７】請求項１に記載のエステル分解酵素を産生
   する、Bacillus brevis 042-24株。
8. 【請求項８】 光学活性２-ベンジルコハク酸またはそ
   の誘導体の製造方法であって、該方法は、以下の一般
   式： 【化３】 （ここで、Ｒ₁、Ｒ₂は、それぞれ独立して、ハロゲン原
   子、水酸基、またはアルコキシル基で置換されているか
   または置換されていない炭素数１〜２０の、直鎖、分
   枝、あるいは環状の飽和または不飽和炭化水素基であ
   り、Ｒ₃は、水素原子またはハロゲン原子であるか、あ
   るいはハロゲン原子、水酸基、またはアルコキシル基で
   置換されているかまたは置換されていない炭素数１〜２
   ０の、直鎖、分枝、あるいは環状の飽和または不飽和炭
   化水素基である。）で表される（Ｒ，Ｓ）-２-ベンジル
   コハク酸またはその誘導体のジエステルと、請求項１〜
   ４のいずれかに記載のエステル分解酵素とを反応させる
   工程；および生成した該光学活性２-ベンジルコハク酸
   またはその誘導体のジエステルと該光学活性２-ベンジ
   ルコハク酸またはその誘導体のモノエステルとを分離す
   る工程、を包含する、方法。