JPH10262661A - 新規なα−アミラーゼおよびその単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なα−アミラーゼを提供する。 【解決手段】 下記の酵素化学的性質を有するバチルス
・サーキュランス(Bacillus circulans)由来のα−アミ
ラーゼ： 作用および基質特異性；可溶性デンプン、アミロー
ス、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキスト
リン及びプルラン、特にマルトオリゴ糖に対して加水分
解活性を有する； 至適ｐＨ；７．０〜８．０；
安定ｐＨ；６．５〜９．０； 至適温度；４０℃；
温度安定性；１０分間の熱処理に対して５０℃まで；
分子量；ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で、約６６，０００；及び 活性；Ｃｄ²⁺及びＣｕ²⁺
により完全に阻害。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なα−アミラ
ーゼおよびその単離方法に関するものである。さらに詳
しく述べると、本発明は、バチルス・サーキュランス(B
acillus circulans)由来の新規なα−アミラーゼ及び該
α−アミラーゼ生産能を有しバチルス・サーキュランス
(Bacillus circulans)に属する菌を培養し、培養物中に
α−アミラーゼを産生させ、これを精製することからな
るα−アミラーゼの単離方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、糖転移反応を行なう酵素が数多く
見い出され、これらの酵素を利用した新規有用物質の合
成が活発に行なわれている。これら有用物質のうち、特
に低カロリー、ビフィズス因子活性、抗うしょく性など
様々な生理的機能を有するオリゴ糖の合成に利用した例
が盛んであり、現在、次々と新しい製品が開発されてい
る。

【０００３】このような糖転移反応を行なう酵素として
は、アミラーゼがある。アミラーゼは、デンプン様多糖
を加水分解する酵素の総称であり、近年、新しい製品の
開発のため様々な研究が成されている。その一例として
は、β−アミラーゼ及びイソアミラーゼの併用によるデ
ンプンからマルトースの製造があり、マルトースは甘味
がショ糖の半分であり、保存性を向上させる性質を持っ
ているため、その性質を利用して様々な食品に使用され
るようになり、さらに、高純度のマルトースはグルコー
スに代わって輸液として注射することができるので、医
療へも利用されるようになった。

【０００４】アミラーゼは、その加水分解の様式によ
り、従来では、主に以下の５つに分類されていた：デン
プンのα−１，４−グルコシド結合をランダムに（エン
ド型）加水分解するα−アミラーゼ；デンプンの非還元
末端からα−１，４−グルコシド結合を順次（エキソ
型）加水分解するβ−アミラーゼ；デンプンの非還元末
端からα−１，４−またはα−１，６−グルコシド結合
をエキソ型で加水分解するグルコアミラーゼ；マルトー
スやマルトオリゴ糖を非還元末端からエキソ型で加水分
解するα−グルコシダーゼ；及びデンプンのα−１，６
−グルコシド結合を分解するがα−１，４−グルコシド
結合は分解しないイソアミラーゼ。これらのうち、代表
的なアミラーゼとしては、α−グルコシダーゼとシクロ
マルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧ
Ｔａｓｅ）がある。

【０００５】このＣＧＴａｓｅは、すでに、様々な細菌
（例えば、バチルス・マセランス(Bacillus macerans)
、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium) 、
バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearoth
ermophilus) 及びバチルス・サーキュランス(Bacillus
circulans)）から得られている。このように、近年、ア
ミラーゼの糖転移活性が着目され、種々の有用な配糖体
が合成されているが、そのほとんどは転移活性の強いバ
チルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearother
mophilus) のアミラーゼ（特開昭５０−６３，１８９
号）を利用したものであり、他の起源のアミラーゼを用
いた有用配糖体の合成に関する報告は少ない。このた
め、本発明者らは、新たな糖転移活性を有するアミラー
ゼおよびそのようなアミラーゼ生産能を有する微生物の
発見が強く望まれていることを考慮して、特開平８−２
５６，７６６号において、バチルス・サーキュランス(B
acilluscirculans)由来の新規なＣＧＴａｓｅを発見し
た。

【０００６】また、上記アミラーゼのうち、α−アミラ
ーゼは、その加水分解反応は工業的に非常に重要である
が、糖転移反応については、あまり研究がなされておら
ず、ハイドロキノンを受容体としてスクリーニングした
バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) ｘ−２３株
の産生するα−アミラーゼがフェノール類に対して高い
糖転移活性を有すること（T. Nishimura et at., J. Fe
rment. Bioeng., 78(1), 31-36(1994); T. Nishimura e
t at., J. Ferment. Bioeng., 78(1), 37-41(1994); T.
Nishimura et at., J. Ferment. Bioeng., 80(1), 18-
23(1994)) やタカアミラーゼＡが糖転移反応を行なうこ
と（岡田茂孝ら、アミラーゼシンポジウム、８１−８
９）が報告されているくらいである。

【０００７】上述してきたように、様々な種由来のアミ
ラーゼが現在発見されてきたが、新たな糖転移活性を有
するアミラーゼ、特にα−アミラーゼ及びそのようなア
ミラーゼ生産能を有する微生物の発見およびそのような
アミラーゼや微生物を利用した種々の有用な配糖体が合
成に対しては、依然として強い要望がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、新規なα−アミラーゼを提供することである。

【０００９】本発明の他の目的は、上記α−アミラーゼ
を産生する微生物を提供することである。

【００１０】本発明のさらなる目的は、上記微生物の培
養物からの上記α−アミラーゼの単離方法を提供するこ
とである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、特開平８
−２５６，７６６号において発見した上記バチルス・サ
ーキュランス(Bacillus circulans)についてさらに鋭意
研究を行った結果、バチルス・サーキュランス(Bacillu
s circulans)がＣＧＴａｓｅに加えて新規なα−アミラ
ーゼを産生することを発見し、これにより本発明を完成
するに至った。

【００１２】すなわち、上記諸目的は下記（１）から
（４）のいずれかにより達成される。

【００１３】（１） 下記の酵素化学的性質を有するバ
チルス・サーキュランス(Bacillus circulans)由来のα
−アミラーゼ： 作用および基質特異性；可溶性デンプン、アミロー
ス、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキスト
リン及びプルラン、特にマルトオリゴ糖に対して加水分
解活性を有する 至適ｐＨ；７．０〜８．０ 安定ｐＨ；６．５〜９．０ 至適温度；４０℃ 温度安定性；１０分間の熱処理に対して５０℃まで 分子量；ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で、約６６，０００ 活性；Ｃｄ²⁺及びＣｕ²⁺により完全に阻害。

【００１４】（２） 上記バチルス・サーキュランス(B
acillus circulans)が受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１４８
２９号のバチルス・サーキュランス ４ｄ１(Bacillus
circulans 4d1)株である、前記（１）記載のα−アミラ
ーゼ。

【００１５】（３） バチルス・サーキュランス(Bacil
lus circulans)に属し、α−アミラーゼ生産能を有する
微生物を培養し、該微生物に培養物中にアミラーゼを産
生せしめ、該培養物から前記（１）記載のα−アミラー
ゼを精製することからなるα−アミラーゼの単離方法。

【００１６】（４） 上記バチルス・サーキュランス(B
acillus circulans)が受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１４８
２９号のバチルス・サーキュランス ４ｄ１(Bacillus
circulans 4d1)株である、前記（３）記載の方法。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明のα−アミラーゼは、下記
特徴的な酵素化学的な性質を有するものである： 作用および基質特異性；可溶性デンプン、アミロー
ス、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキスト
リン及びプルラン、特にマルトオリゴ糖に対して加水分
解活性を有する 至適ｐＨ；７．０〜８．０ 安定ｐＨ；６．５〜９．０ 至適温度；４０℃ 温度安定性；１０分間の熱処理に対して５０℃まで 分子量；ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で、約６６，０００ 活性；Ｃｄ²⁺及びＣｕ²⁺により完全に阻害。

【００１８】以下、本発明について詳細に説明する。

【００１９】本発明のα−アミラーゼは、上記諸性質を
有するα−アミラーゼを産生しバチルス・サーキュラン
ス(Bacillus circulans)（以降、括弧内は省略する）由
来のα−アミラーゼであるが、特に受託番号がＦＥＲＭ
Ｐ−１４８２９号のバチルス・サーキュランス ４ｄ
１(Bacillus circulans 4d1)株（以降、単に「４ｄ１
株」と称する）由来のα−アミラーゼが好ましく使用さ
れる。

【００２０】本発明において、バチルス・サーキュラン
スの培養に使用する培地は、当業者には公知の成分から
なる培地が使用され、特に制限されない。本発明におい
ては、上記培地は、固体または液体培地のいずれでもよ
く、また、本菌が資化しうる炭素源、適量の窒素源、無
機塩及びその他の栄養素を含有する培地であれば、合成
培地または天然培地のいずれでもよい。

【００２１】本発明によるバチルス・サーキュランスの
培養において使用できる炭素源としては、上記菌株が良
好に生育し、α−アミラーゼを順調に産生できうるもの
であれば特に制限されず、デンプンまたはその組成画
分、焙焼デキストリン、加工デンプン、デンプン誘導
体、物理処理デンプン及びα−デンプン等の炭水化物が
使用できる。具体例としては、可溶性デンプン、アミロ
ース、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキス
トリン、プルラン、トウモロコシデンプン、馬鈴薯デン
プン、甘藷デンプン及びデキストリン等の炭水化物が挙
げられる。これらの炭素源のうち、酵素産生の観点か
ら、可溶性デンプンが好ましく使用される。これらの炭
素源は、単独あるいは２種以上の混合物の形態で使用で
きる。

【００２２】本発明によるバチルス・サーキュランスの
培養において使用できる窒素源としては、肉エキス、ペ
プトン、ポリペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、
大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸
及びコーンスティープリカー等の有機窒素化合物、およ
びアンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及
び塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリ
ウムなどの硝酸塩、尿素等の無機窒素化合物等が挙げら
れる。これらの窒素源も、単独あるいは２種以上の混合
物の形態で使用できる。

【００２３】本発明による培養に使用できる無機塩とし
ては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウ
ム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸
塩、硫酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以
上を使用することができる。

【００２４】本発明において、バチルス・サーキュラン
スの培養は、好気的条件下で行われ、その際の培養条件
は、培地の組成や培養法によって適宜選択され、本菌株
が増殖し目的とする酵素であるα−アミラーゼが失活せ
ずに効率よく産生できる条件であれば特に制限されな
い。通常は、培養温度が、３０〜５５℃、好ましくは３
５〜４５℃であり、また、培養に適当な培地のｐＨは、
５〜９、好ましくは６〜８である。培養時間は、培養温
度及びｐＨや菌体の初期濃度等の培養条件および培養方
法によって異なるが、例えば、５００ｍｌ容量の坂口フ
ラスコを用いて１００ｍｌの培養液中に４ｄ１株を一白
金耳接種して３７℃で振盪培養（１２０ｒｐｍ）を行っ
た場合、７０〜１６０時間、好ましくは９０〜１４０時
間である。

【００２５】ここで、４ｄ１株の培養方法の一実施態様
を以下に示す。１．０％可溶性デンプン（和光純薬製、
１級）、１．０％ポリペプトン（和光純薬製、微生物培
養基用）、０．３％酵母エキス（オリエンタル酵母
製）、及び０．３％硫酸アンモニウム、０．３％ＮａＣ
ｌ（和光純薬製、特級）からなる培地（ｐＨ７．０）８
０ｍｌを５００ｍｌ容量の坂口フラスコに入れ、シリコ
ン栓をして、オートクレーブ（１２１℃、２．０気圧、
１５分間）による滅菌処理を行う。次に、下記のように
して保存された４ｄ１株の一白金耳を上記液体培地に植
菌し、３７℃で振盪（１２０ｒｐｍ）条件下において９
５〜１３０時間培養する。

【００２６】なお、本発明において、４ｄ１株は、下記
培地ＡとＢに適宜交互に植菌し、３７℃で一晩培養した
後、４℃で保存したものを使用する。

【００２７】培地Ａ：１．０％ポリペプトン（和光純薬
製、微生物培養基用）、０．７％肉エキス（極東製薬
製）、０．３％ＮａＣｌ（和光純薬製、特級）及び２．
０％寒天（和光純薬製、細菌培養用）からなる培地を試
験管に８ｍｌずつ分注し、シリコン栓をして、オートク
レーブ（１２１℃、２．０気圧、１５分間）滅菌した
後、試験管を斜めに傾けて固化した。

【００２８】培地Ｂ：１．０％可溶性デンプン（和光純
薬製、１級）、１．０％ポリペプトン（和光純薬製、微
生物培養基用）、０．７％肉エキス（極東製薬製）、
０．３％ＮａＣｌ（和光純薬製、特級）及び２．０％寒
天（和光純薬製、細菌培養用）からなる培地を試験管に
８ｍｌずつ分注し、シリコン栓をして、オートクレーブ
（１２１℃、２．０気圧、１５分間）滅菌した後、試験
管を斜めに傾けて固化した。

【００２９】本発明のα−アミラーゼの単離方法を以下
に記載する。

【００３０】α−アミラーゼ産生能を有する微生物を培
養し、遠心分離等によって菌体を培養液から除去し、培
養瀘液を得る。この培養瀘液から、硫安塩析または有機
溶媒沈降などにより、粗アミラーゼを回収する。このよ
うにして得られた粗アミラーゼをさらにデアエ(DEAE)−
トヨパール６５０Ｍ等を用いたイオン交換クロマトグラ
フィー、セファクリル エス−２００エッチアール(Sep
hacryl S-200HR) 等を用いたゲル瀘過クロマトグラフィ
ー、ブチル(Butyl) −トヨパール６５０Ｍ等を用いた疎
水クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグ
ラフィーなどのクロマトグラフィーや電気泳動等の手法
を単独若しくは組み合わせて用いることによって、α−
アミラーゼを電気泳動的に単一になるまで精製する。

【００３１】また、特に４ｄ１株を使用した場合の４ｄ
１株培養液からのα−アミラーゼの精製方法の一実施態
様を以下に記載する。

【００３２】上記したようにして培養した４ｄ１株の培
養物のうち、０．１Ｕ／ｍｌ以上のデンプン糖化活性を
示した培養液のみを集める。この際、デンプン糖化活性
の測定方法を下記に示す。このようにして集められた４
ｄ１株の培養液を遠心分離（２０，０００×ｇ、１５
分）することによって菌体を培養液から除去し、その上
清を粗酵素液とする。この粗酵素液に３０％飽和になる
ように硫酸アンモニウムを加え、一晩静置した後、遠心
分離（２０，０００×ｇ、２５分）によって沈殿物を除
去する。得られた上清に７０％飽和になるように硫酸ア
ンモニウムを加え、一晩静置した後、遠心分離（２０，
０００×ｇ、２５分）によって沈殿物を回収する。沈殿
物を少量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解
し、同緩衝液に対して３日間透析する。このようにして
得られた硫安沈殿物を遠心分離（２０，０００×ｇ、２
５分）することによって不溶物を除去し、予め２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したデアエ(DEAE)
−トヨパール６５０Ｍカラム（φ５．０×２５ｃｍ）に
供し、約１，５００ｍｌの同緩衝液で非吸着物を溶出さ
せた後、０Ｍから０．５Ｍ ＮａＣｌまでの直線濃度勾
配２，５００ｍｌにより溶出させる（流速：６０ｍｌ／
時間、１２ｍｌ／画分）。各画分のデンプン糖化活性を
上記と同様にして調べ、メインの活性ピーク画分を集
め、この画分をＵＨＰ−６２（アドヴァンテック(ADVAN
TEC)製）を用い、ＵＦ膜（分画分子量：１０，０００、
アドヴァンテック(ADVANTEC)製）を装着して限外瀘過に
より濃縮する。次に、この濃縮液に２５％飽和になるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、予め２５％飽和硫酸アン
モニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で
平衡化したブチル−トヨパール６５０Ｍカラム（φ２．
６×３１ｃｍ）に供し、約５００ｍｌの同緩衝液で非吸
着物を溶出させた後、２５％から０％飽和硫酸アンモニ
ウムまでの直線濃度勾配６６０ｍｌにより溶出させる
（流速：３０ｍｌ／時間、４．５ｍｌ／画分）。各画分
のデンプン糖化活性を上記と同様にして調べ、メインの
活性ピーク画分を集め、この画分をＵＨＰ−６２（アド
ヴァンテック(ADVANTEC)製）及びＵＨＰ−４３（アドヴ
ァンテック(ADVANTEC)製）を用い、ＵＦ膜（分画分子
量：１０，０００、アドヴァンテック(ADVANTEC)製）を
装着して限外瀘過により濃縮する。さらに、この濃縮液
を、予め０．１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファクリルＳ−３００
ＨＲカラム（φ２．０×９５ｃｍ）を用いてゲル瀘過を
行う（流速：１１ｍｌ／時間、２．０ｍｌ／画分）。各
画分のデンプン糖化活性を上記と同様にして調べ、タン
パク質の溶出ピークと一致した活性ピークが認められる
ため、活性ピーク周辺の画分の酵素液についてＳＤＳ−
ＰＡＧＥを行い、電気泳動的に単一であることを確認し
た後、得られた酵素液を最終精製酵素標品とする（以
下、「４ｄ１アミラーゼ」とも称する）。なお、上記操
作はすべて、酵素の失活を防止するために、４℃で行
う。

【００３３】なお、酵素のデンプン糖化活性を、以下の
ようにして測定する。８％マルトペンタオース（和光純
薬製、生化学用）溶液２００μｌ（５０ｍＭ酢酸緩衝
液、ｐＨ６．０）を３７℃で５分間予めインキュベート
した後、酵素液５０μｌを添加する。１０分後、還元糖
量をソモギ−ネルソン(Somogyi-Nelson)法にて測定す
る。この測定条件にて、１分間に１マイクロモルのグル
コースに相当する還元糖を遊離する酵素量を１Ｕとす
る。

【００３４】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、これらにより本発明の範囲がなんら制限され
るものでないことはいうまでもない。

【００３５】参考例１：デンプン糖化活性測定法 以下の実施例において、酵素活性は以下のデンプン糖化
活性で表した。８％マルトペンタオース（和光純薬製、
生化学用）溶液２００μｌ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ
６．０）を３７℃で５分間予めインキュベートした後、
酵素液５０μｌを添加した。１０分後、還元糖量をソモ
ギ−ネルソン(Somogyi-Nelson)法にて測定した。この測
定条件にて、１分間に１マイクロモルのグルコースに相
当する還元糖を遊離する酵素量を１Ｕとした。

【００３６】参考例２：デンプン液化活性測定法 ０．５５％デンプン（メルク(Merck) 社製、Ｎｏ．１２
５７）溶液２５０μｌ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．
０）を３７℃で５分間予めインキュベートした後、酵素
液５０μｌを添加した。１０分後、０．５Ｍ酢酸１ｍｌ
を加えて反応を停止させ、ヨウ素液（０．０２％ヨウ素
・０．２％ヨウ化カリウム溶液）１ｍｌを加え、７００
ｎｍの吸光度を測定した。この測定条件にて、７００ｎ
ｍの吸光度を１分間に１０％減少させる酵素量を１Ｕと
した。

【００３７】参考例３：糖転移活性測定法 酵素の糖転移活性を、以下のようにして、１−ヘキサノ
ールに対する転移活性で示した。０．５％可溶性デンプ
ン（メルク(Merck) 社製）溶液５００μ１（５０ｍＭ酢
酸緩衝液、ＰＨ ６．０）に酵素液を加えた後、１−ヘ
キサノール２００μｌを加え、３７℃、１７５ｒｐｍで
２４時間撹拌し、反応させた。反応液１−ヘキサノール
層を薄層クロマログラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略
す）のＴＬＣプレート（メルク(Merck) 社製、Ｋｉｅｓ
ｅｌ ｇｅｌ ６０ ＴＬＣプレート）にスポットし、
ＴＬＣ分析（展開溶媒：酢酸エチル／酢酸／水（３：
１：１（ｖ／ｖ））、１重展開、検出条件：５０％硫酸
を噴霧し、１３０℃で数分間加熱する）に供し、転移生
成物のスポットを検出した。

【００３８】参考例４：シクロデキストリンの定性試験
［トリクロロエチレンテスト（以下、「ＴＣＥテスト」
と略す］ ５．０％デンプン（メルク(Merck) 社製）溶液２．０ｍ
ｌ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）に酵素液０．２
ｍｌを加え、３７℃にて２４時間反応させた。反応後、
トリクロロエチレン１ｍｌを添加し、１分間激しく撹拌
し、氷上に３０分間静置した。生成したシクロデキスト
リンがトリクロロエチレンと包接化合物を形成し、白濁
することによりシクロデキストリン合成活性を確認し
た。

【００３９】実施例１：バチルス・サーキュランス ４
ｄ１株の培養 １．０％可溶性デンプン（和光純薬製、１級）、１．０
％ポリペプトン（和光純薬製、微生物培養基用）、０．
３％酵母エキス（オリエンタル酵母製）、及び０．３％
硫酸アンモニウム、０．３％ＮａＣｌ（和光純薬製、特
級）からなる培地（ｐＨ７．０）８０ｍｌを５００ｍｌ
容量の坂口フラスコに入れ、シリコン栓をして、オート
クレーブ（１２１℃、２．０気圧、１５分間）による滅
菌処理を行い、４ｄ１株用の培養液を調製した。

【００４０】次に、４ｄ１株の一白金耳を上記液体培地
に植菌し、３７℃で振盪（１２０ｒｐｍ）条件下におい
て１２０時間培養した。

【００４１】実施例２：酵素の精製 以下の精製操作はすべて４℃で行った。実施例１と同様
にして培養した４ｄ１株の培養液２２０本のうち、培養
液当たり０．１Ｕ／ｍｌ以上のデンプン糖化活性を示し
た培養液２００本を一緒にした。この際、デンプン糖化
活性は、参考例１に示される方法により測定した。

【００４２】このようにして集められた４ｄ１株の培養
液を遠心分離（２０，０００×ｇ、１５分）することに
よって菌体を培養液から除去し、その上清を粗酵素液と
した。この粗酵素液に３０％飽和になるように硫酸アン
モニウムを加え、一晩静置した後、遠心分離（２０，０
００×ｇ、２５分）によって沈殿物を除去した。得られ
た上清に７０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加
え、一晩静置した後、遠心分離（２０，０００×ｇ、２
５分）によって沈殿物を回収した。沈殿物を少量の２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、同緩衝液に
対して３日間透析した。この際、粗酵素液及び硫安沈殿
物の糖転移活性を参考例３と同様にして調べたところ、
両者ともに転移生成物が検出されたことから、目的とす
る酵素は硫安沈殿物中に含まれていることが分かった。

【００４３】このようにして得られた硫安沈殿物を遠心
分離（２０，０００×ｇ、２５分）することによって不
溶物を除去し、予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で平衡化したデアエ(DEAE)−トヨパール６５０Ｍカ
ラム（φ５．０×２５ｃｍ）に供し、約１，５００ｍｌ
の同緩衝液で非吸着物を溶出させた後、０Ｍから０．５
Ｍ ＮａＣｌまでの直線濃度勾配２，５００ｍｌにより
溶出させた（流速：６０ｍｌ／時間、１２ｍｌ／画
分）。各画分のデンプン糖化活性を参考例１に記載の方
法により調べ、メインの活性ピーク画分を集めた。この
際、非吸着画分および上記活性画分について、特開平８
−２５６，７６６号に開示されたＣＧＴａｓｅの存在を
ＴＣＥ試験（参考例４を参照）によるＣＤ合成活性によ
り調べたところ、ＣＧＴａｓｅはすべて非吸着画分中に
溶出し、集めた活性画分中には含まれていないことが分
かった。また、上記活性画分の糖転移活性を参考例３と
同様にして調べ、転移生成物の検出を確認した。このた
め、活性画分をＵＨＰ−６２（アドヴァンテック(ADVAN
TEC)製）を用い、ＵＦ膜（分画分子量：１０，０００、
アドヴァンテック(ADVANTEC)製）を装着した限外瀘過に
より、酵素液を約５００ｍｌから約８０ｍｌにまで濃縮
した。

【００４４】次に、この濃縮液に２５％飽和になるよう
に硫酸アンモニウムを加え、予め２５％飽和硫酸アンモ
ニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平
衡化したブチル−トヨパール６５０Ｍカラム（φ２．６
×３１ｃｍ）に供し、約５００ｍｌの同緩衝液で非吸着
物を溶出させた後、２５％から０％飽和硫酸アンモニウ
ムまでの直線濃度勾配６６０ｍｌにより溶出させた（流
速：３０ｍｌ／時間、４．５ｍｌ／画分）。各画分のデ
ンプン液化活性を参考例２により調べ、メインの活性ピ
ーク画分を集めた。上記活性画分の糖転移活性を参考例
３と同様にして調べたところ、糖転移活性が認められた
ので、この画分をＵＨＰ−６２（アドヴァンテック(ADV
ANTEC)製）及びＵＨＰ−４３（アドヴァンテック(ADVAN
TEC)製）を用い、ＵＦ膜（分画分子量：１０，０００、
アドヴァンテック(ADVANTEC)製）を装着した限外瀘過に
より、酵素液を約２２０ｍｌから約３ｍｌにまで濃縮し
た。

【００４５】さらに、この濃縮液を、予め０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平
衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（φ２．０
×９５ｃｍ）を用いてゲル瀘過を行い（流速：１１ｍｌ
／時間、２．０ｍｌ／画分）、精製した。各画分のデン
プン糖化活性を上記と同様にして調べたところ、タンパ
ク質の溶出ピークと一致した活性ピークが認められた。
このため、活性ピーク周辺の画分の酵素液についてＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行い、電気泳動的に単一であることを確
認してから上記画分を回収し、得られた酵素液を最終精
製酵素標品とした（以下、「４ｄ１アミラーゼ」と称す
る）。

【００４６】実施例３：４ｄ１アミラーゼのｐＨ依存性 下記実験を行い、４ｄ１アミラーゼのｐＨ依存性を調べ
た。８％マルトペンタオースを含む各ｐＨの緩衝液（５
０ｍＭ）を調製し、実施例２で得られた４ｄ１アミラー
ゼのデンプン糖化活性を参考例１に記載の方法により測
定した。基質溶液は、ｐＨ ４．０〜６．５は酢酸緩衝
液、ｐＨ６．０〜８．０はリン酸緩衝液およびｐＨ
８．０〜１０．０はグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、さらに
ｐＨ８．０及び９．０はトリス塩酸緩衝液も用いて調製
した。

【００４７】結果を図１に示す。これより、本発明の４
ｄ１アミラーゼの至適ｐＨは７．０〜８．０であるが、
アルカリ域でも活性を保持しており、ｐＨ １０．０に
おいても、最大活性の約７０％の値を有していることが
示される。また、ｐＨ８．０及び９．０においてトリス
塩酸緩衝液を用いた場合は、同じｐＨのグリシン一Ｎａ
ＯＨ緩衝液を用いた時と比べて著しく相対活性が低い値
を示したが、これはトリス塩酸緩衝液の成分がデンプン
糖化活性の測定法に影響を与えているのではなく、トリ
スが４ｄ１アミラーゼの阻害剤となり、相対活性を低く
していると推測される。

【００４８】実施例４：４ｄ１アミラーゼのｐＨ安定性 以下の実験により４ｄ１アミラーゼのｐＨ安定性を評価
した。実施例２で得られた４ｄ１アミラーゼ溶液（１３
Ｕ／ｍｌ）５０μｌを各ｐＨの緩衝液（５０ｍＭ）２０
０μｌに加えて、３７℃、５時間インキュベ−トした
後、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し、その
残存活性を測定した。この際、各ｐＨの緩衝液は実施例
３と同じものを用いた。

【００４９】結果を図２に示す。これより、本発明の４
ｄ１アミラーゼは、ｐＨ６．５〜９．０の範囲で安定で
あることが分かった。

【００５０】実施例５：４ｄ１アミラーゼの温度依存性 下記実験を行い、４ｄ１アミラーゼの温度依存性を調べ
た。実施例２で得られた４ｄ１アミラーゼのデンプン糖
化活性を、参考例１に記載された測定法により３０〜７
０℃の各温度で行なった。またＣａ²⁺は酵素の熱に対す
る安定性を高める作用が知られているので、４ｄ１アミ
ラーゼの温度依存性への影響を調べるために１０ｍＭ
ＣａＣｌ₂ を含む８％マルトペンタオース溶液（５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液，ｐＨ６．０）を基質として本酵素の活性
測定を行なった。

【００５１】結果を図３に示す。図３において、４０℃
の値を１００％として相対活性で表したところ、本発明
の４ｄ１アミラーゼの至適温度は３５〜４０℃であるこ
とが分かった。また、ＣａＣｌ₂ を基質溶液に加える
と、至適温度は３５〜４０℃と変わらなかったが、４５
〜５５℃の範囲ではＣａＣｌ₂ を加えない時に比べて反
応速度が約１．５倍に達した。

【００５２】実施例６：４ｄ１アミラーゼの温度安定性 以下の実験により４ｄ１アミラーゼの温度安定性を評価
した。５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ６．０）に実施例２
で得られた４ｄｌアミラーゼを０．４３５Ｕ／ｍｌにな
るように加え、３０〜７０℃の各温度で１０分間インキ
ユベ−トし、残存活性を測定した。またＣａ⁺⁺の熱安定
性への影響を調べるため、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む
５０ｍｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に４ｄｌアミラーゼ
を０．４３５Ｕ／ｍｌになるように加え、同様の実験を
行なった。

【００５３】結果を図４に示す。図５において、４０℃
の値を１００％として残存活性を表した。これより、本
発明の４ｄ１アミラーゼは１０分間の熱処理に対して５
０℃までは安定であることが示された。また、ＣａＣｌ
₂ を添加すると安定温度は５０℃までと変わりなかった
が、３０〜５０℃の範囲ではＣａＣｌ₂ を添加しないと
きに比べて残存活性が約１．４倍の値を示した。

【００５４】実施例７：４ｄ１アミラーゼの金属イオン
・阻害剤の影響 以下のようにして、４ｄ１アミラーゼの金属イオン・阻
害剤の影響を調べた。実施例２で得られた４ｄ１アミラ
ーゼ溶液（３．０Ｕ／ｍｌ）５０μｌを１ｍＭの金属イ
オンや阻害剤（ｐ−クロロメルクリ安息香酸（ＰＣＭ
Ｂ）は０．２５ｍＭ）を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ ８．０〉１５０μｌに加え、３７℃で１０分間イン
キユベ−トした後、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ６．
０）で希釈し、残存活性を測定した。結果を表１に示
す。

【００５５】

【表１】

【００５６】これより、本発明の４ｄ１アミラーゼは、
ＣｕＳＯ₄ 、（ＣＨ₃ ＣＯＯ）₂ Ｃｄ及びＰＣＭＢによ
って強く阻害され、ＨｇＣｌ₂ 、ＡｇＮＯ₃ 及びＰＭＳ
Ｆによっても阻害されることが分かった。

【００５７】実施例８：４ｄ１アミラーゼのアミノ酸組
成の分析 ８−１）セミドライ・ブロッティング法 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（泳動ゲルとして、７．５％アク
リルアミドを用い、濃縮ゲルとして３．７５％アクリル
アミドを使用）を４℃で一晩静置した後、１５ｍＡの定
電流、トリス−グリシン緩衝液（ｐＨ８．３）の条件下
で泳動させた。泳動後、ゲルを切り出し、Ｔｒａｎｓｆ
ｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ（０．６６４ｍｇＣＡＰＳ、０．０
２３ｍｇ ＤＴＴ、３０ｍｌメタノール／３００ｍｌ）
に浸した。ポリビニリデンジフルオライド膜（以下、
「ＰＶＤＦ膜」と略す）は５分間メタノ−ルに浸した
後、濾紙とともにＴｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒに浸
した。十分に浸したゲル、ＰＶＤＦ膜及び濾紙をセミド
ライ・ブロッティング装置にセットして、１５ｍＡの定
電流で３時間転写した。転写後、ＰＶＤＦ膜をクーマシ
ーブリリアンドブルー（以下、「ＣＢＢ」と略す） Ｒ
−２５０で染色し、セミドライ・ブロッティングを行っ
た。

【００５８】８−２）アミノ酸組成の分析 ＰＶＤＦ膜に転写したタンパク質バンドを切り取り、試
料とした。試料は、反応バイアルに入れ、１％フェノー
ルを含む６Ｎ塩酸溶液２００μｌを加え、窒素置換後、
１１０℃で２４時間加水分解した。冷却後、洗浄液（メ
タノール／水／トリエチルアミン（２：２：１，ｖ／
ｖ））１０μｌを加え撹拌し、減圧乾固した。次に反応
液（メタノール／水／イソエチルアミン／イソチオシア
ン酸フェニル（７：１：１：ｌ，ｖ／ｖ））２０μｌを
加え、撹拌後、窒素置換した。室温に２０分問放置後、
減圧乾固した。残渣にサンプル希釈液（ピコ・タグ希釈
液、和光純薬製）２００μｌを加え、撹拌後、ピコ・タ
グアミノ酸分析装置に供して次の条件で分析を行なっ
た。標準曲線は各アミノ酸を等モル含む溶液を同様の方
法で誘導化、分析し、作成した。結果を下記表２に示
す。

【００５９】 装置：ＬＣ Ｍｏｄｕｌｅ−１（Ｗａｔｅｒｓ） 記録計：８０５ Ｄａｔａ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ） カラム：Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ （３．９×１５０ｍｍ，Ｗ
ａｔｅｒｓ） カラム温度：３８℃ 流速：１．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ２５４ｎｍ 溶離液：Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ Ｅｌｕｅｎｔ Ａ（和光純
薬製） Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ Ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（和光純薬製） Ｅｌｕｅｎｔ Ｂのプログラムグラジエント溶出

【００６０】

【表２】

【００６１】これより、本発明の４ｄ１アミラーゼのア
ミノ酸組成は報告されている値と大きな違いはなかっ
た。

【００６２】実施例９：４ｄ１アミラーゼの分子量 本発明の４ｄ１アミラーゼの分子量を下記のようにして
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣによって求めた。

【００６３】１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定 標準タンパク質としてミオシン（Ｍｗ：２００，００
０）、β−ガラクトシダーゼ（Ｍｗ：１１６，２５
０）、ホスホリラーゼｂ（Ｍｗ：９７，４００）、血清
アルブミン（Ｍｗ：６６，２００）及びオボアルブミン
（Ｍｗ：４５，０００）を用いた。標準タンパク質と４
ｄ１アミラーゼの相対移動度を求め、作成した標準曲線
より目的とする分子量を算出した。

【００６４】２）ＨＰＬＣ分析による分子量測定 標準タンパク質としてアルコール脱水素酵素（Ｍｗ：１
４８，０００）、コンアルブミン（Ｍｗ：８７，００
０）、血清アルブミン（Ｍｗ：６９，０００）、オボア
ルブミン（Ｍｗ：４５，０００）、β−ラクトグロブリ
ン（Ｍｗ：３５，０００）及びチトクロムｃ（Ｍｗ：１
２，４００）を用いた。ＨＰＬＣ分析（下記条件）によ
り得られた標準タンパク質の保持時間より標準曲線を作
成し、本酵素の保持時間から分子量を算出した。

【００６５】ＨＰＬＣ分析条件： ポンプ：日本分光製８８０−ＰＵ 検出器：日本分光製８３０−ＲＩ カラムオーブン：日本分光製８６０−ＣＯ クロマトグラムの記録及びピーク面積の算出：ＳＩＣ製
Chromatocorder-11 カラム：ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ_×Ｌ（φ
７．８ｍｍ×３０ｃｍ） カラム温度：２７℃ 流速：０．５ｍｌ／分 溶媒：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）−０．１Ｍ
ＮａＣｌ その結果、本発明の４ｄ１アミラーゼの分子量は、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによると６６，０００と推定されたが、Ｈ
ＰＬＣ分析では３５５，０００と大きな値を示した。こ
のような分析法による相違は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥはタン
パク質を構成しているポリペプチド鎖レベルの分子量を
分析するのに対し、ＨＰＬＣによるゲル瀘過法はタンパ
ク質粒子の大きさや形状に左右されることが知られてお
り、ゲル濾過法で分子量を推定するためには、標準タン
パク質と試料タンパク質の形状がほぼ同じでないと信頼
性が低くなるが、４ｄ１アミラーゼを構成するタンパク
質は球状でないため実際よりも大きな分子量の値を示し
たと推定できる。または４ｄ１アミラーゼを構成するタ
ンパク質が球状である際には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２−
メルカプトエタノールの存在下でも非存在下と同じバン
ドを示すことより、分子量６６，０００のペプチド鎖が
Ｓ−Ｓ結合以外の結合（おそらく疎水結合）で重合し、
見かけの分子量を大きくしていると推定できる。

【００６６】実施例１０：４ｄ１アミラーゼの基質特異
性 本実施例において、本発明の４ｄ１アミラーゼの加水分
解作用に対する基質特異性を調べた。可溶性デンプン、
アミロペクチン、アミロース、プルラン、グリコーゲ
ン、α−、β−、γ−シクロデキストリン、マルトオリ
ゴ糖、マルトース、イソマルトース及びｐ−ニトロフェ
ニルグリコシド（以下、「ＰＮＰＧ」と略す）の０．１
％溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ ６．０）をそれぞ
れ調製し、基質溶液とした。３７℃で１０分間反応後、
各基質溶液に対する４ｄ１アミラーゼのデンプン糖化活
性（参考例１）を測定した。なお、可溶性デンプンはメ
ルク(Merck) 社製、アミロース、マルトオリゴ糖（Ｇ
ｎ；ｎ＝３〜７，１７）及びＰＮＰＧは和光純薬製を用
いた。他の試薬はできるだけ特級以上を用いた。

【００６７】結果を表３に示す。結果はマルトペンタオ
ースを基質とした時の値を１００％として、相対活性で
表した。これから、本発明の４ｄ１アミラーゼはマルト
オリゴ糖に対し、高い加水分解活性を示し、特に、マル
トテトラオースが最適な基質であることが分かった。ま
た、可溶性デンプン、アミロペクチン、アミロース、プ
ルラン、α−、β−、γ−シクロデキストリン及びＰＮ
ＰＧに対しても活性を示したが、その相対活性は１５〜
０．３％と低いものだった。一方、マルトース、イソマ
ルトース及びグリコーゲンは加水分解しなかった。

【００６８】

【表３】

【００６９】実施例１１：本発明の４ｄ１アミラーゼ加
水分解生成物 実施例１０において本発明の４ｄ１アミラーゼが加水分
解活性を示した基質について加水分解生成物を確認し
た。マルトオリゴ糖（Ｇｎ；ｎ＝３〜７）、可溶性デン
プン、プルラン及びα−、β−、γ−シクロデキストリ
ンの０．１％溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ ６．
０）をそれぞれ調製し基質溶液とした。実施例２で得ら
れた４ｄ１アミラーゼ液を、可溶性デンプンには０．３
Ｕ／ｍｌ及び０．８Ｕ／ｍｌ、プルラン及びα−、β
−、γ−シクロデキストリン溶液には０．３Ｕ／ｍｌ、
マルトオリゴ糖溶液には０．０４Ｕ／ｍｌとなるように
加え、３７℃でインキユベートした。反応液は経時的に
サンプリングし、１００℃に５分間保つことにより酵素
を失活させた後、ＴＬＣ分析（ＴＬＣプレート（メルク
(Merck) 社製、Ｋｉｅｓｅｌ ｇｅｌ ６０ ＴＬＣプ
レート））（展開溶媒：酢酸エチル／酢酸／水（２：
１：１（ｖ／ｖ））、１重展開、検出条件：５０％硫酸
を噴霧し、１３０℃で数分間加熱する）を行なった。ス
ポットの同定は標準物質との比較により行なった。

【００７０】この結果、マルトオリゴ糖の場合では、マ
ルトトリオースからはマルトースとグルコースが生成さ
れ、マルトテトラオースからは反応初期からほぼマルト
ースのみが生成され、マルトペンタオースからは反応初
期からほぼマルトースとマルトトリオースのみが生成さ
れ、マルトヘキサオースからは主にマルトースとマルト
テトラオースが生成され、マルトヘプタオースからは主
にマルトースとマルトペンタオースが生成され、さらに
マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースからはマル
トトリオース以上の他のオリゴ糖がわずかではあるが確
認された。またいずれの場合においても時間の経過とと
もにマルトースのスポットが濃くなっていった。

【００７１】また、可溶性デンプンの場合では、反応初
期から主にマルトースが生成され、同時にマルトトリオ
ース以上のオリゴ糖も確認された。また、時間の経過と
ともにマルトースのスポットが濃くなっていった。酵素
量を多くした場合には、マルトースのスポットが著しく
濃く、マルトトリオース以上のオリゴ糖はほとんど検出
されなかった。

【００７２】さらに、α−、β−、γ−シクロデキスト
リンおよびプルランの場合では、α−シクロデキストリ
ンからは主にマルトースとマルトテトラオースが生成
し、わずかにマルトトリオースが確認された。β−シク
ロデキストリンからは主にマルトースとマルトペンタオ
ースが生成し、次いでマルトトリオース、そしてわずか
のグルコース、マルトテトラオース及びマルトヘキサオ
ースが確認された。γ−シクロデキストリンからは主に
マルトースとマルトヘキサオースが生成し、さらに他の
オリゴ糖がわずかに確認された。プルランからは、マル
トトリオースとマルトテトラオースよりＲｆ値の低いス
ポットがそれぞれ認められ、さらにそれ以上の、重合度
の糖が確認された。

【００７３】実施例１２：４ｄ１アミラ−ゼの加水分解
機構の解析 本発明の４ｄ１アミラーゼの加水分解機構を解析するた
めに、以下の実験を行なった。

【００７４】１）加水分解率とヨウ素呈色度との関係
（エンド型あるいはエキソ型の決定） １−１）加水分解率 ０．５５％可溶性デンプン溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液，
ｐＨ ６．０）を基質溶液とし、実施例２で得られた４
ｄ１アミラーゼ液を０．４Ｕ／ｍｌとなるように加え、
３７℃でインキュベートした。反応液は経時的に２５０
μｌずつサンプリングし、ソモギ−ネルソン(Somogyi-N
elson)法によりグルコース相当の還元糖量を測定した。
また、フェノール・硫酸法により全糖量を測定し、加水
分解率を次式により求めた。

【００７５】加水分解率（％）＝［反応液中の還元糖量
（ｍＭ）／全糖量（ｍｌ）］×１００ １−２）ヨウ素呈色度 ０．５５％可溶性デンプン溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液，
ｐＨ ６．０）を基質溶液とし、実施例２で得られた４
ｄ１アミラーゼ液液を０．４Ｕ／ｍｌとなるように加
え、３７℃でインキユベ−トした。反応液は経時的に３
００μｌずつサンプリングし、０．５Ｍ酢酸１ｍｌを加
えて反応を停止させた後、ヨウ素液（０．０２％ヨウ素
・０．２％ヨウ化カリウム溶液）１ｍｌを加え、７００
ｎｍの吸光度を測定した。

【００７６】加水分解率とヨウ素呈色度の関係を図５に
示す。これより、ヨウ素呈色度が反応前の約５０％に低
下した地点で加水分解率が約７％と低い値を示した。こ
の結果より本発明の４ｄ１アミラーゼは、可溶性デンプ
ンに対し、ランダムに作用するエンド型の酵素であるこ
とが明らかとなった。

【００７７】２）加水分解生成物のアノマー型の決定 下記の旋光度法により、加水分解生成物のアノマー型の
決定を行なった。０．５％可溶性デンプン溶液（５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液，ｐＨ ６．０）２．０ｍｌをｌｃｍガラ
スセルに入れた後、実施例２で得られた４ｄ１アミラー
ゼ液（３０Ｕ／ｍｌ）ｌ０μｌを加え、経時的に旋光角
の変化を測定した。反応９０分後、反応液に２５％アン
モニア水を３滴加えて変旋光の方向を観察した。旋光角
の測定はＵｎｉｏｎ技研製ＰＭ−２０１旋光計を用い
た。

【００７８】反応時間（横軸）及び旋光角（縦軸）との
関係を図６に示す。これより、本発明の４ｄ１アミラー
ゼによる可溶性デンプンからの加水分解生成物は、アン
モニア水を加えると下向きの変旋光を示した。この結果
より生成物のアノマー型はα型であることが明らかとな
った。以上の結果より、４ｄｌアミラーゼはα‐アミラ
ーゼとして分類される。

【００７９】３）マルトオリゴ糖アルコールを用いた加
水分解機構の決定 下記実験により、マルトオリゴ糖アルコールを用い、マ
ルトオリゴ糖に対する本発明の４ｄ１アミラーゼの切断
様式を決定した。

【００８０】３−１）マルトオリゴ糖アルコールの調製 １．５％マルトトリオース及びマルトペンタオース水溶
液に過剰量のＮａＢＨ₄ を加え、室温にて２４時間撹拌
し、還元を行なった。次いでｌＭ酢酸を加えて過剰のＮ
ａＢＨ₄ を分解した。生じたＮａ⁺ はＡｍｂｅｒｌｉｔ
ｅ ＩＲ−１２０（Ｈ⁺ ）により除去した後減圧濃縮
し、濃縮液にメタノールを加えて濃縮することを繰り返
しホウ酸をホウ酸メチルとして除去した。このようにし
て得られた還元物をそれぞれマルトトリイトトール及び
マルトペンタイトールとした。

【００８１】３−２）マルトオリゴ糖アルコールからの
加水分解生成物 １．０％マルトトリイトトール、マルトペンタイトール
溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ ６．０）に実施例２
で得られた４ｄ１アミラーゼ液を０．３Ｕ／ｍｌとなる
ように加え、３７℃で３時間インキユベ−トした。反応
液は１００℃に５分間保つことにより酵素を失活させた
後、ＴＬＣ分析（メルク(Merck) 社製、Ｋｉｅｓｅｌ
ｇｅｌ ６０ ＴＬＣプレート）（展開溶媒：酢酸エチ
ル／酢酸／水（２：１：１（ｖ／ｖ））、２重展開、検
出条件：５０％硫酸を噴霧し、１３０℃で数分間加熱す
る；および紫外線（２５４ｎｍ）照射下で紫外線吸収物
質を確認）を行なった。スポットの同定は標準物質との
比較により行なった。

【００８２】この結果、マルトトリイトトールを基質と
した場合、マルトースよりもＲｆ値の低いスポットが検
出された。またマルトペンタイトールの場合にも同じス
ポットが検出された。このスポットはＡＨＰ試薬で発色
させた時、発色しなかったのでマルトチトールであると
考えられる。それ以外にマルトペンタイトールを基質と
した場合にマルトース及びマルトトリオースのスポット
も検出された。これらのスポットはＡＨＰ試薬で褐色に
発色したことからも、還元末端をもったマルトース及び
マルトトリオースと同定した。これらの結果より、本発
明の４ｄ１アミラーゼは、マルトオリゴ糖の還元末端側
から２番目のα−（１→４）結合を切断し、マルトース
を生成することが明らかとなった。

【００８３】マルトトリイトトールからマルトチトール
を生成した場合、それに伴い、グルコースも生成される
はずであるが、ＴＬＣ分析ではグルコ−スのスポットは
検出されなかった。これは、おそらく転移反応が加水分
解反応と同時に起こったためであると考えた。

【００８４】実施例１３：反応速度論的定数の解析 下記のようにして、反応速度論定数をマルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース及び可溶
性デンプン（メルク(Merck) 社製）に対して求めた。基
質溶液として０〜０．０５％マルトトリオース溶液、０
〜０．０７％マルトテトラオース溶液、０〜０．０９％
マルトペンタオース溶液及び０〜４．０％可溶性デンプ
ン溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ ６．０）を用い
た。実施例２で得られた４ｄ１アミラーゼ液として０．
０１Ｕ／ｍｌを用い、それぞれの活性をアミラーゼ活性
により測定した。ミカエリス定数（Ｋｍ値）及びＶｍａ
ｘ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット法により求めた。

【００８５】Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット法により
求めたミカエリス定数（Ｋｍ値）及びＶｍａｘを表４に
示した。表４に示される結果から、Ｋｍ値はマルトテト
ラオースの場合が最も低い値を示した。これにより本発
明の４ｄ１アミラーゼは、マルトテトラオースに対して
最も高い親和性をもっていることが明らかとなった。こ
れは、基質特異性で示された結果を支持するものであっ
た。

【００８６】

【表４】

【００８７】実施例１４：４ｄ１アミラーゼの受容体特
異性 本発明の４ｄ１アミラーゼの糖転移反応における受容体
特異性を調べるため、可溶性デンプンを糖供与体、単
糖、糖アルコール、フェノール類、アルコール類を受容
体とし、糖転移反応を行い、転移生成物をＴＬＣ分析で
確認した。反応中に分解してしまう可能性のある化合物
を受容体とした場合は、アミラーゼを加えずに同条件で
反応させたものと対照実験を行い、加えた場合と反応生
成物をＴＬＣ上で比較して分解生成物以外のスポットが
観察された場合、転移反応が起こっているものとした。
またフエノール類を受容体とした場合においては、転移
率も求めた。

【００８８】１）単糖・糖アルコールを受容体とした場
合 本実施例において、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトー
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロ−ス、Ｄ−ガラクトー
ス、Ｄ，Ｌ−アラビノース、Ｄ，Ｌ−フコース及びＬ−
ラムノースの単糖、Ｄ−グルコサミン、１，５−アンヒ
ドログリシトール、メソ−エリシトール、ソルビトール
及びグリセロールの糖アルコールを受容体として使用し
た。

【００８９】５．０％受容体及び５．０％可溶性デンプ
ン（メルク(Merck) 社製）を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ ６．０）１００μｌに実施例２で得られた４ｄ
１アミラーゼ酵素液（０．６Ｕ／ｍｌ）１００μｌを添
加し、３７℃で２４時間反応させた。反応液２μｌをＴ
ＬＣ分析（展開溶媒：酢酸エチル／酢酸／水（２：１：
１（ｖ／ｖ））、１重展開、検出条件：５０％硫酸を噴
霧し、１３０℃で数分間加熱する）に供した。

【００９０】その結果、単糖を受容体として糖転移反応
を行なった場合では、Ｄ−グルコース、フルクトースは
デンプン分解物と発色の色が同じであり、転移生成物と
確信はできないが受容体を添加しなかったものに比べて
スポットが濃く表れたため、おそらく転移反応が起こっ
ていると考えられる。また、受容体でグルコースと異な
った発色を示す他のものについては、発色の色で転移生
成物と判断した。Ｄ−マンノース、キシロ−ス、ガラク
トース、Ｄ，Ｌ−アラビノースは茶色に、Ｄ，Ｌ−フコ
ース及びＬ−ラムノースは黄色に発色したスポットがマ
ルトースからマルトトリオース付近で確認された。これ
により、転移反応が起こっていると考えられる。また、
アミノ糖と糖アルコールを受容体として糖転移反応を行
なった場合では、いずれの受容体の場合でも転移生成物
が検出された。

【００９１】２）フェノール類を受容体とした場合 本実施例においては、受容体として、ヒドロキノン、レ
ゾルシノール、カテコール、バニリン、マルトール、ピ
ロガロール、（＋）−カテキン、コウジ酸、コーヒー
酸、没食子酸およびピリドキシンを用いた。

【００９２】５．０％受容体、５．０％可溶性デンプン
（メルク(Merck) 社製）及び２０％メタノールを含む５
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ６．０）１００μｌに実施例
２で得られた４ｄ１アミラーゼ液（０．６Ｕ／ｍｌ）１
００μｌを添加し、３７℃で２４時間反応させた。受容
体の酸化を防ぐためにアルゴンガスで置換した後、暗所
下にて反応を行なった。反応液５μｌはＴＬＣ分析（展
開溶媒：酢酸エチル／酢酸／水（３：１：１（ｖ／
ｖ））、１重展開、検出条件：５０％硫酸を噴霧し、１
３０℃で数分間加熱する；および紫外線（２５４ｎｍ）
照射下で紫外線吸収物質を確認）に供した。また、転移
率は、上記の反応液２０μｌを２０％メタノールを含む
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ６．０）４８０μｌに加え
た後、ＨＰＬＣ分析（下記条件）に供した。アミラーゼ
を加えずに同じ条件で反応させたものをブランクとし、
転移率を転移反応による受容体の減少率（％）で表し
た。

【００９３】ＨＰＬＣ分析条件： ポンプ：日本分光製８８０−ＰＵ 検出器：日本分光製８７５−ＵＶ カラムオーブン：日本分光製８６０−ＣＯ クロマトグラムの記録及びピーク面積の算出：島津製作
所製Ｃ−Ｒ６Ａ カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（φ６．０ｍｍ
×１５０ｃｍ） カラム温度：室温 流速：１．０ｍｌ／分 溶媒：メタノール／水／酢酸（１５：８５：１，ｖ／
ｖ） 検出：ＵＶ ２８０ｎｍ この結果、マルトールとコウジ酸の場合にはっきりとし
た転移生成物のスポットが検出された。また、ピロガロ
ールの場合、受容体自身の酸化が激しくて確認しにくい
が、酵素を加えずに同じ条件で反応させたものとの比較
により、転移生成物と思われるスポットが検出された。
ピリドキシンの場合、デンプンの加水分解生成物である
マルトオリゴ糖と同じ範囲のＲｆ値に転移生成物のスポ
ットが確認された。このスポットはＵＶ照射によって、
より鮮明に確認された。ヒドロキシベンゼンは全て転移
生成物が検出された。また、転移率を求めた（表５）と
ころ、ヒドロキシベンゼンは、ヒドロキノン、カテコー
ル、レゾルシノールの順で高くなっていった。他のフェ
ノールについては、マルトールを用いた場合に、転移率
が１４％という高い活性を示した。

【００９４】

【表５】

【００９５】３）メトキシフェノールを受容体とした場
合 上記２）において、ヒドロキシベンゼンを用いた場合、
水酸基の位置がｏ−，ｍ−，ｐ−の順で転移率の減少が
認められたため、この点に関して検討を行なうために、
ｏ−，ｍ−，ｐ−メトキシフェノールを受容体として糖
転移反応を行なった。

【００９６】５．０％受容体、５．０％可溶性デンプン
（メルク(Merck) 社製）及び２０％メタノールを含む５
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ６．０）１００μｌに実施例
２で得られた４ｄ１アミラーゼ液（０．６Ｕ／ｍｌ）１
００μｌを添加し、３７℃で２４時間反応させた。この
反応においても受容体の酸化を防ぐためにアルゴンガス
で置換した後、暗所下にて反応を行なった。反応液５μ
ｌをＴＬＣ分析（展開溶媒：酢酸エチル／酢酸／水
（２：１：１（ｖ／ｖ））、１重展開、検出条件：５０
％硫酸を噴霧し、１３０℃で数分間加熱する）に供し
た。また、転移率を上記２）と同様の方法で求めた。

【００９７】この結果、メトキシフェノールはｏ−，ｍ
−，ｐ−の全てにおいてわずかであるが、転移生成物が
確認され、転移率（表５）はｏ−，ｍ−，ｐ−の順で減
少し、ヒドロキシベンゼンの結果と一致した。

【００９８】４）アルコール類を受容体とした場合 ４−１）受容体特異性 ５．０％可溶性デンプン（メルク(Merck) 社製）溶液
（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ ６．０）５００μｌに実
施例２で得られた４ｄ１アミラーゼ液（０．６Ｕ／ｍ
ｌ）１００μｌを添加した後、各アルコール２００μｌ
を加え、３７℃で２４時間、１７５ｒｐｍで反応させ
た。水に不溶性のアルコールへの転移反応は、２層系で
行なった。反応液５μｌをＴＬＣ分析（展開溶媒：クロ
ロホルム／メタノール／酢酸／水（４０：３０：２：１
（ｖ／ｖ））、１−ヘプタノール、１−オクタノール及
び分岐鎖アルコールは２重展開、それ以外は１重展開、
検出条件：５０％硫酸を噴霧し、１３０℃で数分間加熱
する）に供した。不溶性アルコールの場合は、両層をＴ
ＬＣ分析に供した。

【００９９】４−２）供与体の影響 供与体として可溶性デンプンとマルトテトラオース、受
容体として１−ヘキサノールを用いて転移反応における
供与体の影響を確認した。５．０％可溶性デンプン（メ
ルク(Merck) 社製）あるいはマルトテトラオース溶液
（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ ６．０）５００μｌに実
施例２で得られた４ｄ１アミラーゼ液（０．６Ｕ／ｍ
ｌ）１００μｌを添加した後、１−ヘキサノール２００
μｌを加え、３７℃で２４時間、１７５ｒｐｍで反応さ
せた。反応後、１−ヘキサノール層を各同量ずつＴＬＣ
分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／酢酸／水
（４０：３０：２：１（ｖ／ｖ））、２重展開、検出条
件：５０％硫酸を噴霧し、１３０℃で数分間加熱する）
に供し、比較した。

【０１００】この結果、直鎖アルコールは炭素数１〜８
を、分岐鎖アルコールは２−プロパノール及び２−ヘキ
サノール、芳香族アルコールはベンジルアルコールとβ
−フェニルエチルアルコールを用いた。ＴＬＣ分析の結
果、直鎖と分岐鎖アルコールについては、いずれのアル
コールに対してもわずかであるが転移生成物が確認され
た。また、不溶性アルコールの場合、アルコール層に２
つの転移生成物が検出された。さらに、芳香族アルコー
ルの場合、転移生成物は検出されなかった。

【０１０１】供与体としてマルトテトラオースを用いる
と、可溶性デンプンを用いた場合に比べて転移生成物の
スポットが濃く検出され、さらにＲｆ値の低い転移生成
物が著しく生成された。

【０１０２】実施例１５：４ｄ１アミラーゼの糖転移生
成物の分析 実施例１４において、アルコールを受容体とした場合、
転移生成物のスポットが２つ検出された。よって、この
両者の違いについて１−ヘキサノールを受容体とした場
合で検討した。両者は糖残基の結合様式、あるいは糖の
重合度で異なると思われるので、この点について検討す
るため、酵素処理およびメチル化分析に供した。以下、
糖転移反応のＴＬＣ分析において検出された転移生成物
のスポットで、Ｒｆ値の高いものをＰｌ、低いものをＰ
２とした。

【０１０３】１）酵素処理による検討 まず、グルコアミラーゼ処理及びグルコシダーゼ処理を
行なった。

【０１０４】５．０％可溶性デンプン（メルク(Merck)
社製）溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ ６．０）１．
５ｍｌに実施例２で得られた４ｄ１アミラーゼ液（０．
６Ｕ／ｍｌ）３００μｌを添加した後、１−へキサノー
ル６００μｌを加え、３７℃で２４時間、１７５ｒｐｍ
で反応させた。その後、反応液の１−ヘキサノール層５
０μｌを蒸留水と共沸乾固させた後、２０％メタノール
を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ６．０）１００μｌ
に再溶解させた。次いで、その溶液にグルコアミラーゼ
（３５Ｕ／ｍｌ）、α−グルコシダーゼあるいはβ−グ
ルコシダーゼ（４０Ｕ／ｍｌ）２００μｌを添加し、３
７℃で１６時間で反応させた。１００℃に５分間保つこ
とにより酵素を失活させた後減圧乾固し、２０％メタノ
ール５０μｌに再溶解させてＴＬＣ分析（展開溶媒：ク
ロロホルム／メタノール／酢酸／水（４０：３０：２：
１（ｖ／ｖ））、２重展開、検出条件：５０％硫酸を噴
霧し、１３０℃で数分間加熱する）に供した。酵素を加
えずに同じ条件で反応させたものをブランクとし、同時
にＴＬＣ分析を行い、比較した。なおグルコアミラーゼ
はリゾプス デレマー(Rhizopus delemar)由来のグルコ
アミラーゼ（東洋紡績株式会社製）、α−グルコシダー
ゼはサッカロマイセス エスピー(Saccharomyces sp.)
由来のα−グルコシダーゼ（和光純薬製）、β−グルコ
シダーゼはスィートアーモンド(Sweet almond)由来のβ
−グルコシダーゼ（オリエンタル酵母製）を用いた。

【０１０５】グルコアミラーゼ処理後のＴＬＣ分析の結
果、グルコアミラーゼを作用させることにより、Ｐ２の
スポットが消滅しＰｌとグルコースの２つのスポットが
検出された。また、β−グルコシダーゼで処理をした場
合には、Ｐ１とＰ２の両者ともスポットが検出された
が、α−グルコシターゼで処理をすることにより、２つ
のスポットは消滅した。これらの結果より、転移生成物
はＰｌとＰ２の両者とも、糖残基がα−結合をしてお
り、さらにＰｌはモノグリコシドであることが明らかと
なった。

【０１０６】２）メチル化分析による検討 さらに糖残基の結合様式について検討するためにＰ１と
Ｐ２を精製しそれぞれメチル化分析を行なった。

【０１０７】２−１）転移生成物の精製 ５．０％可溶性デンプン（メルク(Merck) 社製）溶液
（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ ６．０）５．０ｍｌに実
施例２で得られた４ｄ１アミラーゼ液（０．６Ｕ／ｍ
ｌ）２．０ｍｌを添加した後、１−ヘキサノール４．０
ｍｌを加え、３７℃で２４時間、１７５ｒｐｍで反応さ
せた。反応後、１−へキサノール層をＴＬＣ分析（展開
溶媒：クロロホルム／メタノール／酢酸／水（４０：３
０：２：１（ｖ／ｖ））、１重展開、検出条件：５０％
硫酸を噴霧し、１３０℃で数分間加熱する）に供し、転
移生成物を確認した。次いで、転移生成物をシリカゲル
クロマトグラフィーにて精製した：ガラスカラムにクロ
ロホルムで懸濁させたシリカゲル（ワコーゲルＣ−２０
０、和光純薬製）を詰め、反応液の１−ヘキサノール層
を静かにのせた。約３倍容のクロロホルムで１−ヘキサ
ノールを溶出させた後、クロロホルム／メタノール
（９：１、ｖ／ｖ）、でＰｌを溶出させた。溶出液は一
定量ずつ集め、ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／
メタノール／酢酸／水（４０：３０：２：１（ｖ／
ｖ））、１重展開、検出条件：５０％硫酸を噴霧し、１
３０℃で数分間加熱する）によりＰｌの確認を行なっ
た。ＴＬＣ上でＰ１のスポットが検出されなくなった地
点で、溶媒をクロロホルム／メタノ−ル（７：３、ｖ／
ｖ）に変えＰ２を溶出させた。

【０１０８】２−２）メチル化分析 ２−１）で得られたＰｌとＰ２を箱守法(S. Hakomori,
J. Biochem., 50, 205(1964)) によりメチル化した。得
られたメチル化物を加水分解し、アルジトールアセテー
トとした：メチル化物に９０％ギ酸１ｍｌを加え、１０
０℃で２時間加熱した後、ギ酸を蒸留水と共に減圧濃縮
して除去した。これに０．５Ｍ硫酸１ｍｌを加え、１０
０℃で１２時間加熱して加水分解した。この反応液は炭
酸バリウムで中和し、遠心分離により硫酸バリウムを除
去後、バリウムイオンをＡｍｌｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−
１２０（Ｈ⁺ ）により除去して減圧乾固した。これに水
素化ホウ素ナトリウム（１００ｍｇ／ｍｌ １Ｍアンモ
ニア水溶液）０．１ｍｌを加え、３７℃で９０分間イン
キユベートして還元した後、無水酢酸０．１ｍｌで過剰
な水素化ホウ素ナトリウムを分解した。次いで、メチル
イミタゾール０．２１ｍｌ及び無水酢酸２ｍｌ加え、超
音波層中に３０分間置きアセチル化を行った後、氷水に
よって反応を停止し、クロロホルム抽出を行なうことに
より部分メチル化アルジトールアセテ−トを得た。これ
を下記条件でガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）分析に
供した。ガスクロマトグラム上に認められたピークは標
品の保持時間の比較により同定した。

【０１０９】ＧＬＣ分析条件： 分析器：水素炎イオン検出器（ＦＩＤ）を装備した島津
製作所製ＧＣ−７Ａ クロマトグラムの記録及びピーク面積の算出：ＳＩＣ製
Chromatocorder-21 カラム：ＣＢＰ−１−Ｍ２５−０２５キャピラリーカラ
ム（φ０．２ｍｍ×２５ｍ） 温度：１６０→２２０℃（昇温：３℃／分） キャリアーガス：Ｎ₂ ５０ｍｌ／分 部分メチル化アルジトールアセテートのガスクロマトグ
ラムの結果、Ｐｌからは、非還元末端グルコ−ス残基由
来のｌ，５−ジ−Ｏ−アセチル−２，３，４，６−テト
ラ−Ｏ−メチルグルシトール(1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6
-tetra-O-methyl glucitol) のピークのみ、およびＰ２
からは、非還元末端グルコース残基由来のｌ，５−ジ−
Ｏ−アセチル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチルグ
ルシトール(1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl
glucitol) のピークと（１→４）結合中間グルコース残
基由来の１，５，４−トリ−Ｏ−アセチル−２，３，６
−テトラ−Ｏ−メチルグルシトール(1,5,4-di-O-acetyl
-2,3,6-tetra-O-methyl glucitol) の２つのピークがお
よそｌ：ｌで認められた。以上の結果より、Ｐ１は１−
ヘキシル α−グルコシドであり、Ｐ２は１−ヘキシル
α−マルコシドであることが明らかとなった。

【０１１０】

【発明の効果】上述したように、本発明のα−アミラー
ゼは新規なα−アミラーゼであり、特にバチルス・サー
キュランス ４ｄ１(Bacillus circulans 4d1)株由来の
α−アミラーゼは、下記酵素学的な性質を有する新規な
α−アミラーゼである： ａ）至適ｐＨは７．０〜８．０であり、ｐＨ６．５〜
９．０の範囲で安定である； ｂ）至適温度は４０℃であり、１０分間の熱処理に対し
て５０℃まで安定である； ｃ）Ｃｄ²⁺及びＣｕ²⁺により完全に阻害され、Ｈｇ²⁺及
びＡｇ⁺ によっても大きく阻害される； ｄ）アミノ酸組成を分析したところ、報告されている値
と大きな相違は認められない； ｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は６６，０００と算
出されたが、ＨＰＬＣでは３５万と大きな値を示す； ｆ）デンプン、アミロース、アミロペクチン、マルトオ
リゴ糖、シクロデキストリン及びプルランを加水分解す
ることができるが、マルトース、イソマルト−ス及びグ
リコーゲンは分解しない； ｇ）可溶性デンプン、マルトオリゴ糖及びシクロデキス
トリンの加水分解生成物はマルトースである； ｈ）可溶性デンプンのα−ｌ，４結合をランダムに分解
することによりオりゴ糖単位にした後、還元末端側から
マルトースを特異的に生成するようにオリゴ糖に作用す
る； ｉ）可溶性デンプン及びマルトオリゴ糖を基質としたＫ
ｍ値は、マルトテトラオースが最も低い値を示す； ｊ）単糖及び糖アルコールを受容体とした糖転移反応で
は、糖アルコールを用いた場合にはっきりとした転移物
が検出される； ｋ）フェノール類を受容体とした糖転移反応では、ヒド
ロキシベンゼン、メトキシフェノール、マルトール、ピ
ロガロール、コウジ酸およびピリドキシンに転移活性を
示し、水酸基の位置が、オルト、メタ、パラの順で転移
率が上昇する傾向が見られる； ｌ）アルコール類を受容体とした糖転移反応では、直鎖
および分岐アルコールに対してはいずれにも転移生成物
が検出されるが、芳香族アルコールには転移活性を示さ
ない；および ｍ）１−ヘキサノールを受容体とした場合の転移生成物
の主生成物は、ヘキシルグルコシドとへキシルグルコシ
ドである。

【０１１１】また、このバチルス・サーキュランス ４
ｄ１(Bacillus circulans 4d1)株由来のα−アミラーゼ
は、１−ヘキサノールのような脂溶性の化合物に対して
も糖転移活性を示すため、今後この酵素を用いた配糖体
などの有用な化合物の合成が期待される。

【０１１２】さらに、本発明によるバチルス・サーキュ
ランス(Bacillus circulans)の培養物に硫安沈殿、イオ
ン交換、疎水及びゲル瀘過等のクロマトグラフィーによ
る精製手段を施すことにより、本発明のα−アミラーゼ
が電気泳動的に単一のタンパク質バンドとして単離でき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の４ｄ１アミラーゼの至適ｐＨを示す
グラフである。

【図２】 本発明の４ｄ１アミラーゼのｐＨ安定性を示
すグラフである。

【図３】 本発明の４ｄ１アミラーゼの温度依存性を示
すグラフである。

【図４】 本発明の４ｄ１アミラーゼの温度安定性を示
すグラフである。

【図５】 加水分解率とヨウ素呈色度の関係を示すグラ
フである。

【図６】 反応時間（横軸）及び旋光角（縦軸）との関
係を示すグラフである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の酵素化学的性質を有するバチルス
   ・サーキュランス(Bacillus circulans)由来のα−アミ
   ラーゼ： 作用および基質特異性；可溶性デンプン、アミロー
   ス、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキスト
   リン及びプルラン、特にマルトオリゴ糖に対して加水分
   解活性を有する 至適ｐＨ；７．０〜８．０ 安定ｐＨ；６．５〜９．０ 至適温度；４０℃ 温度安定性；１０分間の熱処理に対して５０℃まで 分子量；ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
   で、約６６，０００ 活性；Ｃｄ²⁺及びＣｕ²⁺により完全に阻害。
2. 【請求項２】 該バチルス・サーキュランス(Bacillus
   circulans)が受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１４８２９号の
   バチルス・サーキュランス ４ｄ１(Bacillus circulan
   s 4d1)株である、請求項１に記載のα−アミラーゼ。
3. 【請求項３】 バチルス・サーキュランス(Bacillus ci
   rculans)に属し、α−アミラーゼ生産能を有する微生物
   を培養し、該微生物に培養物中にα−アミラーゼを産生
   せしめ、該培養物から請求項１に記載のα−アミラーゼ
   を精製することからなるα−アミラーゼの単離方法。
4. 【請求項４】 該バチルス・サーキュランス(Bacillus
   circulans)が受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−１４８２９号の
   バチルス・サーキュランス ４ｄ１(Bacillus circulan
   s 4d1)株である、請求項３に記載の方法。