JPH10265383A

JPH10265383A - 医薬組成物

Info

Publication number: JPH10265383A
Application number: JP7182397A
Authority: JP
Inventors: Takaaki Akaike; 孝章赤池; Tomonori Kondo; 智紀近藤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-03-25
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 1998-10-06

Abstract

(57)【要約】【課題】ＰＴＩＯ類に生体内での反応特異性が付与さ
れ、さらに製剤内でのＰＴＩＯ類の保存安定性のよいＰ
ＴＩＯ類の製剤及び医薬組成物を提供する。【解決手段】一般式（１）で表される化合物及び／又
はその生理的に許容される塩を、コレステロール及びそ
の類縁体から選ばれる１種又は２種以上と、リン脂質と
して飽和のリン脂質のみを含有する球状膜に内包して、
小球体とする。また、前記小球体を医薬組成物に配合す
る。【化１】（但し、式中Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴はそれぞれ独立して水
素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ⁵はア
ミノ基、炭素数１〜４のアルキル基を有する２級又は３
級のアミノ基、もしくは炭素数１〜４のアルキル基を有
する４級アンモニウム基を表す。）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、２−フェニル−イ
ミダゾロ−１−イロキシ−３−オキサイド誘導体を有効
成分とする製剤及びこれを含有する医薬組成物に関し、
詳しくは、前記化合物に製剤内での保存安定性と生体内
での反応特異性を付与することを可能とした小球体状の
製剤及びこれを含有する医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】２−フェニル−４，４，５，５−テトラ
メチル−イミダゾロ−１−イロキシ−３−オキサイド
（ＰＴＩＯ）や２−（４−カルボキシフェニル）−４，
４，５，５−テトラメチル−イミダゾロ−１−イロキシ
−３−オキサイド（カルボキシＰＴＩＯ）などのＰＴＩ
Ｏ及びその誘導体（以下、この様な２−フェニル−イミ
ダゾロ−１−イロキシ−３−オキサイド骨格を有する化
合物を総称して「ＰＴＩＯ類」という）は、一酸化窒素
の消去能力に優れており、それが関与するといわれてい
る循環器疾患や炎症に対して有効に作用するであろうと
推測されている。しかしながら、これらＰＴＩＯ類はそ
の反応性のよさのために血中に入るとすぐに血中成分と
反応して一酸化窒素消去力を失い失活してしまうことか
ら、その医薬としての有用性が十分に実証されていない
のが実状であった。そこで、これらＰＴＩＯ類を医薬と
して用いるために、ＰＴＩＯ類に生体内での反応特異性
を付与した製剤の開発が望まれていた。

【０００３】この様な状況のなか、上記ＰＴＩＯ類をリ
ポソームに内包して生体内での反応性を調整しようとす
る試みが為され、これによりＰＴＩＯ類が生体内で有効
に作用するような製剤が得られるようになった。しか
し、これら従来のリポソーム内包型のＰＴＩＯ類製剤で
は、リポソームの構成成分であるリン脂質がリポソーム
の膜弾性を維持するために不飽和化合物のリン脂質を含
んでいることにより、ＰＴＩＯが経時的に失活してしま
うため、製剤的な保存安定性は得られなかった。つまり
従来のリポソーム内包型のＰＴＩＯ類製剤は、用時調製
での使用に限られていた。

【０００４】そこで、ＰＴＩＯ類に生体内での反応特異
性が付与され、かつＰＴＩＯ類が製剤内で失活せずに安
定して保存されるような、ＰＴＩＯ類の製剤の開発が望
まれていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記観点から
なされたものであり、ＰＴＩＯ類に生体内での反応特異
性が付与され、さらに製剤内でのＰＴＩＯ類の保存安定
性のよいＰＴＩＯ類の製剤及び医薬組成物を提供するこ
とを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、従来のリポソー
ム製剤では生体内でのＰＴＩＯ類の反応性を調整するた
めに膜弾性を保持することが要求され、そのために不飽
和化合物のリン脂質が用いられており、これがＰＴＩＯ
類により酸化されるために製剤の保存安定性が得られな
かったが、ＰＴＩＯ類への生体内での反応特異性付与の
ためにはリポソームの膜弾性は重要な要素ではないこと
を解明した。

【０００７】この様な状況から本発明者らは、上記不飽
和化合物のリン脂質の替わりにリン脂質として飽和化合
物のリン脂質のみを含有させた球状膜に、特定のＰＴＩ
Ｏ類を内包させて小球体としてＰＴＩＯ類を製剤化すれ
ば、ＰＴＩＯ類に生体内での反応特異性が付与されて投
与時には有効に作用し、且つ、製剤保存時には小球体内
部のＰＴＩＯ類は安定に保存されることを見出し、さら
に上記飽和化合物のリン脂質を含有させた球状膜にコレ
ステロール及びその類縁体を含有させて同様にＰＴＩＯ
類を製剤化すれば、前記製剤の保存安定性がより優れた
ものとなることを見出し、本発明を完成させた。

【０００８】すなわち本発明は、リン脂質を含有する球
状膜と、これに内包された一般式（１）で表される化合
物及び／又はその生理的に許容される塩と、を含む小球
体であって、前記リン脂質が飽和のリン脂質であり、且
つ、前記球状膜がコレステロール及びその類縁体から選
ばれる１種又は２種以上を含有することを特徴とする小
球体である。

【０００９】

【化３】

【００１０】（但し、式中Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴はそれぞ
れ独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表
し、Ｒ⁵はアミノ基、炭素数１〜４のアルキル基を有す
る２級又は３級のアミノ基、もしくは炭素数１〜４のア
ルキル基を有する４級アンモニウム基を表す。）本発明の小球体に用いられる上記一般式（１）に表され
る化合物として、具体的には、下記式（２）で表される
２−（４−（トリメチルアミノ）フェニル）−４，４，
５，５−テトラメチル−イミダゾロ−１−イロキシ−３
−オキサイドが挙げられる。

【００１１】

【化４】

【００１２】また、本発明の小球体に用いられる上記飽
和のリン脂質として、具体的には、水素添加レシチン、
フォスファチジルコリン、フォスファチジルイノシトー
ル、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチ
ジルグリセロール、フォスファチジン酸等を挙げること
ができる。

【００１３】この様な本発明の小球体として具体的に
は、上記本発明の特徴を持たせたリポソーム等が挙げら
れる。さらに、本発明は上記本発明の小球体を有効成分
として含有する医薬組成物を提供する。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下に本発明を説明する。まず、
本発明の小球体の球状膜により内包されるＰＴＩＯ類に
ついて説明する。

【００１５】（１）本発明に用いるＰＴＩＯ類本発明の小球体には、上記一般式（１）で表される化合
物及び／又はその生理的に許容される塩の１種または２
種以上がＰＴＩＯ類として用いられる。これは、ＰＴＩ
Ｏ類の内でも上記一般式（１）で表される化合物及び／
又はその生理的に許容される塩以外のＰＴＩＯ類では、
本発明の小球体のリン脂質を含有する球状膜中に取り込
まれることが困難であるためである。

【００１６】本発明に用いられる上記一般式（１）で表
される化合物として、具体的には、下記式（２）で表さ
れる２−（４−（トリメチルアミノ）フェニル）−４，
４，５，５−テトラメチル−イミダゾロ−１−イロキシ
−３−オキサイド（以下、「トリメチルアミノＰＴＩ
Ｏ」と省略する）、下記式（３）で表される２−（４−
（ジメチルアミノ）フェニル）−４，４，５，５−テト
ラメチル−イミダゾロ−１−イロキシ−３−オキサイド
（以下、「ジメチルアミノＰＴＩＯ」と省略する）等が
挙げられるが、本発明において好ましくはトリメチルア
ミノＰＴＩＯが用いられる。

【００１７】

【化５】

【００１８】

【化６】

【００１９】また、本発明の小球体に用いられる上記一
般式（１）で表される化合物の生理的に許容される塩と
して、具体的には、上記一般式（１）で表される化合物
の塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の鉱酸塩、クエン酸塩、
シュウ酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。こ
れらの塩のうちでも、本発明において好ましくは塩酸塩
が用いられる。さらに塩酸塩のうちでも上記一般式
（１）のＲ⁵が４級アンモニウムクロライドであるもの
がより好ましく用いられる。

【００２０】この様な本発明に用いるＰＴＩＯ類、すな
わち上記一般式（１）で表される化合物及び／又はその
生理的に許容される塩は、いずれも既知の化合物であ
り、その製造方法も公知である。

【００２１】例えば、上記一般式（１）で表される化合
物を製造するには、以下の反応式に示すように、ジヒド
ロキシルアミン誘導体にパラ置換ベンズアルデヒドを反
応させ、得られた化合物を二酸化鉛などの金属酸化物を
触媒として酸化すればよい。

【００２２】

【化７】

【００２３】（但し、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵はそれ
ぞれ一般式（１）と同じものを意味する。）また、上記一般式（１）で表される化合物の生理的に許
容される塩は、例えば、一般式（１）に表される化合物
と、塩酸、硝酸、リン酸等の鉱酸やクエン酸、シュウ
酸、酒石酸等の有機酸などの酸と、を極性又は非極性溶
媒中で混合することで容易に得られる。

【００２４】この様にして得られる一般式（１）で表さ
れる化合物やその生理的に許容される塩は、さらに、再
結晶やカラムクロマトグラフィー等の通常の方法により
容易に精製できる。

【００２５】次に、本発明の小球体において上記ＰＴＩ
Ｏ類を内包する球状膜について説明する。

【００２６】（２）本発明の小球体の球状膜本発明の小球体の球状膜は、リン脂質と、コレステロー
ル及びその類縁体から選ばれる１種又は２種以上とを含
有し、前記リン脂質が飽和化合物のリン脂質のみで構成
されることを特徴とする。

【００２７】本発明の小球体の球状膜に用いるリン脂質
は、上記の様に飽和化合物である。ここで、飽和化合物
とは化合物中に不飽和性の炭素原子間多重結合を含まな
い化合物を、不飽和化合物とは化合物中に不飽和性の炭
素原子間多重結合を有する化合物をそれぞれいうが、以
下本明細書においては、飽和化合物に分類されるリン脂
質を「飽和リン脂質」、不飽和化合物に分類されるリン
脂質を「不飽和リン脂質」とそれぞれ記載することとす
る。

【００２８】本発明の小球体を構成する球状膜が含有す
る飽和リン脂質としては、飽和化合物に分類されるリン
脂質であれば特に制限されないが、具体的には、水素添
加レシチン、ジミリストイルフォスファチジルコリン、
ジステアロイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイ
ルフォスファチジルコリン等のフォスファチジルコリ
ン、これと同様なジミリストイル、ジステアロイル、ジ
パルミトイル等のそれぞれフォスファチジルイノシトー
ル、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチ
ジルグリセロール、フォスファチジン酸、さらにはこれ
らのリゾ体等を挙げることができる。これら飽和リン脂
質は、通常の方法で製造することができる他、市販品も
あるのでこれらの市販品を本発明に用いることも可能で
ある。

【００２９】本発明においては、これらの飽和リン脂質
のうちでも、安価で入手しやすい水素添加レシチン、ジ
ステアロイルフォスファチジルコリン、ジステアロイル
フォスファチジルグリセロール等が、好ましく用いられ
る。本発明の小球体を構成する球状膜には、これらの飽
和リン脂質の１種が単独で用いられてもよいし、２種以
上を組み合わせて用いてもよい。また、本発明の小球体
を構成する球状膜における飽和リン脂質の好ましい含有
量は１〜９０重量％であり、１０〜７０重量％がより好
ましく、２０〜６０重量％が更に好ましい。

【００３０】本発明の小球体を構成する球状膜は上記飽
和リン脂質以外にコレステロール及びコレステロール類
縁体から選ばれる１種又は２種以上を含有する。前記本
発明に用いられるコレステロール類縁体として、具体的
には、ヒドロキシコレステロール等が好ましく挙げられ
る。これら、コレステロール及びその類縁体は、通常の
方法により各種基源生物から得られるが、本発明に用い
るコレステロールやその類縁体がその基源を問われない
ことはいうまでもない。また、これら化合物には市販品
があるので、これを本発明に用いることも可能である。

【００３１】ここで、コレステロールやその類縁体の様
な不飽和化合物は、本来、ＰＴＩＯ類によって酸化され
やすく、従ってこれら不飽和化合物とＰＴＩＯ類とを共
存させればＰＴＩＯ類の安定性を損なうものと推定され
ていたが、コレステロール及びその類縁体は不飽和化合
物であってもＰＴＩＯ類の安定性を損なわず、却って安
定性を向上させることが後記実施例に示す通り、本発明
者等によって明らかにされている。

【００３２】本発明においては、コレステロール及びコ
レステロール類縁体（以下、「コレステロール類」とい
うこともある）の唯一種を用いることもできるし、これ
らの２種以上を組み合わせて用いることも可能である。
本発明の小球体を構成する球状膜におけるコレステロー
ル及びその類縁体から選ばれる１種又は２種以上の好ま
しい含有量は、１〜５０重量％であり、より好ましくは
５〜４０重量％であり、更に好ましくは１０〜２０重量
％である。

【００３３】本発明の小球体を構成する球状膜は、上記
飽和リン脂質およびコレステロール類以外に、本発明の
効果を損なわない範囲において、膜特性の改善等を目的
として、各種任意成分を含有することが可能である。こ
の様な任意成分としては、１，３−ブタンジオールやプ
ロピレングリコールの様な多価アルコール、ＰＯＥ硬化
ひまし油やＰＯＥステアリン酸エステルの様な界面活性
剤等を例示することができる。これら多価アルコールや
界面活性剤などの成分は、球状膜に柔軟性を付与するこ
とができるという長所がある反面、含有量によっては内
包するＰＴＩＯ類が流出し易くなるという短所があるた
め、含有量はこれらの長所を生かし、本発明の効果を損
なわないように設定することが必要である。この様な含
有量として、多価アルコールにおいては、１〜２０重量
％が好ましく、３〜１５重量％がより好ましく、５〜１
０重量％が更に好ましく例示できる。また、界面活性剤
においては、０．１〜１０重量％が好ましく、０．５〜
７重量％がより好ましく、１〜５重量％が更に好まし
い。

【００３４】（３）本発明の小球体及び医薬組成物本発明の小球体は、リン脂質を含有する球状膜と、これ
に内包された一般式（１）で表される化合物及び／又は
その生理的に許容される塩と、を含む小球体であって、
前記リン脂質が飽和のリン脂質であり、且つ、前記球状
膜がコレステロール及びその類縁体から選ばれる１種又
は２種以上を含有することを特徴とする。

【００３５】本発明の小球体における一般式（１）に表
される化合物及び／又はその生理的に許容される塩は上
記球状膜内に内包される際、こられのＰＴＩＯ類単独で
内包されてもよいし、適当な溶液として内包されてもよ
い。また、その他任意成分と共に内包されてもよい。Ｐ
ＴＩＯ類を溶液として球状膜に内包させる際には、溶媒
として水が好ましく用いられ、さらに好ましくは水に各
種成分を添加して調製された生理食塩水、リン酸緩衝
液、リン酸緩衝生理食塩水等が用いられる。

【００３６】本発明の小球体における上記ＰＴＩＯ類の
好ましい含有量は、１〜３０重量％であり、５〜２０重
量％がより好ましく、７〜１７重量％が更に好ましい。
本発明の小球体は、コレステロール類と、リン脂質とし
て飽和リン脂質とを含有する球状膜の原料成分、ＰＴＩ
Ｏ類及びその他任意成分を、通常の薄膜分散法や逆転蒸
発法等の方法で処理することにより製造することが可能
である。しかし、本発明に用いるリン脂質が全て飽和リ
ン脂質であって不飽和リン脂質を含まないため、これら
の方法に用いられる溶媒への溶解性が低いことから、上
記処理の前に強度の超音波等による分散処理を行うこと
が好ましい。また、溶液法、溶液−エクストリュージョ
ン法、薄膜分散−凍結解凍−エクストリュージョン法等
で本発明の小球体を製造することも可能であり、これら
の方法が本発明においては好ましい製造方法である。ま
た、これらの製造方法のなかでも、薄膜分散−凍結解凍
−エクストリュージョン法で本発明の小球体を作製する
ことが特に好ましい。製造方法のより具体的な例を以下
に示す。

【００３７】飽和リン脂質とコレステロール類およびそ
の他膜形成のための任意成分や有機溶媒をソニケーター
でソニケーションし、これに、ＰＴＩＯ類及びその他内
包される任意成分をリン酸緩衝生理食塩水等の溶媒に溶
解した溶液を加え、更にソニケーションをかける。得ら
れた分散液をエバポレーターにかけて有機溶媒を緩やか
に減圧溜去して小球体を得る。これにリン酸緩衝生理食
塩水等を加えてよく振盪した後、遠心分離を行い小球体
をペレット化する。上清を捨ててペレット化された小球
体をよく洗浄する。この振盪−遠心分離−洗浄の作業
を、上清にＰＴＩＯ誘導体の青紫色が消えるまで約４〜
５回繰り返し行うことでペレット化された小球体が得ら
れる。

【００３８】あるいは、飽和リン脂質とコレステロール
類およびその他膜形成のための任意成分を有機溶媒に溶
解した後乾固させて薄膜を作製し、これに、ＰＴＩＯ類
及びその他内包される任意成分をリン酸緩衝生理食塩水
等の溶媒に溶解した溶液を加え、ソニケートし凍結融解
させる。これをエクストルーダーにかけて粒径をそろえ
た後、遠心分離を行い得られた遠沈物（小球体）を取り
出すことで、小球体が得られる。

【００３９】この様にして得られる本発明の小球体の好
ましい形態として、具体的には、リポソームやニオソー
ム等が例示できるが、本発明においては、リポソームが
より好ましいといえる。また、本発明の小球体の好まし
い平均粒径として、例えば、１０〜５００ｎｍ程度の平
均粒径が挙げられる。さらに、前記平均粒径は、より好
ましくは１０〜３００ｎｍ程度であり、更に好ましくは
１０〜２００ｎｍ程度である。

【００４０】本発明の小球体は、コレステロール類と、
リン脂質として飽和リン脂質とを含有する球状膜が、上
記ＰＴＩＯ類を内包する形態を有する。これにより、こ
の小球体が製剤として保存される場合には、反応性の高
いＰＴＩＯ類は球状膜に保護されていることから様々な
物質との反応による失活がなく、また球状膜成分と反応
して失活することもなく、安定して保存される。

【００４１】本発明の医薬組成物は、この様にして得ら
れる上記本発明の小球体を含有する。本発明の医薬組成
物の剤形は特に限定されず、例えば、注射剤、散剤、顆
粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、外用剤等、通常用いら
れている剤形を本発明の医薬組成物の剤形として挙げる
ことができる。また、製剤化に際しては、上記ＰＴＩＯ
類内包の小球体以外に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢
剤、矯味矯臭剤、増量剤、被覆剤、糖衣剤、乳化・可溶
化・分散剤、安定剤、ｐＨ調整剤、等張剤、外用剤基剤
等の医薬品で通常用いられる任意成分を任意の量、用い
ることが可能であり、これら成分と上記ＰＴＩＯ類を通
常の方法に従って製剤化することにより本発明の医薬組
成物を得ることができる。

【００４２】本発明の医薬組成物の投与量、投与方法な
どは、疾患の種類、症状、患者の年令、体重等を勘案し
て適宜選択される。注射剤の投与方法としては、静脈内
投与、動脈内投与、門脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投
与、皮下投与等が例示できる。

【００４３】この様な、ＰＴＩＯ類を安定して含有し、
有効に作用させることが可能な本発明の小球体を配合し
た上記本発明の医薬組成物は、保存時にはＰＴＩＯ類が
安定に保存され、また、投与時にはＰＴＩＯ類は生体内
で患部まで反応性を失うことなく移送され、これを必要
とする患部において球状膜を介して特定物質、具体的に
は一酸化窒素を消去することにより、各種薬理作用を発
揮することが可能となる。本発明の医薬組成物は、具体
的には、血管保護剤として心筋梗塞などの循環器疾患用
の医薬組成物に、呼吸器保護剤として肺炎などの呼吸器
疾患用の医薬組成物に、あるいは抗炎症剤、アトピー性
皮膚炎治療剤等に用いることが可能である。

【００４４】

【実施例】以下に本発明の実施例を説明する。

【００４５】

【実施例１】水素添加レシチン３３ｍｇ、コレステロー
ル１１ｍｇおよびエーテル３ｍｌを試験管に秤込み、ソ
ニケーターで５分間ソニケーションし、これに２ｍＭの
濃度でトリメチルアミノＰＴＩＯを含有する１０ｍＭリ
ン酸緩衝生理食塩水溶液（ｐＨ７．４、以下「ＰＢＳ」
と省略）を１ｍｌ加え、更に１５分間のソニケーション
をかけた。これをエバポレーターにかけてエーテルを緩
やかに減圧溜去して小球体を得た。

【００４６】得られた小球体に０．６ｍｌのＰＢＳを加
えてよく振盪した後、１５０００Ｇで１０分間遠心分離
を行い小球体をペレット化した。遠心分離の上清を捨て
てペレット化した小球体をＰＢＳで洗浄した。さらに、
上記振盪−遠心分離−洗浄の作業を、遠心分離の上清に
ＰＴＩＯ類の青紫色が消えるまで、４〜５回繰り返し行
った。この様にして得られたペレット化した小球体の平
均粒径は３００ｎｍであった。

【００４７】また、上記の小球体の製造においてコレス
テロールの替わりに水素添加レシチンを用いた以外は、
上記と全く同様の方法で比較例１の小球体を製造した。
さらに上記の小球体の製造において水素添加レシチンの
替わりにレシチンを用いた以外は、上記と全く同様の方
法で比較例２の小球体を製造した。

【００４８】上記実施例１および比較例１、２で得られ
た小球体について、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）の測定を
行ったところ、どちらの小球体についてもＰＴＩＯ類特
有のニトロオキサイドラジカルの吸収スペクトルが検出
された。これらのスペクトルは線幅が広がっており、実
施例１及び比較例１、２で得られた小球体内には上記ト
リメチルアミノＰＴＩＯが内包されていることが確認さ
れた。

【００４９】

【実施例２】ジミリストイルフォスファチジルコリン２
４ｍｇとコレステロール２０ｍｇをクロロホルム３０ｍ
ｌで溶解し乾固させて薄膜を作製し、これに２ｍＭの濃
度でトリメチルアミノＰＴＩＯを含有する１０ｍＭＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．４）を１ｍｌ加え、ソニケートし凍結融解
させた。これをエクストルーダーにかけ（フィルターサ
イズ；２００ｎｍ、５回）粒径をそろえた後、１５００
００Ｇで３０分間の遠心分離を３回行った。この遠心分
離で得られた遠沈物（小球体）を取り出し、これを１ｍ
ｌのＰＢＳで再分散させ小球体の分散液を得た。

【００５０】また、上記の小球体の製造においてコレス
テロールの替わりにジミリストイルフォスファチジルコ
リンを用いた以外は、上記と全く同様の方法で比較例３
の小球体の分散液を製造した。

【００５１】実施例２および比較例３で得られた小球体
について分散液の状態でＥＳＲ測定を行ったところ、結
果は上記実施例１と同様であり、これらの小球体内にト
リメチルアミノＰＴＩＯが内包されていることが確認さ
れた。

【００５２】

【実施例３】ジステアロイルフォスファチジルグリセロ
ール２０ｍｇ、ジステアロイルフォスファチジルコリン
１９ｍｇおよびコレステロール５ｍｇをクロロホルム３
０ｍｌで溶解し乾固させて薄膜を作製し、これに２ｍＭ
の濃度でトリメチルアミノＰＴＩＯを含有する１０ｍＭ
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１ｍｌ加え、ソニケートし凍結
融解させた。これをエクストルーダーにかけ（フィルタ
ーサイズ；１００ｎｍ、５回）粒径をそろえた後、１５
００００Ｇで３０分間の遠心分離を３回行った。この遠
心分離で得られた遠沈物（小球体）を取り出し、これを
１ｍｌのＰＢＳで再分散させ小球体の分散液を得た。

【００５３】また、上記実施例３の小球体の製造におい
てコレステロールの替わりにジステアロイルフォスファ
チジルグリセロールを用いた以外は、上記と全く同様の
方法で比較例４の小球体の分散液を製造した。

【００５４】実施例３および比較例４で得られた小球体
について分散液の状態でＥＳＲ測定を行ったところ、結
果は上記実施例１と同様であり、これらの小球体内にト
リメチルアミノＰＴＩＯが内包されていることが確認さ
れた。

【００５５】

【実施例４】ジパルミトイルトイルフォスファチジン酸
１８ｍｇ、ジステアロイルフォスファチジルエタノール
アミン１５ｍｇおよびコレステロール１１ｍｇをクロロ
ホルム３０ｍｌで溶解し乾固させて薄膜を作製し、これ
に２ｍＭの濃度でトリメチルアミノＰＴＩＯを含有する
１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１ｍｌ加え、ソニケー
トし凍結融解させた。これをエクストルーダーにかけ
（フィルターサイズ；２００ｎｍ、５回）粒径をそろえ
た後、１５００００Ｇで３０分間の遠心分離を３回行っ
た。この遠心分離で得られた遠沈物（小球体）を取り出
し、これを１ｍｌのＰＢＳで再分散させ小球体の分散液
を得た。

【００５６】また、上記の小球体の製造においてコレス
テロールの替わりにジパルミトイルトイルフォスファチ
ジン酸を用いた以外は、上記と全く同様の方法で比較例
５の小球体の分散液を製造した。

【００５７】実施例４および比較例５で得られた小球体
について分散液の状態でＥＳＲ測定を行ったところ、結
果は上記実施例１と同様であり、これらの小球体内にト
リメチルアミノＰＴＩＯが内包されていることが確認さ
れた。

【００５８】

【実施例５】ジステアロイルフォスファチジン酸１８ｍ
ｇ、ジミリストイルフォスファチジルイノシトール１５
ｍｇ、コレステロール１１ｍｇおよびエーテル３ｍｌを
試験管に秤込み、ソニケーターで５分間ソニケーション
し、これに２ｍＭの濃度でトリメチルアミノＰＴＩＯを
含有する１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１ｍｌ加え、
更に１５分間のソニケーションをかけた。これをエバポ
レーターにかけてエーテルを緩やかに減圧溜去して小球
体を得た。

【００５９】得られた小球体に０．６ｍｌのＰＢＳを加
えてよく振盪した後、１５０００Ｇで１０分間遠心分離
を行い小球体をペレット化した。遠心分離の上清を捨て
てペレット化した小球体をＰＢＳで洗浄した。さらに、
上記振盪−遠心分離−洗浄の作業を、遠心分離の上清に
ＰＴＩＯ類の青紫色が消えるまで、４〜５回繰り返し行
った。この様にして得られたペレット化した小球体の平
均粒径は１００ｎｍであった。

【００６０】また、上記の小球体の製造においてコレス
テロールの替わりにジステアロイルフォスファチジン酸
を用いた以外は、上記と全く同様の方法で比較例６の小
球体を製造した。

【００６１】実施例５および比較例６で得られた小球体
についてＥＳＲ測定を行ったところ、結果は上記実施例
１と同様であり、これらの小球体内にトリメチルアミノ
ＰＴＩＯが内包されていることが確認された。

【００６２】

【実施例６】水素添加レシチン３３ｍｇ、ヒドロキシコ
レステロール１１ｍｇおよび１，３−ブタンジオール４
ｍｇを試験管に秤込み、８０℃で加熱溶解したものに、
これとは別に８０℃に加熱した、２ｍＭの濃度でトリメ
チルアミノＰＴＩＯを含有する１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ
７．４）の１ｍｌを徐々に加えた後、得られた溶液を１
００ｎｍのフィルターを装着したエクストルーダーにか
けてエクストリュージョン処理した。これを１５０００
０Ｇ、１０分間の遠心分離にかけ、得られた遠沈物（小
球体）を取り出した。

【００６３】得られた小球体に０．６ｍｌのＰＢＳを加
えてよく振盪した後、１４０００Ｇで１０分間遠心分離
を行い小球体をペレット化した。遠心分離の上清を捨て
てペレット化した小球体をＰＢＳで洗浄した。さらに、
上記振盪−遠心分離−洗浄の作業を、遠心分離の上清に
ＰＴＩＯ類の青紫色が消えるまで、４〜５回繰り返し行
った。

【００６４】また、上記の小球体の製造においてヒドロ
キシコレステロールの替わりに水素添加レシチンを用い
た以外は、上記と全く同様の方法で比較例７の小球体を
製造した。

【００６５】実施例６および比較例７で得られた小球体
についてＥＳＲ測定を行ったところ、結果は上記実施例
１と同様であり、これらの小球体内にトリメチルアミノ
ＰＴＩＯが内包されていることが確認された。

【００６６】＜本発明の小球体の評価＞上記各実施例で
得られたトリメチルアミノＰＴＩＯ内包の小球体あるい
は小球体分散液について、製剤内でのＰＴＩＯ類の保存
安定性試験及び薬効試験（生体内でのＰＴＩＯ類の反応
特異性の評価）を行った。

【００６７】（１）保存安定性試験上記実施例１〜６及び比較例１〜７で得られた小球体ま
たは小球体分散液を、室温で４ヶ月間放置した。これら
の小球体または小球体分散液について試験開始から経時
的に４ヶ月間、ＥＳＲの測定を行ったところ、実施例で
得られた小球体、小球体分散液では何れも、４ヶ月後の
ＥＳＲ測定結果においても、なお製造直後にＥＳＲを測
定した時とほぼ同じピークが観察された。一方、比較例
１及び比較例３〜７で得られた小球体、小球体分散液で
は何れも、４ヶ月後のＥＳＲ測定結果において微弱なピ
ークしか認められなかった。さらに、比較例２の小球体
では、製造の７日後には、既にニトロオキサイドラジカ
ルの吸収ピークが観察できなかった。

【００６８】この結果より、本発明のＰＴＩＯ類内包の
小球体においては、ＰＴＩＯ類を長期的に安定して保存
できることがわかった。

【００６９】（２）薬効試験本発明のＰＴＩＯ類内包の小球体について、上記実施例
１で得られた小球体を用いて薬効試験を行い、試験管内
および生体（組織）内で本発明の小球体のＰＴＩＯ類が
反応特異性を有するかどうかあるいは安定性を有するか
どうかを評価した。

【００７０】ａ）試験管内における一酸化窒素消去活性本発明のＰＴＩＯ類内包小球体の一酸化窒素消去活性
を、試験管内において上記実施例１で得られたトリメチ
ルアミノＰＴＩＯ内包小球体に一酸化窒素を直接反応さ
せた際のＥＳＲ測定結果を解析する方法によって評価し
た。これは、ＰＴＩＯ類が一酸化窒素とモル比１：１で
反応すると、ＰＴＩＯ類に由来する反応産物、２−フェ
ニル−４，４，５，５−テトラメチルイミダゾロ−１−
オキシル（ＰＴＩ）類が生成し、ＥＳＲ測定により得ら
れるＰＴＩＯ類のシグナルとＰＴＩ類のシグナル、例え
ば、図１ａ）に示すカルボキシＰＴＩＯのナトリウム塩
のシグナルと、図１ｂ）に示すカルボキシＰＴＩのナト
リウム塩のシグナルが全く異なることを利用した評価方
法である。

【００７１】具体的には、実施例１で得られたトリメチ
ルアミノＰＴＩＯ内包小球体をＰＢＳで希釈してトリメ
チルアミノＰＴＩＯ濃度で１００μＭになるように各試
験管に入れ、これら試験管のそれぞれに、一酸化窒素放
出試薬プロピルアミンＮＯＮＯエートを一酸化窒素添加
量で０〜４０μＭとなるように種々の量添加した。反応
を十分に行わせた後、試験管毎（添加量毎）にＥＳＲ測
定を行い、その結果を解析して各一酸化窒素添加量にお
けるトリメチルアミノＰＴＩ生成量を算定しその値から
一酸化窒素消去量（μＭ）を求めた。

【００７２】また、比較のために、上記試験において実
施例１で得られたトリメチルアミノＰＴＩＯ内包小球体
をＰＴＩＯに替えた以外は全く同様の試験を行った。結
果を図２に示す。

【００７３】この結果より、何の保護もされていない従
来のＰＴＩＯに比べて、実施例１で得られたトリメチル
アミノＰＴＩＯ内包小球体は、試験管内において、一酸
化窒素放出試薬プロピルアミンＮＯＮＯエートより生じ
る一酸化窒素を定量的に効率よく消去しており、有効に
一酸化窒素と反応していることがわかる。

【００７４】ｂ）ウサギ大動脈内皮細胞より産生される
一酸化窒素の消去活性一般に、血管内皮細胞から生成する一酸化窒素は、血管
組織内の平滑筋を弛緩させる内因性の血管弛緩因子とし
て機能している。そこで、ウサギ大動脈をアセチルコリ
ンにより刺激し、内皮より放出される一酸化窒素による
弛緩反応に対する阻害作用について、実施例１で得られ
たトリメチルアミノＰＴＩＯ内包小球体、ＰＴＩＯ、お
よび一酸化窒素合成阻害剤Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニ
ン（Ｌ−ＮＮＡ）を用いて比較試験を行った。

【００７５】３本ずつ９群のウサギ大動脈の全てをアセ
チルコリンにより刺激した。その後、各群のウサギ大動
脈をそれぞれ、実施例１で得られたトリメチルアミノＰ
ＴＩＯ内包小球体、ＰＴＩＯ、Ｌ−ＮＮＡをそれぞれ３
０μＭ、１００μＭ、３００μＭの各濃度で含有する９
種類の検体で処理し、弛緩反応の程度を測定した。な
お、実施例１で得られたトリメチルアミノＰＴＩＯ内包
小球体を含有する検体についての上記濃度は、トリメチ
ルアミノＰＴＩＯとしての濃度である。コントロールと
して上記と同様にアセチルコリンにより刺激しその後何
も処理しなかったウサギ大動脈３本の弛緩反応の程度を
測定した。コントロールのウサギ大動脈弛緩反応の平均
を基に上記各ウサギ大動脈の弛緩反応抑制率を算出し
た。この弛緩反応抑制率について各試験群毎に平均と標
準偏差を求めた。結果を図３に示す。

【００７６】この結果から、一酸化窒素合成阻害剤のＬ
−ＮＮＡや何の保護もされていない従来のＰＴＩＯに比
べて、実施例１で得られたトリメチルアミノＰＴＩＯ内
包小球体は、ウサギ大動脈における血管弛緩反応を強く
抑制していることがわかり、本発明の小球体の強い一酸
化窒素消去活性が明らかとなった。

【００７７】ｃ）マクロファージから生成する一酸化窒
素の消去反応マクロファージ細胞をインターフェロンγ（ＩＦＮ−
γ）や細菌の内毒素であるリポポリサッカライド（ＬＰ
Ｓ）で刺激するすると、誘導型の一酸化窒素合成酵素が
発現され、マクロファージから多量の一酸化窒素が産生
される。そこで、ＩＦＮ−γとＬＰＳによって刺激さ
れ、一酸化窒素合成酵素を発現したマクロファージの誘
導系に、上記実施例１で得られたトリメチルアミノＰＴ
ＩＯ内包小球体を添加した後、上記ａ）と同様のＥＳＲ
測定を行い、そのチャートを解析することで本発明の小
球体の一酸化窒素消去作用を評価した。上記ＥＳＲの測
定結果を図４に示す。

【００７８】この結果から、実施例１で得られたトリメ
チルアミノＰＴＩＯ内包小球体が、上記ＩＦＮ−γとＬ
ＰＳによって刺激されたマクロファージ細胞内の一酸化
窒素を捕捉することで、小球体内のトリメチルアミノＰ
ＴＩＯがトリメチルアミノＰＴＩに変換されることがわ
かった。従って、本発明のＰＴＩＯ類内包の小球体は、
細胞より放出される一酸化窒素を効率よく消去できるも
のと考えられる。

【００７９】ｄ）ＰＴＩＯ内包小球体の生体内安定性本発明の小球体の生体内での安定性を検討するため、ラ
ットより採取した血液中に上記実施例１で得られたトリ
メチルアミノＰＴＩＯ内包小球体とＰＴＩＯとをそれぞ
れ別々に添加して、各添加血液について添加ＰＴＩＯ類
の残存量の変化をＥＳＲにより経時的に測定した。結果
を図５に示す。なお、図５の縦軸は血液中のＰＴＩＯ類
の残存量を添加初濃度に対する百分率で表したものであ
る。

【００８０】この結果から、何の保護もされていない従
来のＰＴＩＯを血液に添加した場合、前記ＰＴＩＯは血
液中の還元物質により速やかに消失していくが、実施例
１で得られたトリメチルアミノＰＴＩＯ内包小球体を添
加した場合には、ＰＴＩＯ類を示すＥＳＲシグナルは非
常に安定で２４時間を越えてもほとんど変化しないこと
がわかった。

【００８１】さらに、上記実施例１で得られたトリメチ
ルアミノＰＴＩＯ内包小球体とＰＴＩＯとを２匹のラッ
トのそれぞれに静脈内投与し、その後の血中でのＰＴＩ
Ｏ類の残存量の変化をＥＳＲにより経時的に測定して、
生体内での安定性を評価した。結果を図６に示す。な
お、図６の縦軸は血液中のＰＴＩＯ類の残存量を添加初
濃度に対する百分率で表したものである。

【００８２】この結果から、上記試験管内に採取した血
液中と同様に、ラットの生体内においても、何の保護も
されていない従来のＰＴＩＯに比べて、実施例１で得ら
れたトリメチルアミノＰＴＩＯ内包小球体のトリメチル
アミノＰＴＩＯは長時間保持されることがわかった。

【００８３】以上の結果から、本発明のＰＴＩＯ類内包
の小球体においては、ＰＴＩＯ類が上記特定の球状膜に
内包されることで生体内あるいは生体組織内で反応特異
性と安定性を共に有し、そのために各種薬効を十分に発
揮することが可能であることがわかった。

【００８４】

【発明の効果】本発明の小球体は、内包するＰＴＩＯ類
に生体内での反応特異性が付与されており、さらに小球
体内でのＰＴＩＯ類の保存安定性がよいことから、ＰＴ
ＩＯ類の製剤として有用である。また、本発明の医薬組
成物は、ＰＴＩＯ類の有する薬効を十分に発揮できるも
のである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＴＩＯ類とＰＴＩ類のＥＳＲ測定シグナル
の違いを示す図である。ａ）は、ＰＴＩＯ類の一種であ
るカルボキシＰＴＩＯのＮａ塩のＥＳＲ測定シグナル
を、ｂ）は、ＰＴＩ類の一種であるカルボキシＰＴＩの
Ｎａ塩のＥＳＲ測定シグナルをそれぞれ示す。

【図２】実施例１で得られたトリメチルアミノＰＴＩ
Ｏ内包小球体とＰＴＩＯのそれぞれに一酸化窒素を直接
反応させた時の、一酸化窒素添加量と一酸化窒素消去量
の関係を示す図である。

【図３】アセチルコリンにより刺激されたウサギ大動
脈に対する弛緩反応抑制率を、実施例１で得られたトリ
メチルアミノＰＴＩＯ内包小球体、ＰＴＩＯおよびＬ−
ＮＮＡで比較した図である。

【図４】ＩＦＮ−γとＬＰＳによって刺激されたマク
ロファージ細胞に実施例１で得られたトリメチルアミノ
ＰＴＩＯ内包小球体を添加した時のＥＳＲ測定結果を示
す図である。

【図５】実施例１で得られたトリメチルアミノＰＴＩ
Ｏ内包小球体とＰＴＩＯをそれぞれラット血液中に添加
した時のＰＴＩＯ類の残存量の経時変化を示す図であ
る。

【図６】実施例１で得られたトリメチルアミノＰＴＩ
Ｏ内包小球体とＰＴＩＯをそれぞれラットの静脈内に投
与した時のＰＴＩＯ類の血中残存量の経時変化を示す図
である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リン脂質を含有する球状膜と、これに内
包された一般式（１）で表される化合物及び／又はその
生理的に許容される塩と、を含む小球体であって、前記
リン脂質が飽和のリン脂質であり、且つ、前記球状膜が
コレステロール及びその類縁体から選ばれる１種又は２
種以上を含有することを特徴とする小球体。【化１】（但し、式中Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴はそれぞれ独立して水
素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ⁵はア
ミノ基、炭素数１〜４のアルキル基を有する２級又は３
級のアミノ基、もしくは炭素数１〜４のアルキル基を有
する４級アンモニウム基を表す。）
【請求項２】一般式（１）に表される化合物が、下記
式（２）で表される２−（４−（トリメチルアミノ）フ
ェニル）−４，４，５，５−テトラメチル−イミダゾロ
−１−イロキシ−３−オキサイドである請求項１記載の
小球体。【化２】
【請求項３】前記リン脂質が、水素添加レシチン、フ
ォスファチジルコリン、フォスファチジルイノシトー
ル、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチ
ジルグリセロール及びフォスファチジン酸から選ばれる
ことを特徴とする請求項１又は２記載の小球体。
【請求項４】リポソームである請求項１〜３の何れか
一項に記載の小球体。
【請求項５】請求項１〜４の何れか一項に記載の小球
体を含有する医薬組成物。