JPH10265403A

JPH10265403A - チロシナーゼ活性阻害剤

Info

Publication number: JPH10265403A
Application number: JP9069416A
Authority: JP
Inventors: Hideyuki Yamada; 英幸山田; Yorikiyo Fuwa; 順清不破; Masakazu Nomura; 正和野村
Original assignee: Seiren Co Ltd
Current assignee: Seiren Co Ltd
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 1998-10-06

Abstract

(57)【要約】【課題】天然物由来であるため人体への安全性が高
く、熱を加えても失活せず阻害活性が長く持続し、生産
あるいは精製が容易で安価に製造でき、単一高純度で水
溶性の新規チロシナーゼ活性阻害剤を提供する。【解決手段】セリシンを有効成分とするチロシナーゼ
活性阻害剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医薬品、医薬部外
品、化粧品、あるいは食品等の広範囲の分野に於いて利
用可能な新規チロシナーゼ活性阻害剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】チロシナーゼは、酵素番号１．１４．１
８．１で表されるモノフェノールオキシダーゼ活性を有
する酵素の一種である。この種の酵素は、メイラノサイ
ト、イエバエ、マッシュルーム、ジャガイモ、リンゴ、
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａなど動物、植物、微生物に広く分
布している。また、この種の酵素は、近年各種材料から
高度に精製されており、例えばマッシュルームの子実体
からはアセトン処理、硫安分別、イオン交換、ゲルろ過
などの方法により精製されている。分子量はマッシュル
ームの酵素で１１．９万、高等植物の酵素で１４．４
万、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａの酵素で３．３万と由来によ
りかなり異なる。これらはいずれも銅酵素であるが、銅
含有量も異なっている。基質は、モノフェノール、ｏ−
ジフェノールに特異的であり、特に動物由来の酵素はチ
ロシン、ＤＯＰＡに対して高い活性を示し、メラニンの
生合成の最初の段階で深く関与する。これを反応式で示
すと次のようになる。Ｌ−チロシン＋ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン
（ＤＯＰＡ）＋Ｏ₂→ ＤＯＰＡ＋ＤＯＰＡ−キノン＋
Ｈ₂Ｏ

【０００３】メラニンは、人間の場合、髪、皮膚などに
分布しており、それらの色を決定している色素である。
皮膚でのメラニンの形成は、人間の防御機能の一つでも
ある。メラニンは、過剰の光を吸収、散乱する機能があ
り、皮膚の内部で増加することにより、サンバーンなど
の紫外線による悪影響を防御している。動物の場合、メ
ラニンは次のように生合成される。まず、紫外線を浴び
るとメラノサイト中のメラノソームにあるチロシナーゼ
が活性化され、前述した反応式のようにチロシンから、
ＤＯＰＡ、さらにＤＯＰＡ−キノンが生合成される。Ｄ
ＯＰＡ−キノン以降では非酵素的酸化、脱炭酸、カップ
リング反応によって重縮合しメラニンとなる。紫外線の
照射から解放されると、メラニンは皮膚の新陳代謝によ
り角質層から落ち、皮膚の色に戻る。一方、紫外線を大
量に浴びるなどの刺激があると、メラニン生成機能が局
部的に持続し、その部分の皮膚が黒いまま残り、色素沈
着、しみの原因となる。

【０００４】一方、食品の分野において、例えば捕獲し
た甲殻類を死亡させた場合は、その甲殻類の甲殻が短時
間のうちに変色する。また、リンゴ、山芋、レタスなど
の青果物の皮を剥いだ場合や切断した場合などは、その
青果物の内部が、それぞれ短時間のうちに変色する。こ
の現象は、甲殻類あるいはリンゴ、山芋、レタスなどの
青果物に存在しているチロシナーゼが活性化された結
果、反応生成物としてメラニンが形成されることに起因
する。これらメラニン形成に起因する皮膚の色素沈着、
しみを防止し、美白効果を促進させたり、あるいは食品
の変色を防止するものとして、従来から、メラニンの生
合成を阻害するためのチロシナーゼ活性阻害剤が使用さ
れてきている。例えば、合成チロシナーゼ活性阻害剤と
して亜硫酸塩類などがあり、天然チロシナーゼ活性阻害
剤として麹酸、プラセンターエキス、ビタミンＣ、シス
テイン、あるいは植物等から抽出されたチロシナーゼ活
性阻害機能を有する抽出物などが知られていた。

【０００５】しかしながら、合成チロシナーゼ活性阻害
剤の場合は、人体への安全性に関しての問題があった。
例えば、亜硫酸塩類は人体へのアレルギー作用が認めら
れたり、また甲殻類に使用したときは保存中にホルムア
ルデヒドが発生したりするなどの懸念があった。食品添
加物に指定されている亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナ
トリウムなども使用基準があり、食品中への残存につい
ても規制があった。天然チロシナーゼ活性阻害剤の場合
は、例えば、麹酸は、生産あるいは精製が難しく、高価
であった。具体的には、麹酸生産能を有する菌株を培養
し、麹酸を主成分とする発酵液から、麹酸を抽出しさら
に結晶化していた。一方、麹酸生産能を有するいくつか
の菌種で、強い発ガン性を有するアフラトキシンが生産
されることがわかっており、安全性に問題があった。胎
盤から抽出されるプラセンターエキスの生産あるいは精
製も、麹酸と同様で難しく、高価であった。またビタミ
ンＣの場合は、それ自身の還元力により、チロシナーゼ
による酵素的酸化反応（前記反応式）を抑制している。
したがって、経時、アスコルビン酸はデヒドロアスコル
ビン酸へと変化し、アスコルビン酸は減少していくた
め、阻害活性が持続しなかった。システインの場合もビ
タミンＣと同様それ自身酸化されていくため、阻害活性
が持続しなかった。かつ、システインは酸化すると黒色
に変色する欠点もあった。植物等から抽出されたチロシ
ナーゼ活性阻害機能を有する抽出物は、その化学組成が
同定しにくく、純度も低かった。さらに抽出物のロット
間での品質のバラツキも懸念されていた。また、従来使
用されてきたチロシナーゼ活性阻害剤は、脂溶性の物質
がほとんどで、水溶性チロシナーゼ活性阻害剤は限られ
ていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、天然
物由来であるため人体への安全性が高く、熱を加えても
失活せず阻害活性が長く持続し、生産あるいは精製が容
易で安価に製造でき、単一高純度で水溶性の新規チロシ
ナーゼ活性阻害剤を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、セリシンを有
効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤である。本発明で
用いるセリシンとしては通常、繭または生糸由来の高純
度のセリシン（加水分解物を含む）が好ましく用いられ
る。本発明に係る非加水分解物としてのセリシンは、繭
又は生糸から一般的に行われる抽出方法で得ることがで
きる。例えば以下のようにして純度９０％以上の高精製
度の単一タンパク質の状態で抽出できる。

【０００８】即ち、繭又は生糸に含有されるセリシン
を、水によって抽出し、例えば後述の（１）、（２）、
または（３）のような方法で非加水分解物としてのセリ
シンを得る。また、本発明に係るセリシンの加水分解物
は、繭又は生糸から一般的に行われる抽出方法で得るこ
とが出来る。例えば以下のようにして純度９０％以上の
高精製度のタンパク室（ペプチド）の状態で抽出でき
る。即ち、繭又は生糸に含有されるセリシンを、酸、ア
ルカリ、あるいは酵素によって部分加水分解して抽出し
てから、例えば次の（１）、（２）、または（３）のよ
うな方法でセリシンの加水分解物を得る。（１）セリシン水溶液を有機酸あるいは無機酸によっ
てｐＨ３〜５に調整した後、有機凝集剤あるいは無機凝
集剤を添加してセリシンを析出させ、ろ過、乾燥して固
体のセリシンを得る。（２）セリシン水溶液をメタノール、エタノール、ジ
オキサン等の水溶性溶媒と混合してセリシンを析出させ
た後、ろ過、乾燥して固体のセリシンを得る。（３）セリシン水溶液のうち透析膜を透過した物質を
除去した後、透析膜を透過しなかった物質を乾燥するこ
とによりセリシン固体を得る。

【０００９】上述のようにして得られた非加水分解物又
は加水分解物としてのセリシンは、チロシナーゼ活性阻
害剤としての使用意図に応じて、そのままの固体、また
は溶媒に溶解して、好適には水に適量を溶解して水溶液
として等適宜の形態で用いることができる。用途として
は、化粧品、食品、食品添加物、外用薬、医薬部外品、
医薬品等に従来のチロシナーゼ活性阻害剤と同様に利用
可能である。例えば、化粧品、食品添加物、外用薬、医
薬部外品等におけるセリシンの添加量は通常０．１〜５
０重量％、好ましくは０．５〜５重量％程度である。食
品におけるセリシンの添加量は通常０．１〜１００重量
％、好ましくは０．５〜５０重量％程度である。セリシ
ンは毒性がなく、また水溶性にも優れるため多量に添加
ないし摂取しても特段の問題は生じない。化粧品や外用
薬における剤型としてはクリーム、乳液、ファウンデー
ション、パック、ローション、ゲル状、溶液状、ステイ
ック状等がある。またこれらには適宜の成分、例えば油
剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、顔料、ｐＨ調製
剤、他の薬効成分、紫外線吸収剤、香料等を配合しう
る。また医薬品として経口投与することもできる。この
場合の投与量も特に制限されないが例えば１０ｍｇ〜１
００ｇ／日程度が投与される。次に、本発明を実施例に
より具体的に説明する。

【００１０】

【実施例】

〔実施例１〕生糸からなる絹織物１ｋｇを、水５０ｌ中
で９５℃にて２時間処理し、セリシンを抽出した。得ら
れた抽出液を平均孔径０．２μｍのフィルターでろ過
し、凝集物を除去した後、ろ液を分画分子量３５００の
透析膜を用いて透析し、透過した物質を除去した後、非
透過物質を分取することにより、濃度０．２％の無色透
明のセリシン水溶液を得た。この水溶液をエバポレータ
ーを用いてセリシン濃度約２％にまで濃縮した後、凍結
乾燥を行って、純度９５％以上のセリシン固体１００ｇ
を得た。

【００１１】〔実施例２〕生糸からなる絹織物１ｋｇ
を、０．２％炭酸ナトリウム水（ｐＨ１１〜１２）５０
ｌ中で９５℃にて２時間処理し、セリシン加水分解物を
抽出した。得られた抽出液を平均孔径０．２μｍのフィ
ルターでろ過し、凝集物を除去した後、ろ液を分画分子
量３５００の透析膜を用いて透析し、透過した物質を除
去した後、非透過物質を分取することにより、濃度０．
２％の無色透明のセリシン加水分解物抽出液を得た。こ
の抽出液をエバポレーターを用いてセリシン濃度約２％
にまで濃縮した後、凍結乾燥を行って、純度９０％以上
のセリシン加水分解物固体１００ｇを得た。

【００１２】〔試験例１〕セリシンまたはセリシン加水
分解物を含む１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に
０．５ｍｇ／ｍｌ（１／１５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．
８）のチロシナーゼ（マッシュルーム由来、シグマ社
製）溶液０．１ｍｌと１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）０．９ｍｌを加えて２５℃で１０分間インキュ
ベートした。ついで０．３ｍｇ／ｍｌＤＯＰＡ（１／１
５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．８）１ｍｌを加えて２５℃で
５分間インキュベートしたのち、４７５ｎｍの吸光度
（Ｄ１）を測定した。別に加熱失活させた酵素を用いて
同様の操作を行い（Ｄ２）、セリシン無添加のＤＯＰＡ
クロム量（Ｄ３）を求めて阻害率を算出した。阻害率（％）＝（（Ｄ３−Ｄ１）／（Ｄ３−Ｄ２））×
１００表１のように、セリシンおよびセリシン加水分解物のい
ずれにもチロシナーゼ活性阻害能が存在することが確認
された。特に最終濃度０．５％以上で、確実にチロシナ
ーゼ活性阻害能が存在した。

【００１３】〔試験例２〕ここではセリシンおよびセリ
シン加水分解物の最終濃度を０．５％とし、比較のため
牛血清アルブミン（最終濃度０．５％）でも試験例１と
同様な実験を行った。さらに、リン酸緩衝液に溶解させ
たセリシンおよびセリシン加水分解物溶液を２時間煮沸
し、加熱後のチロシナーゼ活性阻害能も調べた。セリシ
ンおよびセリシン加水分解物と他の一般のタンパク質
（牛血清アルブミン）とのチロシナーゼ活性阻害率の比
較を行ったところ、牛血清アルブミンのチロシナーゼ活
性阻害能はほとんど存在せず、セリシンおよびセリシン
加水分解物の優位性が確認された。一方、セリシンおよ
びセリシン加水分解物のチロシナーゼ活性阻害能は、加
熱によってもほとんど変化なく維持されていた。したが
って、セリシンおよびセリシン加水分解物のチロシナー
ゼ活性阻害能は、熱に対しても、かなり安定であること
が確認された。

【００１４】

【発明の効果】本発明のチロシナーゼ活性阻害剤は、水
溶性であるため油脂含量の低い製品にも用いることがで
きる。また、本発明のチロシナーゼ活性阻害剤は、天然
物由来のタンパクあるいはペプチドとしての特性を持
ち、皮膚との親和性が良く、プロテアーゼにより容易に
加水分解されるので蓄積性がなく、高い安全性を有し、
医薬品、医薬部外品、化粧品、あるいは食品等の広範囲
の分野に於いて利用可能なものである。しかも加熱処理
を行ってもチロシナーゼ活性が失活せず、安定であると
同時に、阻害活性持続性が長いという特徴がある。さら
に、本発明のチロシナーゼ活性阻害剤は、繭又は生糸の
溶媒抽出物から、容易にしかも単一のタンパクあるいは
ペプチドとしては高純度で抽出できるため、安価に得ら
れ、しかも水溶液の色が無色透明であるので、消色の必
要がなく複雑な処理工程を必要としないという大きな利
点がある。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【表２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 7/00 Ａ６１Ｋ 7/00 ＪＸ 7/48 7/48 37/18 ＡＤＡ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】セリシンを有効成分とするチロシナーゼ
活性阻害剤。
【請求項２】セリシンが繭又は生糸から抽出した天然
セリシンである請求項１記載のチロシナーゼ活性阻害
剤。
【請求項３】セリシンが天然セリシンの加水分解物で
ある請求項１記載のチロシナーゼ活性阻害剤。