JPH10271991A

JPH10271991A - 新規糖質加水分解酵素

Info

Publication number: JPH10271991A
Application number: JP9098104A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Yamagishi; 政昭山岸; Kazuo Oishi; 一男大石; Toshiya Ota; 俊也太田; Yoshiyuki Totsuka; 好之戸塚; Yasuichi Usui; 泰市碓氷
Original assignee: Shizuoka Prefecture
Current assignee: Shizuoka Prefecture
Priority date: 1997-03-31
Filing date: 1997-03-31
Publication date: 1998-10-13

Abstract

(57)【要約】【課題】 β１−３結合を高い選択性で加水分解する新
規なエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラーゼを提供するこ
と。【解決手段】ラクト−Ｎ−ビオシド化合物と糖受容体
とからβ１−３ラクト−Ｎ−ビオシド結合（Ｇａｌβ１
−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｒ）を形成する作用を有する
エキソ型糖質加水分解酵素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なエキソラク
ト−Ｎ−ビオヒドラーゼ、および当該酵素を用いるβ１
−３ラクト−Ｎ−ビオシド結合を有する糖質の製造方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、糖蛋白質および糖脂質中の糖鎖に
関しては多くの報告においてその重要性が指摘されてい
る（木幡陽、有機合成化学、第５０巻第５号、４５１〜
４６３（１９９２））。そのような糖鎖の機能を解明し
ていくためには、糖鎖の構造を正確に決定するととも
に、明らかにされた糖鎖構造をもとにその糖鎖を合成す
ることも必要となってくる。

【０００３】従来、複雑な糖鎖を合成する方法として
は、反応に関与しない水酸基を完璧に保護した受容体糖
に対して、１位を活性化した糖を反応させるという化学
合成法が採用されてきた（K. Toshimaおよび K. Tatsut
a, Chem. Rev., 93, 1503-1531(1993) ）。しかしこの
ような化学合成法は工程数が多く、工業的生産への応用
には適さないため、近年、２糖あるいは３糖のオリゴ糖
ブロックをつなぎ合わせるブロック合成法が発展しつつ
ある。しかし、ブロック合成法でも、ブロック同士をつ
なぎ合わせるためには化学合成的手法が採用されている
のが現状である。化学合成法の場合、前述したように結
合に関与しない水酸基は予め保護しておく必要があり、
工業的生産には極めて不利である。もし酵素的に、オリ
ゴ糖ブロック同士をつなぎ合わせることができれば、産
業上極めて有用な技術となり得ることが期待され、その
ような酵素の発見が求められていた。

【０００４】例えば、特開平６−１５３９４４、特開平
５−２５２９４６および特開平８−５３４８７には、ス
トレプトミセス（Streptomyces）属由来のエキソラクト
−Ｎ−ビオヒドラーゼが報告されており、さらに最近に
なって、ストレプトミセス（Streptomyces）属由来のエ
キソラクト−Ｎ−ビオヒドラーゼを用いることにより、
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ（ラクト−Ｎ−ビオース）
の２糖ブロックをガラクトースに転移させ得ることが報
告されている（特願平８−７０８９２）。この反応で
は、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃがガラクトースにβ１
−６結合した３糖が主生成物として得られた。

【０００５】一方、天然の糖蛋白質あるいは糖脂質中の
糖鎖の中には、ラクト−Ｎ−ビオースがβ１−３結合で
結合した糖鎖が多く見出されている。しかしながら、前
述のストレプトミセス（Streptomyces）sp. １４２株由
来のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラーゼを用いた反応で
は、ラクト−Ｎ−ビオースをβ１−３結合で転移させる
ことはできなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】これまでの研究から、
加水分解酵素を用いた転移反応によりオリゴ糖を酵素合
成する場合は、その酵素が切断しやすい結合が転移反応
によっても生成しやすいということが分かっている（藤
本浩他、応用糖質科学、第４３巻、２６５−２７２（１
９９６））。即ち、上記の反応の場合、Ｇａｌβ１−３
ＧｌｃＮＡｃという２糖ブロックをβ１−３結合により
ガラクトースに転移させるには、Ｇａｌβ１−３Ｇｌｃ
ＮＡｃβ１−３Ｇａｌという３糖の還元末端側のＧｌｃ
ＮＡｃβ１−３Ｇａｌ結合を加水分解する酵素が必要で
ある。特願平８−７０８９２において用いた酵素は、市
販されているストレプトミセス（Streptomyces）sp. １
４２株由来のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラーゼであっ
たが、その加水分解の結合特異性は極めて高いというわ
けではなかった。従って、上記のエキソラクト−Ｎ−ビ
オヒドラーゼは、反応性の高い一級水酸基に結合して、
β１−６結合を主に生成したものを思われる。

【０００７】上記の観点から、β１−３結合の転移生成
物を酵素合成するにはβ１−３結合を高い選択性で加水
分解するエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラーゼを探索する
ことが必要とされた。

【０００８】即ち、本発明の目的の一つは、β１−３結
合を高い選択性で加水分解する新規なエキソラクト−Ｎ
−ビオヒドラーゼを提供することである。本発明の別の
目的は、上記のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラーゼを用
いることを特徴とするβ１−３ラクト−Ｎ−ビオシド結
合を有する糖質の製造方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ラクト−
Ｎ−ビオシド結合を加水分解するエキソラクト−Ｎ−ビ
オヒドラーゼを鋭意探索した結果、目的とするエキソラ
クト−Ｎ−ビオヒドラーゼを見出した。さらに、本発明
者らは、この酵素を用いてパラニトロフェニル−β−Ｄ
−ラクト−Ｎ−ビオシド（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ
β−ｐＮＰ）を糖供与体として転移反応を行うと、Ｇａ
ｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３結合した３糖が得られ
ることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【００１０】即ち、本発明の第１の側面によれば、ラク
ト−Ｎ−ビオシド化合物と糖受容体とからβ１−３ラク
ト−Ｎ−ビオシド結合（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ
１−３Ｒ）を形成する作用を有するエキソ型糖質加水分
解酵素が提供される。本発明の第２の側面によれば、上
記のエキソ型糖質加水分解酵素を用いることを特徴とす
る、β１−３ラクト−Ｎ−ビオシド結合を有する糖質の
製造方法が提供される。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明で使用する菌株は、β１−３結合でラクト
−Ｎ−ビオシド結合を形成する酵素を産生する能力を有
する菌株であれば、いかなる菌株であってもよく、また
これらの株の変異株であってもよい。このような酵素の
産生能を有する菌株は、エキソラクト−Ｎ−ビオヒドラ
ーゼ活性測定によるスクリーニングを行うことにより単
離することができる。このような酵素の生産能を有する
菌株の一例としては、オーレオバクテリウム（Aureobac
terium）Ｌ１０１が挙げられる。本菌株は、Aureobacte
riumと表示され、茨城県つくば市東１丁目１番３号の通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、１９９
７年３月２７日に受託番号ＦＥＲＭＰ−１６１６３と
して寄託されている。

【００１２】本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラー
ゼは、例えば上述した菌を栄養培地中で培養し、該培養
物から酵素を単離することにより得られる。菌株を培養
する際に使用する培地としては、通常の微生物の培養に
用いられる炭素源、窒素源、無機質、金属塩を含むもの
であればよく、特に限定されるものではない。例えば、
炭素源としては、グリセロール、グルコース、ガラクト
ース、マルトース、ラクトース、フコース、ムチンなど
を利用できる。窒素源としては、酵母エキス、ペプト
ン、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどを利用できる。
また、無機質、金属塩としては、リン酸塩、カリウム
塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などを利用できる。

【００１３】培養温度は、一般的には２０〜４０℃、好
ましくは２５〜３０℃であり、培地のｐＨは、一般的に
は６．０〜７．５、好ましくは６．５〜７．０であり、
１〜５日の通気撹拌培養で培養できる。培養条件は、菌
株の種類、培地組成などに応じて、エキソラクト−Ｎ−
ビオヒドラーゼの生産量が最大になるように設定するこ
とが好ましく、これは当業者の通常の知識の範囲内のも
のである。

【００１４】本酵素は、本来菌体内酵素であるが、培養
条件を調整することにより、培養上清中に放出させるこ
ともできる。この場合、培養上清から通常用いられる精
製手段により本酵素を精製することができる。例えば、
塩析、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過などにより精製を行い、Ｓ
ＤＳ電気泳動において単一バンドを示すまで精製するこ
とができる。

【００１５】本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラー
ゼの酵素化学的性質および理化学的性質は次の通りであ
る。（１）作用：エキソラクト−Ｎ−ビオシド結合に作用し
て、ラクト−Ｎ−ビオースを遊離する。（２）基質特異性：ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌ
β１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）
に作用してラクト−Ｎ−ビオースおよびラクトースを遊
離する。パラニトロフェニル−β−Ｄ−ラクト−Ｎ−ビ
オシドに作用してラクト−Ｎ−ビオースおよびパラニト
ロフェノールを遊離する；（３）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約１２０，
０００；（４）至適ｐＨおよびｐＨ安定性：ｐＨ５．５〜６．０
に至適ｐＨを有し、３０℃にて１時間インキュベートす
るという条件下では、ｐＨ６．０〜９．０の間で安定で
ある；（５）至適温度：作用至適温度は５０℃であり、ｐＨ
５．５における３０分のインキュベートでは、３７℃ま
で安定である；（６）等電点：４．０〜４．５; （７）Ｋｍ：４ｍＭ（ｐＮＰ−ラクト−Ｎ−ビオシドを
基質として）

【００１６】（８）酵素活性の測定：エキソラクト−Ｎ
−ビオヒドラーゼ活性の測定は以下の通りに行った。２
ｍＭのｐＮＰ−ラクト−Ｎ−ビオシド（５０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．５）に溶解）を基質とし、基質溶液２０
０μｌに酵素液５０μｌを加え、３７℃で１０分間反応
させる。反応後、０．２Ｍの炭酸ナトリウム溶液１．０
ｍｌを加えて反応を停止し、さらに蒸留水２．０ｍｌを
加えて、４０５ｎｍの吸光度を測定した。このような条
件下で、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを
生成する酵素を１単位（ｕｎｉｔ）とした。

【００１７】本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラー
ゼを用いて、ラクト−Ｎ−ビオシド結合を有するオリゴ
糖を酵素合成する反応における糖供与体としては、ラク
ト−Ｎ−ビオースがβ結合で結合しているグリコシド化
合物であればよく、アグリコン側の構造に限定されるも
のではない。例えば、パラニトロフェニル−β−Ｄ−ラ
クト−Ｎ−ビオシド、オルトニトロフェニル−β−Ｄ−
ラクト−Ｎ−ビオシドのようなグリコシド類あるいはＧ
ａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌのような３糖
であってもその非還元末端のＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡ
ｃ残基が転移される。

【００１８】上記のような転移反応によって合成された
オリゴ糖においては、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ残基
がβ１−３結合で転移した化合物が生成物として得られ
る。

【００１９】以下、実施例を挙げて本発明をより具体的
に例示説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに
限定されるものではない。

【００２０】

【実施例】

実施例１：微生物のスクリーニングおよび単離スクリーニング培地（ムチン（０．５％）、ＮＨ₄ＮＯ₃
（０．４％）、ＫＨ₂ＰＯ₄（０．１５％）、Ｎａ₂ＨＰ
Ｏ₄・１２Ｈ₂Ｏ（０．１５％）、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
（０．０２％）、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０００１
％）、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ（０．００１％）、酵母エキ
ス（０．０５％）および寒天（１．５％）、ｐＨ７．
０）に水質あるいは土壌の希釈液を塗布し、３０℃で３
日間培養した後、生じたコロニー（１２０個）を単離し
た。１．０ｍＭのｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）ラクト
−Ｎ−ビオシドを含む０．５％酵母エキス活性検定液を
５０μｌずつ９６穴マイクロプレートに分注し、単離し
たコロニーをマイクロプレートに接種した。酵素の生産
性は、生じた黄色の呈色の有無によって判定した。この
結果、Ｌ−１０１、Ｌ−１０２、Ｌ−１０４、Ｌ−１１
２およびＬ−１１８の５菌株に活性が確認された。

【００２１】上記の５菌株について、スクリーニング培
地と同じ組成の液体培地に植菌し、３０℃で２８時間培
養後、上清と菌体を分離した。菌体は、洗浄後、酢酸緩
衝液（ｐＨ６．０）４ｍｌに懸濁し、これにトルエン
０．２ｍｌ（１／２０容量）を加えて、２０秒間激しく
懸濁し、酵素活性を測定した。結果を表１に示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】表１の結果から分かるように、上記の５菌
株は、菌体外および菌体内に酵素を生産していた。また
５菌株のコロニーの形状などから、類似の菌と推定され
たことから、Ｌ−１０１菌株を以下の実験に使用した。
なお、Ｌ−１０１株は受託番号ＦＥＲＭＰ−１６１６
３として、通産商業省工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている。

【００２４】実施例２：微生物の培養条件の検討（酵素
生産性に及ぼす酵母エキスの影響）ムチン（１．０％）、ＮＨ₄ＮＯ₃（０．４％）、ＫＨ₂
ＰＯ₄（０．１５％）、Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ（０．
１５％）、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０２％）、ＦｅＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０００１％）、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ
（０．００１％）に、酵母エキス（０％、０．２％また
は０．５％）を加えて、ｐＨ７．０とした培地を作製
し、植菌した後、３０℃にて２２時間培養した。遠心分
離により上清と菌体に分け、それぞれ酵素活性を測定し
た。得られた結果を表２に示す。

【００２５】

【表２】

【００２６】表２の結果から分かるように、Ｌ−１０１
株は、ムチンが存在しても酵母エキスを添加しない場合
は、酵素生産性が非常に低く、酵母エキスが酵素生産に
大きく影響することが示された。

【００２７】実施例３：Ｌ−１０１菌株の同定Ｌ−１０１菌株は、多形性を示す無芽胞のグラム陽性桿
菌であり、その菌学的性質は下記の表３に示すように、
好気性で移動性はなく、ＯＦテストが酸化性、細胞壁ペ
プチドグリカンのジアミノ酸がＤ−オルニチンであり、
イソプレノイドキノンがメナキノン−１２．−１３．−
１１、ＧＣ含量が６９％であることなどから、Aureobac
terium属に属する細菌であると同定され、Aureobacteri
um sp.Ｌ−１０１と命名した。

【００２８】

【表３】

【００２９】実施例４：菌の培養 Aureobacterium sp.Ｌ−１０１（ＦＥＲＭＰ−１６１
６３）を、ムチン（豚胃）（０．５％）、ＮＨ₄ＮＯ
₃（０．４％）、ＫＨ₂ＰＯ₄（０．１５％）、Ｎａ₂ＨＰ
Ｏ₄・１２Ｈ₂Ｏ（０．１５％）、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
（０．０２％）、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０００１
％）、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ（０．００１％）および酵母
エキス（１．０％）を含む３Ｌの液体培地（ｐＨ７．
０）を用いて３０℃にて２４時間培養した。培養後、遠
心分離により菌体を分離し、上清を粗酵素液として得
た。

【００３０】実施例５：酵素の精製実施例４で得た粗酵素液に６５％になるように硫酸アン
モニウムを加えて、生じた沈殿を遠心分離し、ペレット
を得た。ペレットを０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０、０．５ＭのＮａＣｌを含む）に溶解し、
遠心分離により不溶物を除去後、０．０１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。次
いで、この酵素液を豚の胃のムチンから調製したカラム
を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行った。
即ち、ムチン（豚胃、和光製）をリガンドとして、ホル
ミルセルロファイン固定化担体に結合し、カラムに充填
した。カラムは、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で平衡化した後、透析液を添加し、カラム容
量の５倍量の同緩衝液で洗浄した。次いで、塩化ナトリ
ウム０〜０．４Ｍを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩
衝液を流すことにより、エキソラクト−Ｎ−ビオヒドラ
ーゼを含む画分を得た。ムチンアフィニティークロマト
グラフィーの結果を図１に示す。

【００３１】上記画分を６５％飽和硫酸アンモニウム液
として、得られた沈殿を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．０）に対して透析した。この透析液は、予
め５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平
衡化したＭｏｎｏＱカラムに添加し、カラムを塩化ナト
リウム０〜０．５Ｍの濃度勾配で溶離することによりエ
キソラクト−Ｎ−ビオヒドラーゼ画分を得た。この陰イ
オン交換クロマトグラフィーの結果を図２に示す。

【００３２】上記画分をウルトラフリーＵＶ１５（ミリ
ポア社製）膜を用いて濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
２００ＨＲカラムに添加して、ゲル濾過を行うことによ
り、高度に精製されたエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラー
ゼ画分を得た。本画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単
一のバンドを示した（図３を参照）。なお、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥはLaemmli の方法に従い、マルチゲル４／２０
（第一化学製）を用いて行い、タンパク質の確認は銀染
色により行った。

【００３３】上記した各精製段階における精製の程度を
示す結果を表４に示す。

【００３４】

【表４】

【００３５】実施例６：エキソラクト−Ｎ−ビオヒドラ
ーゼの特性実施例５で精製された酵素の至適ｐＨは５．５であり、
各ｐＨで３０℃１時間におけるｐＨ安定性は６〜９であ
り、至適温度は５０℃であり、ｐＨ５．５で各温度３０
分間における熱安定性は３７℃であった（図４および図
５を参照）。分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約１２
０，０００であった。また、等電点は４．０〜４．５、
Ｋｍ値はｐＮＰ−ラクト−Ｎ−ビオシドに対して４ｍＭ
であった。また各種金属による本酵素の阻害について、
表５に示す。本酵素はＺｎ²+、Ｈｇ²+、Ｃｕ²+およびＦ
ｅ³+で阻害された。

【００３６】

【表５】

【００３７】実施例７：転移反応による３糖の合成Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰ（１００ｍｇ）
およびパラニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド（Ｇａｌβ−ｐＮＰ）（４８０ｍｇ）を１２ｍｌの４
０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、
エキソラクト−Ｎ−ビオヒドラーゼを１０．４ユニット
加え、４０℃で反応させた。１００分後、酵素を熱失活
させることにより、反応を停止した。反応液をジエチル
エーテルで洗浄することにより、パラニトロフェノール
を除去した。その後、濃縮した反応液は、Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌＨＷ−４０Ｓカラム（２．６×９０ｃｍ）に供
し、２５％エタノールで生成物を溶出させた。生成物の
溶出パターンを図６に示す。さらに、ＹＭＣ−ｐａｃｋ
ＳＨ−３４３−５ＯＤＳ（２０×２５０ｍｍ）により
さらに精製を行い、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−
３Ｇａｌβ−ｐＮＰおよびＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ
β１−６Ｇａｌβ−ｐＮＰをそれぞれ３．８ｍｇおよび
４．１ｍｇ得た。

【００３８】

【発明の効果】本発明の酵素は新規な酵素であり、これ
を用いることによりＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃをβ１
−３結合で結合する糖鎖を容易に合成することが可能に
なった。また、本発明の酵素を産生する菌株は、本酵素
の生産性が高く、菌体外生産が多く精製に有利であり、
また菌株の培養も容易である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラーゼを
含む溶液をムチンアフィニティカラムにより精製したと
きの溶出パターンを示す図である。

【図２】本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラーゼを
含む溶液をｐＨ７．０のＭｏｎｏＱカラムにより精製し
たときの溶出パターンを示す図である。

【図３】最終的に精製された本発明のエキソラクト−Ｎ
−ビオヒドラーゼのＳＤＳ電気泳動パターンを示す図で
ある。

【図４】本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラーゼの
至適ｐＨとｐＨ安定性を示すグラフである。

【図５】本発明のエキソラクト−Ｎ−ビオヒドラーゼの
至適温度と温度安定性を示すグラフである。

【図６】Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムからの生成物の溶出
パターンを示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ラクト−Ｎ−ビオシド化合物と糖受容体と
からβ１−３ラクト−Ｎ−ビオシド結合（Ｇａｌβ１−
３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｒ）を形成する作用を有するエ
キソ型糖質加水分解酵素。
【請求項２】オーレオバクテリウム（Aureobacterium）
属微生物由来であることを特徴とする、請求項１記載の
エキソ型糖質加水分解酵素。
【請求項３】受託番号ＦＥＲＭＰ−１６１６３を有す
る微生物から産生されることを特徴とする、請求項１ま
たは２に記載のエキソ型糖質加水分解酵素。
【請求項４】下記の理化学的性質を有することを特徴と
する、請求項１から３のいずれか１項に記載のエキソ型
糖質加水分解酵素。（１）作用：エキソラクト−Ｎ−ビオシド結合に作用し
て、ラクト−Ｎ−ビオースを遊離する；（２）基質特異性：ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌ
β１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）
に作用してラクト−Ｎ−ビオースおよびラクトースを遊
離する。パラニトロフェニル−β−Ｄ−ラクト−Ｎ−ビ
オシドに作用してラクト−Ｎ−ビオースおよびパラニト
ロフェノールを遊離する；（３）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約１２０，
０００；（４）至適ｐＨおよびｐＨ安定性：ｐＨ５．５〜６．０
に至適ｐＨを有し、３０℃にて１時間インキュベートす
るという条件下では、ｐＨ６．０〜９．０の間で安定で
ある；（５）至適温度：作用至適温度は５０℃であり、ｐＨ
５．５における３０分のインキュベートでは、３７℃ま
で安定である；（６）等電点：４．０〜４．５（７）Ｋｍ：４ｍＭ（ｐＮＰ−ラクト−Ｎ−ビオシドを
基質として）
【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項に記載のエキ
ソ型糖質加水分解酵素を用いることを特徴とする、β１
−３ラクト−Ｎ−ビオシド結合を有する糖質の製造方
法。