JPH10271994A

JPH10271994A - ポリウレタンエステラーゼをコードする遺伝子

Info

Publication number: JPH10271994A
Application number: JP9078745A
Authority: JP
Inventors: Toshiaki Nakajima; 敏明中島; Tadaatsu Nakahara; 忠篤中原; Nobuhiko Nomura; 暢彦野村; Noriko Kanehara; 則子金原
Original assignee: Suzuki Motor Corp
Current assignee: Suzuki Motor Corp
Priority date: 1997-03-31
Filing date: 1997-03-31
Publication date: 1998-10-13

Abstract

(57)【要約】【課題】コマモナス・アシドボランス（Ｃｏｍａｍｏ
ｎａｓａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）ＴＢ−３５株のポリ
ウレタンエステラーゼをコードする遺伝子を利用して遺
伝子工学的にポリウレタンエステラーゼを得る。【解決手段】ポリウレタン分解酵素をコードする塩基
配列を含む配列番号１に記載の塩基配列中の１〜１６４
７番目の塩基配列を決定する。また、前記遺伝子を含有
する組換えベクター、及び、前記ベクターによって形質
転換された形質転換体を作成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エステル系ポリウ
レタンを分解する酵素をコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】ポリウレタンは、四輪自動車や二輪自動
車のシートクッション、衣類の繊維、靴のクッション、
接着剤、塗料等に用いられている。ポリウレタンは、熱
硬化性樹脂であり、リサイクルが困難なため、埋め立て
処理を行うことが多い。しかし、ポリウレタンは半永久
的に土中に残存するため、埋め立て地の不足を招く原因
となっている。そこで、近年、ポリウレタンを処理する
技術の開発が研究されている。

【０００３】ポリウレタンの処理技術としては、埋め立
て処理、化学的分解処理、焼却処理を挙げることができ
る。埋め立て処理は、使用済みポリウレタンや製造工程
で生じるポリウレタン片をそのまま埋め立て処分するも
のである。しかし、次のような欠点がある。すなわち、
ポリウレタンは、スポンジ、クッション等に使用され、
密度の低い樹脂であるため、これを土中に埋没させる
と、地盤が固まらず、安定しない。また、重量の割にか
さばるため、輸送効率が悪い。さらに、ポリウレタン
は、微生物により分解されず腐らないため、埋め立て処
理場に占める割合が高く、処理場不足の一因となる。

【０００４】化学的分解処理は、熱分解により、ガスや
石油に分解するものである。この処理方法は、グリコー
ル分解により原料のポリオールを再生することができる
という利点がある。しかし、処分するポリウレタンの品
質にばらつきがあるため、分解産物の品質が安定せず、
また、処理にかかる費用や手間が莫大であるため、採算
が合わないという欠点がある。焼却処理は、ポリウレタ
ンを炉で焼却するものである。しかし、次のような欠点
がある。すなわち、旧来の炉では、ポリウレタンの焼却
の際に発生する高温に耐えることができない。また、四
輪自動車や二輪自動車のシートクッションに使用されて
いるホットキュア製ポリウレタンには、２９％の塩素を
含む縮合リン酸エステルが難燃剤として用いられている
ため、ポリウレタンを焼却する際に、塩化水素が発生
し、炉を腐食させる。さらに、焼却時に二酸化炭素や有
毒ガスが発生して、大気環境を汚染する。

【０００５】コマモナス・アシドボランス（Ｃｏｍａｍ
ｏｎａｓａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）ＴＢ−３５株は、
茨城県つくば市内の土壌から分離した細菌であり、ポリ
ウレタンを分解することが知られている。コマモナス・
アシドボランスＴＢ−３５株（以下、単に「ＴＢ−３５
株」という）は、菌体表面及び菌体外にそれぞれ存在す
る２種類のエステラーゼをもつ。そのうち、菌体表面に
付着するエステラーゼのみがエステル系ポリウレタンを
分解することができる。特願平８−９６７４号は、コマ
モナス・アシドボランスの有するポリウレタンエステラ
ーゼの粗精製方法を開示している。さらに、特願平８−
３５８７８号は、ＴＢ−３５株の有するポリウレタンエ
ステラーゼの精製法を開示している。

【０００６】特願平８−９６７４号及び特願平８−３５
８７８号によるエステラーゼの精製法は、それぞれ以下
の通りである。特願平８−９６７４号では、ＴＢ−３５
株をエステル系ポリウレタンを炭素源とする培地で培養
し、菌体を分離し、界面活性剤で処理して限外濾過で濃
縮し、粗精製エステラーゼを得る。特願平８−３５８７
８号では、菌体に界面活性剤を加えて得られる抽出液に
疎水クロマトグラフィー用担体を加え、該担体に吸着し
た画分を集め、さらにその画分を陰イオン交換クロマト
グラフィーに供して、該陰イオン交換体に吸着しない画
分を集めて、ポリウレタンエステラーゼを精製する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかし、ＴＢ−３５株
は、継代培養を続けるうち変異し、酵素活性や酵素発現
量が低下してしまい、安定したポリウレタン分解処理が
できないという問題がある。また、コマモナス・アシド
ボランスは培養しても増殖速度が遅く、必要な酵素量を
得るのに時間がかかる。ＴＢ−３５株のポリウレタンエ
ステラーゼをコードする遺伝子の塩基配列が決定されれ
ば、その遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換させて、
遺伝子工学的にポリウレタンエステラーゼを得ることが
できる。したがって、本発明は、コマモナス・アシドボ
ランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）
ＴＢ−３５株のポリウレタンエステラーゼをコードする
遺伝子の配列を決定することを目的とする。また、得ら
れた遺伝子配列を利用して遺伝子工学的にポリウレタン
エステラーゼを得ることを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的達成のため、本
発明者らはポリウレタン分解酵素をコードする塩基配列
を含む配列番号１に記載の塩基配列中の−１００〜１６
４７番目の塩基配列を決定した。本発明は、ＤＮＡポリ
ウレタン分解酵素をコードする配列番号１に記載の塩基
配列のうち、オープンリーディングフレームと終止コド
ンを含む１〜１６４７番目の塩基配列、及び、オープン
リーディングフレームと終止コドンを含む配列からシグ
ナル配列を除いた７９〜１６４７番目の塩基配列からな
るＤＮＡをも含む。また、本発明は、配列表の配列番号
２で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなるポリウレタン分解活性を
有するポリウレタン分解酵素をコードするＤＮＡをも含
む。

【０００９】さらに、本発明は、上記のＤＮＡのいずれ
かの遺伝子を含有する組換えベクターを含む。また、本
発明は、上記ベクターによって形質転換された形質転換
体をも含むものである。

【００１０】本発明によって、コマモナス・アシドボラ
ンス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）
ＴＢ−３５株由来のポリウレタンエステラーゼが迅速に
安定して得られる。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のＴＢ−３５株のポリウレ
タンエステラーゼをコードする塩基配列は、公知の制限
酵素、形質転換技術により、任意のベクターを用いて任
意の宿主を形質転換させ、ポリウレタンエステラーゼを
発現させることができる。ベクターに本発明の塩基配列
をもつ遺伝子を組み込む場合は、エステラーゼの発現を
制御できるようにプロモーター、エンハンサーと連結さ
せてもよい。

【００１２】形質転換に用いる宿主としては、種々の宿
主を用いることができ、特に限定しないが、例えば大腸
菌が挙げられる。本発明の遺伝子を組み込むためのベク
ターとしては、種々のプラスミドベクター、ファージベ
クター等を使用できる。当業者は、宿主に合わせて任意
のベクター並びに培養条件を選択することができる。Ｔ
Ｂ−３５株のエステラーゼを発現している形質転換体
は、例えば、ポリジエチレングリコールアジペートを乳
化せさたプレートに播き、プレート上にハローを形成す
るか否か等の手段でスクリーニングできる。

【００１３】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細
に説明するが、これらにより本発明を制限するものでは
ない。

【００１４】（ＴＢ−３５株の全ＤＮＡ）ＴＢ−３５株
の全ＤＮＡをＨ．Ｓａｉｔｏ，Ｋ．Ｍｉｕｒａ，Ｂ．
Ｂ．Ａ．，ｖｏｌ．７２，６１９（１９６３）に記載の
方法を一部改変して、ＴＢ−３５株の全ＤＮＡを調製し
た。要約すれば、ＴＢ−３５株の細胞約０．３ｇにＴＥ
ＳＳを６ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌのリゾチームを２ｍｌ加
え、３７℃で３０分保温した。この溶菌処理で多量の多
糖が遊離して溶液の粘度が高まるために、脱脂綿を詰め
た注射器で溶液を濾過して、多糖を除去した。さらに、
１０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを１ｍｌ加え、３７
℃で３０分保温した。１０％ＳＤＳを１ｍｌ加えた後、
ＴＥ飽和フェノール、クロロホルム／イソアミルアルコ
ールを加えてよく攪拌し、遠心後、上部の水層を集め
た。水相にＴＥ飽和フェノール、クロロホルム／イソア
ミルアルコールを加えてよく攪拌し、遠心後、上部の水
相を集める操作を数度繰り返して、タンパク質を除去し
た後、２倍容量のエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿させ
た。７０％、８０％、９０％のエタノールで順次、ＤＮ
Ａを洗い、乾燥後、ＴＥを５ｍｌとＲＮａｓｅを加え、
３７℃で１時間保温した。ＴＥ飽和フェノール及びクロ
ロホルム／イソアミルアルコールを加え、遠心後、上層
を集めて２倍容量のエタノールでＤＮＡを沈殿させた。
７０、８０、９０％のエタノールで順次洗い、乾燥後、
ＴＥを１ｍｌ加えてＴＢ−３５株の全ＤＮＡとした。

【００１５】（精製エステラーゼのＮ末端アミノ酸配列
の決定及びプローブの作成）特願平８−３５８７８号の
方法に従って精製したＴＢ−３５株のエステラーゼのＮ
末端から２０番目までのアミノ酸配列を決定した。その
結果、本酵素のＮ末端部分のアミノ酸配列は、ＣＧＧＳ
ＤＮＤＳＳＳＮＮＱＧＡＰＡＶＡＩＴであるとわかっ
た。ただし、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、Ｇ
はＧｌｙ、ＩはＩｌｅ、ＮはＡｓｎ、ＰはＰｒｏ、Ｑは
Ｇｌｎ、ＳはＳｅｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌを表す。
この配列のうち、ＮＤＳＳＳＮＮＱＧの部分を基にオリ
ゴヌクレオチドプローブを作成した。コマモナス属細菌
のコドン使用頻度を考慮して、以下の２種の２７ｍｅｒ
のオリゴヌクレオチドを合成し、プローブとした。５’
−ＡＡＣＧＡＴＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧ
ＧＧＣ−３’５’−ＡＡＣＧＡＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡ
ＡＣＡＡＣＣＡＧＧＧＣ−３’

【００１６】（クローニング）ＴＢ−３５株の全ＤＮＡ
をEcoRI で完全分解し、上記２種のオリゴヌクレオチド
プローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブとハイブリッド形成した約１０ｋｂの断片
をプラスミドｐＵＣ１９のEcoRI 部位に連結させ、その
プラスミドを用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。
形質転換した大腸菌をポリジエチレングリコールアジペ
ート（以下、「ｐＤＥＡ」という）を乳化せさたプレー
トに播いたところ、プレート上にハローを形成する形質
転換体が１コロニー生じた。したがって、上記１０ｋｂ
の断片にエステラーゼをコードする塩基配列が含まれて
いることがわかった。簡単な制限酵素解析を行ったとこ
ろ、上記約１０ｋｂの断片の中央付近に目的の遺伝子が
コードされていることがわかった。エステラーゼタンパ
ク質の分子量から、目的とするＴＢ−３５株のエステラ
ーゼ遺伝子は約１．７ｋｂであると推定されているた
め、約１０ｋｂの断片をさらに断片化して、どの断片に
目的とする遺伝子が含まれているかを解析した。

【００１７】上記約１０ｋｂの断片をPstIで完全分解
し、上記２種のプローブを用いてサザンハイブリダイゼ
ーションを行った。プローブとハイブリッド形成した約
２．３ｋｂの断片（PstI₁-PstI₂断片）をサブクローニ
ングし、目的遺伝子について制限酵素解析を行った。そ
の結果、約２．３ｋｂのPstI断片には、１．７ｋｂの目
的遺伝子のうちの上流部分約１ｋｂが含まれていること
がわかった。

【００１８】さらに下流の０．７ｋｂを得るために、上
記約１０ｋｂの断片をSphIで処理して得られた断片につ
いてサザンハイブリダイゼーションを行った。上記２．
３ｋｂのPstI断片をSphIで処理して、目的遺伝子の上記
の上流部分約１ｋｂのうちの下流よりの０．８ｋｂ（Sp
hI₂-PstI₂断片）を含む断片をプローブとして用いた。
ハイブリッド形成した約１．５ｋｂの断片（SphI₂-SphI
₃）と、２．３ｋｂをSphI で処理して生じた断片のう
ちの上流側の断片（PstI₁-SphI₂断片）とを連結し、約
３．０ｋｂの断片（PstI₁-SphI₃断片）を得た。この断
片をプラスミドｐＵＣ１８のPstI-SphI 部位に連結し
て、そのプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換させた。この形質転換体をｐＤＥＡプレートに播い
たところ、ハローを形成するコロニーが生じたため、エ
ステラーゼを発現している形質転換体が得られたことが
わかった。

【００１９】（全塩基配列の決定）上記の約３．０ｋｂ
の断片の塩基配列を決定した。シーケンスサンプルの調
製には、ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ社のＡＢＩＰＲＩ
ＳＭＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔを用い、塩基配列の決定に
は、ＡＢＩ社のオートシーケンサーを用いた。

【００２０】３．０ｋｂの断片の全塩基配列及び推定ア
ミノ酸配列を配列表１に記す。また、３．０ｋｂの断片
の制限酵素地図を図１に記す。３．０ｋｂの断片は、図
１中のＰｓｔＩ₁−ＳｐｈＩ₃断片である。２．３ｋｂ
の断片、１０ｋｂのEcoRI 断片をさらにSphIで処理して
得られる１．５ｋｂの断片、及びプローブとして用いた
０．８ｋｂの断片は、それぞれ、ＰｓｔＩ₁−ＰｓｔＩ
₂断片、ＳｐｈＩ₂−ＳｐｈＩ₃断片、ＳｐｈＩ₂−Ｐ
ｓｔＩ₂断片である。

【００２１】この塩基配列から、この断片は、１，６４
４ｂｐからなるオープンリーディングフレームを含み、
その５’末端部分には精製されたＴＢ−３５株のエステ
ラーゼＮ末端部分より決定されたアミノ酸配列ＣＧＧＳ
ＤＮＤＳＳＳＮＮＱＧＡＰＡＶＡＩＴをコードする塩基
配列が存在することがわかった。−１００〜−１番目の
塩基は、プロモーター部位であると考えられる。推定さ
れるアミノ酸配列中には、Ｎ末端部分の２６アミノ酸残
基のシグナルペプチドが含まれていた。また、エステラ
ーゼの活性部位として知られるＧ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ（Ｘ
は任意のアミノ酸）が存在し、ＴＢ−３５株のエステラ
ーゼではアミノ酸２２３〜２２７番目のＧ−Ｅ−Ｓ−Ａ
−Ｇであった。

【００２２】塩基配列から推定されるタンパク質の分子
量は５５，１１０であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとゲル濾過
クロマトグラフィーを用いて推定された精製エステラー
ゼの分子量である約６２，０００より小さかった。これ
は、本酵素が疎水性の高いタンパク質からなることによ
る誤差であると考えられる。精製されたＴＢ−３５株の
エステラーゼは、高い疎水性を有することから疎水部分
の存在が示唆されていた。決定されたアミノ酸配列から
は疎水性の高い部位は明確に見いだせなかったが、今回
得られたアミノ酸配列中の疎水性アミノ酸含有率は、５
５．３６％と高いものであった。

【００２３】（ホモロジー検索）塩基配列から推定され
るアミノ酸配列のホモロジー検索を行ったところ、活性
部位（アミノ酸２２３〜２２７番目のＧ−Ｅ−Ｓ−Ａ−
Ｇ）付近を中心に、真核生物のエステラーゼに対する高
い相同性が見られた。

【００２４】（大腸菌で発現した酵素の諸性質）ＴＢ−
３５株のエステラーゼ遺伝子で形質転換した大腸菌は、
エステラーゼを生成し、その生成量はＴＢ−３５株の生
成量の１／１０量であった。しかし、得られたエステラ
ーゼは、ＴＢ−３５株から精製されたエステラーゼと同
様の活性を持ち、実際にポリウレタンを分解することが
明らかになった。

【００２５】

【発明の効果】本発明によれば、コマモナス・アシドボ
ランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓａｃｉｄｏｖｏｒａｎ
ｓ）ＴＢ−３５株のエステラーゼをコードする遺伝子の
塩基配列を同定したことによって、その塩基配列を含む
組換えベクターが得られ、そのベクターを用いて形質転
換を行うことによって、その形質転換体からエステラー
ゼを安定して得ることができる。また、上記組換えベク
ターを用いて大腸菌を形質転換した場合、ＴＢ−３５株
に比べて大腸菌のエステラーゼ生産量は１／１０程と低
いが、大腸菌のほうがＴＢ−３５株より７倍以上増殖率
が高いため、酵素を得るための培養期間を短縮でき、容
易かつ大量にエステラーゼを得ることができる。このエ
ステラーゼは、ポリウレタン分解活性を十分有するた
め、ポリウレタンの処理技術に応用可能である。

【００２６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１９８６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：コマモナス・アシドボランス(Comamonas
acidovorans）株名：ＴＢ−３５株配列 GTCGCAAGGCGAGCCGGATTGGGATCTGGCAGCTCAACCCGACGAGGTAGACCAGCGCGT -280 CAATTGGTGACCCAGTGAAGCGGCGGTATCCATCGCTGCGGGGAAGCAGCTGCGCGCGCG -220 CCAGGCCCAAATGCATACTGCCTCCCAAGCTCTTGCCATTGAGCGGCAAGCGAGCGCTCA -160 ACCTTCCTTGGCCGAACGTGTTTCGAGGCCCAAAACTCGTGCCATACTTGGCCTCATGCG -100 GTTGAATTTCCTATCCGTGGTAGCATCGTTCGCGCGGAAATAAATAAAACAACATTTCGC -40 AGGGTAAAACACATACCAAGATCCTTCAGGAGACATTGA -1 ATG AAT AGC CGT TCC CTA ACT AAA GCG ATC CGA TTT CCC ACA ATT CTT 48 GCA CTC GCC GGC TTC AGC GTA CTT GGT GCA TGC GGT GGC AGC GAC AAC 96 GAC AGC AGT AGT AAC AAC CAG GGC GCA CCC GCC GTT GCC ATT ACG GTC 144 GCA GGC CAG GTC CAG GCT GTG GAC CGC CTC GGC ATG CGC AGA TAT TTC 192 GGG ATA CCT TTT GCC GCG CCT CCG GTG GGC AAC CTG CGC TGG ATG CCG 240 CCG GCG CCG CCT CAA TCC TGG GCC GCC CCG CTG GCG AAG ACC CAG TCT 288 AAT GCG CCC TGC ATG CAA ACC GGC GCC ACC GAT CCC CTC CGC CTG CCC 336 AAC GGC ACC GAG GAC TGC CTC TAC CTC GAC GTC CAT GCC CCT GCC ACC 384 GGC GAA GGC CCC TTC CCT GTC ATG GTG TGG ATC CAC GGC GGC GCC TTC 432 AGC ATC GGC GGC ACC ATC ACC TAT GCC GAC CCG TCG CCC CTG GTC AGC 480 AAG GGC GTC ATC GTT GTC AAC ATC GCC TAC CGC ATG GGC GCC ATG GGT 528 TTC CTG GGC CAT CCG TCG CTG CGC GCC GCG GAC GGC ACG GTC GGC AAC 576 TAC GGC ATC ATG GAC CAG CAG GCA GCA CTG CGC TGG GTG CAG GAC AAT 624 ATC GCC GCG TTC GGC GGC GAC AAG TCC AAT GTC ACC ATC TTC GGC GAA 672 TCC GCC GGC GGC TTC AGC GTG ATG ACA CAC CTG GCG TCA CCG CTA TCC 720 AAG GGT CTG TTC GCC AAG GCC ATC GTC CAA AGC GGC GGC TAC GGA TTC 768 GAT CGC CAG CTG ACA CAG GCG CAG CTT GAA GCG CAG AGC ACG TCG ATC 816 GTC AAC AGC GCG CTG GCC GCA GCC GGC GTT AGC TGC CCC ACC GTC GAC 864 GCG GCA TGT TTG CGC GGC TTG TCC GCC GAG CTT GTC AAC AAC CAG CTC 912 GCG ACC GCA TTC ACC ACG GCC AAC TGG AGC CCC GTG CCT TCG GTG GAT 960 GGC AAG GTT TTG CCC AAG TCC ATC AAG GCG ACT TTC GTC GCC GGG GAG 1008 AAC AAC AAG GTG CCG CTG GTC AAT GGC TCC AAC CAA GAC GAG TGG TCG 1056 TAC TTC GTT GCA TCG CGC GAA CTG GTG GCG GGG CCG CTG ACC GCT GCC 1104 CAG TAC CCT TCC TAT CTG CAG ACC TCG CTC GGT CTG CCA CCA TCG CTC 1152 GCC ACG GTA TAT CCA CTG ACG GAT TAC GGC ACC AAT ACC GCG CAG CAA 1200 CCC AGC CTC GCG GCG ACG GCG GCC GGC ACC GAC ATG CAC TTT TCC TGT 1248 CCG GCG TTG AAC CTG TCG AAG CGG GTA CTG AGC CAG GCA ACG CCA ATC 1296 TTC ATG TAC GAG TTC CGG GAC CGG ACT GCG ATC CCG TCG ATC GGC CGC 1344 AAC ACT ATC AGT TTC AAC CAG GGG GCA GGT CAC ACG TAT GAG CTC CAG 1392 TAC CTG TTC AAC CTG CGT GAC CTG GAG ACC GCG GAA CAC CGC GAC CTG 1440 CAG GCC AGC ATG GCA CGC TAC TGG ACC AAC TTT GCC CGC ACC AGC AAT 1488 CCG AAT AAT GGC GAC CCG GTG GCG ACG TCA TGG CCT GCA TTT ACG GGA 1536 CCG ACC AAG GTG CTC GGA CTG GAC GTC GCC TCC GCT GGC GGC ATC AGG 1584 GAA CTG GCC ACG TTC GAG ACC GAC CAC AAG TGC AAC ACG GCC TGG ACA 1632 TCA CTG ACT TTT TGA 1647

【００２７】配列番号：２配列の長さ：５４８配列の型：アミノ酸配列の種類：タンパク質起源生物名：コマモナス・アシドボランス(Comamonas
acidovorans）株名：ＴＢ−３５株配列 Met Asn Ser Arg Ser Leu Thr Lys Ala Ile Arg Phe Pro Thr Ile Leu 16 Ala Leu Ala Gly Phe Ser Val Leu Gly Ala Cys Gly Gly Ser Asp Asn 32 Asp Ser Ser Ser Asn Asn Gln Gly Ala Pro Ala Val Ala Ile Thr Val 48 Ala Gly Gln Val Gln Ala Val Asp Arg Leu Gly Met Arg Arg Tyr Phe 64 Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Pro Val Gly Asn Leu Arg Trp Met Pro 80 Pro Ala Pro Pro Gln Ser Trp Ala Ala Pro Leu Ala Lys Thr Gln Ser 96 Asn Ala Pro Cys Met Gln Thr Gly Ala Thr Asp Pro Leu Arg Leu Pro 112 Asn Gly Thr Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asp Val His Ala Pro Ala Thr 128 Gly Glu Gly Pro Phe Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe 144 Ser Ile Gly Gly Thr Ile Thr Tyr Ala Asp Pro Ser Pro Leu Val Ser 160 Lys Gly Val Ile Val Val Asn Ile Ala Tyr Arg Met Gly Ala Met Gly 176 Phe Leu Gly His Pro Ser Leu Arg Ala Ala Asp Gly Thr Val Gly Asn 192 Tyr Gly Ile Met Asp Gln Gln Ala Ala Leu Arg Trp Val Gln Asp Asn 208 Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Lys Ser Asn Val Thr Ile Phe Gly Glu 224 Ser Ala Gly Gly Phe Ser Val Met Thr His Leu Ala Ser Pro Leu Ser 240 Lys Gly Leu Phe Ala Lys Ala Ile Val Gln Ser Gly Gly Tyr Gly Phe 256 Asp Arg Gln Leu Thr Gln Ala Gln Leu Glu Ala Gln Ser Thr Ser Ile 272 Val Asn Ser Ala Leu Ala Ala Ala Gly Val Ser Cys Pro Thr Val Asp 288 Ala Ala Cys Leu Arg Gly Leu Ser Ala Glu Leu Val Asn Asn Gln Leu 304 Ala Thr Ala Phe Thr Thr Ala Asn Trp Ser Pro Val Pro Ser Val Asp 320 Gly Lys Val Leu Pro Lys Ser Ile Lys Ala Thr Phe Val Ala Gly Glu 336 Asn Asn Lys Val Pro Leu Val Asn Gly Ser Asn Gln Asp Glu Trp Ser 352 Tyr Phe Val Ala Ser Arg Glu Leu Val Ala Gly Pro Leu Thr Ala Ala 368 Gln Tyr Pro Ser Tyr Leu Gln Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Ser Leu 384 Ala Thr Val Tyr Pro Leu Thr Asp Tyr Gly Thr Asn Thr Ala Gln Gln 400 Pro Ser Leu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Thr Asp Met His Phe Ser Cys 416 Pro Ala Leu Asn Leu Ser Lys Arg Val Leu Ser Gln Ala Thr Pro Ile 432 Phe Met Tyr Glu Phe Arg Asp Arg Thr Ala Ile Pro Ser Ile Gly Arg 448 Asn Thr Ile Ser Phe Asn Gln Gly Ala Gly His Thr Tyr Glu Leu Gln 464 Tyr Leu Phe Asn Leu Arg Asp Leu Glu Thr Ala Glu His Arg Asp Leu 480 Gln Ala Ser Met Ala Arg Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Arg Thr Ser Asn 496 Pro Asn Asn Gly Asp Pro Val Ala Thr Ser Trp Pro Ala Phe Thr Gly 512 Pro Thr Lys Val Leu Gly Leu Asp Val Ala Ser Ala Gly Gly Ile Arg 528 Glu Leu Ala Thr Phe Glu Thr Asp His Lys Cys Asn Thr Ala Trp Thr 544 Ser Leu Thr Phe 548

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例により得られた３．０ｋｂの断片の制限
酵素地図を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｓ 13/00 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリウレタン分解酵素をコードする塩基
配列を含む配列番号１に記載の塩基配列中の−１００〜
１６４７番目の塩基配列からなるＤＮＡを含んでなる遺
伝子。
【請求項２】ポリウレタン分解酵素をコードする配列
番号１に記載の塩基配列中の１〜１６４７番目の塩基配
列からなるＤＮＡを含んでなる遺伝子。
【請求項３】ポリウレタン分解酵素をコードする配列
番号１に記載の塩基配列中の７９〜１６４７番目の塩基
配列からなるＤＮＡを含んでなる遺伝子。
【請求項４】配列表の配列番号２で表されるアミノ酸
配列又は該アミノ酸配列において、１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
らなるポリウレタン分解活性を有するポリウレタン分解
酵素をコードするＤＮＡを含んでなる遺伝子。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか一に記載の遺伝
子を含有する組換えベクター。
【請求項６】請求項５に記載のベクターによって形質
転換された形質転換体。