JPH10271995A - グルコース存在下で活性を持つキャンディダ属酵母のプロモーターｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体およびそれを用いたイノシトールの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】経済的なイノシトール生産を可能とする。 【解決手段】グルコース存在下で活性を持つプロモータ
ーＤＮＡを使用し、イノシトール生合成反応中の酵素遺
伝子を発現する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】イノシトールは、高等生物に
おいてビタミンの一種として重要な物質で、栄養食品、
飼料添加物、医薬品などに利用される。

【０００２】本発明は、グルコース存在下で活性を持つ
新規なプロモーターＤＮＡ、該プロモーターＤＮＡを使
用し遺伝子を発現する方法、および該プロモーター遺伝
子を使用してイノシトール生合成に関与する酵素遺伝子
を発現し、イノシトールを微生物を利用して製造する方
法に関する。

【０００３】

【従来の技術】従来イノシトールは、米糠、コーンステ
ィープリカーなどからの抽出（特開昭６１−５６１４
２）、パン酵母を培養して製造する方法（欧州特許５０
６２８９号公開広報）などが知られている。またパン酵
母ではイノシトール−１−リン酸合成酵素遺伝子を用
い、イノシトール蓄積濃度を向上させることができるこ
とを明かにしている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】米糠、コーンスティー
プリカーなどから抽出する方法は、イノシトール以外の
不純物が多く、精製が困難であり、経済的に問題があ
る。また、パン酵母を培養して製造する方法は、生産性
が低く、やはり経済的に問題があり、さらに工業的実績
もない。また、パン酵母以外にはイノシトールを菌体外
に生産する微生物は、知られていない。本発明者らは、
パン酵母以外にイノシトールを生産する潜在能力を持つ
微生物を探索し、イノシトールを菌体外に分泌する微生
物を広く検討した結果、キャンディダ属に属する微生物
の変異株がイノシトールを菌体外に分泌することを見い
出した。さらに一連のイノシトール生合成反応の中か
ら、イノシトール−１−リン酸合成酵素が律速反応であ
ると推定し、この酵素遺伝子を強力なプロモーター遺伝
子で高発現し、イノシトール生合成を促進することを検
討したが、既存のプロモーターはわずかしかなく、効果
も低い。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決するため、キャンディダ属酵母からグルコース
存在下で活性を持つプロモーターＤＮＡを探索し、グリ
セロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモ
ーターＤＮＡがグルコース存在下で活性を持つことを見
い出した。キャンディダ属酵母を宿主として、このプロ
モーターＤＮＡ支配下でパン酵母の酸性ホスファターゼ
遺伝子とキャンディダ属酵母のイノシトール−１−リン
酸合成酵素遺伝子を発現でき、イノシトール−１−リン
酸合成酵素遺伝子を発現した場合には、イノシトール蓄
積濃度、生成収率が向上することも見いだし本発明に到
達した。

【０００６】すなわち、本発明はグルコース存在下で活
性を持つ新規なプロモーターＤＮＡ、該プロモーターＤ
ＮＡを含んだ自己複製可能なＤＮＡ、該プロモーターを
使用した遺伝子の発現方法、該プロモーターＤＮＡを使
用しイノシトール生合成反応中の酵素を発現することを
特徴とするイノシトールの製造方法に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明における遺伝子取得源につ
いて説明する。プロモーターＤＮＡを取得する遺伝子源
としては、キャンディダ属酵母、より好ましくはキャン
ディダ属ボイディニィ種に属する酵母を用いる。プロモ
ーターＤＮＡを取得する遺伝子としては、グルコースを
炭素源として培養した時に活性を持つ酵素の遺伝子、す
なわち例えばグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼなどの遺伝子を用いる。

【０００８】一方、本発明のプロモーターＤＮＡを使用
して発現する遺伝子は、キャンディダ属酵母の遺伝子以
外に、パン酵母から取得した遺伝子でも発現することが
明らかとなった。従って、本発明のプロモーターＤＮＡ
を使用して発現する遺伝子として宿主以外から取得した
遺伝子を含む組換えＤＮＡ、形質転換体およびそれを用
いたイノシトールの製造方法も本発明に含まれる。

【０００９】イノシトールの製造に微生物を用いる場合
には、プロモーターＤＮＡを使用して発現する遺伝子と
して、イノシトール生合成反応で使用される酵素の遺伝
子、すなわちイノシトール−１−リン酸合成酵素などの
遺伝子を用いる。

【００１０】本発明のＤＮＡの単離法について説明す
る。キャンディダ属ボイディニイ種（以下Ｃａｎｄｉｄ
ａ ｂｏｉｄｉｎｉｉと記す）の染色体ＤＮＡの取得法
は、パン酵母の方法と同様であり、たとえば名取俊二
（新生化学実験講座１７微生物実験法p245-246）の方法
が例としてあげられる。

【００１１】グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼをコードするＤＮＡの単離法は、グリセロアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質コード
部分の適切な部位を使用したプライマーを使用し、ゲノ
ムＤＮＡをテンプレートとしてポリメレースチェインリ
アクション法（以下ＰＣＲ法）によりＤＮＡ配列特異的
に遺伝子を増幅する方法が望ましい。

【００１２】具体的には、パン酵母とヒトのグリセロア
ルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のタンパ
ク質コード部分よりＤＮＡ配列の内、保存性の高い配列
を元にプライマーを合成し、ゲノムＤＮＡライブラリを
テンプレートとして、ＰＣＲ法によって該遺伝子のタン
パク質コード部分を増幅する。増幅したＤＮＡ断片はｐ
ＵＣ１８などの大腸菌用ベクターに挿入した後、ダイデ
オキシ法によりＤＮＡ配列を確認して他のグリセロアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子との相同性
を確認する。取得したグリセロアルデヒド−３−リン酸
デヒドロゲナーゼの遺伝子配列を元に、タンパク質コー
ド部分の上流部分を増幅するようにプライマーを合成す
る。ゲノムＤＮＡライブラリをテンプレートとして、再
びＰＣＲ法によりプロモーターＤＮＡを増幅し、得られ
たＤＮＡ断片をｐＵＣ１８などの大腸菌用ベクターに挿
入した後、ダイデオキシ法によりＤＮＡ配列を確認し、
グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝
子のタンパク質コード部分のＤＮＡ配列が一致するＤＮ
Ａ断片を取得、その上流部分をプロモーターＤＮＡとし
て取得する。

【００１３】次にＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉを
形質転換する方法について説明する。宿主としては、該
菌株のURA3遺伝子欠損株などをマーカーとした株を用い
る。ベクターとしては該菌株用のものでURA3遺伝子など
を保持したものが用いられ、例えばpYSN01（図３）が用
いられる。このようなベクターの適当な制限酵素切断部
位に、上記のように取得したイノシトール-1-リン酸合
成酵素をコードするDNAを挿入し、形質転換用DNAを調製
する。形質転換はプロトプラスト法、リチウム酢酸法な
ど通常の方法が用いられる。

【００１４】取得したDNAの制限酵素地図、塩基配列な
どの決定は通常行われている方法にしたがう。

【００１５】本発明における培養方法について説明す
る。イノシトール生産用の培地は、炭素源、窒素源、無
機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含
有する通常の培地である。

【００１６】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、でんぷんおよびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸のごとき有機
酸、メタノール、エタノール、グリセロールのごときア
ルコール類などを１〜１５％、窒素源として、酢酸アン
モニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、のごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を０．１〜４．０％、有機微
量成分としては、ビオチン等の被要求性物質が０．００
０００１％〜０．１％、また必要に応じて、コーンステ
ィープリカー、ペプトン、酵母エキス等０〜５％をそれ
ぞれ適当に含有する培地が用いられる。これらの他に、
リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、
塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄、等が
微量成分として添加される。また好ましくは消泡剤など
も添加し、培養条件の安定化をはかる。

【００１７】培養は好気条件で行う。培養の間、培地の
ｐＨ３〜８に、温度は２０〜３５℃に調節し、２４〜１
２０時間振盪または通気撹拌培養すれば好ましい結果が
得られる。

【００１８】培養液中に分泌蓄積されたイノシトール
は、そのまま単離採取することなく、飼料などに用いる
ことができる。また、培養液あるいは反応液からイノシ
トールを採取するには公知の方法で可能である。例え
ば、菌体を遠心分離などで除去した後、カチオンおよび
アニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すれば
結晶を取得することができる。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。

【００２０】実施例１ （プローブDNAの調製）キャンディダ・ボイディニィＴ
Ｒ−１（FERM BP-5076）から染色体ＤＮＡの取得を名取
俊二（新生化学実験講座１７微生物実験法p245-246）の
方法により行なった。一方Saccharomyces cerevisiaeと
ヒトのグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子のアミノ酸配列の保存性が高い領域を調べmix
primer（mix A primer、mix B primer）を合成し、キャ
ンディダ・ボイディニィＴＲー１の染色体ＤＮＡを鋳型
とし、ポリメレースチェイン反応（PCR）を行ない、合
成したDNAをベクターpUC18（宝酒造社製）に接続した。
プローブＤＮＡの塩基配列解析を行い、Saccharomyces
cerevisiaeの相当する配列と比較した結果、図４，５の
ようにＤＮＡレベルで７５．９％の相同性があった。

【００２１】mix A primer：5' AA(CT)GGITT(CT)GGI(A
C)GIAT(ACT)GG 3' mix B primer：5' ACIGC(TC)TTIGCIGCICCIGT 3'

【００２２】実施例２ （染色体ＤＮＡライブラリーの作成）実施例１でキャン
ディダ・ボイディニィＴＲ−１（FERM BP-5076）から取
得した染色体ＤＮＡ２０μｇについて、制限酵素Sau3AI
を１．４ユニット用い、３７℃５分間で部分分解した。
５ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を電気泳動により精製し、こ
のＤＮＡ断片を鋳型として実施例１と同様にＰＣＲを行
った所、実施例１と同じ大きさの６２６ｂｐのＤＮＡ断
片が得られ、ＤＮＡ断片中にグリセロアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が存在することを確認し
た。精製した約５ｋｂｐのＤＮＡ断片はλＤＮＡ（STRA
TAGENE λ ZAP Express Vector）に導入し、染色体ＤＮ
Ａライブラリーを作成した。

【００２３】実施例３ （２段階ＰＣＲによるグリセロアルデヒド−３−リン酸
デヒドロゲナーゼプロモーターＤＮＡの取得）実施例２
で作成した染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型にして、G3
P proA primerおよびλＤＮＡ配列中に存在するM4 prim
erを用いてＰＣＲによる１回目の増幅を行った。続いて
１回目のＰＣＲ反応液を鋳型にしてG3P proB primerお
よびλＤＮＡ配列中に存在するT7 primerを用いて２回
目のＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡフラグメントは電
気泳動で精製し、ｐＵＣ１８に導入した後ＤＮＡ配列解
析を行い、配列番号１に示す７６６ｂｐのＤＮＡ配列を
得た。また図６に示したような制限酵素地図を作成し
た。

【００２４】G3P proA primer：5' CTTGTATTGTTTGTGGGT
GGAA 3' G3P proB primer：5' AAGCAGCGTAATCAGCAGCAA 3' M4 primer ：5' GTAAAACGACGGCCAGT 3' T7 primer ：5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'

【００２５】実施例４ （酸性フォスファターゼ発現ベクターの構築）実施例３
で取得したプロモーターＤＮＡを鋳型とし、phoA prime
rとphoB primerを合成してＰＣＲを行い、プロモーター
ＤＮＡの5'末端側にSacI、3'末端側にBglIIの制限酵素
認識配列を導入した。図７に示すように、プロモーター
下流にパン酵母由来の酸性フォスファターゼ遺伝子PHO5
[EC 3.1.3.2]とアルコールオキシダーゼ遺伝子のターミ
ネーターＤＮＡを接続し、さらにURA3遺伝子を挿入した
組換えＤＮＡ（ｐＨＯ３０）を作成した。

【００２６】phoA primer：5' CCCGAGCTCGATCTACTGCCGT
TCTTGCT 3' phoB primer：5' GGGAAGATCTGTTTGTTTGTAAGTTTATAT 3'

【００２７】実施例５ （イノシトール−１−リン酸合成酵素発現ベクターの構
築）実施例３で取得したプロモーターＤＮＡを鋳型と
し、inoA primerとinoB primerを合成してＰＣＲを行
い、プロモーターＤＮＡの5'末端側にEcoRI、3'末端側
にNotIの制限酵素認識配列を導入した。図８に示すよう
に、大腸菌とキャンディダ・ボイディニィのシャトルベ
クターpYSN01のプロモーターＤＮＡを置換し、プロモー
ターＤＮＡ下流にキャンディダ・ボイディニィDGR1-14
(FERM BP-5070)のイノシトール−１−リン酸合成酵素遺
伝子を導入した組換えＤＮＡ（ｐＹＳＮ６０２）を作成
した。

【００２８】inoA primer：5' CCGGAATTCGATCTACTGCCGT
TCTTGCT 3' inoB primer：5' AAGGAAAAAAGCGGCCGCTGAAGAAGTTTTTGTT
TGTT 3'

【００２９】実施例６ （プロモーター活性の測定）実施例４の発現ベクターを
用い、キャンディダ・ボイディニィδ−６５(FERMP-157
39)から、Ｙ．ＳＡＫＡＩらのＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１７３：７４５８−７４６３の方法でＵＲＡ３遺伝
子欠損株にした宿主キャンディダ・ボイディニィ FOAR6
5-4をプロトプラスト法（酵母分子遺伝学実験法（学会
出版センター）p120-121、大嶋泰治編著）により形質転
換した。

【００３０】組換え体を表１に示す組成の培地５ｍｌを
含む１８ｍｍ径試験管に植菌して２日間培養後、菌体を
生理食塩水で洗浄し、表２に示す組成の培地５ｍｌを含
む１８ｍｍ径試験管に６６０ｎｍでの吸光度が０．０５
になるよう植菌した。６６０ｎｍでの吸光度が１．０に
なるまで培養した後、菌体を生理食塩水で洗浄、０．０
５Ｍ酢酸水溶液（ｐＨ４．０）に懸濁した。

【００３１】パラニトロフェニルリン酸３２ｍｇ／０．
０５Ｍ酢酸水溶液（ｐＨ４．０）５０ｍｌを８００μｌ
を菌体懸濁液２００μｌに添加し、３７℃で１０分間反
応した後、１０％トリクロロ酢酸水溶液１ｍｌを加え攪
拌、飽和炭酸二ナトリウム水溶液１ｍｌを添加して、遠
心上清の４２０ｎｍでの吸光度を測定した。パラニトロ
フェノール／０．０５Ｍ酢酸水溶液（ｐＨ４．０）を標
準溶液として反応したパラニトロフェノールリン酸の量
を計算し、酸性フォスファターゼ活性を測定したとこ
ろ、表３に示すように酸性フォスファターゼ活性が向上
した組換え体ＴＦ２株を得た。

【００３２】

【表１】

【００３３】

【表２】

【００３４】

【表３】

【００３５】実施例７ （イノシトール−１−リン酸合成酵素の発現）宿主キャ
ンディダ・ボイディニィ FOAR65-4（URA3欠損株）を実
施例５で作成した発現ベクターを用いてプロトプラスト
法（酵母分子遺伝学実験法（学会出版センター）p120-1
21、大嶋泰治編著））により形質転換した。

【００３６】組換え体を表４に示す培地５ｍｌを含む２
２ｍｍ径試験管に植菌して２日間培養した後、表４に示
す培地５０ｍｌを含む５００ｍｌバッフル付フラスコに
５％植菌した。培養４０時間の菌体を超音波で破砕し、
イノシトール−１−リン酸合成酵素の活性を特願平8-28
355に示す方法で測定したところ、表５に示すように酵
素活性が向上した組換え体ＴＦ１６３株を得た。

【００３７】

【表４】

【００３８】

【表５】

【００３９】実施例８ （組換え体を使用したイノシトール発酵）実施例７で取
得した組換え体ＴＦ１６３株を使用し、イノシトール発
酵を行った。

【００４０】表４に示す培地５ｍｌを含む２２ｍｍ径試
験管に組換え体を植菌し、１．５日培養後、同じ培地５
０ｍｌを含む５００ｍｌバッフル付フラスコに５％量植
菌した。培養開始から１．５日後にグルコース５０ｇ／
Ｌを添加し、合計５日間培養した結果、表６に示すよう
に蓄積濃度が向上した。

【００４１】

【表６】

【００４２】

【発明の効果】本発明のプロモーターＤＮＡを用い、グ
ルコース存在下で酵素遺伝子を発現し、酵素活性を向上
する事が可能となる。さらに、イノシトール生合成反応
中の酵素遺伝子を本発明のプロモーターＤＮＡを用いて
発現することにより、イノシトール発酵能力の向上が可
能となる。

【００４３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：７６６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：キャンディダ・ボイディニィ 株名：ＴＲ−１ 配列の特徴 特徴をあらわす記号：promoter 存在位置：１−７６６ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GATCTACTGC CGTTCTTGCT GGTAGTGCGG GTCTCCTGGA AGGCAGCTTA CAAATTCGCA 60 ATTCTGTCAA CAACGGCGGC TTATTCTCTG CCAGACCCAG TGGTTTTCGC CACCAGGCGC 120 AATATAGTCA ATACACCGGG CCAGGAGGGC CCTGAGCGAG TGCTCTCGGA GGCACTGCAG 180 GCAAGCGAAA CCAATAACAG ATACTACAGC GGTCGCCACG TTAAAGAGCG GCGCCTGCAT 240 GATGAAGCAC ATAGATGCAG AACATACAGA CACACCACGC CAATACCGTA CAACACATTG 300 AACACATGCA TTCATATAAC ACAACCTAAC TGCAAAAGAT AATATTTTAA CCAACAACTC 360 CACTTTCTCT CTCCTCTGTC AATTACTGTT TCAAGTGGAA TTTTAATTTT AATTAATAAT 420 TAATTGATTA ATTAATTAAT TAACTACTGC CACCACAATA ATTATTATTA CTGCTATTAT 480 TATTATTATT CTAATTTGCA TTGTCCTAAT TCACACATTA AGCATCCTAC TATTCTAGGG 540 AGAAGGAGGT CTTAACAGTT TTCAATTTTG GTTTTTTTGC TGATTGTCCT TACCCAGAAA 600 TTTTAATATA AATATTTGAC AATTGCCCCT ATTTCTAAAT CAATTTAATT TGTATCAATT 660 TATTATTATA TTTTTTTCTC CTTTCTCCAT CATTTTTAAT CAGTTTCTTT TAACTATTAA 720 TTATATAAAC TTACAAACAA ACAAAAACTT CTTCAAATAA AACAAA 766

【００４４】配列番号：２ 配列の長さ：５２６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド（タンパク質） 配列 Met Thr Tyr Gln Phe Val Pro Thr Val Lys Val Asp Asn Asp Asn 1 5 10 15 Cys Thr Tyr Thr Asp Ser Glu Leu Val Thr Lys Tyr Thr Tyr Lys 20 25 30 Asn Ser Val Val Thr Lys Glu Ser Asn Gly Ser Phe Ser Ile Lys 35 40 45 Pro Lys Thr Glu Asp Tyr Glu Phe Lys Val Asp Leu Lys Val Pro 50 55 60 Lys Leu Gly Val Met Leu Val Gly Leu Gly Gly Asn Asn Gly Thr 65 70 75 Thr Phe Cys Ala Ala His Phe Ala Asn Lys His Asn Ile Glu Phe 80 85 90 Asn Thr Lys Glu Gly Val Val Lys Pro Asn Tyr Tyr Gly Ser Val 95 100 105 Thr Gln Ser Ala Thr Ile Lys Leu Gly Ile Asp Glu Glu Gly Leu 110 115 120 Asp Val Tyr Ala Pro Phe Asn Ser Leu Leu Pro Phe Thr Asn Pro 125 130 135 Asn Asp Phe Val Ile Ser Gly Trp Asp Ile Ser Gly Ile Asn Gln 140 145 150 Tyr Asp Ala Met Val Arg Ala Glu Val Leu Glu Tyr Asp Leu Gln 155 160 165 Gln Lys Leu Lys Pro Tyr Met Glu Thr Ile Lys Pro Leu Pro Ser 170 175 180 Ile Tyr Tyr Pro Asp Phe Ile Ala Ala Asn Gln Asp Gly Arg Ala 185 190 195 Asp Asn Cys Tyr Asn Arg Lys Gly Asn Glu Pro Ala Ser Thr Lys 200 205 210 Asp Lys Trp Ala His Val Glu Gln Ile Arg Lys Asp Ile Arg Glu 215 220 225 Phe Lys Lys Ser Asn Asn Leu Asp Lys Val Ile Val Leu Trp Thr 230 235 240 Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Cys Asp Leu Ile Glu Gly Val Asn Asp 245 250 255 Thr Ala Asp Asn Leu Val Asn Ala Ile Lys Asn Asp His Ala Glu 260 265 270 Val Ser Pro Ser Thr Val Phe Ala Ile Ala Ser Ile Leu Glu Asn 275 280 285 Thr Pro Tyr Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val Pro Gly 290 295 300 Leu Leu Glu Leu Ala Glu Lys Glu Asn Thr Phe Ile Gly Gly Asp 305 310 315 Asp Phe Lys Ser Gly Gln Thr Lys Phe Lys Ser Val Ile Ala Gln 320 325 330 Phe Leu Val Asp Ala Gly Ile Arg Pro Ile Ser Ile Ala Ser Tyr 335 340 345 Asn His Leu Gly Asn Asn Asp Gly Tyr Asn Leu Ser Ser Pro Lys 350 355 360 Gln Phe Arg Ser Lys Glu Ile Ser Lys Ala Ser Val Val Asp Asp 365 370 375 Ile Ile Lys Ser Asn Glu Ile Leu Tyr Asn Asp Lys Thr Gly Arg 380 385 390 Lys Val Asp His Cys Ile Val Ile Lys His Met Ser Ala Val Gly 395 400 405 Asp Ser Lys Val Ala Met Asp Glu Tyr Tyr Ser Glu Leu Met Leu 410 415 420 Gly Gly His Asn Arg Ile Ser Cys His Asn Val Cys Glu Asp Ser 425 430 435 Leu Leu Ala Thr Pro Leu Ile Ile Asp Leu Ile Ile Met Thr Glu 440 445 450 Phe Phe Ser Arg Val Ser Tyr Lys Lys Ala Glu Asp Asn Ala Ser 455 460 465 Ala Tyr Asp Lys Met Tyr Ser Val Leu Ser Phe Leu Ser Tyr Trp 470 475 480 Leu Lys Ala Pro Leu Thr Arg Pro Gly Tyr Glu Ala Ile Asn Gly 485 490 495 Leu Asn Lys Gln Arg Ala Gly Val Asp Asn Phe Leu Arg Leu Leu 500 505 510 Ile Gly Leu Pro Ala Leu Asp Glu Leu Arg Phe Glu Glu Arg Leu 515 520 525 Lys 526

【００４５】配列番号：３ 配列の長さ：１５７８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：キャンディダ ボイディニイ 株名：ＤＧＲ１−１４ 配列の特徴 特徴をあらわす記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１．．１５７８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATGACTTACC AATTTGTTCC AACTGTTAAA GTCGATAACG ACAACTGTAC TTATACTGAC 60 TCTGAGTTAG TCACTAAGTA TACTTATAAA AACAGTGTTG TTACCAAGGA AAGTAATGGT 120 TCATTCTCGA TTAAACCAAA GACAGAAGAT TATGAGTTTA AAGTTGATTT AAAAGTTCCA 180 AAATTAGGTG TTATGCTTGT CGGTTTAGGT GGTAACAATG GTACTACTTT CTGTGCTGCT 240 CATTTTGCTA ATAAACATAA TATTGAATTC AATACGAAAG AAGGTGTTGT TAAACCAAAT 300 TATTATGGTT CTGTTACTCA GTCTGCTACT ATTAAATTAG GTATTGATGA AGAAGGTTTG 360 GATGTTTATG CCCCATTTAA CTCTCTTTTA CCATTCACTA ACCCAAATGA TTTTGTTATT 420 TCTGGTTGGG ATATTAGCGG TATTAACCAA TACGATGCTA TGGTTAGAGC TGAAGTCTTA 480 GAATATGACT TACAACAAAA ATTAAAGCCA TACATGGAAA CTATTAAACC ATTACCATCA 540 ATCTACTATC CAGATTTCAT TGCTGCCAAC CAAGATGGAA GAGCTGATAA TTGTTACAAC 600 AGAAAGGGTA ATGAACCAGC TTCTACCAAG GATAAATGGG CCCATGTTGA ACAAATTAGA 660 AAAGATATCA GAGAATTCAA GAAATCTAAT AATTTAGATA AAGTCATTGT CTTATGGACT 720 GCCAATACTG AAAGATATTG TGATCTTATT GAAGGTGTTA ATGATACCGC TGATAATTTA 780 GTCAATGCCA TAAAGAATGA TCATGCTGAA GTTTCACCAT CTACTGTCTT TGCCATTGCT 840 TCAATTTTAG AAAACACTCC ATATATCAAT GGTTCTCCAC AAAACACTTT TGTTCCAGGT 900 CTCTTAGAAT TAGCCGAAAA GGAAAATACT TTTATTGGTG GTGATGATTT TAAGAGTGGT 960 CAAACCAAAT TTAAATCTGT TATTGCTCAA TTTTTAGTTG ATGCTGGTAT TAGACCAATT 1020 TCCATTGCTT CATACAACCA TTTAGGTAAC AATGATGGTT ATAACTTAAG TTCTCCAAAA 1080 CAATTCAGAT CTAAGGAAAT TTCCAAGGCT TCTGTTGTTG ATGATATCAT TAAATCAAAC 1140 GAAATTTTAT ACAACGATAA GACAGGAAGA AAAGTTGATC ATTGTATTGT CATTAAGCAC 1200 ATGAGTGCTG TTGGTGATTC TAAAGTTGCC ATGGATGAAT ATTATTCTGA ATTAATGCTT 1260 GGCGGTCATA ACAGAATTTC ATGTCATAAC GTTTGTGAAG ATTCTTTATT AGCAACACCA 1320 TTAATTATTG ATTTAATTAT TATGACTGAA TTTTTTTCTA GAGTTTCTTA TAAGAAAGCT 1380 GAAGATAATG CATCTGCATA TGATAAGATG TATTCTGTAT TATCATTCCT TTCTTATTGG 1440 TTGAAGGCAC CATTAACTAG ACCAGGTTAT GAAGCCATCA ATGGTTTAAA CAAACAACGT 1500 GCTGGTGTTG ACAATTTCTT AAGATTATTA ATTGGTTTAC CAGCACTTGA TGAGTTAAGA 1560 TTTGAAGAAA GATTAAAA 1578

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のプロモーターＤＮＡの制限酵素切断地
図を示す図である。

【図２】本発明のイノシトール−１−リン酸合成酵素を
コードするＤＮＡの制限酵素切断地図を示す図である。

【図３】本発明で用いられるベクターの例を示す図であ
る。

【図４】本発明の実施例１で取得したプローブＤＮＡと
Saccharomyces cerevisiaeのグリセロアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子タンパク質コード部分の
ＤＮＡの配列を比較した図である。

【図５】本発明の実施例１で取得したプローブＤＮＡと
Saccharomyces cerevisiaeのグリセロアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子タンパク質コード部分の
ＤＮＡの配列を比較した図である。

【図６】本発明の実施例３で得たプロモーターＤＮＡの
制限酵素地図を示す図である。

【図７】本発明の実施例４で得た酸性フォスファターゼ
発現ベクターの構築を示す図である。

【図８】本発明の実施例５で得たイノシトール−１−リ
ン酸合成酵素発現ベクターの構築を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 7/22 Ｃ１２Ｐ 7/22 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 7/22 Ｃ１２Ｒ 1:72） (72)発明者 白井 真 愛知県名古屋市港区大江町９番地の１ 東 レ株式会社名古屋事業場内 (72)発明者 米原 撤 愛知県名古屋市港区大江町９番地の１ 東 レ株式会社名古屋事業場内

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】グルコース存在下で活性を持つキャンディ
   ダ属酵母のプロモーターＤＮＡ。
2. 【請求項２】制限酵素切断地図が図１である請求項１記
   載のプロモーターＤＮＡ。
3. 【請求項３】塩基配列が配列番号１またはそれに相補的
   な塩基配列である請求項２記載のプロモーターＤＮＡ。
4. 【請求項４】塩基配列の１個または２個以上を他の塩基
   で置換した請求項３記載のプロモーターＤＮＡ。
5. 【請求項５】塩基配列の１個または２個以上を他の塩基
   で置換し、制限酵素認識配列を１個または２個以上導入
   した請求項４記載のプロモーターＤＮＡ。
6. 【請求項６】酵母がキャンディダ属ボイディニィ種に属
   する酵母である請求項１〜５のいずれか１項記載のプロ
   モーターＤＮＡ。
7. 【請求項７】グルコース存在下で活性を持つキャンディ
   ダ属酵母のプロモーターＤＮＡ、酵素をコードするＤＮ
   Ａ、ターミネーターＤＮＡ、自立複製可能なベクターを
   含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
8. 【請求項８】グルコース存在下で活性を持つキャンディ
   ダ属酵母のプロモーターＤＮＡ、酵素をコードするＤＮ
   Ａ、ターミネーターＤＮＡ、キャンディダ属酵母の染色
   体ＤＮＡに組み込むことが可能なベクターを含んでな
   る、染色体ＤＮＡに組み込み可能な組換えＤＮＡ。
9. 【請求項９】プロモーターＤＮＡが請求項１から６のい
   ずれか１項に記載のプロモーターＤＮＡである請求項７
   または８記載の組換えＤＮＡ。
10. 【請求項１０】グルコース存在下で活性を持つキャンデ
    ィダ属酵母のプロモーターＤＮＡ、イノシトール−１−
    リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ、ターミネーターＤ
    ＮＡ、自立複製可能なベクターを含んでなる複製可能な
    組換えＤＮＡ。
11. 【請求項１１】グルコース存在下で活性を持つキャンデ
    ィダ属酵母のプロモーターＤＮＡ、イノシトール−１−
    リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ、ターミネーターＤ
    ＮＡ、キャンディダ属酵母の染色体ＤＮＡに組み込むこ
    とが可能なベクターを含んでなる、染色体ＤＮＡに組み
    込み可能な組換えＤＮＡ。
12. 【請求項１２】イノシトール−１−リン酸合成酵素をコ
    ードするＤＮＡの制限酵素切断地図が図２である請求項
    １０または１１記載の組換えＤＮＡ。
13. 【請求項１３】イノシトール−１−リン酸合成酵素をコ
    ードするＤＮＡから翻訳されるイノシトール−１−リン
    酸合成酵素のアミノ酸配列が配列番号２に示すアミノ酸
    配列である請求項１０または１１記載の組換えＤＮＡ。
14. 【請求項１４】イノシトール−１−リン酸合成酵素をコ
    ードするＤＮＡが配列番号３に示す塩基配列またはそれ
    に相補的な塩基配列を有する請求項１０から１３のいず
    れか１項に記載の組換えＤＮＡ。
15. 【請求項１５】イノシトール−１−リン酸合成酵素をコ
    ードするＤＮＡが配列番号２に示すアミノ酸配列を変え
    ることなく配列番号３に示す塩基配列の１個または２個
    以上を他の塩基で置換したＤＮＡである請求項１０から
    １４のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。
16. 【請求項１６】イノシトール−１−リン酸合成酵素をコ
    ードするＤＮＡがキャンディダ属ボイディニィ種に属す
    る酵母に由来するＤＮＡである請求項１０から１５のい
    ずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。
17. 【請求項１７】プロモーターＤＮＡが請求項１から６の
    いずれか１項に記載のプロモーターＤＮＡである請求項
    １０から１６のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ。
18. 【請求項１８】グルコース存在下で活性を持つキャンデ
    ィダ属酵母のプロモーターＤＮＡ、酵素をコードするＤ
    ＮＡ、ターミネーターＤＮＡ、自立複製可能なベクター
    を含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入
    してなる形質転換体。
19. 【請求項１９】グルコース存在下で活性を持つキャンデ
    ィダ属酵母のプロモーターＤＮＡ、酵素をコードするＤ
    ＮＡ、ターミネーターＤＮＡ、キャンディダ属酵母の染
    色体ＤＮＡに組み込むことが可能なベクターを含んでな
    る、染色体ＤＮＡに組み込み可能な組換えＤＮＡを適宜
    宿主に導入してなる形質転換体。
20. 【請求項２０】組換えＤＮＡが請求項１０から１７のい
    ずれか１項に記載の組換えＤＮＡである請求項１８また
    は１９記載の形質転換体。
21. 【請求項２１】宿主が大腸菌である請求項１８から２０
    のいずれか１項に記載の形質転換体。
22. 【請求項２２】宿主がキャンディダ属に属する酵母であ
    る請求項１８から２０のいずれか１項に記載の形質転換
    体。
23. 【請求項２３】宿主がキャンディダ属ボイディニィ種に
    属する酵母である請求項２２に記載の形質転換体。
24. 【請求項２４】グルコース存在下で活性を持つキャンデ
    ィダ属酵母のプロモーターＤＮＡ、酵素をコードするＤ
    ＮＡ、ターミネーターＤＮＡ、自立複製可能なベクター
    を含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入
    してなる形質転換体を用いたイノシトールの製造方法。
25. 【請求項２５】グルコース存在下で活性を持つキャンデ
    ィダ属酵母のプロモーターＤＮＡ、酵素をコードするＤ
    ＮＡ、ターミネーターＤＮＡ、キャンディダ属酵母の染
    色体ＤＮＡに組み込むことが可能なベクターを含んでな
    る、染色体ＤＮＡに組み込み可能な組換えＤＮＡを適宜
    宿主に導入してなる形質転換体を用いたイノシトールの
    製造方法。
26. 【請求項２６】形質転換体が請求項１８から２３のいず
    れか１項に記載の形質転換体である請求項２４または２
    ５に記載のイノシトールの製造方法。