JPH10276763A

JPH10276763A - コンパクト細胞培養ディスク

Info

Publication number: JPH10276763A
Application number: JP9079997A
Authority: JP
Inventors: Larsson Beere; ベーレ・ラルソン
Original assignee: Microcloning CCCD AB
Current assignee: Microcloning CCCD AB
Priority date: 1997-03-31
Filing date: 1997-03-31
Publication date: 1998-10-20
Anticipated expiration: 2017-03-31
Also published as: JP3878709B2

Abstract

(57)【要約】【課題】同時に独立して多数の生物資料を培養し、同
時に簡単な方法で観察できるようにした生物試料を培養
する配列を提供する。【解決手段】互いに隔離され、選択可能に画定された
透過性の内壁によって周囲から密封可能の、多数のマイ
クロチャンバもしくは好ましくは透明の薄膜で覆われた
ピット（１７）を含む細胞および／またはその他の生物
試料を培養するための配列。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、互いに隔離された
顕微鏡的次元の生存空間の配列と、このような配列の製
造方法と、この配列を利用した調査および測定のための
方法とに関する。

【０００２】

【従来の技術，発明が解決しようとする課題】ここに記
述する本発明は、単細胞生物、細胞集合体または多細胞
微生物の形をとる顕微鏡観察の生物試料の培養に適した
平面ディスクに配置された浅いピットの形態をとるマイ
クロチャンバの設計と使用とに関する。このような「コ
ンパクト細胞培養ディスク」（ＣＣＣＤ）の１つは、同
時培養、クローニング、機器観察または肉眼観察、およ
び場合により隔離して閉じ込めた数百から数千の生物試
料の保管（インヴィトロまたはポストモルテム）を可能
にする。その目標は、一様の培養条件下で前述のような
試料セットにおいて顕微鏡的および物理的化学的パラメ
ータの効率的な、精密かつ再現可能の研究を可能にする
ことである。このために、試料（単細胞、受精卵、胚な
ど）は個別的にそれぞれ１つの隔離された該試料自体の
マイクロチャンバに植えつけられることができる。前記
マイクロチャンバは、シリコン、石英、ガラス、プラス
チックまたはこれらの適切な複合材から作られ底板に確
実に取付けられた薄い生化学的に不活性の薄膜中の小孔
（典型的な場合は直径５００〜５０００マイクロメー
タ）で画定された浅い（典型的な場合では深さ１０〜１
００マイクロメータ）の円筒状のピットから成る。この
ピットは半透過性被膜（図１）から形成される薄いプラ
スチック膜で被覆することができる。この方法でＣＣＣ
Ｄに対し最適かつ一様に呼吸ガス、栄養素、抗生物質、
試薬等の制御を保証することが可能になる。この方法に
より各ピットは、内部環境が被覆薄膜の透過性の性質に
よって決定される閉鎖した無菌のマイクロチャンバを提
供することができる。巨大分子の培地成分はピットが閉
じられる前またはその後に被覆膜を通して注入すること
ができる。上述の配列は顕微鏡観察の生物試料の個別的
培養および顕微鏡分析または機器分析のために優れた条
件を提供する。これに加え、実験用または他の用途のた
めに、物理的、化学的または生物学的薬品に対する暴露
を管理することができる。ウィルスおよびバクテリアに
対し不透過性の薄膜で被覆されたとき、小室は閉鎖生物
系を形成し、事実上無菌の微小実験室として機能する。
培養後および実験後、調査した物質は、ＣＣＣＤから移
動することなく、別の分析または保管のために固着また
は凍結することができる。

【０００３】種々の生物学的専門分野（細胞生物学およ
び分子生物学、微生物学、遺伝学、免疫学、腫瘍学、放
射線生物学、薬理学、胎生学など）において、生物学的
な微小試料の個別培養、成長特性の研究またはその他の
細胞生物学的なパラメータ、細胞クローニングおよびク
ローン選別および資料整備、記録および保管に対する要
請がある（インヴィトロまたはポストモルテム）。この
理由から、本発明自体の記載に加え、本明細書の記述
は、顕微鏡観察および物理的化学的測定へのＣＣＣＤの
適合を明らかにする。

【０００４】上述の技術は、基礎生物医学および生物工
学研究、およびそれらの継続開発および実地適用、たと
えば臨床診断および治療計画、毒物学および胎生衛生学
に適用するような工業用遺伝子工学の分野において本発
明の効率的使用のために欠くことができない。ＣＣＣＤ
はとりわけ単細胞からの娘細胞個体群の製造のために好
ましい条件を提供する（細胞クローニング）。一様の培
養条件下で、多数の細胞クローンを製造し、かつ一定の
サイズで、たとえば１０００〜１００００細胞を提供す
ることを可能にする。この状況は、特に遺伝子工学研究
と腫瘍診断において著しい利益をもたらす。

【０００５】腫瘍診断においては、たとえば典型的な場
合では数十万から数百万の腫瘍および支質細胞を含む腫
瘍生検は、同一のＣＣＣＤにおいて同時に数千の細胞ク
ローンの成長によって適切に代表させることができる。
このために、腫瘍から得られた分散単細胞は一つ一つの
微小ピットの中で自動的に植え込むことができる。選択
肢として、一つは高度に希釈した細胞懸濁液による無作
為植え込みに再仕分けすることができる。これは通常１
ピットあたり細胞１または０の植え込みを成功に導く技
術である。

【０００６】ピットの被覆薄膜は、バクテリア、ウィル
スおよびその他の生物汚染因子に対し非透過性にするこ
とができるので、既存のマイクロチャンバは細胞生物学
的に無菌実験室として使用することができる。問題はこ
のカバー薄膜を通して栄養素およびその他の物質を極く
限定して交換するときに生ずる。ところが、ここに提案
した個々の培養の構造と微小の細胞質量とにより、この
交換の問題は除去もしくは抑制することができる。

【０００７】本発明の課題の一つは、ある配列を利用し
同時に相互に広範に独立して多数の生物試料を培養し、
それと同時に最も簡単な方法で観察できる配列を作るこ
とである。単一クローンの細胞個体群の場合では、特に
培養と分析のために好ましい条件を可能にする小室状の
微小実験室が構築されなければならない。これにより、
たとえば遺伝子に一様性があるとき、数十万または数百
万の細胞を含む腫瘍試料からクローン細胞の代表選別に
ついて信頼しうる特性化が可能になる長所が提供されな
ければならない。本発明に基づく課題は、たとえば臨床
腫瘍学において、個々の、互いに隔離した、少なくとも
約１０００クローンのための個別的な場所を構築するこ
とにより解決されなければならない。これにより上述の
選別の所望の代表のための条件が作られる。この配列は
当然ながら培養育種、研究および保管のために少量の細
胞個体群から単一細胞まで１つの微小実験室で使用でき
なければならない。

【０００８】もう１つ別の課題は、この配列を最も簡単
な方法で個々の細胞を供給することができ、培養中およ
び成長と細胞性質の観察中に成長条件の一様性に及ぼす
すべての望ましくない外部の影響をマイクロチャンバも
しくは個々の「ピット」の中で除去することである。

【０００９】さらにもう１つの課題は、本発明に基づい
て構築された配列もしくはその中に配列された細胞また
は生物培養を成長段階中に記録し、もしくは評価する適
切な測定方法を構築することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明に基づき設定され
た課題は、特に請求項１に記載された配列を利用して解
決される。

【００１１】本発明に基づき、多数のマイクロチャンバ
もしくは「ピット」を有し、互いに隔離され、かつたと
えば円板状の平坦な受け台上に顕微鏡観察の精度でハニ
カム状に配列される細胞を培養するための配列が提案さ
れる。マイクロチャンバは半透過性内壁もしくは薄膜に
よって被覆される。すなわち周囲の生物学的な汚染因子
に対して密閉されている。小室構造は典型的な場合で
は、種々の適用目的に選択された組合せにおける平行平
面の、薄いプレートおよび／または薄膜のいわゆるサン
ドイッチ構造である。その際に前記サンドイッチ構造の
中心に配置されたプレートもしくは薄膜は、部分的に網
目状またはハニカム状に、マイクロチャンバを形成する
ための穴明けが施されている。それと同時に「サンドイ
ッチ構造」の一部とすることができる受け台は、たとえ
ば薄いシリコン構造、石英構造、ガラスまたはプラスチ
ック構造によって形成されるディスクである。受け台の
面積径はそれぞれその上に配置されるマイクロチャンバ
の数とサイズに応じて典型的な場合では５〜２０ｃｍと
することができる。円形の受け台を選択することによ
り、たとえば顕微鏡または分光器によるマイクロチャン
バの分析を利用して走査することができるオーディオ分
野またはビデオ分野で使用されているコンパクトディス
クに最も良く比較できる配列の実施形態の変形体の可能
性が生ずる。

【００１２】たとえばハニカム状に配設されたマイクロ
チャンバは、典型的な場合で直径約０．５〜５ｍｍに、
ただし必ずしも円形ではなく、仕上げることができる。
小室の配分、形状およびサイズも決定する小室の幾何学
的形状を画定するハニカム構造と、円板状の受け台との
間で、好ましい場合には、たとえばアガロース層(Agaro
seschicht)のような薄い透明の薄膜または透明のゲルか
ら成る薄層を細胞親和力なしに配置させることができ
る。当然ながら、前記層を形成するために細胞もしくは
その培養に対して広範囲に不活性であり、または他の性
質を有するその他の適切な物質も使用することができ
る。

【００１３】ハニカム構造の各マイクロチャンバの底部
もしくは受け台もしくは上述の薄膜またはゲル層の上に
載置されて、たとえば中心に形成された「パラジウムイ
ンゼル」（Palladiuminsel）のような細胞の培養に適し
た薄い細胞親和力のある金属層または分子層、またはそ
の他の同じ機能をもつ平面を形成する物質から成る、典
型的な場合では同心に形成された細胞親和力のある平面
を配設することができる。ハニカム構造自体もしくは小
室内壁は、たとえばプラスチック、金属、セラミックス
または複合材料のような寸法の安定した物質から製造す
ることができる。最後に半透過性膜は好ましくは、たと
えばテフロン、ポリカーボネートまたはポリスチロール
のような、少なくともほとんど光を透過する物質から成
る。

【００１４】本発明に基づく配列のその他の好ましい実
施形態の変形体および細胞を培養するための配列の製造
方法は、請求項２ないし２０にその特徴が記載されてい
る。

【００１５】本発明に基づく配列を製造するための個々
の方法手段については、以下に記載する図との関連でよ
り詳しく説明する。本発明に基づく方法の好ましい実施
形態の変形体は、従属請求項１４ないし１８にその特徴
が記載されている。

【００１６】本発明もしくは配列は、同様に「コンパク
ト細胞培養ディスク」（“CompactCell Culture Disk”
または“ＣＣＣＤ”）とも呼ばれるが、少量でも大量で
も、すなわち単一細胞から典型的な場合には数千の細胞
に至るまで物理学的、化学的または生物学的に最適化さ
れた条件下で、個々の細胞もしくは細胞または多細胞構
造の顕微鏡的、分子生物学的、生化学的および物理的化
学的研究を可能にする。提案された細胞培養配列の中に
植え込まれた生物学的物質とともに、個々の培養もしく
はその形成の制御、観察および分析を可能にする微小実
験室が生じる。その際に環境の制御は個別的にまたは全
体的に可能になる。全配列も個々の小室もしくは微小実
験室も無菌または非無菌条件下で、短時間でも長時間で
も、さらにまた永久保管でも、輸送または、たとえば顕
微鏡下でまたは分光器方法による観察目的のために、た
とえば光導体、フォトマルチプリケータまたはフォトダ
イオードの利用により保持することができる。

【００１７】最後に提案されているのは測定もしくは記
録、評価および場合により本発明に基づいて画定された
配列に植え込まれかつ保管された細胞もしくは細胞培養
クローンおよびその他の上述の生物試料に関する情報の
記憶のための方法である。これらは、好ましくは自動の
電子データ処理（ＥＤＶ）支援による方法であり、前記
方法はマニュアル式およびビジュアル式技術との関連で
植込みおよび分析容量ならびに速度を高めることができ
る。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下に、添付図面に示される本発
明の実施の形態を説明する。

【００１９】図１(a) は平面図に「コンパクト細胞培養
ディスク」（“Compact Cell Culture Disk ”）、ドイ
ツ語では“Kompaktzellkulturscheibe bzw.-platte”の
一例を、図１(b) および図１(c) に描写した２つの実施
態様の変形体におけるマイクロチャンバとともに示す。
このディスク１の構造は、以下の図２に関連して、以下
により詳しく説明する。ディスク１の中心領域には、そ
れぞれ１つの外側に封鎖可能の、いわゆるピットを含む
本発明に基づいて画定されたマイクロチャンバもしくは
微小実験室１７または１８が配列される。その際に各マ
イクロチャンバもしくは各ピット内の中心に培養細胞も
しくは細胞培養を配置することができる。最後に製造技
術上の理由から、ディスク１は周縁部に溝もしくは切欠
１９を有し、その意義は同様に以下の説明から明らかで
ある。

【００２０】図１(a) に示したマイクロチャンバ１７の
配列は、一例のみを示すものであり、当然ながら、以下
に説明する図１０（Ａ）および１０（Ｂ）から明らかな
ように、マイクロチャンバ１１を任意の他の方法でディ
スク１に配置することも可能である。

【００２１】図１(a) のディスク１から抜粋により、両
方の図１(b) および図１(c) にそれぞれ１つのマイクロ
チャンバ１７を示す。その際に図１(b) によるマイクロ
チャンバにはない図１(c) のマイクロチャンバには中心
に細胞親和力平面１８を備えている。さまざまな種類の
このような平面、位置および仕上および種々の位置また
はその他の細胞親和力の構造は、自由に浮遊する粒子の
ように、同様に使用することができる。

【００２２】図２ならびに図３ないし図４との関連で、
横断面に、可能な本発明に基づく配列の種々の実施態様
の変形体を示す。その際、図２は図式的に前述の配列の
構造に指定された成分もしくは個々の要素を示す。配列
の構造のために考慮されるのは、図２に示すように、た
とえばハニカム状もしくは孔状に貫通して形成された金
属、セラミックまたはプラスチック薄膜ならびに半透過
性内壁５である。これはたとえばテフロン、ポリスチロ
ールまたはその他の適切な、好ましくは光に対し透明な
物質から成ることができる。本来のマイクロチャンバも
しくは微小実験室を形成するために、たとえばプラスチ
ック、金属、セラミックまたは複合材料もしくは強化ジ
ュロマ(Duromeren) のような寸法の安定した物質から形
成される格子状またはハニカム状のマトリックス６が使
用される。しかし前記マトリックスは、たとえば図２に
関連符号８で示すように、酸化またはエッチングを利用
して処理されたシリコンディスクからも製造することが
できる。この場合には、酸化またはエッチングされたシ
リコンマトリックスは好ましくは透明の石英層で配列さ
れる。

【００２３】マトリックス６のための受け台として、た
とえば、培養される細胞を配列することができる細胞親
和力のある平面１８が設けられているシリコンディスク
７を使用することができる。さらにこの受け台は、たと
えばすでに上述の図２に関連符号８をもつディスクのよ
うに、酸化およびエッチングを利用して処理されるシリ
コンディスクの一部とすることができる。しかしこの受
け台７は、シリコンの代わりに石英またはガラスから
も、またはその他の適切な物質からも製造することがで
きる。好ましくはこのシリコン受け台は、薄いアガロー
スポリマ層(Agarosepolymerschicht) で被覆され、その
上にアガロース層を載置しながら、たとえばパラジウム
から成る細胞親和力のあるスポット１８が配列されてい
る。パラジウムとは異なりアガロースは細胞親和力をも
たない。前述のパラジウムスポットは、特に個々の細胞
の培養およびクローンに適している。いわゆるパラジウ
ムインゼル技術についてはここでこれ以上詳しく述べな
い。なぜならこの技術は個々の細胞を最適に培養するた
めの関連の技術水準で非常に良く知られているからであ
る。ここではその文献箇所のみを指摘しておく：U. Ama
ldi 、B. Larsson：「腫瘍学におけるハドロン治療」第
１回国際ハドロン治療シンポジウム議事録。コモ、イタ
リア、１９９３年１０月１８日−２１日エクセルプタメ
ディカ、国際会議シリーズ１０７７、１９９４年、エル
ゼビエ、７３５頁以下（U. Amaldi, B.Larsson, Hadron
therapy in Oncology, Proceedings of the first inte
rnational symposium on Hadrontherapy, Como, Italy,
18. - 21. October 1993, Excerpta Medica, Internat
ional Congress Series 1077, 1994, Elsevier, Seiten
735 ff. ）。

【００２４】言うまでもなくこれ以外の類似の方法もこ
の目的のために使用することができる。それぞれ選択し
た配列に応じて、そのために磁気ディスク９の使用が考
慮されているサンドイッチ構造を磁気的に保持すること
も可能である。この磁気ディスクは、関連符号９で示し
たように、平らに形成することができ、さらにまた関連
符号１０のように、ハニカム状もしくは孔状に貫通する
こともできる。後者の磁気ディスクは、たとえば該磁気
ディスクを通して光学的分析がおこなわれるときに必要
である。

【００２５】サンドイッチ状の、本発明に基づく配列も
しくは分析構造の保管、取扱および輸送を確実にするた
めに、たとえば少なくとも片側に観察窓を設けた特殊鋼
箱とすることができる容器１１を設けることが好まし
い。

【００２６】ここで図３に横断面図で配列１２を含む容
器１１を示す。分かり易くするために、配列１２は爆発
状に展開させて、同様に図３に示す。これにより個々の
図２に使用した構成要素が明らかに分かる。その際に構
造もしくは配列１２は、図１(c) の線分Ａ−Ａに沿う断
面に相当する。

【００２７】構造もしくは配列１２は第一にハニカム状
もしくは孔あきシリコンディスクから成り、このシリコ
ンディスクは石英箔もしくは石英板８と組み合わせるこ
とができる。シリコンディスク８の孔状開口部は、酸化
またはエッチングによりシリコンディスクから得ること
ができる。石英表面は、好ましくは物質が細胞親和力を
もたないアガロースポリマ層で被覆される。図３に基づ
く構造は、さらにハニカムを覆う膜５ならびに新たにハ
ニカム状に形成されたニッケル薄膜４を含む。その際に
ハニカム構造は、シリコンディスク８の構造と合同であ
る。本発明に基づく構造もしくは配列を保持するため
に、石英層にシリコンハニカムに対して反対に磁気ディ
スク１０が配設され、この磁気ディスクが再びこれに対
応する開口部を備えたシリコンハニカムと合同に設けら
れる。金属箔および磁気ディスクの配列により、磁力の
結果としてこの配列が保持される。最後に確実に保管す
るために、たとえば特殊鋼製の容器１１の中にこの配列
が挿入され、その中に保管される。それと同時に該特殊
鋼箱は、片側または両側に窓状の開口部を備えることが
でき、この開口部は再びシリコンハニカム構造に対して
合同である。この窓状の開口部は、配列もしくは構造も
しくはその中に配列された細胞もしくは細胞培養が適切
な分析機器２１もしくは２１ａによって分析もしくは観
察するために利用される。特に一緒にまとめた構造に示
したように、細胞親和力のある構造の例として個々の小
室は石英表面上のパラジウムインゼル（パラジウム小区
画）１８の中心にを有する。

【００２８】このパラジウムインゼル上に個々の細胞２
３を付着させることができ、その上で細胞の培養が開始
される。個々の小室は、血清、栄養物質、作用物質など
のような種々の液体で混合される。この構造は半透過性
内壁５を利用して被覆もしくは密封されるので、培養過
程中にその他の物質を小室中に挿入することも可能であ
る。この半透過性内壁は、たとえばテフロン、ポリスチ
ロールまたはその他の適切な透明の物質製とすることが
できる。

【００２９】図４に、新たに一緒にまとめたものと、爆
発的に展開した、もう１つの本発明に基づく配列とを、
図式的に横断面図と部分図で示す。さらにこの部分図
は、たとえば図１(c) の断面Ａ−Ａに相当するが、その
際に図４にはこの構造に投与された細胞は示されていな
い。図４による配列もしくは構造では、シリコンディス
ク７の上に、たとえばポリカーボネートから成るマトリ
ックス６が載置される。さらにマトリックスは、膜５に
より覆われ、全体の配列は金属箔と磁気ディスクとによ
り磁力を利用して保持される。この配列を保管するため
に新たに容器１１が用意されるが、その際に図４による
例に、たとえば測定装置２１を利用して上から容器１１
のキャップを通して分析が考慮される。この例では、新
たにシリコンディスクがアガロース装置を利用して備え
られる場合が好ましい。さらにこのアガロース層の上に
パラジウムインゼル１８が、これに対応する細胞を挿入
するために設けられる。

【００３０】当然ながら図３に記載の構造１２において
も、図４に記載の構造１３においても、個々のマイクロ
チャンバを形成する際に大幅に異なる寸法を選択するこ
とも可能であるが、たとえば、以下の寸法が適切である
ことが証明されている。シリコンディスクの直径：約１０〜２０ｃｍシリコンディスクの厚さ：０．３〜１ｍｍアガロース層の厚さ：＜１０μ 好ましくは円形に仕上げられたマイクロチャンバ１１の
内径：約０．５〜５ｍｍ、好ましくは約０．８〜２ｍｍ個々の小室間のハニカム構造の肉厚：約０．２ｍｍハニカム構造の内壁の高さ：約０．１〜２ｍｍパラジウムインゼルの直径：約０．３ｍｍたとえばテフロン製のポリマ被覆層もしくは半透過性膜
の厚さ：＜１０μ 図５に、新たにたとえば測定の実施、観察または容器１
１の底部を通して分析する測定方法のために備えた本発
明に基づく配列１４のもう１つの可能な実施態様の変形
体の横断面図における部分図を図式的に示す。この構造
は新たにシリコン石英ディスク８と、金属箔４と、容器
１１の底部に配設された膜５とから成る。この構造は磁
気ディスク９によって覆われ、それと同時に前記磁気デ
ィスクが容器もしくは特殊鋼箱１１のキャップを形成す
る。

【００３１】図３−５に詳しく記述した小室構造を含む
本発明により説明されたコンパクト細胞培養配列もしく
は構造１２ないし１４は、特に多数の異なる細胞を含む
腫瘍の検査に適している。その際まず初めに腫瘍試料
（生検）の細胞堆積が個々の細胞分散されて分けられ
る。実際に、このような個々の細胞を比較的多数検査す
る必要のあることが示されている。前述のような試料は
一般に約１０万〜１００万の個々の細胞を含むので、腫
瘍生検の顕著な像を得るためには、少なくとも数千の個
々の試料を検査することが望ましい。前述のような細胞
生検の分離、分散は非常に良く知られている。

【００３２】上述の分散によって得られた個々の細胞
は、ここで個々のまだ密封されていないピット１７の中
に投与される。最後にハニカム構造が半透過性内壁２５
を利用して外側へ、しかも上述のパラジウムインゼル１
８の上に密封される。小室１７の充填後および密封後、
一般に標準化された、低分子成長成分もしくは栄養素が
被覆膜を経由して投与される。本発明により説明された
配列もしくは構造の長所は、これが多数のコンパクト
で、生物学的に滅菌された微小実験室を有することであ
り、これが以下の可能性を開く。１．続けて観察および肉眼ならびに機器的に分析するこ
とができる個別的に自体密封された小室内での任意の数
の個々の培養細胞の移植（数千の試料から）。２．直立または逆にされた、通常のまたは共焦点のレー
ザ走査型顕微鏡を利用した最適の光学的条件下での培養
と該培養の環境培地の形態学的または分光学的調査３．緩衝液、栄養素、抗生物質のような標準化された低
分子培地成分の添加の可能性。４．半透過性内壁を通す生物および成長細胞によって引
き渡された廃棄生成物の除去５．再び半透過性内壁を通す呼吸ガスまたはその他のガ
スによる個々の小室の管理６．薬剤または毒性の環境因子のような低分子作用物質
の連続的または一次的添加７．被覆膜を通る微量注入を利用した移植時点または任
意の時点での各培養に対して個別的な生化学的、およ
び、重要な場合は、微生物学的環境の制御８．外部暴露を利用した任意の時点での電離または非電
離放射線のような非化学的な試験態様の共通のまたは異
なる影響９．共通のまたは異なる温度制御１０．非滅菌環境における保管、輸送、取扱、分析およ
び観察中の培養のための滅菌条件図３ないし図５に図式的に、細胞が個々の小室の中で調
査中にどのように観察もしくは分析することができるか
を説明するために、顕微鏡またはその他の光学機器２１
もしくは２１ａを示す。この場合では、たとえば健康な
細胞が、通常の顕微鏡で簡単に観察できる、いわゆる
「単層」を形成するのに対し、いわゆる形質転換細胞
（「腫瘍細胞」）は「多層」構造を形成する可能性があ
る。これは共焦点の顕微鏡を利用してより良く観察もし
くは分析することができる。

【００３３】本発明に基づいて画定されたコンパクト細
胞培養プレートの形成は、新方式の細胞培養微小室の構
造原理と、前記小室の配列とに基づいている。これによ
り制限され、実規模で設定された、手動式または自動式
の、個々の生細胞の隔離、培養、特性化および資料化、
小多細胞生物または腫瘍または組織体外培養のような細
胞個体群または細胞の構造体系も可能になる。

【００３４】簡単な円板状の要素の上にサンドイッチ状
に構成された本発明により記述されたコンパクト細胞培
養プレートは、必然的に非常に優れた適用と取扱いの長
所を伴っている。一つは該コンパクト細胞培養プレート
が比較的小さくかつコンパクトであり、もう一つは該コ
ンパクト細胞培養プレートの上で多数の情報が記憶され
ており、この情報を最良の精度で最も簡単な方法で分析
可能もしくは呼出可能である。このように上述のような
細胞培養プレートもしくはディスクは、コンパクトディ
スクと類比的に分析機器もしくは処理機器に挿入するこ
とができ、正確に定められた座標を利用して精密に個々
の細胞室を定め分析し、もしくは影響を及ぼすことがで
きる。この方法で多数の微小実験室が比較的速く、任意
にまたは体系的に、たとえば段階的に、半径方向に、お
よび方位のディスクの運動で走査することができる。本
発明に基づいて請求されたコンパクト細胞培養プレート
には多数の適用方法があり、たとえば分子遺伝学または
細胞遺伝学、微生物学、腫瘍生物学、毒物学、薬理学お
よび放射線生物学において適用されている。「コンパク
ト細胞培養ディスク」（略語：ＣＣＣＤ）は、バイオテ
クノロジー、臨床医学または環境技術において自動化さ
れたルーチンワークの適用に適し、たとえば教育の分野
にも適用されている。特に大幅に増加した容量、精度、
再現性および滅菌生が、手動式でも電算機制御式でも、
いわゆる「細胞クローニング」（“cell cloning”）の
実施、すなわち隔離、培養、特性化および個々のクロー
ンの資料化を可能にする。

【００３５】図６および図７に図式的に、２つの可能な
測定方法もしくは分析方法を概略で示す。これに基づき
培養する細胞もしくは培養された細胞もしくは細胞培養
を観察もしくは分析することができる。その際、図６は
図式的に横断面において、上方へ測定のために利用でき
るマイクロチャンバもしくは実験室１７による本発明に
基づく配列１を示す。個々の細胞スポット２３の観察も
しくは分析は、この結果、培養過程中にその本来の位置
で、たとえば光学的機器２１を利用しておこなわれる。
その際に当然他の分析機器を使用することができる。こ
の測定方法は任意に繰り返しできるので、培養過程中に
好ましく適用可能である。その際、特定の選択または配
列の中に考慮された全部の小室１７を走査するために、
全体のコンパクト細胞培養プレートもしくはディスク１
が走査される。

【００３６】これに対し図７に密封された精密測定もし
くは物質の懸濁除去のために当初の構造の全被覆が取り
除かれ、細胞培養もしくは培養された生物試料は死滅固
定された、場合により凍結乾燥または灰化した物質２５
の形態で生ずる。死滅した物質の測定もしくは分析は、
暗示した矢印方向に偶然に起こる光子または中性子の放
射を利用しておこなわれる。この測定方法の大きな長所
は、一方で該測定方法が最も精度の高い結果を伝え、他
方では検査する物質にほぼ平行に放射線が衝突すること
により、たとえばシリコンディスクのように、その下に
ある受け台の中にまったく散乱が生じないでおこなわれ
ることにある。他の粒子放射線もしくはＸ線の光子また
は熱中性子を利用した測定は先行技術から非常に良く知
られている。

【００３７】図３ないし図５に部分的に示した、磁力を
利用してサンドイッチ状に保持されるマイクロチャンバ
構造もしくは配列１２ないし１４とは異なり、当然なが
ら、前記配列もしくは構造を通常の方法で接着を利用し
て製造することも可能である。これは特に、図９に断面
で図式的に示したように、その際に発生する磁場が細胞
の培養時に妨害すると見なされるときに必要である。す
なわち場合により、サンドイッチ構造が磁場を利用して
保持される場合に欠点となる可能性があり、このため場
合により本発明に基づくコンパクト細胞培養プレートも
しくは配列または構造を、図８に図式表示したように、
すなわち何らかの磁場がないように製造する必要があ
る。前述のような本発明に基づくコンパクト細胞培養プ
レートは、好ましくは以下に説明する処理工程にしたが
って製造することができる。１．マイクロチャンバ１７を形成するために設けられた
好ましくは円形の小孔を備えた、たとえばポリカーボネ
ート、シリコン、セラミックス、またはテフロンを被膜
したニッケルのような比較的堅い物質からのハニカム状
の構造もしくはマトリックス６の調達。その際、最小の
空間に可能な限り多くのマイクロチャンバ１７が形成で
きるようにするため、好ましくは可能な限り高いパッケ
ージ密度が選択される。２．前述の格子状またはハニカム状の構造もしくはマト
リックスは、薄い、たとえばテフロンまたはポリスチロ
ールからなるポリマ薄膜５（膜）の上に接着される。そ
の際、接着剤としてたとえばシリコン誘導体またはＵＶ
硬化性ポリマを使用することができる。ポリマ薄膜は、
上述の、任意に調達された、好ましくは個々の小室１７
の半透過性被覆５を形成する。３．栄養素液、血清、作用物質等による個々のピット１
７の充填４．上へ開放された小室１１の中へ個々の細胞１３の投
与５．たとえば直径約１０ｃｍを有するシリコンウエハも
しくはガラスプレートの上に、まず初めに、たとえばア
ガロースから成る薄いポリマ層が供給される。ハニカム
構造と調和してシリコンウエハもしくはアガロース層の
上にパラジウムインゼルまたはその他の構造を塗布また
は投与することができる。６．このように製造されたシリコンウエハが、上述のハ
ニカム構造の上に取付けられ、その際、好ましくはハニ
カム構造もシリコンウエハもマーキングもしくは切欠１
９（図１(c) ）を有する。これによりシリコンウエハは
ハニカム構造の上に合同に取付けられる。ハニカム構造
をもつシリコンウエハの接着は、たとえばシリコングリ
ースを利用しておこなわれる。７．最後にこのような製造された、本発明に基づく配列
もしくはコンパクト細胞培養プレートが、図６に記載す
る位置へ１８０゜回転され、この結果、シリコンウエハ
は受け台もしくは架台２３として利用される。

【００３８】これに対する選択肢として、接着する代わ
りに一つはハニカム状の構造をもつプラスチックフィル
ムと、もう一つはシリコンディスクをもつハニカム状の
構造とが上述の磁石を使用する可能性がある。この目的
のために、まだ片側が開いている図２に記載するハニカ
ム構造の製造で半透過性壁を形成するポリマフィルムが
格子状のニッケル薄膜または特殊鋼薄膜の上に塗布さ
れ、これがハニカム小孔と一致して同様に小孔をもつ。
さらに再びそれぞれの金属箔およびポリカーボネート‐
ハニカム構造の中の側面の切欠１９により、個々の小室
１７がニッケル薄膜または金属箔を通して、たとえば分
析目的のために可視化することを保証できる。シリコン
ディスク７の取付け後、このシリコンディスクの裏面に
磁石板９が載置され、この結果、このように形成された
配列もしくはコンパクト細胞培養‐サンドイッチ構造が
磁力を利用して保持される。最後に新たにこのように形
成されたコンパクト細胞培養プレートが１８０゜回転さ
れ、これにより個々の小室１７が薄膜内の小孔を通して
分析または処理目的のために可視化される。選択肢また
は磁石薄膜に追加して、ハニカム状の構造をポリマの代
わりに、たとえばニッケルまたはその他の磁性材料から
製造することも可能である。

【００３９】図１０（Ａ）に、いわゆる「コンパクト細
胞培養ディスク」のもう１つの例を示す。その際、相対
的に狭い周縁部を除き、プレート全体がハニカム状の構
造もしくは個々のマイクロチャンバを備えている。この
方法に基づいて、たとえば直径１０ｃｍのディスクと直
径０．８ｍｍのマイクロチャンバの場合で８０００以上
のマイクロチャンバを配置することが可能になる。

【００４０】図１０（Ｂ）はさらに本発明に基づく「コ
ンパクト細胞培養ディスク」の実施態様、特に細胞もし
くは細胞培養または異なる実験シリーズのその他の生物
試料の保管、培養および分析に適している。たとえば、
構造３３の領域における第１試料の細胞を投与する一
方、第２試料の細胞を構造もしくは領域３５の個々の小
室もしくはピットの中に投与する等々も可能である。こ
の主領域の間にある各中間領域３４もしくは４４に、基
準細胞を投与し、さらにまた培養のために比較的少数の
みを必要とする細胞を培養および観察することも可能で
ある。

【００４１】最後に図１１は、特に放射線研究と放射線
医学に適した本発明により説明した配列の適用を示す。
たとえば水を充填したモデル構造３１において、図１１
に示すように、個々の本発明に基づいて製造されたコン
パクト細胞培養ディスク１が挿入される。ここで生物学
的効果を種々の試料系もしくは種々のコンパクト細胞培
養ディスク上の試料の座標関数で検査することが可能で
ある。これはコンパクト細胞培養ディスクを含むモデル
構造３１が電磁界、Ｘ線、光子、中性子または任意のそ
の他の放射線３０にさらされることによっておこなわれ
る。個々のマイクロチャンバ１７がそれぞれモデル構造
３１の座標系のどこに配置されるかに応じて、構造３１
によってもたらされた波長に対して異なる暴露が生じ
る。

【００４２】図１−図１１に示した、本発明に基づいて
画定された細胞培養配列において、すなわち“Compact
Cell Culture Disk”では当然任意の方法で変化させ、
修正し、さらに補足することができる例にすぎない。特
に上述の寸法の代わりにその他の寸法を使用し、および
使用した材料の代わりにその他の適切な材料を使用する
ことも可能である。

【００４３】たとえば、パラジウムの代わりに別の適切
な特殊鋼、有機物質または化学的に固定した配位子を選
択することも可能である。またポリカーボネートの代わ
りに別の適切な、好ましくは透明の疎水性ポリマ、金
属、半導体または絶縁材料を使用することもできる。ま
た半透過性被覆層としてテフロンまたはポリスチロール
の代わりに、一般に全透過性の、半透過性のまたは非透
過性の内壁に使用されているようなその他の材料を使用
することができる。シリコンウエハの上にアガロース
は、特に、アガロースが不活性であり、細胞によってそ
の成長時に抑制されることから使用することが強要され
ている。しかし当然ながら適切な性質を有するその他の
材料をシリコンウエハの被覆のために使用することも可
能である。最後にシリコンディスクの代わりに透明のデ
ィスクを使用することができる（石英またはその他のガ
ラス）。さらにまた、少ない吸水性を有し、耐熱性であ
り、寸法安定性があり、および高い衝撃破壊強度を有す
るたとえばポリカーボネートまたはその他のポリマから
成るディスクを使用することができる。種々の複合材料
構造は、同様に、たとえば石英窓を設けた備付けの小孔
を有するシリコンのハニカム構造のように最新のものが
ある。

【００４４】また本発明に基づいて画定された配列の可
能な適用に関しても、限界は設定されていない。説明し
た適用方法のほかにも、特に、宇宙飛行において前述の
コンパクト細胞構造ディスクを使用することも可能であ
る。たとえば、本発明に基づいて画定されたコンパクト
細胞培養ディスク上に配置された細胞もしくは細胞培養
を、たとえば無重力、宇宙線等が個々の細胞の培養中に
該細胞に及ぼす影響を調査するために宇宙の条件にさら
すことも可能である。

【００４５】

【発明の効果】本質的であるのは、種々の材料を選択す
るとき細胞を培養するための配列を得ることができ、こ
れにより多数のマイクロチャンバを、互いに隔離するこ
とができ、好ましくは半透過性内壁によって周囲から密
封され、かつ適切な窓開口部を通して観察できることが
可能にされることである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１(a) は本発明に基づく円板状の配列の例の
平面図、図１(b) と図１(c) は図１(a) の配列からの部
分拡大図である。

【図２】本発明に基づく、サンドイッチ状の配列の図式
的および拡大図における、種々の典型的な場合で使用さ
れた個々の要素もしくは成分の断面図である。

【図３】組立てられ、爆発的に展開した状態における配
列の可能な本発明の実施形態の変形体の断面図である。

【図４】組立てられ、爆発的に展開した描写の横断面図
における本発明に基づく配列のその他の実施形態の変形
体の断面図である。

【図５】新たに組立てられ、爆発的に展開した本発明に
基づく配列のその他の実施形態の変形体の断面図であ
る。

【図６】図式的に描写した本発明に基づく配列で可能な
本来の位置での測定方法の断面図である。

【図７】図式的に描写した、死滅させた物質および被覆
配列による本発明のもう一つの測定方法の断面図であ
る。

【図８】図式的に描写した、本発明に基づく配列の実施
形態の変形体の断面図である。

【図９】図式的に描写した、本発明に基づく磁場により
保持された配列のもう一つの実施形態の変形体の断面図
である。

【図１０】図１０（Ａ）は本発明に基づく円板状の円形
に形成された配列の平面図、図１０（Ｂ）はコンパクト
ディスクに類似して形成されたもう一つの実施形態の変
形体の平面図である。

【図１１】図式的に透視画法で描写した、試料系におけ
る座標の関数として抽出された物体における種々の放射
線の種類の生物学的効果を調査するための本発明に基づ
く配列の可能な適用を示す図である。

【符号の説明】

１ディスク５半透過性内壁６マトリックス７シリコンディスク８ディスク９磁気ディスク１１容器１７、１８マイクロチャンバ１９切欠

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年７月１５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】本発明に基づく円板状の配列の例とその配列か
らの部分拡大部を示す平面図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】互いに隔離され、選択可能に画定された
透過性の内壁（５）によって周囲から密封可能の、多数
のマイクロチャンバもしくは好ましくは透明の薄膜で覆
われたピット（１７）を備えたことを特徴とする細胞お
よび／またはその他の生物試料を培養するための配列。
【請求項２】マイクロチャンバもしくは、内壁（２
５）で覆い可能のピット（１７）が、円板状の、平坦
な、少なくともほぼ平滑の受け台（７）の上に配置され
ることを特徴とする特に請求項１に記載の配列。
【請求項３】前記マイクロチャンバもしくは、内壁で
覆い可能のピットが、相前後に調整され、もしくは相対
して適合された合同の円板状または薄膜状の要素のサン
ドイッチ構造から成り、マイクロチャンバを形成するた
めに１つまたはそれ以上のディスクまたは薄膜が小孔
（１７）を有するハニカム状またはマトリックス状の構
造を有することを特徴とする特に請求項２に記載の配
列。
【請求項４】受け台が、薄い平面平行の、好ましくは
平滑の、光学的に高度かつ一様の品質をもつディスクに
よって形成されることを特徴とする特に請求項２または
３のいずれか１項に記載の配列。
【請求項５】小室もしくはピット（１７）の少なくと
も一部が、受け台（７）に載置され、かつ、前記受け台
に確実に連結されたハニカム状の格子構造またはマトリ
ックス（６）によって形成され、前記受け台（７）に対
置された小室（１７）もしくは格子中空の開口部が、好
ましくは半透過性膜（５）または薄膜を利用して覆い可
能もしくは密封可能であることを特徴とする特に請求項
１ないし４のいずれか１項に記載の配列。
【請求項６】個々の小室もしくはピット（１７）が高
精度に直径約０．２〜５ｍｍをもつ円形に仕上げられ、
小室の少なくとも一部がハニカム構造の形態に配置され
ることを特徴とする特に請求項１ないし５のいずれか１
項に記載の配列。
【請求項７】受け台（７）が、好ましくは透明のゲル
層またはポリマ層を利用して細胞親和力なしに覆われ、
その上にピット（１７）が配置されることを特徴とする
特に請求項２ないし６のいずれか１項に記載の配列。
【請求項８】受け台もしくはゲル層またはポリマ層の
上に載置される小室底部に、細胞の培養に適した薄層か
ら成る、それぞれ点状または島状に形成されたスポット
が配置されることを特徴とする特に請求項１ないし７の
いずれか１項に記載の配列。
【請求項９】格子構造もしくは小室内壁（１５）が、
剛性の、かつ寸法の安定した材料、特にポリカーボネー
ト、シリコン、金属材料、セラミック材料または複合材
料から成ることを特徴とする特に請求項１ないし８のい
ずれか１項に記載の配列。
【請求項１０】好ましくは半透過性の被膜（５）が、
選択可能の透過性の性質を有する、たとえばテフロン、
ポリスチロールまたはポリカーボネートのようなポリマ
材料から成ることを特徴とする特に請求項１ないし９の
いずれか１項に記載の配列。
【請求項１１】顕微鏡、測定機器もしくは処理機器の
保持装置にディスクを配設するために、中心に孔（７）
を有する円形ディスクが約５〜２０ｃｍの直径を有する
ことを特徴とする特に請求項３ないし１０のいずれか１
項に記載の配列。
【請求項１２】配列もしくは構造が、磁石の配置を利
用してサンドイッチ状に保持されることを特徴とする特
に請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の配列。
【請求項１３】容器の中に配置された配列で測定を実
施するために、該配列が、片側または両側に光を透過す
る開口部を備えた、たとえば特殊鋼箱のような容器（１
１）の中に配置されることを特徴とする特に請求項１な
いし１２のいずれか１項に記載の配列。
【請求項１４】細胞またはその他の生物試料を培養す
るための配列の製造方法であって、個々の細胞または生物試料用の、すなわち微小実験室も
しくはピットを形成するための中空もしくは小孔として
開かれた培養空間（１７）を含む、格子状またはハニカ
ム状の構造（６）を形成し、半透過性薄膜（５）もしくは被覆層の上に格子状または
ハニカム状の構造を取付けおよび連結し、栄養物質、血清、作用物質および／またはその他の液体
もしくは溶解または溶解可能の成分を、下方へ半透過性
薄膜もしくは被覆層によって密封された個々の中空もし
くは小孔（１７）に充填し、個々の中空もしくは小孔もしくは小室（１７）の中に細
胞（２３）もしくは生物試料を注入し、小孔もしくは中空を半透過性薄膜もしくは被覆層（５）
に対して反対に密封するための、受け台として円板状の
平板（７）を取付け、形成された配列を１８０゜回転させる、ことを特徴とす
る方法。
【請求項１５】ハニカム状または格子状の構造を有す
る半透過性内壁がＵＶ硬化性材料を利用して確実に連結
可能であることを特徴とする特に請求項１４に記載の方
法。
【請求項１６】円板状の受け台（７）が、シリコン、
石英またはガラスから製造され、これに続いて細胞親和
力のない、好ましくは透明のゲル層またはポリマ層、好
ましくはアガロース層（１７）を利用して被覆され、最
後に構造（１５）の中空もしくは小孔（１１）と幾何学
的に一致した点状もしくは島状の細胞親和力のあるスポ
ット（１４）を備え、これに続き、その都度前記スポッ
トが本質的に中空もしくは小孔の中心に位置するように
受け台が構造と合同に連結されることを特徴とする特に
請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】受け台および構造が、シリコングリー
スのような脂肪状の物質を利用して確実に互いに連結さ
れることを特徴とする特に請求項１４ないし１６のいず
れか１項に記載の方法。
【請求項１８】被覆層（２５）が、小孔を設けた金属
板もしくは金属箔上に載置され、前記小孔が幾何学的に
構造の中空もしくは小孔に対応し、構造（１５）および
受け台（２３）の取付けに続いて、磁石による金属板も
しくは金属箔の引張の結果として配列を保持するため
に、前記磁石が構造に対して反対側に前記受け台の上に
取付けられ、最後に前記配列が１８０゜回転されること
を特徴とする特に請求項１４または１６のいずれか１項
に記載の方法。
【請求項１９】培養された物質を露出および死滅させ
ることができるように、配列もしくは小室構造が解体さ
れ、光子放射または熱中性子を利用して死滅させた物質
の測定が実施されることを特徴とする請求項１ないし１
３のいずれか１項に記載の配列で測定を実施するための
測定方法。
【請求項２０】培養物質が、電気泳動またはその他の
分離方法のような生化学的または分子生物学的な調査方
法のために露出されるように、配列もしくは小室構造が
解体されることを特徴とする請求項１ないし１３のいず
れか１項に記載の配列で測定を実施するための測定方
法。