JPH10276789A

JPH10276789A - 修飾フィターゼ

Info

Publication number: JPH10276789A
Application number: JP10096830A
Authority: JP
Inventors: Kosutoriwa Dark; コストリワダーク; Pasamontes Louis; パサモンテスルイ; Tomskii Andreas; トムスキーアンドレア; Van Ruun Adorupus; ヴァンルーンアドルプス; Vogel Kurt; ヴォゲルカート; Weiss Marcus; ワイスマーカス
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-03-25
Filing date: 1998-03-25
Publication date: 1998-10-20
Anticipated expiration: 2018-03-25
Also published as: US20030092155A1; AU5954398A; EP0897010A3; CN1146658C; US20040142424A1; CA2231948C; US7078183B2; BRPI9801130B1; JP4097315B2; US6734004B2; DE69840617D1; ES2323819T3; KR100498206B1; AU746874B2; EP0897010B1; BR9801130A; EP0897010A2; CN1194305A; US6391605B1; KR19980080603A

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、改良された活性特性を有する修飾
フィターゼおよびその生産方法を提供することを目的と
する。【解決手段】自然に存在するフィターゼの３次元構造
を基に、修飾するフィターゼ、および選択的により好都
合な活性特性を有する別のフィターゼの３次元構造をコ
ンピューターでモデル化し、両フィターゼの活性部位の
構造を比較して異なるアミノ酸残基を同定し、該アミノ
酸を少なくとも一つコードするヌクレオチドを変化させ
ることにより修飾フィターゼをコードするDNA配列を構
築し、適当なベクターに該DNA配列を組み込み、該DNA配
列または該ベクターで適当な宿主細胞を形質転換させ、
該宿主細胞を培養し、該細胞または培地から修飾フィタ
ーゼを単離することによる、修飾フィターゼの生産方法
が提供された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フィチン酸（ミオ
イノシトールヘキサキスホスフェート）に作用してこれ
をミオイノシトールと無機リン酸とに加水分解する酵素
で、有益な飼料添加物として知られているフィターゼ
（ミオイノシトールヘキサキスホスフェートホスホヒド
ロラーゼ；EC 3.1.3.8）に関する。

【０００２】

【従来の技術】フィターゼは、1907年に最初に米ぬかで
記述され[Suzukiら、Bull. Coll. Agr. Tokio Imp. Uni
v. 7, 495 (1907)]、1911年にコウジカビ属(Aspergillu
s)のフィターゼが記述された[DoxおよびGolden, J. Bio
l. Chem. 10, 183〜186 (1911)]。フィターゼは小麦の
ふすま、植物の種子、動物の腸、および微生物でも見つ
かっている[HowsenおよびDavix, Enzyme Microb. Techn
ol. 5, 377〜382 (1983)、Lambrechtsら、Biotech. Let
t. 14, 61〜66(1992)、ShiehおよびWare, Appl.Microbi
ol. 16, 1348〜1351 (1968)]。

【０００３】アスペルギルス・ニガー（Aspergillus ni
ger） (フィクウムficuum)由来のフィターゼのクローニ
ングと発現は、フォン・ハーチングスベルツ（Van Hart
ingsveldt）らにより[Gene, 127, 87-94 (1993)]および
欧州特許出願第(EP)420 358号において、アスペルギル
ス・ニガー・アワモリ変種（Aspergillus niger var.aw
amori）のフィターゼのクローニングと発現はピディン
トン（Piddington）らにより[Gene 133, 55〜62 (199
3)]において報告されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】特性が改良されたフィ
ターゼのクローニング、発現、および精製は、欧州特許
第684 313号に開示されている。しかし、特に活性特性
に関してまだフィターゼをさらに改良する必要性があ
る。従って、本発明は、改良された活性特性を有する修
飾フィターゼの生産方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、上記の方法によって得られる修飾フィ
ターゼを提供することを課題とする。さらに、本発明
は、上述のフィターゼをコードするDNA配列を含むDNA配
列、該DNA配列を含むベクター、好ましくは発現ベクタ
ー、該DNA配列またはベクターにより形質転換された宿
主細胞、上述の宿主細胞が適当な培養条件下で培養さ
れ、該宿主細胞または培地から当技術分野で周知の方法
によりフィターゼが単離される、本発明のフィターゼの
調製方法、および本発明のフィターゼを含む食物または
飼料組成物を提供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の修飾フィターゼ
の生産方法においては、（１）a) アスペルギルス・ニガー（Aspergillus nige
r）のフィターゼの３次元構造を基にして、修飾するフ
ィターゼ、および選択的に、修飾するフィターゼの活性
特性よりも好都合な活性特性を有する別のフィターゼの
３次元構造を、コンピュータでモデル化する段階、 b) 修飾するフィターゼと、より好都合な活性特性を有
するフィターゼとの活性部位の構造を比較し、両方の活
性部位において異なるアミノ酸残基を同定する段階、 c) 両方の活性部位が異なる少なくとも１つのアミノ酸
をコードするヌクレオチドを変化させることにより、修
飾フィターゼをコードするDNA配列を構築する段階、 d) 適当な宿主細胞において発現する能力を有するベク
ターに該DNA配列を組み込む段階、 e) c)のDNA配列またはd)のベクターにより適当な宿主細
胞を形質転換し、該宿主細胞を適当な培養条件下で培養
し、当技術分野で公知の方法により、宿主細胞または培
地から修飾フィターゼを単離する段階を実行することを
特徴とする、改良された活性特性を有する修飾フィター
ゼの生産方法であることを特徴とする。

【０００６】また、本発明の方法においては、（２）修飾するフィターゼが真核生物由来である、
（１）記載の方法であることを特徴とする。

【０００７】また、本発明の方法においては、（３）修飾するフィターゼが菌類由来である、（１）ま
たは（２）記載の方法であることを特徴とする。

【０００８】また、本発明の方法においては、（４）修飾するフィターゼがコウジカビ属(Aspergillu
s)由来である、（１）から（３）のいずれか一項に記載
の方法であることを特徴とする。

【０００９】また、本発明の方法においては、（５）修飾するフィターゼが、アスペルギルス・フミガ
ツス（Aspergillus fumigatus）由来のフィターゼであ
る、（１）から（４）のいずれか一項に記載の方法であ
ることを特徴とする。

【００１０】また、本発明の方法においては、（６）より好都合な活性特性を有するフィターゼが真核
生物由来である、（１）から（５）のいずれか一項に記
載の方法であることを特徴とする。

【００１１】また、本発明の方法においては、（７）より好都合な活性特性を有するフィターゼが菌類
由来である、（１）から（６）のいずれか一項に記載の
方法であることを特徴とする。

【００１２】また、本発明の方法においては、（８）よ
り好都合な活性特性を有するフィターゼがコウジカビ属
(Aspergillus)由来である、（１）から（７）のいずれ
か一項に記載の方法であることを特徴とする。

【００１３】また、本発明の方法においては、（９）より好都合な活性特性を有するフィターゼがアス
ペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来の
フィターゼである、（１）から（８）のいずれか一項に
記載の方法であることを特徴とする。

【００１４】また、本発明の方法においては、（１０）修飾するフィターゼがアスペルギルス・フミガ
ツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼであり、
より好都合な活性特性を有するフィターゼがアスペルギ
ルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィターゼであ
る、（１）から（９）のいずれか一項に記載の方法であ
ることを特徴とする。

【００１５】また、本発明の方法においては、（１１）修飾するフィターゼがアスペルギルス・フミガ
ツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼであり、
より好都合な活性特性を有するフィターゼがアスペルギ
ルス・テレウス（Aspergillus terreus）のフィターゼ
である、（１）から（９）のいずれか一項に記載の方法
であることを特徴とする。

【００１６】また、本発明の修飾フィターゼにおいて
は、（１２）（１）から（１１）のいずれか一項に記載の方
法により得られた、または得ることの可能な修飾フィタ
ーゼであることを特徴とする。

【００１７】また、本発明のフィターゼにおいては、（１３）活性特性が非修飾フィターゼの活性特性よりも
好都合であるように修飾されたフィターゼであることを
特徴とする。

【００１８】また、本発明のフィターゼにおいては、（１４）非修飾フィターゼのアミノ酸配列が、１つまた
は複数のアミノ酸の欠失、置換、および／または付加に
より変化していることを特徴とする、（１３）記載のフ
ィターゼであることを特徴とする。

【００１９】また、本発明のフィターゼにおいては、（１５）アスペルギルス・ニガー（Aspergillus nige
r）のフィターゼのアミノ酸配列の以下の位置：27、6
6、71、103、140、141、188、205、234、235、238、27
4、277、282、340および／または424、好ましくは27、6
6、140、205、274、277、282および／または340の１つ
に相同である少なくとも１つの位置に変化が生じてい
る、（１３）または（１４）のいずれか一項に記載のフ
ィターゼであることを特徴とする。

【００２０】また、本発明のフィターゼにおいては、（１６）コウジカビ属(Aspergillus)、好ましくはアス
ペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）の
フィターゼである、（１３）から（１５）のいずれか一
項に記載のフィターゼであることを特徴とする。

【００２１】また、本発明のフィターゼにおいては、（１７）位置27に変化が生じている、または少なくとも
位置27に変化が生じている、（１５）または（１６）の
いずれか一項に記載のフィターゼであることを特徴とす
る。

【００２２】また、本発明のフィターゼにおいては、（１８）位置27のアミノ酸が、 a) Ala、Val、Leu、Ile；または b) Thrの群の１つから選択されるアミノ酸で置換されて
いる、（１７）記載のフィターゼであることを特徴とす
る。

【００２３】また、本発明のフィターゼにおいては、（１９）位置27に加えて、位置66でも変化が生じてい
る、（１７）または（１８）記載のフィターゼであるこ
とを特徴とする。

【００２４】また、本発明のフィターゼにおいては、（２０）位置27に加えて、位置140でも変化が生じてい
る、（１７）または（１８）記載のフィターゼであるこ
とを特徴とする。

【００２５】また、本発明のフィターゼにおいては、（２１）以下の変異：Q27L、Q27N、Q27T、Q27I、Q27V、
Q27A、Q27G、S66D、S140Y、D141G、A205E、Q274L、G277
D、G277K、Y282Hおよび／またはN340Sのうちの少なくと
も１つを特徴とする、（１３）から（２０）のいずれか
一項に記載のフィターゼであることを特徴とする。

【００２６】また、本発明のDNA配列においては、（２２）（１２）から（２１）のいずれか一項に記載の
フィターゼをコードするDNA配列を含むDNA配列であるこ
とを特徴とする。

【００２７】また、本発明のベクターにおいては、（２３）（２２）記載のDNA配列を含むベクターである
ことを特徴とする。

【００２８】また、本発明のベクターにおいては、（２４）発現ベクターである、（２３）記載のベクター
であることを特徴とする。

【００２９】また、本発明の宿主細胞においては、（２５）（２２）記載のDNA配列または（２３）もしく
は（２４）記載のベクターにより形質転換された宿主細
胞であることを特徴とする。

【００３０】また、本発明の調製方法においては、（２６）（２５）記載の宿主細胞が適当な培養条件下で
培養され、該宿主細胞または培地から当技術分野で公知
の方法によりフィターゼが単離される、（１２）から
（２１）のいずれか一項に記載のフィターゼを調製する
方法であることを特徴とする。

【００３１】また、本発明の組成物においては、（２７）（１２）から（２１）のいずれか一項に記載の
フィターゼを含む、食料または飼料組成物であることを
特徴とする。

【００３２】

【発明の実施の形態】本発明は、 i) 以下の段階を実施することを特徴とする、改良され
た活性特性を有する修飾フィターゼの生産方法を提供す
る。

【００３３】a) アスペルギルス・ニガー（Aspergillus
niger）（フィクウム（ficuum））のフィターゼの3次
元構造を基にして、修飾するフィターゼ、および選択的
に、修飾するフィターゼの活性特性よりも好都合な活性
特性を有する別のフィターゼの3次元構造を、コンピュ
ータでモデル化する段階； b) 修飾するフィターゼと、より好都合な活性特性を有
する別のフィターゼとの活性部位の構造を比較し、両方
の活性部位において異なるアミノ酸残基を同定する段
階； c) 両方の活性部位で異なる少なくとも1つのアミノ酸を
コードするヌクレオチドを変化させることにより、修飾
フィターゼをコードするDNA配列を構築する段階； d) 適当な宿主細胞において発現する能力を有するベク
ターに該DNA配列を組み込む段階； e) c)のDNA配列またはd)のベクターにより適当な宿主細
胞を形質転換し、該宿主細胞を適当な増殖条件下で増殖
させ、当技術分野で公知の方法により、宿主細胞または
培地から修飾フィターゼを単離する段階。

【００３４】また、本発明は、 ii) i)に説明される方法であって、修飾されるフィター
ゼが真核生物由来、好ましくは菌類、さらに好ましくは
例えばアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumi
gatus）のようなコウジカビ属(Aspergillus)由来であ
る方法、または iii) i)もしくはii)に説明される方法であって、より好
都合な活性特性を有するフィターゼが真核生物由来、好
ましくは菌類、さらに好ましくは例えばアスペルギルス
・ニガー（Aspergillus niger）またはアスペルギルス
・テレウス（Aspergillus terreus） (アスペルギルス
・テレウス cbs 116.46または9A1）のようなコウジカビ
属由来である方法、または iv) i)、ii)、もしくはiii)に説明される方法であっ
て、修飾されるフィターゼがアスペルギルス・フミガツ
ス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼであり、よ
り好都合な活性特性を有するフィターゼがアスペルギル
ス・テレウス（Asperigillus terreus）のフィターゼも
しくはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）
のフィターゼである方法、を提供する。

【００３５】これに関連して、改良された特性を有する
フィターゼを生産する別の可能性は、例えばアスペルギ
ルス・フィクウム（Aspergillus Ficuum）のような、同
じ生物であるが天然に見つかり任意の既知の寄託機関に
よって寄託されている異なる株から、フィターゼを単離
することである。そのアミノ酸配列は、例えば欧州特許
出願第(EP) 684 313号に記載されているような方法によ
って、対応するDNA配列をクローニングすることにより
決定できる。一旦そのような配列が決定されれば、アス
ペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィター
ゼの3次元構造を基にしてそのモデルを作製することが
でき、両方の配列の活性部位を比較してそのフィターゼ
が改良された活性特性（実施例8参照）を有するか否か
を調べるか、または両方の活性部位の配列を直接比較し
て本出願に記載されるアッセイにより上昇および／また
は改良された活性を有するか否かを試験することができ
る。

【００３６】さらに、本発明は、上記の方法によって得
られる修飾フィターゼを提供する。一般的に、非修飾フ
ィターゼの活性特性よりも好都合な活性特性を有するよ
うに修飾されたフィターゼ、具体的には非修飾フィター
ゼのアミノ酸配列が1つまたは複数の欠失、置換、およ
び／または付加により変更されたフィターゼ、さらに具
体的にはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus nige
r）（図1参照）のフィターゼのアミノ酸配列の以下の位
置：27、66、71、103、140、141、188、205、234、23
5、238、274、277、282、340および／または424、好ま
しくは27、66、140、205、274、277、282および／また
は340のうちの１つに相同な少なくとも１つの位置にお
いて改変されたフィターゼ、またさらに具体的には真核
生物、好ましくは菌類、さらに好ましくはコウジカビ
属、最も好ましくはアスペルギルス・フミガツス（Aspe
rgillus fumigatus）由来であるフィターゼを提供す
る。

【００３７】さらに、本発明は、位置27に変化が生じて
いる、または少なくとも位置27に変化が生じているフィ
ターゼ、好ましくは位置27のアミノ酸が a) Ala、Val、Leu、Ile；または b) Thrまたは c) Asn；の群のうちの１つから選択されるアミノ酸によ
って置換されているフィターゼ、ならびに位置27に加え
て位置66でもさらに変化が生じているフィターゼ、また
は位置27に加えて位置140および／もしくは位置274およ
び／もしくは277でも変化が生じているフィターゼを提
供する。

【００３８】また、本発明は、以下の変異：Q27L、Q27
N、Q27T、Q27I、Q27V、Q27A、Q27G、S66D、S140Y、D141
G、A205E、Q274L、G277D、G277K、Y282Hおよび／または
N340Sのうちの少なくとも1つを特徴とする上述のフィタ
ーゼを提供する。

【００３９】さらに、本発明は、菌類、好ましくはコウ
ジカビ属、最も好ましくはアスペルギルス・ニガー（A.
niger）（フィクウム（ficuum））由来のプロテアーゼ
による分解に対して抵抗性であるフィターゼ変異蛋白質
を提供する。そのような変異蛋白質は、少なくとも以下
の位置（アスペルギルス・ニガーのアミノ酸配列の相同
位置を指す）、すなわち、好ましくはアスペルギルス・
フミガツス（A. fumitatus）のフィターゼの位置130ま
たは129と130、または好ましくはアスペルギルス・ニー
ドランス（A. nidulans）のフィターゼのアミノ酸配列
の167、168のうちの1つにおいて、野生型に存在するア
ミノ酸が、プロテアーゼ感受性を変化させることが知ら
れている別のアミノ酸で置き換えられていることを特徴
とする。例えば、アスペルギルス・フミガツス（A. fum
igatus）の場合には位置130で「S」から「N」、および
位置129で「R」から「L」に、アスペルギルス・ニード
ランス（A. nidulans）の場合には位置167で「K」から
「G」、および位置168でRからQに置換されている。該位
置は、改良された活性特性を提供する位置と組み合わせ
ることもできる。

【００４０】これに関連して、「改良された活性特性」
とは、非変異フィターゼと比較した変異フィターゼの活
性におけるあらゆる種類の改良を意味する。これは、例
えば、欧州特許第684 313号などのようにフィターゼの
活性を測定するために当技術分野で周知のアッセイまた
は本出願の実施例に記載されるアッセイにおけるより高
い比活性、好ましくは少なくとも2倍またはより好まし
くは少なくとも3〜4倍高い比活性を意味する。さらに、
これは当技術分野で周知のアッセイまたは例えば本発明
の特定の実施例に記載されるアッセイによって決定され
る、異なる基質特異性を意味する。これは、当技術分野
で周知のアッセイ、または例えば本発明の実施例に記載
されるアッセイによって決定される、より好都合な異な
るpHにおける最大比活性または広範囲の至適pH（改良さ
れたpHプロフィール）をも意味する。最後に、これは該
特性の任意の組み合わせをも意味する。

【００４１】本発明における「相同」とは、修飾するフ
ィターゼおよびアスペルギルス・ニガーのフィターゼの
一次構造、好ましくは二次構造、最も好ましくは三次構
造が最も適合することを意味する。どのようにして最大
の適合性が得られるかは、本発明の実施例１に詳細に説
明されている。図１は、アスペルギルス・ニガー（A.ni
ger）のアミノ酸配列に基づき整列させた、アスペルギ
ルス・フミガツス（A.fumigatus）およびアスペルギル
ス・テレウス（A. terreus）のフィターゼのアミノ酸配
列に関する最大の適合性の例であり、また、アスペルギ
ルス・ニガーの配列は他の配列、例えば上記の配列の位
置を言及するときの参照として用いられる。さらに、Q2
7L変異を有するアスペルギルス・フミガツスの修飾フィ
ターゼは、上記に定義されるように指定した27の位置
（実際にはアスペルギルス・フミガツスのアミノ酸配列
の位置23である）において、天然に生じるグルタミン
（「Q」とは標準UPACの１文字のアミノ酸記号を表す）
が、ロイシン（「L」）で置換されていることを意味す
る。本発明のすべての変異蛋白質は、プロテアーゼ抵抗
性変異蛋白質であるか改良された活性特性を有する変異
蛋白質であるかにかかわらず、このように表示されてい
る。

【００４２】さらに、本発明は、上述のフィターゼをコ
ードするDNA配列を含むDNA配列、該DNA配列を含むベク
ター、好ましくは発現ベクター、該DNA配列またはベク
ターにより形質転換された宿主細胞、上述の宿主細胞が
適当な培養条件下で培養され、該宿主細胞または培地か
ら当技術分野で周知の方法によりフィターゼが単離され
る、本発明のフィターゼの調製方法、および本発明のフ
ィターゼを含む食物または飼料組成物を提供する。

【００４３】また、これに関連して、本発明は、本発明
の特異的変異を少なくとも１つ有し、標準的条件で本発
明の特定の修飾フィターゼのDNA配列にハイブリダイズ
するDNA配列、または遺伝コードの縮重のためにハイブ
リダイズはしないが、それがハイブリダイズしないDNA
配列によってコードされているものと全く同じアミノ酸
配列を有するポリペプチドをコードするDNA配列、また
は該DNA配列の断片であり元のポリペプチドの活性特性
を維持しているDNA配列を提供する。

【００４４】これに関連して、ハイブリダイゼーション
の「標準的条件」とは、当業者が特異的ハイブリダイゼ
ーションシグナルを検出するために一般的に使用し、例
えば[サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニン
グ（Molecular Cloning）」第2版、コールドスプリング
ハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Lab
oratory Press） 1989、NY]に記載されているような条
件、または当業者に周知で例えば[サムブルック（Sambr
ook）ら(s.a.)]に記載されている、好ましくはいわゆる
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび非ス
トリンジェントな洗浄条件、またはより好ましくはいわ
ゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび
ストリンジェントな洗浄条件を意味する。

【００４５】さらに、本発明は、特異的に記述された本
発明のDNAに基づいて設計されたPCRプライマーを用いた
いわゆるポリメラーゼ連鎖反応法（「PCR」）によって
得られるDNA配列を提供する。このようにして得られたD
NA配列は、その設計の由来するフィターゼと少なくとも
同一の変異を有し、それと同等の活性特性を有するフィ
ターゼをコードすると理解される。

【００４６】ポリメラーゼ連鎖反応法（「PCR」）の原
理は、例えば[ホワイト（White）ら、Trends in Geneti
cs, 5,185〜189 (1989)]に概説されており、改良法は例
えばイニス（Innis）らによって記載されている（PCRプ
ロトコール：方法と応用の手引き（PCR Protocols: A g
uide to Methods and Applications）、Academic Pres
s, Inc. (1990)）。

【００４７】本発明のDNA配列は、当技術分野で周知
の、フィターゼをコードするゲノムまたはcDNA配列を開
始材料として構築できる（配列情報に関しては、例えば
欧州特許第684 313号などの上述の参照、または例えばG
enbank (Intelligenetics、米国カリフォルニア）、Eur
opean Bioinformatics Institute (ヒンストンホール、
英国ケンブリッジ）、NBRF (ジョージタウン大学メディ
カルセンター、米国ワシントンDC）、およびVecbase
（ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、米
国ウィスコンシン州マジソン）のような配列データベー
ス、またはインビトロ変異誘発の方法の図に開示されて
いる配列［例えばSambrookら、「分子クローニング（Mo
lecular Cloning）」、Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York］を参照のこと。最初にハチンソン
（Hurchinson）およびエジェル（Edgell） [J. Virol.
8, 181 (1971)]に概説された「部位特異的突然変異誘発
法」は、所望のヌクレオチド置換を有する合成オリゴヌ
クレオチドを、変異を誘発する一本鎖DNA配列の標的領
域にアニーリングさせることを含む［総説はSmith, Ann
u. Rev. Genet. 19, 423 (1985)、改良法はStanssen
ら、Nucl. Acid Res., 17, 4441〜4454 (1989)の参考文
献2〜6を参照］。所定のDNA配列に変異を誘発する可能
性で本発明の実施のためにやはり好ましいものは、ポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）を使用する変異誘発である。
開始材料とするDNAは、当技術分野で周知であり、例え
ばサムブルック（Sambrook）ら(Molecular Cloning)に
記載されている方法に従い各株から単離することができ
る。株に関する情報については、例えば欧州特許第684
313または任意の下記の寄託機関を参照のこと。アスペ
ルギルス・ニガー（Aspergillus niger）[ATCC 9142]、
ミセリオフルトラ・サーモフィラ（Myceliophthora the
rmophila）[ATCC 48102]、タラロミセス・サーモフィル
ス（Talaromyces thermophilus）[ATCC 20186]およびア
スペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）
[ATCC 34625]は、ブダペスト条約の規定に従って1997年
3月14日にアメリカンタイプカルチャー細胞コレクショ
ン（American Type Culture Cell Collection）に各々
以下の受諾番号で寄託されている：ATCC 74337、ATCC 7
4340、ATCC 74338、およびATCC 74339。しかし、本発明
に従って変異を誘発するフィターゼをコードするDNA
は、例えば図１０〜１２に示されるように合成法によ
り、および例えば欧州特許第747 483に記載されるよう
な周知の方法を用いて既知のDNA配列に基づいて調製す
ることもできる。

【００４８】一旦本発明の完全なDNA配列が得られれ
ば、これを当技術分野で周知の、例えば[サムブルック
（Sambrook）ら(s.a.)]に記載されている方法によって
ベクターに組み込み、適当な宿主系において、コードさ
れているポリペプチドを過剰発現させることができる。
しかし、DNA配列自身を使って本発明の適当な宿主系を
形質転換し、コードされるポリペプチドを過剰発現させ
ることができることも当業者には周知である。適当な宿
主系の例は、例えばアスペルギルス・ニガー（A. nige
r）[ATCC 9142]もしくはアスペルギルス・フィクウム
（A. ficuum）[NRRL 3135]などのコウジカビ属（Asperg
illus）または例えばトリコデルマ・レーゼイ（Trichod
erma reesei）などのトリコデルマ（Trichoderma）のよ
うな菌類、または例えばサッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母菌、ピヒア・
パストリス（Pichia pastoris）などのピヒア属、もし
くは例えばハンゼヌラ・ポリモルファ（H. polymorph
a） (DSM5215)などのハンゼヌラ・ポリモルファ（Hanse
nula polymorpha）のような酵母である。微生物は例え
ばアメリカンタイプカルチャーコレクション（American
Type Culture Collection） (ATCC)、Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS)、またはDeutsche Sammlu
ng fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSN)
などの寄託機関、または雑誌Industrial Property [(19
91) 1, 29〜40]に記載されている他の任意の寄託機関か
ら入手できることは、当業者には周知である。使用でき
る細菌は、例えば大腸菌、例えば枯草菌のようなバチル
ス属(Bacillus)、または例えばストレプトミセス・リビ
ダンス（Streptomyces lividans）のようなストレプト
ミセス属(Streptomyces)である（例えばAnneおよびMall
aert、FEMS Microbiol. Letters 114, 121(1993)参
照）。使用できる大腸菌は、例えばM15［Villarejoら、
J. Bacteriol. 120, 466〜474 (1974)にDZ291として記
載］などのK12株、HB101 [ATCC 33694]、またはSG13009
[Gottesmanら、J. Bacteriol. 148, 265〜273 (1981)]
である。

【００４９】菌類における発現に使用できるベクターは
当技術分野で周知であり、例えば欧州特許第420 358
号、またはクレン（Cullen）ら[Bio／Technology 5, 36
9〜376(1987)]または[糸状菌の分子工業菌類学、システ
ムおよび応用の手引き（Ward in Molecular Industrial
Mycology, Systems and Applications for Filamentou
s Fungi）, Marcel Dekker, New York(1991)]、アップ
シェル（Upshall）ら、[Bio／Technology 5, 1301〜130
4 (1987)]、グウィン（Gwynne）ら[Bio／Technology 5,
71〜79 (1987)]、プンツ（Punt）ら[J. Biotechnol. 1
7, 19〜34 (1991)]、および酵母に関してはスリークニ
シュナ（Sreekrishna）ら[J. Basic Microbiol. 28, 26
5〜278 (1988), Biochemistry 28, 4117〜4125 (198
9)]、ハイツゼルマン（Hitzemann）ら[Nature 293, 717
〜722 (1981)]または欧州特許第183 070号、欧州特許第
183 071号、欧州特許第248 227号、欧州特許第263 311
号に記載されている。大腸菌における発現に使用できる
適当なベクターは、例えば[Sambrookら(s.a.)]、または
フライヤー（Fiers）ら、Procd. 8th Int. Biotechnol
ogy Symposium [Soc. Franc. de Microbiol., Paris（D
urandら編）、680〜697頁(1988)]またはブヤード（Buja
rd）ら、Methods in Enzymology、ウ（Wu）およびグロ
スマン（Grossmann）編、Academic Press, Inc. Vol.15
5, 416〜433 (1987)およびステューバー（Stuber）ら、
Immunological Methods、レフコビッツ（Lefkovits）お
よびペルニス（Pernis）編、Academic Press, Inc., Vo
l. IV, 121〜152 (1990)に記載されている。バチルス属
における発現に使用できるベクターは当技術分野で周知
であり、例えば欧州特許第405 370号、ヤンシュラ（Yan
sura）およびヘンナー（Henner）の[Procd. Natl. Aca
d. Sci. USA 81, 439 (1984)、Meth. Enzymol. 185, 19
9〜228 (1990)]、または欧州特許第207 459号などに記
載されている。H. Polymorphaにおける発現に使用でき
るベクターは当技術分野で周知であり、例えば[ゲリセ
ン（Gellissen）ら、Biotechnology 9, 291〜295 (199
1)]などに記載されている。

【００５０】そのようなベクターは、例えばプロモータ
ーのような調節要素をすでに有しているか、または本発
明のDNA配列をそのような要素を含むように操作するこ
とができる。使用できる適当なプロモーター要素は当技
術分野で周知であり、例えば、 Trichoderma reeseiで
はcbh1プロモーター［Haarkiら、Biotechnology 7, 596
〜600 (1989)］またはpki1プロモーター［Schindler
ら、Gene 130, 271〜275 (1993)］、Aspergillus oryza
eではamyプロモーター［Christensenら、Abstr. 19th L
unteren Lectures on Molecular Genetics F23 (198
7)、 Christensenら、Biotechnology 6, 1419〜1422 (1
988)、Tadaら、Mol. Gen. Genet.229, 301 (1991)］、
アスペルギルス・ニガーではglaAプロモーター［Cullen
ら、Bio／Technology 5, 369〜376 (1987)、Gwynneら、
Bio／Technology 5, 713〜719 (1987)、糸状菌の分子工
業菌類学、システムおよび応用の手引き（Ward in Mole
cular Industrial Mycology, Systems and Application
s for Filamentous Fungi）、 Marcel Dekker, New Yor
k, 83〜106 (1991)］、alcAプロモーター［Gwynneら、
Bio／Technology 5, 718〜719 (1987)］、suc1プロモー
ター［Boddyら、Curr. Genet. 24, 60〜66 (1993)］、a
phAプロモーター［MacRaeら、Gene 71, 339〜348 (198
8)、MacRaeら、Gene 132, 193〜198 (1993)］、tpiAプ
ロモーター［McKnightら、Cell 46, 143〜147 (1986)、
Upshallら、Bio／Technology 5, 1301〜1304 (198
7)］、gpdAプロモーター［Puntら、Gene 69,49〜57 (19
88)、Puntら、J. Biotechnol. 17, 19〜37 (1991)］、
およびpkiAプロモーター［de Graaffら、Curr.Genet. 2
2, 21〜27 (1992)］である。酵母での発現に使用できる
適当なプロモーター要素は当技術分野で周知であり、例
えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）においてはpho5プロモーター［Vogelら、Mo
l. Cell. Biol., 2050〜2057 (1989); RudolfおよびHin
nen, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1340〜1344 (198
7)］またはgapプロモーター、ピヒア・パストリス（Pic
hiapastoris）においては例えばaox1プロモーター［Kou
tzら、Yeast 5, 167〜177(1989); Sreekrishnaら、J. B
asic Microbiol. 28, 265〜278 (1988)］またはFMDプロ
モーター［Hollenbergら、欧州特許出願第0299108
号］、またはH. polymorphaではMOXプロモーター［Lede
boerら、Nucleic Acids Res. 13, 3063〜3082 (1985)］
である。

【００５１】従って、本発明のDNA配列を含むベクタ
ー、好ましくは細菌または菌類または酵母の宿主におい
て該DNA配列を発現させるためのベクター、およびかか
る形質転換された細菌または菌類または酵母の宿主も本
発明により提供される。

【００５２】一旦DNA配列が適当な宿主細胞において適
当な培地中で発現されると、コードされているフィター
ゼは、フィターゼが培地中に分泌される場合には培地か
ら、該フィターゼが細胞内に存在する場合には宿主生物
体から、蛋白質精製の技術分野で周知の方法により、ま
たは例えば欧州特許第420 358号に記載されているよう
にして単離することができる。したがって、上述のよう
に形質転換された細菌または宿主細胞を適当な培養条件
下で培養し、それからポリペプチドを回収することを特
徴とする本発明のポリペプチド調製方法、および該方法
によって生産されるポリペプチドまたは本発明のDNA配
列にコードされるポリペプチドも、本発明により提供さ
れる。

【００５３】本発明のフィターゼは、例えば[ペン（Pe
n）ら、Bio／Technology 11, 811〜814 (1994)]または
欧州特許第449 375号に記載されている方法にしたがっ
て、好ましくは例えば欧州特許第449376号に記載されて
いるように、種子において植物中で発現させることもで
きる。

【００５４】例えば、本発明のフィターゼをコードする
DNA配列を、ブラシカ・ナプス（Brassica napus）由来
の12S貯蔵蛋白質クルシフェリンをコードする遺伝子由
来の調節配列の制御下に置くことができる。その後、こ
の構築物をpMOG23（大腸菌K-12株DH5α中、オランダBaa
rnのCentraal Bureauvoor Schimmelculturesに受諾番号
CBS 102.90として寄託）のようなバイナリーベクターに
サブクローニングする。このベクターを無力化したTiプ
ラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）に導入する。この構築
物を含む細菌細胞を、タバコまたはアブラナ由来の組織
と共培養し、形質転換した植物細胞を抗生物質を含む栄
養培地によって選択し、そのような培地上で再生して植
物に分化するように誘導する。結果として得られる植物
は、DNA構築物を含み発現する種を生産する。または、
フィターゼをコードするDNA配列をカリフラワーモザイ
クウイルス(CaMV)の35Sプロモーター由来の調節配列の
制御下に置くことができる。その後、この構築物をバイ
ナリーベクターにサブクローニングする。それから、こ
のベクターを無力化したTiプラスミドを含むアグロバク
テリウム・ツメファシエンスに導入する。この構築物を
含む細菌細胞を、タバコまたはアブラナ由来の組織と共
培養し、形質転換した植物細胞を抗生物質を含む栄養培
地によって選択し、そのような培地上で再生して植物に
分化するように誘導する。結果として得られる植物は、
構成的にDNA構築物を含み発現する。

【００５５】フィターゼを含む植物体または植物体の一
部は、飼料組成物の調製に直接用いたり、または当技術
分野で周知の方法によって植物体または植物器官から抽
出したりできる。したがって、本発明のフィターゼを植
物体または種子のような植物器官で生産する方法、該方
法で生産されるフィターゼ、形質転換された植物体およ
び種子自体のような植物器官も、本発明により提供され
る。

【００５６】本発明のポリペプチドが一旦得られれば、
農業において有用となる特性に関して解析することがで
き、本技術分野で周知の、例えばシモンズ（Simons）
ら、［Br. J. Nutr. 64, 525-540 (1990)］、ショーナ
ー（Schoner）ら［J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr.
66, 248-255 (1991)］、ボグト（Vogt）［Arch. Geflug
elk. 56, 93-98 (1992)］、ジョングブロイド（Jongblo
ed）ら［J. Anim. Sci.,70,1159-1168 (1992)］、パー
ニー（Perney）ら［Poultry Sci. 72, 2106-2114(199
3)］、ファレル（Farrell）ら［J.Anim. Physiol. a An
im. Nutr. 69, 278-283 (1993)］、ブロツ（Broz）ら
［Br. Poultry Sci. 35,273-280 (1994)］およびダンゲ
ルホエフ（Dungelhoef）ら［Animal Feed Sci. Techno
l. 49, 1-10 (1994)］により記述されている任意のアッ
セイが使用できる。

【００５７】一般に、本発明のポリペプチドは、フィチ
ン酸のようなイノシトールポリリン酸をイノシトールと
無機リン酸とに変換するための特定の応用分野に限定す
ることなく、使用できる。

【００５８】さらに本発明のポリペプチドは、組成物の
成分が１つまたは複数の本発明のポリペプチドと混合さ
れた合成食料または飼料の調製方法に使用できる。した
がって、本発明により、1つまたは複数の本発明のポリ
ペプチドを含む合成食料または飼料も提供される。当業
者は調製方法を熟知している。さらに該合成食料または
飼料には、そうした目的に一般的に使用される当技術分
野で公知の添加物または成分が含まれうる。

【００５９】飼料中に含まれるフィチン酸をイノシトー
ルおよび無機リン酸に変換するために有効な量の飼料組
成物を動物に与えることを特徴とする、動物肥料中のフ
ィチン酸量を低下させる方法も本発明により提供され
る。

【００６０】

【実施例】

実施例１．アスペルギルス・フミガツス（A. fumigatu
s）およびアスペルギルス・テレウス（A. terreus）cbs
116.46フィターゼの相同性モデリングアスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]（図1参照）
およびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼ
（図１参照）のアミノ酸配列を、3次元構造がX線結晶解
析により決定されているアスペルギルス・ニガー（A. n
iger）（フィクウム（ficuum））フィターゼ（図1参
照）と比較した。結晶学データは図１６〜５７に示され
ている。

【００６１】アスペルギルス・ニガー（フィクウム）フ
ィターゼ、アスペルギルス・フミガツスフィターゼお
よびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼの
アミノ酸配列を、「PILEUP」プログラム（ウィスコンシ
ンパッケージ用プログラムメニュー、バージョン８、19
94年9月、ジェネティクスコンピュータグループ、53711
米国ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ57
5）によって計算して整列させた。アスペルギルス・フ
ミガツスフィターゼおよびアスペルギルス・テレウス c
bs116.46フィターゼの3次元モデルは、アスペルギルス
・ニガー（フィクウム）フィターゼの構造を鋳型として
使用し、各々アスペルギルス・フミガツスおよびアスペ
ルギルス・テレウス cbs116.46フィターゼの整列させた
アミノ酸配列に従ってアスペルギルス・ニガー（フィク
ウム）フィターゼのアミノ酸を交換して構築した。モデ
ルの構築とエネルギーの最適化は、Moloc (Gerber, P.
およびMuller, K. (1995) Moloc molecular modeling s
oftware. J. Comput. Aided Mol. Des. 9, 251〜268)プ
ログラムを用いて行った。新しい挿入／欠失および活性
部位から離れたループの位置を除き、C-α位置は固定し
た。

【００６２】外部ループでは、モデル化された構造と元
の結晶構造との差はわずかしか観察されなかった。さら
に、シュードモナス属(Pseudomonas)の細菌のフィター
ゼおよび、決定されている限りでアスペルギルス・ニガ
ー（フィクウム）フィターゼ（Cosgrove, D.J. (1980)
イノシトールリン酸-その化学、生化学および生理学：
有機化学の研究、第4章（Inositol phosphates - their
chemistry, biochemistry and physiology: studies i
n organic chemistry, chapter 4） ElsevierScientifi
c Publishing Company, Amsterdam, Oxford, New Yor
k；図１）による、フィチン酸（ミオイノシトール-ヘキ
サキスホスフェート）の分解経路で主に発生する異なる
基質を作製し、各フィターゼ構造の活性部位の穴に入れ
た。これらの基質はすべて、ヒスチジン酸ホスファター
ゼに関して提唱されている推測上の結合モードの方向(V
an Etten, R.L. (1982) Human prostatic acid phospha
tase: a histidine phosphatase. Ann. NY Acad. Sci.
390, 27〜50)に合わせた。容易に開裂できるリン酸基
は、触媒作用に必須のHis 59の方向に向き、共有結合に
よりリン酸化酵素中間体を形成する。開裂後にAsp 339
によりプロトン付加される基質のリン酸エステル結合
は、プロトンの供与体の方向を向く。基質およびこれを
取り巻く活性部位の残基の残りの構造部分の構造的緩和
は、Molocプログラムを用いてエネルギーの最適化によ
って行った。

【００６３】構造モデルに基づいて、活性部位の穴に向
かう残基を同定した。これらの位置の半分以上（60％）
がこれら３つのフィターゼ間で同一であり、ごく少数の
位置のみが保存されていなかった（図１参照）。この観
察結果は別の4つのフィターゼ配列(アスペルギルス・ニ
ードランス（A. nidulans）、アスペルギルス・テレウ
ス（A. terreus）9A1、タラロミセス・サーモフィルス
（Talaromyces thermophilus）、ミセリオフトラ・サー
モフィラ（Myceliophthora thermophila）)にも当ては
まった。

【００６４】好都合な酵素-基質相互作用を含め、配列
の整列と構造情報から得られた結果を組み合わせ、表１
に示すような変異分析を行う位置を決定した。

【００６５】実施例２．プラスミドpUC18-AfumgDNAおよ
びpUC18-AfumcDNAの構築下記のすべてのアスペルギルス・フミガツス（A. fumig
atus）変異蛋白質の基礎となる構築物である、プラスミ
ドpUC18-AfumgDNAおよびpUC18-AfumcDNAは、以下のよう
にして構築した。

【００６６】pUC18-AfumgDNA：「エキスパンド・ハイフ
ィデリティPCRキット(Expand(登録商標) High Fidelity
PCR Kit)」（Boehringer Mannheim社、ドイツ、マンハ
イム）を使用し、プライマー#39および#40（図１０〜１
２に示すゲノム配列を元にデザインした）およびλFixI
Iベクター［Stratagene社、92037米国カリフォルニア州
ルゴラ；カタログ番号946055］のアスペルギルス・フミ
ガツス（NIHストック5233）ゲノムライブラリー由来の
アスペルギルス・フミガツス [ATCC13073]ゲノムDNAを
用いたPCRにより、アスペルギルス・フミガツスのフィ
ターゼ遺伝子のゲノムDNA配列を得た。プライマー#39：プライマー#40 反応液には、各プライマーが10 pmolずつおよび鋳型DNA
が200 ng含まれていた。以下のサイクル値で35ラウンド
の増幅を行なった：95℃、１分／56℃、１分／72℃、９
０秒。PCR増幅したアスペルギルス・フミガツス変異蛋
白質遺伝子は、ATG開始コドンのところに、プライマー#
39によって導入された新しいBspHI部位を有し、その結
果2番目のアミノ酸がバリンからイソロイシンに変化し
た。さらに、遺伝子のTGA終止コドンの下流に、プライ
マー#40によってEcoRV部位が作られた。

【００６７】その後、「シュアクローンキット(sure cl
one Kit)」（Boehringer Mannheim社 s.a. )を用いて製
造元の推奨する方法により、PCR断片（約1450 bp）をpU
C18のSmaI部位にクローニングした。この結果得られた
プラスミドをpUC18-AfumgDNAと命名した。

【００６８】pUC18-AfumcDNA：このプラスミドはアスペ
ルギルス・フミガツスフィターゼ遺伝子のイントロン
（図１０〜１２の文字の小さな間隙）を持たず、図６３
に概説される方法で構築した。簡単に述べると、プライ
マーFum28およびFum11を用いてエキソン2の5’末端をPC
R（以下参照）により増幅し、NcoIおよびEagI（プライ
マーFum28により導入された新しい制限酵素切断部位）
により消化し、プライマーFum26およびFum27を含みエキ
ソン1をコードするリンカーと共に、pUC18-AfumgDNAのX
baIおよびNcoI部位に連結し、これによってプラスミドp
UC18-AfumcDNAを得た。

【００６９】アスペルギルス・フミガツス（A. fumigat
us）フィターゼのエキソン2の5’末端を得るためのPCR
反応： 2 μl 鋳型：pUC18-AfumgDNA (20 ng) 1 μl dNTP混合物（Boehringer Mannheim社s.a.） 5 μl 10x 緩衝液 1 μl Taqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim社s.a.） 1.9 μl Fum11 (=10 pmol) 2 μl Fum28 (=10 pmol) 37.1 μl H₂O 以下の温度設定で合計35サイクル実行した：95℃で30
秒／56℃で30秒／72℃で45秒。増幅された断片（約330
bp）を等量のフェノール／クロロフォルム(1:1)で1回抽
出した。回収された水相に、0.1倍量の3 M酢酸ナトリウ
ム、pH 4.8および2.5倍量のエタノールを添加した。反
応液を12000 gで10分間遠心し、沈殿を20μlのH₂Oに再
懸濁した。その後、精製された断片をNcoIおよびEagIで
消化し、以下のように処理した。

【００７０】実施例３．アスペルギルス・ニガー（A. n
iger）における発現のためのアスペルギルス・フミガツ
ス（A. fumigatus）フィターゼ変異蛋白質の構築アスペルギルス・ニガーで発現するためのすべての変異
蛋白質を構築するために、プラスミドpUC18-AfumgDNAを
部位特異的突然変異誘発法の鋳型として使用した。変異
はStratagene社（米国カリフォルニア州ラホヤ）の「ク
イックエクスチェンジ部位特異的突然変異誘発キット(q
uick exchange(登録商標) site-directed mutagenesis
kit)」を使用し、製造元のプロトコールに従って、対応
するプライマー（図６４〜６７）を用いて導入した。す
べての変異は表1AおよびBにまとめられており、T1〜T7
およびN1〜N6はそれぞれ、変異蛋白質およびその位置で
置換されたアミノ酸の変異を示す。例えばT5は二重変異
を有する変異蛋白質を示し、27の位置にQの代わりにL、
274の位置にQの代わりにLを有する。変異を導入するた
めに使用したプライマーセット(A〜H）は図６４〜６６
に示されている。新しく導入されたアミノ酸は太字で示
されており、下付き文字はアスペルギルス・ニガーのア
ミノ酸配列の番号付けを用いた、成熟したアスペルギル
ス・フミガツス酵素中の位置を示す。図６８および６９
は単独の変異(T1〜T4; N1〜N3)または複数の変異(T5〜T
7; N4〜N6)を有する変異蛋白質をコードするプラスミド
pgT1〜pgT7およびpgN1〜pgN6の構築方法の概要を示す。
所望の変異を有するクローンは、当技術分野で周知のDN
A配列分析によって同定した。変異フィターゼは遺伝子
の全配列決定によって確認した。

【００７１】実施例４．サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）における発現のためのア
スペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）フィターゼ
の変異蛋白質の作製各々変異蛋白質T1〜T7およびN1〜N6をコードする、サッ
カロミセス・セレビシエにおける発現用プラスミドpcT1
〜pcT7（図７０）およびpcN1〜pcN6（図７３）の構築
は、基本的に実施例3に概説されるようにして行った。
変異を導入するための基礎となる構築物としてpUC18-Af
umgDNAを使用する代わりに、プラスミドpUC18-AfumcDNA
を使用した（図６３）。

【００７２】変異蛋白質N27、G27、V27、A27、I27およ
びT27をコードするプラスミドpcDNA-N27、-G27、-V27、
-A27、-I27および-T27は以下のようにして構築した。

【００７３】実施例３に説明されるようにして、プライ
マーセットI（図６５）を用いて、部位特異的突然変異
誘発法によりプラスミドpcT1にAvrIIのサイレント制限
酵素切断部位を導入した。その後、アスペルギルス・フ
ミガツスフィターゼ遺伝子断片AvrII／XhoIを所望の変
異を有するリンカー断片で置換した（図７２）。各リン
カー断片は合成ポリヌクレオチドの各々の対（図６７；
センスおよびアンチセンス鎖；各90 ng）を9 μlの蒸留
水中で70℃で3分間アニーリングして作製した。

【００７４】アスペルギルス・フミガツス Q27L-S66Dの
二重変異およびアスペルギルス・フミガツス Q27L-S140
Y-D141Gの三重変異をコードするプラスミドpcT1-S66Dお
よびpcT1-S140Y-D141Gの構築は、基本的に実施例3に記
載されるようにして実行した。Q27Lをコードする変異を
有するプラスミドpcT1は、対応するプライマーセットJ
およびKと共に、部位特異的突然変異誘発法の鋳型とし
て使用した（図６４〜６７）。

【００７５】すべての変異は遺伝子全体のDNA配列分析
により確認した。

【００７６】実施例５．アスペルギルス・ニガー（A. n
iger）における発現上記アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼおよ
び変異蛋白質をコードする遺伝子は、プラスミドpgDNAT
1〜pgDNAT7およびpgDNAN1〜pgDNAN6からBspHIおよびEco
RVによって単離し、アスペルギルス・ニガーのグルコア
ミラーゼプロモーター(glaA)の下流のNcoI部位およびア
スペルギルス・ニードランストリプトファンCターミネ
ーター(trpC)の上流のEcoRV部位（Mullaney, E.J., J.
E. Hamer, K.A. Roberti, M.M. Yelton, and W.E. Timb
erlake. 1985. Primary structure of the trpC gene f
rom Asperigillus nidulans. Mol. Gen.Gent. 199:37〜
45）に連結した。この結果得られる発現プラスミドは、
さらに選択マーカーとしてアカパンカビ（Neurospora c
rassa）のオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺
伝子(pyr4)を有していた。図７４は変異蛋白質T1をコー
ドする遺伝子を有する、そうしたプラスミドの例を示す
（Van den Hondel, C.A.M.J.J., P.J. Punt,and R.F.M
van Gorcom. 1991、糸状菌における異種遺伝子発現（He
terologousgene expression in filamentous fungi）、
続・菌類の遺伝子操作（More gene manipulations in fu
ngi）396〜428頁より、Bennett, J.W. and Lasure, L.
L.（編）Academic Press Inc., San Diego, CA）。上述
の基本的な発現プラスミドは、欧州特許第684 313号の
実施例9に説明されるpGLACベクターに基本的に対応す
る。アスペルギルス・ニガーの形質転換と変異蛋白質の
発現は、欧州特許第684313号に記載されるようにして行
った。

【００７７】上清をAmicon 8400セル（PM30メンブレ
ン）の限外濾過およびウルトラフリー15(ultrafree-15)
遠心フィルター装置（Biomax-30K、Millipore社）によ
って濃縮した。

【００７８】濃縮物（通常1.5〜5 ml）を1.5 mlに分割
し、10 mM酢酸ナトリウムpH 5.0を溶出緩衝液としてフ
ァーストデソルティング(Fast Desalting) HR 10／10カ
ラム（Pharmacia Biotech社）で脱塩した。脱塩したア
スペルギルス・フミガツス試料を1.7 ml ポロス(Poros)
HS／M陽イオン交換クロマトグラフィーカラム(PerSept
ive Biosystems社、米国マサチューセッツ州フラミンガ
ム）に直接かけた。アスペルギルス・テレウス cbs 11
6.46 [CBS 220.95]フィターゼは、1.7 ml ポロス(Poro
s) HQ／M陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに直接
かけた。両方とも、フィターゼは塩化ナトリウム勾配に
よって純粋な形で溶出された。

【００７９】実施例６．サッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）における発現アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼおよび上
述の異なる変異蛋白質（図７０〜７３）をコードするイ
ントロンのない遺伝子を、各プラスミドpUC18-AfumcDN
A、pcDNAT1〜pcDNAT7およびpcDNAN1〜pcDNAN6からEcoRI
およびEcoRVによって単離し、プラスミドpYES2（Invitr
ogen社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）のXhoI平
滑末端とEcoRI部位の間、またはJanesら(Janes, M., B.
Meyhack, W. Zimmermann and A. Hinnen. 1990. The i
nfluence of GAP promoter variants on hirudine prod
uction, average plasmid copy number and cell growt
hin Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 18: 97
〜103)に記述されたようにして、短くしたGAPFL（グリ
セルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモー
ターおよびPHO5ターミネーターの間にサブクローニング
した。例えばINVSc1（Invitrogen社、米国カリフォルニ
ア州サンディエゴ）などのサッカロミセス・セレビシエ
株の形質転換は、Hinnenら(Hinnen, A., J.B. Hicks an
d G.R. Fink. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1
929〜1933)に従って行った。GAPFLプロモーターの制御
下にフィターゼ遺伝子を有するシングルコロニーを選ん
で5 ml選択培地（SD-ウラシル）（Shermanら、1986）中
で30℃で1日間激しく振盪(250 rpm)して培養した。この
予備培養を500 mlのYPD培地（Sheman, J.P., Finck, G.
R.およびHicks, J.B. (1986)、酵母遺伝学における実験
室コースマニュアル（Laboratory Course Manual for M
ethods in Yeast Genetics）、Cold Spring HarborUniv
ersity Press）に添加し、同じ条件で培養した。4日後
に細胞培養液を遠心し（7000 rpm、GS3ローター、15
分、5℃）、上清を採集した。GAL1プロモーター（米国
カリフォルニア州サンディエゴInvitrogen社製のプラス
ミドpYES2）の誘導は、製造元の説明書どおりに実行し
た。変異蛋白質の精製は、実施例5(s.a.)に記載される
とおりである。

【００８０】実施例７．フィターゼ活性と基質特異性の
測定フィターゼ活性は、0.5％フィチン酸（〜5 mM）、200 m
M酢酸ナトリウムpH 5.0を含むアッセイ反応液で測定し
た。37℃で15分間インキュベートした後、等量の15%ト
リクロロ酢酸を加えて反応を停止させた。遊離したリン
酸イオンは100μlのアッセイ反応液に900 μl H₂Oおよ
び1 mlの0.6 M H₂SO₄、2%アスコルビン酸、0.5%モリブ
デン酸アンモニウムを混合して定量した。リン酸カリウ
ムの標準溶液を基準として使用した。

【００８１】至適pH曲線の場合には、精製した酵素を10
mM酢酸ナトリウムpH 5.0で希釈した。分注した希釈蛋
白質を一連の異なる緩衝液：0.4 Mグリシン／HCl、pH
2.5;0.4 M酢酸／NaOH、pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.
5; 0.4 Mイミダゾール／HCl、pH 6.0、6.5; 0.4 M Tris
／HCl、pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0中の等量の１％フ
ィチン酸(〜10 mM)と混合してインキュベーションを開
始した。対照実験では、混合段階によってpHはごくわず
かしか変化しないことが示された。インキュベーション
は上述のように37℃で15分間行った。

【００８２】野生型および変異体のアスペルギルス・フ
ミガツスフィターゼの基質特異性を決定するために、ア
ッセイ反応液中のフィチン酸を5 mM濃度の各リン酸化合
物で置き換えた。活性試験は上述のように行った。

【００８３】蛋白質濃度は、既知の蛋白質配列からDNA^*
ソフトウェア（DNASTAR社、米国ウィスコンシン州マジ
ソン）によって計算した理論的な吸光度を用いて、280
nmにおけるODから計算した。280 nmにおける吸光度1.0
ODは、アスペルギルス・フミガツスフィターゼ0.94 mg
／mlおよびアスペルギルス・テレウス cbs116.46フィタ
ーゼ0.85 mg／mlに相当する。

【００８４】アスペルギルス・フミガツス変異体T1 (Q2
7L)、T5 (Q27L、Q274L)およびT6 (Q27L、Q274L、G277D)
のpHプロフィールは、野生型アスペルギルス・フミガツ
スフィターゼと比較して、劇的に変化していた（図2参
照）。すべての変異体は同等なpHプロフィールを示し
た。アスペルギルス・フミガツスの野生型フィターゼと
比較して、pH 5.0において変異蛋白質の比活性が上昇し
ていることを表2に示す。酵素活性はpH 5.0において標
準的なアッセイ条件下で測定した。いくつかの個々の測
定値（n: アッセイ数）を平均した。

【００８５】アスペルギルス・フミガツスフィターゼ変
異体Q27AのpHプロフィールは、pH範囲ほぼ全体にわたっ
て、アスペルギルス・フミガツス野生型フィターゼのpH
プロフィールと類似している（図７５）。野生型フィタ
ーゼの比活性がpH 4.0未満のpHで低下しているのに対
し、フィターゼ変異体Q27Aの比活性はpH2.9までほぼ一
定である。

【００８６】単一アミノ酸の変更Q27L、Q27I、Q27Vまた
はQ27Tは、pH範囲全体にわたり、特にpH 5.0と7.5の間
で、比活性を著しく上昇させた（図７５）。最大値はpH
6.5で観察される。さらに、変異Q27Tは低いpH (pH 3.0
〜5.0)においてフィチン酸に対する最高の比活性を誘導
した。

【００８７】単一変異Q27GまたはQ27Nによっても、pH
2.5と7.0の間で比活性が上昇し、最大値はpH 6.0で見ら
れる（図７５）。pH 3.5未満では比活性は低下する。

【００８８】すべての単一変異は、アスペルギルス・フ
ミガツス野生型フィターゼの基質特異性と同等の、広い
基質特異性を示す（図７６）。変異体の中には、例えば
Q27T変異体のp-ニトロフェニルリン酸およびATPに対す
る活性、またはQ27G変異体のホスホエノールピルビン酸
に対する活性のように、選択された基質に対して他の変
異体よりも有意に高い比活性を示すものもあった。

【００８９】図７７に示すように、変異Q27LとS66Dとの
組み合わせ、またはS140YおよびD141Gとの組み合わせ
は、pHプロフィールを低いpHの方に移動させた。単一変
異A27Lによって得られた最大比活性は、アミノ酸の置換
を追加することでさらに上昇する。

【００９０】図3に示すように、アスペルギルス・フミ
ガツスフィターゼ変異体T1 (Q27L)は、三重変異体T6 (Q
27L、Q274L、G277D)と比較して、基質特異性には差がな
かった。

【００９１】N2を除き、変異蛋白質N1〜6のpHプロフィ
ールは、野生型フィターゼと比較して有意な差を示す
（図５９）。変異蛋白質N4のpHプロフィールは低いpH方
向に拡大しているが、変異蛋白質N3〜N6のプロフィール
は低いpH方向に移動している。変異蛋白質N5とN6は、す
でにpH 3.0で最大活性に達する。

【００９２】変異蛋白質N1〜N6では、ほぼすべての場合
において、フィチン酸を除き、試験されたすべての基質
に対して比活性がかなり低下している（図５８）。フィ
チン酸に対する比活性は、野生型フィターゼに比較して
変わりがないが、変異蛋白質N3およびN6の活性はあきら
かに高い傾向がある（図５８）。

【００９３】

【表１】A) アスペルギルス・テレウス（A. terreusu）
cbs116.46フィターゼ方向への変異 B) アスペルギルス・ニガー（A. niger）（フィクウム
（ficuum））フィターゼ方向への変異

【００９４】

【表２】

【００９５】

【表３】pH 5.0における標準的アッセイ条件下での比活
性。平均の標準偏差は10％。

【００９６】実施例８．改変された特性を有するフィタ
ーゼを入手する別の方法として、および特定の種の中で
天然に見られるフィターゼ特性の差異をよりよく理解す
るために、アスペルギルス・フミガツスフィターゼの天
然に生じる変異体を分析した。フィターゼ遺伝子をアス
ペルギルス・フミガツスの６つの異なる単離株から入手
した。2つのアスペルギルス・フミガツス単離株（ATCC
26934およびATCC 34625）由来のフィターゼのアミノ酸
配列は、野生型アスペルギルス・フミガツスフィターゼ
ATCC 13073のアミノ酸配列と違いを示さなかった。他の
3つの単離株では1つまたは2つのアミノ酸の置換が示さ
れたが、いずれも活性部位には直接影響を与えていなか
った。酵素特性は、これらの置換の影響を受けていなか
った（データは示さず）。アスペルギルス・フミガツス
(ATCC 32239)単離株のフィターゼは、もとの野生型ア
スペルギルス・フミガツスフィターゼ(ATCC 13073)と比
較して、シグナル配列において13箇所の位置において、
蛋白質の成熟した部分で51箇所の位置において違いを示
した。これらの置換のうちには、活性部位の穴の可変ア
ミノ酸に影響を与えるものもある。この結果、フィチン
酸を基質とした比活性の上昇（47 U/mg、標準酵素アッ
セイ）と、pH7（図８０）以上における酵素活性の損失
が観察された。また、この場合、フィチン酸に対する比
活性は、他の基質に対する比活性と比較して上昇してい
た（図８１）。

【００９７】実施例９．アスペルギルス・フミガツス
[ATCC 13073]フィターゼS130N単独変異、R129L-S130N二
重変異およびアスペルギルス・ニードランスフィターゼ
K167G-R168Q二重変異をコードするプラスミドpc-S130
N、pc-R129L-S130N、pc-K167G-R168Qの構築は、基本的
に実施例3に記載されるようにして実行した。プラスミ
ドpUC18-AfumcDNAは、対応するプライマーセットL、Mお
よびN（図６６；図８２）を用いた部位特異的突然変異
誘発法の鋳型として用いた。

【００９８】すべての変異は遺伝子全体のDNA配列分析
によって確認した。

【００９９】実施例１０．アスペルギルス・ニガー中で
発現し濃縮培養上清として4℃で保存すると、アスペル
ギルス・フミガツス、アスペルギルス・ニードランスの
フィターゼは蛋白質分解を受ける傾向を示した。断片の
N末端の配列決定により、切断は各々アミノ酸S130-V131
およびK167-R168またはR168-A169の間で起こったことが
示唆された。アスペルギルス・ニガー・フィターゼの立
体構造と比較すると、すべての切断部位は表面に露出し
たループ構造内にあり、したがってプロテアーゼが近付
ける部位であることが分かった。

【０１００】アスペルギルス・フミガツスフィターゼ
（S130N、R129-S130N）およびアスペルギルス・ニード
ランスフィターゼ（K167G-R168Q）のプロテアーゼ感受
性部位に、部位特異的突然変異を導入すると、蛋白質分
解に対する感受性がかなり低下した変異蛋白質が生成し
た。

【０１０１】アスペルギルス・ニガーにおける発現とは
対称的に、ハンゼヌラ・ポリモルファにおいてフィター
ゼが発現れたときには、蛋白質分解は観察されなかっ
た。

【０１０２】

【発明の効果】本発明により、改良された活性特性を有
する修飾フィターゼの生産方法が提供された。また、本
発明により、上記の方法によって得られる修飾フィター
ゼが提供された。さらに、本発明により、上述のフィタ
ーゼをコードするDNA配列を含むDNA配列、該DNA配列を
含むベクター、好ましくは発現ベクター、該DNA配列ま
たはベクターにより形質転換された宿主細胞、上述の宿
主細胞が適当な培養条件下で培養され、該宿主細胞また
は培地から当技術分野で周知の方法によりフィターゼが
単離される、本発明のフィターゼの調製方法、および本
発明のフィターゼを含む食物または飼料組成物が提供さ
れた。

【図面の簡単な説明】

【図１】アスペルギルス・ニガー（フィクウム）、ア
スペルギルス・テレウス cbs116.46およびアスペルギル
ス・フミガツス [ATCC 13073]のフィターゼの一次配列
を整列させた図である。星印は活性部位内の同一のアミ
ノ酸残基を示し、長方形は活性部位内の異なる残基を示
す。

【図２】至適pH曲線を示す図である。野生型および変
異体のアスペルギルス・フミガツスフィターゼの比活性
を、インキュベーションのpHに対して表す。黒四角はア
スペルギルス・フミガツス野生型のフィターゼ；白三角
はアスペルギルス・フミガツス Q27L変異体；黒丸はア
スペルギルス・フミガツス Q27L, Q274L変異体；白四角
はアスペルギルス・フミガツスQ27L, Q274L, G277D変異
体を表す。

【図３】野生型と変異体のアスペルギルス・フミガツ
スフィターゼの基質特異性を示す図である。(A)野生
型；(B) Q27L単一変異体；(C) Q27L, Q274L, G277D三重
変異体。以下の基質を使用した：(1)フィチン酸；(2) p
-ニトロフェニルリン酸；(3)フルクトース-1,6-ビスリ
ン酸；(4)フルクトース-6-リン酸；(5)グルコース-6-リ
ン酸；(6)リボース-5-リン酸；(7)α-グリセロリン酸；
(8)β-グリセロリン酸；(9) 3-ホスホグリセリン酸；(1
0)ホスホエノールピルビン酸；(11) AMP；(12) ADP；(1
3) ATP。

【図４】アスペルギルス・ニードランス（A. nidulan
s）フィターゼの全コード配列（１〜７００）およびコ
ードされるアミノ酸配列（１〜１６３）を示す図であ
る。

【図５】アスペルギルス・ニードランス（A. nidulan
s）フィターゼの全コード配列（７０１〜１３５０）お
よびコードされるアミノ酸配列（１６４〜３８０）を示
す図である。

【図６】アスペルギルス・ニードランス（A. nidulan
s）フィターゼの全コード配列（１３５１〜１９３１）
およびコードされるアミノ酸配列（３８１〜４６３）を
示す図である。

【図７】タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyce
s thermophilus）フィターゼの全コード配列（１〜７５
０）およびコードされるアミノ酸配列（１〜１３６）を
示す図である。

【図８】タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyce
s thermophilus）フィターゼの全コード配列（７５１〜
１４００）およびコードされるアミノ酸配列（１３７〜
３５３）を示す図である。

【図９】タラロミセス・サーモフィルス（Talaromyce
s thermophilus）フィターゼの全コード配列（１４０１
〜１８４５）およびコードされるアミノ酸配列（３５４
〜４６６）を示す図である。

【図１０】アスペルギルス・フミガツス（A. fumigat
us）[ATCC 13073]フィターゼの全コード配列（１〜６０
０）およびコードされるアミノ酸配列（１〜１６７）を
示す図である。

【図１１】アスペルギルス・フミガツス（A. fumigat
us）[ATCC 13073]フィターゼの全コード配列（６０１〜
１２５０）およびコードされるアミノ酸配列（１６８〜
３８４）を示す図である。

【図１２】アスペルギルス・フミガツス（A. fumigat
us）[ATCC 13073]フィターゼの全コード配列（１２５１
〜１５７１）およびコードされるアミノ酸配列（３８５
〜４６５）を示す図である。

【図１３】アスペルギルス・テレウス（A. terreus）
CBS 116.46フィターゼの全コード配列（１〜６５０）お
よびコードされるアミノ酸配列（１〜１７４）を示す図
である。

【図１４】アスペルギルス・テレウス（A. terreus）
CBS 116.46フィターゼの全コード配列（６５１〜１２５
０）およびコードされるアミノ酸配列（１７５〜３７
４）を示す図である。

【図１５】アスペルギルス・テレウス（A. terreus）
CBS 116.46フィターゼの全コード配列（１２５１〜１５
６７）およびコードされるアミノ酸配列（３７５〜４６
６）を示す図である。

【図１６】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１〜９９）を示す図で
ある。

【図１７】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１００〜１８４）を示
す図である。

【図１８】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１８５〜２６９）を示
す図である。

【図１９】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２７０〜３５４）を示
す図である。

【図２０】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（３５５〜４３９）を示
す図である。

【図２１】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（４４０〜５２４）を示
す図である。

【図２２】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（５２５〜６０９）を示
す図である。

【図２３】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（６１０〜６９４）を示
す図である。

【図２４】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（６９５〜７７９）を示
す図である。

【図２５】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（７８０〜８６４）を示
す図である。

【図２６】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（８６５〜９４９）を示
す図である。

【図２７】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（９５０〜１０３４）を
示す図である。

【図２８】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１０３５〜１１１９）
を示す図である。

【図２９】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１１２０〜１２０４）
を示す図である。

【図３０】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１２０５〜１２８９）
を示す図である。

【図３１】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１２９０〜１３７４）
を示す図である。

【図３２】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１３７５〜１４５９）
を示す図である。

【図３３】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１４６０〜１５４４）
を示す図である。

【図３４】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１５４５〜１６２９）
を示す図である。

【図３５】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１６３０〜１７１４）
を示す図である。

【図３６】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１７１５〜１７９９）
を示す図である。

【図３７】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１８００〜１８８４）
を示す図である。

【図３８】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１８８５〜１９６９）
を示す図である。

【図３９】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（１９７０〜２０５４）
を示す図である。

【図４０】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２０５５〜２１３９）
を示す図である。

【図４１】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２１４０〜２２２４）
を示す図である。

【図４２】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２２２５〜２３０９）
を示す図である。

【図４３】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２３１０〜２３９４）
を示す図である。

【図４４】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２３９５〜２４７９）
を示す図である。

【図４５】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２４８０〜２５６４）
を示す図である。

【図４６】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２５６５〜２６４９）
を示す図である。

【図４７】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２６５０〜２７３４）
を示す図である。

【図４８】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２７３５〜２８１９）
を示す図である。

【図４９】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２８２０〜２９０４）
を示す図である。

【図５０】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２９０５〜２９８９）
を示す図である。

【図５１】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（２９９０〜３０７４）
を示す図である。

【図５２】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（３０７５〜３１５９）
を示す図である。

【図５３】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（３１６０〜３２４４）
を示す図である。

【図５４】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（３２４５〜３３２９）
を示す図である。

【図５５】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（３３３０〜３４１４）
を示す図である。

【図５６】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（３４１５〜３４９９）
を示す図である。

【図５７】アスペルギルス・ニガー（A. niger）フ
ィターゼの構造の結晶学データ（３５００〜３５８９）
を示す図である。

【図５８】野生型および変異体のアスペルギルス・フ
ミガツス（A. fumigatus）(N1〜N6)フィターゼの基質特
異性を示す図である。基質1〜13 は図3と同じ。

【図５９】変異体のアスペルギルス・フミガツス (N1
〜N6)フィターゼの至適pH曲線を示す図である。すべて
の活性の値は標準化している（最大活性=1.0）。

【図６０】アスペルギルス・ニガー (アスペルギルス
・フィクウム; NRRL3135)フィターゼの3次元折り畳みの
立体図である。活性部位を丸で示し、触媒作用に必須の
アミノ酸残基Arg 58およびHis 59は球と棒で表してあ
る。この図は「MOLSCRIPT」プログラム［Kraulis, P.
J., J. Appl. Cryst. 24, 946〜950 (1991)］および「R
ASTER3D」プログラム［Merritt, E. A.およびMurphy,
M.E.P., Acta Cryst.,869〜873 (1994)］を用いて作製
した。

【図６１】 (a)と同じ方法を用いた位相学的スケッチ
を示す図である。5つのジスルフィド結合は、黒いジグ
ザグ線で示し、関与するシステイン残基の配列番号も示
してある。β鎖は配列番号A: 48〜58、B: 134〜138、C:
173〜177、D:332〜337、E: 383〜391、およびF: 398〜
403で定義している。αヘリックスは配列番号a: 66〜8
2、b:88〜95、c:107〜123、d:141〜159、e:193〜197、
f:200〜210、g:213〜223、h:231〜246、i:257〜261、j:
264〜281、k:290〜305、l:339〜348、m:423〜429、およ
びn:439〜443と定義してある。β鎖AのC末端の星印は、
触媒作用に必須のアミノ酸残基Arg 58およびHis 59の位
置を示す。

【図６２】アスペルギルス・フィクウム (ATCC 1307
3)のフィターゼの活性部位の立体図で、基質のフィチン
酸の推測上の結合様式を示す図である。このモデルで
は、結合した結晶水分子が除去され、基質と相互作用す
るためにLys 68の側鎖のねじれ角がわずかに調節されて
いる以外、蛋白質の原子の位置は固定されている。すべ
ての保存されたアミノ酸残基Arg 58、His 59、Arg 62、
Arg 142、His 338およびAsp 339は点線で示されるよう
に、フィチン酸の容易に開裂できる3リン酸基と水素結
合を作る。太い点線で示すように、His 59は容易に開裂
できるリンに求核性攻撃を行うために好都合な位置にあ
り、Asp 339は去って行く基にプロトン付加を行う位置
にある。

【図６３】部位特異的突然変異誘発法のための基本プ
ラスミドpUC18-AfumgDNAおよびpUC18-AfumcDNAの構築を
示す図である。

【図６４】部位特異的突然変異誘発法に使用したプラ
イマーセットA〜E。

【図６５】部位特異的突然変異誘発法に使用したプラ
イマーセットF〜K。

【図６６】部位特異的突然変異誘発法に使用したプラ
イマーセットL〜N。

【図６７】部位特異的突然変異誘発法に使用したプラ
イマーセットO〜Tを示す図である。

【図６８】プラスミドpgDNAT1〜pgDNAT7の構築を示す
図である。

【図６９】プラスミドpgDNAN1〜pgDNAN6の構築を示す
図である。

【図７０】プラスミドpcT1〜pcT7の構築を示す図であ
る。

【図７１】プラスミドpcT1-AvrII、pcT1-S66Dおよびp
cT1-S140Y-D141Gの構築を示す図である。

【図７２】プラスミドpcDNA-N27、-T27、-I27、-V2
7、-A27、-G27の構築を示す図である。

【図７３】プラスミドpcN1〜pcN6の構築を示す図であ
る。

【図７４】アスペルギルス・ニガーにおける変異蛋白
質T1の発現用プラスミドpAfum-T1を示す図である。

【図７５】至適pH曲線を示す図である。野生型および
変異体のアスペルギルス・フミガツスフィターゼの比活
性を、インキュベーションのpHに対して表す。白三角：
アスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]の野生型フ
ィターゼ；白菱形：アスペルギルス・フミガツス Q27G
フィターゼ；黒四角：アスペルギルス・フミガツス Q2
7Nフィターゼ；黒三角：アスペルギルス・フミガツス Q
27Vフィターゼ；白四角：アスペルギルス・フミガツス
Q27Aフィターゼ；黒丸：アスペルギルス・フミガツス
Q27Iフィターゼ；白丸：アスペルギルス・フミガツス
Q27Tフィターゼ；破線：アスペルギルス・フミガツス
Q27Lフィターゼ。

【図７６】野生型と変異体アスペルギルス・フミガツ
ス[ATCC 13073]のフィターゼの基質特異性を示す図であ
る。使用した基質1〜13は図3と同じ。試験された13の基
質に対する異なるフィターゼの比活性は、すべて次の順
に記載されている（左から右）：アスペルギルス・フミ
ガツス野生型フィターゼ、アスペルギルス・フミガツ
ス Q27Nフィターゼ、アスペルギルス・フミガツス Q27
Tフィターゼ、アスペルギルス・フミガツス Q27Lフィ
ターゼ、アスペルギルス・フミガツス Q27Iフィター
ゼ、アスペルギルス・フミガツス Q27Vフィターゼ、
アスペルギルス・フミガツス Q27Aフィターゼ、アスペ
ルギルス・フミガツス Q27Gフィターゼ。

【図７７】至適pH曲線を示す図である。野生型および
変異体のアスペルギルス・フミガツス [ATCC 13073]フ
ィターゼの比活性を、インキュベーションのpHに対して
表す。黒菱形：アスペルギルス・フミガツス野生型フィ
ターゼ；黒四角：アスペルギルス・フミガツス Q27Lフ
ィターゼ；白丸：アスペルギルス・フミガツス Q27L-S
66D二重変異体；黒三角：アスペルギルス・フミガツス
Q27L-S140Y-D141G三重変異体。

【図７８】アスペルギルス・フミガツス [ATCC 1307
3]の異なる単離株におけるフィターゼの天然の変動を示
す図である。予測される蛋白質配列をアスペルギルス・
フミガツス ATCC 13073株由来のフィターゼの蛋白質配
列（１〜３２０）と比較して示す。#13073と異なるアミ
ノ酸のみを示す。

【図７９】アスペルギルス・フミガツス [ATCC 1307
3]の異なる単離株におけるフィターゼの天然の変動を示
す図である。予測される蛋白質配列をアスペルギルス・
フミガツス ATCC 13073株由来のフィターゼの蛋白質配
列（３２１〜４７０）と比較して示す。#13073と異なる
アミノ酸のみを示す。

【図８０】２つの異なるアスペルギルス・フミガツス
野性株から単離されたフィターゼのpHに依存する比活性
を示す図である。白四角：野生株ATCC 13073；黒丸：株
ATCC 32239。

【図８１】２つの異なるアスペルギルス・フミガツス
野性株から単離されたフィターゼの基質特異性を示す図
である。黒：野生株ATCC 13073；白：株ATCC32239。

【図８２】プラスミドpc-S130N、pc-R129L-S130N、pc
-K167G-R168Qの構築を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:68） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者ルイパサモンテススイス国トリムバックバスラーストラッセ 197 (72)発明者アンドレアトムスキードイツ国グレンザック−ワイレンクラフトウェルクストラッセ 47 (72)発明者アドルプスヴァンルーンスイス国レインフェルデンワルドシャウターストラッセ 17 (72)発明者カートヴォゲルスイス国バセルユーラーストラッセ 41 (72)発明者マーカスワイススイス国ライスタルロタッカーストラッセ９

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の段階を実行することを特徴とす
る、改良された活性特性を有する修飾フィターゼの生産
方法： a) アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフ
ィターゼの３次元構造を元にして、修飾するフィター
ゼ、および選択的に、修飾するフィターゼの活性特性よ
りも好都合な活性特性を有する別のフィターゼの３次元
構造を、コンピュータでモデル化する段階、 b) 修飾するフィターゼ、およびより好都合な活性特性
を有するフィターゼの活性部位の構造を比較し、両方の
活性部位において異なるアミノ酸残基を同定する段階、 c) 両方の活性部位が異なる少なくとも１つのアミノ酸
をコードするヌクレオチドを変化させることにより、修
飾フィターゼをコードするDNA配列を構築する段階、 d) 適当な宿主細胞において発現する能力を有するベク
ターに該DNA配列を組み込む段階、 e) c)のDNA配列またはd)のベクターにより、適当な宿主
細胞を形質転換し、該宿主細胞を適当な培養条件下で培
養し、当技術分野で公知の方法により、宿主細胞または
培地から修飾フィターゼを単離する段階。
【請求項２】修飾するフィターゼがアスペルギルス・
フミガツス（Aspergillus fumigatus）のフィターゼで
あり、より好都合な活性特性を有するフィターゼがアス
ペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のフィター
ゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３】請求項１または２のいずれか一項に記載
の方法により得られた、または得ることの可能な修飾フ
ィターゼ。
【請求項４】活性特性が非修飾フィターゼの活性特性
よりも好都合であるように修飾されたフィターゼ。
【請求項５】非修飾フィターゼのアミノ酸配列が、１
つまたは複数のアミノ酸の欠失、置換、および／または
付加により変化していることを特徴とする、請求項４記
載のフィターゼ。
【請求項６】アスペルギルス・ニガー（Aspergillus
niger）のフィターゼのアミノ酸配列の以下の位置：2
7、66、71、103、140、141、188、205、234、235、23
8、274、277、282、340および／または424、好ましくは
27、66、140、205、274、277、282および／または340の
１つに相同である少なくとも１つの位置に変化が生じて
いる、請求項４または５のいずれか一項に記載のフィタ
ーゼ。
【請求項７】位置27のアミノ酸が、以下の群の１つよ
り選択されるアミノ酸で置換されている、請求項６記載
のフィターゼ： a) Ala、Val、Leu、Ile；または b) Thr。
【請求項８】以下の変異：Q27L、Q27N、Q27T、Q27I、
Q27V、Q27A、Q27G、S66D、S140Y、D141G、A205E、Q274
L、G277D、G277K、Y282Hおよび／またはN340Sのうちの
少なくとも１つを特徴とする、請求項４から７のいずれ
か一項に記載のフィターゼ。
【請求項９】請求項３から８のいずれか一項に記載の
フィターゼをコードするDNA配列を含むDNA配列。
【請求項１０】請求項９記載のDNA配列を含むベクタ
ー。
【請求項１１】請求項９記載のDNA配列または請求項
１０記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】請求項１１記載の宿主細胞が適当な培
養条件下で培養され、該宿主細胞または培地から当技術
分野で公知の方法によりフィターゼが単離される、請求
項３から８のいずれか一項に記載のフィターゼを調製す
る方法。
【請求項１３】請求項３から８のいずれか一項に記載
のフィターゼを含む、食料または飼料組成物。