JPH10298104A - ワクチン - Google Patents
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- JPH10298104A JPH10298104A JP10097400A JP9740098A JPH10298104A JP H10298104 A JPH10298104 A JP H10298104A JP 10097400 A JP10097400 A JP 10097400A JP 9740098 A JP9740098 A JP 9740098A JP H10298104 A JPH10298104 A JP H10298104A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56905—Protozoa
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/455—Eimeria
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- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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- G01N2333/455—Eimeria
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 コクシジウム症のワクチンの提供。
【解決手段】 寄生虫エイメリア(Eimeria)個体を含有
しないが、１種以上のタンパク質、又はそのフラグメン
トもしくは変異体を含有する組成物であって、該タンパ
ク質は、（ａ）エイメリアのスポロゾイトのトライトン
Ｘ−１１４抽出液の親水性相に存在し、（ｂ）還元条件
下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では分子量２６−３０ｋ
Ｄａ±５ｋＤａ（即ち２１−３５ｋＤａ）を有すること
を特徴とする該組成物。
しないが、１種以上のタンパク質、又はそのフラグメン
トもしくは変異体を含有する組成物であって、該タンパ
ク質は、（ａ）エイメリアのスポロゾイトのトライトン
Ｘ−１１４抽出液の親水性相に存在し、（ｂ）還元条件
下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では分子量２６−３０ｋ
Ｄａ±５ｋＤａ（即ち２１−３５ｋＤａ）を有すること
を特徴とする該組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は特にコクシジウム症
ワクチンに関する。
ワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】エイメ
リア(Eimeria)属に属する寄生性原生動物は腸内コクシ
ジウム症、即ちトリを冒す腸炎の原因体である。腸内コ
クシジウム症は、特に家禽産業に重大な経済的損失をも
たらす。（本出願の目的のために、“家禽”という用語
は、卵又は肉の源として役立つトリを意味するものと
し、特にニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ホロホ
ロチョウ、キジ、ハト、及びクジャクを含む。）今日、
コクシジウム症は主に餌における抗生物質の使用によっ
て防除される。薬剤耐性株の急速な出現(Chapman 199
3)、及び新規薬剤の開発と登録の多大なコストにより、
防除の代替方法の開発への関心が増大している。それ
故、有効ワクチンの開発は長年望まれていた。しかし、
一部成功したにすぎない。
リア(Eimeria)属に属する寄生性原生動物は腸内コクシ
ジウム症、即ちトリを冒す腸炎の原因体である。腸内コ
クシジウム症は、特に家禽産業に重大な経済的損失をも
たらす。（本出願の目的のために、“家禽”という用語
は、卵又は肉の源として役立つトリを意味するものと
し、特にニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ホロホ
ロチョウ、キジ、ハト、及びクジャクを含む。）今日、
コクシジウム症は主に餌における抗生物質の使用によっ
て防除される。薬剤耐性株の急速な出現(Chapman 199
3)、及び新規薬剤の開発と登録の多大なコストにより、
防除の代替方法の開発への関心が増大している。それ
故、有効ワクチンの開発は長年望まれていた。しかし、
一部成功したにすぎない。
【０００３】現在使用可能なワクチン戦略は、毒性のあ
る寄生虫又は生きている弱毒寄生虫による制御された感
染からなる(Shirley 1993)。安全性とコストの理由か
ら、コクシジウム症に対する免疫予防の最適な方法はサ
ブユニットワクチンを使用することのように考えられ
る。寄生虫物質の分画（Murrayら、1986, McKenzie & L
ong 1986）又は組換えエイメリアタンパク質(Danforth
ら、1989, Jenkinsら、1991)によってコクシジウム症に
対しニワトリを免疫処置する多くの試みがなされてきた
けれども、攻撃感染に対し限定された防御が達成された
にすぎない。防御免疫の誘導を起こす寄生虫の段階は一
般的に初期無性発達段階であると考えられる(Jenkins
ら、1991)。最初に免疫ニワトリからの抗体を用いて抗
原候補の選別が行われたが、防御免疫における細胞媒介
反応の基本的役割を考えて(Lillehoj &Trout 1993, Ros
e 1996による総説)、現在では特異的Ｔ細胞反応を刺激
する能力について抗原をスクリーニングすることが注目
されている(Dunnら、1995)。
る寄生虫又は生きている弱毒寄生虫による制御された感
染からなる(Shirley 1993)。安全性とコストの理由か
ら、コクシジウム症に対する免疫予防の最適な方法はサ
ブユニットワクチンを使用することのように考えられ
る。寄生虫物質の分画（Murrayら、1986, McKenzie & L
ong 1986）又は組換えエイメリアタンパク質(Danforth
ら、1989, Jenkinsら、1991)によってコクシジウム症に
対しニワトリを免疫処置する多くの試みがなされてきた
けれども、攻撃感染に対し限定された防御が達成された
にすぎない。防御免疫の誘導を起こす寄生虫の段階は一
般的に初期無性発達段階であると考えられる(Jenkins
ら、1991)。最初に免疫ニワトリからの抗体を用いて抗
原候補の選別が行われたが、防御免疫における細胞媒介
反応の基本的役割を考えて(Lillehoj &Trout 1993, Ros
e 1996による総説)、現在では特異的Ｔ細胞反応を刺激
する能力について抗原をスクリーニングすることが注目
されている(Dunnら、1995)。
【０００４】ニワトリにおいてエイメリア・テネラ(E.t
enella)一次感染約８日後、寄生虫特異的Ｔ細胞が末梢
血液で循環しているということが以前に報告された(Bre
edら、1996)。スポロゾイト抗原全部での誘発に応じ
て、これらの細胞は増殖及び／又はＩＦＮ−γの産生を
開始するように考えられた(Breedら、1997)。
enella)一次感染約８日後、寄生虫特異的Ｔ細胞が末梢
血液で循環しているということが以前に報告された(Bre
edら、1996)。スポロゾイト抗原全部での誘発に応じ
て、これらの細胞は増殖及び／又はＩＦＮ−γの産生を
開始するように考えられた(Breedら、1997)。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明で、寄生虫エイメ
リア個体を含有しないが、１種以上のタンパク質、又は
そのフラグメントもしくは変異体を含有する組成物であ
って、該タンパク質は、（ａ）エイメリアのスポロゾイ
トのトライトンＸ−１１４抽出液の親水性相に存在し、
（ｂ）還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では分子
量２６−３０ｋＤａ±５ｋＤａ（即ち２１−３５ｋＤ
ａ）を有することを特徴とする該組成物を提供する。
リア個体を含有しないが、１種以上のタンパク質、又は
そのフラグメントもしくは変異体を含有する組成物であ
って、該タンパク質は、（ａ）エイメリアのスポロゾイ
トのトライトンＸ−１１４抽出液の親水性相に存在し、
（ｂ）還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では分子
量２６−３０ｋＤａ±５ｋＤａ（即ち２１−３５ｋＤ
ａ）を有することを特徴とする該組成物を提供する。
【０００６】本発明者らは、このような組成物を用い
て、エイメリア媒介疾患に対しトリ（好ましくは家禽）
にかなりの程度の防御を与えるワクチンを提供できるこ
とを見出した。例えば、寄生虫エイメリアによる次なる
攻撃を行う場合、このようなワクチンで免疫処置された
トリにおいて盲腸病巣の形成に対して防御することがで
きる。
て、エイメリア媒介疾患に対しトリ（好ましくは家禽）
にかなりの程度の防御を与えるワクチンを提供できるこ
とを見出した。例えば、寄生虫エイメリアによる次なる
攻撃を行う場合、このようなワクチンで免疫処置された
トリにおいて盲腸病巣の形成に対して防御することがで
きる。
【０００７】この知見は従来の研究からは予見すること
はできなかった。種々のグループが、上記の２６−３０
ｋＤａ±５ｋＤａ範囲内の分子量を偶然に有する可能性
のあるエイメリア由来タンパク質を開示したが、これら
のタンパク質は本発明のタンパク質とは全く異なる。
はできなかった。種々のグループが、上記の２６−３０
ｋＤａ±５ｋＤａ範囲内の分子量を偶然に有する可能性
のあるエイメリア由来タンパク質を開示したが、これら
のタンパク質は本発明のタンパク質とは全く異なる。
【０００８】例えば、ＥＰ−Ａ−０２３１５３７(Newma
nら)では、２５ｋＤａの表面タンパク質が開示されてい
る。しかし、還元条件下でこのタンパク質は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで約１７ｋＤａと約８ｋＤａの２本のバンドを
形成するように分裂するのに対して、本発明のタンパク
質は還元条件下で行うと少なくとも２１ｋＤａの相対的
分子量を有した。
nら)では、２５ｋＤａの表面タンパク質が開示されてい
る。しかし、還元条件下でこのタンパク質は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで約１７ｋＤａと約８ｋＤａの２本のバンドを
形成するように分裂するのに対して、本発明のタンパク
質は還元条件下で行うと少なくとも２１ｋＤａの相対的
分子量を有した。
【０００９】Bouvierら(J.Biol.Chem. (1985) 260(29);
pp15504-15509)は、トライトンＸ１１４(Triton X114)
抽出を用いると、両親媒性タンパク質（膜結合）は界面
活性剤相のみに検出され、親水性相には検出されないこ
とを教示する。
pp15504-15509)は、トライトンＸ１１４(Triton X114)
抽出を用いると、両親媒性タンパク質（膜結合）は界面
活性剤相のみに検出され、親水性相には検出されないこ
とを教示する。
【００１０】ＵＳ−Ａ−４７１０３７７(Schenkelら)で
は、分子量約２８ｋＤａ及び約２６ｋＤａの抗原を開示
している。しかし、これらは両親媒性外膜成分であり、
そのため本発明のタンパク質を調製するために使用でき
たトライトンＸ−１１４抽出液の親水性相に存在しない
であろう。
は、分子量約２８ｋＤａ及び約２６ｋＤａの抗原を開示
している。しかし、これらは両親媒性外膜成分であり、
そのため本発明のタンパク質を調製するために使用でき
たトライトンＸ−１１４抽出液の親水性相に存在しない
であろう。
【００１１】両親媒性であるエイメリアタンパク質は、
ＷＯ９２／０４４６１(Jacobsonら)、ＥＰ−Ａ−０３２
４６４８(Liberatorら)、ＡＵ−Ａ−２８５４２／４９
(Turnerら)、ＥＰ−Ａ−０３４４８０８(Alternburger
ら)及びＥＰ−Ａ−０１６７４４３(Murrayら)にも開示
されている。
ＷＯ９２／０４４６１(Jacobsonら)、ＥＰ−Ａ−０３２
４６４８(Liberatorら)、ＡＵ−Ａ−２８５４２／４９
(Turnerら)、ＥＰ−Ａ−０３４４８０８(Alternburger
ら)及びＥＰ−Ａ−０１６７４４３(Murrayら)にも開示
されている。
【００１２】ワクチン研究において、エイメリア一次感
染後Ｔ細胞反応を刺激するタンパク質の能力と家禽に防
御反応を与えるタンパク質の能力との直接の関連はない
ようであるということを考えることも重要である。
染後Ｔ細胞反応を刺激するタンパク質の能力と家禽に防
御反応を与えるタンパク質の能力との直接の関連はない
ようであるということを考えることも重要である。
【００１３】本発明の組成物は通常、天然状態でエイメ
リアに存在する１種以上のエイメリアタンパク質は含ま
ない。好ましくは、本発明の組成物では、エイメリアス
ポロゾイトのトライトンＸ−１１４抽出液の親水性相に
存在するエイメリアタンパク質以外のエイメリアタンパ
ク質は実質的に含まない。それ故、エイメリアで膜結合
のタンパク質は含まない可能性がある。
リアに存在する１種以上のエイメリアタンパク質は含ま
ない。好ましくは、本発明の組成物では、エイメリアス
ポロゾイトのトライトンＸ−１１４抽出液の親水性相に
存在するエイメリアタンパク質以外のエイメリアタンパ
ク質は実質的に含まない。それ故、エイメリアで膜結合
のタンパク質は含まない可能性がある。
【００１４】本組成物中に存在するタンパク質性物質の
かなりの部分（例えば、存在する全タンパク質の５０％
ｗ／ｗ以上、７０％ｗ／ｗ以上、又は９０％ｗ／ｗ以
上）は、本発明の１種以上のタンパク質又はそのフラグ
メントもしくは変異体からなりうる。
かなりの部分（例えば、存在する全タンパク質の５０％
ｗ／ｗ以上、７０％ｗ／ｗ以上、又は９０％ｗ／ｗ以
上）は、本発明の１種以上のタンパク質又はそのフラグ
メントもしくは変異体からなりうる。
【００１５】例えば、複数の該タンパク質（又はその変
異体もしくはフラグメント）がこのような組成物に存在
しうる。２種又は３種のこのようなタンパク質（又はそ
の変異体もしくはフラグメント）が存在しうる。
異体もしくはフラグメント）がこのような組成物に存在
しうる。２種又は３種のこのようなタンパク質（又はそ
の変異体もしくはフラグメント）が存在しうる。
【００１６】あるいは、これらのタンパク質（又はその
変異体もしくはフラグメント）の唯一のものを提供して
もよく、実質的に純粋形態、即ち本質的に他のエイメリ
アタンパク質が存在しない形態で提供してもよい。精製
は当業者公知の技術によって行うことができる。このよ
うな技術を一般的な表現で後に記載する。
変異体もしくはフラグメント）の唯一のものを提供して
もよく、実質的に純粋形態、即ち本質的に他のエイメリ
アタンパク質が存在しない形態で提供してもよい。精製
は当業者公知の技術によって行うことができる。このよ
うな技術を一般的な表現で後に記載する。
【００１７】本発明のタンパク質を配列決定のために十
分なレベルの純度で提供するための適切な精製方法は以
下のようである。
分なレベルの純度で提供するための適切な精製方法は以
下のようである。
【００１８】組成物のタンパク質は、ＳＤＳ存在下適切
な緩衝液系で１２−１８％アクリルアミド（好ましくは
１５％）分離ゲルで泳動することができる。タンパク質
の染色（例えば４５％メタノール、１０％酢酸中の０．
１％クーマシーブリリアントブルー）後、個々のタンパ
ク質を含むバンドを切出し、トリプシンを用いてin sit
uで消化することができる。
な緩衝液系で１２−１８％アクリルアミド（好ましくは
１５％）分離ゲルで泳動することができる。タンパク質
の染色（例えば４５％メタノール、１０％酢酸中の０．
１％クーマシーブリリアントブルー）後、個々のタンパ
ク質を含むバンドを切出し、トリプシンを用いてin sit
uで消化することができる。
【００１９】トリプシン消化ペプチドの抽出と次のＨＰ
ＬＣ精製後、自動気相アミノ酸配列決定機を用いて該ペ
プチドの配列決定をすることができる。この方法を用
い、上記の方法を使用してスポロゾイトから提供されう
るタンパク質２０−５０ｐｍｏｌという少量から、内部
アミノ酸配列決定ができる。
ＬＣ精製後、自動気相アミノ酸配列決定機を用いて該ペ
プチドの配列決定をすることができる。この方法を用
い、上記の方法を使用してスポロゾイトから提供されう
るタンパク質２０−５０ｐｍｏｌという少量から、内部
アミノ酸配列決定ができる。
【００２０】本発明のタンパク質の変異体を提供するこ
とができる。
とができる。
【００２１】“タンパク質”という用語は、ペプチド結
合によって結合した複数のアミノ酸を含む分子を示すも
のとして本明細書で使用する。それ故、それはその範囲
内にペプチド及びポリペプチドを含む。それはまたその
範囲内に、ジスルフィド結合の開裂によって、還元条件
下、より大きなタンパク質から分離されるようになりう
るポリペプチド鎖をも含む。
合によって結合した複数のアミノ酸を含む分子を示すも
のとして本明細書で使用する。それ故、それはその範囲
内にペプチド及びポリペプチドを含む。それはまたその
範囲内に、ジスルフィド結合の開裂によって、還元条件
下、より大きなタンパク質から分離されるようになりう
るポリペプチド鎖をも含む。
【００２２】“変異体”という用語は、本発明のタンパ
ク質に関し１種以上のアミノ酸欠失、挿入及び／又は置
換を有するが、エイメリア抗原の１種以上の免疫原性決
定基を保持する分子を包含するものとして用いる。変異
体は、宿主動物における免疫反応を発揮できる１種以上
のエピトープ、好ましくは完全抗原を有するであろう
（必要ならばより大きい分子と組合せる）。
ク質に関し１種以上のアミノ酸欠失、挿入及び／又は置
換を有するが、エイメリア抗原の１種以上の免疫原性決
定基を保持する分子を包含するものとして用いる。変異
体は、宿主動物における免疫反応を発揮できる１種以上
のエピトープ、好ましくは完全抗原を有するであろう
（必要ならばより大きい分子と組合せる）。
【００２３】本発明のタンパク質に関し、アミノ酸配列
における天然の変異体が個々のエイメリア寄生虫又は株
で存在しうることが理解されよう。このような天然の変
異体及び天然には存在しない変異体も本発明の範囲内で
ある。
における天然の変異体が個々のエイメリア寄生虫又は株
で存在しうることが理解されよう。このような天然の変
異体及び天然には存在しない変異体も本発明の範囲内で
ある。
【００２４】実質的に生物学的及び免疫学的活性を変化
させないアミノ酸置換は、例えば“The Protein” Acad
emic Press New York(1979) 中にNeurathらによって記
載されている。関連アミノ酸間のアミノ酸置換又は進化
においてしばしば起った置換は特に、Ｓｅｒ／Ａｌａ、
Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉ
ｌｅ／Ｖａｌである(Dayhof,M.C., Atlas of protein s
equence and structure, Nat. Biomed, Res. Found., W
ashington D.C., 1978, vol.5, suppl.3 を参照された
い)。他のアミノ酸置換には、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ
／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／
Ａｓｎ／Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐ
ｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａ
ｌ、及びＡｌａ／Ｇｌｕなどがある。この情報を基に、
Lipman とPearsonは、相同タンパク質間の迅速で感度の
高いタンパク質比較及び機能性類似度決定の方法を開発
した(Science, 227, 1435-1441, 1985)。アミノ酸置換
は本発明の範囲内である。
させないアミノ酸置換は、例えば“The Protein” Acad
emic Press New York(1979) 中にNeurathらによって記
載されている。関連アミノ酸間のアミノ酸置換又は進化
においてしばしば起った置換は特に、Ｓｅｒ／Ａｌａ、
Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉ
ｌｅ／Ｖａｌである(Dayhof,M.C., Atlas of protein s
equence and structure, Nat. Biomed, Res. Found., W
ashington D.C., 1978, vol.5, suppl.3 を参照された
い)。他のアミノ酸置換には、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ
／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／
Ａｓｎ／Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐ
ｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａ
ｌ、及びＡｌａ／Ｇｌｕなどがある。この情報を基に、
Lipman とPearsonは、相同タンパク質間の迅速で感度の
高いタンパク質比較及び機能性類似度決定の方法を開発
した(Science, 227, 1435-1441, 1985)。アミノ酸置換
は本発明の範囲内である。
【００２５】上記のように、変異は置換に限定されな
く、並びに／又は免疫活性が残る欠失及び／もしくは挿
入を含むことができる。しかし、タンパク質の構造配置
に大きく影響する欠失又は挿入であっても免疫的に重要
なエイメリアエピトープ又は抗原が失わなければ、該欠
失又は挿入は一般的に本発明の変異体に存在するであろ
う。
く、並びに／又は免疫活性が残る欠失及び／もしくは挿
入を含むことができる。しかし、タンパク質の構造配置
に大きく影響する欠失又は挿入であっても免疫的に重要
なエイメリアエピトープ又は抗原が失わなければ、該欠
失又は挿入は一般的に本発明の変異体に存在するであろ
う。
【００２６】本発明のタンパク質の好適な変異体は、該
タンパク質と、高度の配列相同性、例えば５０％以上、
７５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列相同性
を有する。
タンパク質と、高度の配列相同性、例えば５０％以上、
７５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列相同性
を有する。
【００２７】アミノ酸配列相同性決定の一つの方法は、
あるアミノ酸配列の全長にわたって最大数のアミノ酸が
一致するように、該アミノ酸配列と別のアミノ酸配列と
を並べることである。配列相同性の割合は（ｍ／ｔ）×
１００である。ここでｍは該アミノ酸配列の全長にわた
って２種の並べた配列で一致した数であり、ｔは該アミ
ノ酸配列に存在するアミノ酸総数である。
あるアミノ酸配列の全長にわたって最大数のアミノ酸が
一致するように、該アミノ酸配列と別のアミノ酸配列と
を並べることである。配列相同性の割合は（ｍ／ｔ）×
１００である。ここでｍは該アミノ酸配列の全長にわた
って２種の並べた配列で一致した数であり、ｔは該アミ
ノ酸配列に存在するアミノ酸総数である。
【００２８】配列相同性決定の別の方法は、２種のアミ
ノ酸配列をマッチさせるときにギャップを導入すること
である（０個、１個、２個、３個、又はそれより多くの
ギャップさえ許されうる）。このことは、例えば、“Th
e Wisconsin Package”の一部としてGenetics Computer
Groupから市販の“ギャップ”プログラムを用いて行う
ことができる。このプログラムは、Smith and Waterman
によって提供されたアルゴリズム(Advances in Applied
Mathematics, 482-489(1981))に基づいている。
ノ酸配列をマッチさせるときにギャップを導入すること
である（０個、１個、２個、３個、又はそれより多くの
ギャップさえ許されうる）。このことは、例えば、“Th
e Wisconsin Package”の一部としてGenetics Computer
Groupから市販の“ギャップ”プログラムを用いて行う
ことができる。このプログラムは、Smith and Waterman
によって提供されたアルゴリズム(Advances in Applied
Mathematics, 482-489(1981))に基づいている。
【００２９】配列相同性決定のこれらの方法の両方が本
発明に関し使用できるが、１個以上のギャップを考慮す
ることが好ましい。
発明に関し使用できるが、１個以上のギャップを考慮す
ることが好ましい。
【００３０】高度の配列相同性が存在する場合、アミノ
酸配列において比較的少数の差がありうる。例えば、２
０個未満、１０個未満、又は５個未満の差である。
酸配列において比較的少数の差がありうる。例えば、２
０個未満、１０個未満、又は５個未満の差である。
【００３１】とにかく、多数の変異体が本発明の範囲内
であることを理解すべきである。例えば、本発明のタン
パク質が別の部分に結合している（例えば、安定性を増
加させるために、又は精製の助けとするために）融合タ
ンパク質も提供しうる。このような融合タンパク質を後
に詳細に記載する。
であることを理解すべきである。例えば、本発明のタン
パク質が別の部分に結合している（例えば、安定性を増
加させるために、又は精製の助けとするために）融合タ
ンパク質も提供しうる。このような融合タンパク質を後
に詳細に記載する。
【００３２】本発明の範囲内の他の変異体は、本発明の
タンパク質が還元条件下ジスルフィド結合の開裂によっ
て得られうる、そのジスルフィド結合を含むエイメリア
タンパク質である。
タンパク質が還元条件下ジスルフィド結合の開裂によっ
て得られうる、そのジスルフィド結合を含むエイメリア
タンパク質である。
【００３３】本発明のタンパク質のフラグメントも本発
明の範囲内に含まれる。このようなフラグメントは好ま
しくは１０個以上の長さのアミノ酸、より好ましくは５
０個以上、又は１００個以上の長さのアミノ酸である。
明の範囲内に含まれる。このようなフラグメントは好ま
しくは１０個以上の長さのアミノ酸、より好ましくは５
０個以上、又は１００個以上の長さのアミノ酸である。
【００３４】本発明のタンパク質、又はそのフラグメン
トもしくは変異体は治療に有用である。それらは、１種
以上の医薬として許容できる担体と組合せて医薬組成物
として提供できる。（本発明の目的のために、“医薬と
して許容できる組成物”とは獣医学での使用に適した組
成物である。“医薬として許容できる担体”という用語
及び同様の用語は同様に理解すべきである。） 医薬組成物は単位投与剤形として提供できる。それは密
封容器で提供され、通常滅菌剤形である。
トもしくは変異体は治療に有用である。それらは、１種
以上の医薬として許容できる担体と組合せて医薬組成物
として提供できる。（本発明の目的のために、“医薬と
して許容できる組成物”とは獣医学での使用に適した組
成物である。“医薬として許容できる担体”という用語
及び同様の用語は同様に理解すべきである。） 医薬組成物は単位投与剤形として提供できる。それは密
封容器で提供され、通常滅菌剤形である。
【００３５】本発明の好適な医薬組成物はワクチン（特
にコクシジウム症ワクチン）である。このようなワクチ
ンは後に詳細に考察する。
にコクシジウム症ワクチン）である。このようなワクチ
ンは後に詳細に考察する。
【００３６】本発明は、本発明のタンパク質、そのフラ
グメント又は変異体を含む組成物に限定されない。核酸
分子も提供する。
グメント又は変異体を含む組成物に限定されない。核酸
分子も提供する。
【００３７】本発明のタンパク質をコードする核酸分子
を提供できる。何故ならば、タンパク質又はそのフラグ
メントもしくは変異体をコードするアミノ酸配列は標準
的方法で決定できるからである。当業者ならば遺伝コー
ドを使用して、このようなアミノ酸配列をコードする多
数の核酸分子を同定できる。
を提供できる。何故ならば、タンパク質又はそのフラグ
メントもしくは変異体をコードするアミノ酸配列は標準
的方法で決定できるからである。当業者ならば遺伝コー
ドを使用して、このようなアミノ酸配列をコードする多
数の核酸分子を同定できる。
【００３８】“長いプローブ”又は“短いプローブ”ア
プローチを用いて、エイメリアからの特定の核酸分子を
単離しクローンできる。ｃＤＮＡ分子は適当なｍＲＮＡ
源から得ることができる。あるいは、化学合成技術を用
い分子のde novo合成を行うことができる。核酸分子が
得られると、それらは標準的技術（例えばＰＣＲを用い
て）によって増幅できる。
プローチを用いて、エイメリアからの特定の核酸分子を
単離しクローンできる。ｃＤＮＡ分子は適当なｍＲＮＡ
源から得ることができる。あるいは、化学合成技術を用
い分子のde novo合成を行うことができる。核酸分子が
得られると、それらは標準的技術（例えばＰＣＲを用い
て）によって増幅できる。
【００３９】本発明の核酸分子は、天然では結合してい
ない１種以上の異種核酸分子と連結させることができ、
いわゆる“組換えベクター”を得ることができる。適切
な宿主の形質転換のために、これを使用できる。有用な
組換えベクターは好ましくはプラスミド、バクテリオフ
ァージ、コスミド又はウイルス由来である。
ない１種以上の異種核酸分子と連結させることができ、
いわゆる“組換えベクター”を得ることができる。適切
な宿主の形質転換のために、これを使用できる。有用な
組換えベクターは好ましくはプラスミド、バクテリオフ
ァージ、コスミド又はウイルス由来である。
【００４０】本発明の核酸配列をクローンするために使
用できる特定のベクター又はクローニングビヒクルは当
業界公知であり、特に、ｐＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、
ｐＧＥＭ、及びブルースクリプトプラスミドのようなプ
ラスミドベクター；バクテリオファージ、例えばラムダ
ｇｔ−ＥＳ、カロン２８及びＭ１３由来ファージ、又は
ＳＶ４０、アデノウイルスもしくはポリオーマウイルス
のようなウイルスベクターを含む（Rodriquez,R.L. and
D.T.Denhardt編、Vectors：A survey of molecular cl
oning vectors and their uses, Butterworths, 1988；
Lenstra,J.A.ら、Arch,Virol., 110, 1-24, 1990）。
本発明の組換えベクターの構築に使用する方法は当業者
に公知であり、特にManiatis,T.ら(Molecular Cloning
A Laboratory Manual, ２版; Cold Spring Harbor Labo
ratory, 1989)に記載されている。
用できる特定のベクター又はクローニングビヒクルは当
業界公知であり、特に、ｐＢＲ３２２、種々のｐＵＣ、
ｐＧＥＭ、及びブルースクリプトプラスミドのようなプ
ラスミドベクター；バクテリオファージ、例えばラムダ
ｇｔ−ＥＳ、カロン２８及びＭ１３由来ファージ、又は
ＳＶ４０、アデノウイルスもしくはポリオーマウイルス
のようなウイルスベクターを含む（Rodriquez,R.L. and
D.T.Denhardt編、Vectors：A survey of molecular cl
oning vectors and their uses, Butterworths, 1988；
Lenstra,J.A.ら、Arch,Virol., 110, 1-24, 1990）。
本発明の組換えベクターの構築に使用する方法は当業者
に公知であり、特にManiatis,T.ら(Molecular Cloning
A Laboratory Manual, ２版; Cold Spring Harbor Labo
ratory, 1989)に記載されている。
【００４１】例えば、本発明の核酸配列のクローニング
ベクターへの挿入は、遺伝子と所望のクローニングベヒ
クルの両方を同一の制限酵素で切断して容易に達成でき
る。何故ならば、それによって相補的ＤＮＡ末端が産生
され、その相補的ＤＮＡ末端はアニールでき、続いて連
結できるからである。
ベクターへの挿入は、遺伝子と所望のクローニングベヒ
クルの両方を同一の制限酵素で切断して容易に達成でき
る。何故ならば、それによって相補的ＤＮＡ末端が産生
され、その相補的ＤＮＡ末端はアニールでき、続いて連
結できるからである。
【００４２】あるいは、適当なＤＮＡポリメラーゼによ
る一本鎖ＤＮＡの消化又は一本鎖末端の充填によって平
滑末端が得られるように、産生される制限部位を修飾す
ることが必要であるかもしれない。次に、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼのような酵素による平滑末端連結を行うことがで
きる。
る一本鎖ＤＮＡの消化又は一本鎖末端の充填によって平
滑末端が得られるように、産生される制限部位を修飾す
ることが必要であるかもしれない。次に、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼのような酵素による平滑末端連結を行うことがで
きる。
【００４３】所望ならば、ＤＮＡ末端へのリンカーの連
結によって、任意の制限部位を産生できる。このような
リンカーは制限部位配列をコードする特別のオリゴヌク
レオチド配列を含みうる。制限酵素で開裂されたベクタ
ーと核酸配列は、ホモポリマーテーリングによっても修
飾できる。
結によって、任意の制限部位を産生できる。このような
リンカーは制限部位配列をコードする特別のオリゴヌク
レオチド配列を含みうる。制限酵素で開裂されたベクタ
ーと核酸配列は、ホモポリマーテーリングによっても修
飾できる。
【００４４】本明細書で用いる“形質転換”は、用いる
方法に関らずに、例えば直接的取込み又はトランスダク
ションによる宿主細胞への異種核酸配列の導入を指す。
異種核酸配列は自律的複製によって維持されうるか、又
は宿主ゲノムに挿入されうる。所望ならば、組換えベク
ターに、指定された宿主と適合性のある適当な制御配列
を付与する。これらの配列は挿入核酸配列の発現を制御
できる。微生物の他に、多細胞生物由来の細胞培養物も
宿主として使用できる。
方法に関らずに、例えば直接的取込み又はトランスダク
ションによる宿主細胞への異種核酸配列の導入を指す。
異種核酸配列は自律的複製によって維持されうるか、又
は宿主ゲノムに挿入されうる。所望ならば、組換えベク
ターに、指定された宿主と適合性のある適当な制御配列
を付与する。これらの配列は挿入核酸配列の発現を制御
できる。微生物の他に、多細胞生物由来の細胞培養物も
宿主として使用できる。
【００４５】本発明のベクターは好ましくは、所望の形
質転換体を選択するのに用いることができる１種以上の
マーカー、例えばｐＢＲ３２２におけるアンピシリン及
びテトラサイクリン耐性を含む。
質転換体を選択するのに用いることができる１種以上の
マーカー、例えばｐＢＲ３２２におけるアンピシリン及
びテトラサイクリン耐性を含む。
【００４６】適切な宿主細胞は、本発明のタンパク質又
はその変異体もしくはフラグメントをコードする核酸配
列によって、又はこのような核酸配列を含む組換えベク
ターによって形質転換できる微生物又は細胞である。所
望ならば、その宿主細胞を用いてタンパク質（又はその
変異体もしくはフラグメント）を発現させることができ
る。宿主細胞は、原核細胞起源、例えば大腸菌、枯草菌
もしくはシュードモナス属の種などの細菌、あるいは真
核細胞起源、例えばSaccharomyces cerevisiaeなどの酵
母、又は高等真核細胞、例えば昆虫細胞、植物細胞もし
くはヒーラ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞を含む哺乳動物細胞でありうる。昆虫細胞は，
Spodopter frugiperdaのＳｆ９細胞株(Luckowら、Biote
chnology6,47-55,1988)を含む。寄生虫でさえ使用でき
る（例えばリーシュマニア、トキソプラズマ又はエイメ
リア）。
はその変異体もしくはフラグメントをコードする核酸配
列によって、又はこのような核酸配列を含む組換えベク
ターによって形質転換できる微生物又は細胞である。所
望ならば、その宿主細胞を用いてタンパク質（又はその
変異体もしくはフラグメント）を発現させることができ
る。宿主細胞は、原核細胞起源、例えば大腸菌、枯草菌
もしくはシュードモナス属の種などの細菌、あるいは真
核細胞起源、例えばSaccharomyces cerevisiaeなどの酵
母、又は高等真核細胞、例えば昆虫細胞、植物細胞もし
くはヒーラ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞を含む哺乳動物細胞でありうる。昆虫細胞は，
Spodopter frugiperdaのＳｆ９細胞株(Luckowら、Biote
chnology6,47-55,1988)を含む。寄生虫でさえ使用でき
る（例えばリーシュマニア、トキソプラズマ又はエイメ
リア）。
【００４７】真核細胞クローニングシステムにおけるク
ローニングと発現に関する情報はEsser,K.ら(Plasmids
of Eukaryotes, Springer-Verlag, 1986)に記載されて
いる。
ローニングと発現に関する情報はEsser,K.ら(Plasmids
of Eukaryotes, Springer-Verlag, 1986)に記載されて
いる。
【００４８】一般的に、原核細胞が、本発明で有用な組
換えベクターの構築のために好ましい。E.Coli Ｋ１２
株が特に有用であり、特にＤＨ５ａ又はＭＣ１０６１株
が特に有用である。
換えベクターの構築のために好ましい。E.Coli Ｋ１２
株が特に有用であり、特にＤＨ５ａ又はＭＣ１０６１株
が特に有用である。
【００４９】発現のために、本発明の核酸分子は、適切
な発現ベクターに導入でき、そこで該分子が発現制御領
域に機能できるように結合させることができる。このよ
うな制御領域は、プロモーター、エンハンサー、オペレ
ーター、インデューサー、リボソーム結合部位などを含
みうる。それ故、本発明は、１種以上の発現制御配列に
機能できるように結合した、本発明のエイメリアタンパ
ク質又はそのフラグメントもしくは変異体をコードする
核酸配列を含む組換えベクターを提供する。
な発現ベクターに導入でき、そこで該分子が発現制御領
域に機能できるように結合させることができる。このよ
うな制御領域は、プロモーター、エンハンサー、オペレ
ーター、インデューサー、リボソーム結合部位などを含
みうる。それ故、本発明は、１種以上の発現制御配列に
機能できるように結合した、本発明のエイメリアタンパ
ク質又はそのフラグメントもしくは変異体をコードする
核酸配列を含む組換えベクターを提供する。
【００５０】クローニングベクターの選択部位に挿入さ
れた核酸配列は、所望の発現産物の実際の構造遺伝子の
一部ではないヌクレオチドを含みうるし、又は形質転換
宿主がエイメリアタンパク質抗原の１種以上の抗原決定
基（エピトープ）を有する発現産物を産生する限り、所
望の発現産物の完全な構造遺伝子のフラグメントのみを
含みうることを理解すべきであることは当然である。
れた核酸配列は、所望の発現産物の実際の構造遺伝子の
一部ではないヌクレオチドを含みうるし、又は形質転換
宿主がエイメリアタンパク質抗原の１種以上の抗原決定
基（エピトープ）を有する発現産物を産生する限り、所
望の発現産物の完全な構造遺伝子のフラグメントのみを
含みうることを理解すべきであることは当然である。
【００５１】宿主細胞が細菌である場合、使用できる有
用な発現制御配列はＴｒｐプロモーター及びオペレータ
ー(Goeddelら、Nucl.Acids Res., 8,4057,1980)；Ｌａ
ｃプロモーター及びオペレーター(Changeら、Nature 27
5, 615, 1978)；外膜タンパク質プロモーター(Nakamur
a,K. and Inouge,M., EMBO J., 1,771-775,1982)；バク
テリオファージラムダプロモーター及びオペレーター(R
emaut,E.,ら、Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688,198
3)；及び選択された宿主細胞に対し適合性を有する他の
発現増強及び制御配列などである。
用な発現制御配列はＴｒｐプロモーター及びオペレータ
ー(Goeddelら、Nucl.Acids Res., 8,4057,1980)；Ｌａ
ｃプロモーター及びオペレーター(Changeら、Nature 27
5, 615, 1978)；外膜タンパク質プロモーター(Nakamur
a,K. and Inouge,M., EMBO J., 1,771-775,1982)；バク
テリオファージラムダプロモーター及びオペレーター(R
emaut,E.,ら、Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688,198
3)；及び選択された宿主細胞に対し適合性を有する他の
発現増強及び制御配列などである。
【００５２】宿主細胞が酵母である場合、有用な発現制
御配列の例は接合因子である。昆虫細胞の場合、バキュ
ロウイルスのポリヘドリンプロモーター又はｐ１０プロ
モーターを用いることができる(Smith,G.E.ら、Mol. Ce
ll. Biol. 3, 2156-65, 1983)。宿主細胞が哺乳動物起
源である場合、有用な発現発現制御配列の例は、ＳＶ−
４０プロモーター(Berman,P.W.ら、Science, 222, 524-
527, 1983)、メタロチオネインプロモーター(Brinster,
R.L., Nature, 296, 39-42, 1982)、又は熱ショックプ
ロモーター(Voellmyら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 82,
4949-53, 1985)である。あるいは、エイメリアに存在
する発現制御配列も提供できる。遺伝子発現最大化のた
めには、Roberts and Lauer(Methods in Enzymology, 6
8, 473,1979)も参照されたい。
御配列の例は接合因子である。昆虫細胞の場合、バキュ
ロウイルスのポリヘドリンプロモーター又はｐ１０プロ
モーターを用いることができる(Smith,G.E.ら、Mol. Ce
ll. Biol. 3, 2156-65, 1983)。宿主細胞が哺乳動物起
源である場合、有用な発現発現制御配列の例は、ＳＶ−
４０プロモーター(Berman,P.W.ら、Science, 222, 524-
527, 1983)、メタロチオネインプロモーター(Brinster,
R.L., Nature, 296, 39-42, 1982)、又は熱ショックプ
ロモーター(Voellmyら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 82,
4949-53, 1985)である。あるいは、エイメリアに存在
する発現制御配列も提供できる。遺伝子発現最大化のた
めには、Roberts and Lauer(Methods in Enzymology, 6
8, 473,1979)も参照されたい。
【００５３】それ故、本発明は更に、核酸配列によって
コードされたタンパク質の発現によってエイメリアタン
パク質を産生できる上記核酸配列又は組換え核酸分子又
は組換えベクターを含む非トリ宿主を包含する。
コードされたタンパク質の発現によってエイメリアタン
パク質を産生できる上記核酸配列又は組換え核酸分子又
は組換えベクターを含む非トリ宿主を包含する。
【００５４】エイメリア感染に対するトリの免疫処置
は、所謂サブユニットワクチンとして本発明のタンパク
質（又はその変異体もしくはフラグメント）をトリに投
与することで行うことができる。本発明のサブユニット
ワクチンは実質的に純粋形態のタンパク質（又はその変
異体もしくはフラグメント）を、場合によっては医薬と
して許容できる担体の存在下含むことができる。タンパ
ク質（又はその変異体もしくはフラグメント）は、精製
に有利でありうる異種タンパク質（又はその変異体もし
くはフラグメント）と共有結合させることができる。こ
のような異種タンパク質の例は、β−ガラクトシダー
ゼ、プロテインＡ、プロキモシン、血液凝固因子Ｘａな
どである。
は、所謂サブユニットワクチンとして本発明のタンパク
質（又はその変異体もしくはフラグメント）をトリに投
与することで行うことができる。本発明のサブユニット
ワクチンは実質的に純粋形態のタンパク質（又はその変
異体もしくはフラグメント）を、場合によっては医薬と
して許容できる担体の存在下含むことができる。タンパ
ク質（又はその変異体もしくはフラグメント）は、精製
に有利でありうる異種タンパク質（又はその変異体もし
くはフラグメント）と共有結合させることができる。こ
のような異種タンパク質の例は、β−ガラクトシダー
ゼ、プロテインＡ、プロキモシン、血液凝固因子Ｘａな
どである。
【００５５】場合によっては、これらのタンパク質（又
はその変異体もしくはフラグメント）を用いて防御免疫
を起こさせる能力はそれ自体では低いかもしれない。そ
れ故、小フラグメント（場合によっては“ハプテン”と
いう）を、免疫原性を高めるために担体分子と結合して
もよい。この目的のための適切な担体は高分子である。
これらの高分子には、天然ポリマー（例えば、key hole
limpetヘモシアニン、アルブミン、毒素などのタンパ
ク質）、ポリアミノ酸（ポリリシン、ポリアラニン）の
ような合成ポリマー、又はサポニンのような両親媒性化
合物のミセルなどがある。あるいはこれらのフラグメン
トはそのポリマー、好ましくは直鎖状ポリマーであって
もよい。
はその変異体もしくはフラグメント）を用いて防御免疫
を起こさせる能力はそれ自体では低いかもしれない。そ
れ故、小フラグメント（場合によっては“ハプテン”と
いう）を、免疫原性を高めるために担体分子と結合して
もよい。この目的のための適切な担体は高分子である。
これらの高分子には、天然ポリマー（例えば、key hole
limpetヘモシアニン、アルブミン、毒素などのタンパ
ク質）、ポリアミノ酸（ポリリシン、ポリアラニン）の
ような合成ポリマー、又はサポニンのような両親媒性化
合物のミセルなどがある。あるいはこれらのフラグメン
トはそのポリマー、好ましくは直鎖状ポリマーであって
もよい。
【００５６】必要ならば、ワクチンで用いることができ
る本発明のタンパク質（又はその変異体もしくはフラグ
メント）は、インビトロ又はインビボで修飾できる。例
えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン
酸化である。
る本発明のタンパク質（又はその変異体もしくはフラグ
メント）は、インビトロ又はインビボで修飾できる。例
えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン
酸化である。
【００５７】サブユニットワクチンに対する代替は生ワ
クチンである。組換え微生物がまだ複製でき、そのため
に挿入核酸配列によってコードされたポリペプチドを発
現し、感染宿主トリで免疫反応を行えるように、組換え
ＤＮＡ技術によって本発明の核酸分子を微生物（例えば
細菌又はウイルス）に導入できる。M.A.Barryら、Natur
e(1995),377,pp632-635は、核酸分子を用いるワクチン
の製造方法を教示する。
クチンである。組換え微生物がまだ複製でき、そのため
に挿入核酸配列によってコードされたポリペプチドを発
現し、感染宿主トリで免疫反応を行えるように、組換え
ＤＮＡ技術によって本発明の核酸分子を微生物（例えば
細菌又はウイルス）に導入できる。M.A.Barryら、Natur
e(1995),377,pp632-635は、核酸分子を用いるワクチン
の製造方法を教示する。
【００５８】本発明の好適実施態様は、上記異種核酸配
列を含み、組換えベクターウイルスに感染した宿主細胞
又は宿主トリにおいてＤＮＡ配列を発現できる組換えベ
クターウイルスである。“異種”という用語は、本発明
の核酸配列が通常にはベクターウイルスに天然では存在
しないということを指す。
列を含み、組換えベクターウイルスに感染した宿主細胞
又は宿主トリにおいてＤＮＡ配列を発現できる組換えベ
クターウイルスである。“異種”という用語は、本発明
の核酸配列が通常にはベクターウイルスに天然では存在
しないということを指す。
【００５９】更に、本発明は、組換えベクターウイルス
に感染し、核酸配列の発現によってエイメリアタンパク
質（又はその変異体もしくはフラグメント）を産生でき
る宿主細胞又は細胞培養物も包含する。
に感染し、核酸配列の発現によってエイメリアタンパク
質（又はその変異体もしくはフラグメント）を産生でき
る宿主細胞又は細胞培養物も包含する。
【００６０】例えば、インビボ相同組換えという周知技
術を用いて、ベクターウイルスのゲノムに本発明の異種
核酸配列を導入できる。
術を用いて、ベクターウイルスのゲノムに本発明の異種
核酸配列を導入できる。
【００６１】まず第一に、ベクターゲノムの挿入領域、
即ち感染又は複製に必要な機能のようなベクターの必須
の機能を破壊することなしに異種配列の導入に使用でき
る領域と一致するＤＮＡフラグメントを、標準的組換え
ＤＮＡ技術によってクローニングベクターに挿入する。
挿入領域は多数の微生物について報告されている（例え
ば、ＥＰ８０，８０６、ＥＰ１１０，３８５、ＥＰ８
３，２８６、ＥＰ３１４，５６９、ＷＯ８８／０２０２
２、ＷＯ８８／０７０８８、ＵＳ４，７６９，３３０、
ＵＳ４，７２２，８４８）。
即ち感染又は複製に必要な機能のようなベクターの必須
の機能を破壊することなしに異種配列の導入に使用でき
る領域と一致するＤＮＡフラグメントを、標準的組換え
ＤＮＡ技術によってクローニングベクターに挿入する。
挿入領域は多数の微生物について報告されている（例え
ば、ＥＰ８０，８０６、ＥＰ１１０，３８５、ＥＰ８
３，２８６、ＥＰ３１４，５６９、ＷＯ８８／０２０２
２、ＷＯ８８／０７０８８、ＵＳ４，７６９，３３０、
ＵＳ４，７２２，８４８）。
【００６２】第二に、所望ならば、第一の工程で得られ
た組換えベクター分子に存在する挿入領域に欠失を導入
できる。このことは、例えば、第一の工程からの組換え
ベクター分子の適当なエクソヌクレアーゼＩＩＩ消化又
は制限酵素処理によって行うことができる。
た組換えベクター分子に存在する挿入領域に欠失を導入
できる。このことは、例えば、第一の工程からの組換え
ベクター分子の適当なエクソヌクレアーゼＩＩＩ消化又
は制限酵素処理によって行うことができる。
【００６３】第三に、異種核酸配列は、第一の工程の組
換えベクターに存在する挿入配列に挿入されるか、又は
組換えベクターから欠失したＤＮＡの代わりに挿入領域
に挿入される。挿入領域ＤＮＡ配列は、ベクターゲノム
との相同組換えが起るように適当な長さであるべきであ
る。
換えベクターに存在する挿入配列に挿入されるか、又は
組換えベクターから欠失したＤＮＡの代わりに挿入領域
に挿入される。挿入領域ＤＮＡ配列は、ベクターゲノム
との相同組換えが起るように適当な長さであるべきであ
る。
【００６４】その後、適切な細胞は野生型ベクターウイ
ルスで感染させることができ、又は適切なベクターＤＮ
Ａ配列によって隣接された挿入配列を含む組換えベクタ
ー存在下、ベクターゲノムＤＮＡで形質転換させること
ができる（それによって、組換えベクターとベクターゲ
ノム中の対応する領域で組換えが起る）。今や組換えベ
クターの子孫は細胞培養で産生されることができ、例え
ば、ハイブリダイゼーション、異種核酸配列と共に同時
挿入された遺伝子によってコードされた酵素活性の検
出、又は組換えベクターによって発現された抗原異種タ
ンパク質の免疫的検出によって、例えば遺伝子的に又は
表現形質的に選別することができる。
ルスで感染させることができ、又は適切なベクターＤＮ
Ａ配列によって隣接された挿入配列を含む組換えベクタ
ー存在下、ベクターゲノムＤＮＡで形質転換させること
ができる（それによって、組換えベクターとベクターゲ
ノム中の対応する領域で組換えが起る）。今や組換えベ
クターの子孫は細胞培養で産生されることができ、例え
ば、ハイブリダイゼーション、異種核酸配列と共に同時
挿入された遺伝子によってコードされた酵素活性の検
出、又は組換えベクターによって発現された抗原異種タ
ンパク質の免疫的検出によって、例えば遺伝子的に又は
表現形質的に選別することができる。
【００６５】次に、この組換え微生物は免疫処置のため
にトリに投与できる。この組換え微生物はしばらくそれ
自体を維持することができ、又は接種動物体内で複製さ
えでき、本発明の挿入核酸配列によってコードされたタ
ンパク質をインビボで発現し、接種動物の免疫系を刺激
するようになる。本発明の核酸配列の導入のための適切
なベクターはポックスウイルス、例えばワクシニアウイ
ルス(ＥＰ１１０，３８５、ＥＰ８３，２８６、ＵＳ
４，７６９，３３０、ＵＳ４，７２２，８４８)もしく
は鶏痘ウイルス（ＷＯ８８／０２０２２）、ＨＶＴ（Ｗ
Ｏ８８／０７０８８）もしくはマレック病ウイルスのよ
うなヘルペスウイルス、アデノウイルスもしくはインフ
ルエンザウイルスなどのウイルス、あるいは大腸菌もし
くは特定のサルモネラの種のような細菌から得ることが
できる。この型の組換え微生物では、宿主動物で合成さ
れたタンパク質は表面抗原として曝されることができ
る。上記のことから、該タンパク質と、該生物によって
認識されるシグナル及びアンカー配列の例えば大腸菌又
は合成によって提供されるＯＭＰタンパク質（又はその
変異体もしくはフラグメント）又は線毛タンパク質（又
はその変異体もしくはフラグメント）との融合が考えら
れる。所望ならば、より大きい全体の一部として、免疫
処置される動物体内でエイメリアタンパク質が放出され
ることも可能である。これらの場合の全てで、１種以上
の免疫原性産物の、種々の病原体に対する防御及び／又
はある特定の病原体の種々の抗原に対する防御を生じさ
せる発現も可能である。
にトリに投与できる。この組換え微生物はしばらくそれ
自体を維持することができ、又は接種動物体内で複製さ
えでき、本発明の挿入核酸配列によってコードされたタ
ンパク質をインビボで発現し、接種動物の免疫系を刺激
するようになる。本発明の核酸配列の導入のための適切
なベクターはポックスウイルス、例えばワクシニアウイ
ルス(ＥＰ１１０，３８５、ＥＰ８３，２８６、ＵＳ
４，７６９，３３０、ＵＳ４，７２２，８４８)もしく
は鶏痘ウイルス（ＷＯ８８／０２０２２）、ＨＶＴ（Ｗ
Ｏ８８／０７０８８）もしくはマレック病ウイルスのよ
うなヘルペスウイルス、アデノウイルスもしくはインフ
ルエンザウイルスなどのウイルス、あるいは大腸菌もし
くは特定のサルモネラの種のような細菌から得ることが
できる。この型の組換え微生物では、宿主動物で合成さ
れたタンパク質は表面抗原として曝されることができ
る。上記のことから、該タンパク質と、該生物によって
認識されるシグナル及びアンカー配列の例えば大腸菌又
は合成によって提供されるＯＭＰタンパク質（又はその
変異体もしくはフラグメント）又は線毛タンパク質（又
はその変異体もしくはフラグメント）との融合が考えら
れる。所望ならば、より大きい全体の一部として、免疫
処置される動物体内でエイメリアタンパク質が放出され
ることも可能である。これらの場合の全てで、１種以上
の免疫原性産物の、種々の病原体に対する防御及び／又
はある特定の病原体の種々の抗原に対する防御を生じさ
せる発現も可能である。
【００６６】本発明のベクターワクチンは、組換え細
菌、又は本発明の核酸配列を含む組換えベクターに感染
した宿主細胞を培養することによって製造でき、その後
組換え細菌又はベクター含有細胞及び／もしくは細胞中
で増殖した組換えベクターウイルスを集め、場合によっ
ては純粋形態で集め、ワクチン、場合によっては純粋形
態のワクチンに形成でき、場合によっては凍結乾燥形態
のワクチンに形成できる。
菌、又は本発明の核酸配列を含む組換えベクターに感染
した宿主細胞を培養することによって製造でき、その後
組換え細菌又はベクター含有細胞及び／もしくは細胞中
で増殖した組換えベクターウイルスを集め、場合によっ
ては純粋形態で集め、ワクチン、場合によっては純粋形
態のワクチンに形成でき、場合によっては凍結乾燥形態
のワクチンに形成できる。
【００６７】本発明の組換えベクターで形質転換された
宿主細胞は、核酸配列によってコードされたタンパク質
の発現に適した条件下での培養物でもありうる。粗培養
物、宿主細胞溶解液又は宿主細胞抽出液のサンプルを用
いてワクチンを製造できるが、別の実施態様では、意図
した使用に基づき、本発明のより精製したタンパク質を
ワクチンに形成する。産生したタンパク質を精製するた
めに、本発明の組換えベクターで形質転換された宿主細
胞を、適当な培地で培養し、産生されたタンパク質をこ
のような細胞から、又はタンパク質（又はその変異体も
しくはフラグメント）が分泌されるならば培地から単離
する。培地に分泌されたタンパク質は、標準的技術、例
えば塩分画、遠心、限外濾過、クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過又は免疫アフィニティクロマトグラフィーによっ
て単離精製でき、一方細胞内タンパク質は、最初に細胞
を集め、細胞を破壊し、例えば音波処理又はフレンチプ
レスのような他の機械的破壊法で破壊し、該タンパク質
を他の細胞内成分から分離して単離でき、該タンパク質
をワクチンに形成できる。細胞破壊も、化学的方法（例
えばＥＤＴＡの使用又はトライトンＸ１１４のような界
面活性剤の使用）、又はリゾチーム消化のような酵素的
方法によっても行うことができる。
宿主細胞は、核酸配列によってコードされたタンパク質
の発現に適した条件下での培養物でもありうる。粗培養
物、宿主細胞溶解液又は宿主細胞抽出液のサンプルを用
いてワクチンを製造できるが、別の実施態様では、意図
した使用に基づき、本発明のより精製したタンパク質を
ワクチンに形成する。産生したタンパク質を精製するた
めに、本発明の組換えベクターで形質転換された宿主細
胞を、適当な培地で培養し、産生されたタンパク質をこ
のような細胞から、又はタンパク質（又はその変異体も
しくはフラグメント）が分泌されるならば培地から単離
する。培地に分泌されたタンパク質は、標準的技術、例
えば塩分画、遠心、限外濾過、クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過又は免疫アフィニティクロマトグラフィーによっ
て単離精製でき、一方細胞内タンパク質は、最初に細胞
を集め、細胞を破壊し、例えば音波処理又はフレンチプ
レスのような他の機械的破壊法で破壊し、該タンパク質
を他の細胞内成分から分離して単離でき、該タンパク質
をワクチンに形成できる。細胞破壊も、化学的方法（例
えばＥＤＴＡの使用又はトライトンＸ１１４のような界
面活性剤の使用）、又はリゾチーム消化のような酵素的
方法によっても行うことができる。
【００６８】本発明のタンパク質に対する抗体又はその
誘導体（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）2、又はＦｖフラ
グメントのようなフラグメント）は受身免疫療法、診断
免疫アッセイ及び抗イデオタイプ抗体の生成において使
用する可能性を有する。好ましくは、これらのものは本
発明のエイメリアタンパク質又はその変異体／フラグメ
ントに対し特異的である。抗体又はその誘導体を含む血
清も提供できる。
誘導体（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）2、又はＦｖフラ
グメントのようなフラグメント）は受身免疫療法、診断
免疫アッセイ及び抗イデオタイプ抗体の生成において使
用する可能性を有する。好ましくは、これらのものは本
発明のエイメリアタンパク質又はその変異体／フラグメ
ントに対し特異的である。抗体又はその誘導体を含む血
清も提供できる。
【００６９】上記で特徴づけたエイメリアタンパク質
（又はその変異体もしくはフラグメント）を用い抗体を
産生できる。その抗体はポリクローナル、単一特異性も
しくはモノクローナル（又はその誘導体）でありうる。
ポリクローナル抗体が所望ならば、ポリクローナル血清
を産生し、プロセシングを行わせる技術は当業界公知で
ある（例えば、Mayer and Walter編、Immunochemical M
ethods in Cell and Molecular Biology, Academic Pre
ss, London, 1987）。免疫原に対する単一特異性抗体
は、Hallら(Nature, 311, 379-387, 1984)の方法の変法
によって多重特異性抗血清からアフィニティ生成でき
る。本明細書で使用する単一特異性抗体は、問題の抗原
に対し均一結合特徴を有する単一抗体種又は多重抗体種
と定義される。本明細書で使用する均一結合とは、特異
的抗原又はエピトープに結合する抗体種の能力を指す。
（又はその変異体もしくはフラグメント）を用い抗体を
産生できる。その抗体はポリクローナル、単一特異性も
しくはモノクローナル（又はその誘導体）でありうる。
ポリクローナル抗体が所望ならば、ポリクローナル血清
を産生し、プロセシングを行わせる技術は当業界公知で
ある（例えば、Mayer and Walter編、Immunochemical M
ethods in Cell and Molecular Biology, Academic Pre
ss, London, 1987）。免疫原に対する単一特異性抗体
は、Hallら(Nature, 311, 379-387, 1984)の方法の変法
によって多重特異性抗血清からアフィニティ生成でき
る。本明細書で使用する単一特異性抗体は、問題の抗原
に対し均一結合特徴を有する単一抗体種又は多重抗体種
と定義される。本明細書で使用する均一結合とは、特異
的抗原又はエピトープに結合する抗体種の能力を指す。
【００７０】本発明のエイメリアタンパク質（又はその
変異体もしくはフラグメント）に対して反応性のモノク
ローナル抗体は、当業界公知技術（Kohler and Milstei
n, Nature, 256, 495-497, 1975）によって近交系マウ
スを免疫処置して製造できる。ハイブリドーマ細胞は、
ダルベッコ改変イーグル培地のような適当な細胞培養培
地でヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリン存在
下での増殖で選別する。抗体産生ハイブリドーマをクロ
ーンする。好ましくはMacPhersonの軟寒天技術（軟寒天
技術、Tissue Culture Methods and Applications, Kru
se and Paterson編、Academic Press, 276, 1973）を用
いてクローンする。離れ離れのコロニーを、適当な培養
培地中の培養のために、培養プレートの個々のウエルに
移す。抗体産生細胞を、適当な免疫原によるスクリーニ
ングで同定する。免疫原に対して陽性のハイブリドーマ
細胞を当業界公知技術で維持する。特異的抗モノクロー
ナル抗体は、インビトロでハイブリドーマを培養する
か、又は当業界公知方法によるハイブリドーマ注射の
後、マウスの腹水を調製して生産する。
変異体もしくはフラグメント）に対して反応性のモノク
ローナル抗体は、当業界公知技術（Kohler and Milstei
n, Nature, 256, 495-497, 1975）によって近交系マウ
スを免疫処置して製造できる。ハイブリドーマ細胞は、
ダルベッコ改変イーグル培地のような適当な細胞培養培
地でヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリン存在
下での増殖で選別する。抗体産生ハイブリドーマをクロ
ーンする。好ましくはMacPhersonの軟寒天技術（軟寒天
技術、Tissue Culture Methods and Applications, Kru
se and Paterson編、Academic Press, 276, 1973）を用
いてクローンする。離れ離れのコロニーを、適当な培養
培地中の培養のために、培養プレートの個々のウエルに
移す。抗体産生細胞を、適当な免疫原によるスクリーニ
ングで同定する。免疫原に対して陽性のハイブリドーマ
細胞を当業界公知技術で維持する。特異的抗モノクロー
ナル抗体は、インビトロでハイブリドーマを培養する
か、又は当業界公知方法によるハイブリドーマ注射の
後、マウスの腹水を調製して生産する。
【００７１】抗イデオタイプ抗体は、ワクチン中の免疫
原として使用できる防御しようとする病原体の抗原の
“内部イメージ”を有する免疫グロブリンである(Drees
manら、J.Infect.Disease, 151, 761, 1985)。抗イデ
オタイプ抗体を作出する技術は当業界公知である(MacNa
maraら、Science 226, 1325, 1984)。
原として使用できる防御しようとする病原体の抗原の
“内部イメージ”を有する免疫グロブリンである(Drees
manら、J.Infect.Disease, 151, 761, 1985)。抗イデ
オタイプ抗体を作出する技術は当業界公知である(MacNa
maraら、Science 226, 1325, 1984)。
【００７２】本発明のワクチンは通常の能動免疫スキー
ムで投与できる。即ち、投与方式と適合性を有するよう
な、且つ予防的に有効な量、即ち免疫抗原量又は毒性の
エイメリア寄生虫による攻撃に対しトリ（特に家禽）に
おいて免疫を誘導する抗原の発現が可能な組換え微生物
量を用いる単一又は反復投与である。免疫とは、非ワク
チン群と比較してワクチン接種後、トリの集団における
有意のレベルの防御の誘導と定義される。
ムで投与できる。即ち、投与方式と適合性を有するよう
な、且つ予防的に有効な量、即ち免疫抗原量又は毒性の
エイメリア寄生虫による攻撃に対しトリ（特に家禽）に
おいて免疫を誘導する抗原の発現が可能な組換え微生物
量を用いる単一又は反復投与である。免疫とは、非ワク
チン群と比較してワクチン接種後、トリの集団における
有意のレベルの防御の誘導と定義される。
【００７３】本発明のタンパク質を含むワクチンは感染
動物によって播かれるオーシスト数を減少させることが
できる。通常、播かれたオーシストは群の中の他の動物
に感染する。播かれるオーシスト数の減少により、次に
感染する動物数も減少し、また、播かれるオーシスト数
の減少により感染の負荷を小さくする。
動物によって播かれるオーシスト数を減少させることが
できる。通常、播かれたオーシストは群の中の他の動物
に感染する。播かれるオーシスト数の減少により、次に
感染する動物数も減少し、また、播かれるオーシスト数
の減少により感染の負荷を小さくする。
【００７４】更に寄生虫それ自体に対する効果無くして
でさえ、ワクチンは疾患の発生を減少させうる。疾患の
症状が寄生虫によって放出される産物によって引起され
るときには、このことが特に当てはまる。このような産
物に対するワクチンは、寄生虫を攻撃することなくして
症状を軽減させる。
でさえ、ワクチンは疾患の発生を減少させうる。疾患の
症状が寄生虫によって放出される産物によって引起され
るときには、このことが特に当てはまる。このような産
物に対するワクチンは、寄生虫を攻撃することなくして
症状を軽減させる。
【００７５】とにかく、次なるエイメリア感染による攻
撃のときに、本発明のワクチンがトリにおける盲腸病巣
の数を減少させることができることが好ましい。
撃のときに、本発明のワクチンがトリにおける盲腸病巣
の数を減少させることができることが好ましい。
【００７６】生ウイルスワクチンの場合、ニワトリ１匹
当りの投与割合は１０3〜１０8ｐｆｕの範囲でありうる
（しかし、１０００未満のｐｆｕでさえ、例えばＨＶＴ
の場合十分でありうる）。本発明の典型的サブユニット
ワクチンは本発明のタンパク質（又はその変異体もしく
はフラグメント）を０．１〜１００μｇ含む。５μｇ以
上存在するのが好ましい。このようなワクチンは皮膚
内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口又は鼻内投与
できる。
当りの投与割合は１０3〜１０8ｐｆｕの範囲でありうる
（しかし、１０００未満のｐｆｕでさえ、例えばＨＶＴ
の場合十分でありうる）。本発明の典型的サブユニット
ワクチンは本発明のタンパク質（又はその変異体もしく
はフラグメント）を０．１〜１００μｇ含む。５μｇ以
上存在するのが好ましい。このようなワクチンは皮膚
内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口又は鼻内投与
できる。
【００７７】更に、ワクチンは、活性及び／又は保存期
間を増大させるために、しばしば他の成分と混合した水
性媒質又は水含有懸濁液も含みうる。これらの成分は
塩、ｐＨ緩衝液、安定化剤（スキムミルク又はカゼイン
加水分解物など）、乳化剤、免疫反応改善のためのアジ
ュバント（例えば、油、ムラミルジペプチド、水酸化ア
ルミニウム、サポニン、ポリアニオン、及び両親媒性物
質）及び／又は保存剤でありうる。好適なアジュバント
はクイルＡ（Quil A）である。これは、例えば約１５０
μｇ／投与のレベルで投与できる。
間を増大させるために、しばしば他の成分と混合した水
性媒質又は水含有懸濁液も含みうる。これらの成分は
塩、ｐＨ緩衝液、安定化剤（スキムミルク又はカゼイン
加水分解物など）、乳化剤、免疫反応改善のためのアジ
ュバント（例えば、油、ムラミルジペプチド、水酸化ア
ルミニウム、サポニン、ポリアニオン、及び両親媒性物
質）及び／又は保存剤でありうる。好適なアジュバント
はクイルＡ（Quil A）である。これは、例えば約１５０
μｇ／投与のレベルで投与できる。
【００７８】本発明のタンパク質、変異体又はフラグメ
ントを含むワクチンは、E.tenellaの他の免疫原タンパ
ク質又は他のエイメリア属の種の免疫原タンパク質も含
みうる。このような組合せワクチンは一群のトリに対す
る寄生虫の負荷を減少させることができ、コクシジウム
症に対する防御のレベルを増加させることができる。
ントを含むワクチンは、E.tenellaの他の免疫原タンパ
ク質又は他のエイメリア属の種の免疫原タンパク質も含
みうる。このような組合せワクチンは一群のトリに対す
る寄生虫の負荷を減少させることができ、コクシジウム
症に対する防御のレベルを増加させることができる。
【００７９】本発明のワクチンはまた、トリの他の病原
体関連免疫原を含みうるし、又はマレック病ウイルス
（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感
染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血病原体
（ＣＡＡ）、レオウイルス、トリレトロウイルス、ニワ
トリアデノウイルス、七面鳥鼻気管炎ウイルス、もしく
は大腸菌のような免疫原をコードする核酸配列を含みう
る。
体関連免疫原を含みうるし、又はマレック病ウイルス
（ＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、感
染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血病原体
（ＣＡＡ）、レオウイルス、トリレトロウイルス、ニワ
トリアデノウイルス、七面鳥鼻気管炎ウイルス、もしく
は大腸菌のような免疫原をコードする核酸配列を含みう
る。
【００８０】本発明は、本発明のタンパク質（又はその
変異体もしくはフラグメント）を含む“免疫化学試薬”
にも関する。“免疫化学試薬”という用語は、本発明の
タンパク質（又はその変異体もしくはフラグメント）が
適切な支持体に結合しているか、又は標識物質を有する
ことを意味する。
変異体もしくはフラグメント）を含む“免疫化学試薬”
にも関する。“免疫化学試薬”という用語は、本発明の
タンパク質（又はその変異体もしくはフラグメント）が
適切な支持体に結合しているか、又は標識物質を有する
ことを意味する。
【００８１】使用できる支持体は、例えば微量試験ウエ
ルもしくはキュベットの内壁、チューブもしくはキャピ
ラリー、膜、フィルター、試験片、又は例えばラテック
ス粒子、赤血球、色素ゾル、金属ゾル、もしくはゾル粒
子として金属化合物のような粒子の表面である。（ゾル
とは、金属のようにそれ自体は水に不溶な微粒子の安定
な懸濁液である。） 使用できる標識物質は特に、放射性同位元素、蛍光化合
物、酵素、色素ゾル、又はゾル粒子としての金属化合物
である。
ルもしくはキュベットの内壁、チューブもしくはキャピ
ラリー、膜、フィルター、試験片、又は例えばラテック
ス粒子、赤血球、色素ゾル、金属ゾル、もしくはゾル粒
子として金属化合物のような粒子の表面である。（ゾル
とは、金属のようにそれ自体は水に不溶な微粒子の安定
な懸濁液である。） 使用できる標識物質は特に、放射性同位元素、蛍光化合
物、酵素、色素ゾル、又はゾル粒子としての金属化合物
である。
【００８２】本発明の核酸分子はまた、サンプル中のエ
イメリア関連核酸の検出を可能にするハイブリダイゼー
ション用の特異的プローブを提供するためにも使用でき
る。このようなハイブリダイゼーションはストリンジェ
ント条件下で行うのが好ましい。（例えば、約０．９Ｍ
の塩溶液を用いて、温度約３５〜約６５℃で行う。しか
し、当業者ならば、プローブの長さ、塩基組成、存在す
るイオンのタイプなどの変数を考慮するために、このよ
うなパラメーターを適宜変えることができよう。） 本発明は、エイメリア感染の診断に有用な、本発明の核
酸分子を含む試験キットも包含する。試験キットはプロ
ーブ又はプライマーとして提供できる。例えばプライマ
ーはＰＣＲで使用できる。
イメリア関連核酸の検出を可能にするハイブリダイゼー
ション用の特異的プローブを提供するためにも使用でき
る。このようなハイブリダイゼーションはストリンジェ
ント条件下で行うのが好ましい。（例えば、約０．９Ｍ
の塩溶液を用いて、温度約３５〜約６５℃で行う。しか
し、当業者ならば、プローブの長さ、塩基組成、存在す
るイオンのタイプなどの変数を考慮するために、このよ
うなパラメーターを適宜変えることができよう。） 本発明は、エイメリア感染の診断に有用な、本発明の核
酸分子を含む試験キットも包含する。試験キットはプロ
ーブ又はプライマーとして提供できる。例えばプライマ
ーはＰＣＲで使用できる。
【００８３】本発明は更に、免疫アッセイで有用な試験
キットを包含する。
キットを包含する。
【００８４】この試験キットは、本発明の少なくとも１
種の免疫処化学試薬を含みうる。このような試験キット
を用いて行う免疫化学反応は、サンドイッチ反応、凝集
反応、競合反応又は阻害反応であることが好ましい。
種の免疫処化学試薬を含みうる。このような試験キット
を用いて行う免疫化学反応は、サンドイッチ反応、凝集
反応、競合反応又は阻害反応であることが好ましい。
【００８５】サンドイッチ反応を行う場合、試験キット
は例えば、微量試験ウエルの内壁のような固体支持体に
結合した本発明のタンパク質、変異体、又はフラグメン
トを含みうる。あるいは、試験キットは本発明の標識さ
れたタンパク質を含みうる。
は例えば、微量試験ウエルの内壁のような固体支持体に
結合した本発明のタンパク質、変異体、又はフラグメン
トを含みうる。あるいは、試験キットは本発明の標識さ
れたタンパク質を含みうる。
【００８６】しかし、試験キットは上記の成分を含む必
要はない。試験キットは１種以上の抗体又はその誘導体
を含みうる。
要はない。試験キットは１種以上の抗体又はその誘導体
を含みうる。
【００８７】
【発明の実施の形態】本発明を、図面に関してのみ実施
例として説明する。
例として説明する。
【００８８】材料及び方法 実験の設計 E.tenella感染ニワトリからのＴ細胞をインビトロで刺
激する能力について、上清のリンパ球増殖及びＭＡＦ活
性を測定して、E.tenellaのスポロゾイトタンパク質分
画を試験した。１０００個の胞子形成E.tenellaオーシ
ストをニワトリに経口接種して、８日後、インビトロで
刺激についてＰＢＬを試験した。
激する能力について、上清のリンパ球増殖及びＭＡＦ活
性を測定して、E.tenellaのスポロゾイトタンパク質分
画を試験した。１０００個の胞子形成E.tenellaオーシ
ストをニワトリに経口接種して、８日後、インビトロで
刺激についてＰＢＬを試験した。
【００８９】Ｔ細胞を刺激したスポロゾイト分画をワク
チン組成物として用い、Ｔ細胞関連免疫原性と効力につ
いて試験した。強力なE.tenella攻撃後、盲腸病巣の減
少によってワクチン効力を評価した。
チン組成物として用い、Ｔ細胞関連免疫原性と効力につ
いて試験した。強力なE.tenella攻撃後、盲腸病巣の減
少によってワクチン効力を評価した。
【００９０】ニワトリ 特定の病原体が存在しない条件下で飼育した異系交配、
不稔の白色レグホンニワトリを、食物と水を自由に摂る
ことができる隔離室で飼育した。排泄物を週毎にモニタ
ーし、ニワトリが望まないコクシジウム感染していない
ことを確かめた。感染のために、５〜７週齢のニワトリ
を用いた。ワクチン接種のために、３週齢ニワトリを用
いた。
不稔の白色レグホンニワトリを、食物と水を自由に摂る
ことができる隔離室で飼育した。排泄物を週毎にモニタ
ーし、ニワトリが望まないコクシジウム感染していない
ことを確かめた。感染のために、５〜７週齢のニワトリ
を用いた。ワクチン接種のために、３週齢ニワトリを用
いた。
【００９１】寄生虫及びスポロゾイトの精製 E.tenellaのウエイブリッジ株を用いた(Shirley 198
6)。コクシジウムの存在しないニワトリに規則的間隔で
該寄生虫を接種した。オーシストの取扱い、胞子形成オ
ーシストからのスポロシストとスポロゾイトの放出を、
胆汁酸塩(Toyama &Kitano 1983)の代わりに０．４％タ
ウロコレート(Sigma, St.Louis, MO, USA)を用いて、以
前に報告されたように(Longら、1976)行った。スポロゾ
イトは、ナイロンウール通過によって更に精製し(Larse
nら 1984)、ペレットとして−７０℃に保存した。
6)。コクシジウムの存在しないニワトリに規則的間隔で
該寄生虫を接種した。オーシストの取扱い、胞子形成オ
ーシストからのスポロシストとスポロゾイトの放出を、
胆汁酸塩(Toyama &Kitano 1983)の代わりに０．４％タ
ウロコレート(Sigma, St.Louis, MO, USA)を用いて、以
前に報告されたように(Longら、1976)行った。スポロゾ
イトは、ナイロンウール通過によって更に精製し(Larse
nら 1984)、ペレットとして−７０℃に保存した。
【００９２】スポロゾイトタンパク質分画 トライトンＸ１１４抽出 トライトンＸ−１１４抽出を行い、全スポロゾイトタン
パク質の親水性相（ＨＰＳ）を単離した(Bordier 198
1)。２×１０9個の精製E.tenellaスポロゾイトを、プロ
テアーゼ阻害剤（１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニ
ル(PMSF, Serva, Heidelberg, Germany)、５μｇ／ｍＬ
アプロチニン、１μｇ／ｍＬロイペプチン、及び１μｇ
／ｍＬペプスタチンＡ）を補充した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４（ＴＢ
Ｓ）中に懸濁し（１×１０9／ｍｌ）、氷上で位置７で
２０秒間、３回音波処理した(Branson, Soest, The Net
herlandsからの音波処理機を用いる)。予め濃縮された
トライトンＸ−１１４(Serva)を最終濃度１０％（ｖ／
ｖ）までスポロゾイト懸濁液に加え、十分に混合し、タ
ンパク質を溶解させた（全容量１０ｍＬ）。不溶物質を
遠心でペレットにした（４℃で１２０００ｇ、２０分
間）。回収した上清をスクロースクッションに重層し、
４０℃で１５分インキュベートし（相分離）、室温（Ｒ
Ｔ）で４００ｇ、１０分間遠心した。親水性分画の抽出
を１０％（ｖ／ｖ）前濃縮トライトンＸ−１１４、次に
２０％（ｖ／ｖ）で一度繰返した。bichinchonic acid
（ＢＣＡ）アッセイ(Pierce Chemicals, Rockford, Roc
kford, Illinois, USA)を用いて、全タンパク質濃度を
測定した。更なる使用まで、この親水性相を−７０℃で
保存した。
パク質の親水性相（ＨＰＳ）を単離した(Bordier 198
1)。２×１０9個の精製E.tenellaスポロゾイトを、プロ
テアーゼ阻害剤（１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニ
ル(PMSF, Serva, Heidelberg, Germany)、５μｇ／ｍＬ
アプロチニン、１μｇ／ｍＬロイペプチン、及び１μｇ
／ｍＬペプスタチンＡ）を補充した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４（ＴＢ
Ｓ）中に懸濁し（１×１０9／ｍｌ）、氷上で位置７で
２０秒間、３回音波処理した(Branson, Soest, The Net
herlandsからの音波処理機を用いる)。予め濃縮された
トライトンＸ−１１４(Serva)を最終濃度１０％（ｖ／
ｖ）までスポロゾイト懸濁液に加え、十分に混合し、タ
ンパク質を溶解させた（全容量１０ｍＬ）。不溶物質を
遠心でペレットにした（４℃で１２０００ｇ、２０分
間）。回収した上清をスクロースクッションに重層し、
４０℃で１５分インキュベートし（相分離）、室温（Ｒ
Ｔ）で４００ｇ、１０分間遠心した。親水性分画の抽出
を１０％（ｖ／ｖ）前濃縮トライトンＸ−１１４、次に
２０％（ｖ／ｖ）で一度繰返した。bichinchonic acid
（ＢＣＡ）アッセイ(Pierce Chemicals, Rockford, Roc
kford, Illinois, USA)を用いて、全タンパク質濃度を
測定した。更なる使用まで、この親水性相を−７０℃で
保存した。
【００９３】Ｐｒｅｐ−ｃｅｌｌ分画 全ての操作は４℃で行った。分画前に、アセトン沈殿で
ＨＰＳを濃縮した。４℃、１５０００ｇ、１０分間の遠
心及び空気乾燥後、３０ｍｇ／ｍＬジチオトレイトール
（ＤＴＴ）を含有する還元サンプル緩衝液(Laemmli 197
0)にペレットを溶解し、１００℃で３分間煮沸した。Bi
o-Rad Prep cell 装置(Bio-Rad Labs, Richmond, CA)の
３７ｍｍチューブ中の１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルア
ミド（ＰＡＡ）分離ゲル（７ｃｍ）と４％（ｗ／ｖ）Ｐ
ＡＡスタッキングゲルを製造業者のプロトコルの通りに
用いて、親水性タンパク質を分画した。Prepcellを、４
０ｍＡ、最大５００Ｖで操作した。分画（±３ｍＬ）を
一晩集め、−８５℃で保存した。分画のサンプルを２倍
濃度還元サンプル緩衝液で一度希釈し、分析のために１
２％（ｗ／ｖ）ＰＡＡゲルを用いるドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリアルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）(Laemmli 1970)にかけた。Wrayら(1981)の方法に
より、ゲルを銀染色した。相対的分子量に基づき５０個
の分画を９個の分画にまとめ、０．０１Ｍリン酸緩衝化
生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．３に対し透析した。プー
ルした分画の全タンパク質濃度をＢＣＡアッセイを用い
て測定した。
ＨＰＳを濃縮した。４℃、１５０００ｇ、１０分間の遠
心及び空気乾燥後、３０ｍｇ／ｍＬジチオトレイトール
（ＤＴＴ）を含有する還元サンプル緩衝液(Laemmli 197
0)にペレットを溶解し、１００℃で３分間煮沸した。Bi
o-Rad Prep cell 装置(Bio-Rad Labs, Richmond, CA)の
３７ｍｍチューブ中の１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルア
ミド（ＰＡＡ）分離ゲル（７ｃｍ）と４％（ｗ／ｖ）Ｐ
ＡＡスタッキングゲルを製造業者のプロトコルの通りに
用いて、親水性タンパク質を分画した。Prepcellを、４
０ｍＡ、最大５００Ｖで操作した。分画（±３ｍＬ）を
一晩集め、−８５℃で保存した。分画のサンプルを２倍
濃度還元サンプル緩衝液で一度希釈し、分析のために１
２％（ｗ／ｖ）ＰＡＡゲルを用いるドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリアルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）(Laemmli 1970)にかけた。Wrayら(1981)の方法に
より、ゲルを銀染色した。相対的分子量に基づき５０個
の分画を９個の分画にまとめ、０．０１Ｍリン酸緩衝化
生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．３に対し透析した。プー
ルした分画の全タンパク質濃度をＢＣＡアッセイを用い
て測定した。
【００９４】リンパ球増殖アッセイ用スポロゾイト分画
の調製 残りの界面活性剤を除去するために、プールした分画と
ＨＰＳをBiobeads(Calbiochem, La Jolla, CA)で処理し
た。最初にＰＢＳ（０．０４Ｍ，ｐＨ７．３，２８０−
３００ｍＯｓｍ／Ｋｇ）で５回ビーズを洗浄し、２ｍＭ
Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２
００ＩＵ／ｍＬ ペニシリン、２００μｇ／ｍＬストレ
プトマイシン（ＲＰＭＩ−ＧＰＰＳ）、及び２％正常ニ
ワトリ血清(GIBCO, Life Technologies Paisley, Unite
d Kingdom)を補充したＲＰＭＩ １６４０培地(Dutch mo
dification)と共に３０分間インキュベートした。回転
プラットフォーム上室温で１時間、サンプルをビーズと
共にインキュベートし、次に４℃でＰＢＳに対し透析し
た。アセトン沈殿後、タンパク質ペレットを９６％エタ
ノールで洗浄し、空気乾燥し、ＲＰＭＩ−ＧＰＰＳに溶
解した。
の調製 残りの界面活性剤を除去するために、プールした分画と
ＨＰＳをBiobeads(Calbiochem, La Jolla, CA)で処理し
た。最初にＰＢＳ（０．０４Ｍ，ｐＨ７．３，２８０−
３００ｍＯｓｍ／Ｋｇ）で５回ビーズを洗浄し、２ｍＭ
Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２
００ＩＵ／ｍＬ ペニシリン、２００μｇ／ｍＬストレ
プトマイシン（ＲＰＭＩ−ＧＰＰＳ）、及び２％正常ニ
ワトリ血清(GIBCO, Life Technologies Paisley, Unite
d Kingdom)を補充したＲＰＭＩ １６４０培地(Dutch mo
dification)と共に３０分間インキュベートした。回転
プラットフォーム上室温で１時間、サンプルをビーズと
共にインキュベートし、次に４℃でＰＢＳに対し透析し
た。アセトン沈殿後、タンパク質ペレットを９６％エタ
ノールで洗浄し、空気乾燥し、ＲＰＭＩ−ＧＰＰＳに溶
解した。
【００９５】リンパ球増殖アッセイ ＰＢＬの増殖反応を、Breedら、1996の報告のように[3
Ｈ]チミジン取込みで測定した。以下に簡単に述べる。
感染、ワクチン接種、又は対照ニワトリからのＰＢＬ
を、全E.tenellaスポロゾイト抗原（ウエル当り３×１
０5スポロゾイトに相当）、これらのＨＰＳ分画（１０
−１５μｇ／ウエル）、もしくはこれらのプールした分
画（５０μＬ／ウエル）の存在下、又は培地だけで、全
量１５０μＬの１％（ｖ／ｖ）正常ニワトリ血清(GIBC
O; Life Technologies, Paisley, United Kingdom)を補
充したＲＰＭＩ−ＧＰＰＳ中で、丸底９６ウエルマイク
ロタイタープレート(Nunc, Kampstrump, Denmark)中で
培養した（１×１０6／ｗｅｌｌ）。インキュベーショ
ン６４時間後、プレートを遠心し、８０μＬ培養液を取
出し、ＭＡＦ活性の存在についてアッセイした（亜硝酸
アッセイを参照）。新鮮ＲＰＭＩ−ＧＰＰＳ培地を加
え、細胞に最後の８時間、ウエル当り[3Ｈ]チミジン１
８．５ｋＢｑ（比活性１８５ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）をパル
スした。[3Ｈ]チミジン取込みを、ベータプレート１２
０５(Wallac, Turku, finland)を用い測定した。増殖反
応を刺激指数（ＳＩ）として表した。刺激指数は、刺激
後のカウント／分（ＣＰＭ）で表した平均増殖 対 培
地対照値の比を表す。
Ｈ]チミジン取込みで測定した。以下に簡単に述べる。
感染、ワクチン接種、又は対照ニワトリからのＰＢＬ
を、全E.tenellaスポロゾイト抗原（ウエル当り３×１
０5スポロゾイトに相当）、これらのＨＰＳ分画（１０
−１５μｇ／ウエル）、もしくはこれらのプールした分
画（５０μＬ／ウエル）の存在下、又は培地だけで、全
量１５０μＬの１％（ｖ／ｖ）正常ニワトリ血清(GIBC
O; Life Technologies, Paisley, United Kingdom)を補
充したＲＰＭＩ−ＧＰＰＳ中で、丸底９６ウエルマイク
ロタイタープレート(Nunc, Kampstrump, Denmark)中で
培養した（１×１０6／ｗｅｌｌ）。インキュベーショ
ン６４時間後、プレートを遠心し、８０μＬ培養液を取
出し、ＭＡＦ活性の存在についてアッセイした（亜硝酸
アッセイを参照）。新鮮ＲＰＭＩ−ＧＰＰＳ培地を加
え、細胞に最後の８時間、ウエル当り[3Ｈ]チミジン１
８．５ｋＢｑ（比活性１８５ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）をパル
スした。[3Ｈ]チミジン取込みを、ベータプレート１２
０５(Wallac, Turku, finland)を用い測定した。増殖反
応を刺激指数（ＳＩ）として表した。刺激指数は、刺激
後のカウント／分（ＣＰＭ）で表した平均増殖 対 培
地対照値の比を表す。
【００９６】亜硝酸アッセイ ＨＤ１１ニワトリマクロファージによる酸化窒素の生成
(Beugら、1979)を、最もＩＦＮ−γに帰因する（Breed
ら、1997）と考えられるＭＡＦ活性の指標として用い
た。Breedら(1997)によって報告されたように、培養培
地中への亜硝酸の蓄積によって、酸化窒素を定量した。
以下に要約する。１００μＬリンパ球上清の存在下、丸
底９６ウエルプレート(Nunc)中で１００μＬ ＨＤ１１
細胞（１．５×１０6／ｍＬ ＲＰＭＩ−ＧＰＰＳ＋２
０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清及び２％（ｖ／ｖ）Ｌ−ア
ルギニン溶液）を培養した。２４時間インキュベーショ
ン後、培養培地中のＮＯ2 -の量をＧｒｉｅｓｓ反応で測
定した。ＣｏｎＡ活性下ニワトリ脾臓細胞からの上清を
参照のために含めた。データをμＭ ＮＯ2 -／１．５×
１０6細胞／２４時間（ＭＡＦ活性）として表す。亜硝
酸指数（ＮＩ）は刺激された培養物の上清を用いて測定
した亜硝酸の平均量 対 非刺激培養物（培地対照）の
値の比を表す。
(Beugら、1979)を、最もＩＦＮ−γに帰因する（Breed
ら、1997）と考えられるＭＡＦ活性の指標として用い
た。Breedら(1997)によって報告されたように、培養培
地中への亜硝酸の蓄積によって、酸化窒素を定量した。
以下に要約する。１００μＬリンパ球上清の存在下、丸
底９６ウエルプレート(Nunc)中で１００μＬ ＨＤ１１
細胞（１．５×１０6／ｍＬ ＲＰＭＩ−ＧＰＰＳ＋２
０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清及び２％（ｖ／ｖ）Ｌ−ア
ルギニン溶液）を培養した。２４時間インキュベーショ
ン後、培養培地中のＮＯ2 -の量をＧｒｉｅｓｓ反応で測
定した。ＣｏｎＡ活性下ニワトリ脾臓細胞からの上清を
参照のために含めた。データをμＭ ＮＯ2 -／１．５×
１０6細胞／２４時間（ＭＡＦ活性）として表す。亜硝
酸指数（ＮＩ）は刺激された培養物の上清を用いて測定
した亜硝酸の平均量 対 非刺激培養物（培地対照）の
値の比を表す。
【００９７】ワクチン接種実験 選別した抗原調製物を融解し、特に記載されていなけれ
ば５−１０μｇタンパク質／投与（０．５ｍＬ）になる
ように容量を調製した。各投与に、１５０μｇ／投与の
クイルＡ(Superfos Biosector, Vedbaek, Denmark)をア
ジュバントとして加えた。異なるワクチン組成物を１群
１０羽のニワトリに皮下注射した。対照群にはＰＢＳ中
のアジュバントを注射した。３週間後、凍結抗原保存物
から新たに調製し同じ調製物でニワトリを追加免疫処置
した。ワクチン接種１１日後に、ヘパリン添加血液サン
プル（５ｍＬ）を心臓穿刺で採取し、全E.tenellaスポ
ロゾイト抗原（ウエル当り３×１０5スポロゾイトに等
しい）又は培地だけに反応した増殖とＭＡＦ生成につい
てアッセイした。３〜４日後、全てのニワトリに、E.te
nellaの４５００個の胞子形成オーシストを経口接種し
た。この攻撃１週間後、盲腸病巣の存在についてニワト
リをアッセイした。盲腸病巣の程度に、記載された(Joh
nson & Reid 1970)ように０〜４のスケールのスコアを
与えた。
ば５−１０μｇタンパク質／投与（０．５ｍＬ）になる
ように容量を調製した。各投与に、１５０μｇ／投与の
クイルＡ(Superfos Biosector, Vedbaek, Denmark)をア
ジュバントとして加えた。異なるワクチン組成物を１群
１０羽のニワトリに皮下注射した。対照群にはＰＢＳ中
のアジュバントを注射した。３週間後、凍結抗原保存物
から新たに調製し同じ調製物でニワトリを追加免疫処置
した。ワクチン接種１１日後に、ヘパリン添加血液サン
プル（５ｍＬ）を心臓穿刺で採取し、全E.tenellaスポ
ロゾイト抗原（ウエル当り３×１０5スポロゾイトに等
しい）又は培地だけに反応した増殖とＭＡＦ生成につい
てアッセイした。３〜４日後、全てのニワトリに、E.te
nellaの４５００個の胞子形成オーシストを経口接種し
た。この攻撃１週間後、盲腸病巣の存在についてニワト
リをアッセイした。盲腸病巣の程度に、記載された(Joh
nson & Reid 1970)ように０〜４のスケールのスコアを
与えた。
【００９８】統計的解析 リンパ球増殖の統計的解析を、形質転換刺激指標の対数
におけるスチューデントｔ−テストを用い行った(Benne
tt & Riley 1992)。亜硝酸アッセイの場合、同様の形質
転換を行った。群平均の差はＰ値０．０５未満で有意で
あると考えられた。病巣スコアの群平均値の差はスチュ
ーデントｔ−テストを用い解析した。
におけるスチューデントｔ−テストを用い行った(Benne
tt & Riley 1992)。亜硝酸アッセイの場合、同様の形質
転換を行った。群平均の差はＰ値０．０５未満で有意で
あると考えられた。病巣スコアの群平均値の差はスチュ
ーデントｔ−テストを用い解析した。
【００９９】結果 プールしたE.tenellaスポロゾイトの親水性分画 ＴＸ−１１４抽出によって得られた精製E.tenellaスポ
ロゾイトホモジネートの親水性タンパク質相（ＨＰＳ）
を、分取ゲル電気泳動を用い分画した。各分画のタンパ
ク質の相対的分子量を、ＳＤＳ−ＰＳＧＥ解析を用いて
推定した。異なる相対的分子量のタンパク質を含む９個
の分画を得た（表１）。これらの分画を、E.tenella感
染ニワトリからのＰＢＬを刺激する能力についてアッセ
イした。
ロゾイトホモジネートの親水性タンパク質相（ＨＰＳ）
を、分取ゲル電気泳動を用い分画した。各分画のタンパ
ク質の相対的分子量を、ＳＤＳ−ＰＳＧＥ解析を用いて
推定した。異なる相対的分子量のタンパク質を含む９個
の分画を得た（表１）。これらの分画を、E.tenella感
染ニワトリからのＰＢＬを刺激する能力についてアッセ
イした。
【０１００】
【表１】
【０１０１】Ｔ細胞刺激抗原分画の選別 感染ニワトリからのＰＢＬでのＴ細胞反応を刺激する分
画の能力（８日、p.i.）を、上清中のリンパ球増殖とＭ
ＡＦ活性によって測定した。平均刺激指数を図１Ａに示
す。抗原調製物と対照調製物（全スポロゾイト抗原及び
ＨＰＳ）の両方とも感染動物において高増殖反応を誘起
した。９個全部の分画が、非感染対照からのＰＢＬにお
けるよりも感染動物からのＰＢＬにおいて有意に高い増
殖反応を誘導した。最大反応は分画１、２、３、８で見
出された。刺激されたＰＢＬの培養液を取得し、亜硝酸
アッセイを用いてＭＡＦ活性の存在についてアッセイし
た。マクロファージによって生成される亜硝酸量として
表したＭＡＦ活性を図１Ｂに示す。ＭＡＦ活性の高レベ
ルを抗原−対照調製物で刺激したＰＢＬの培養液で測定
した。非刺激培養物のバックグラウンドレベルは低かっ
た。分画１、２、３だけが、非感染ニワトリのＰＢＬに
おけるよりも感染ニワトリからのＰＢＬの培養液で有意
に高いレベルのＭＡＦ活性を誘導した。比較的高い増殖
誘導能力と低いＭＡＦ誘導活性を含む、反応（１、２、
３）と分画８の両方のタイプを刺激する分画を選別し、
ワクチン力価を測定した。
画の能力（８日、p.i.）を、上清中のリンパ球増殖とＭ
ＡＦ活性によって測定した。平均刺激指数を図１Ａに示
す。抗原調製物と対照調製物（全スポロゾイト抗原及び
ＨＰＳ）の両方とも感染動物において高増殖反応を誘起
した。９個全部の分画が、非感染対照からのＰＢＬにお
けるよりも感染動物からのＰＢＬにおいて有意に高い増
殖反応を誘導した。最大反応は分画１、２、３、８で見
出された。刺激されたＰＢＬの培養液を取得し、亜硝酸
アッセイを用いてＭＡＦ活性の存在についてアッセイし
た。マクロファージによって生成される亜硝酸量として
表したＭＡＦ活性を図１Ｂに示す。ＭＡＦ活性の高レベ
ルを抗原−対照調製物で刺激したＰＢＬの培養液で測定
した。非刺激培養物のバックグラウンドレベルは低かっ
た。分画１、２、３だけが、非感染ニワトリのＰＢＬに
おけるよりも感染ニワトリからのＰＢＬの培養液で有意
に高いレベルのＭＡＦ活性を誘導した。比較的高い増殖
誘導能力と低いＭＡＦ誘導活性を含む、反応（１、２、
３）と分画８の両方のタイプを刺激する分画を選別し、
ワクチン力価を測定した。
【０１０２】選別した抗原分画のキャラクタリゼーショ
ン ４種の選別した抗原分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分
析した。図２は選別した分画に存在する異なるポリペプ
チドを示す。分画１は分子量１５ｋＤ未満のポリペプチ
ドを含んでいた。分画２は、約９種の異なるポリペプチ
ド、約１６ｋＤと２２ｋＤの２種の主要なバンド及び１
７〜２６ｋＤの範囲の少量のバンドを示した。分画３は
２６−３０ｋＤ（±５ｋＤａ、用いる測定技術の可能性
のある限界を考慮）の範囲の３種のポリペプチドを含ん
でいた。分画８は約４９ｋＤの主要ポリペプチドを示し
た。
ン ４種の選別した抗原分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分
析した。図２は選別した分画に存在する異なるポリペプ
チドを示す。分画１は分子量１５ｋＤ未満のポリペプチ
ドを含んでいた。分画２は、約９種の異なるポリペプチ
ド、約１６ｋＤと２２ｋＤの２種の主要なバンド及び１
７〜２６ｋＤの範囲の少量のバンドを示した。分画３は
２６−３０ｋＤ（±５ｋＤａ、用いる測定技術の可能性
のある限界を考慮）の範囲の３種のポリペプチドを含ん
でいた。分画８は約４９ｋＤの主要ポリペプチドを示し
た。
【０１０３】選別した抗原分画のワクチン力価の測定 何群かのニワトリを４種の選別した抗原分画で免疫し
た。動物に０日に初回ワクチンを接種し、２１日に追加
ワクチン接種を行った。追加ワクチン接種１１日後（攻
撃感染３日前）、ＰＢＬを採取し、全スポロゾイト抗原
で刺激してＴリンパ球反応性を測定した。４種の実験群
全てからのリンパ球は、上清におけるリンパ球増殖の刺
激とＭＡＦ活性の誘導の両方に関し、スポロゾイト抗原
による刺激で高い反応性を示した（図３Ａ及びＢ）。
た。動物に０日に初回ワクチンを接種し、２１日に追加
ワクチン接種を行った。追加ワクチン接種１１日後（攻
撃感染３日前）、ＰＢＬを採取し、全スポロゾイト抗原
で刺激してＴリンパ球反応性を測定した。４種の実験群
全てからのリンパ球は、上清におけるリンパ球増殖の刺
激とＭＡＦ活性の誘導の両方に関し、スポロゾイト抗原
による刺激で高い反応性を示した（図３Ａ及びＢ）。
【０１０４】分画３でワクチン接種したニワトリからの
リンパ球は最大反応を示した。追加ワクチン接種１４日
後、全ての動物をE.tenella胞子形成オーシストで攻撃
した。７日後、動物を殺し、盲腸の病巣スコアを測定し
た。一つの値（群３に存在する）を更なる分析から除外
した。何故ならば、これは、群全体の９５％信頼限界外
の唯一の値であると決定されたからである（ｎ＝４６；
値＞平均＋１．９６ｘＳＤ）。結果は、抗原分画３をワ
クチン接種した動物の唯一の群だけが、非ワクチン接種
対照と比べて盲腸病巣のスコアが減少したことを示す
（図３Ｃ）。この減少は統計的に有意であった（Ｐ<
０．０５）。
リンパ球は最大反応を示した。追加ワクチン接種１４日
後、全ての動物をE.tenella胞子形成オーシストで攻撃
した。７日後、動物を殺し、盲腸の病巣スコアを測定し
た。一つの値（群３に存在する）を更なる分析から除外
した。何故ならば、これは、群全体の９５％信頼限界外
の唯一の値であると決定されたからである（ｎ＝４６；
値＞平均＋１．９６ｘＳＤ）。結果は、抗原分画３をワ
クチン接種した動物の唯一の群だけが、非ワクチン接種
対照と比べて盲腸病巣のスコアが減少したことを示す
（図３Ｃ）。この減少は統計的に有意であった（Ｐ<
０．０５）。
【０１０５】防御抗原分画３の用量−効果応答 防御のレベルを増加させることができるかどうかを決定
するために、用量−効果実験を行った。動物の何群かを
異なる量の抗原（０、５、１５μｇ／投与）でワクチン
接種した。動物に３週間間隔で初回及び追加ワクチン接
種した。追加ワクチン接種１１日後、全スポロゾイト抗
原に対する末梢血液リンパ球反応性を測定した。ワクチ
ン接種を受けた動物からのリンパ球はスポロゾイト抗原
による刺激に反応した。最大抗原投与量を与えた動物か
らのリンパ球は最大のＴ細胞活性化反応を示した（増殖
アッセイ及び亜硝酸アッセイの両方；図４Ａ及びＢ）と
いう点で明白な用量−効果関係があった。４日後にE.te
nella胞子形成オーシストによって攻撃されるとき、防
御のレベルとワクチン接種のために使用される抗原投与
量の間に用量−効果関係はないようであった。盲腸病巣
の悪化に関し、動物の両群は同程度に防御された（図４
Ｃ）。動物の両方のワクチン接種を受けた群の平均病巣
のスコアにおける減少は、対照群のスコアとは統計的に
有意に異なった（Ｐ<０．００５）。
するために、用量−効果実験を行った。動物の何群かを
異なる量の抗原（０、５、１５μｇ／投与）でワクチン
接種した。動物に３週間間隔で初回及び追加ワクチン接
種した。追加ワクチン接種１１日後、全スポロゾイト抗
原に対する末梢血液リンパ球反応性を測定した。ワクチ
ン接種を受けた動物からのリンパ球はスポロゾイト抗原
による刺激に反応した。最大抗原投与量を与えた動物か
らのリンパ球は最大のＴ細胞活性化反応を示した（増殖
アッセイ及び亜硝酸アッセイの両方；図４Ａ及びＢ）と
いう点で明白な用量−効果関係があった。４日後にE.te
nella胞子形成オーシストによって攻撃されるとき、防
御のレベルとワクチン接種のために使用される抗原投与
量の間に用量−効果関係はないようであった。盲腸病巣
の悪化に関し、動物の両群は同程度に防御された（図４
Ｃ）。動物の両方のワクチン接種を受けた群の平均病巣
のスコアにおける減少は、対照群のスコアとは統計的に
有意に異なった（Ｐ<０．００５）。
【０１０６】考察 分子量の違いによって分離されたスポロゾイトタンパク
質の９種の親水性分画を、８日p.i.からのＰＢＬにおけ
るＴ細胞反応を刺激する能力について試験した。９種全
部の分画が８日ＰＢＬの増殖を誘導した。タンパク質濃
度は分画毎に異なるが、分画の各々は再び未知の比で２
種以上の異なるポリペプチドを含むので、濃度を補正し
ないことに決めた。このことは、適切な分画を選別する
ためには、反応の高さの違いだけには基づくことはでき
ないことを意味する。ＮＯアッセイのデータは、ワクチ
ン接種−攻撃実験の分画を選別するために第２の基準に
なった。感染動物からのＰＢＬ中のＴ細胞反応の両方の
タイプを刺激する分画１、２、３は別として、分画８
は、低いＭＡＦ誘導活性で比較的高い増殖誘導能力を含
んでいた（恐らくＩＦＮ−γ；Breedら、1997）。全て
のワクチン組成物は強いＴ細胞反応を誘導したが、驚く
べきことに唯一の分画だけがE.tenellaオーシストによ
る経口攻撃感染に対し部分的防御を誘導した。
質の９種の親水性分画を、８日p.i.からのＰＢＬにおけ
るＴ細胞反応を刺激する能力について試験した。９種全
部の分画が８日ＰＢＬの増殖を誘導した。タンパク質濃
度は分画毎に異なるが、分画の各々は再び未知の比で２
種以上の異なるポリペプチドを含むので、濃度を補正し
ないことに決めた。このことは、適切な分画を選別する
ためには、反応の高さの違いだけには基づくことはでき
ないことを意味する。ＮＯアッセイのデータは、ワクチ
ン接種−攻撃実験の分画を選別するために第２の基準に
なった。感染動物からのＰＢＬ中のＴ細胞反応の両方の
タイプを刺激する分画１、２、３は別として、分画８
は、低いＭＡＦ誘導活性で比較的高い増殖誘導能力を含
んでいた（恐らくＩＦＮ−γ；Breedら、1997）。全て
のワクチン組成物は強いＴ細胞反応を誘導したが、驚く
べきことに唯一の分画だけがE.tenellaオーシストによ
る経口攻撃感染に対し部分的防御を誘導した。
【０１０７】参考文献
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
【表４】
【図１】E.tenellaスポロゾイト、ＨＰＳ又は全スポロ
ゾイト抗原（sporo）の異なる親水性分画に対するE.ten
ella感染（８日、p.i.）ニワトリ及び対照ニワトリから
のＰＢＬのＴ細胞反応。各分画を、濃度０．１５×最初
の容量で試験した。（Ａ）平均増殖反応。（Ｂ）ＰＢＬ
上清による平均ＭＡＦ活性。垂直線は平均の標準偏差
（ＳＥＭ）を示す。★非処置群とは有意に異なる（★Ｐ
<０．０５，★★Ｐ<０．００５，★★★Ｐ<０．０００
５）。
ゾイト抗原（sporo）の異なる親水性分画に対するE.ten
ella感染（８日、p.i.）ニワトリ及び対照ニワトリから
のＰＢＬのＴ細胞反応。各分画を、濃度０．１５×最初
の容量で試験した。（Ａ）平均増殖反応。（Ｂ）ＰＢＬ
上清による平均ＭＡＦ活性。垂直線は平均の標準偏差
（ＳＥＭ）を示す。★非処置群とは有意に異なる（★Ｐ
<０．０５，★★Ｐ<０．００５，★★★Ｐ<０．０００
５）。
【図２】ワクチン接種に使用したE.Tenellaスポロゾイ
トの親水性分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。銀染色。各セット
は、各分画の２倍連続希釈の３列のレーンにわたる。
トの親水性分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。銀染色。各セット
は、各分画の２倍連続希釈の３列のレーンにわたる。
【図３】選別した抗原分画のワクチン力価。追加ワクチ
ン接種１１日後にＰＢＬを採取し、E.tenellaスポロゾ
イト抗原で刺激した。（Ａ）平均増殖ＰＢＬ反応。
（Ｂ）上清による平均ＭＡＦ活性。（Ｃ）E.tenella攻
撃感染後のワクチン接種を受けた群の平均盲腸病巣スコ
ア。垂直線はＳＥＭを示す。★非処置群とは有意に異な
る（★Ｐ<０．０５，★★Ｐ<０．００５，★★★Ｐ<
０．０００５）。
ン接種１１日後にＰＢＬを採取し、E.tenellaスポロゾ
イト抗原で刺激した。（Ａ）平均増殖ＰＢＬ反応。
（Ｂ）上清による平均ＭＡＦ活性。（Ｃ）E.tenella攻
撃感染後のワクチン接種を受けた群の平均盲腸病巣スコ
ア。垂直線はＳＥＭを示す。★非処置群とは有意に異な
る（★Ｐ<０．０５，★★Ｐ<０．００５，★★★Ｐ<
０．０００５）。
【図４】抗原分画３の容量−効果反応。追加ワクチン接
種１１日後にＰＢＬを採取し、E.tenellaスポロゾイト
抗原で刺激した。（Ａ）平均増殖ＰＢＬ反応。（Ｂ）上
清による平均ＭＡＦ活性。（Ｃ）E.tenella攻撃感染後
のワクチン接種を受けた群の平均盲腸病巣スコア。垂直
線はＳＥＭを示す。★非処置群とは有意に異なる（★Ｐ
<０．０５，★★Ｐ<０．００５，★★★Ｐ<０．０００
５）。
種１１日後にＰＢＬを採取し、E.tenellaスポロゾイト
抗原で刺激した。（Ａ）平均増殖ＰＢＬ反応。（Ｂ）上
清による平均ＭＡＦ活性。（Ｃ）E.tenella攻撃感染後
のワクチン接種を受けた群の平均盲腸病巣スコア。垂直
線はＳＥＭを示す。★非処置群とは有意に異なる（★Ｐ
<０．０５，★★Ｐ<０．００５，★★★Ｐ<０．０００
５）。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/09 15/00 Ａ
Claims (21)
- 【請求項１】 寄生虫エイメリア(Eimeria)個体を含有
しないが、１種以上のタンパク質、又はそのフラグメン
トもしくは変異体を含有する組成物であって、該タンパ
ク質は、（ａ）エイメリアのスポロゾイトのトライトン
Ｘ−１１４抽出液の親水性相に存在し、（ｂ）還元条件
下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では分子量２６−３０ｋ
Ｄａ±５ｋＤａ（即ち２１−３５ｋＤａ）を有すること
を特徴とする該組成物。 - 【請求項２】 エイメリアのスポロゾイトの抽出液は、
エイメリア・テネラ(E.tenella)、エイメリア・アセル
ブリナ(E.acervulina)、エイメリア・マクシマ(E.maxim
a)、エイメリア・ブルネチ(E.brunetti)、エイメリア・
ネカトリックス(E.necatrix)、又はエイメリア・ミチス
(E.mitis)のスポロゾイトの抽出液であることを特徴と
する請求項１に記載の組成物。 - 【請求項３】 存在するタンパク質性物質の少なくとも
５０％ｗ／ｗが、１種以上の該タンパク質、フラグメン
ト、及び／又は変異体からなることを特徴とする請求項
１又は２に記載の組成物。 - 【請求項４】 複数（例えば２種又は３種の該タンパク
質、そのフラグメントもしくは変異体）が存在すること
を特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項５】 唯一の該タンパク質又はそのフラグメン
トもしくは変異体が、例えば実質的に純粋形態で存在す
ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の組
成物。 - 【請求項６】 核酸分子であって、（ａ） 請求項１〜
５のいずれかに記載の、タンパク質、その変異体もしく
はフラグメントをコードする、（ｂ） （ａ）に記載の
核酸分子に相補的である、又は（ｃ） （ａ）もしくは
（ｂ）に記載の核酸分子にハイブリダイズすることを特
徴とする該核酸分子。 - 【請求項７】 単離形態又は組換え形態であることを特
徴とする請求項６に記載の核酸分子。 - 【請求項８】 請求項６又は７に記載の核酸分子を含む
ことを特徴とするベクター。 - 【請求項９】 請求項８に記載のベクター又は請求項６
もしくは７に記載の核酸を含有することを特徴とする非
トリ宿主。 - 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれかに記載のタン
パク質、その変異体又はフラグメントを発現するのに適
していることを特徴とする請求項８に記載のベクター又
は請求項９に記載の宿主。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載のベクター又は宿主
（生存形態、死亡形態、又は弱毒化形態のいずれか）を
含有することを特徴とする医薬として許容できるワクチ
ン組成物。 - 【請求項１２】 ワクチン剤形であることを特徴とする
請求項１〜５のいずれかに記載の医薬として許容できる
組成物。 - 【請求項１３】 ワクチンがアジュバントを含有するこ
とを特徴とする請求項１１又は１２に記載の組成物。 - 【請求項１４】 アジュバントがクイルＡ（Quil A）で
あることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。 - 【請求項１５】 単位投与剤形であることを特徴とする
請求項１２〜１４のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項１６】 医薬として使用することを特徴とする
請求項１〜５又は請求項１１〜１５のいずれかに記載の
組成物。 - 【請求項１７】 エイメリア媒介疾患、例えばコクシジ
ウム症に対するワクチンの製造における請求項１〜５の
いずれかに記載の組成物の使用。 - 【請求項１８】 請求項１〜５のいずれかに記載のタン
パク質、その変異体又はフラグメントと結合することを
特徴とする抗体又はその誘導体。 - 【請求項１９】 支持体に結合しているか又は検出標識
を有する請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質、
その変異体又はフラグメントを含有することを特徴とす
る免疫試薬。 - 【請求項２０】 支持体に結合しているか又は標識物質
を有する請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質、
その変異体又はフラグメントを含有することを特徴とす
る免疫試薬。 - 【請求項２１】 エイメリア感染の診断用試験キットで
あって、請求項６又は７に記載の核酸分子、請求項１８
に記載の抗体又はその誘導体、あるいは請求項１９又は
２０に記載の免疫試薬を含有することを特徴とする該試
験キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97302447 | 1997-04-09 | ||
| NL97302447.4 | 1997-04-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10298104A true JPH10298104A (ja) | 1998-11-10 |
Family
ID=8229285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10097400A Pending JPH10298104A (ja) | 1997-04-09 | 1998-04-09 | ワクチン |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020006408A1 (ja) |
| JP (1) | JPH10298104A (ja) |
| AU (1) | AU747818B2 (ja) |
| BR (1) | BR9801023A (ja) |
| CA (1) | CA2234472A1 (ja) |
| NZ (1) | NZ330158A (ja) |
| ZA (1) | ZA982763B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000219635A (ja) * | 1998-10-07 | 2000-08-08 | Akzo Nobel Nv | コクシジウム症ワクチン |
| JP2003511420A (ja) * | 1999-10-13 | 2003-03-25 | カイロン コーポレイション | タンパク質から細胞性免疫応答を得る方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6680061B1 (en) * | 1998-10-07 | 2004-01-20 | Theodorus Cornelis Schaap | Coccidiosis vaccines |
| AU2005204977B2 (en) * | 2004-01-16 | 2008-11-27 | Advanced Grinding Technologies Pty Limited | Processing apparatus and methods |
-
1998
- 1998-04-01 ZA ZA982763A patent/ZA982763B/xx unknown
- 1998-04-08 AU AU60754/98A patent/AU747818B2/en not_active Ceased
- 1998-04-08 NZ NZ330158A patent/NZ330158A/en unknown
- 1998-04-08 US US09/056,806 patent/US20020006408A1/en not_active Abandoned
- 1998-04-08 CA CA002234472A patent/CA2234472A1/en not_active Abandoned
- 1998-04-09 JP JP10097400A patent/JPH10298104A/ja active Pending
- 1998-04-09 BR BR9801023-9A patent/BR9801023A/pt not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000219635A (ja) * | 1998-10-07 | 2000-08-08 | Akzo Nobel Nv | コクシジウム症ワクチン |
| JP2003511420A (ja) * | 1999-10-13 | 2003-03-25 | カイロン コーポレイション | タンパク質から細胞性免疫応答を得る方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6075498A (en) | 1998-10-15 |
| NZ330158A (en) | 1998-07-28 |
| ZA982763B (en) | 1998-10-05 |
| AU747818B2 (en) | 2002-05-23 |
| US20020006408A1 (en) | 2002-01-17 |
| BR9801023A (pt) | 2000-01-11 |
| CA2234472A1 (en) | 1998-10-09 |
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