JPH10300751A - 免疫分析要素 - Google Patents

免疫分析要素

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JPH10300751A
JPH10300751A JP12281697A JP12281697A JPH10300751A JP H10300751 A JPH10300751 A JP H10300751A JP 12281697 A JP12281697 A JP 12281697A JP 12281697 A JP12281697 A JP 12281697A JP H10300751 A JPH10300751 A JP H10300751A
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JP
Japan
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enzyme
layer
glucose
antigen
antibody
Prior art date
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JP12281697A
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English (en)
Inventor
Toshihiro Mori
寿弘 森
Yoshikazu Amano
芳和 天野
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Fujifilm Holdings Corp
Original Assignee
Fuji Photo Film Co Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 検体中の内因性グルコースを除去して、夾雑
グルコースによるノイズの影響をなくし精度の高い免疫
分析要素を提供する。 【構成】 標識酵素活性の変化を測定することにより抗
原（又は抗体）の量を分析する免疫分析要素であって、
標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含
有する基質層と、前記拡散性物質をさらにグルコースに
する低分子化酵素とこの産生されたグルコースをさらに
過酸化水素に変換する変換酵素とを含有する試薬層を備
え、この過酸化水素量を検出することにより被検物であ
る抗原（又は抗体）量を分析する免疫分析要素。試薬層
より上層に、検体中に含まれるグルコースを試薬層内の
変換酵素の基質とはならない物質に変換することにより
除去するグルコース除去層を設けた。変換酵素がグルコ
ースオキシダーゼである場合には、グルコースデヒドロ
ゲナーゼやグルコキナーゼをグルコース除去層に含有さ
せる。試薬層は、親水性ポリマーをバインダとして含有
する層で形成するのが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素免疫測定法を適用
した乾式免疫分析要素に関するものである。詳しくは、
標識酵素により生成される生成物をさらにグルコースに
分解してこのグルコースを検出することにより被検物で
ある抗原又は抗体の量を測定する免疫分析要素であっ
て、検体中に含有されるグルコースの影響を受けないよ
うにした免疫分析要素に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】血液や尿などの体液に含まれる生体成
分、薬物等の分析は、病態の診断や治療経過の判定に非
常に有用であり、臨床検査の分野で重要な役割を果たし
ている。このような微量成分（リガンド）の分析方法と
して、酵素免疫分析方法（エンザイムイムノアッセイ）
がある。酵素免疫分析方法には、Ｂ／Ｆ分離が必要な非
均一系とＢ／Ｆ分離が不要な均一系がある。均一系反応
は抗体と抗原（リガンド）が結合すると標識酵素の酵素
活性が何らかの干渉を受けることに基づくもので、抗原
抗体結合による阻害作用を利用する。一般には、抗原を
酵素標識しておいて、これに大分子である抗体が結合す
ることにより、酵素の基質に対する結合が立体障害を受
けたり、或いは酵素の立体構造が変化するために生じる
酵素活性の抑制を検出する。
【０００３】抗原が高分子である場合には、これとは逆
に抗体に酵素標識しておいても、抗原抗体結合反応によ
る酵素活性の抑制を検出できる。
【０００４】一方、多数の検体試料を取扱いルーティン
化している臨床検査では、簡便、迅速に分析でき自動操
作化もできることが望まれ、このような観点から、乾式
分析要素が提案されている（例えば特開昭49-53888（対
応US 3,992,158）、特開昭55-90859（US 4,258,001）、
特開昭55-164356（US 4,292,272）、特開昭60-222769
（EP 0 162 302A）、特開昭59-77356（EP 0 097 952
A）、特開昭59-102388（US4,861,552）、特表昭61-5018
66（US 4,459,358））。
【０００５】抗体に酵素標識しておいて均一系酵素免疫
反応をさせる乾式分析要素は以下のものが知られている
（特開平1-321360）。これは(A) 高分子化抗原（リガン
ドと高分子化合物との結合物）、(B) 水不溶性の高分子
基質、(C) リガンドに対する抗体と、基質に対する酵素
との結合物、の３つを多層分析要素の同一層或いは別々
の層に含有させたものである。分析要素に点着し供給さ
れた抗原は、高分子化抗原と競争して、抗体−酵素結合
物に結合する。この抗原−抗体−酵素複合体は、水不溶
性高分子基質に反応して、可溶性の低分子生成物を生成
する。一方、高分子化抗原と結合してできた高分子抗原
−抗体−酵素複合体は、高分子基質に対して酵素活性を
示すことができない。従って検体中の抗原量が増えるに
従って、酵素反応生成物は増えることになる。この生成
物を検出層に移行させて、その量をその有色化学基が与
える吸収の光学濃度を測定することにより、検体中の抗
原量を分析するというものである。
【０００６】特許第2576910号公報（対応US 5,569,58
9）記載の免疫分析要素は、これをさらに改良したもの
である。この分析要素では、標識酵素分解物をさらに低
分子化する低分子化酵素を含有する試薬層が設けられ、
この低分子化生成物（グルコース）を検出することによ
り感度の上昇が図られている。
【０００７】測定対象が高分子抗原である場合には、特
許第2576913号公報記載の免疫分析要素を使用すること
ができる。この分析要素は、(A) 水不溶性の高分子基
質、(B) 高分子抗原に対する抗体と、基質に対する酵素
との結合物、の２つを多層分析要素の同一層或いは別々
の層に含有させたもので、特許第2576910号公報（対応U
S 5,569,589）記載の免疫分析要素と同じように、標識
酵素による分解物（グルコースオリゴマー）をさらに低
分子化する低分子化酵素を含有する試薬層を設けて、こ
の低分子化生成物（グルコース）を検出することにより
感度の上昇を図っている。
【０００８】いずれの乾式免疫分析要素でも、高分子基
質としてデンプン等の多糖類を用い、抗体標識酵素とし
てα−アミラーゼなどのエンド活性型糖質加水分解酵素
を用い、低分子化酵素としてグルコアミラーゼなどのエ
キソ活性型糖質加水分解酵素を用いている。最終生成物
であるグルコースは、試薬層中に含有させたグルコース
オキシダーゼによりグルコン酸に変換され、この反応か
ら化学量論的に生成される過酸化水素（H2O2）を検出し
ている。
【０００９】しかしながら、このように最終生産物であ
るグルコースを過酸化水素（H2O2）に変換してこれを検
出する分析要素では、点着する検体中に内因性グルコー
スが夾雑していると、これが試薬層に移行してノイズの
原因となることが判明した。特に、検体として多く分析
される血液や尿などの体液には、グルコースが含まれて
いることが多く、これによるノイズが無視できないもの
となる。
【００１０】
【発明の目的】本発明は、以上のような事情に鑑みなさ
れたものであり、検体中の内因性グルコースを除去し
て、夾雑グルコースによるノイズの影響をなくした精度
の高い免疫分析要素を提供することを目的とする。
【００１１】
【発明の構成】このような本発明の目的は、抗原と酵素
標識抗体との反応、もしくは、抗原と抗体と酵素標識抗
原との反応、もしくは抗原と、抗原と高分子化合物との
結合物と、酵素標識抗体との間の反応のいずれかの反応
により生じた標識酵素活性の変化を測定することにより
抗原の量を分析する免疫分析要素であって、前記標識酵
素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する
基質層と、前記拡散性物質をさらにグルコースにする低
分子化酵素とこの産生されたグルコースをさらに過酸化
水素に変換する変換酵素とを含有する試薬層を備え、こ
の過酸化水素量を検出することにより被検物である抗原
量を分析する免疫分析要素において、前記試薬層より上
層に、検体中に含まれるグルコースを試薬層内の変換酵
素の基質とはならない物質に変換することにより除去す
るグルコース除去層が設けられていることを特徴とする
免疫分析要素、により達成される。
【００１２】また被検物が抗体である場合には、本発明
の目的は、抗体と酵素標識抗原との反応もしくは、抗体
と抗原と酵素標識抗体との反応により生じた標識酵素活
性の変化を測定することにより抗体の量を分析する免疫
分析要素であって、前記標識酵素により拡散性物質を生
成する非拡散性基質を含有する基質層と、前記拡散性物
質をさらにグルコースにする低分子化酵素とこの産生さ
れたグルコースをさらに過酸化水素に変換する変換酵素
とを含有する試薬層を備え、この過酸化水素量を検出す
ることにより被検物である抗体量を分析する免疫分析要
素において、前記試薬層より上層に、検体中に含まれる
グルコースを試薬層内の変換酵素の基質とはならない物
質に変換することにより除去するグルコース除去層が設
けられていることを特徴とする免疫分析要素、により達
成される。
【００１３】すなわち本発明の分析要素は、検出すべき
過酸化水素がグルコースから生成される試薬層よりも上
に、検体中に含まれるグルコースを除去するグルコース
除去層を設けたものである。これにより、検体中に夾雑
グルコースが存在しても、検出すべき過酸化水素の生成
量に影響を与えることがなくなる。夾雑グルコース濃度
が検体によって異なるレベルのものであっても、この夾
雑グルコースは試薬層に達することがないので、各検体
の測定値がバラつくことがなくなる。
【００１４】グルコース除去層は、検体中に含まれるグ
ルコースを、試薬層内の変換酵素の基質とならずその反
応に影響を与えない物質に変換する。このようなグルコ
ース除去には酵素を使用することができる。例えば、グ
ルコースから過酸化水素を生成する変換酵素がグルコー
スオキシダーゼ（ＧＯＤ）である場合には、グルコース
デヒドロゲナーゼやグルコキナーゼにより、検体中のグ
ルコースをＧＯＤの酵素反応に影響を与えない物質に変
換することができる。グルコキナーゼを使用する場合に
は、ＡＴＰも併せてグルコース除去層に含有させる。
【００１５】グルコースデヒドロキナーゼやグルコキナ
ーゼなどの酵素をグルコース除去層に含有させる場合に
は、その下層である試薬層は、親水性ポリマーをバイン
ダとして含有する層で形成するのが好ましい。親水性ポ
リマバインダにより構成された無多孔性層からなる試薬
層であれば、グルコースデヒドロキナーゼやグルコキナ
ーゼなど大分子量の酵素蛋白は、試薬層に移行すること
がない。従って、試薬層内で低分子化酵素により生成さ
れるグルコースが、グルコースデヒドロキナーゼやグル
コキナーゼなどの酵素で除去されることがない。
【００１６】グルコース除去層は、試薬層より上の層で
あればよく、基質層と同一の層としてもよいし、また基
質層の上に積層された層であってもよい。
【００１７】非拡散性基質として澱粉などの高分子多糖
類を用い、抗体又は抗原の標識酵素をエンド活性型の糖
質分解酵素としてこの高分子多糖類からグルコースオリ
ゴマーを生成させ、さらにこのオリゴマーをグルコース
に変換（分解）する変換酵素をエキソ活性型の糖質分解
酵素とするのが好ましい態様である。
【００１８】
【発明の構成の詳細な説明】免疫分析要素の層構成 図１に本発明の免疫分析要素の一実施態様を示す。この
図１において符号１０は光透過性支持体であり、その上
には試薬層１２、基質層１４が積層されている。
【００１９】基質層１４は、水浸透性層で構成され、抗
体又は抗原に標識として結合された酵素の基質である非
拡散性基質を含有する。
【００２０】試薬層１２は、水浸透性層で構成され、基
質層から拡散・移行して来た拡散性物質をさらに低分子
量の生成物（グルコース）にする低分子化酵素を含有す
る。基質層１２はまたこの低分子生成物を検出するため
の試薬組成物を含有する。
【００２１】この基本構成は、測定対象が低分子抗原で
あるか、高分子抗原であるか、また抗体であるかを問わ
ず同じである。ただし、測定対象が低分子抗原である場
合には、検体と高分子化抗原（抗原と高分子化合物との
結合物）と酵素標識抗体とを混合して競争反応をした混
合液を、基質層１４に点着又は供給することにより分析
を行う。或いは、検体と抗体と酵素標識抗原とを混合し
て競争反応をした混合液を、基質層１４に点着又は供給
することにより分析を行う。いずれの場合も、リガンド
（低分子抗原）の量が多いほど生成される拡散性物質は
増大する。
【００２２】これに対して、測定対象が高分子量の抗原
である場合には、検体と酵素標識抗体のみを混合して抗
原抗体結合反応させ、その反応液を基質層１４に点着又
は供給すればよい。この場合には、リガンド（高分子抗
原）の量が多いほど生成される拡散性物質は減少する。
【００２３】測定対象が抗体である場合には、検体と酵
素標識抗原とを混合して反応をした混合液を、基質層１
４に点着又は供給することにより分析を行う。この場
合、被検抗体量が多いほど生成される拡散性物質は減少
する。或いは、検体と抗原と酵素標識抗体とを混合して
競争反応をした混合液を、基質層１４に点着又は供給す
ることにより分析を行う。この場合には被検抗体量が多
いほど生成される拡散性物質は増大する。
【００２４】測定対象 本発明の測定対象は検体に含まれる抗原又は抗体であ
る。抗原とは、抗原決定基を有するリガンドである。検
体の種類は限定されないが、例えば血液（全血、血漿、
血清）リンパ液、尿などがある。血球などの浮遊物があ
る場合には予め除去しておくのが好ましい。ただし適当
な濾過層を分析要素の最上層に設けた場合にはそのまま
分析要素に点着・供給してもよい。
【００２５】抗原（リガンド）は抗原性があってその抗
体を用意できるものであれば、低分子量物質から高分子
量物質までの抗原について本発明の分析要素で分析でき
る。なお抗原性(antigenecity)があるとは、対応する抗
体と反応し得るという意味であり抗原決定基(ideoptop
e)を有するものであればよい。それ自体では免疫原性(i
mmunogenecity)がないものでも、ハプテンとして免疫す
れば抗体が得られるものであれば、本発明における測定
対象のリガンド（抗原）となりうる。
【００２６】低分子量の抗原としては、例えば、ジゴキ
シン、テオフィリン、フェノバルビタール、フェニトイ
ン、ペニシリン、アミカシン等の薬物の誘導体（例えば
薬物と蛋白等の生体物質との結合物）、プロスタグラン
ジン、テストステロン、プロゲステロン、チロキシン等
のホルモン等を挙げることができる。
【００２７】高分子量の抗原としては、例えば、各種内
分泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリン、アルブ
ミン、フェリチン、ＨＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピ
ン）、Ｃ−反応性蛋白（以下ＣＲＰと略す）等の血漿蛋
白質、ＨＢ抗原等のウイルス、バクテリア類、α−フェ
トプロティン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等の各種臓器あ
るいは血中、尿中に存在する抗原がある。
【００２８】なお、測定対象であるリガンドが、これを
酵素標識した場合に酵素活性への干渉（抑制）作用を示
す程度の高分子量の抗原である場合には、後述するよう
に、リガンドと抗原決定基を共通にする他の低分子量物
質を酵素標識して、これを酵素標識抗原とすればよい。
ここで使用する酵素標識抗原とは、被検物であるリガン
ド（抗原）を酵素標識したものだけでなく、リガンドと
抗原決定基を共通にする物質を酵素標識したものを含む
概念である。リガンド誘導体などの化学構造状の類縁体
のみならず、抗体に対する免疫応答性において、リガン
ドと類似の挙動を示す化合物であれば、であれば、これ
を酵素標識して、酵素標識抗原として使用できる。
【００２９】本明細書でいう高分子抗原とは、酵素標識
抗体に結合してる酵素活性への干渉（抑制）作用を示す
程度の高分子量の抗原をいい、例えば分子量２万ダルト
ン以上、好ましくは約５万ダルトン以上の抗原をいう。
これに対して本明細書でいう低分子抗原とは、酵素標識
抗体に結合してる酵素活性にあまり影響を与えない程度
の分子量の抗原をいい、例えば分子量２万ダルトン以下
の抗原をいう。但しこれらの分子量の値はあくまで目安
であって、リガンドが低分子抗原であるか高分子抗原で
あるかの判断は、高分子化合物と結合した結合物（高分
子化抗原）との競合反応を利用するか否かでなされる。
【００３０】高分子化抗原 高分子化抗原、即ちリガンド（抗原）と高分子化合物と
の結合物は、抗体と結合することにより、その抗体を標
識する酵素の活性を抑制するものである。測定対象が低
分子抗原である場合に使用されるものであり、測定対象
が高分子抗原である場合には使用されない。高分子化合
物の分子量は分子量５万ダルトン以上のもので、かつ水
溶性のものが好ましい。このような高分子化合物とし
て、ゼラチン、ヘモシアニンやフェリチン等の蛋白質、
ポリエチレングリコールなどを挙げることができる。こ
れらはリガンドと結合した状態で前述の条件を備えてい
れば十分であり、例えば牛血清アルブミンのような比較
的低分子量のものであっても、それを多量体に自家重合
させるなどして高分子化したものでもよい。
【００３１】抗原（リガンド）と高分子化合物との結合
方法は双方の官能基を考慮して決定することができる。
官能基は、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオー
ル基、イミダゾール基、フェニル基などを利用すること
ができる。例えばアミノ基相互間を結合する方法は、イ
ソシアネート法、グルタルアルデヒド法、ジフルオロベ
ンゼン法、ベンゾキノン法等数多く知られている。アミ
ノ基とカルボキシル基とを結合する方法としては、カル
ボキシル基をサクシニルイミドエステル化する方法の他
カルボジイミド法、ウッドワード試薬法等が知られてお
り、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Naka
ne法）も適用できる。チオール基を利用する場合には、
例えば一方の側のカルボキシル基をサクシニルイミドエ
ステル化してこれにシスティンを反応させてチオール基
を導入し、チオール基反応性二価架橋剤を用いて双方を
結合することができる。フェニル基を利用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法は
これらの例に限られるものではなく、この他例えば「Met
hod in Immunology and Immunochemistry」Vol.1,(C.A.W
illiams,M.W.Chase, Academic Press,1967年) あるいは
石川、河井、宮井編「酵素免疫測定法」（医学書院、19
78年発行）等の成書に記載されている方法の中から適宜
選択して利用することができる。リガンドと高分子化合
物との結合比は１：１に限らず、目的に応じて任意の比
率とすることができるのはいうまでもない。結合反応後
は、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー等によ
り精製し、必要により凍結乾燥法等により乾燥する。
【００３２】また、リガンド自体を重合させて高分子化
抗原としてもよい。その場合の重合方法は前述の結合方
法に準じて行なうことができ、例えばカルボジイミド、
グルタルアルデヒド等の二価性架橋剤で高分子化すれば
よい。
【００３３】高分子化合物には，リガンドの代わりに、
リガンドに対する抗体と交差反応性を有するリガンド誘
導体を結合させてもよい。ここでいうリガンド誘導体と
は、単に化学構造上の類縁体のみならず、免疫反応性に
おいて、リガンドと類似の挙動を示すものを指す。例え
ば、リガンドであるテオフィリンに対する抗体がカフェ
インにも交差反応する場合には、カフェインの誘導体も
高分子化抗原の材料として用いることができる。
【００３４】なおリガンドまたはリガンド誘導体に高分
子化合物と結合させるための適当な官能基がない場合に
は、これらにアミノ基、カルボキシル基或いはチオール
基等が導入してもよい。その際にはスペーサーを介して
導入し、高分子化合物と結合し易くしてもよい。例えば
リガンドがテオフィリンである場合には、カルボキシル
基を導入した８−プロピルカルボキシルテオフィリンを
高分子化合物に結合することができる。
【００３５】抗体 抗体は、被検抗原を含む検体と抗体と酵素標識抗原とを
混合して競争反応させる場合に使用する。被検物である
抗原に対する特異抗体を用いる。酵素標識抗原に抗原
（リガンド）の誘導体を用いる場合には、リガンドとリ
ガンド誘導体に共通する抗原決定基に反応するものを用
いる。常法により得られるポリクローナル抗体でよい
が、モノクローナル抗体を用いれば、より感度が向上す
る。またこの抗体はＦ(ab')2、Ｆab' 、Ｆabなどのフラ
グメントでもよい。
【００３６】酵素標識抗原 酵素標識抗原は、被検抗原を含む検体と抗体と酵素標識
抗原とを混合して競争反応させる場合に使用する。また
被検抗体を含む検体を酵素標識抗原と混合して結合反応
させ、標識酵素の活性変化から被検抗体量を分析する場
合にも使用する。
【００３７】被検物が抗原（リガンド）である場合に
は、酵素標識抗原は、リガンド（或いはこのリガンドと
抗原決定基を共通にするリガンド様物質）と酵素との結
合物である。リガンドが薬物のような低分子量物質であ
る場合には、酵素と直接結合させてもよい。リガンドが
タンパク質などのようにこのまま酵素と結合させた場合
に酵素活性に干渉する程度に大きな大分子量物質である
場合には、タンパク質をフラグメント化して、これを酵
素標識してもよい。このフラグメント化して低分子量と
したタンパク質が、フラグメント化していないタンパク
質（すなわちリガンド）と抗原決定基を共通にしていれ
ばよい。
【００３８】リガンドと酵素との結合方法は、前記した
抗原（リガンド）と高分子化合物との結合方法と同じよ
うに行うことができる。
【００３９】酵素には，リガンドの代わりに、リガンド
に対する抗体と交差反応性を有するリガンド誘導体を結
合させてもよい。ここでいうリガンド誘導体とは、単に
化学構造上の類縁体のみならず、免疫反応性において、
リガンドと類似の挙動を示すものを指す。例えば、リガ
ンドであるテオフィリンに対する抗体がカフェインにも
交差反応する場合には、カフェインの誘導体も高分子化
抗原の材料として用いることができる。
【００４０】なおリガンドまたはリガンド誘導体に酵素
と結合させるための適当な官能基がない場合には、これ
らにアミノ基、カルボキシル基或いはチオール基等が導
入してもよい。その際にはスペーサーを介して導入し、
酵素と結合し易くしてもよい。例えばリガンドがテオフ
ィリンである場合には、カルボキシル基を導入した８−
プロピルカルボキシルテオフィリンを酵素に結合するこ
とができる。
【００４１】酵素標識抗体 酵素標識抗体は、被検抗体を含む検体と抗原と酵素標識
抗体とを混合して競争反応させる場合に使用する。また
被検抗原を含む検体を酵素標識抗体と混合して結合反応
させ、標識酵素の活性変化から被検抗原量を分析する場
合にも使用する。被検抗原が低分子量物質である場合に
は、被検抗原を含む検体と高分子化抗原と酵素標識抗体
とを混合して競争反応させる場合に使用する。
【００４２】被検抗体と抗原と酵素標識抗体との間の競
争反応を行わせる反応系では、酵素標識される抗体は、
被検抗体が認識するのと同じ抗原上の同じ抗原決定基を
認識するものを使用する。
【００４３】被検抗原と高分子化抗原と酵素標識抗体と
の間の競争反応を行わせる反応系では、酵素標識される
抗体は、抗原と高分子化抗原に共通する抗原決定基に反
応するものを用いる。
【００４４】リガンドと酵素との結合方法は、前記した
抗原（リガンド）と高分子化合物との結合方法と同じよ
うに行うことができる。
【００４５】酵素−非拡散性基質−低分子化酵素 抗原或いは抗体に標識として結合された酵素は、高分子
からなる非拡散性基質を分解して、低分子化酵素により
さらに低分子の生成物（グルコース）を生じるような拡
散性生成物を生成する。非拡散性基質は、水性検体液に
対して非拡散性でそれ自体は基質層１４から試薬層１２
に拡散・移行しない。低分子化酵素は、抗原（又は抗
体）に標識として結合された酵素により非拡散性基質よ
り生成した拡散性生成物を、さらに検出可能な低分子生
成物であるグルコースにするものであり、本発明の分析
要素の試薬層１２に含有される。
【００４６】これらの組合わせは、酵素が非拡散性基質
に作用して拡散性物質を生成し、さらにこの拡散性生成
物が、後記低分子化酵素によりさらに低分子の生成物を
生じて容易に検出できるような組合わせから選ぶことが
できる。
【００４７】酵素 このような酵素としては重合体からなる非拡散性基質か
ら拡散性オリゴマーを生成するような分解酵素があり、
例えば、糖質加水分解酵素を挙げることができる。この
ような糖質加水分解酵素として、α−アミラーゼ、β−
アミラーゼ、デキストラナーゼ等がある。
【００４８】これらの酵素はいずれの検体中に存在する
妨害因子で影響されないものが好ましく、また検体中に
は競合する同種の酵素がないことが好ましい。ただし、
標識酵素を同種の酵素が検体中に含まれている場合に
は、この酵素阻害剤を用いてもよい。この酵素阻害剤
は、検体中の酵素を阻害する程度が標識酵素の活性を阻
害する程度より大きいものであればよい。酵素阻害剤は
検体中の酵素を完全に失活させるが、標識酵素を全く阻
害しないものが最も好ましい。しかし実用上は単に測定
時においてブランク値を上昇させなければよく、測定後
には酵素阻害剤が失活するなどして検体中の酵素活性が
回復しても構わない。なお酵素阻害剤は、酵素標識リガ
ンドの酵素を阻害しないものであればよく、遊離状態の
酵素を阻害することは構わない。この酵素阻害剤は、公
知の酵素阻害剤から上記のような特異性を持つものを選
んで用いればよい。或いは検体中の問題となる酵素に対
する抗体を作って、これを酵素阻害剤として用いてもよ
い。
【００４９】非拡散性基質 前述のα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、デキストラナ
ーゼ等に対する基質の例として、カルボキシメチル化澱
粉、澱粉、アミロース、アミロペクチン等がある。
【００５０】低分子化酵素 この低分子化酵素は標識酵素と同じ種類の酵素であって
もよい。この場合には標識酵素は分子内部から切断して
オリゴマーを生成するエンド(endo)活性の酵素であり、
低分子化酵素は分子の端から作用して単量体を生成する
エクソ(exo) 活性を持つものとするのが好ましい。例え
ば、非拡散性基質が重合体（例えば澱粉）である場合
に、標識酵素により生成される拡散性オリゴマー（例え
ばマルトース）を単量体（例えばグルコース）にまで分
解できるものが用いられる。このような低分子化酵素の
例として糖加水分解酵素、より具体的には、α−アミラ
−ゼ、β−アミラーゼ、デキストラナーゼ、グルコアミ
ラーゼ、α−グルコシダ−ゼ等があげられる。
【００５１】グルコース検出系 試薬層において低分子化酵素により生成された低分子生
成物であるグルコースは、グルコースをグルコースオキ
シダーゼ存在下に酸化し生成した過酸化水素を検出する
方法により、光学的に検出することができる。例えば、 (1) Ann.Clin.Biochem., 6, 24(1964) 、J.Clin.Patho
l., 22, 246(1969)に記載のTrinder 試薬を用いる方
法；特開昭49-50991号(対応米国特許3,886,045)、米国特
許3,992,158、 特開昭55-164356号(対応米国特許4,292,2
72)等に記載のTrinder試薬を用いる方法； (2) 特開昭53-26188号(対応米国特許4,089,747)、特開
昭58-45557号等に記載のトリアリール置換イミダゾール
ロイコ色素を含む試薬を用いる方法； (3) 特開昭59-193352号(対応欧州特許公開 EP 0122641
A)、特開昭60-224677号(対応米国特許4,665,023）等に
記載のジアリール−モノアラルキル置換イミダゾールロ
イコ色素を含む試薬を用いる方法; 等、公知の方法を用いることができる。これらの検出方
法の中で、過酸化水素をペルオキシダーゼとロイコ色素
を用いて検出する方法が、感度の点で最も望ましい。
【００５２】これらの検出試薬は分析要素の試薬層１２
に低分子化酵素と一緒に含有させてもよいが、試薬層１
２の下層に設けた別の層（例えば第２試薬層又は検出層
等）に含有させてこの層で検出するようにしてもよい。
なお、ロイコ色素を使用する場合には、水非混和性溶媒
の溶液として、これを親水性バインダー中へ分散させる
のが生成した色素の安定性の上で好ましい。
【００５３】分析要素の層構成 本発明の乾式免疫分析要素は、公知の多種の乾式分析要
素と同様の層構成とすることができる。要素は、基質
層、試薬層の他、支持体、展開層、検出層、光遮蔽層、
接着層、吸水層、下塗り層その他の層を含む多重層とし
てもよい。このような分析要素として、例えば特開昭49
-53888号（対応米国特許 3,992,158）、特開昭51-40191
号（対応米国特許 4,042,335）、 及び特開昭55-164356
号（対応米国特許 4,292,272）、 特開昭61-4959(対応Ｅ
ＰＣ公開特許0166365A)の各明細書に開示されたものが
ある。
【００５４】光透過性水不透過性支持体を用いる場合に
は、本発明の乾式免疫分析要素は、実用的に次のような
構成を取り得る。ただし本発明の内容はこれに限定はさ
れない。 (1) 支持体上に試薬層、その上に基質層を有するもの。 (2) 支持体上に試薬層、接着層、基質層をこの順に有す
るもの。 (3) 支持体上に検出層、試薬層、基質層をこの順に有す
るもの。 (4) 支持体上に試薬層、光反射層、基質層をこの順に有
するもの。 (5) 支持体上に検出層、試薬層、光反射層、基質層をこ
の順に有するもの。 (6) 支持体上に検出層、光反射層、試薬層、基質層をこ
の順に有するもの。 (7) 支持体上に第２試薬層、光反射層、第１試薬層、基
質層をこの順に有するもの。 (8) 支持体上に検出層、第２試薬層、光反射層、第１試
薬層、基質層をこの順に有するもの。
【００５５】上記(1) ないし(6) において試薬層は異な
る複数の層から成ってもよい。また基質層は後述するよ
うに免疫反応し得る成分を含む免疫反応層としてもよ
い。支持体と試薬層又は検出層との間には吸水層を設け
てもよい。また各層の間には濾過層を設けてもよい。ま
た基質層の上には展開層を設けてもよく、又は基質層に
展開作用を持たせ展開層として機能させてもよい。
【００５６】基質層 基質層１４は、水浸透性層で構成され、抗原又は抗体を
標識する酵素の基質である非拡散性基質を含有する。ま
た検体中に含まれるグルコースを、試薬層内の変換酵素
の基質とならずその反応に影響を与えない物質に変換す
る酵素を含有する。すなわち基質層１４はグルコース除
去層としての機能を併せ持つ。このグルコース除去層は
試薬層１２より上層にあればよく、基質層と同じ層か、
或いはその上に独立した層としてもよい。
【００５７】例えば、試薬層内でグルコースから過酸化
水素を生成する変換酵素がグルコースオキシダーゼ（Ｇ
ＯＤ）である場合には、グルコースデヒドロゲナーゼや
グルコキナーゼ（ヘキソキナーゼ Type IV）を基質層
（グルコース除去層）に含有させ、検体中のグルコース
をＧＯＤの酵素反応に影響を与えない物質に変換するこ
とができる。グルコキナーゼを使用する場合には、ＡＴ
Ｐも併せて基質層（グルコース除去層）に含有させる。
【００５８】基質層の水浸透性を確保するためには、多
孔性媒体からなる多孔性層とするか、親水性ポリマーバ
インダーからなる層とするのが好ましい。
【００５９】多孔性層は繊維質であってもよいし、非繊
維質であってもよい。繊維質材料としては、例えば濾
紙、不織布、織物布地（例えば平織布地）、編物布地
（例えばトリコット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用
いることができる。非繊維質材料としては、特開昭49-5
3888等に記載の酢酸セルロース等からなるメンブランフ
ィルター、特開昭49-53888、特開昭55-90859（対応米国
特許 4,258,001）、特開昭58-70163（対応米国特許 4,4
86,537）等に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連
続空隙含有粒状構造物層等のいずれでもよい。特開昭61
-4959(対応欧州公開EP 0166365A）、特開昭62-116258
、特開昭62-138756(対応欧州公開 EP 0226465A）、特
開昭62-138757(対応欧州公開 EP 0226465A）、特開昭62
-138758(対応欧州公開 EP 0226465A）等に記載の部分接
着された複数の多孔性層の積層物も好適である。
【００６０】多孔性層は供給される液体の量にほぼ比例
した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する
展開層であってもよい。展開層としては、これらのうち
織物布地、編物布地などが好ましい。織物布地などは特
開昭57-66359号に記載されたようなグロー放電処理をし
てもよい。展開層には、展開面積、展開速度等を調節す
るため、特開昭60-222770（対応: EP 0162301A）、特開
昭63-219397（対応西独特許公開 DE 37 17 913A）、特
開昭63-112999（対応: DE 37 17 913A）、特開昭62-182
652（対応: DE 37 17 913A）に記載したような親水性高
分子あるいは界面活性剤を含有させてもよい。
【００６１】例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等
に基質を予め含浸又は塗布した後、支持体上に設けた他
の水浸透性層、例えば試薬層の上に、特開昭55-164356
号のような方法で接着させるのも有用な方法である。ま
た別の方法として多孔質層を他の水浸透性層（例えば試
薬層）に前記のような方法で接着させた後、基質を含む
組成物を多孔質層に塗布してもよい。多孔質層への含浸
又は塗布には公知の方法を利用できる。塗布には例えば
ディップ塗布、ドクター塗布、ホッパー塗布、カーテン
塗布等を適宜選択して用いる。
【００６２】こうして作られる基質層の厚さは特に制限
されないが、塗布層として設ける場合には、１μm〜50
μm程度、好ましくは2μm〜30μmの範囲が適当である。
ラミネートによる積層など、塗布以外の方法による場
合、厚さは数十μmから数百μmの範囲で大きく変化し得
る。
【００６３】親水性ポリマーバインダーからなる水浸透
性層で基質層を構成する場合、使用できる親水性ポリマ
ーとしては、例えば、以下のものがある。ゼラチン及び
これらの誘導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロー
ス誘導体（例えばヒドロキシエチルセルロース）、アガ
ロース、アルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合
体、メタアクリルアミド共重合体、アクリルアミド又は
メタアクリルアミドと各種ビニル性モニマーとの共重合
体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナ
トリウム、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重
合体などである。
【００６４】親水性ポリマーバインダーで構成される基
質層は、特公昭53-21677号（対応米国特許 3,992,158)、
特開昭55-164356号（対応米国特許 4,292,272)、特開昭
54-101398号（対応米国特許 4,132,528)、特開昭61-2920
63号（Chemical Abstracts,106; 210567y) 等の明細書
に記載の方法に従って、基質その他の試薬組成物と親水
性ポリマーを含む水溶液又は水分散液を支持体又は検出
層等の他の層の上に塗布し乾燥することにより設けるこ
とができる。親水性ポリマーをバインダーとする基質層
の乾燥時厚さは約2μm〜約50μm 、好ましくは約4μm〜
約30μmの範囲、被覆量では約2g/m2〜約50g/m2、好まし
くは約4g/m2〜約30g/m2の範囲である。
【００６５】基質層には非拡散性基質の他に、塗布特
性、拡散性化合物の拡散性、反応性、保存性等の諸性能
の向上を目的として、酵素の活性化剤、補酵素、界面活
性剤、ｐＨ緩衝剤組成物、微粉末、酸化防止剤、その
他、有機物あるいは無機物からなる各種添加剤を加える
ことができる。基質層に含有させることができる緩衝剤
の例としては、日本化学会編「化学便覧 基礎編」（東
京、丸善（株）、1966年発行）1312-1320頁、R.M.C.Daw
son et al編、「Data for Biochemical Research」第２
版(Oxford at the Clarendon Press,1969 年発行) 476-
508頁、「Biochemistry」 5, 467-477頁(1966年) 、「Anal
ytical Biochemistry」 104, 300-310頁(1980年)に記載
のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤の具体例としてトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）を含む緩
衝剤；燐酸塩を含む緩衝剤；硼酸塩を含む緩衝剤；クエ
ン酸又はクエン酸塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝
剤；ビシン(Bicine)を含む緩衝剤；HEPESを含む緩衝
剤；MESを含む緩衝剤などのグッド緩衝剤等がある。
【００６６】試薬層 試薬層１２は、基質層１４から拡散・移行してきた拡散
性物質を検出する試薬組成物を含有する。この試薬組成
物の中には拡散性物質をグルコース単量体に分解する低
分子化酵素が含有される。また生じた低分子生成物（グ
ルコース）に反応して化学量論的量の過酸化水素を産生
する変換酵素、並びにこの過酸化水素を光学的に検出す
るための検出試薬組成物を含有する。
【００６７】試薬層は、水浸透性層で構成され、前記基
質層の説明で述べた水浸透性層のうち、親水性ポリマー
バインダーからなる連続層とするのが好ましい。親水性
ポリマバインダにより構成された無多孔性層からなる試
薬層であれば、グルコースデヒドロキナーゼやグルコキ
ナーゼなど大分子量の酵素蛋白は、試薬層に移行するこ
とがない。従って、試薬層内で低分子化酵素により生成
されるグルコースが、グルコースデヒドロキナーゼやグ
ルコキナーゼなどの酵素で除去されることがない。用い
る親水性ポリマーバインダーは基質層で生成される拡散
性生成物や、試薬層内に含有する発色試薬などを考慮し
て決められる。
【００６８】支持体 支持体１０としては光不透過性（不透明）、光半透過性
（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いる
ことができるが、一般的には光透過性で水不透過性の支
持体が好ましい。光透過性水不透過性支持体の材料とし
て好ましいのものはポリエチレンテレフタレート、ポリ
スチレンである。親水性層を強固に接着させるため通
常、下塗り層を設けるか、親水化処理を施す。
【００６９】免疫反応層 図１の基質層１４には、拡散性基質のみならず、免疫反
応に必要な分子種を含有させてもよい。例えば、 (1) 被検抗原と酵素標識抗体とを反応させて、被検抗原
量を分析する場合には、酵素標識抗体を； (2) 被検抗原と抗体と酵素標識抗原とを反応させて、被
検抗原量を分析する場合には、抗体と酵素標識抗原と
を； (3) 被検分子抗原と高分子化抗原と酵素標識抗体とを反
応させて、被検抗原量を分析する場合には、高分子化抗
原と酵素標識抗体とを； (4) 被検抗体と酵素標識抗原とを反応させて、被検抗体
量を分析する場合には、酵素標識抗原を； (5) 被検抗体と抗原と酵素標識抗体とを反応させて、被
検抗体量を分析する場合には、抗原と酵素標識抗体と
を； 基質層に含有させる。これにより、基質層は、その層内
で免疫反応を併せて行なわせる免疫反応層として機能す
る。この場合には、要素に検体を点着するだけで、要素
内で均一系の酵素免疫反応を進行させることができる。
【００７０】或いは基質層にこれらいずれかを含有させ
て残りの方は基質層の上層に積層された水浸透性層に含
有させてもよい。又は、基質層の上に１つ又は複数の層
からなる水浸透性層を設け、これらに免疫反応に必要な
分子種を含有させてもよい。これら免疫反応層の層構成
は、その免疫反応の反応様式に応じて、任意に決めるこ
とができる。
【００７１】例えば、上記(2)の場合では、基質層とは
別の複数の層に抗体と酵素標識抗原を別々に含有させて
もよい。例えば図２に示すように、基質層１４の上に抗
体を含有する水浸透性層１６を設け、さらにその上に酵
素標識抗原を含有する水浸透性層１８を設けて免疫分析
要素を構成してもよい。この場合には、検体中の抗原
（リガンド）は、層１８の酵素標識抗原と共に、層１６
に拡散・浸透する。層１６では、抗原と酵素標識抗原と
はそれぞれ抗体と結合し、さらに基質層１４に移行す
る。
【００７２】これとは逆に、水浸透性層１６に酵素標識
抗原を含有させ、その上の水浸透性層１８には抗体を含
有させて、免疫分析要素を構成してもよい。この場合に
は、検体中の抗原（リガンド）は、層１８の抗体と結合
し、層１６に移行する。層１６では、抗原に結合してい
なかった抗体が酵素標識抗原と結合し、さらに基質層１
４に移行する。
【００７３】また、基質層とは別の１つの層に抗体と酵
素標識抗原を実質的な乾燥状態又は実質的に水の不存在
状態で一緒に含有させてもよい。例えば、図３に示すよ
うに、基質層１４の上に抗体と酵素標識抗原を実質的な
乾燥状態又は実質的に水の不存在状態で含有する水浸透
性層２０を設けて免疫分析要素を構成してもよい。この
場合には、水が溶媒である被検液が層２０に点着供給さ
れた時に、層２０の中で被検液に由来する水の中で、検
体中のリガンド（抗原）と酵素標識抗原とは、それぞれ
抗体と結合し、基質層１４に移行する。１つの層に抗体
と酵素標識リガンドを実質的な乾燥状態又は実質的に水
の不存在状態で一緒に含有させるには、抗体と酵素標識
抗原の一方又は両者をアルコール（例、エタノール）等
の非水溶媒に溶解又は分散させて水浸透性層に含浸させ
ればよい。
【００７４】なお、免疫反応層を設けない場合には、本
発明の分析要素は、基質層１４に含有される非拡散性基
質を分解する酵素の分析にも使用することができる。例
えば、非拡散性基質としてカルボキシル化澱粉、澱粉、
アミロース、アミロペクチンなどを使用する場合には、
α−アミラーゼや、β−アミラーゼなどのエンド活性型
糖質加水分解酵素の分析に使用することができる。
【００７５】免疫分析要素の製造方法 本発明の乾式免疫分析要素は前述の諸特許明細書に記載
の公知の方法により調製することができる。本発明の分
析要素は一辺約15mmから約30mmの正方形またはほぼ同サ
イズの円形等の小片に裁断し、特公昭57-28331（対応米
国特許 4,169,751)、実開昭56-142454（対応米国特許
4,387,990)、特開昭57-63452、実開昭58-32350、特表昭
58-501144（対応国際公開: WO 83/00391)等に記載のス
ライド枠に収めて化学分析スライドとして用いること
が、製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ま
しい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットま
たはマガジンに収めて用いたり、または小片を開口のあ
るカードに貼付または収めて用いることなどもできる。
【００７６】免疫分析要素による分析方法 本発明の分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作
と同様の操作により液体試料中の被検物である抗原又は
抗体の定量分析ができる。例えば約５μL〜約30μL、好
ましくは８〜15μLの範囲の血漿、血清、尿などの水性
液体試料液を基質層１４に点着する。点着した分析要素
を約20℃〜約45℃の範囲の一定温度で、好ましくは約30
℃〜約40℃の範囲内の一定温度で１〜10分間インキュベ
ーションする。要素内の発色又は変色を光透過性支持体
側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測
定法の原理により検体中のリガンドの量を求めることが
できる。点着する液体試料の量、インキュベーション時
間及び温度を一定にすることにより定量分析を高精度に
実施できる。
【００７７】測定操作は特開昭60-125543、同60-22086
2、同61-294367、同58-161867(対応米国特許 4,424,19
1）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作
で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精
度によっては、目視により発色の度合いを判定して、半
定量的な測定を行なってもよい。
【００７８】分析要素が免疫反応層を有さない場合、す
なわち、分析要素内に被検物である抗原又は抗体との免
疫反応系に必要な分子種を含有させていない場合には、
分析要素外の適当な反応溶液中で必要な免疫反応を行わ
せた後、その反応液を要素に点着すれば標識酵素活性の
変化として被検物を分析することができる。例えば、抗
原を分析する場合には、要素に点着する前に、水性試料
液を抗体及び酵素標識リガンドを含む溶液と混和して、
結合反応を十分行なわせてから、基質層に点着すればよ
い。
【００７９】
【実施例１と比較例１】ゼラチン下塗層が設けられてい
る厚さ180μｍの無色透明ポリエチレンテレフタレート
（PET）シート（支持体）上に下記の被覆量になるよう
に架橋剤含有試薬溶液を塗布し、乾燥して試薬層を設け
た。 アルカリ処理ゼラチン 14.5 g/m2 ノニルフェノキシポリエトキシエタノール （オキシエチレン単位平均 9〜10含有） 0.2 g/m2 グルコースオキシダーゼ 5000 u/m2 ペルオキシダーゼ 15000 u/m2 グルコアミラーゼ 5000 u/m2 2-(4- ヒドロキシ-3,5- ジメトキシフェニル-4-[4-（ジメチルアミノ） フェニル]-5-フェネチルイミダゾール（ロイコ色素）酢酸塩 0.38 g/m2 ビス[(ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン 0.1 g/m2
【００８０】この試薬層の表面に下記の被覆量になるよ
うに下記試薬含有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤さ
せ、その上に50デニール相当のPET 紡績糸36ゲージ編み
した厚さ約250μｍのトリコット編物布地をほぼ一様に
軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層を設け
た。 ノニルフェノキシポリエトキシエタノール （オキシエチレン単位平均 9〜10含有） 0.15 g/m2 ビス[(ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン 0.4 g/m2
【００８１】次に、下記の被覆量になるように基質を塗
布、乾燥して基質層兼グルコース除去層を設けてＣＲＰ
分析用多層分析要素を調製した。 カルボキシメチル化澱粉 3.5 g/m2 マンニトール 3.0 g/m2 ＭＥＳ（2-モルホリノエタンスルホン酸） 2.0 g/m2 グルコキナーゼ（ヘキソキナーゼ Type IV） 5.0 KU/m2 ＡＴＰ（アデノシン三燐酸） 2.0 g/m2 MgCl2 10.0 g/m2
【００８２】次いでこの分析要素を15mm四方のチップに
裁断し、特開昭57-63452に記載のスライドの枠に収め
て、本実施例のＣＲＰ分析用多層乾式スライド１とし
た。比較例として、この乾式スライド１の基質層からグ
ルコキナーゼのみを除いたものを作製し、比較例の乾式
スライド２とした。
【００８３】
【性能評価試験】50mMグリセロ燐酸緩衝溶液（pH7）の1
0μLを実施例１の乾式スライド１に点着した。400mg/dL
グルコース水溶液を50mMグリセロ燐酸緩衝溶液（pH7）
で21倍希釈したもの10μLを、実施例１のスライド１及
び比較例のスライド２に点着した。この後、各スライド
を37℃に保って、支持体側から650nmの反射光学濃度を
経時的に測定した。点着後の反射光学濃度の時間変化を
図４に示す。
【００８４】基質層にグルコキナーゼを含有しない比較
例のスライド２では、グルコース含有試料液点着後に著
しい反射光学濃度の増加が見られる（図中、比較例（Gl
u(+)）。点着約２分後からは増加傾向は減少するがそれ
でもなお、緩やかに反射光学濃度は増加していた。これ
は点着した試料液中のグルコースが基質層から試薬層に
移行して、試薬層内でグルコースオキシダーゼの基質と
なって過酸化水素が生成されたことを示している。
【００８５】一方、実施例１のスライド１では、グルコ
ース含有試料液点着後２０秒ほどは反射光学濃度の増加
が見られたが、その後はプラトーに達し、反射光学濃度
は一定値であった。（図４、実施例（Glu(+)）。乾燥状
態にあったスライドに試料液を点着した直後は、試料液
が層内で展開・拡散すると共に、次の試薬層に速やかに
浸潤する。試料液の浸潤が終わった後は、試料液中の物
質は拡散により移行することになる。液体中の単なる拡
散による物質移動よりも、液体そのものの移動によ物質
移動の方がはるかに早い。このため、点着直後では、試
料液中のグルコースは基質層兼グルコース除去層内で除
去されないうちに、試料液そのものの浸潤と共に試薬層
に移行する。この結果、点着後しばらくの反射光学濃度
の増大となって現れたものと思われる。しかし、ひとた
び試薬層まで浸潤が完了すれば、その後基質層から供給
される物質は、液体中の拡散法則に従うものでありそれ
ほど速くはない。点着約２０秒後以降では、すでにグル
コースがグルコキナーゼにより消費され、試料液中のグ
ルコースはほとんど試薬層に移行していないものと思わ
れる。
【００８６】
【性能評価試験２】アミラーゼ標識抗ＣＲＰ−ＩｇＧ
(0.1mg/mL）を含み、既知量のＣＲＰを含有する50mMグ
リセロ燐酸緩衝溶液（pH7）10μLを、実施例１のスライ
ド１と、比較例のスライド２に点着した。37℃に保っ
て、中心波長650nmの可視光でＰＥＴ支持体側から各ス
ライド１，２の反射光学濃度を測定した。点着から４分
後および６分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ6-4）を図
５に示す。図５の検量線より、基質層にグルコキナーゼ
を含有させてグルコース除去層とした本発明のＣＲＰ分
析用乾式免疫分析要素は、グルコース除去層を持たない
比較例と同様、ＣＲＰの定量が精度良く行えることが明
らかである。このことは、グルコース除去層は、ＣＲＰ
定量の検出感度に悪影響を与えていないことを示してい
る。
【００８７】
【実施例２と比較例２】実施例１と同様にして多層分析
要素を作成し、その基質層兼展開層であるトリコット編
物布地層に、さらにアミラーゼ標識ＣＲＰ−ＩｇＧを３
mg/m2の被覆量となるようにしてエタノール溶液を塗布
し含浸させ乾燥させてＣＲＰ分析用多層免疫スライド３
（実施例２）を作成した。同様に、比較例１の多層分析
要素のトリコット編物布地層に、アミラーゼ標識ＣＲＰ
−ＩｇＧを３mg/m2の被覆量となるようにしてエタノー
ル溶液を塗布し含浸させ乾燥させて比較例２のＣＲＰ分
析用多層免疫スライド４を作成した。
【００８８】
【性能評価試験】このスライド３及びスライド４に、既
知一定量のＣＲＰと各種濃度のグルコースを含有する50
mMグリセロ燐酸緩衝溶液(pH7)を10μLを点着し、37℃に
保って、支持体側から650nmの反射光学濃度を測定し、
点着から４分後および６分後の反射光学濃度の差（ΔＯ
Ｄ6-4）を求めた。
【００８９】図６に示すように、従来の比較例２のスラ
イド４では、試料液中のグルコース濃度が増加するにつ
れて、ΔＯＤ6-4の値は大きくなっていた。これに対し
て、グルコース除去層を設けた実施例２のスライド３で
は、試料液中にグルコースが存在しても、ΔＯＤ6-4の
値には影響がほとんど見られなかった。このことは、本
発明による乾式免疫分析要素では、試料液中のグルコー
ス濃度が検体によって変動するような場合でも、精度良
く免疫分析できることを示している。
【００９０】最後に本発明に好ましい態様をまとめる
と、以下の通りである。 (1) 抗原と酵素標識抗体との反応、もしくは、抗原と抗
体と酵素標識抗原との反応、もしくは抗原と、抗原と高
分子化合物との結合物と、酵素標識抗体との間の反応の
いずれかの反応により生じた標識酵素活性の変化を測定
することにより抗原の量を分析する免疫分析要素であっ
て、前記標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性
基質を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらにグル
コースにする低分子化酵素とこの産生されたグルコース
をさらに過酸化水素に変換する変換酵素とを含有する試
薬層を備え、この過酸化水素量を検出することにより被
検物である抗原量を分析する免疫分析要素において、前
記試薬層より上層に、検体中に含まれるグルコースを試
薬層内の変換酵素の基質とはならない物質に変換するこ
とにより除去するグルコース除去層が設けられているこ
とを特徴とする免疫分析要素。 (2) 前記グルコース除去層は、前記基質層と同一の層
又はこれより上に積層された層であることを特徴とする
(1)記載の免疫分析要素。 (3) 前記非拡散性基質が高分子多糖類であり、前記標
識酵素がエンド活性型の糖質分解酵素であり、前記変換
酵素がエキソ活性型の糖質分解酵素であることを特徴と
する(1)記載の免疫分析要素。 (4) 前記変換酵素がグルコースオキシダーゼであり、
前記グルコース除去層には、グルコースデヒドロゲナー
ゼ又は、グルコキナーゼとＡＴＰとの混合物のいずれか
が含有されていることを特徴とする(1)記載の免疫分析
要素。 (5) 前記試薬層は親水性ポリマーをバインダとして含
有する層で形成されていることを特徴とする(1)記載の
免疫分析要素。 (6) 前記酵素標識抗体が、前記基質層、前記グルコー
ス除去層又はこれらの層の上に積層された層に含有され
ていることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。 (7) 前記抗体が、前記基質層、前記グルコース除去層
又はこれらの層の上に積層された層に含有されているこ
とを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。 (8) 前記酵素標識抗原が、前記基質層、前記グルコー
ス除去層又はこれらの層の上に積層された層に含有され
ていることを特徴とする(1)記載の免疫分析要素。 (9) 前記抗体と、前記酵素標識抗原とが、前記基質
層、前記グルコース除去層又はこれらの層の上に積層さ
れた層に含有されていることを特徴とする請求項(1)記
載の免疫分析要素。 (10) 抗原と高分子化合物との前記結合物と、前記酵素
標識抗体とが、前記基質層、前記グルコース除去層又は
これらの層の上に積層された層に含有されていることを
特徴とする請求項(1)記載の免疫分析要素。 (11) 前記過酸化水素と反応して可視吸収を有する色素
を生成する試薬組成物を、前記試薬層又は他の水浸透性
層に含有していることを特徴とする(1)記載の免疫分析
要素。 (12) 前記試薬組成物が、酸化により発色するロイコ色
素を含む(8)記載の免疫分析要素。 (13) 前記試薬組成物が、ロイコ色素の水不溶性溶媒か
らなる溶液の水性液中への分散物を含む(9)記載の免疫
分析要素。 (14) 前記試薬組成物が、ペルオキシダーゼ及びロイコ
色素を含む(10)記載の免疫分析要素。 (15) 抗体と酵素標識抗原との反応もしくは、抗体と抗
原と酵素標識抗体との反応により生じた標識酵素活性の
変化を測定することにより抗体の量を分析する免疫分析
要素であって、前記標識酵素により拡散性物質を生成す
る非拡散性基質を含有する基質層と、前記拡散性物質を
さらにグルコースにする低分子化酵素とこの産生された
グルコースをさらに過酸化水素に変換する変換酵素とを
含有する試薬層を備え、この過酸化水素量を検出するこ
とにより被検物である抗体量を分析する免疫分析要素に
おいて、前記試薬層より上層に、検体中に含まれるグル
コースを試薬層内の変換酵素の基質とはならない物質に
変換することにより除去するグルコース除去層が設けら
れていることを特徴とする免疫分析要素。 (16) 前記グルコース除去層は、前記基質層と同一の層
又はこれより上に積層された層であることを特徴とする
(15)記載の免疫分析要素。 (17) 前記非拡散性基質が高分子多糖類であり、前記標
識酵素がエンド活性型の糖質分解酵素であり、前記変換
酵素がエキソ活性型の糖質分解酵素であることを特徴と
する(15)記載の免疫分析要素。 (18) 前記変換酵素がグルコースオキシダーゼであり、
前記グルコース除去層には、グルコースデヒドロゲナー
ゼ又は、グルコキナーゼとＡＴＰとの混合物のいずれか
が含有されていることを特徴とする(15)記載の免疫分析
要素。 (19) 前記試薬層は親水性ポリマーをバインダとして含
有する層で形成されていることを特徴とする(15)記載の
免疫分析要素。 (20) 前記酵素標識抗原が、前記基質層、前記グルコー
ス除去層又はこれらの層の上に積層された層に含有され
ていることを特徴とする(15)記載の免疫分析要素。 (21) 前記酵素標識抗体が、前記基質層、前記グルコー
ス除去層又はこれらの層の上に積層された層に含有され
ていることを特徴とする(15)記載の免疫分析要素。 (22) 前記抗原が、前記基質層、前記グルコース除去層
又はこれらの層の上に積層された層に含有されているこ
とを特徴とする(15)記載の免疫分析要素。 (23) 前記抗原と、前記酵素標識抗体とが、前記基質
層、前記グルコース除去層又はこれらの層の上に積層さ
れた層に含有されていることを特徴とする請求項(1)記
載の免疫分析要素。 (24) 前記過酸化水素と反応して可視吸収を有する色素
を生成する試薬組成物を、前記試薬層又は他の水浸透性
層に含有していることを特徴とする(15)記載の免疫分析
要素。 (25) 前記試薬組成物が、酸化により発色するロイコ色
素を含む(15)記載の免疫分析要素。 (26) 前記試薬組成物が、ロイコ色素の水不溶性溶媒か
らなる溶液の水性液中への分散物を含む(15)記載の免疫
分析要素。 (27) 前記試薬組成物が、ペルオキシダーゼ及びロイコ
色素を含む(15)記載の免疫分析要素。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の免疫分析要素の一実施態様例の構成図
である。
【図２】本発明の免疫分析要素の他の実施態様例の構成
図である。
【図３】本発明の免疫分析要素のさらに他の実施態様例
の構成図である。
【図４】実施例１及び比較例１の免疫分析要素にグルコ
ース含有資料を点着した場合の反射光学濃度の経時変化
を示す図である。
【図５】実施例１及び比較例１の免疫分析要素の検量線
を示す図である。
【図６】実施例２及び比較例２のＣＲＰ分析用免疫分析
要素の反射光学濃度ΔＯＤ6-4に対するグルコース濃度
の影響を調べた図である。点着した試料液中のＣＲＰ濃
度は一定である。
【符号の説明】
１０ 透光性支持体 １２ 試薬層 １４ 基質層兼グルコース除去層 １６ 抗体（又は酵素標識抗原）を含有する水浸透性層 １８ 酵素標識抗原（又は抗体）を含有する水浸透性層 ２０ 抗体と酵素標識抗原とを含有する水浸透性層

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 抗原と酵素標識抗体との反応、もしく
    は、抗原と抗体と酵素標識抗原との反応、もしくは抗原
    と、抗原と高分子化合物との結合物と、酵素標識抗体と
    の間の反応のいずれかの反応により生じた標識酵素活性
    の変化を測定することにより抗原の量を分析する免疫分
    析要素であって、 前記標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質
    を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらにグルコー
    スにする低分子化酵素とこの産生されたグルコースをさ
    らに過酸化水素に変換する変換酵素とを含有する試薬層
    を備え、この過酸化水素量を検出することにより被検物
    である抗原量を分析する免疫分析要素において、 前記試薬層より上層に、検体中に含まれるグルコースを
    試薬層内の変換酵素の基質とはならない物質に変換する
    ことにより除去するグルコース除去層が設けられている
    ことを特徴とする免疫分析要素。
  2. 【請求項２】 前記グルコース除去層は、前記基質層と
    同一の層又はこれより上に積層された層であることを特
    徴とする請求項１記載の免疫分析要素。
  3. 【請求項３】 前記非拡散性基質が高分子多糖類であ
    り、前記標識酵素がエンド活性型の糖質分解酵素であ
    り、前記変換酵素がエキソ活性型の糖質分解酵素である
    ことを特徴とする請求項１記載の免疫分析要素。
  4. 【請求項４】 前記変換酵素がグルコースオキシダーゼ
    であり、前記グルコース除去層には、グルコースデヒド
    ロゲナーゼ又は、グルコキナーゼとＡＴＰとの混合物の
    いずれかが含有されていることを特徴とする請求項１記
    載の免疫分析要素。
  5. 【請求項５】 前記試薬層は親水性ポリマーをバインダ
    として含有する層で形成されていることを特徴とする請
    求項１記載の免疫分析要素。
  6. 【請求項６】 抗体と酵素標識抗原との反応もしくは、
    抗体と抗原と酵素標識抗体との反応により生じた標識酵
    素活性の変化を測定することにより抗体の量を分析する
    免疫分析要素であって、 前記標識酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質
    を含有する基質層と、前記拡散性物質をさらにグルコー
    スにする低分子化酵素とこの産生されたグルコースをさ
    らに過酸化水素に変換する変換酵素とを含有する試薬層
    を備え、この過酸化水素量を検出することにより被検物
    である抗体量を分析する免疫分析要素において、 前記試薬層より上層に、検体中に含まれるグルコースを
    試薬層内の変換酵素の基質とはならない物質に変換する
    ことにより除去するグルコース除去層が設けられている
    ことを特徴とする免疫分析要素。
  7. 【請求項７】 前記グルコース除去層は、前記基質層と
    同一の層又はこれより上に積層された層であることを特
    徴とする請求項６記載の免疫分析要素。
  8. 【請求項８】 前記非拡散性基質が高分子多糖類であ
    り、前記標識酵素がエンド活性型の糖質分解酵素であ
    り、前記変換酵素がエキソ活性型の糖質分解酵素である
    ことを特徴とする請求項６記載の免疫分析要素。
  9. 【請求項９】 前記変換酵素がグルコースオキシダーゼ
    であり、前記グルコース除去層には、グルコースデヒド
    ロゲナーゼ又は、グルコキナーゼとＡＴＰとの混合物の
    いずれかが含有されていることを特徴とする請求項６記
    載の免疫分析要素。
  10. 【請求項１０】 前記試薬層は親水性ポリマーをバイン
    ダとして含有する層で形成されていることを特徴とする
    請求項６記載の免疫分析要素。
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