JPH10304882A5 - - Google Patents

Description

【００４５】
得られた濃縮酵素液のうち３００ｍｌを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透析液上清（３８０ｍｌ）を、ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）にかけた。

【００４６】
本発明のコージビオースホスホリラーゼをＤＥＡＥ−トヨパール ６５０ゲルに吸着せしめ、０Ｍ食塩水から０．５Ｍ食塩水までのリニアグラジエントにより、カラムより溶出させた。約０．２Ｍの食塩で溶出される酵素活性画分を回収した後、以下の方法で更に精製を行った。１．５Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、次に、ブチルトヨパール ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量１００ｍｌ）を行った。吸着したコージビオースホスホリラーゼを、１．５Ｍ硫安から０Ｍ硫安までのリニアグラジエントによりカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収した。

【００５２】
本発明のコージビオースホスホリラーゼ活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を、活性測定方法に準じて調べた。すなわち、温度の影響を調べる際には、活性測定法における反応温度６０℃に代えて約４０℃乃至約８０℃のいずれかの温度で反応を行い、ｐＨの影響を調べる際には、活性測定法において用いられる緩衝液に代えて、ｐＨ約４乃至約８のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液を用いて反応を行い、この後、活性測定法と同様に反応停止し、グルコース生成量を測定した。測定結果を、最大値に対する相対値として表した結果を図１（温度の影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度はｐＨ５．５、３０分間反応で６５℃付近、至適ｐＨは６０℃、３０分間反応で５．５付近であった。本酵素の温度安定性は、当該酵素を溶解せしめた１０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）を約４０℃乃至８０℃のいずれかの温度に１時間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。また、ｐＨ安定性は、ｐＨ約３．５乃至約１０のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液に当該酵素を溶解せしめ、４℃で２４時間保持した後、ｐＨ５．５に調整し、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。測定結果を最大値に対する相対値として表した結果を図３（温度安定性）、図４（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は６５℃付近までであり、ｐＨ安定性は約５．５乃至１０．０であった。また、本酵素活性は、１ｍＭのＨｇ++で阻害された。

【００５４】
（２）中間部部分アミノ酸配列
実験２の方法で得られた精製酵素標品の一部を１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して透析した後、同緩衝液にて１ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行った。マイクロボンダスフェアーＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製、米国）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−０％アセトニトリル溶液から０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−４８ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液までの１２０分間のリニアグラジエントの条件で行った。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した２ペプチド、ＫＰ１５（保持時間６６分）、ＫＰ２３（保持時間９６分）を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−５０ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液に溶解した。これらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれＮ末端から５残基までアミノ酸配列を分析した。ペプチドＫＰ１５からは、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列が、またペプチドＫＰ２３からは、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列が得られた。さらに同じ試料を用いて同じ方法により、より詳細に分析したところ、ペプチドＫＰ１５及びペプチドＫＰ２３はそのＮ末端部に、それぞれ、配列表における配列番号７及び配列番号８に示すアミノ酸配列を含んでいることが判明した。

【００７２】
【実験１０】
〈コージトリオース〉
本発明のコージビオースホスホリラーゼによるコージビオースへの糖転移反応で生成するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、２０％コージビオースを溶解含有する５ｍＭリン酸二水素ナトリウムをｐＨ５．５に調整し、これに実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをコージビオース１ｇ当たり１０単位加え、６０℃で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果反応終了液にはコージビオースとも、また、Ｄ−グルコースやβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とも保持時間の異なる成分が多量生成していることが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率は約３０％であった。本反応液の残り全量を実験８と同様に分画精製し、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末を、反応に供したコージビオースの固形物当たり収率約１５％で得た。本粉末標品は、当該グルコシル転移糖を固形物当たり約９８％含有していた。

【００９０】
この実施例Ａ−４の方法で得た透析物を、さらに実験２に示した方法に準じて、ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０ゲル、ウルトロゲル ＡｃＡ４４を用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、さらにこの精製酵素を実験３に示した方法に準じて分析した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量８３，０００±５，０００ダルトン、ゲル濾過法による分子量５００，０００±３０，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点４．４±０．５、コージビオースホスホリラーゼ活性の至適温度６５℃付近、至適ｐＨ５．５付近、温度安定性は６５℃付近まで、ｐＨ安定性は約５．５乃至１０．０であり、実験１乃至２に示した方法で調製された当該酵素の理化学的性質と実質的に同一であった。以上の結果は、本発明のコージビオースホスホリラーゼは、組換えＤＮＡ技術によっても良好に製造でき、なお且つ酵素の生産性も有意に向上することを示している。