JPH10304882A - コージビオースホスホリラーゼとその製造方法並びに用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規酵素コージビオースホスホリラーゼを提
供するとともに本酵素の製造方法及び本酵素を利用した
グルコシル転移糖含有糖質並びにその用途を提供する。 【解決手段】 コージビオースホスホリラーゼ活性を有
する新規酵素と、当該酵素をコードするＤＮＡと、当該
酵素を産生する微生物を栄養培地中で培養し、産生した
酵素を培養物から採取する酵素の製造方法と、その酵素
をβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とそれ以外の糖質に作
用させて得られるグルコシル転移糖含有糖質、並びに、
そのグルコシル転移糖含有糖質を含有せしめた組成物に
より解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規酵素コージビ
オースホスホリラーゼとその製造方法並びに用途に関
し、更に詳細には、無機質のリン酸および／またはその
塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて
「無機リン酸」と略称する。）の存在下コージビオース
を分解してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リ
ン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、
本明細書を通じて「β−Ｄ−グルコース−１リン酸」と
略称する。）を生成し、また、逆に、β−Ｄ−グルコー
ス−１リン酸とＤ−グルコースからコージビオースと無
機リン酸を生成する作用を示す新規酵素コージビオース
ホスホリラーゼとその製造方法、並びに、このコージビ
オースホスホリラーゼを用いて製造されるグルコシル転
移糖含有糖質、さらには、これら糖質を含有せしめた組
成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、マルトース、トレハロースなどの
オリゴ糖とその機能が注目され、これらオリゴ糖の多様
な生産方法が各方面から広く検討されるようになってき
た。これらオリゴ糖を生産する方法としてマルトースホ
スホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、スクロー
スホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ラミ
ナリビオースホスホリラーゼなど種々のホスホリラーゼ
の利用が知られている。また、これらホスホリラーゼの
給源としては、種々の微生物が知られている。

【０００３】これらホスホリラーゼとその作用並びに給
源微生物については『酵素ハンドブック』朝倉書店（１
９８２年）にまとめられている。しかしながら、コージ
ビオースを生成しうるホスホリラーゼは未だ知られてお
らず、その提供が望まれる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規酵素コ
ージビオースホスホリラーゼを提供するとともに本酵素
の製造方法及び本酵素を利用したグルコシル転移糖含有
糖質並びにその用途を提供するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために未知のコージビオースホスホリラーゼ
を求めて、その酵素を産生する微生物を広く検索した。
その結果、サーモアナエロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａ
ｅｒｏｂｉｕｍ）属に属する微生物サーモアナエロビウ
ム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ
ｂｒｏｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ ３５０４７）が、新規酵
素コージビオースホスホリラーゼを産生することを見い
だすとともに、本酵素の製造方法を確立した。さらに、
本酵素をβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体とし
て各種糖質共存下で作用させることにより得られる、新
規および／または既知のグルコシル転移糖含有糖質並び
に該糖質を含有せしめた組成物の製造方法を確立して本
発明を完成した。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明のコージビオースホスホリ
ラーゼは、無機リン酸の存在下でコージビオースを分解
してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を
生成する作用を有する酵素すべてを包含するものであ
り、その出所・由来は問わない。斯かるコージビオース
ホスホリラーゼとしては、例えば、下記のような作用を
示し、理化学的性質を有する酵素を挙げることができ
る。 （１） 作用 （ａ）無機リン酸存在下でコージビオースを分解してＤ
−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生
成する。 （ｂ）β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコース
とからコージビオースと無機リン酸を生成し、さらにβ
−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として、他の糖
質にグルコシル基の転移を触媒する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、８３，０００±５，０００
ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ４．４±０．
５。 （４） 至適温度 ｐＨ５．５、３０分間反応で６５℃付近。 （５） 至適ｐＨ ６０℃、３０分間反応でｐＨ５．５付近。 （６） 温度安定性 ｐＨ５．５、１時間保持の条件で６５℃付近まで安定。 （７） ｐＨ安定性 ４℃、２４時間保持の条件でｐＨ約５．５乃至１０．
０。 （８） 阻害 本酵素活性は、１ｍＭのＨｇ++で阻害を受ける。

【０００７】斯かるコージビオースホスホリラーゼとし
てさらに具体的には、例えば、部分アミノ酸配列として
配列表における配列番号１、２又は３に示すアミノ酸配
列を含み、全体としては配列表における配列番号４に示
すアミノ酸配列を含む蛋白質や、その機能性誘導体を挙
げることができる。ここでいう機能性誘導体とは、上述
したようなコージビオースホスホリラーゼとしての作用
を実質的に失わない範囲で、そのアミノ酸配列における
アミノ酸の１又は複数を他のアミノ酸で置換したもの、
そのアミノ酸配列におけるＮ末端及び／又はＣ末端に１
個又は複数のアミノ酸を付加したもの、そのアミノ酸配
列における中間部に１個又は複数のアミノ酸を挿入した
もの、そのアミノ酸配列におけるＮ末端及び／又はＣ末
端のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したもの、及び、
そのアミノ酸配列における中間部のアミノ酸が１個又は
２個以上欠失したものを意味する。以上の如き本発明の
コージビオースホスホリラーゼは、当該酵素を産生する
微生物の培養物など天然の給源から分離したものであっ
ても、当該微生物を変異誘起剤等で処理して得られる変
異株の培養物から分離したものであっても、さらには、
組換えＤＮＡ技術やペプチド合成法を適用して人工的に
合成したものであっても構わない。なお、後に詳述する
ように当該コージビオースホスホリラーゼは、本発明の
製造方法によれば、天然の給源からでも、組換えＤＮＡ
技術を適用した場合にもいずれも良好なものを得ること
ができる。

【０００８】本発明のＤＮＡは、上述の、本発明のコー
ジビオースホスホリラーゼをコードするＤＮＡすべてを
包含するものである。斯かるＤＮＡとしては、例えば、
配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列をコード
する、配列表における配列番号５に示す塩基配列を含む
ＤＮＡや、その機能性誘導体を挙げることができる。こ
こでいう機能性誘導体とは、当該ＤＮＡがコードする蛋
白質が、上述したようなコージビオースホスホリラーゼ
としての作用を実質的に消失しない範囲で、その塩基配
列における塩基の１又は複数を他の塩基で置換したも
の、その塩基配列における５′末端及び／又は３′末端
に１又は複数の塩基を付加したもの、その塩基配列にお
ける中間部に１又は複数の塩基を挿入したもの、その塩
基配列における５′末端及び／又は３′末端の塩基が１
又は複数欠失したもの、その塩基配列における中間部の
塩基が１又は複数欠失したもの、及び、これら塩基配列
に相補的な塩基配列のものを意味する。斯かる機能性誘
導体としては、例えば、配列表の配列番号５に示す塩基
配列において、それがコードするアミノ酸配列を変更す
ることなく、塩基の１又は複数を他の塩基で置換した塩
基配列を含んでなるＤＮＡが挙げられる。また、本発明
のＤＮＡには、以上の如きＤＮＡのみならず、斯かるＤ
ＮＡの５′末端及び／又は３′末端に、当該コージビオ
ースホスホリラーゼをコードする塩基配列以外のＤＮ
Ａ、例えば、開始コドン、終始コドン、シャイン・ダル
ガノ配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、適
宜の制限酵素による認識配列、プロモーター、エンハン
サー、ターミネーター等から選ばれる１又は複数を連結
してなるＤＮＡも包含される。

【０００９】本発明においては、斯かるＤＮＡの給源や
調製方法は問わない。例えば、斯かるＤＮＡの天然の給
源として、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣ
Ｃ３５０４７）を含む、サーモアナエロビウム属の微生
物を挙げることができ、常法により、当該微生物を培養
して得られる菌体破砕物よりＤＮＡ画分を回収すれば、
本発明のＤＮＡを含むＤＮＡを得ることができる。斯く
して得られるＤＮＡはそれ自体でこの発明に用いること
もできるが、さらに、本発明のＤＮＡを、当該ＤＮＡ含
む断片を自律複製可能なベクターに挿入してなる組換え
ＤＮＡとして得る場合には、この発明を実施する上で極
めて有利なものとなる。当該組換えＤＮＡは、例えば、
通常一般の組換えＤＮＡ技術を上記のようにして得たＤ
ＮＡに適用して遺伝子ライブラリーを作製し、本発明の
コージビオースホスホリラーゼをコードするＤＮＡの塩
基配列、例えば、配列表における配列番号５に示す塩基
配列に基づいて、目的とする組換えＤＮＡを当該遺伝子
ライブラリーより選択する、ハイブリダイゼーション法
などを適用して得ることができる。斯くして得られる組
換えＤＮＡは、大腸菌等の適宜の宿主に導入して得られ
る形質転換体を培養したとき増幅され、培養物に通常一
般のアルカリ−ＳＤＳ法などを適用すれば、この発明の
ＤＮＡの所望量を極めて容易に得られることとなる。一
方、当該微生物の菌体破砕物又はそこから回収されるＤ
ＮＡを鋳型として用い、配列表における配列番号５に示
す塩基配列に基づき化学合成したＤＮＡをプライマーと
して用い、常法にしたがってＰＣＲ法を適用したり、配
列表における配列番号５に示す塩基配列を含むＤＮＡを
化学合成することによっても本発明のＤＮＡは容易に得
ることができる。また、先述の機能性誘導体たる本発明
のＤＮＡを得るには、例えば、当該組換えＤＮＡに部位
特異的変異導入法を適用したり、当該組換えＤＮＡを鋳
型に用い、所望の配列に変換せしめた塩基配列を含む化
学合成したＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ法を適用す
ることによって得ることができる。

【００１０】また、本発明のＤＮＡは、自律複製可能な
ベクターに挿入された組換えＤＮＡとしての形態のもの
をも包含する。斯かる組換えＤＮＡは、上述のように、
本発明のＤＮＡを得る上で極めて有用のみならず、後に
詳述するように、本発明のコージビオースホスホリラー
ゼを製造する上においても極めて有用である。斯かる組
換えＤＮＡは、先述のようにして目的とするＤＮＡが一
旦得られれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術を適用すれ
ば、所望のベクターに当該ＤＮＡを挿入して得ることは
比較的容易である。この発明のＤＮＡを挿入し得るベク
ターは、適宜の宿主内で自律複製する性質を有している
ものであればいずれでもよく、例えば、大腸菌を宿主と
して用いるｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ
ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３及びλｇｔ・λＣ等、枯
草菌を宿主として用いるｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ
１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５等、２種以上の宿主
を用いるｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、
ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等はいずれも有利に用いることが
できる。斯かるベクターに本発明のＤＮＡを挿入する方
法の一例を述べると、先ず、上述のようにして得られる
本発明のＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むＤＮＡと、適宜の
ベクターとを制限酵素により切断し、次に、生成したＤ
ＮＡ断片とベクター断片を連結する。ここで用いられる
制限酵素としては、例えば、Ａｃｃ Ｉ、Ｂａｍ Ｈ
Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｓｔ ＸＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、
ＳａｌＩ、Ｓｍａ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｘｈ
ｏ Ｉなどはいずれも有利に用いることができる。ま
た、ＤＮＡ断片とベクター断片の連結の際に、必要に応
じて、例えば、適宜の制限酵素認識配列等を有する化学
合成したＤＮＡを介在させることも随意である。ＤＮＡ
の連結には、両者をアニーリングした後細胞内又は細胞
外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。

【００１１】さらに、本発明のＤＮＡは、適宜の宿主微
生物に導入された形質転換体としての形態のものをも包
含する。斯かる形質転換体は、本発明のコージビオース
ホスホリラーゼや本発明のＤＮＡを得る上で極めて有用
である。斯かる形質転換体の宿主微生物として、例え
ば、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などはいずれも有利
に用いることができる。斯かる形質転換体は、通常、先
述のようにして得られる組換えＤＮＡを適宜の宿主に導
入して得られ、具体的には、宿主が大腸菌の場合には宿
主を当該組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培
養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピ
テントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。以
上に説明した本発明のＤＮＡを得るための個々の方法
は、いずれも斯界においては慣用であり、例えば、ジェ
ー・サムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア
・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行な
どに詳述されている。

【００１２】本発明のコージビオースホスホリラーゼの
製造方法は、当該酵素産生能有する微生物を培養し、培
養物から当該酵素を採取することを特徴とするものであ
り、この製造に用いる微生物の種類や培養方法は問わな
い。斯かる微生物としては、例えば、サーモアナエロビ
ウム属に属する微生物、より望ましくは、サーモアナエ
ロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）や、本
発明のＤＮＡを適宜の宿主微生物に導入してなる形質転
換体を挙げることができる。

【００１３】本発明の製造方法において、微生物の培養
に用いる培地は、当該微生物が生育でき、本発明の酵素
を産生するものであればよく、合成培地および天然培地
のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が資化でき
る物であればよく、例えば、マルトース、トレハロー
ス、デキストリン、澱粉などの糖質、糖蜜、および酵母
エキスなどの糖含有物などの天然物なども使用すること
ができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源
の種類により適宜選択される。例えば、培養液の糖質の
濃度は、２０ｗ／ｖ％以下が望ましく、菌の生育および
増殖からは、通常、５ｗ／ｖ％以下が好ましい。窒素源
としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機
窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ
・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス
などの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分と
しては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリ
ウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛
塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが必要
に応じて適宜用いられる。

【００１４】培養には、製造に用いる微生物が良好に生
育する条件を適宜に選択して適用すればよい。例えば、
先述のサーモアナエロビウム属に属する微生物を用いる
場合、通常、温度５０乃至８０℃、好ましくは６０乃至
７０℃、ｐＨ５乃至８、好ましくはｐＨ６．５乃至７．
５から選ばれる条件で、嫌気的に行われる。培養時間は
本微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１
０乃至５０時間である。一方、先述の形質転換体微生物
を用いる場合は、その微生物種にもよるが、通常、温度
２０乃至６５℃、ｐＨ２乃至９に保ちつつ、通気攪拌な
どによる好気的条件下で、培養時間を約１乃至６日間と
すればよい。

【００１５】このようにして、微生物を培養した後、得
られる培養物から本発明の酵素を回収する。本酵素活性
は、通常、培養物の菌体内に認められ、菌体または菌体
処理物を粗酵素として回収すればよく、また、培養物全
体を粗酵素として用いることもできる。菌体外培養液と
菌体との分離には通常の固液分離手段が採用される。例
えば、培養物そのものをそのまま遠心分離する手段、培
養物に濾過助剤を加えたり、あるいは、プレコートする
ことにより濾過分離する手段、平膜、中空糸膜などを用
いる膜濾過分離する手段などが採用される。菌体または
菌体処理物をそのまま粗酵素液として用いることもでき
る。さらに必要ならば部分精製した酵素として用いるこ
とも可能である。なお、例えば、枯草菌等を宿主に用い
た形質転換体の場合には、形質転換に用いた組換えＤＮ
Ａの種類によっては、当該酵素が培養に用いた培地中に
産生される場合がある。このような場合には、当該培養
上清を粗酵素として用いることもできる。

【００１６】菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結
乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波破砕
物、機械的摩砕処理物、機械的圧力処理物、菌体のタン
パク質画分、菌体または菌体処理物の固定化物などがあ
げられる。酵素としては粗酵素または精製酵素のいずれ
も用いられ、菌体処理物を、通常、酵素の精製に用いら
れる方法、例えば、硫安塩析法、アセトンおよびアルコ
ール沈殿法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濃縮・透析
法などが採用される。

【００１７】更に、菌体および菌体処理物は、通常の手
段で固定化することもできる。例えば、イオン交換体と
の結合法、樹脂および膜などとの共有結合・吸着法、高
分子物質を用いた包括法などが採用される。

【００１８】粗酵素はそのまま用いてもよいが、通常の
手段によって精製することもできる。一例として、菌体
処理物を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、Ｄ
ＥＡＥ−トヨパール樹脂（東ソー株式会社製）を用いた
陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、ＣＭ
−トヨパール樹脂（東ソー株式会社製）を用いた陽イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、ブチルトヨパール樹
脂（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグ
ラフィー、ウルトロゲル ＡｃＡ４４樹脂（フランス
国、セプラコル社製）を用いたゲル濾過カラムクロマト
グラフィーにて電気泳動的に単一な酵素を得ることがで
きる。

【００１９】本発明のコージビオースホスホリラーゼの
活性は次のようにして測定する。基質として１．０ｗ／
ｖ％コージビオースを含む２０ｍＭマッキルベイン緩衝
液（ｐＨ５．５）２ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え、６
０℃で３０分間反応させた後、反応液０．５ｍｌを１０
０℃、１０分間加熱し反応を停止させる。この反応停止
液にＤ−グルコースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ試
薬０．５ｍｌを添加、攪拌し、４０℃に３０分放置した
後、５Ｎ塩酸２．５ｍｌを添加、撹拌し、５２５ｎｍに
おける吸光度を測定する。酵素活性１単位は、前記反応
条件下で、１分間当たり１μｍｏｌのＤ−グルコースを
生成する酵素量とする。また、マルトースホスホリラー
ゼ及びトレハロースホスホリラーゼの活性は、基質とし
てのコージビオースを、それぞれ、マルトース及びトレ
ハロースに代えて用いること以外は全て同一の手順によ
り測定することができる。

【００２０】本発明のコージビオースホスホリラーゼを
利用してグルコシル転移糖含有糖質を製造する酵素反応
は、基質として、通常、β−Ｄ−グルコース−１リン酸
を糖供与体とし、他の適切な糖質、例えばＤ−グルコー
ス、Ｌ−ソルボースなどの単糖類、マルトース、コージ
ビオース、トレハロース、スクロースなどの二糖類、さ
らには、マルトトリオース、マルトテトラオース、マル
トペンタオースなどの三糖以上よりなるオリゴ糖類を受
容体として、後述するような条件下で当該酵素を作用さ
せる。その結果、用いた受容体に応じて、例えば、コー
ジビオース、グルコシルソルボース、コージビオシルグ
ルコース、コージトリオース、コージビオシルグルコシ
ド、コージビオシルフラクトシド、コージビオシルマル
トース、コージビオシルマルトトリオース及びコージビ
オシルマルトテトラオースを始めとする種々のグルコシ
ル転移糖を生成せしめることができる。なお、これら転
移糖のうち、グルコシルソルボース及びコージビオシル
フラクトシドは、本発明で初めて見出された新規の糖質
である。

【００２１】糖供与体としてのβ−Ｄ−グルコース−１
リン酸は、市販の試薬をそのまま用いてもよいし、ま
た、無機質のリン酸及び／又はその塩の存在下で適宜の
ホスホリラーゼをその基質たる糖質に作用させ、生成さ
せて調製してもよい。具体的には、例えば、無機質のリ
ン酸及び／又はその塩の存在下で、コージビオースにコ
ージビオースホスホリラーゼを作用させるか、マルトー
スにマルトースホスホリラーゼを作用させるか、あるい
はトレハロースにトレハロースホスホリラーゼを作用さ
せて調製してもよい。さらにまた、これらホスホリラー
ゼの作用によるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸の生成反
応のいずれかを、当該コージビオースホスホリラーゼを
利用したグルコシル転移糖生成反応と同一の反応系内で
行う場合には、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を当該転
移糖生成反応系に直接供給できることとなり、製造コス
トを低減したり、製造工程を簡略化することができるの
で極めて有利である。受容体としては、上記の如き糖質
の２種以上を同時に用いることも有利に実施できる。な
お、ここでいう無機質のリン酸とは、オルトリン酸のみ
ならず縮合リン酸をも包含するが、通常、オルトリン酸
を用いるのが望ましい。また、ここでいうその塩とは、
前記の無機質のリン酸に由来するリン酸イオンの化合物
全般を包含するが、通常は、これらのうち、水溶性の高
いナトリウム塩やカリウム塩等を用いるのが望ましい。

【００２２】本発明のコージビオースホスホリラーゼを
用いたグルコシル転移糖生成反応における基質濃度は特
に限定されない。一般的には、糖供与体としてβ−Ｄ−
グルコース−１リン酸を１乃至２０ｗ／ｗ％（以下、本
明細書では、特にことわらない限りｗ／ｗ％を％と略称
する。）程度の水溶液として、受容体を１乃至２０％程
度の水溶液として用いるのが好適である。一方、前述の
ごとく、適宜のホスホリラーゼの作用によるβ−Ｄ−グ
ルコース−１リン酸生成反応を当該グルコシル転移糖生
成反応と同一反応系内で行う場合には、以下のようにす
るのが望ましい。すなわち、コージビオースホスホリラ
ーゼの作用による場合は、当該グルコシル転移反応の基
質たるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸に代えて、１乃至
２０％程度のコージビオース水溶液を用い、更に、０．
５乃至２０ｍＭ程度のリン酸二水素ナトリウムなどのリ
ン酸塩を共存させる。また、その他のホスホリラーゼの
作用による場合は、当該グルコシル転移反応の基質たる
β−Ｄ−グルコース−１リン酸に代えて、例えば、１乃
至２０％程度のマルトース又はトレハロースと、０．５
乃至２０ｍＭ程度のリン酸二水素ナトリウムなどのリン
酸塩を共存させ、更に、用いる糖質に基づき、それぞ
れ、マルトースホスホリラーゼ又はトレハロースホスホ
リラーゼを当該糖質１ｇ当たり０．１乃至５０単位程度
共存させておくのが望ましい。

【００２３】反応温度は基質存在下で酵素が失活しない
温度、すなわち約７０℃までで行えばよく、好ましくは
約１５乃至６５℃の範囲を用いる。反応ｐＨは、通常、
約４．０乃至９．０の範囲、好ましくはｐＨ約５．０乃
至７．５の範囲に調整すればよい。反応時間は、酵素反
応の進行具合により適宜選択すればよく、通常基質固形
物１ｇ当たり約０．１乃至５０単位の使用量で０．１乃
至１００時間程度である。また、前述のように、その他
のホスホリラーゼの作用によるβ−Ｄ−グルコース−１
リン酸の生成反応を、当該コージビオースホスホリラー
ゼを利用したグルコシル転移糖生成反応と同一の反応系
内で行う場合には、共存させるホスホリラーゼの安定性
に応じて、用いるいずれのホスホリラーゼも失活しない
反応温度や反応ｐＨに調整するのが望ましい。

【００２４】斯くして反応物中には、基質として用いた
糖質に応じてグルコシル転移糖が生成する。その生成率
は、酵素反応の基質濃度、用いる基質の種類、反応条件
などによって異なる。例えば、濃度５％のβ−Ｄ−グル
コース−１リン酸及び濃度２５％のソルボースを基質と
して用いた場合、グルコシルソルボースの生成率は約３
０％である。なお、生成率は本明細書を通じて、反応液
中の全糖質重量に対する、生成した当該転移糖重量の百
分率を意味する。

【００２５】また、反応物中の当該グルコシル転移糖含
量をできるだけ高めるために、反応液中に生成するＤ−
グルコースを分解除去する活性を有する酵素源を共存さ
せ、該転移反応を促進することも有利に実施できる。こ
の方法は、前述の、適宜のホスホリラーゼによるβ−Ｄ
−グルコース−１リン酸生成反応を当該グルコシル転移
反応と同一系内で行い糖供与体を直接供給する場合、反
応過程で副生するＤ−グルコースを分解除去し、該転移
反応を促進するのに特に有利に適用できる。

【００２６】Ｄ−グルコース分解活性を有する酵素源と
しては、Ｄ−グルコース分解活性を有する微生物、微生
物の培養物、菌体もしくは菌体処理物またはＤ−グルコ
ース分解活性を有する酵素などがあげられる。Ｄ−グル
コース分解活性を有する微生物としては、Ｄ−グルコー
ス分解活性が高く、転移糖分解活性を有さないか又はほ
とんど有さない微生物であればいずれの微生物でも用い
ることができる。好ましくは酵母が用いられる。Ｄ−グ
ルコース分解活性を有する酵素としては、例えばグルコ
ースオキシダーゼ、カタラーゼ、ピラノースオキシダー
ゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコキナーゼまた
はヘキソキナーゼなどいずれも用いることができる。好
ましくはグルコースオキシダーゼ又はカタラーゼが用い
られる。

【００２７】以上のようにしてグルコシル転移糖を生成
せしめた反応液は、常法により、瀘過、遠心分離などし
て不溶物を除去した後、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ
型イオン交換樹脂による脱塩などの精製工程を経た後、
濃縮し、シラップ状製品にする。必要ならば、更に、噴
霧乾燥などの方法で乾燥して粉末状製品にすることも随
意である。

【００２８】また、本発明のグルコシル転移糖含有糖質
は、酵素反応液から当該グルコシル転移糖を分離、精製
して、当該グルコシル転移糖の高含有物とすることもで
きる。その方法としては、例えば、酵母を用いた発酵法
により単糖類を除去する方法（酵母発酵法）、膜濾過
法、カラムクロマトグラフィーなどにより、夾雑糖質を
分離除去する方法が適宜採用できる。とりわけ、特開昭
５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公
報などに開示されている塩型強酸性カチオン交換樹脂を
用いるカラムクロマトグラフィーにより、夾雑糖質を除
去して目的とするグルコシル転移糖高含有画分を採取す
る方法は、工業的規模で有利に実施できる。この際、公
知の固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれ
を採用することも随意である。

【００２９】斯くして夾雑糖質を分離した液は、常法に
より、濾過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活
性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱
塩などの精製工程を経た後、濃縮し、シラップ状製品に
する。必要ならば、更に、噴霧乾燥などの方法で乾燥し
て粉末状製品にすることも随意である。

【００３０】このようにして得られる本発明のグルコシ
ル転移糖含有糖質は、通常グルコシル転移糖を固形物当
たり５％以上、望ましくは１０％以上含有している。

【００３１】このようにして得られる本発明のコージビ
オースホスホリラーゼにより生成されるグルコシル転移
糖含有糖質は、味質良好な甘味を有し、また、浸透圧調
節性、保湿性、照付与性、結晶防止性、澱粉老化防止性
などの性質を有し、また、抗う蝕性、ビフィズス菌増殖
促進性、ミネラル吸収促進性などの機能を有し、広く飲
食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品、成形物な
ど、さらには、生活用品、農林水産用品、試薬、化学工
業用品などの各種組成物に有利に利用される。

【００３２】グルコシル転移糖含有糖質は、そのまま甘
味付けのための調味料として使用することができるが、
必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトース、ト
レハロース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メイプルシュガ
ー、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒ
ドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオ
シド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカ
リン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の一
種または二種以上の適量と混合して使用してもよく、ま
た必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような
増量剤と混合して使用することもできる。

【００３３】また、グルコシル転移糖含有糖質の呈味
は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味
を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大き
いので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、また品
質改良などに有利に利用できる。

【００３４】例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味
噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシ
ング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、
麺つゆ、ソース、ケチャップ、たくあん漬の素、白菜漬
の素、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープ
の素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テー
ブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料に有
利に使用できる。

【００３５】また、例えば、せんべい、あられ、おこ
し、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊
羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、
パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリ
ン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリ
ーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレ
ート、チューインガム、キャラメル、キャンデーなどの
洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果
実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペー
スト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレ
ッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロッ
プ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べ
ったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、ハム、
ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセー
ジ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、
イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しな
どの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで
製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻
などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビ
ン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの
酒類、紅茶、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、
乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミック
ス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープな
どの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、
米飯、麺類、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、
呈味改良に、また、物性改良などに有利に利用できる。

【００３６】また、家畜、家禽、魚などの飼育動物のた
めに飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用す
ることもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リッ
プクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、
口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種固形物、ペー
スト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種
組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤と
して、更には、品質改良剤として有利に利用できる。

【００３７】品質改良剤、安定剤としては、有効成分の
活性などを失い易い各種生理活性物質またはこれを含む
健康食品、医薬品などに有利に適応できる。例えば、イ
ンターフェロン−α、インターフェロン−β、インター
フェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、
ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ
遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファ
クター、インターロイキン１、インターロイキン２、イ
ンターロイキン６、インターロイキン１２、インターロ
イキン１５、インターロイキン１８などのサイトカイン
含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、
エリトロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、卵細胞刺激ホルモン、胎盤ホルモンなどのホルモン
含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワ
クチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、
ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有
液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコ
ール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カ
ナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラ
ビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エル
ゴステロール、トコフェロール、などのビタミン含有
液、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテア
ーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナー
ゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、ス
ッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポ
リスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母な
どの生菌、ロイヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、
その有効成分の活性を失うことなく、安定で高品質の健
康食品や医薬品などを容易に製造できる。

【００３８】以上述べたように、本発明でいう組成物
は、経口的または非経口的に利用する飲食物、化粧品、
医薬品のみならず、それ以外にも、例えば、生活用品、
農林水産用品、試薬、化学工業用品など広範な用途を有
する。

【００３９】また、これら組成物に、本発明のグルコシ
ル転移糖含有糖質を含有せしめる方法は、その製品が完
成するまでの工程で含有せしめればよく、例えば、混
和、溶解、浸漬、浸透、散布、塗布、噴霧、注入、固化
などの公知の方法が適宜選ばれる。その含有せしめる量
は、組成物によっても異なるが、一般的には、グルコシ
ル転移糖として、０．１％以上、望ましくは０．５％以
上の量が好適である。

【００４０】次に実験により本発明をさらに具体的に説
明する。

【００４１】

【実験１】 〈コージビオースホスホリラーゼの生産〉炭素源として
０．５ｗ／ｖ％グルコースに代えて０．５ｗ／ｖ％トレ
ハロースを用いたこと以外は全て『ＡＴＣＣカタログ・
オブ・バクテリア・アンド・バクテリオファージズ、第
１８版』（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン発行、１９９２年）、４５２乃至４５６頁に記載の
サーモアナエロビウム・ブロッキイ培地の調製法に従っ
て、培地を１００ｍｌ容耐圧ボトルに１００ｍｌずつ調
製した後、サーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣ
Ｃ３５０４７を接種し、６０℃、４８時間静置培養した
ものを種培養とした。

【００４２】容量１１ｌのステンレスボトル４本に種培
養の場合と同組成の培地を約１０ｌずつ入れて、加熱滅
菌、冷却して温度６０℃とした後、種培養液をこの培地
体積当たり１ｖ／ｖ％接種し、温度６０℃で、約４０時
間静置培養した。

【００４３】培養液約４０ｌを遠心分離して、培養菌体
９２ｇを得た。菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、
超音波破砕した後遠心分離して菌体破砕上清を得た。培
養液ｍｌ当たりに換算するとコージビオースホスホリラ
ーゼの活性は、０．１単位／ｍｌであった。

【００４４】

【実験２】 〈コージビオースホスホリラーゼの精製〉実験１で得た
菌体破砕上清をＵＦ膜濃縮し、コージビオースホスホリ
ラーゼを１ｍｌ当たり約１０単位有する濃縮酵素液約３
６０ｍｌを回収した。

【００４５】得られた濃縮酵素液のうち３００ｍｌを１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して２４時間透
析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透析液上清
（３８０ｍｌ）を、ＤＥＡＥ−トヨパールゲル ６５０
ゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムク
ロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）にかけた。

【００４６】本発明のコージビオースホスホリラーゼを
ＤＥＡＥ−トヨパールゲル ６５０ゲルに吸着せしめ、
０Ｍ食塩水から０．５Ｍ食塩水までのリニアグラジエン
トにより、カラムより溶出させた。約０．２Ｍの食塩で
溶出される酵素活性画分を回収した後、以下の方法で更
に精製を行った。１．５Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して
透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、次
に、ブチルトヨパール６５０ゲル（東ソー株式会社製）
を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量１００
ｍｌ）を行った。吸着したコージビオースホスホリラー
ゼを、１．５Ｍ硫安から０Ｍ硫安までのリニアグラジエ
ントによりカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収し
た。

【００４７】続いて、ウルトロゲル ＡｃＡ４４（フラ
ンス国、セプラコル社製）を用いたゲル濾過クロマトグ
ラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行い、溶出した酵素活
性画分を回収した。

【００４８】以上の精製手段により得られた精製酵素標
品の回収率は、活性換算で、菌体破砕上清に対して約２
０％であった。また、精製酵素標品の比活性は蛋白質ｍ
ｇ当たり７１．４単位であった。なお、蛋白質はローリ
ー法に従って牛血清アルブミンを標準にして定量した。

【００４９】精製した酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポ
リアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の
純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い
標品であった。

【００５０】

【実験３】 〈コージビオースホスホリラーゼの性質〉実験２で得た
コージビオースホスホリラーゼ標品をＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度１０ｗ／ｖ％）に
供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラ
ッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の
分子量を測定したところ、分子量８３，０００±５，０
００ダルトンであった。また、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ４００
０ＳＷカラム（φ７．５ｍｍ×６００ｍｍ，東ソー株式
会社製）を用いたゲル濾過法により、分子量を測定した
結果、５００，０００±３０，０００ダルトンであっ
た。

【００５１】精製コージビオースホスホリラーゼを２ｗ
／ｖ％アンフォライン（スウェーデン国、ファルマシア
・エルケイビー社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルの
ｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点
（ｐＩ）は４．４±０．５であった。

【００５２】本発明のコージビオースホスホリラーゼ活
性に及ぼす温度、ｐＨの影響を、活性測定方法に準じて
調べた。すなわち、温度の影響を調べる際には、活性測
定法における反応温度６０℃に代えて約４０℃乃至約８
０℃のいずれかの温度で反応を行い、ｐＨの影響を調べ
る際には、活性測定法において用いられる緩衝液に代え
て、ｐＨ約４乃至約８のいずれかのｐＨに緩衝能有する
緩衝液を用いて反応を行い、この後、活性測定法と同様
に反応停止し、グルコース生成量を測定した。測定結果
を、最大値に対する相対値として表した結果を図１（温
度の影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適
温度はｐＨ５．５、３０分間反応で６５℃付近、至適ｐ
Ｈは６０℃、３０分間反応で５．５付近であった。本酵
素の温度安定性は、当該酵素を溶解せしめた１０ｍＭマ
ッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）を約４０℃乃至８０
℃のいずれかの温度に１時間保持し、水冷した後、残存
する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。また、
ｐＨ安定性は、ｐＨ約３．５乃至約１０のいずれかのｐ
Ｈに緩衝能を有する緩衝液に当該酵素を溶解せしめ、４
℃で２４時間保持した後、ｐＨ５．５に調整し、残存す
る酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。測定結果
を最大値に対する相対値として表した結果を図３（温度
安定性）、図４（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度
安定性は６５℃付近までであり、ｐＨ安定性は約５．５
乃至１０．０であった。また、本酵素活性は、１ｍＭの
Ｈｇ++で阻害された。

【００５３】

【実験４】 〈コージビオースホスホリラーゼの部分アミノ酸配列〉 （１）Ｎ末端アミノ酸配列 実験２の方法で得られた精製酵素標品の一部を蒸留水に
対して透析した後、蛋白量として約４０μｇをＮ末端配
列分析用の試料とした。Ｎ末端配列はプロテインシーケ
ンサー・モデル４７３Ａ（アプライドバイオシステムズ
社製、米国）を用い、Ｎ末端から５残基まで分析した。
Ｎ末端から得られた配列は、配列表における配列番号１
に示すアミノ酸配列であった。さらに同じ試料を用いて
同じ方法により、より詳細に解析したところ、当該酵素
はＮ末端に、配列表における配列番号６に示すアミノ酸
配列を含んでいることが判明した。

【００５４】（２）中間部部分アミノ酸配列 実験２の方法で得られた精製酵素標品の一部を１０ｍＭ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して透析した
後、同緩衝液にて１ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう希釈し
た。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドペ
プチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、
２２時間反応させることによりペプチド化した。生成し
たペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行った。マ
イクロボンダスフェアーＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ
×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製、米国）を用い、
流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１ｖ／ｖ％トリフルオ
ロ酢酸−０％アセトニトリル溶液から０．１ｖ／ｖ％ト
リフルオロ酢酸−４８ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液まで
の１２０分間のリニアーグラジエントの条件で行った。
カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光
度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく
分離した２ペプチド、ＫＰ１５（保持時間６６分）、Ｋ
Ｐ２３（保持時間９６分）を分取し、それぞれを真空乾
燥した後、２００μｌの０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢
酸−５０ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液に溶解した。これ
らペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それ
ぞれＮ末端から５残基までアミノ酸配列を分析した。ペ
プチドＫＰ１５からは、配列表における配列番号２に示
すアミノ酸配列が、またペプチドＫＰ２３からは、配列
表における配列番号３に示すアミノ酸配列が得られた。
さらに同じ試料を用いて同じ方法により、より詳細に分
析したところ、ペプチドＫＰ１５及びペプチドＫＰ２３
はそのＮ末端部に、それぞれ、配列表における配列番号
７及び配列番号８に示すアミノ酸配列を含んでいること
が判明した。

【００５５】

【実験５】 〈コージビースホスホリラーゼの糖分解反応における基
質特異性〉Ｄ−グルコース、マルトース、スクロース、
ラクトース、トレハロース、ネオトレハロース、セロビ
オース、メリビオース、コージビオース、イソマルトー
ス、ソホロース、ゲンチオビオース、ニゲロース及びラ
ミナリビオースから選ばれる糖質の水溶液に、実験２の
方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼを糖質固
形物１ｇ当たりそれぞれ１０単位ずつ加え、５ｍＭリン
酸二水素ナトリウム存在下、６０℃、ｐＨ５．５で２４
時間作用させた。各反応液中の糖質濃度はいずれも２ｗ
／ｖ％とした。酵素反応前後の反応液をキーゼルゲル６
０（メルク社製；アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を
用いた薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略
称する。）に供した。ＴＬＣは展開溶媒に１−ブタノー
ル：ピリジン：水＝７：３：１（容積比）を用いて室温
で１回展開した後、２０ｖ／ｖ％硫酸−メタノール溶液
を噴霧し、１１０℃で約１０分間加熱して発色させた。
両反応液に由来するスポットを比較し、それぞれの糖質
に対する酵素作用の有無を判定した。結果を表１に示し
た。

【００５６】

【表１】

【００５７】表１に示されるように、本発明のコージビ
オースホスホリラーゼは、コージビオースに極めて高い
特異性で作用してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース
−１リン酸とを生成することが判明した。一方、他の糖
質には作用しないことが判明した。

【００５８】

【実験６】 〈コージビースホスホリラーゼのグルコシル転移糖生成
反応における受容体特異性〉受容体として表２に示す各
種単糖類、オリゴ糖類および糖アルコール類のいずれか
と、糖供与体としてβ−Ｄ−グルコース−１リン酸と
を、固形物重量で等量溶解含有している水溶液に、実験
２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ
−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位ずつ加
え、６０℃、ｐＨ５．５で２４時間反応させた。なお、
受容体及び糖供与体の反応液中の濃度はいずれも１ｗ／
ｖ％とした。酵素反応前後の反応液を、実験５と同様に
ＴＬＣに供した後発色させた。両反応液に由来するスポ
ットを比較し、反応後に新たに生成したスポットより、
転移糖を生成しているかどうかを判定した。また転移糖
と判定されたスポットの発色強度を肉眼観察することに
より、転移糖の生成率を相対的に評価した。結果を表２
に示した。

【００５９】

【表２】

【００６０】表２に示されるように、本発明のコージビ
オースホスホリラーゼは、β−Ｄ−グルコース−１リン
酸を糖供与体として、Ｄ−グルコース、Ｌ−ソルボース
などの単糖類、マルトース、コージビオース、トレハロ
ース、スクロースなどの二糖類、及びマルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどの三
糖以上のオリゴ糖類にグルコシル基を良く転移し、グル
コシル転移糖を生成することが判った。なお、β−Ｄ−
グルコース−１リン酸にかえてα−Ｄ−グルコース−１
リン酸を糖供与体として用いた場合、グルコシル転移糖
は得られなかった。

【００６１】この実験６により、本発明のコージビオー
スホスホリラーゼによる糖転移反応で生成することが明
らかとなったグルコシル転移糖のうちのいくつかの詳細
な構造について、次の実験７乃至１２を示しながら説明
する。

【００６２】

【実験７】 〈β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとか
らのグルコシル転移糖〉実験６で得たβ−Ｄ−グルコー
ス−１リン酸とＤ−グルコースとを基質とした酵素反応
液の糖成分をガスクロマトグラフィー（以下、「ＧＬ
Ｃ」と略称する。）で分析した。酵素反応液の一部を乾
固し、ピリジンに溶解した後、トリメチルシリル化した
ものをＧＬＣの分析試料とした。ＧＬＣカラムは、２％
シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ（ジー・エル・サ
イエンス株式会社製）を充填したステンレスカラム（３
ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは、窒素ガスを流量４
０ｍｌ／分で、カラムオーブン温度は、１６０℃から３
２０℃まで７．５℃／分の昇温速度で分析した。検出
は、水素炎イオン検出器を用いた。

【００６３】その結果、本発明のコージビオースホスホ
リラーゼによるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グ
ルコースとからのグルコシル転移糖のピークの保持時間
は、既知糖質コージビオースのそれと一致した。本発明
のコージビオースホスホリラーゼによるβ−Ｄ−グルコ
ース−１リン酸とＤ−グルコースとからのグルコシル転
移糖は、コージビオースであると判断される。

【００６４】

【実験８】 〈グルコシルソルボース〉本発明のコージビオースホス
ホリラーゼによるＬ−ソルボースへの糖転移反応で生成
するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル
転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、β−
Ｄ−グルコース−１リン酸を２．５％、Ｌ−ソルボース
を２．５％含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実
験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼを
β−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位加
え、６０℃で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０
分間加熱して酵素を失活させた。実験７で示した方法に
準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その
結果、反応終了液にはβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及
びＬ−ソルボースのいずれとも保持時間の異なる成分が
多量生成していることが確認され、本成分が当該グルコ
シル転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果よ
り求めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率
は約２４％であった。本反応液の残り全量を活性炭で脱
色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩
して精製し、濃度約５０％まで濃縮して、以下に説明す
るカラムクロマトグラフィーを行い、当該グルコシル転
移糖高含有画分を採取した。

【００６５】分画用樹脂は、アルカリ金属型強酸性カチ
オン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製、商品名
『ＸＴ−１０１６』、Ｎａ型、架橋度４％）を使用し、
内径３ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス製カ
ラム４本に水懸濁状で充填し、直列につなぎ、樹脂層全
長を約４ｍになるようにした。カラム内温度を４０℃に
維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これ
に４０℃の温水をＳＶ０．１５の流速で流して分画し、
当該グルコシル転移糖高含有画分を採取した。

【００６６】当該転移糖高含有画分を脱塩、精製し、濃
度約４０％に濃縮してオクタデシルシリカゲルを充填し
たカラム（株式会社ワイエムシー、商品名『ＹＭＣ−Ｐ
ａｋＯＤＳ』）を用いたクロマトグラフィーを行い、当
該グルコシル転移糖画分を採取した。採取された画分を
濃度約４０％に濃縮し、再度オクタデシルシリカゲルを
用いたカラムクロマトグラフィーに供する操作を繰り返
し、採取された当該グルコシル転移糖高含有液を脱塩、
精製、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含
有粉末を、反応に供した糖質の固形物当たり収率約２０
％で得た。実験７で示した方法に準じて本粉末標品をＧ
ＬＣで分析したところ、本標品は固形物当たり約９８％
当該グルコシル転移糖を含有していた。

【００６７】次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末を
酸分解し、ＧＬＣ分析に供した。その結果、当該グルコ
シル転移糖は酸分解によりほぼ１対１のモル比でＤ−グ
ルコースとＬ−ソルボースを生成することが分かった。
また、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチル化した
後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化して
得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧＬＣで
分析すると２，３，４，６−テトラメチル−１，５−ジ
アセチルグルシトールが認められた。以上のことは、当
該グルコシル転移糖が、Ｄ−グルコースとＬ−ソルボー
スが１対１のモル比で結合したものであり、更に、Ｄ−
グルコースの１位のＯＨ基がその結合に関与しているこ
とを示唆している。なお、ソルボースのメチル化誘導体
は認められなかったが、これは酸により分解されたため
と思われる。

【００６８】当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細
に調べるため13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。
その結果、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ2
Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ１０１．２，１０
０．４，９９．５，９９．３，７７．１，７５．６，７
４．９，７４．５，７４．０，７３．２，７２．２，６
６．３，６３．２，６２．１の各値が得られた。この分
析データから当該グルコシル転移糖はＤ−グルコースの
１位がＬ−ソルボースの５位にα型で結合した２糖類で
あるグルコシルソルボース、すなわち、α−Ｄ−ｇｌｕ
ｃｏｓｙｌ（１→５）−Ｌ−ｓｏｒｂｏｓｅであること
が分かった。本物質は、従来知られていなかった新規な
糖質である。

【００６９】

【実験９】 〈コージビオシルグルコース〉本発明のコージビオース
ホスホリラーゼによるマルトースへの転移反応で生成す
るグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転
移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、β−Ｄ
−グルコース−１リン酸を５％、マルトースを１０％含
む水溶液をｐＨ６．０に調整し、これに実験２の方法で
得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グル
コース−１リン酸１ｇ当たり２０単位加え、６０℃で４
８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵
素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反応
終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果、反応終了
液にはβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及びマルトースの
いずれとも保持時間の異なる成分が多量生成しているこ
とが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えら
れた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応にお
ける当該グルコシル転移糖の生成率は約４０％であっ
た。本反応液の残り全量を実験７と同様に分画精製し、
濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末
を、反応に供した糖質の固形物当たり収率約２０％で得
た。本粉末標品は、当該グルコシル転移糖を固形物当た
り約９８％含有していた。

【００７０】次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末を
メチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元、ア
セチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテー
トをＧＬＣ分析に供した。その結果、２，３，４，６−
テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールと３，
４，６−トリメチル−１，２，５−トリアセチルグルシ
トールおよび２，３，６−トリメチル−１，４，５−ト
リアセチルグルシトールが約１対１対１の比率で認めら
れた。このことは、当該グルコシル転移糖が、１位のＯ
Ｈ基のみが結合に関与しているグルコースと、１位と２
位のＯＨ基がともに結合に関与しているか又は２位のＯ
Ｈ基のみが結合に関与しているグルコースと、１位と４
位のグルコースがともに結合に関与しているか又は４位
のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースとが、そ
れぞれ１対１対１の割合で互いに結合しているオリゴ糖
であることを示唆している。

【００７１】当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細
に調べるため13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。
その結果、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ2
Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ９９．５，９９．
４，９９．１，９８．６，９４．６，７９．２，７８．
８，７８．６，７８．０，７７．６，７７．３，７７．
０，７６．１，７５．６，７５．３，７４．７，７４．
２，７４．１，７３．８，７２．７，７２．２，７２．
１，６３．６，６３．５，６３．２，６３．１の各値が
得られた。この分析データから本グルコシル転移糖の構
造はマルトースの非還元末端グルコース残基にＤ−グル
コースがα型で１，２結合した３糖類であるコージビオ
シルグルコース、すなわち、α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ
（１→２）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→４）−Ｄ−
ｇｌｕｃｏｓｅであることが分かった。

【００７２】

【実験１０】 〈コージトリオース〉本発明のコージビオースホスホリ
ラーゼによるコージビオースへの糖転移反応で生成する
グルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転移
糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、２０％コ
ージビオースを溶解含有する５ｍＭリン酸二水素ナトリ
ウムをｐＨ５．５に調整し、これに実験２の方法で得た
精製コージビオースホスホリラーゼをコージビオース１
ｇ当たり１０単位加え、６０℃で４８時間反応させ、次
いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実
験７で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬ
Ｃで分析した。その結果反応終了液にはコージビオース
ともとも、また、Ｄ−グルコースやβ−Ｄ−グルコース
−１リン酸とも保持時間の異なる成分が多量生成してい
ることが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考
えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応
における当該グルコシル転移糖の生成率は約３０％であ
った。本反応液の残り全量を実験８と同様に分画精製
し、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有
粉末を、反応に供したコージビオースの固形物当たり収
率約１５％で得た。本粉末標品は、当該グルコシル転移
糖を固形物当たり約９８％含有していた。

【００７３】次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末を
メチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元、ア
セチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテー
トをＧＬＣ分析に供した。その結果、２，３，４，６−
テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールと３，
４，６−トリメチル−１，２，５−トリアセチルグルシ
トールが約１対２の比率で認められた。このことは、当
該グルコシル転移糖が、１位のＯＨ基のみが結合に関与
しているグルコースと、１位と２位のＯＨ基がともに結
合に関与しているか又は２位のＯＨ基のみが結合に関与
しているグルコースとが、１対２の割合で互いに結合し
ているオリゴ糖であることを示唆している。さらに、グ
ルコースの結合様式の可能性を考慮に入れるとこのこと
は、当該グルコシル転移糖が、１位のＯＨ基のみが結合
に関与しているグルコースと、１位と２位のＯＨ基がと
もに結合に関与しているグルコースと、２位のＯＨ基の
みが結合に関与しているグルコースとが、それぞれ１対
１対１の割合で互いに結合しているオリゴ糖であること
を強く示唆している。

【００７４】当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細
に調べるため13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。
その結果、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ2
Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ９９．３，９９．
０，９８．３，９７．６，９６．５，９２．２，８１．
３，７８．８，７８．６，７８．５，７７．２，７７．
１，７５．７，７５．６，７４．７，７４．６，７４．
５，７４．３，７４．２，７４．１，７４．０，７３．
９，７２．６，７２．３，７２．２，７２．１，７２．
０，６３．６，６３．４，６３．２，６３．１，６３．
１，６３．０の各値が得られた。この分析データから本
グルコシルコージビオースの構造はコージビオースの非
還元末端グルコース残基にＤ−グルコースがα型で１，
２結合した３糖類であるコージトリオース、すなわち、
α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）α−Ｄ−ｇｌｕｃ
ｏｓｙｌ（１→２）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅであることが
分かった。

【００７５】

【実験１１】 〈コージビオシルグルコシド〉本発明のコージビオース
ホスホリラーゼによるトレハロースへの転移反応で生成
するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル
転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、β−
Ｄ−グルコース−１リン酸を５％、トレハロースを１０
％含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実験２の方
法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−
グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位加え、６０℃
で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱し
て酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの
反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果、反応
終了液にはβ−Ｄ−グルコース及びトレハロースのいず
れとも保持時間の異なる成分が多量生成していることが
確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えられ
た。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応におけ
る当該グルコシル転移糖の生成率は約７５％であった。
本反応液の残り全量を実験８と同様に分画精製し、濃
縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末
を、反応に供した糖質の固形物当たり収率約６５％で得
た。本粉末標品は、当該グルコシル転移糖を固形物当た
り約９８％含有していた。

【００７６】次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末を
メチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元、ア
セチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテー
トをＧＬＣ分析に供した。その結果、２，３，４，６−
テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールと３，
４，６−トリメチル−１，２，５−トリアセチルグルシ
トールが２対１の比率で認められた。このことは、当該
グルコシル転移糖が、１位のＯＨ基のみが結合に関与し
ているグルコースと、１位と２位のＯＨ基がともに結合
に関与しているグルコースとが、２対１の割合で互いに
結合しているオリゴ糖であることを示唆している。

【００７７】当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細
に調べるため13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。
その結果、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ2
Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ９８．６，９６．
２，９３．３，７７．３，７５．８，７５．４，７５．
１，７４．８，７４．６，７４．６，７４．０，７３．
９，７２．５，７２．３，７２．２，６３．４，６３．
４，６３．３の各値が得られた。この分析データから本
グルコシルトレハロースの構造はトレハロースにＤ−グ
ルコースが１，２結合した３糖類であるコージビオシル
グルコシド（別名セラギノース）、すなわち、α−Ｄ−
ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ
（１，１）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅであることが分
かった。

【００７８】

【実験１２】 〈コージビオシルフラクトシド〉本発明のコージビオー
スホスホリラーゼによるスクロースへの転移反応で生成
するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル
転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、β−
Ｄ−グルコース−１リン酸を５％、スクロースを１０％
含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実験２の方法
で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グ
ルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位加え、６０℃で
４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して
酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反
応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果、反応終
了液にはβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及びスクロース
のいずれとも保持時間の異なる成分が多量生成している
ことが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考え
られた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応に
おける当該グルコシル転移糖の生成率は約７０％であっ
た。本反応液の残り全量を実験８と同様に分画精製し、
濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末
を、反応に供した糖質の固形物当たり収率約５０％で得
た。本粉末標品は、当該グルコシル転移糖を固形物当た
り約９８％含有していた。

【００７９】次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末を
酸分解し、ＧＬＣ分析に供した。その結果、当該グルコ
シル転移糖は酸分解によりほぼ２対１のモル比でＤ−グ
ルコースとＤ−フラクトースを生成することが分かっ
た。また、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチルし
た後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化し
て得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧＬＣ
で分析すると２，３，４，６−テトラメチル−１，５−
ジアセチルグルシトールと３，４，６−トリメチル−
１，２，５−トリアセチルグルシトールが１対１の比率
で認められた。以上のことは、当該グルコシル転移糖
が、Ｄ−グルコースとＤ−フラクトースが２対１のモル
比で結合したものであり、更に、当該グルコシル転移糖
を構成するＤ−グルコースは、１位のＯＨ基のみが結合
に関与するものと、１位と２位のＯＨ基がともに結合に
関与するものとが、１対１のモル比で存在していること
を示唆している。なお、Ｄ−フラクトースのメチル化誘
導体は認められなかったが、これは酸により分解された
ためと思われる。

【００８０】当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細
に調べるため13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。
その結果、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ2
Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ１０７．０，９９．
３，９２．５，８４．０，７９．１，７８．５，７６．
５，７５．７，７４．９，７４．７，７４．１，７４．
０，７２．２，７２．１，６４．９，６４．６，６３．
２，６３．１の各値が得られた。この分析データから本
グルコシルスクロースの構造はスクロースのグルコース
残基にＤ−グルコースがα型で１，２結合した３糖類で
あるコージビオシルフラクトシド、すなわち、α−Ｄ−
ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ
（１→２）β−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｉｄｅであることが
分かった。本物質は、従来知られていなかった新規な糖
質である。

【００８１】

【実験１３】 〈急性毒性〉７週齢のｄｄ系マウスを使用して、実験８
乃至１２で得たグルコシルソルボース高含有粉末、コー
ジビオシルグルコース高含有粉末、コージトリオース高
含有粉末、コージビオシルグルコシド高含有粉末及びコ
ージビオシルフラクトシド高含有粉末を、それぞれ別個
に経口投与して急性毒性テストをしたところ、いずれの
場合にも投与可能な最大投与量すなわち、５０ｇ／ｋｇ
マウス体重においても死亡例は認められなかった。従っ
て、本発明のこれら転移糖は、いずれも毒性の極めて低
い物質である。

【００８２】以下、本発明のコージビオースホスホリラ
ーゼ及び当該コージビオースホスホリラーゼをコードす
る本発明のＤＮＡと、それを利用したグルコシル転移糖
含有糖質の製造方法を実施例Ａで、このグルコシル転移
糖含有糖質を含有せしめた組成物を実施例Ｂで示す。

【００８３】

【実施例Ａ−１】 〈酵素液〉サーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣ
Ｃ３５０４７を、実験１に示した方法で種培養した後、
実験１に示した方法に準じて嫌気ファーメンターに調製
した同じ組成の培地に、この培地体積当たり１ｖ／ｖ％
の種培養液を接種し、培養温度６５℃で約３０時間培養
した。培養液を遠心分離して得た菌体を超音波破砕し、
破砕液上清のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定
した。この活性を培養液１ｍｌ当たりに換算すると、
０．０８単位であった。破砕液上清を限外濾過膜にて濃
縮し、その濃縮液を透析してｍｌ当たりコージビオース
ホスホリラーゼ活性約８単位を有する酵素液を、もとの
培養液の総活性に対して約７０％の収率で得た。

【００８４】

【実施例Ａ−２】 〈ＤＮＡの調製〉実験１に示した培地と同一組成の培地
１１ｌで、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣ
Ｃ ３５０４７）を、実験１に示した方法に準じて６０
℃で２４時間培養した。遠心分離により培養物から菌体
を分離し、適量のトリス−ＥＤＴＡ−食塩緩衝液（以
下、「ＴＥＳ緩衝液」と略記する。）（ｐＨ８．０）に
浮遊させ、リゾチームを当該菌体浮遊液の体積に対し
０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間イン
キュベートした。その後この処理物を−８０℃で１時間
保持して凍結させた後、ここに、予めＴＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ９．０）を加えて６０℃に加温しておいたＴＥＳ緩衝
液／フェノール混液を加えて充分に攪拌し、さらに氷冷
後遠心分離して形成された上層を採取した。この上層
に、２倍容の冷エタノールを加えて生成した沈澱を採取
し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）の適量に溶解後、７．
５μｇのリボヌクレアーゼ及び１２５μｇのプロテアー
ゼを加え、３７℃で１時間インキュベートした。ここ
に、クロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて
攪拌後、静置して形成される上層を採取し、この上層に
冷エタノールを加えて生成した沈澱を採取した。沈澱を
冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで濯ぎ真空乾燥して、Ｄ
ＮＡを得た。得られたＤＮＡは、濃度約１ｍｇ／ｍｌと
なるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８
０℃で凍結した。

【００８５】

【実施例Ａ−３】 〈形質転換体と組換えＤＮＡの調製〉実施例Ａ−２の方
法で得たＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、ここに制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩを約２０単位加え、３７℃で３０分間インキ
ュベートしてＤＮＡを部分分解した後、蔗糖密度勾配超
遠心法により、鎖長約２，０００乃至５，０００塩基対
のＤＮＡ断片を採取した。別途、ストラタジーン・クロ
ーニング・システムズ製プラスミドベクター『Ｂｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）』を常法により制限酵素
Ｈｉｎｄ ＩＩＩを作用させて完全に切断した後、その
切断されたプラスミドベクター０．３μｇと先に得たＤ
ＮＡ断片約３μｇとを宝酒造製『ＤＮＡライゲーション
・キット』を用いて、添付の説明書にしたがって操作し
て連結し、得られた組換えＤＮＡで、通常のコンピテン
トセル法によりストラタジーン・クローニング・システ
ムズ製大腸菌『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１
−Ｂｌｕｅ』１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラ
リーを作製した。

【００８６】このようにして得た遺伝子ライブラリーと
しての形質転換体を、常法により調製した、１０ｇ／ｌ
トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、５ｇ／ｌ 塩化
ナトリウム、７５ｍｇ／ｌ アンピシリンナトリウム塩
及び５０ｍｇ／ｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地（ｐＨ
７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上に
形成された白色のコロニー約４，０００個をアマシャム
製ナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』上に固定した。別
途、実験４の方法で明らかにした、配列表の配列番号７
に示すアミノ酸配列における第１より７番目までのアミ
ノ酸配列に基づき、５′−ＴＴＹＧＡＹＧＡＲＡＡＹＡ
ＡＹＡＴＧＣＣ−３′で表される塩基配列のオリゴヌク
レオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−32Ｐ］Ａ
ＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体
標識してプローブとしての合成ＤＮＡを得た。先に得た
ナイロン膜上に固定されたコロニーのうち、当該プロー
ブと顕著な会合を示すコロニーを、通常のコロニーハイ
ブリダイゼーション法を適用して選択し、当該形質転換
体を『ＴＫＰ１』と命名した。

【００８７】この形質転換体ＴＫＰ１を常法にしたが
い、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム塩を含
むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２
４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により
培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法に
より組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基
配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当
該組換えＤＮＡは、サーモアナエロビウム・ブロッキイ
（ＡＴＣＣ ３５０４７）に由来する、鎖長３９５６塩
基対の、配列表における配列番号９に示す塩基配列のＤ
ＮＡを含んでいた。図５に示すように、この組換えＤＮ
Ａにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
による認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩
基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号９
に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験４
の方法で確認された本発明のコージビオースホスホリラ
ーゼのＮ末端アミノ酸配列及び中間部部分アミノ酸配列
である、配列表における配列番号１乃至３及び配列番号
６乃至８に示すアミノ酸配列とを比較したところ、配列
表における配列番号１、２及び３に示すアミノ酸配列
は、それぞれ、配列番号９に併記したアミノ酸配列にお
ける第１乃至５番目、第５９０乃至５９４番目及び第３
５７乃至３６１番目のアミノ酸配列と完全に一致した。
また、配列表における配列番号６、７及び８に示すアミ
ノ酸配列は、それぞれ、配列表における配列番号９に併
記したアミノ酸配列における第１乃至１０番目、第５９
０乃至５９９番目及び第３５７乃至３６６番目のアミノ
酸配列と完全に一致した。以上のことは、本発明のコー
ジビオースホスホリラーゼが配列表における配列番号４
に示すアミノ酸配列を含むものであり、当該酵素はサー
モアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４
７）においては、配列表における配列番号５に示す塩基
配列のＤＮＡによりコードされていることを示してい
る。以上のようにして調製し、塩基配列を確認した組換
えＤＮＡを『ｐＴＫＰ１』と命名した。

【００８８】

【実施例Ａ−４】 〈形質転換体によるコージビオースホスホリラーゼの産
生〉１６ｇ／ｌポリペプトン、１０ｇ／ｌ酵母エキス及
び５ｇ／ｌ塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容
三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２
１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に
調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌
的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実施
例Ａ−３の方法で得た形質転換体ＴＫＰ１を接種し、３
７℃で約２０時間通気攪拌培養したものを種培養液とし
た。次に１０ｌ容ファーメンタに、種培養に用いたのと
同一組成の培地を、種培養の場合に準じて７ｌ調製し、
種培養液７０ｍｌ接種し、約２０時間通気攪拌培養し
た。この培養物を、常法にしたがい、遠心分離して菌体
を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁
し、超音波処理して菌体を破砕し、さらに遠心分離によ
り不溶物を除去し、上清を採取した。その上清を１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液に対して透析した後、透析液中のコージ
ビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、培養物
１ｌ当たり約５００単位の当該酵素が産生されていた。

【００８９】第一の対照として、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅ株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外
はすべて上述の形質転換体の場合と同一条件で、培養
し、培養物から菌体破砕物の上清を採取し、透析した。
第二の対照として、サーモアナエロビウム・ブロッキイ
（ＡＴＣＣ ３５０４７）を、アンピシリンを含有しな
いこと以外は上述の形質転換体の場合と同一組成の培地
を用い、実験１に示した方法に準じて６０℃で静置培養
し、さらに上述の形質転換体の場合と同じく培養物から
菌体破砕物の上清を採取し、透析した。第一の対照の透
析物には当該酵素活性は全く認められなかった。第二の
対照の透析物には当該酵素活性が認められたが、この場
合は、培養物１ｌ当たり約１００単位であり、形質転換
体ＴＫＰ１の場合に比較して明らかに低い値であった。

【００９０】この実施例Ａ−４の方法で得た透析物を、
さらに実験２に示した方法に準じて、ＤＥＡＥ−トヨパ
ールゲル ６５０ゲル、ウルトロゲル ＡｃＡ４４を用
いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、さらに
この精製酵素を実験３に示した方法に準じて分析した。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子
量８３，０００±５，０００ダルトン、ゲル濾過法によ
る分子量５００，０００±３０，０００ダルトン、等電
点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点４．
４±０．５、コージビオースホスホリラーゼ活性の至適
温度６５℃付近、至適ｐＨ５．５付近、温度安定性は６
５℃付近まで、ｐＨ安定性は約５．５乃至１０．０であ
り、実験１乃至２に示した方法で調製された当該酵素の
理化学的性質と実質的に同一であった。以上の結果は、
本発明のコージビオースホスホリラーゼは、組換えＤＮ
Ａ技術によっても良好に製造でき、なお且つ酵素の生産
性も有意に向上することを示している。

【００９１】

【実施例Ａ−５】 〈酵素液〉実施例Ａ−３に示した方法で得た形質転換体
ＴＫＰ１を実施例Ａ−４に示した方法で培養した。培養
液を遠心分離して得た菌体を超音波破砕し、破砕液上清
のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定した。この
活性を培養液１ｍｌ当たりに換算すると、約０．５単位
であった。破砕液上清を限外濾過膜にて濃縮し、その濃
縮液を透析してｍｌ当たりコージビオースホスホリラー
ゼ活性約１０単位を有する酵素液を、もとの培養液の総
活性に対して約７０％の収率で得た。

【００９２】

【実施例Ａ−６】 〈コージビオース含有糖液〉マルトースを５％含む２５
ｍＭリン酸２カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
に、市販の細菌由来マルトースホスホリラーゼをマルト
ース１ｇ当たり５単位、実施例Ａ−１の方法で調製した
コージビオースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり
４０単位になるように加え、３０℃で７２時間反応させ
た。その反応液を１００℃で３０分間加熱し、酵素を失
活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過
し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製
し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビ
オース含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得
た。

【００９３】本品は、コージビオースを固形物当たり約
３０％含有するとともにコージビオシルグルコースをも
含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を
有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖
促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化
粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用でき
る。

【００９４】

【実施例Ａ−７】 〈コージビオース高含有粉末〉実施例Ａ−６の方法で反
応、精製した固形物当たり約３０％のコージビオースを
含有する糖液を原料として固形物濃度約２０％に調整
し、これにグルコアミラーゼを固形物１ｇ当たり５単位
加えてｐＨ４．５、４０℃で１６時間反応させ残存する
マルトースを分解した。１００℃で３０分加熱して反応
を停止した後、濃度約４０％まで濃縮した。本糖液中の
コージビオース含有率を高めるため、アルカリ金属型強
酸性カチオン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製、
商品名『ＸＴ−１０１６』、Ｎａ型、架橋度４％）を使
用し、内径３ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレ
ス製カラム４本に水懸濁状で充填し、直列につなぎ、樹
脂層全長を約４ｍになるようにした。カラム内温度を４
０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加
え、これに４０℃の温水をＳＶ０．１５の流速で流して
分画し、コージビオース高含有画分を採取した。更に、
精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、コージビオース
高含有粉末を原料固形物当たり収率約２０％で得た。

【００９５】本品は、固形物当たり約９０％のコージビ
オースを含有しており、味質良好な甘味、適度の保湿性
を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増
殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、
化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用で
きる。

【００９６】

【実施例Ａ−８】 〈グルコシルソルボース含有糖液〉β−Ｄ−グルコース
−１リン酸及びＬ−ソルボースをそれぞれ５％含む水溶
液をｐＨ５．５に調整し、これに実施例Ａ−１の方法で
調製したコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グル
コース−１リン酸１ｇ当たり１０単位になるように加
え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液を９０℃
で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法
に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン
交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７
５％のシラップ状のグルコシルソルボース含有糖液を原
料固形物当たり収率約９５％で得た。

【００９７】本品は、固形物当たりグルコシルソルボー
スを約３０％含有しており、味質良好な甘味、適度の粘
度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフ
ィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広
く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有
利に利用できる。

【００９８】

【実施例Ａ−９】 〈グルコシルソルボース高含有糖液〉β−Ｄ−グルコー
ス−１リン酸を５％及びＬ−ソルボースを１０％含む水
溶液をｐＨ６．０に調整し、これに実施例Ａ−１の方法
で調製したコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グ
ルコース−１リン酸１ｇ当たり３０単位になるように加
えて、６０℃で７２時間反応させた。反応後冷却し、市
販パン酵母を固形物重量当たり湿重量で５％になるよう
に加え、１規定の水酸化ナトリウム溶液を用いて該反応
液をｐＨ５乃至６に制御しながら２７℃で６時間反応さ
せた。その反応液を９０℃で３０分間加熱し、反応を停
止させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過
し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製
し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のグルコシ
ルソルボース含有糖液を原料固形物当たり収率約６５％
で得た。

【００９９】本品は、固形物当たりグルコシルソルボー
スを約４０％含有しており、味質良好な甘味、適度の粘
度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフ
ィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広
く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有
利に利用できる。

【０１００】

【実施例Ａ−１０】 〈グルコシルソルボース高含有粉末〉実施例Ａ−９の方
法で反応、精製した固形物当たり約４０％のグルコシル
ソルボースを含有する糖液を原料として、これを固形物
濃度約４５％に調整した。本糖液中のグルコシルソルボ
ース含有率を高めるため、アルカリ金属型強酸性カチオ
ン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製、商品名『Ｘ
Ｔ−１０１６』、Ｎａ型、架橋度４％）を使用し、内径
３ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス製カラム
４本に水懸濁状で充填し、直列につなぎ、樹脂層全長を
約４ｍになるようにした。カラム内温度を４０℃に維持
しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに４
０℃の温水をＳＶ０．１５の流速で流して分画し、グル
コシルソルボース高含有画分を採取した。更に、精製、
濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、グルコシルソルボース
高含有粉末を原料固形物当たり収率約２５％で得た。

【０１０１】本品は、固形物当たり約９０％のグルコシ
ルソルボースを含有しており、味質良好な甘味、適度の
保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズ
ス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲
食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に
利用できる。

【０１０２】

【実施例Ａ−１１】 〈コージビオシルフラクトシド含有糖液〉コージビオー
スを１０％及びスクロースを１０％含む水溶液を調整
し、これに実施例Ａ−１の方法で調製したコージビオー
スホスホリラーゼをコージビオース１ｇ当たり４０単位
になるように加え、５ｍＭリン酸二水素ナトリウム塩存
在下ｐＨ５．０、６０℃で７２時間反応させた。その反
応液を９０℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、
冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及び
ＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮
して濃度約７５％のシラップ状のコージビオシルフラク
トシド含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得
た。

【０１０３】本品は、固形物当たり約５５％のコージビ
オシルフラクトシドを含有しており、味質良好な甘味、
適度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、
成形物など各種組成物に有利に利用できる。

【０１０４】

【実施例Ａ−１２】 〈コージビオシルフラクトシド高含有粉末〉実施例Ａ−
１１の方法で反応、精製した、固形物当たり約５５％の
コージビオシルフラクトシドを含有する糖液を原料とし
て、これを固形物濃度約４５％に調整した。本糖液中の
コージビオシルフラクトシド含有率を高めるため、アル
カリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂（ダウケミカル
社販売、商品名『ダウエックス５０Ｗ×４』、Ｃａ型）
を用いた以外は、実施例Ａ−１０の方法に従ってカラム
クロマトグラフィーを行い、コージビオシルフラクトシ
ド高含有画分を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾
燥し、粉砕して、コージビオシルフラクトシド高含有粉
末を原料固形物当たり収率約４０％で得た。

【０１０５】本品は、固形物当たり約９５％のコージビ
オシルフラクトシドを含有しており、味質良好な甘味、
適度の保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物
など各種組成物に有利に利用できる。

【０１０６】

【実施例Ａ−１３】 〈コージビオシルグルコース含有糖液〉β−Ｄ−グルコ
ース−１リン酸を１０％及びマルトースを２０％含む水
溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実施例Ａ−１の方法
で調製したコージビオースホスホリラーゼをマルトース
１ｇ当たり４０単位になるように加え、６０℃で７２時
間反応させた。その反応液を９０℃で３０分間加熱し、
酵素を失活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱
色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩
して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状の
コージビオシルグルコース含有糖液を原料固形物当たり
収率約９５％で得た。

【０１０７】本品は、固形物当たり約４５％のコージビ
オシルグルコースを含有しており、味質良好な甘味、適
度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成
形物など各種組成物に有利に利用できる。

【０１０８】

【実施例Ａ−１４】 〈コージビオシルグルコシド高含有糖液〉β−Ｄ−グル
コース−１リン酸を５％、トレハロースを１０％含む水
溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実施例Ａ−１の方法
で調製したコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グ
ルコース−１リン酸１ｇ当たり２０単位になるように加
え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液に水酸化
ナトリウムを加えてｐＨ１０以上のアルカリ性に保ちな
がら１００℃で加熱した後、冷却し、常法に従って活性
炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂によ
り脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラッ
プ状のコージビオシルグルコシド高含有糖液を原料固形
物当たり収率約６０％で得た。

【０１０９】本品は、固形物当たり約９５％のコージビ
オシルグルコシドを含有しており、味質良好な甘味、適
度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成
形物など各種組成物に有利に利用できる。

【０１１０】

【実施例Ａ−１５】 〈コージビオース含有糖液〉マルトースを５％含む２５
ｍＭリン酸２カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
に、市販の細菌由来マルトースホスホリラーゼをマルト
ース１ｇ当たり５単位、実施例Ａ−５の方法で調製した
コージビオースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり
４０単位になるように加え、３０℃で７２時間反応させ
た。その反応液を１００℃で３０分間加熱し、酵素を失
活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過
し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製
し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビ
オース含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得
た。

【０１１１】本品は、コージビオースを固形物当たり約
３０％含有するとともにコージビオシルグルコースをも
含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を
有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖
促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化
粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用でき
る。

【０１１２】

【実施例Ａ−１６】 〈コージビオシルグルコシド高含有糖液〉β−Ｄ−グル
コース−１リン酸を５％、トレハロースを１０％含む水
溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実施例Ａ−５の方法
で調製したコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グ
ルコース−１リン酸１ｇ当たり２０単位になるように加
え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液に水酸化
ナトリウムを加えてｐＨ１０以上のアルカリ性に保ちな
がら１００℃で加熱した後、冷却し、常法に従って活性
炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂によ
り脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラッ
プ状のコージビオシルグルコシド高含有糖液を原料固形
物当たり収率約６０％で得た。

【０１１３】本品は、固形物当たり約９５％のコージビ
オシルグルコシドを含有しており、味質良好な甘味、適
度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成
形物など各種組成物に有利に利用できる。

【０１１４】

【実施例Ｂ−１】 〈甘味剤〉実施例Ａ−１０の方法で得たグルコシルソル
ボース高含有粉末１重量部に対し、α−グリコシルステ
ビオシド（東洋精糖株式会社製造、商品名α−Ｇスィー
ト）０．０５重量部を加えて均一に混合して粉末甘味剤
を製造した。本品は、上品な甘味で、砂糖の約２倍の甘
味を有し、カロリーは甘味度当たり砂糖の約２分の１と
なる。したがって、この甘味剤は低カロリー甘味料とし
て、カロリーの摂取を制限している人、例えば、肥満
者、糖尿病者などのための低カロリー飲食物に対する味
付けに好適である。また、この甘味剤は、虫歯誘発菌に
よる酸の生成も少なく、不溶性グルカンの生成も少ない
ことにより、虫歯を抑制する飲食物などの味付けにも好
適である。

【０１１５】

【実施例Ｂ−２】 〈ハードキャンディー〉実施例Ａ−８の方法で得たグル
コシルソルボース含有糖液３０重量部に対し、還元麦芽
糖水飴（水分２５％）８０重量部を加えて混合溶解し、
減圧下で水分が２％未満になるまで濃縮し、これにクエ
ン酸１重量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和
し、次いで、常法に従って成形しハードキャンディーを
製造した。本品は、上品な甘味を有し、吸湿性少なく、
ダレを起こしにくい歯切れの良いハードキャンディーで
ある。

【０１１６】

【実施例Ｂ−３】 〈チューインガム〉実施例Ａ−１２の方法で得たコージ
ビオシルフラクトシド高含有粉末４重量部に対し、グル
コース３重量部および、柔らかくなる程度に加熱溶融し
たガムベース２重量部を加えて混合し、さらに適量のハ
ッカ香料を混合した後、常法に従ってロールにより練り
合わせ成形することによってチューインガムを製造し
た。本品は、テクスチャー、風味ともに優れた製品であ
る。

【０１１７】

【実施例Ｂ−４】 〈チョコレート〉実施例Ａ−７の方法で得たコージビオ
ース高含有粉末１５重量部に対し、カカオペースト４０
重量部、カカオバター１０重量部、蔗糖１０重量部及び
全脂粉乳１５重量部を加えて混合し、レファイナーを通
した。そして粒度を下げた後、コンチェに入れ、レシチ
ン０．５重量部を加えて、５０℃で二昼夜練り上げた。
次いで、常法に従い成型機に流し込み成型固化してチョ
コレートを製造した。本品は、ファットブルーム、シュ
ガーブルームの恐れがなく、舌にのせた時の融け具合、
風味ともに良好である。

【０１１８】

【実施例Ｂ−５】 〈カスタードクリーム〉実施例Ａ−１０の方法で得たグ
ルコシルソルボース高含有粉末４００重量部に対し、コ
ーンスターチ５００重量部、マルトース５００重量部及
び食塩５重量部を加え、篩いを通して充分に混合し、さ
らに鶏卵１，４００重量部を加えて攪拌し、これに沸騰
した牛乳５，０００重量部を徐々に加え、さらにこれを
とろ火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊
化して全体が半透明になったとき火を止め、これを冷却
して少量のバニラ香料を加えることによりカスタードク
リームを製造した。本品は、なめらかで光沢を有し、甘
味が強すぎず美味である。

【０１１９】

【実施例Ｂ−６】 〈ういろう〉実施例Ａ−１１の方法で得たコージビオシ
ルフラクトシド含有糖液９０重量部に対し、米粉９０重
量部、コーンスターチ２０重量部、砂糖２０重量部、抹
茶粉末１重量部及び水の適量を加えて混練した後、これ
を容器に入れて６０分間蒸して抹茶ういろうを製造し
た。本品は、照り、口当たり良好で、風味もよいもので
あった。また、澱粉の老化も抑制され、長時間安定であ
った。

【０１２０】

【実施例Ｂ−７】 〈べったら漬〉実施例Ａ−１３の方法で得たコージビオ
シルグルコース含有糖液１重量部に対し、マルトース３
重量部、甘草製剤０．０５重量部、リンゴ酸０．００８
重量部、グルタミン酸ナトリウム０．０７重量部、ソル
ビン酸カリウム０．０３重量部及びプルラン０．２重量
部を均一に混合してべったら漬の素を製造した。大根３
０ｋｇを常法に従って食塩により下漬けし、次いで砂糖
で中漬けしたものを、ここで得たべったら漬の素４ｋｇ
で調製した調味液に漬けて、べったら漬を製造した。本
品は、色艶、香気ともに良好で、適度の甘味を有し歯切
れも良かった。

【０１２１】

【実施例Ｂ−８】 〈乳酸菌飲料〉実施例Ａ−６の方法で得たコージビオー
ス含有糖液１３０重量部に対し、脱脂粉乳１７５重量部
及びラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販
売、登録商標「乳果オリゴ」）５０重量部を、水１，１
５０重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃
に冷却後、これに、常法にしたがって、乳酸菌のスター
ターを３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸
菌飲料を得た。本品は、風味良好な乳酸菌飲料である。
また、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保持
するだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有す
る。

【０１２２】

【実施例Ｂ−９】 〈合成酒〉３０ｖ／ｖ％アルコール水溶液６５１８重量
部（温度１５℃の場合）、７０％ぶどう糖水溶液６００
重量部、実施例Ａ−６の方法で得たコージビオース含有
糖液５０重量部、コハク酸１１．１重量部、７５％乳酸
水溶液３．６６重量部、グルタミン酸ナトリウム２．３
重量部、グリシン１．２重量部、アラニン１．２重量
部、コハク酸ナトリウム２．２２重量部、食塩１．６重
量部、天然塩１．４重量部及び水２５００重量部を混合
して、アルコール含量約２０ｖ／ｖ％の原酒を得た。こ
れを水で希釈して、アルコール含量１５乃至１６ｖ／ｖ
％の製品を得た。本品は、まろやかな甘みと上品な風味
を有し美味である。

【０１２３】

【実施例Ｂ−１０】 〈乳液〉実施例Ａ−９の方法で得たグルコシルソルボー
ス高含有糖液３．５重量部に対し、ポリオキシエチレン
ベヘニルエーテル０．５重量部、テトラオレイン酸ポリ
オキシエチレンソルビトール１重量部、親油型モノステ
アリン酸グリセリン１重量部、ベヘニルアルコール０．
５重量部、アボガド油１重量部、α−グリコシルルチン
１重量部、ビタミンＥ及び防腐剤の適量を加え、常法に
従って加熱溶解し、これに１，３−ブチレングリコール
５重量部、カルボキシビニルポリマー０．１重量部及び
精製水８５．３重量部を加え、ホモゲナイザーにかけて
乳化し、乳液を製造した。本品は、保湿性に優れ、日焼
け止め、色白剤などとして有利に利用できる。

【０１２４】

【実施例Ｂ−１１】 〈スキンクリーム〉実験１２の方法で得たコージビオシ
ルフラクトシド高含有粉末４重量部に対し、モノステア
リン酸ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳
化型モノステアリン酸グリセリン５重量部、α−グリコ
シルルチン２重量部、流動パラフィン１重量部、トリオ
クタン酸グリセリル１０重量部及び防腐剤の適量を加
え、常法に従って加熱溶解し、これに１，３−ブチレン
グリコール５重量部、及び精製水６６重量部を更に加
え、ホモゲナイザーにかけて乳化し、香料の適量を加え
て攪拌混合し、スキンクリームを製造した。本品は、伸
びのよいクリームで、日焼け止め、美肌剤、色白剤など
として有利に利用できる。

【０１２５】

【実施例Ｂ−１２】 〈練歯磨〉実施例Ａ−１４の方法で得たコージビオシル
グルコシド高含有糖液１５重量部に対し、第二リン酸カ
ルシウム重量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５重量
部、グリセリン２５重量部、ポリオキシエチレンソルビ
タンラウレート０．５重量部、サッカリン０．０２重量
部、防腐剤０．０５重量部及び水１３重量部と混合して
練歯磨を得た。本品は、光沢、洗浄力も良好で、練歯磨
として好適である。

【０１２６】

【実施例Ｂ−１３】 〈経管栄養剤〉実施例Ａ−７の方法で得たコージビオー
ス高含有粉末８０重量部と、乾燥卵黄１９０重量部、脱
脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４．４重量部、塩
化カリウム１．８５重量部、硫酸マグネシウム４重量
部、チアミン０．０１重量部、アスコルビン酸ナトリウ
ム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量部及
びニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物を調
製した。この配合物２５ｇずつをラミネートアルミ製小
包に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、１
袋分を約１５０乃３００ｍｌの水に溶解して栄養補給液
とし、経管方法により、鼻腔、食道、胃などへ投与して
使用する。

【０１２７】

【実施例Ｂ−１４】 〈錠剤〉実験８の方法で得たグルコシルソルボース高含
有粉末４重量部に対し、アスピリン５０重量部、マルト
ース１０重量部及びコーンスターチ４重量部を加え、均
一に混合した後、直径１２ｍｍ、２０Ｒ杆を用いて１錠
６８０ｍｇ、錠剤の厚さ５．２５ｍｍ、硬度８ｋｇ±１
ｋｇで打錠した。本品は、適度の甘味を有する飲みやす
い錠剤である。

【０１２８】

【実施例Ｂ−１５】 〈いちごジャム〉生いちご１５０重量部、蔗糖６０重量
部、マルトース２０重量部、実施例Ａ−１５の方法で得
たコージビオース含有糖液４０重量部、ペクチン５重量
部及びクエン酸１重量部を鍋で煮詰め、瓶詰めして製品
を得た。本品は風味、色調とも良好なジャムである。

【０１２９】

【実施例Ｂ−１６】 〈加糖練乳〉原乳１００重量部に実施例Ａ−１６の方法
で得たコージビオシルグルコシド高含有糖液３重量部及
び蔗糖１重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌
し、次いで濃度約７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して
製品を得た。本品は温和な甘味で、風味もよく、乳幼児
食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用
に有利に利用できる。

【０１３０】

【発明の効果】叙上のように本発明は、従来知られてい
なかったコージビオースを生産し得るホスホリラーゼ、
すなわち、コージビオースホスホリラーゼの発見に基づ
くものである。本発明のコージビオースホスホリラーゼ
は、至適温度、温度安定性における温度が高く、また、
ｐＨ安定性におけるｐＨ域が広く、しかも至適ｐＨはそ
のｐＨ域内にあり、更に産生微生物からの酵素生産量も
高い。したがって、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖
供与体として各種糖質の存在下で本発明の酵素を作用さ
せれば、従来公知ではあるが入手の極めて困難であった
コージビオース等や、新規のグルコシルソルボース等を
始めとする各種グルコシル転移糖並びに当該転移糖含有
糖質を大量且つ安価に製造することができる。

【０１３１】この様にして製造されるグルコシル転移糖
並びに当該転移糖含有糖質は、上品な甘味の甘味剤、呈
味改良剤、品質改良剤、ボディー付与剤、粘度調節剤、
保湿剤、照付与剤などとして、さらには、栄養補給剤な
どとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種
組成物に供しうることが大きな特徴であることから、本
発明は、食品、化粧品、医薬品分野のみならず、農水畜
産業や、化学工業等の産業界に貢献すること誠に多大な
意義のある発明といえる。

【０１３２】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：N末端フラグメント

【０１３３】配列番号：2 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【０１３４】配列番号：3 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【０１３５】配列番号：4 配列の長さ：775 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Met Val Lys His Met Phe Leu Glu Asp Val Asn Asn Leu Ile Ser Asp 1 5 10 15 Asp Lys Trp Leu Ile Phe Gln Asn Glu Tyr Asn Thr Glu Val Asn Pro 20 25 30 Arg Tyr Glu Thr Leu Phe Thr Leu Thr Asn Gly Tyr Met Gly Val Arg 35 40 45 Gly Thr Phe Glu Glu Gly Ser Glu Gly Glu Arg Ser Gly Asn Phe Ile 50 55 60 Ala Gly Ile Phe Asp Lys Ser Asp Ala Gln Val Arg Glu Ile Val Asn 65 70 75 80 Ala Gln Asn Trp Leu Arg Ile Lys Leu Tyr Val Glu Gly Glu Glu Leu 85 90 95 Ser Leu Asp Lys Cys Gln Leu Ile Glu Phe Lys Arg Ile Leu Asp Met 100 105 110 Lys Lys Gly Ile Leu Phe Arg Ser Met Leu Ile Lys Asp Ser Lys Asp 115 120 125 Arg Ile Thr Arg Ile Glu Gly Tyr Arg Phe Ile Ser Arg Ser Asp Leu 130 135 140 His Arg Ser Ala Ile Lys Leu Phe Val Thr Pro Val Asn Tyr Ser Gly 145 150 155 160 Val Val Gly Ile Glu Ser Ile Ile Asp Gly Thr Val Leu Asn Ser Ala 165 170 175 Asp Ser Pro Lys His Arg Val Lys His Leu Lys Val Ala Asp Asn Ser 180 185 190 Ser Leu Asn Lys Ser Gly Val Tyr Leu Glu Thr Ala Thr Ile Asp Asp 195 200 205 Asp Ile Arg Ile Ala Thr Gly Ser Ala Val Arg Leu Tyr His Tyr Glu 210 215 220 Asp Lys Glu Lys Asn Asn Ile Ala Lys Phe Lys Arg Phe Leu Pro Leu 225 230 235 240 Gly Glu Met Ser Ile Glu Tyr Phe Glu Phe Asp Gly Thr Glu Asn Lys 245 250 255 Thr Val Val Ile Asp Lys Phe Ile Ile Thr Tyr Thr Ser Arg Asp Val 260 265 270 Lys Lys Gly Leu Leu Lys Ser Thr Val Glu Lys Glu Leu Phe Ala Phe 275 280 285 Ala Gly Glu Gly Ile Asp Lys Glu Leu Gln Arg His Ile Glu Val Tyr 290 295 300 Glu Glu Leu Trp Ser Val Ala Asp Ile Asn Ile Glu Gly Asp Glu Glu 305 310 315 320 Ala Asp Lys Ala Leu Arg Phe Asn Ile Phe His Leu Met Ser Ser Val 325 330 335 Asn Glu Asn Asp Pro Met Val Ser Ile Ala Ala Lys Ala Leu His Gly 340 345 350 Glu Gly Tyr Lys Gly His Val Phe Trp Asp Thr Glu Ile Phe Met Leu 355 360 365 Pro Phe Phe Ile Tyr Val His Pro Lys Ala Ala Lys Thr Leu Leu Met 370 375 380 Tyr Arg Tyr Asn Met Leu Asp Ala Ala Arg Lys Asn Ala Ala Leu Asn 385 390 395 400 Gly Tyr Lys Gly Ala Gln Tyr Pro Trp Glu Ser Ala Asp Thr Gly Glu 405 410 415 Glu Glu Thr Pro Lys Trp Gly Phe Asp Tyr Met Gly Asn Pro Val Arg 420 425 430 Ile Trp Thr Gly Asp Leu Glu His His Ile Thr Ala Asp Ile Ala Phe 435 440 445 Ala Val Trp Glu Tyr Phe Arg Ala Thr Glu Asp Ile Glu Phe Met Leu 450 455 460 Asn Tyr Gly Ala Glu Val Ile Phe Glu Thr Ala Arg Phe Trp Val Ser 465 470 475 480 Arg Cys Glu Tyr Val Lys Glu Leu Asp Arg Tyr Glu Ile Asn Asn Val 485 490 495 Ile Gly Pro Asp Glu Phe His Glu His Val Asp Asn Asn Ala Tyr Thr 500 505 510 Asp Tyr Leu Ala Lys Trp Asn Ile Lys Lys Gly Leu Glu Leu Ile Asn 515 520 525 Met Leu Lys Glu Lys Tyr Pro Glu His Tyr His Ala Ile Ser Asn Lys 530 535 540 Lys Cys Leu Thr Asn Glu Glu Met Glu Lys Trp Lys Glu Val Glu Glu 545 550 555 560 Lys Ile Tyr Ile Pro Tyr Asp Lys Asp Lys Lys Leu Ile Glu Gln Phe 565 570 575 Glu Gly Tyr Phe Asp Lys Lys Asp Tyr Val Ile Asp Lys Phe Asp Glu 580 585 590 Asn Asn Met Pro Ile Trp Pro Glu Gly Val Asp Ile Thr Lys Leu Gly 595 600 605 Asp Thr Gln Leu Ile Lys Gln Ala Asp Val Val Met Leu Met Leu Leu 610 615 620 Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Glu Thr Lys Arg Ile Asn Tyr Glu Tyr 625 630 635 640 Tyr Glu Lys Arg Thr Met His Lys Ser Ser Leu Gly Pro Ser Met Tyr 645 650 655 Ala Ile Met Gly Leu Lys Val Gly Asp His Lys Asn Ala Tyr Gln Ser 660 665 670 Phe Met Arg Ser Ala Asn Val Asp Leu Val Asp Asn Gln Gly Asn Thr 675 680 685 Lys Glu Gly Leu His Ala Ala Ser Ala Gly Gly Thr Trp Gln Val Val 690 695 700 Val Phe Gly Phe Gly Gly Met Glu Ile Asp Lys Glu Gly Ala Leu Asn 705 710 715 720 Ile Asn Ser Trp Leu Pro Glu Lys Trp Asp Lys Leu Ser Tyr Lys Val 725 730 735 Phe Trp Lys Gly Asn Leu Ile Glu Val Ile Val Thr Lys Gln Glu Val 740 745 750 Thr Val Lys Lys Leu Lys Gly Lys Gly Asn Ile Lys Val Lys Val Lys 755 760 765 Gly Lys Glu Leu Thr Ile Glu 770 775

【０１３６】配列番号：5 配列の長さ：2325 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTGGTAAAGC ACATGTTTTT AGAGGATGTA AACAATTTAA TAAGTGATGA CAAATGGCTT 60 ATTTTCCAAA ATGAGTATAA TACAGAGGTA AATCCTCGAT ATGAGACCCT TTTTACACTT 120 ACAAATGGTT ACATGGGCGT AAGAGGTACT TTTGAGGAAG GAAGCGAGGG AGAAAGGTCG 180 GGAAATTTTA TTGCAGGAAT TTTTGACAAG TCAGATGCGC AGGTTAGAGA AATAGTAAAT 240 GCTCAAAATT GGTTGAGAAT AAAGTTGTAT GTTGAAGGTG AAGAATTAAG TTTGGATAAA 300 TGCCAGTTGA TAGAATTTAA AAGAATTCTT GATATGAAAA AAGGTATTCT ATTTAGGAGT 360 ATGTTGATAA AAGACAGCAA AGATAGAATT ACTCGAATTG AGGGATACAG GTTTATAAGC 420 CGTAGCGACC TTCATCGTTC TGCAATTAAG CTATTTGTAA CACCTGTAAA TTACAGTGGT 480 GTTGTAGGTA TAGAGAGCAT TATTGATGGG ACTGTTTTAA ATTCAGCAGA TAGCCCAAAG 540 CATAGGGTAA AGCATTTGAA AGTGGCTGAC AATAGCAGTT TAAATAAAAG CGGAGTTTAT 600 CTTGAAACAG CAACTATTGA CGATGATATT CGCATTGCAA CAGGTAGTGC AGTGAGGTTA 660 TATCATTATG AGGATAAAGA GAAAAATAAC ATAGCTAAAT TTAAGAGATT TTTGCCTTTA 720 GGTGAAATGA GTATTGAATA CTTTGAGTTT GATGGCACAG AGAACAAAAC AGTAGTAATT 780 GACAAATTTA TTATAACCTA TACCTCAAGA GACGTAAAAA AAGGCCTATT AAAGAGTACG 840 GTGGAAAAAG AACTCTTTGC TTTTGCTGGA GAAGGTATTG ACAAAGAGTT GCAGAGACAT 900 ATTGAGGTAT ATGAAGAACT ATGGTCTGTT GCAGATATAA ATATTGAAGG GGATGAAGAA 960 GCAGATAAAG CTTTGAGGTT TAATATTTTT CATCTCATGA GTTCTGTCAA TGAAAATGAC 1020 CCCATGGTAA GTATCGCTGC AAAGGCCCTT CATGGTGAGG GATACAAAGG CCATGTCTTT 1080 TGGGATACAG AAATATTTAT GCTTCCGTTT TTCATATATG TGCATCCAAA AGCGGCAAAG 1140 ACACTTTTGA TGTACAGGTA CAATATGCTG GATGCAGCGA GAAAAAATGC GGCTTTAAAC 1200 GGGTATAAGG GAGCACAATA CCCTTGGGAA TCTGCAGATA CAGGAGAGGA AGAGACACCT 1260 AAATGGGGAT TTGATTACAT GGGAAACCCT GTAAGGATAT GGACGGGTGA TTTAGAGCAT 1320 CATATAACTG CTGATATAGC TTTTGCAGTG TGGGAGTATT TTAGAGCGAC AGAGGATATT 1380 GAGTTTATGT TGAATTACGG TGCAGAAGTC ATTTTTGAGA CTGCAAGGTT TTGGGTATCT 1440 AGATGTGAAT ATGTAAAAGA ATTAGACAGG TATGAAATAA ACAATGTCAT AGGTCCTGAT 1500 GAATTTCATG AGCATGTTGA TAATAATGCT TATACTGATT ACCTTGCAAA ATGGAATATT 1560 AAAAAGGGAC TTGAACTAAT CAATATGTTA AAAGAAAAAT ACCCTGAACA TTATCATGCT 1620 ATATCAAACA AGAAATGTTT GACAAATGAG GAAATGGAAA AGTGGAAAGA AGTTGAAGAA 1680 AAAATATATA TACCTTATGA CAAAGACAAA AAGCTGATAG AACAATTTGA AGGCTATTTT 1740 GATAAAAAAG ATTATGTTAT TGATAAATTT GATGAAAACA ATATGCCTAT ATGGCCTGAA 1800 GGTGTTGATA TAACAAAATT GGGTGATACC CAGCTTATTA AACAGGCTGA TGTTGTTATG 1860 TTAATGCTTT TGTTAGGTGA GGAATTTGAC GAAGAAACGA AAAGAATCAA TTACGAATAT 1920 TATGAAAAGC GAACTATGCA CAAATCTTCA TTAGGTCCCA GCATGTATGC CATTATGGGG 1980 TTAAAAGTAG GGGACCACAA AAACGCATAT CAGTCTTTCA TGAGAAGTGC CAACGTGGAC 2040 CTTGTGGACA ATCAGGGGAA CACTAAAGAA GGTTTGCATG CTGCATCTGC TGGTGGTACA 2100 TGGCAAGTAG TTGTTTTTGG ATTTGGCGGA ATGGAAATTG ACAAAGAAGG GGCATTAAAT 2160 ATAAATTCGT GGCTGCCAGA AAAATGGGAT AAACTTTCCT ATAAAGTATT TTGGAAAGGC 2220 AATTTAATAG AGGTGATTGT TACAAAACAG GAAGTGACAG TAAAAAAATT AAAAGGAAAA 2280 GGAAATATAA AAGTAAAGGT AAAAGGGAAA GAGCTGACAA TAGAA 2325

【０１３７】配列番号：6 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：N末端フラグメント

【０１３８】配列番号：7 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【０１３９】配列番号：8 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【０１４０】配列番号：9 配列の長さ：3956 配列の型：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：サーモアナエロビウム・ブロッキイ 株名：ＡＴＣＣ ３５０４７ 配列の特徴 特徴を表す記号：5′UTR 存在位置：1..100 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：101..2425 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：3′UTR 存在位置：2426..3956 特徴を決定した方法：E 配列 AGCTTGTAAT TAGAGATTCA GCTAGAAAGA TATAATTTTT TTTAAAAAGT ACCCAAAACG 60 TTTCGGATAA AATTTTTAGC AGGAATCAGG AGGTATATAA 100 GTG GTA AAG CAC ATG TTT TTA GAG GAT GTA AAC AAT TTA ATA AGT GAT 148 Met Val Lys His Met Phe Leu Glu Asp Val Asn Asn Leu Ile Ser Asp 1 5 10 15 GAC AAA TGG CTT ATT TTC CAA AAT GAG TAT AAT ACA GAG GTA AAT CCT 196 Asp Lys Trp Leu Ile Phe Gln Asn Glu Tyr Asn Thr Glu Val Asn Pro 20 25 30 CGA TAT GAG ACC CTT TTT ACA CTT ACA AAT GGT TAC ATG GGC GTA AGA 244 Arg Tyr Glu Thr Leu Phe Thr Leu Thr Asn Gly Tyr Met Gly Val Arg 35 40 45 GGT ACT TTT GAG GAA GGA AGC GAG GGA GAA AGG TCG GGA AAT TTT ATT 292 Gly Thr Phe Glu Glu Gly Ser Glu Gly Glu Arg Ser Gly Asn Phe Ile 50 55 60 GCA GGA ATT TTT GAC AAG TCA GAT GCG CAG GTT AGA GAA ATA GTA AAT 340 Ala Gly Ile Phe Asp Lys Ser Asp Ala Gln Val Arg Glu Ile Val Asn 65 70 75 80 GCT CAA AAT TGG TTG AGA ATA AAG TTG TAT GTT GAA GGT GAA GAA TTA 388 Ala Gln Asn Trp Leu Arg Ile Lys Leu Tyr Val Glu Gly Glu Glu Leu 85 90 95 AGT TTG GAT AAA TGC CAG TTG ATA GAA TTT AAA AGA ATT CTT GAT ATG 436 Ser Leu Asp Lys Cys Gln Leu Ile Glu Phe Lys Arg Ile Leu Asp Met 100 105 110 AAA AAA GGT ATT CTA TTT AGG AGT ATG TTG ATA AAA GAC AGC AAA GAT 484 Lys Lys Gly Ile Leu Phe Arg Ser Met Leu Ile Lys Asp Ser Lys Asp 115 120 125 AGA ATT ACT CGA ATT GAG GGA TAC AGG TTT ATA AGC CGT AGC GAC CTT 532 Arg Ile Thr Arg Ile Glu Gly Tyr Arg Phe Ile Ser Arg Ser Asp Leu 130 135 140 CAT CGT TCT GCA ATT AAG CTA TTT GTA ACA CCT GTA AAT TAC AGT GGT 580 His Arg Ser Ala Ile Lys Leu Phe Val Thr Pro Val Asn Tyr Ser Gly 145 150 155 160 GTT GTA GGT ATA GAG AGC ATT ATT GAT GGG ACT GTT TTA AAT TCA GCA 628 Val Val Gly Ile Glu Ser Ile Ile Asp Gly Thr Val Leu Asn Ser Ala 165 170 175 GAT AGC CCA AAG CAT AGG GTA AAG CAT TTG AAA GTG GCT GAC AAT AGC 676 Asp Ser Pro Lys His Arg Val Lys His Leu Lys Val Ala Asp Asn Ser 180 185 190 AGT TTA AAT AAA AGC GGA GTT TAT CTT GAA ACA GCA ACT ATT GAC GAT 724 Ser Leu Asn Lys Ser Gly Val Tyr Leu Glu Thr Ala Thr Ile Asp Asp 195 200 205 GAT ATT CGC ATT GCA ACA GGT AGT GCA GTG AGG TTA TAT CAT TAT GAG 772 Asp Ile Arg Ile Ala Thr Gly Ser Ala Val Arg Leu Tyr His Tyr Glu 210 215 220 GAT AAA GAG AAA AAT AAC ATA GCT AAA TTT AAG AGA TTT TTG CCT TTA 820 Asp Lys Glu Lys Asn Asn Ile Ala Lys Phe Lys Arg Phe Leu Pro Leu 225 230 235 240 GGT GAA ATG AGT ATT GAA TAC TTT GAG TTT GAT GGC ACA GAG AAC AAA 868 Gly Glu Met Ser Ile Glu Tyr Phe Glu Phe Asp Gly Thr Glu Asn Lys 245 250 255 ACA GTA GTA ATT GAC AAA TTT ATT ATA ACC TAT ACC TCA AGA GAC GTA 916 Thr Val Val Ile Asp Lys Phe Ile Ile Thr Tyr Thr Ser Arg Asp Val 260 265 270 AAA AAA GGC CTA TTA AAG AGT ACG GTG GAA AAA GAA CTC TTT GCT TTT 964 Lys Lys Gly Leu Leu Lys Ser Thr Val Glu Lys Glu Leu Phe Ala Phe 275 280 285 GCT GGA GAA GGT ATT GAC AAA GAG TTG CAG AGA CAT ATT GAG GTA TAT 1012 Ala Gly Glu Gly Ile Asp Lys Glu Leu Gln Arg His Ile Glu Val Tyr 290 295 300 GAA GAA CTA TGG TCT GTT GCA GAT ATA AAT ATT GAA GGG GAT GAA GAA 1060 Glu Glu Leu Trp Ser Val Ala Asp Ile Asn Ile Glu Gly Asp Glu Glu 305 310 315 320 GCA GAT AAA GCT TTG AGG TTT AAT ATT TTT CAT CTC ATG AGT TCT GTC 1108 Ala Asp Lys Ala Leu Arg Phe Asn Ile Phe His Leu Met Ser Ser Val 325 330 335 AAT GAA AAT GAC CCC ATG GTA AGT ATC GCT GCA AAG GCC CTT CAT GGT 1156 Asn Glu Asn Asp Pro Met Val Ser Ile Ala Ala Lys Ala Leu His Gly 340 345 350 GAG GGA TAC AAA GGC CAT GTC TTT TGG GAT ACA GAA ATA TTT ATG CTT 1204 Glu Gly Tyr Lys Gly His Val Phe Trp Asp Thr Glu Ile Phe Met Leu 355 360 365 CCG TTT TTC ATA TAT GTG CAT CCA AAA GCG GCA AAG ACA CTT TTG ATG 1252 Pro Phe Phe Ile Tyr Val His Pro Lys Ala Ala Lys Thr Leu Leu Met 370 375 380 TAC AGG TAC AAT ATG CTG GAT GCA GCG AGA AAA AAT GCG GCT TTA AAC 1300 Tyr Arg Tyr Asn Met Leu Asp Ala Ala Arg Lys Asn Ala Ala Leu Asn 385 390 395 400 GGG TAT AAG GGA GCA CAA TAC CCT TGG GAA TCT GCA GAT ACA GGA GAG 1348 Gly Tyr Lys Gly Ala Gln Tyr Pro Trp Glu Ser Ala Asp Thr Gly Glu 405 410 415 GAA GAG ACA CCT AAA TGG GGA TTT GAT TAC ATG GGA AAC CCT GTA AGG 1396 Glu Glu Thr Pro Lys Trp Gly Phe Asp Tyr Met Gly Asn Pro Val Arg 420 425 430 ATA TGG ACG GGT GAT TTA GAG CAT CAT ATA ACT GCT GAT ATA GCT TTT 1444 Ile Trp Thr Gly Asp Leu Glu His His Ile Thr Ala Asp Ile Ala Phe 435 440 445 GCA GTG TGG GAG TAT TTT AGA GCG ACA GAG GAT ATT GAG TTT ATG TTG 1492 Ala Val Trp Glu Tyr Phe Arg Ala Thr Glu Asp Ile Glu Phe Met Leu 450 455 460 AAT TAC GGT GCA GAA GTC ATT TTT GAG ACT GCA AGG TTT TGG GTA TCT 1540 Asn Tyr Gly Ala Glu Val Ile Phe Glu Thr Ala Arg Phe Trp Val Ser 465 470 475 480 AGA TGT GAA TAT GTA AAA GAA TTA GAC AGG TAT GAA ATA AAC AAT GTC 1588 Arg Cys Glu Tyr Val Lys Glu Leu Asp Arg Tyr Glu Ile Asn Asn Val 485 490 495 ATA GGT CCT GAT GAA TTT CAT GAG CAT GTT GAT AAT AAT GCT TAT ACT 1636 Ile Gly Pro Asp Glu Phe His Glu His Val Asp Asn Asn Ala Tyr Thr 500 505 510 GAT TAC CTT GCA AAA TGG AAT ATT AAA AAG GGA CTT GAA CTA ATC AAT 1684 Asp Tyr Leu Ala Lys Trp Asn Ile Lys Lys Gly Leu Glu Leu Ile Asn 515 520 525 ATG TTA AAA GAA AAA TAC CCT GAA CAT TAT CAT GCT ATA TCA AAC AAG 1732 Met Leu Lys Glu Lys Tyr Pro Glu His Tyr His Ala Ile Ser Asn Lys 530 535 540 AAA TGT TTG ACA AAT GAG GAA ATG GAA AAG TGG AAA GAA GTT GAA GAA 1780 Lys Cys Leu Thr Asn Glu Glu Met Glu Lys Trp Lys Glu Val Glu Glu 545 550 555 560 AAA ATA TAT ATA CCT TAT GAC AAA GAC AAA AAG CTG ATA GAA CAA TTT 1828 Lys Ile Tyr Ile Pro Tyr Asp Lys Asp Lys Lys Leu Ile Glu Gln Phe 565 570 575 GAA GGC TAT TTT GAT AAA AAA GAT TAT GTT ATT GAT AAA TTT GAT GAA 1876 Glu Gly Tyr Phe Asp Lys Lys Asp Tyr Val Ile Asp Lys Phe Asp Glu 580 585 590 AAC AAT ATG CCT ATA TGG CCT GAA GGT GTT GAT ATA ACA AAA TTG GGT 1924 Asn Asn Met Pro Ile Trp Pro Glu Gly Val Asp Ile Thr Lys Leu Gly 595 600 605 GAT ACC CAG CTT ATT AAA CAG GCT GAT GTT GTT ATG TTA ATG CTT TTG 1972 Asp Thr Gln Leu Ile Lys Gln Ala Asp Val Val Met Leu Met Leu Leu 610 615 620 TTA GGT GAG GAA TTT GAC GAA GAA ACG AAA AGA ATC AAT TAC GAA TAT 2020 Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Glu Thr Lys Arg Ile Asn Tyr Glu Tyr 625 630 635 640 TAT GAA AAG CGA ACT ATG CAC AAA TCT TCA TTA GGT CCC AGC ATG TAT 2068 Tyr Glu Lys Arg Thr Met His Lys Ser Ser Leu Gly Pro Ser Met Tyr 645 650 655 GCC ATT ATG GGG TTA AAA GTA GGG GAC CAC AAA AAC GCA TAT CAG TCT 2116 Ala Ile Met Gly Leu Lys Val Gly Asp His Lys Asn Ala Tyr Gln Ser 660 665 670 TTC ATG AGA AGT GCC AAC GTG GAC CTT GTG GAC AAT CAG GGG AAC ACT 2164 Phe Met Arg Ser Ala Asn Val Asp Leu Val Asp Asn Gln Gly Asn Thr 675 680 685 AAA GAA GGT TTG CAT GCT GCA TCT GCT GGT GGT ACA TGG CAA GTA GTT 2212 Lys Glu Gly Leu His Ala Ala Ser Ala Gly Gly Thr Trp Gln Val Val 690 695 700 GTT TTT GGA TTT GGC GGA ATG GAA ATT GAC AAA GAA GGG GCA TTA AAT 2260 Val Phe Gly Phe Gly Gly Met Glu Ile Asp Lys Glu Gly Ala Leu Asn 705 710 715 720 ATA AAT TCG TGG CTG CCA GAA AAA TGG GAT AAA CTT TCC TAT AAA GTA 2308 Ile Asn Ser Trp Leu Pro Glu Lys Trp Asp Lys Leu Ser Tyr Lys Val 725 730 735 TTT TGG AAA GGC AAT TTA ATA GAG GTG ATT GTT ACA AAA CAG GAA GTG 2356 Phe Trp Lys Gly Asn Leu Ile Glu Val Ile Val Thr Lys Gln Glu Val 740 745 750 ACA GTA AAA AAA TTA AAA GGA AAA GGA AAT ATA AAA GTA AAG GTA AAA 2404 Thr Val Lys Lys Leu Lys Gly Lys Gly Asn Ile Lys Val Lys Val Lys 755 760 765 GGG AAA GAG CTG ACA ATA GAA 2425 Gly Lys Glu Leu Thr Ile Glu 770 775 TAGTCAAAAA GGTATAGGCA GGTGGATAAC CTGCTATACC TTAAAATAAA TTGATTATGT 2485 TTTAAGGGGG GATAAGTGGA GTTAGAGTAA AATTTTAAGT CCTCAATCAG ATATTTTACT 2545 ATAAAATTGT GAAAGGGGAA AGTGGTAATG AGTAAAAAAC TTTCAAGCAT CTTTGTATTG 2605 ACGATCTTTG TATTAGCTAC TGTTTTAGCT GGTTGTTCAT CCAGTAAAAA TAATACTTCC 2665 AGTGCCAATG AGACAAATAC ACAAAAACAA GAGACAGCAA AACCAGTTAC TATAAAATTA 2725 GGCATGTGGT CTTCATCTCC AGCAGAAAAG AAGATAGTGG ATGACCAAAT AGCTAAGTTT 2785 AAAGAAAAAT ATCCAAATAT AGATGTGCAA ATTGAGACAA TTGTGGGAGA TTACATGCAA 2845 AAATTACAAA CAGAACTGGC GTCAAATACA GCACCAGACA TATTCTATCT TGACAGAATG 2905 CCGGCACCAC AGCTTATGTC TTCAGGAGTT TTAGAGCCAT TAGATGATTA TATTAAGAAA 2965 TACAATGTGG ATGTAAATGA TTTCGAGCCA GCATTGCTTT CCGCTTTTCA GTGGGAGGGA 3025 AAAACTTATG GTTTACCAAA GGATTTCAAT ACTCTAGCTT TGTTTTACAA CAAAGACATG 3085 TTTAAAGCGG CTGGAATAAA TGAGCCTCCA AAAACATGGG AGGAATTAAG AGATGTAGCT 3145 AAAAAGTTGA CAAAAGACGG TGTCAAAGGT TTGGTTTTAT CAGCAGACCT TGCAAGATTT 3205 GATGCTTTTA TAAATCAAAA TGGCGGTTCA GTATATCAAG GATGGAAAAG TTACTTTAAA 3265 TCTGCCAGAG AATGCACAAG CTCTTGATTT TTATGTAGGC CTCATTACAA AAGACAAAGT 3325 TACTGACACA CCACAAAACA TGGGAGAAGG CTGGAATGGA GATGCTTTTG CTGCTAAAAA 3385 AGCTGCAATG GCAATAGAAG GTGGCTGGAT GATACCATTC CTCAAAGAAA AAGCTCCTGA 3445 TTTAAACTAT GGTATAGCAG AGCTTCCAGC AGGAAAGCAA AAATCTACAA TGGCTTTCAC 3505 TGTTGCATAT GTGATGAATA AAAACAGCAA ACATAAAGAT GAAGCCTTTA AACTTATTGA 3565 ATTTTTAACC GGTAAAGAAG GACAGCAATT TGTAGTAGAT TCAGGCCTTG CACTTCCATC 3625 GAGAAAGTCT ATGCAAGAAG GATTTAAGGA GAAATATCCT GAAAGAGCTG CCTTTGTAGA 3685 TGGTGCTTCT TATGCGGTAC CATGGCAATT CGGTTTGTAT GGCACAAAGG TAGTAGATGC 3745 GGCTAATAAA GCCTGTGAAG CATTAATAAT GAAGCAAATA AGTAGTGCTC AGCAAGCTCT 3805 TGACAACGCA CAAAAGGAAG TTGGACAATA ATTTAAGTAA GCAGCACCTT ACTAAAATAA 3865 GGTGCTGCAA TTATGATTTT TTAAGGTTGA AGGGAAGGAT GTATTTATGG AAGCTAAAAT 3925 GACTATGAAA AAGAGGTATT TATACGAAGC T 3956

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のコージビオースホスホリラーゼの酵素
活性に及ぼす温度の影響を示す図である。

【図２】本発明のコージビオースホスホリラーゼの酵素
活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。

【図３】本発明のコージビオースホスホリラーゼの安定
性に及ぼす温度の影響を示す図である。

【図４】本発明のコージビオースホスホリラーゼの安定
性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。

【図５】本発明の組換えＤＮＡの制限酵素地図を示す図
である。図中矢印は、本発明のコージビオースホスホリ
ラーゼをコードするＤＮＡを示す。

【表２】

【表２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ２３Ｇ 3/00 １０５ Ａ２３Ｇ 3/00 １０５ 3/30 3/30 Ａ２３Ｌ 1/06 Ａ２３Ｌ 1/06 1/09 1/09 1/236 1/236 1/30 1/30 Ｚ Ａ６１Ｋ 7/00 Ａ６１Ｋ 7/00 Ｆ 7/16 7/16 31/70 31/70 Ｃ０７Ｈ 3/06 Ｃ０７Ｈ 3/06 Ｃ１２Ｇ 3/04 １０１ Ｃ１２Ｇ 3/04 １０１ Ｃ１２Ｎ 9/00 １０１ Ｃ１２Ｎ 9/00 １０１ 9/12 9/12 Ｃ１２Ｐ 19/18 Ｃ１２Ｐ 19/18 // Ａ２３Ｂ 7/10 Ａ２３Ｂ 7/10 Ａ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 無機リン酸及び／又はその塩の存在下で
   コージビオースを分解してＤ−グルコースおよびβ−Ｄ
   −グルコース−１リン酸及び／又はその塩を生成する作
   用を有するコージビオースホスホリラーゼ。
2. 【請求項２】 β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又
   はその塩とＤ−グルコースとからコージビオースと無機
   リン酸及び／又はその塩を生成し、さらに、β−Ｄ−グ
   ルコース−１リン酸及び／又はその塩を糖供与体とし
   て、他の糖質にグルコシル基の転移を触媒する作用を有
   する請求項１記載のコージビオースホスホリラーゼ。
3. 【請求項３】 下記の理化学的性質を有する請求項１又
   は２記載のコージビオースホスホリラーゼ。 （１） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、８３，０００±５，０００
   ダルトン。 （２） 至適温度 ｐＨ５．５、３０分間反応で６５℃付近。 （３） 至適ｐＨ ６０℃、３０分間反応でｐＨ５．５付近。 （４） 温度安定性 ｐＨ５．５、１時間保持の条件で６５℃付近まで安定。 （５） ｐＨ安定性 ４℃、２４時間保持の条件でｐＨ約５．５乃至１０．
   ０。
4. 【請求項４】 部分アミノ酸配列として配列表における
   配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列の１又は複数を含
   む請求項１、２又は３記載のコージビオースホスホリラ
   ーゼ。
5. 【請求項５】 配列表における配列番号４に記載のアミ
   ノ酸配列を含む請求項１、２、３又は４記載のコージビ
   オースホスホリラーゼ。
6. 【請求項６】 遺伝子を発現させて得ることのできる請
   求項１、２、３、４又は５記載のコージビオースホスホ
   リラーゼ。
7. 【請求項７】 請求項１乃至６記載のコージビオースホ
   スホリラーゼをコードするＤＮＡ。
8. 【請求項８】 配列表における配列番号５に記載の塩基
   配列又はその塩基配列に相補的な塩基配列を含む請求項
   ７記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 遺伝子の縮重に基づき、コードするアミ
   ノ酸配列を変えることなく塩基の１又は複数を他の塩基
   で置換した請求項７又は８記載のＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 自律複製可能なベクター内に挿入され
    た請求項７、８又は９記載のＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 適宜の宿主に導入された請求項７、
    ８、９又は１０記載のＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 請求項１乃至６記載のコージビオース
    ホスホリラーゼ産生能を有する微生物を栄養培地に培養
    し、培養物から産生したコージビオースホスホリラーゼ
    を採取することを特徴とするコージビオースホスホリラ
    ーゼの製造方法。
13. 【請求項１３】 微生物がサーモアナエロビウム属に属
    する微生物である請求項１２記載のコージビオースホス
    ホリラーゼの製造方法。
14. 【請求項１４】 微生物がサーモアナエロビウム属に属
    するサーモアナエロビウム・ブロッキイである請求項１
    ２又は１３記載のコージビオースホスホリラーゼの製造
    方法。
15. 【請求項１５】 微生物が請求項１乃至６記載のコージ
    ビオースホスホリラーゼをコードするＤＮＡを適宜の宿
    主に導入してなる形質転換体である請求項１２、１３又
    は１４記載のコージビオースホスホリラーゼの製造方
    法。
16. 【請求項１６】 生成したコージビオースホスホリラー
    ゼを透析、塩析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換ク
    ロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着
    クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相
    クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
    ー、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動により採取
    する請求項１２、１３、１４又は１５記載のコージビオ
    ースホスホリラーゼの製造方法。
17. 【請求項１７】 請求項１乃至６記載のコージビオース
    ホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／
    又はその塩とそれ以外の糖質とに作用させるグルコシル
    転移糖含有糖質の製造方法。
18. 【請求項１８】 β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／
    又はその塩が、無機リン酸及び／又はその塩の存在下で
    コージビオースにコージビオースホスホリラーゼを作用
    させるか、または無機リン酸及び／又はその塩の存在下
    でマルトースにマルトースホスホリラーゼを作用させる
    か、または無機リン酸及び／又はその塩の存在下でトレ
    ハロースにトレハロースホスホリラーゼを作用させるこ
    とにより生成したものである請求項１７記載のグルコシ
    ル転移糖含有糖質の製造方法。
19. 【請求項１９】 それ以外の糖質がＤ−グルコース、Ｌ
    −ソルボース、マルトース、コージビオース、トレハロ
    ース及びスクロースから選ばれる糖質である請求項１７
    又は１８記載のグルコシル転移糖含有糖質の製造方法。
20. 【請求項２０】 反応液中に生成及び／又は残存するグ
    ルコシル転移糖以外の夾雑糖質を除去する手段として、
    酵母発酵法及びカラムクロマトグラフィーから選ばれる
    方法を含む請求項１７、１８又は１９記載のグルコシル
    転移糖含有糖質の製造方法。
21. 【請求項２１】 請求項１乃至６記載のコージビオース
    ホスホリラーゼを無機リン酸及び／又はその塩の存在下
    でマルトースにマルトースホスホリラーゼとともに作用
    させるか、または無機リン酸及び／又はその塩の存在下
    でトレハロースにトレハロースホスホリラーゼとともに
    作用させることを特徴とするコージビオースの製造方
    法。
22. 【請求項２２】 請求項１７、１８、１９又は２０記載
    のグルコシル転移糖含有糖質の製造方法によって製造さ
    れたグルコシル転移糖含有糖質。
23. 【請求項２３】 グルコシル転移糖が、コージビオー
    ス、グルコシルソルボース、コージビオシルグルコー
    ス、コージトリオース、コージビオシルグルコシド又は
    コージビオシルフラクトシドである請求項２２記載のグ
    ルコシル転移糖含有糖質。
24. 【請求項２４】 請求項２２又は２３記載のグルコシル
    転移糖含有糖質を含有する組成物。
25. 【請求項２５】 組成物が、飲食物、化粧品、医薬品又
    は成形物であることを特徴とする請求項２４記載の組成
    物。
26. 【請求項２６】 α−Ｄ−グルコシル（１→５）−Ｌ−
    ソルボースで表されるグルコシルソルボース。
27. 【請求項２７】 α−Ｄ−グルコシル（１→２）α−Ｄ
    −グルコシル（１→２）β−Ｄ−フラクトシドで表され
    るコージビオシルフラクトシド。