JPH10313864A - アスペルギルス属の新規プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は、アスペルギルス（Aspergillus）属
糸状菌の新規プロモーターを提供する。 【構成】アスペルギルス・オリゼのピルベート・デカル
ボキシラーゼ(Pyrvatedecarboxylase)遺伝子、フルクト
ース-６-ビスホフェート・アルドラーゼ(Fructose-bisp
hosphate aldolase)遺伝子、ピルベート・デヒドロゲナ
ーゼ(Pyrvatedehydrogenase)遺伝子、ピルベート・キナ
ーゼ(Pyrvate kinase)遺伝子、グルコース-６−ホスフ
ェート・イソメラーゼ(Glucose 6-phosphate isomeras
e)遺伝子又はグリセルアルデヒド−３−ホスフェート・
デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydr
ogenase)遺伝子のプロモーター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術】本発明は、アスペルギルス（Aspe
rgillus）属糸状菌の新規プロモーターに関する。更に
詳細には、本発明はアスペルギルス・オリゼ由来の新規
プロモーター配列をクローニングし、アスペルギルス属
糸状菌を宿主として有用蛋白質およびペプチドを発現さ
せるために必要なＤＮＡ断片を有するプラスミドと、そ
れを用いた有用蛋白質およびペプチドの製造法に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】糸状菌は、デンプン、蛋白質、脂質、セ
ルロース等を加水分解する各種加水分解酵素をはじめ多
くの有用酵素を菌体外に多量に分泌するため、古くより
これら有用酵素の給源として利用されてきた。従って、
糸状菌に関する培養法、生成物蛋白質の分離精製法など
の発酵技術の古い歴史と研究成果の裏付けがあり、多く
の菌株の安全性が広く認知されている。また、真核生物
であるが故に哺乳動物などの高等生物と同様に蛋白質の
糖鎖付加機構を有している。

【０００３】これらの理由により、糸状菌を異種蛋白質
の高生産用宿主として利用することが期待されていた。
遺伝子工学技術においては、目的とする蛋白質の生産量
は、プロモーター、ターミネーターなどの転写に関わる
因子、アミノ酸コドンの種類など翻訳に関わる因子、蛋
白質への糖鎖付加、発現した蛋白質の細胞内での存在様
式（分泌過程における移動も含む）などの翻訳後に関わ
る因子、遺伝子のコピー数の因子、宿主由来のプロテア
ーゼなど発現蛋白質の安定性に関わる因子など多くの因
子により影響を受ける。これらのうちもっとも重要であ
り制御しやすい因子は、プロモーターの選択である。

【０００４】この見地から、糸状菌における強力なプロ
モーターを利用した例は、たとえばアスペルギルス・ニ
ガー由来のグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター［Bi
otechnology, 5, 368（1987）］、トリコデルマ・リー
セイ由来のセロビオハイドロラーゼＩ遺伝子のプロモー
ター［Biotechnology, 7, 596（1989）］、アスペルギ
ルス・オリゼ由来のα-アミラーゼ遺伝子のプロモータ
ー［Biotechnology, 6,1419（1988）］（特開昭62-2729
88）、アスペルギルス・ニドランス由来のアルコールデ
ヒドロゲナーゼＩ遺伝子のプロモーター［Biotechnolog
y, 5, 713（1987）］、アスペルギルス・オリゼ、アス
ペルギルス・ニガーのグリセルアルデヒド−３−ホスフ
ェイト デヒドロゲナーゼ（GAP-DH）のプロモーターを
利用して異種蛋白質の製造（特開平3-187392）の場合な
どがある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明はアスペルギル
ス・オリゼ由来の新規なプロモーターを得、この発現系
を使用して異種蛋白質を製造する方法を提供することに
ある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は上記目的を
達成するために鋭意研究し、アスペルギルス・オリゼか
ら新規なプロモーター配列をクローニングすることに成
功し、本発明を完成した。即ち、本発明によりアスペル
ギルス・オリゼ由来の新規なプロモーターが提供され、
それを使用する点で新規なものである。

【０００７】本発明においては、以下のようにして上記
の目的を達することが出来た。例えば、グルコース存在
下で強く発現する遺伝子の同定と単離は、以下のように
してできる。

【０００８】糸状菌をグルコースを唯一の炭素源とした
培地で培養し、得られた菌体からポリＡ付加ＲＮＡを取
得する。このポリＡ付加ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成
し、適当なベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを構
築する。

【０００９】このライブラリーの中から独立したクロー
ンを無作為に多数、例えば500個選別（約8,000遺伝子で
構成されている麹菌であれば約500個で推定できると考
えられる。）し、プラスミドＤＮＡを抽出して約800bp
の塩基配列を解析する。

【００１０】こうして得られた塩基配列は、各ｃＤＮＡ
のコード領域を５’末端領域の塩基配列を含み、ＤＮＡ
塩基配列データベースに対して相同性解析を行うことに
より、含まれる遺伝子を推定する。さらに、全ての塩基
配列間で総当たりで相同性検索を行うことにより、それ
ぞれのｃＤＮＡの頻度解析を行い、培地中のグルコース
存在下で強く発現している遺伝子を同定することができ
る。

【００１１】次に、この様にして同定したグルコース存
在下で強く発現している遺伝子のプロモーターの単離
は、通常よく用いられる方法、即ち上記で得られた各ｃ
ＤＮＡをプローブにして遺伝子ライブラリーからスクリ
ーニングすること等により成し遂げられるし、或いはＰ
ＣＲ（Polymerase chain reaction）を用いる方法によ
っても成し遂げられる。

【００１２】ＰＣＲを用いる方法の一例として、以下の
方法を用いることが出来る。糸状菌からゲノムＤＮＡを
抽出してＥｃｏＲＶ、ＳｃａＩ、ＤｒａＩ、ＰｖｕＩＩ
あるいはＳｓｐＩ等の６ｂｐを認識して平滑末端に切断
するそれぞれの制限酵素で完全消化し、そのゲノムＤＮ
Ａ断片の両端に適当なアダプターを連結する。

【００１３】この両端にアダプターが連結されたゲノム
ＤＮＡ断片を鋳型として、ｃＤＮＡの塩基配列から合成
したプライマーおよびアダプターの一本鎖部分の配列を
有するプライマーを用いてＰＣＲを行う。増幅産物を電
気泳動で確認して１〜２ｋｂｐ程度の長さを有するＤＮ
Ａ断片を電気泳動によって単離・精製し、適当なクロー
ニングベクターに連結して大腸菌にクローニングする。

【００１４】数個の独立したクローンからプラスミドを
調製してクローニングしたＤＮＡ断片の両末端の塩基配
列を解析し、ｃＤＮＡと相同な塩基配列を有しｃＤＮＡ
の上流に位置するＤＮＡ断片をこのｃＤＮＡ由来の遺伝
子のプロモーターと判断する。

【００１５】プロモーター領域を有するＤＮＡ断片のう
ち、翻訳開始コドンより上流１ｋｂｐ程度以上を有する
ＤＮＡ断片を選別し、全塩基配列を決定し、グルコース
存在下で強く発現している遺伝子のプロモーターの単離
を行うことが出来る。上述した工程を図１に示す。

【００１６】本発明のプロモーターは上述のようにして
決定された塩基配列に対してストリンジェントな条件、
例えば、0.1％ SDS（60℃、0.3mol NaCl、0.03Ｍ クエ
ン酸ソーダ）でハイブリダイズする塩基配列をも包含す
る。

【００１７】本発明のプロモーターは、その下流に、所
望の有用タンパク質遺伝子を連結してベクターを構築
し、該ベクターで宿主を形質転換し、それを培養するこ
とにより、有用タンパク質を著量生産させることができ
る。

【００１８】宿主としては、アスペルギルス・オリゼを
はじめ、その他のアスペルギルス属、ノイロスポラ属、
ペニシリウム属、トリコデルマ属などの微生物が使用で
きる。特に、発現効率の点から、宿主として、アスペル
ギルス・オリゼを用いることが好ましい。

【００１９】得られたプロモーターへの有用タンパク質
遺伝子の連結、ベクターへの挿入は、それ自体公知の方
法で行うことができる。有用タンパク質遺伝子として
は、特に限定するものではない。また、ベクターとして
は、アルギニン要求性などの栄養要求性相補遺伝子、ア
セトアミド資化などの炭素、窒素源資化遺伝子、オリゴ
マイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。

【００２０】宿主の形質転換も自体公知の方法で行うこ
とができる。また、該形質転換体の培養も常法に従っ
て、所望のタンパク質に適した培地、培養条件を適宜選
択することにより行うことができ、得られたタンパク質
の採取、精製も公知の方法で行うことができる。

【００２１】以下、実施例を参照しながら本発明を詳細
に説明するが、実施例に使用したプラスミドなどは一例
として挙げたものであり、本発明に使用できるものであ
ればこれらに限定されるものではない。

【００２２】

【実施例】実施例１ グルコース存在下で高発現する遺伝子の同定 (1) 菌体の取得 アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ATCC 4
2149を以下の培養条件で培養した。ＹＰＤ培地（酵母エ
キス１％、ポリペプトン２％及びグルコース２％よりな
る培地（pH6.0）に本菌株を接種し、30℃において22時
間通気攪拌培養し、菌体をろ過して得た。得られた湿菌
体４ｇを液体窒素中で凍結し、そのまま、液体窒素及び
海砂を入れた乳鉢に移し、乳棒で微細な粉末とした。

【００２３】(2) ｃＤＮＡライブラリーの作製 シグイン（Chigwin）等の方法〔バイオケミストリー（B
iochemistry）、18巻、5294頁（1979）〕に従って4.6mg
の全ＲＮＡを得た。その後、オリゴ（dT）セルロース・
カラム（ファルマシア社）に供し、1.4mgの全ＲＮＡか
ら30μgのポリＡ付加ＲＮＡ画分を得た。

【００２４】このポリＡ付加ＲＮＡを用いて、ＮｏｔＩ
制限酵素切断部位を含むプライマー（5'-TTCTAGAATTCAG
CGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'：ここで
VはA,C,Gの混合、NはA,C,G,Tの混合を表す）及びMMLVリ
バーストランスクリプターゼ(RNaseH^-)（クロンテッ
ク）[逆転写酵素]を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、さ
らにE.coli DNA polymerase I（クロンテック）、E.col
i DNA ligase（クロンテック）およびE.coli RNase H
（クロンテック）により、両端が平滑化された二本鎖の
ｃＤＮＡとした。

【００２５】ｃＤＮＡ分離用カラム（クロンテック）を
用いたゲル濾過により短鎖ｃＤＮＡを除去した後、Ｅｃ
ｏＲＩ制限酵素切断部位を含むアダプター（5'-AATTCGG
CACGAGG-3'及び5'-CCTCGTGCCG-3'）を連結した。

【００２６】こうして得られたｃＤＮＡ断片は、Ｎｏｔ
Ｉ制限酵素で完全消化した後、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ
Ｉ制限酵素で消化したプラスミドベクターｐＵＣ１９に
連結した。このプラスミドを大腸菌に形質転換すること
により、ほぼ完全長のｃＤＮＡを含む大腸菌ｃＤＮＡラ
イブラリーを構築した。

【００２７】(3) 高発現する遺伝子の探索 このライブラリーの中から独立したクローンを無作為に
５００個選別し、プラスミドＤＮＡを抽出して、Ｍ１３
ユニバーサルプライマー（5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-
3'）、Taq ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー
社）、ＤＮＡサーマル・サイクラー（パーキン・エルマ
ー社）及びＤＮＡシークエンサー（ＬＩ−ＣＯＲ社、モ
デル4000L）を用いたサイクル・シークエンス法により
約800bpの塩基配列を解析した。

【００２８】こうして得られた塩基配列は、各ｃＤＮＡ
の５’末端領域の塩基配列を含んでいる。GenBank Ｄ
ＮＡ塩基配列データベースに対して、BLASTXを用いて相
同性解析を行うことにより、含まれる遺伝子を推定し
た。

【００２９】さらに、Sequencher（GeneCodes社）を用
いて全ての塩基配列間で総当たりで相同性検索を行うこ
とにより、それぞれのｃＤＮＡの頻度解析を行い、培地
中のグルコース存在下で強く発現している遺伝子のリス
トを作製した。

【００３０】

【表１】

【００３１】表中においては、以下のように示す。 score ：ランタ゛ムに選んだ500のcDNA配列解析での出現頻
度 Source ：GenBankデータベースに対するホモロジーサー
チでヒットしたもの Sc=Saccharomyces cerevisiae Ao=Aspergillus oryzae An=Aspergillus nidulans Sp=Schizosaccharomyces pombe

【００３２】その結果、グルコース存在下で強く発現し
ている遺伝子としてピルベート・デカルボキシラーゼ(P
yrvate decarboxylase)遺伝子、フルクトース-６-ビス
ホスェート・アルドラーゼ(Fructose-bisphosphate ald
olase)遺伝子、ピルベート・デヒドロゲナーゼ(Pyrvate
dehydrogenase)遺伝子、ピルベート・キナーゼ(Pyrvat
e kinase)遺伝子、グルコース-６−ホスフェート・イソ
メラーゼ(Glucose 6-phosphate isomerase)遺伝子、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナー
ゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)遺伝子
を新たに発見した。

【００３３】実施例２ ピルベート・デカルボキシラー
ゼのｃＤＮＡに対応するのプロモーター領域の取得 Aspergillus oryzae RIB-40株（ATCC 42149）からティ
ンバレークとバーナード（Timberlake and Bernard）の
方法に従って得たゲノムＤＮＡを、６ｂｐを認識して平
滑末端に切断するＤｒａＩで完全消化し、(P)5'-ACCTGC
CC-3'(NH2)および5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC
CGCCCGGGCAGGT-3'からなるアダプターを連結した。

【００３４】このゲノムＤＮＡ断片を鋳型とし、センス
プラーマーとしてアダプターの一本鎖部分の配列を有す
るプライマーＡＤ（5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'）
を、アンチセンスプライマーとしてピルベート・デカル
ボキシラーゼｃＤＮＡの塩基配列から合成したプライマ
ー＃１（5'-TCTGTCGCCATTGTAAGGACTCAG-3'）を用いてＰ
ＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、Expand HF（ベーリンガ
ー・マンハイム社）を用い、ＤＮＡサーマル・サイクラ
ー（パーキン・エルマー社）により行った。反応溶液の
組成は以下の通りである。

【００３５】 （終濃度） H₂O 20.25 μｌ [10×]Reaction buffer 2.5 μｌ ［１×］ dNTPs, Mix 10 mM 0.5 μｌ 200 μＭ センスプライマー(フ゜ライマーAD) 0.25 μｌ 5 μＭ アンチセンスプライマー(フ゜ライマー#1) 0.25 μｌ 5 μＭ ＊template(DNA 0.2μg) 1 μｌ Expand HF DNAポリメラーゼミックス 0.25 μｌ 1.25ｕ／TEST 25 μｌ ＊EcoRV分解したＤＮＡを0.2μg／10μｌになるようにＴＥでとかしたもの

【００３６】上記の反応液25μｌを0.2ｍｌ反応チュー
ブ中で混合してＤＮＡ Thermal Cyclerにセットし、以
下のような温度設定によりステップダウンＰＣＲを行っ
た。

【００３７】 95℃、1分 1サイクル 95℃、30秒 74℃、15秒 70℃、3分 3サイクル 95℃、30秒 70℃、15秒 70℃、3分 3サイクル 95℃、30秒 66℃、15秒 70℃、3分 3サイクル 95℃、30秒 62℃、15秒 70℃、3分 3サイクル 95℃、30秒 58℃、15秒 70℃、3分 3サイクル 95℃、30秒 54℃、15秒 70℃、3分 20サイクル

【００３８】増幅産物を1.5％アガロース・ゲル電気泳
動で確認して1.6ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮ
Ａ断片をアガロース・ゲル中より単離・精製し、ＴＡク
ローニングベクターｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社）
に連結して大腸菌にクローニングした。

【００３９】そのクローンからプラスミドを調製してク
ローニングしたＤＮＡ断片の両末端の塩基配列を解析
し、本ＤＮＡ断片がピルベート・デカルボキシラーゼｃ
ＤＮＡと相同な塩基配列及びその上流に翻訳開始コドン
より上流1588bpのＤＮＡ領域を含むことを確認した。

【００４０】この様にして、1588bpのピルベート・デカ
ルボキシラーゼ遺伝子のプロモーターを取得した。その
全塩基配列を決定し、配列番号：１に示す。

【００４１】実施例３ フルクトース-６-ビスホフェー
ト・アルドラーゼのｃＤＮＡに対応するのプロモーター
領域の取得 実施例２と同様にして、フルクトース-６-ビスホフェー
ト・アルドラーゼ遺伝子のプロモーターを取得した。こ
の場合、アスペルギルスオリゼのゲノムＤＮＡを完全消
化する際に、６ｂｐを認識して平滑末端に切断する制限
酵素としてＳｃａＩを用いた。

【００４２】また、アンチセンスプライマーとして、フ
ルクトース-６-ビスホフェート・アルドラーゼｃＤＮＡ
の塩基配列から合成したプライマー＃２（5'-ATGACACCA
GTCTTGCGGGAAAGC-3'）を用いた。こうして得られた1092
bpのフルクトース-６-ビスホフェート・アルドラーゼ遺
伝子のプロモーターの全塩基配列を配列番号：２に示
す。

【００４３】実施例４ ピルベート・デヒドロゲナーゼ
のｃＤＮＡに対応するのプロモーター領域の取得 実施例２と同様にして、ピルベート・デヒドロゲナーゼ
遺伝子のプロモーターを取得した。この場合、アスペル
ギルスオリゼのゲノムＤＮＡを完全消化する際に、６ｂ
ｐを認識して平滑末端に切断する制限酵素としてＰｖｕ
ＩＩを用いた。

【００４４】また、アンチセンスプライマーとして、ピ
ルベート・デヒドロゲナーゼｃＤＮＡの塩基配列から合
成したプライマー＃３（5'-CACCACCTTCCGTAGCATAGCCCC-
3'）を用いた。こうして得られた2572bpのピルベート・
デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの全塩基配列を
配列番号：３に示す。

【００４５】実施例５ ピルベート・キナーゼのｃＤＮ
Ａに対応するのプロモーター領域の取得 実施例２と同様にして、ピルベート・キナーゼ遺伝子の
プロモーターを取得した。この場合、アスペルギルスオ
リゼのゲノムＤＮＡを完全消化する際に、６ｂｐを認識
して平滑末端に切断する制限酵素としてＳｃａＩを用い
た。

【００４６】また、アンチセンスプライマーとして、ピ
ルベート・キナーゼｃＤＮＡの塩基配列から合成したプ
ライマー＃４（5'-CCCCGACCGATGAACGAGGCAAAG-3'）を用
いた。こうして得られた845bpのピルベート・キナーゼ
遺伝子のプロモーターの全塩基配列を配列番号：４に示
す。

【００４７】実施例６ グルコース-６−ホスフェート
・イソメラーゼのｃＤＮＡに対応するのプロモーター領
域の取得 実施例２と同様にして、グルコース-６−ホスフェート
・イソメラーゼ遺伝子のプロモーターを取得した。この
場合、アスペルギルスオリゼのゲノムＤＮＡを完全消化
する際に、６ｂｐを認識して平滑末端に切断する制限酵
素としてＤｒａＩを用いた。

【００４８】また、アンチセンスプライマーとして、グ
ルコース-６−ホスフェート・イソメラーゼｃＤＮＡの
塩基配列から合成したプライマー＃５（5'-GAGGAGAGCAG
AGTGGTAAACAGC-3'）を用いた。こうして得られた1717bp
のグルコース-６−ホスフェート・イソメラーゼ遺伝子
のプロモーターの全塩基配列を配列番号：５に示す。

【００４９】実施例７ グリセロアルデヒド-３−ホス
フェート・デヒドロゲナーゼのｃＤＮＡに対応するのプ
ロモーター領域の取得 実施例２と同様にして、グリセロアルデヒド-３−ホス
フェート・デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターを取
得した。この場合、アスペルギルスオリゼのゲノムＤＮ
Ａを完全消化する際に、６ｂｐを認識して平滑末端に切
断する制限酵素としてＳｓｐＩを用いた。

【００５０】また、アンチセンスプライマーとして、グ
リセロアルデヒド-３−ホスフェート・デヒドロゲナー
ゼｃＤＮＡの塩基配列から合成したプライマー＃６（5'
-ATCTTCTTGCCGTTGACGATGAGG-3'）を用いた。こうして得
られた1042bpのグリセロアルデヒド-３−ホスフェート
・デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの全塩基配列
を配列番号：６に示す。

【００５１】実施例８ ピルベート・デカルボキシラー
ゼ遺伝子プロモーターによる大腸菌由来β-グルクロニ
ダーゼのアスペルギルス・オリゼでの発現 (1) 大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝子発現カセッ
トの構築 実施例２で取得した1.6 kbのDNA断片を鋳型にして、PCR
によりピルベート・デカルボキシラーゼ遺伝子プロモー
ターを含む1.0 kbのDNA断片を得た。PCR反応に用いたプ
ライマーは、 センスプライマー：5'-GTCGACATGCCAGCTTTGCCATTTTGAT-
3' アンチセンスプライーマー：5'-GTCGACTGTAAGGACTCAGTA
AGAGG-3' であった。

【００５２】この断片を制限酵素Sal 消化後、大腸菌由
来β-グルクロニダーゼ遺伝子を有するプラスミドpBRJ2
75（4.5 kb、クロンテック社）のSalI部位に挿入し、転
写方向が順方向に挿入されたプラスミドpBRJPP（5.5 k
b）を得た。

【００５３】次に、アスペルギルス・オリゼのエノラー
ゼ遺伝子を含む2.9-kb BglII断片（Biosci. Biotech. B
iochem., 60巻161-163頁,1996）からエノラーゼ遺伝子
のターミネーター領域0.6-kb EcoRV-HindIII断片をpBlu
escript（ストラタジーン社）のEcoRV-HindIII部位にサ
ブクローニングし、プラスミドpBET(3.6 kb)を得た。

【００５４】プラスミドpBRJPPからピルベート・デカル
ボキシラーゼ遺伝子プロモーターとそれに続く大腸菌由
来β-グルクロニダーゼ遺伝子を含む2.8-kb PstI-EcoRI
断片を取得し、これをプラスミドpBETのPstI-EcoRI部位
に挿入して、大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝子発
現カセットを含むプラスミドpBPPETG(6.4 kb)を得た。

【００５５】(2) 大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝
子発現カセットをアスペルギルス・オリゼへ導入するた
めのプラスミドの構築 プラスミドpBPPETGから制限酵素PstI及びHindIII消化に
より、3.4-kbの大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝子
発現カセットを取得して、アスペルギルス・オリゼの形
質転換マーカーとしてniaD遺伝子を有するプラスミドpN
３（特開昭62-45777）のPstI-HindIII部位に挿入し、本
発現カセットをアスペルギルス・オリゼへ導入するため
のプラスミドpNPPETG（11.6 kb）を構築した。

【００５６】(3) 大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺伝
子のアスペルギルス・オリゼでの発現 プラスミドpBPPETGをUnkels らの方法（Mol. Gen. Gene
t., 218巻 99-104頁,1989）に従ってアスペルギルス・
オリゼniaD欠損株AO1.1に導入した。得られた形質転換
体を３％グルコース及び50μg/ml ５-ブロモ-４-クロロ
-３-インドール-β-Ｄ-グルクロニドを含むCzapek-Dox
プレート上で30℃で10日間培養したところ、コロニーが
青色を呈した。対照として得た形質転換マーカーのみを
有するプラスミドpN3由来の形質転換体は青色を呈しな
かった。このことは大腸菌由来β-グルクロニダーゼ遺
伝子がアスペルギルス・オリゼで発現し、発現したβ-
グルクロニダーゼ酵素が基質５-ブロモ-４-クロロ-３-
インドール-β-Ｄ-グルクロニドに作用したことを示
す。

【００５７】青色を示した形質転換体の１つを栄養培地
で生育させ集めた菌体を洗浄後、３％グルコースを含む
Czapek-Dox培地で８時間培養し、得られた菌体の無細胞
抽出液中のβ-グルクロニダーゼ活性をJeffersonらの方
法（Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 83巻、8447-8451,
1986年）で測定したところ、比活性は80 nmol p-ニト
ロフェノール/min/mg-蛋白質であった。これに対し、pN
3由来形質転換体は、＞1 nmol p-ニトロフェノール/min
/mg-蛋白質であった。

【００５８】

【発明の効果】本発明により、アスペルギルス・オリゼ
由来の新規なプロモーターが提供され、当該プロモータ
ー配列を含むベクターにより形質転換されたアスペルギ
ルス属糸状菌における外来蛋白質の生産が可能である。

【００５９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１５８８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アスペルギルス・オリゼ 配列の特徴 特徴を示す記号：promotor 配列 AAAATCTCAC GCGCAAAAGC CTCTAAATCA ACACTGAGGG TCTTTCGGAT AGATTTGACA 60 GGCGTCATTC GTTGGATGTA TCGGCTTCTC TTCCTGTCTG GGTTGGCATG CGCGTCCACG 120 CAGATCTGAT GGACGAGCTT CTCGGGATCA ATCGACTTAT CGAATCGTAT AAACGATACT 180 AAGTAAGATT TAGTCCTAGT CGTGTCATCT TTAGATAGGG TTAAAAGCAT CTACAAACCA 240 CACGGAATGT CTAGCCTGAT GGCCTGAAAC TGACGAGGCT TGGCCGAGCT AGGCTTCAGC 300 CCTGCGACTT CTTTTCTGAT TTGGGCTTCG ATATCATCCT CGTCCTCCGA ACCGGAGTCA 360 CCATCTTGAC CCCCCGCTTC TGGCGTTTCG ATGCTCTGGT GCACAGGGCA TATGTCAGCC 420 GCACAATTGA AGAGCCCGGA AGATTGCCTC AAAGCACAAC ATCTTCCTGG TCAAAGTTTC 480 TCTCATAGAG CGGCACTGAC CTGGGAGAAG AGATCAAGCA CCTCCGAGAT ACATTTCCCT 540 TCCTTTCCTA TTTCGCAAGT TACAAAAACC CCCCAATCTC CACTTTCAAT GCCAGCTTTG 600 CCATTTTGAT GCTTATGCCA ATTACCGCCT CCCTGTAACA CACATATTAG ATCTCCTGAC 660 TACTGGGGCA ATACAATGGA AAGACGAAGG AAAACATTCG GATGATCATT GGGTCGAGCT 720 CGCCGAGAGT CAGAGCAAAA GTAGGCCAAC CTTTCTTTTT TTGGAGGACT GAGATGAGTT 780 GTCCGGCATG CTCCTTTTTC CTGTTCCCGC CATTCACGGA TGTAGTCCGA GTCAAATTTA 840 GGTAGTGGTG CCGTCTTTTC CCGGCAGGGA TAGTTTCTAA AAAAAAGTTA AGGTTGCTGG 900 ATGTTTGCAC GGGTTTGGTC AGATAAACAC ATCAATATGC TAGTATCTGA TGCCGTTTCG 960 CCGCTGTGCG GTCTTCCCTG GAAATTCTCG ATTATCATTG GCATGGCGGC AACGCCGCGG 1020 GGCTGTCGAG ACGTCCACAT TCGGTTTAGT GGAAGAATAT CATCCCATCC GTATCGGGTG 1080 GGGTGGGCTG ACTGTCACGC CAGCGACTCG GAGCCTCGGG TTCGTCGGCA TGAAGTACCA 1140 GGGATATACT TCTAAAACAC CTGCAGTGAT CAGGTAGATC CCGATATAGA CTATCTTCCA 1200 ACCATCGGCC CATTCTCCAT TGTGTTGGGT CGCAAGTGTT CTTCACCGTG AACCACCCTG 1260 GGCATAGCCT AGACACTTTG TATTTCTTTT ACCGCCGTCC TTAACTACAT TGTGACCTTA 1320 ACTATGACAG CCGGTGGCTG ACTGTATTGT AAGCTTGTAA TTTTGGCGTA CTATCTGTAC 1380 TATCTACCCA TGACATCACG TTATCATGAC GTATGGCCTG GTCTTACTGT TGCACGTCGA 1440 GTTGTACAGG ACATTCTGTA TTCACTACTA TATAACTGCC CCCCCTTGTC CATGTTTCCA 1500 GGAAGAATTC AGTATCCAAC AATCCATAAC AACAACCTTA TCATCTACTA TACCTTCCAT 1560 TTTCCATTCC TCTTACTGAG TCCTTACA 1588

【００６０】配列番号：２ 配列の長さ：１０９２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アスペルギルス・オリゼ 配列の特徴 特徴を示す記号：promotor 配列 ACTATTTTGA GATCCGGAAT ATAACAACAC CGACTGCGTG AAGCTTCCCC ACCTTTTTCA 60 ATTTTAGTAT TATGACTATT TTCTTTTTTA GGGTCAGCTG AGCAGGGACA AGAGGGCCTA 120 GACATAAAAA GACGCAAAGG ACAGAAAGAT GCCGAACGAG TTGGAAAGGA AAGAACGGGT 180 ACGGGGATGA GATCTCCGCC GATTTCCCCG ATGTTTGGCT ATAGCACGAA AGAAATACGG 240 AGAGGGAATG GGTCAATCTT TTAGCAGGAG GGGAGAACCC CAGATTCGCG CAACAACAAC 300 ATCACAATTC AAATTTGTCA TGTTGTGTTT ATGAACCGGT TAATGAGGGT ATCCAGCACG 360 GGGGTTGAAG GTGGATCTCA TACAGGAGAA TTATTATCTA TTTTCTAATT TCTACACTGC 420 ATGAATGGCA TGTCATAGGT GTTTCGGGTC CATGGAAGAA GAGAAGGTGA TGATGTCATG 480 TGATGGCGGG GATTTTCGGG AGGCGCCTGG GTCCTGTTGG GCCTGAGGCA GCAACCAGCG 540 TCATCGTTGA ACCCCACCAA ACAAGTCCAA GTCGTCACGG GAAGAAAAGG GAAGAAGGAC 600 ACGAACTTCC ATCCATTACC CTCGGGCACT GGGAAATGAC TAACTAAATA CTACTTCTTC 660 TGCCTTGTTT CTCGGCTTCT TCTTCTTTCT CCTTTTTTCC CTTTTTCTTA TATATCATCA 720 TAACCCCCGC CTCTTCTTCT TTCCCCTCCC CTCCAATTCT CAGCATCACG CCAGCAACCG 780 GTCAGTGAAA TCATACTGAT ACCATCCGTT CCCCACTACC CGGTGAGTTC TTTCGAGTGC 840 TGTTGCCCCT CCATTAGTGG CTCAGCTGCC CCTCCTCGTC CCTCCCTTTG CCAATGACAC 900 TTTTATTAAA TCCCCTGCTC CGTATTCGTC GTTCGGTAAA GATCCTTAGT TCGGAAGCTC 960 CTACAGAACT TATTTCTAGC TGTTCACTTC CTCCTCCATC CTTTCCTTCT CCTCTTCCAT 1020 TTCTTCTCCC AAACTAATCC AATTCCTAGT CGAGTAAGAC CAGCTATCTG ATCGAATCTT 1080 TCAACTATCA CA 1092

【００６１】配列番号：３ 配列の長さ：２５７２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アスペルギルス・オリゼ 配列の特徴 特徴を示す記号：promotor 配列 CTGACTCGAG CGGGCAAATT CAAAGACATC CCCGTGGAGG AAATAAAATG GGCATGGGAC 60 ACAGACGGTG CGGCGCTCAC CTCTGGTGTG CAGGAAACTT TGAGTGGCTA TCGCAGTGGA 120 AAGGGCCTGC TCAAGTACGA AGGCGGAGAC TGAAACTTTG CGGTGGTCGT GTGTCAAATG 180 ATGCTTATGT CTACTTACAA TTGCGCAGAA CGATTGAGCT AAGACGCAGT AAAGTAACGA 240 CAGTAGAAAG GGCCATTTCC TGCAATACTT CAAACTTCCT TACAACTCCA GTTGTCCTTG 300 ACCCAATCCA AAATCAGATC CGTTAATGTC GTAGCCGGCA TATACACATC ACTGTCCTGG 360 GTGAAGTCTA TACTTAGCCC GGCAAATTTG GCTGCTTGAG CCACATGAGA TTCTATGAAA 420 TCAATATATA CGAGATCCAC TGTTTTCGGA GCCGCCGACT CTTTCGGAGA GATTAGAGCC 480 TGGATGCACT TGGGAACACG ATAGAACGAG ATGGGCGAAT GAATTGTGTC GTCGCCATCC 540 GAGCCTTCAT CGTCTGTGGT AGTATACCCA GGGATAATGC TGGGTTCGGA GTGATCGTTC 600 CTCAGCAGCG GCGTCTGATC TCTGAGGTAA TTCGTAGAGC CCAGGGCGAA CTATCAGTAA 660 TAATCAAATC AGAGGAATAA ACTGACTGTT CTGGGGGCGC AAGTCCCTCA GTGATGGCGG 720 ATCGGTTGTC AGCATCAGTC AGAATTTGAG GCTGTTTGTT TAAGATCTCG ACTATTAAAG 780 TGGCCTTCCC ATAAGGAATG TTCTTAATGT AACGAAAACC GCTGGTAAAA GGAGAGACTA 840 TGAATGTCGA GTCTTGAGTA AAAGGACCTT TGAATATGTC AAAGCGAATG GCGCCGGTGT 900 TGACTATGGC AAGAGCCGGC TTGCCAGTGC GAGATTTATC CTGCAGCGAG TTGGGCAGCG 960 CCTGCTGCTC GAGCCAAGTA TAAATGCTAT CCTCACTCGG ATACTTGACG CGTGACATCC 1020 AAAGATCCCG AGGGGCACAA CCGTGTACCT CATCGAGTCG AAGAGTGCTC CTAGACTCCT 1080 CAATAAGCCG AGACACGTTC CGACCCTCCT CCGTAGAGAA GGTTTCCTCG TCAAGGCCAG 1140 TGTGGTGGTA AAAGGAATAG AGGTTATTAT CTATATATCT TCGATGGAAG CTTGGGGTTG 1200 TCGAAGCAGG CTTTACGAGC TGTTTGCTAC TGGTTAGGCC ATCGATTGAC ATGAAGCCAA 1260 TTGTCTCCAT GAACCGACCG CTTGCTAACC CAAACGCTTT AGAGTCGAAT CTGGCAAAAT 1320 CACGGATATG ATAATGACCA CCAAAGAACT GAATAGGTGT GTCCCAACGG ACCATCCGGA 1380 TCTCCTTGAA AACAGCATCA TATTCCTTAG AATGAACAGG AACGTGTCCC ACGACCAAGA 1440 AGAGGTCAAC TTCCTTATCC CTGATAGCTT CCTGAAACCA CTCCTCTTTG ATAGTCTCTT 1500 CCACCGGATG AACGATGGTG TTATTGTAGT TCTTTGTGAA ATCGAAAAGA AAGCCAAAAG 1560 CAATGATACG GATACCTTGC TTCTTGGTTG TGAATTTCTT GAACCGAGGG GCCAATGGCA 1620 CAGTCTCTTT GGTTAAAGGA TGTATTATAT CAATGTTAGA TGCTAAGTAG TTTCCGCGGA 1680 AATTAGGTAC TGTAGTGAAG AGTTCAGCCT CCGAGGTGTT TTGTTTGTAT AGTTCATGAT 1740 TCCCGGCGGA TAATAGGTCG ATATGCTGTT GCCGCAGAAT TTCCGAGATA TAAACACCTT 1800 TCGGCTCCGA CGAGTCATAG AGACCATTGC CTTCTACCCT GTCACCCGTA TCTATAACTA 1860 ATAGATCTTG TCCTTGTGCC TCCGCTTTCT CTCGCATCCG GGTAGCGAAG GAGACATAAT 1920 CACCCCAATC TGCGGAGTAG GAGGGCCTAT AGTACATTCA ATCAGTATCG TTGGCATCCG 1980 CAGTGGAACT GATGTCCAGC TCAGTGGGCA TACTCCTGGA GATGGCCGCT AGCCAGCCAT 2040 GAGTATCCGT AGTATGGAGA AAATTGAGTT GTCCCCATTT CAGGTCACGC AAAGGGGCCG 2100 GGATAGCTTC CGGAGCGGAA GGTTGACGAG CAAGGATAGG AGTGACGAGG GCAAAGAAGG 2160 AGAGAACATA TGAGTAGGAT CGATCGTAGA TCATACTTTT TACTATCATA ACAATAGTTA 2220 TGAATGAACG GGCGGACGGT AGGAGGAATA GAGTGTGTAC ACGAGGGGGA GGAACGGAGT 2280 ACGGAGTCTA GCGTTATCAC ATCTGTTATC ACTCTACGGA ATGAGCCGCC GGTGAGGACC 2340 GCCCTGTGCT TAGTCATCCC CAACCCAACA GTCTCTCGAA ATGCTCACCA AAAACTAAAA 2400 TCCCCATTAG ATTGACGACC AAGTCCCGAA ACAACGGAAT TGCGAAACCT TCGCTCCGGT 2460 ATCTATCTTC TCTCTTTCCT CTCTCACTTC ACTTGTTGAT CCGTTCGCTG GGGAGTCACT 2520 TGTGAACACC CTCTCCTTTC TTCTGCTGAT ATATATGTCC TTAAGCCCGG CC 2572

【００６２】配列番号：４ 配列の長さ：８４５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アスペルギルス・オリゼ 配列の特徴 特徴を示す記号：promotor 配列 ACTAGTCCGG TTGGCATGGA TCTCAGTATG TACTCGGTGT CTCCGGTGTC CCTGAAAGAG 60 ATTCCTCTTC CCGAGTCAGA CAATCCGAGG GTCATAAGGT ACTTGTTTGT TTGTTTGAAA 120 CAATAACTTT TGTCGAGTAT ACTTCACGAC GTTATTATTT CGTATTCTAT GGGGAAAGTG 180 GCCTGACGTC GAGGATCGTT TGAGATATTA CAGGGTATAC TCATCATGTG GCATTGAGCC 240 ACCGTGATAG TACACATCAT ATAGATAGAG GGTGGGACGC CGTACATAGG TGGATTAAGG 300 CAACAATGGG TGAGTTTGGT CTGCCCTGTA AGTGGGGTGT GGGAAACTAT TGCCAGATGG 360 CACTGCAGTA GATGGAGGTC CTTGGTTTCC TTCCTCTTTC GGACCTCCGA CATCATTTGT 420 TTTGCGTGGG TGACCAAAAG TTGACATAGA TATCGGATGA ATAATTAGTG AAGGTAATAA 480 TAATTACTGG CAGCCGATCC ATTGTAAAAA GGGAGAAAAA GAAATAAGGA AAAAATCCCA 540 AGAGTTGTGG CAGCCGCGGG GAACCGACCG GAGATACTGT AGTGGGCAAC CTCTCTCAAA 600 TGAGAAAGCG GCCAACAACA TTTTCCTCCC GGGCACACAC CCACTCCCGC AAATCAAACC 660 AAACCCAAAG CAGCCCCTCG CTCACCGGCT CTCTTTCTCT GGCCAACCTC TCCGATCTTT 720 TTTTATCGCC CATCCCCCCC CTCTTCCCCC CCCAATTCTT CCATTCATCC ACATCACAAC 780 TTCCTCTCCC CCCCAAACCA TCTTCTCCTC TTCATCCTTC TAGTGTAGAC AGAGAAGCTT 840 TCAAA 845

【００６３】配列番号：５ 配列の長さ：１７１７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アスペルギルス・オリゼ 配列の特徴 特徴を示す記号：promotor 配列 AAATCAATGA TAGGCAGTTG GAACACCTGT GATGGTATCG GTAGCAATGA CTTGAGGTGA 60 ACTTCGTATA CCTATATCGC TTTGATTTTC TTTTTTTTGC TTCGTGGTAA GTCACAGTGT 120 TTGAGTCTAA GAATACCTAC CGAGTAGTAA CAGTTGCATG GCTTGAGCTA CAGTAGTCTT 180 GGTAGCGGGC ACTACCATTG GTCAAAGTAC ACAAGACATT GAACAGCCCA GGTATTACTG 240 AAAATGCATA TGTCGGGACG AGGTGTATAG GGTTTCAATT CAAGGCCTTC ATCGACCGTT 300 ATGTGAGTAT CTGTACTGAG CTGAGCATAC TAGCCACTAT GGGAAATTGT TCGCTTCGCA 360 AAGTCATTTT CACCTATTTA TTCGAAAATC ATGCAATTTC GTATAGATCT GAGCTTATTT 420 GATAGATCAG TCCGACTCAA TGCATGGTAA GTATCGTGTT TGACCGGATA TGTTTTGAGA 480 ACCCGGTGTT GTTGGATGCG GTTACTATAT CGCGTAGCCC TATAGAATCA TAACCCGGGA 540 CTTGAACAAT AGGTTTACCT CAATAGACTC CACTAAATCA GTGGTTTCTG ACATTTCCGT 600 GGCTCCCAGG TCATACATGT TGGTCCAATA GATGTAACGA GTATTATGTC CACAGTGGAT 660 TTAAGTCAGC CTATCATGGT TATGAGCACC TAAGTAGGTA TTTATATTGG CTGCGCAATC 720 CTATTGAGAC ATGTTTTGAC AGGAGTTGGG CATGACAGTC TTAATCGACC GAATTCTTAC 780 AGATTCTAGA ATAATTTTGA AAGGAGAAAG AAAAAGTCTC AATTCGTCGA TTGCAATTAA 840 CCGGCGGACG GAGAAACTCA GGAGTCTAGT CTGTAGTCGA TGGAGTGCCG TAAACCGATA 900 AAGTTCCCGT CCCAGATCAC CGGTGTGATT TCCGAGTACC CTTTGAGAAA GGAATTTATC 960 CCGATGATCC TATTGCCGGA AAGTAAAGTT TATGCATGAA TGATTATGGT CACGGGGTGA 1020 GAAGAAAATG AAGGGGGAGA AAGTTTTTGC TAATTTAGGT CGCCTTGAAG TTTGACAAGC 1080 TGATTAAGTA TTCAGTAAGA GATTATGACG ATTGGTTGTG GCTGTCAAAG CTACTATATT 1140 TGCCCATAGT TAAGTGGTAC GTCGGGGCCC ATAACTCCGG AGTTGATATG GGTACCTGTA 1200 GTCAACCGCC GACATTTGCT CAGACTCCCC CACGCAAATT GCAGGCGATC GACAATGTCG 1260 TAGTAATAGC ATTAATAATA ATAGTTTAAT TAGGACATAC GTACTCCGTA ATATATGACA 1320 AAGGATGAGT AGTCTAGACA GGTCCTAATC CAGTTGGTAA AGTCGGATAA TTTCTTGGAA 1380 GGGAAAAAAA AGGTGAGCCC CACGGCAGCC CCTCCAAAGC CGGACCCCAG CACACCGGTT 1440 GACGCCATAG GATTCAGGCC ATTGTTTGTC TGCCCACCTT CAGCGTCATC TGCCCCTCCG 1500 CGACTCCCGT TGTCTTTTTC CCTCCGTTTC TTTCCCAGCC ATCCATTCTT CTTGGGCATT 1560 CGTCTTGGTG ACTTCCTCTT ATAACCAGGT ATGTCTTTCT TGGGTCAAGC TCGTTCATCT 1620 AGGACTCTTC TTTTCTTGAT TACTTGCTGT TGAGAGCTTC CCCGCACTGA CACCAGCTAT 1680 CTCTACTGTA GAATTTCAAG AAGCAAAAGC TATCATA 1717

【００６４】配列番号：６ 配列の長さ：１０４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アスペルギルス・オリゼ 配列の特徴 特徴を示す記号：promotor 配列 ATTGAATTGA ATTTTTTCTA AAAAGAATAA ACAATGGTAA AAAAATTCCA AAGAGATGAT 60 TAATTGAAAT TAAAAGAGAA AATAAAACCA TGACAAGCGC GTGATCCTCA TTTGCCTACC 120 GGTGAATCTT TTCAGGAATC AGGAGAGCAG AAGAGGCTTA GAGAGATCGC TAAGCCCATG 180 ATATGAGTGT CGAGAGGGAA GAGGGGCAGT GGACCATAGT TGATCCGGTC CGATATCTCG 240 GCCCGGAAAC GGAAAGGTCA CACCGAGTGC CCCTCATTTT TCCATTGCTT CCATCCATTA 300 AGCTTGGGTG GGATGCTGTG GTCTGTAGTG TTAGTCTGTA TGGCCAGATT GTAAATTACA 360 TCATGCCCCT CTATGGGGAT GCCTCAGGTA TGGGACCCCA GGGTATCATT TCCCCCTCAA 420 TTGCTTGAAC TACGGAACAA AGGACAAAAA GATAGAGTAA TAGCCGGGAT CGTCTTCCTC 480 GTAGCCTAGG TAGTACTGCC CCCTCGATTC CGAAAAACTG GCAAAAGATT CACGAGATGG 540 TAGGATTGAG TACCCGGCAT GCTGGATTTG AGGCACGCTT ATTGGCCAGA CCGGTAGCTG 600 CCGAGGAGAG GCAGAGTCCC AAATATCGTG AGTCTCCTGC TTTGCCCGGT GTATGAAACC 660 GGAAAGGGCT GCTGGGAGCT GGGGAGCGGC GCAAGCCGGG AAAACAGCTG ACAAGGACCC 720 ATTTCACTCT GGATCTTGAG GAGAGCTGTA GCTTTTGCCC CGTCTGTCCA CCCGGTGACT 780 GGATTAGTGA CCTGGTCGTT GCGTCAGTCA ACATTGCTCT TTTTTTATCT CCCCCTCCCC 840 CGCCGTCCGA CTTTTCTCCC CTTTTCTACT CTCTTCGTAT ACTCACCACT GCAATCACCT 900 TATCCCTTTG TCTTTTTACT TAAAGTGAGT CGTCTCCCGC CCATCATTCC CTTTGGATCT 960 TCACTTTCAA GTGCCTACCG TTTCCCTTTC CACACAGATT GACTGACAGC TACCCCGCCA 1020 CACCAACAGA CACATCTAAA CA 1042

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のグルコース存在下で発現するプロモー
ターの単離法を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:69）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１乃至配列番号：６に示した塩
   基配列で示されるＤＮＡ。
2. 【請求項２】請求項１記載のＤＮＡとストリンジェント
   な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
3. 【請求項３】アスペルギルス属由来である請求項１又は
   請求項２記載のプロモーター。
4. 【請求項４】アスペルギルス・オリゼ由来である請求項
   １又は請求項２記載のプロモーター。
5. 【請求項５】アスペルギルス・オリゼのピルベート・デ
   カルボキシラーゼ(Pyrvate decarboxylase)遺伝子、フ
   ルクトース-６-ビスホフェート・アルドラーゼ(Fructos
   e-bisphosphate aldolase)遺伝子、ピルベート・デヒド
   ロゲナーゼ(Pyrvate dehydrogenase)遺伝子、ピルベー
   ト・キナーゼ(Pyrvate kinase)遺伝子、グルコース-６
   −ホスフェート・イソメラーゼ(Glucose 6-phosphate i
   somerase)遺伝子又はグリセルアルデヒド−３−ホスフ
   ェート・デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphat
   e dehydrogenase)遺伝子の何れかより選ばれた請求項４
   記載のプロモーター。