JPH08504327A

JPH08504327A - 糸状菌における異種タンパクの生産

Info

Publication number: JPH08504327A
Application number: JP6513800A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムイーヒンツ; ピーターエイラゴスキー
Original assignee: ギストブロカデスナムローゼフェンノートシャップ
Priority date: 1992-12-10
Filing date: 1993-12-10
Publication date: 1996-05-14
Also published as: DK0673429T3; EP0673429B1; DE69332030D1; CA2151154A1; FI952801A7; US5674707A; US5710021A; FI952801A0; NO952293L; NZ259339A; EP0673429A1; WO1994013820A1; AU6653494A; DE69332030T2; ATE219143T1; FI952801L; AU666443B2; CA2151154C; NO952293D0

Abstract

(57)【要約】 creA結合部位が機能的に破壊したプロモーター変異体を使用して、グルコースの存在下、糸状菌宿主中においてタンパクの発現が行われる。

Description

【発明の詳細な説明】糸状菌における異種タンパクの生産技術の分野本発明は、組み替えＤＮＡの技術の、微生物宿主、特にアスペルギルス属を含む糸状菌における目的のタンパク生産への応用に関する。発明の背景様々な遺伝子の発現システムの研究開発が、糸状菌宿主を使用して行われてきた。これらの中で、例えば、グルコース抑制プロモーターのような、炭素異化代謝産物抑制プロモーターを利用したシステムが第一に挙げられる。というのは、醗酵条件を適正化することにより、遺伝子の発現能力を簡単に、明確にコントロールすることができるからである。このタイプのあるシステムでは、アスペルギルスニードランス（Aspergillus nidulans）のalcA遺伝子のプロモーターを使用しており、これはグルコースの存在により抑制され、エタノール、トレオニン又はグルコース欠乏状態における関連した代謝産物により誘発される（Gwynne eta l., Biochem. Soc. Trans., 17:338参照）。この二重のコントロールは、醗酵に対する魅力的な、段階的アプローチを与える。この醗酵において、宿主のアスペルギルス菌株を初めにグルコース存在下で培養して生物量を最大にし、次に、グルコース欠乏状態で誘発剤存在下に培養を行い、目的のタンパクの生産を誘導する。同様に、調節システムもまた研究開発され、他のグルコース抑制プロモーターも使用している。その例として、例えば、アスペルギルスニードランスのaldA 遺伝子（Pickett et al., Gene（1987）51:217参照）、アスペルギルスニードランスのamdS遺伝子（Scazzocchio et al., 1992参照）、アスペルギルスニガー（ Aspergillus niger）のgla遺伝子（Fowler et al., Curr．Genet．（1990）,18: 537）参照）、並びにアスペルギルスニードランス及びセファロスポリウムクリソゲナム（Cephalosporium chrysogenum）のacvA及びipnA遺伝子（Brakhage et al．（1992）174:3789参照）が挙げられる。グルコース抑制プロモーターによる遺伝子発現に対するコントロールは、様々な例において望ましいが、その使用は醗酵の生産段階を複雑化する。遺伝子生産物を形成するために、宿主菌株は、グルコース欠乏状態のみではなく、より好ましい基質であるグルコースに代わる炭素源を使用した培地でも培養されなければならない。従って、グルコース抑制機能を除去したプロモーターを開発することが望ましい。アスペルギルス及び他の糸状菌における、グルコース介在による炭素異化代謝産物抑制の作用機作の研究は、主要なリプレッサーであるcreA遺伝子の生産物に関連している。グルコースが存在するとき、creA遺伝子生産物は、エタノール及びラクトースのような他の炭素基質の使用に関連する遺伝子の発現を抑制し、そのため、グルコースが利用できる場合には、それらの他の経路の利用を抑制することが現在広く認められている（Scazzocchio, in Aspergillus; Biology and I ndustrial Applications, Butterworth-Heinemann, 1992, pp.44-63参照）。アスペルギルスニードランスのcreAの分析とクローン化は、最近ダウザーとケリーにより報告された（Dowzer & Kelly, Mol. Cell. Biol. （1991）11:5701）。発明の要約 creA遺伝子生産物が、グルコース抑制糸状菌遺伝子のプロモーター領域内で結合するドメインが同定された。本発明は、この発見を利用して、グルコース抑制プロモーター内のcreA結合ドメインを破壊し、これにより、グルコース存在下において、発現を調節できるプロモーターの変異体を提供する。また特に、本発明の一つの実施態様では、糸状菌宿主中でタンパクをコードするＤＮＡの発現を達成するのに有用な組み換えＤＮＡ発現カセット、タンパクをコードするＤＮＡを含むカセット、及びそれらと機能的に連結した、破壊され、グルコース存在下で、タンパクをコードするＤＮＡの発現を行わせるcreA結合部位を有するプロモーター変異体が提供される。本発明の実施態様において、プロモーター変異体は、アスペルギルスニードランスの例えばalcA、aldA及びalcR遺伝子から選択された、エタノールの代謝に関与するアスペルギルス遺伝子のプロモーターから誘導される。本発明のもう一つの実施態様は、異種ＤＮＡ及びこれと機能的に連結した、破壊されたcreA結合部位を有するプロモーター変異体を含む組み換えＤＮＡ発現カセットを組み込んだ糸状菌株を提供する。本発明の他の実施態様は、目的のタンパクをコードするＤＮＡを含む組み換えＤＮＡ発現カセットと、これと機能的に連結した、破壊され、空間的に保存されたcreA結合部位を有するプロモーター変異体を組み入れた糸状菌株を、グルコース存在下において培養する工程を含む、目的のタンパクを生産する方法を提供する。本発明とその好ましい実施態様について、添付図面を参照し、詳しく説明する。図面の簡単な説明図１は、アスペルギルスニードランスのalcAプロモーターの領域のヌクレオチド配列を示している。配列表の配列番号：３参照。図２は、alcAプロモーター変異体の構造を図式的に示したものである。詳細な説明及び好ましい実施態様本発明は、プロモーター変異体と機能的に連結した、タンパクをコードするＤＮＡの発現をグルコース存在下で可能とするようなプロモーター変異体を供与するため、通常はグルコース抑制される糸状菌遺伝子のプロモーターを変化させる方法を提供する。これは、グルコース抑制プロモーター内のcreA結合部位を、削除又はより望ましくはヌクレオチド置換により除去することにより達成される。ここで使用されている、“プロモーター変異体”という用語は、通常存在するcr eA結合部位が破壊されたグルコース抑制プロモーターを意味しており、このプロモーター変異体は、与えられた糸状菌株の成長を維持するのに十分な濃度のグルコース存在下において、機能することができる。本発明の目的において、プロモーター変異体は、プロモーター配列内にcreA結合ドメインを含む、グルコース抑制糸状菌遺伝子のプロモーターから主に誘導される。creA結合ドメインはＧＣが豊富な単位であることを特徴とし、また特に、隣接する１０個のヌクレオチド鎖内に、少なくとも６個のＧ又はＣ残基が含まれているヌクレオチド領域として同定される。creA結合ドメインの特定の配列は、このパラメータ内で広く変化することができ、また、例えば、ＧＣＧＧＧＧＣのような完全に連続したＧ／Ｃ残基からなっていてもよく、あるいはＧ／Ｃ残基に少なくとも一個のＡ及びＴ残基が挿入されていてもよい。プロモーター内のcreA結合ドメインは、翻訳及び転写開始部位のような、各々の必要な調節成分の上流に、通常位置している。既に報告された配列を有するグルコース抑制糸状菌遺伝子については、プロモーター内のcreA結合ドメインを同定するのは、配列内のＧＣ豊富な配列を探すという当然単純な作業である。クローン化されているが、配列が全く知られていない遺伝子については、creA結合ドメインは、この技術分野において確立されている手法を用いて、遺伝子の５’ー非翻訳領域の配列分析を行うことにより配置させることができる。他のグルコース抑制遺伝子についても、５’-非翻訳領域のクローニング及び配列分析は必要ではあるが、分子生物学の技術分野で確立された方法に従って達成することができる。 creA結合ドメインを組み入れたグルコース抑制プロモーターから、creA結合ドメインを破壊することにより、グルコース存在下において機能的なプロモーター変異体を得ることができる。creA結合ドメイン及び５’領域を完全に除去するか、プロモーター内からcreA結合ドメイン又はその機能部位を選択的に除去するか、或いはより好ましくは、creA結合ドメイン内の一つ又は複数のＧ／Ｃ残基を置換することにより、破壊を行うことができる。置換残基は、アデニン及びチミンが望ましい。完全除去及び選択的除去と比較して、Ｇ／Ｃ置換は、プロモーター変異体の他の調節ドメインの空間的関係と機能を保持するという利点がある。当然、この場合特に重要なのは、発現調節領域がプロモーター内のcreA結合部位の上流に存在することである。幾つかのケースにおいて、プロモーターは一つ以上のcreA結合部位を含んでいてもよく、また、そのグルコース抑制を除去するために、プロモーター内の各々のcreA結合部位を破壊することが望ましい。このことは既に述べたように、これらの部位を除去するか、これらの部位内の残基を置換するか、又はこれらの破壊技術の組み合わせを使用することにより達成される。本発明の特別な実施態様によると、プロモーター変異体は、下記の同定されたアスペルギルスニードランスプロモーターの変異体であり、プロモーター内の下記のcreA結合部位が、ヌクレオチド置換により破壊されている。グルコース存在下で機能するプロモーター変異体の創製は、従来の遺伝子操作技術を適用することにより、これらの又はその他のプロモーターを使用して行うことができる。例えば、creA結合部位を含む選択されたプロモーターの領域は、フランキング制限部位を用いて除去することができ、増幅と次の遺伝子操作に適するベクターに組み込まれる。部位特異的突然変異化の技術は、次に、目的のcr eA結合部位の破壊に適用することができる。creA結合部位及びその５’の配列を除去するには、例えば、望ましい制限部位をcreA部位の３’に導入するオリゴヌクレオチドを使用して除去を行う。同様の技術を利用して、望ましい配置には不適合であるが、しかし、破壊を目的とした領域と相補的でかつハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用して、creA結合部位内のヌクレオチド置換を導入することができる。ポリメラーゼ鎖反応（polymerase chain reaction）（ＰＣＲ）の簡便な技術も、部位特異的アプローチと組み合わせて応用することができ、突然変異を起こして、次にプロモーター全体又はその選択された領域のどちらかを増幅する。目的のプロモーター変異体は、現在の遺伝子合成技術の基本的な方法を用いて新たに合成してもよい。簡単にいうと、これは、自動合成機中で適正に保護したヌクレオチド試薬のカップリングによる連続した３’から５’の構築と、脱保護したポリヌクレオチドのゲル精製による回収を必要とする。例として、Wosnick et al. Gene（1989）76:153に記載されているブロック連結反応による方法を用いてもよく、それにより約８０までの長さのオリゴヌクレオチド対の“ブロック”が合成され、相補的に突き出した部分を連結する方法で（by ove rhang complementary）正しく連続して連結される。代わりのアプローチとして、全く異なる方法で目的のＤＮＡを合成し、次に、例えばBarnett et al.，Nucl ．Acids Res．（1990）18:3094に記載されている方法を用いてＰＣＲ技術により増幅することができる。一度得られたならば、プロモーター変異体を、既に糸状菌用に別に確立された技術に従って、糸状菌宿主中で目的のタンパクをコードするＤＮＡの発現を行うのに利用してもよい（Ballance，Yeast（1986）2:229参照）。この目的において、本発明は組み換えＤＮＡ構築物を提供し、この構築物においてプロモーター変異体はタンパクをコードするＤＮＡと機能的に連結している。“機能的に連結している（linked operably）”という用語は、プロモーターがタンパクをコードするＤＮＡと、糸状菌宿主中でその発現を可能とするように連結していることを意味する。本明細書の目的において、タンパクをコードするＤＮＡは、翻訳開始コドンと翻訳終止コドンを有すると考えられ、かつ、その他に、目的のタンパク最終生産物それ自身；アスペルギルスニガーのグルコアミラーゼのようなキャリアンパクと切断可能な組み合わせで、最初目的のタンパクが生産される融合タンパク；或いは、目的のタンパク最終生産物が、グルコアミラーゼや又は他の同等な機能を有するもの等のアスペルギルスタンパクと通常会合しているシグナルペプチドのような、切断可能なシグナルペプチドと結合している、分泌可能なプレカーサーをコードする。実験結果は、翻訳ターミネーターは構築物の必須の成分ではないことが経験的に判明しているが、プロモーター及びタンパクをコードするＤＮＡに加えて、本発明の構築物には、タンパクをコードするＤＮＡの３’位にこのような翻訳ターミネーターを含んでいてもよい。このような翻訳ターミネーターは、アスペルギルス遺伝子、例えばアスペルギルスニガーのグルコアミラーゼ遺伝子の３’非コーディング領域の0.5−1.0kbフラグメントとして得ることができる。一度この構築物が得られたならば、線状の形態で、或いはpUC-ベースの又は他のベクターのようなプラスミドの形態で、ＤＮＡ媒介形質転換、電気穿孔法、粒子銃衝撃、原形質融合、等の技術を用いて、糸状菌宿主に導入することが可能である。得られた形質転換体の選択を可能にするため、形質転換は、発現カセットと共に、同じベクター上に、又はコトランスフォーメーションにより、遺伝子マーカーが選択可能である宿主菌株中に導入された選択可能な遺伝子マーカーを通常含む。アスペルギルスニードランスの栄養要求株と共に使用するためのpyrG、 argB及びniaD遺伝子；アスペルギルスオリザエ（Aspergillus oryzae）の栄養要求株用のpyrG及びargB遺伝子；ペニシリウムクリソゲナムの栄養要求株用のpyrG 、trpC及びniaD遺伝子；及びトリコダーマレセイ（Tricoderma ressei）の栄養要求株用のargB遺伝子を含む様々なマーカー／宿主システムが利用できる。amdS 、oliC、hyg及びpheloを含む主要な選択可能なマーカーもまた以下に挙げる糸状菌と共に使用するために入手可能である。Ａ.ニガー、Ａ.オリザエ、Ａ.フィクム（ficuum）,P．クリソゲナム、セファロスポリウムアクレモニウム（Cephalos poriumacremonium）、コクリオボラスヘテロストロファス（Cochliobolus heter ostrophus）、グロメレラシングラータ（Glomerella cingulata）、フルビアフルバ（Fulviafulva）、及びレプトスファエリアマクランス（Leptosphaeria mac ulans）、（Ward，Modern Microbial Genetics, 1991, Wiley-Liss, Inc., 455- 495頁参照）。形質転換から得られる糸状菌株を、本発明の他の実施態様に従い、成育維持濃度のグルコース存在下において、目的のタンパク生産物を得るために培養する。目的の遺伝子生産物の発現を可能とするプロモーター変異体は、グルコースの存在下で機能的に抑制されないため、グルコース欠乏成育条件を確立する必要無しにこの株の培養を行うことができる。それらのプロモーターはそれ以外にはその機能が調節されていないので、目的のタンパクの生産は培養期間を通して行うことができる。また、グルコース抑制以外のメカニズムにより調節されるプロモーター変異体を用いて、段階的生産を行うことも可能である。以下、例示するように、培養期間内でタンパクの生産をある範囲に制限する誘発剤を使用して、creA 結合部位の破壊後においてもalcAプロモーターを機能的に調節することができる。実施例１ alcAプロモーター変異体の調製アスペルギルスニードランスalcA遺伝子のプロモーターを、creA遺伝子生産物及びグルコースの組み合わせにより抑制する；また、グルコース欠乏状態下、al cR遺伝子生産物とエタノールのような誘発剤の組み合わせにより誘発する。アスペルギルスの成育を維持するのに十分な濃度のグルコース存在下で機能するalcA プロモーター変異体を構築するために、Gwynne et al., Bio/Technology（1987 ）5:713に報告されている方法、及び下記に述べる方法によりalcAプロモーターを得た。二つのcreA結合部位と推定された部位（両方ともＧＣＧＧＧＧＣ）を最初に配列分析により同定した。図１に示すように、alcA遺伝子のＡＴＧ開始コドンの上流の−３０２及び−１６７の位置にこれらの部位は存在し、好都合なことにかつどちらも、プロモーターのＳｐｈＩ／ＳｐｌＩ領域内にある。ヌクレオチド置換によるこれらの部位におけるalcAプロモーターの破壊を起こすために、プロモーターの160bpフラグメントを、下記に示した末端を欠落させたプライマー（taile d primers）を使用して増幅した。 Scharfらにより１９９０年に報告されている方法（“PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications”．M．A. Innis et al．（Eds．），Academic Pr ess．）に従い、ＰＣＲ増幅を２５回行った。HindIII／EcoRI−末端増幅の生産物はPTZ18R維持ベクター内へサブクローン化し、正確な、様々な配列をＤＮＡ配列分析により決定した。次に、維持ベクター及びalcA遺伝子の全鎖（pUC8バックグラウンド）を、それぞれSphI及びSpIIで制限した。次に、選択的に連結させて、野性型alcAプロモーターのSphI／SpII領域を、二つの推定上のcreA結合部位の突然変異を含む様々な領域で置換したプラスミドpalcA^var-2EBを形成した。この方法により、alcAプロモーター内のヌクレオチドの空間的な配置もまた保持された。 alcAプロモーター変異体の発現は、creA媒介メカニズムによりグルコース抑制されるalcR遺伝子の生産物による誘導が必要であるため、成分としてalcRを生産するアスペルギルスニードランス菌株を、変異プロモーターからのalcA遺伝子の発現に利用した。選択された宿主株は、選択可能なマーカーであるアスペルギルスニードランスargB遺伝子と、発現カセットの両方を保持するプラスミドで形質転換することにより、グラスゴー（Glasgow）二重栄養要求株FGSC4（argB-;ura- ）から構築された。発現カセット内のalcR生産物をコードするＤＮＡ（Felenbok etal., Gene（1989）73:385）は、アスペルギルスニードランスのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（Punt et al., Gene（1988 ）69:49参照）の成分プロモーターの発現コントロール下に置かれた。alcAプロモーター変異体を保持するカセットの複数コピーを調製するため、成分であるal cR遺伝子の複数コピーを保持する株が選択され、これをＴ２６２５（ura，multi ple alcR^c）と名づけた。プラスミドpalcA^var-2EBを次に、選択された宿主アスペルギルスニードランス菌株へ、ニューロスポーラクラッサ（Neurospora crassa）のpyr4遺伝子を保持するマーカープラスミドpFB94と共に導入した（Buxton and Radford, Mol．Gen ．Genet．（1983）190:403参照）。Royer et al., Mol．Gen. Genet. （1991）2 25:168に報告された方法に従い、PEG/CaCl₂を媒介とした技術を用いて形質転換を行った。pFB94成分を含む、推定上の形質転換体を、最小培地上で、ウリジン無しに最初に選択した。シングルプレート上のほぼ80ura⁺形質転換体から集めた混合した胞子を（３ｍｍコロニー）、５０ｍｌの選択した培地（0.4％ 2-デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）、1.0％エタノール、0.67％酵母栄養ブロス）に接種した。カルチャーを３日間３０℃で、攪拌（200 rpm）しながら培養した。羊毛状のコロニーを液体状の培養物から集め、単一胞子から誘導された単離物を、さらに分析するために、２−ＤＯＧ耐性コロニーからそれぞれ調製した。宿主株及び形質転換体は次に、成育における炭素源の効果を調べるために、４８時間３０℃で、選択された様々な添加物を含んだ液体培地中で培養した。結果を表１に示す。胞子懸濁液は５０ｍｌの液体培地に接種した。この培地には、0.67％酵母窒素ベース（YNB）、１mMウリジンが添加されており、その他に、エタノール（1.0％）、グルコース（0.4％）又は非代謝性類似物である2-デオキシグルコース（2-DOG ）（0.4％）が含まれていてもよい。表が示すように、宿主菌株は、エタノール又はグルコースどちらか、或いは両混合物の存在下において成育することが可能であった。非代謝性グルコース類似物の２−ＤＯＧのみが存在する場合、成育することができず、又２−ＤＯＧ存在下においてエタノールを利用することができなかった。明らかに、２−ＤＯＧは効果的に野性型のalcA遺伝子からの、エタノールの使用が要求される生産物の発現を抑制した。一方、グルコースと共にエタノールを使用した場合、又はエタノールが単一の炭素源である場合、palcA^var-2EB形質転換体は、（例えグルコース又は２−ＤＯＧが等量存在しても）成育することが可能であり、エタノールの利用が要求されるalcA遺伝子生産物の発現は、alcAプロモーター変異体により媒介されていることを決定的に示している。配列リスト（1）一般的情報（i）出願人（A）名称：ギスト・ブロカデスＮ．Ｖ．（B）通り：Ｐ．Ｏ．ＢＯＸ１（C）市：デルフト（E）国：オランダ（F）郵便コード（ＺＩＰ）：ＮＬ−２６００ＭＡ（G）電話番号：３１−１５−７９９１１１（H）ＦＡＸ番号：３１−１５−７９３９５７（ii）発明の名称：糸状菌における異種タンパクの生産（iii）配列数：３（iv）コンピューターによる読み取り可能な形式：（A）媒体：フロッピーディスク（B）コンピューター：ＩＢＭＰＣ compatible （C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（D）ソフトウェア：PatentIn Release ♯1.0,Version ♯1.25（EPO）（vi）先行出願データ：（A）出願番号：ＵＳ０７／９８８，７７８（B）出願日：１０−ＤＥＣ−１９９２（2）配列番号：１：（i）配列の特徴：（A）長さ：５１塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：ＹＥＳ（xi）配列：配列番号：１：（2）配列番号：２：（i）配列の特徴：（A）長さ：５０塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：ＹＥＳ（xi）配列：配列番号：２：（2）配列番号：３：（i）配列の特徴：（A）長さ：３６０塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ（vi）起源：（A）生物名：アスペルギルスニードランス（xi）配列：配列番号：３：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:66）Ｃ１２Ｒ 1:66） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者ラゴスキーピーターエイカナダオンタリオエム４シー１エス３トロントウォールパーリーブールヴァード 225

Claims

【特許請求の範囲】１．タンパクをコードするＤＮＡが、破壊したcreA結合部位を有する糸状菌プロモーター変異体と機能的に結合し、該プロモーター変異体が、グルコースの存在下、該タンパクをコードするＤＮＡの発現を媒介する、組み換えＤＮＡ構築物。２．creA結合部位が破壊され、かつこの部位において、ヌクレオチド残基の置換により、空間的に保持されている請求の範囲１記載の組み換えＤＮＡ構築物。３．ヌクレオチド置換がＡ及びＴから選択される請求の範囲２記載の組み換えＤＮＡ構築物。４．プロモーター変異体がアスペルギルスプロモーターの変異体である請求の範囲１記載の組み換えＤＮＡ構築物。５．プロモーター変異体が、alcA、aldA及びalcRから選択されるアスペルギルスプロモーターの変異体である請求の範囲４記載の組み換えＤＮＡ構築物。６．請求の範囲１記載の組み換えＤＮＡ構築物を組み入れた糸状菌株。７．アスペルギルス属である請求の範囲５記載の糸状菌株。８．アスペルギルスニードランス種である請求の範囲６記載の糸状菌株。９．グルコースの存在下、請求の範囲５記載の糸状菌株を培養する工程を含む、目的のタンパクを生産する方法。 10．グルコースの存在下、alcR遺伝子生産物を発現し、タンパクをコードするＤＮＡが、全てのcreA結合部位が機能的に破壊しているalcAプロモーターの変異体と機能的に結合している組み換えＤＮＡを組み入れてあり、該タンパクをコードするＤＮＡは、該菌株がグルコース及び誘発剤の存在下で培養されるとき発現する、アスペルギルスニードランス菌株。 11．請求の範囲９記載のアスペルギルスニードランス菌株を、グルコース及び誘発剤の存在下で培養する工程を含む、目的のタンパクを生産する方法。