JPH10324693A - フルクトース−２，６−ビスリン酸の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 溶出後の脱塩操作を容易に行うことのできる
フルクトース−２，６−ビスリン酸の精製方法を提供す
る。 【解決手段】 フルクトース−２，６−ビスリン酸含有
液から陰イオン交換材料を用いてフルクトース−２，６
−ビスリン酸を精製するに際し、溶出液として一価の金
属のアルカリ塩の溶液を用いることを特徴とするフルク
トース−２，６−ビスリン酸の精製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フルクトース−
２，６−ビスリン酸（以下、Ｆ２，６Ｐ２と略記する）
の精製方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生体における糖代謝の調節機構として
は、例えば、インスリンホルモンによる調節、グルカゴ
ンやアドレナリンによる調節、セカンドメッセンジャー
と呼ばれるサイクリックアデノシン５’−モノリン酸に
よる調節、アデノシン５’−モノリン酸（以下、ＡＭＰ
と略記する）、アデノシン５’−トリリン酸（以下、Ａ
ＴＰと略記する）、クエン酸による調節、Ｆ２，６Ｐ２
による調節等が報告されている。

【０００３】生体における糖代謝は解糖系と呼ばれる一
連の経路により行われ、この経路において、ホスホフル
クトキナーゼ１酵素（ Ｅ．Ｃ．２．７．１．１１ ：
以下、ＰＦＫ１と略記する）は重要な調節因子である。
このＰＦＫ１を活性化するＦ２，６Ｐ２が糖代謝に関す
る因子として重要であることが、近年確認されている。
さらに、Ｆ２，６Ｐ２は、糖尿病、糖尿病合併症治療剤
及び肝細胞増殖促進剤として有用であることが報告され
ている（特開平２―２０２８２２号公報参照）。

【０００４】従来、Ｆ２，６Ｐ２の製造方法としては、
（１）フルクトース−１，６−ビスリン酸（以下、Ｆ
１，６Ｐ２と略記する）から、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを触媒としてフルクトース−１，２−サイクリ
ック−６−ビスリン酸（以下、ＦＣＰと略記する）を
得、さらにこのＦＣＰをアルカリで部分分解することに
より製造する方法〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー誌、１１７巻、３１９頁（１９８１
年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー誌、２５６巻、８６７９頁（１９８１年）、特開昭６
０−１６１９９４号公報参照〕と、（２）酵母の菌体破
砕液からポリエチレングリコール沈殿、セファクリルブ
ルー（Sephacryl-blue）樹脂、ＣＭセファデックス（CM
-Sephadex ）樹脂を用いて精製したホスホフルクトキナ
ーゼ２酵素（ Ｅ．Ｃ．２．７．１．１０５ ：以下、
ＰＦＫ２と略記する）をフルクトース−６−リン酸（以
下、Ｆ６Ｐと略記する）とＡＴＰとに作用させることに
より製造する方法〔バイオケミストリー誌、３２巻、１
１１４７頁（１９９３年）参照〕が知られている。

【０００５】このような方法でＦ２，６Ｐ２を合成する
と、Ｆ６Ｐ、Ｆ１，６Ｐ２、ＦＣＰ、ＡＴＰ等の不純物
が合成反応液に混在するため、この合成反応液からＦ
２，６Ｐ２を分離精製することが必要となる。合成反応
液からＦ２，６Ｐ２を精製する方法として、特開平９−
１０７９８６号公報には、Ｆ２，６Ｐ２の合成反応液を
陰イオン交換樹脂にアプライし、洗浄後、炭酸水素ナト
リウムの水溶液で溶出する方法が開示されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし、炭酸水素ナト
リウムを用いて溶出を行うと、高濃度の水溶液を使用す
ることが必要となり、このため、Ｆ２，６Ｐ２の回収液
（溶出液）から炭酸水素ナトリウムを除去すること（脱
塩）が困難であるという問題があった。

【０００７】本発明は、溶出後の脱塩操作を容易に行う
ことのできるＦ２，６Ｐ２の精製方法を提供することを
目的とするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意検討の結果、一価の金属の
アルカリ塩の溶液を用いれば、Ｆ２，６Ｐ２を低濃度の
溶液でも溶出することができるということを見出し、本
発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、フルク
トース−２，６−ビスリン酸含有液から陰イオン交換材
料を用いてフルクトース−２，６−ビスリン酸を精製す
るに際し、溶出液として一価の金属のアルカリ塩の溶液
を用いることを特徴とするフルクトース−２，６−ビス
リン酸の精製方法を要旨とするものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
Ｆ２，６Ｐ２は、動物組織中に微量物質として存在する
下記一般式で表わされる糖リン酸化合物である。

【００１０】

【化１】

【００１１】本発明に用いられる陰イオン交換材料とし
ては、陰イオン交換樹脂や陰イオン交換膜が挙げられ、
これらは３級アミン基やピロリジル基等の陰イオン交換
基を有するものであれば特に限定されるものではなく、
一般に市販されているものを使用すればよい。市販され
ている陰イオン交換樹脂としては、ダイアイオンＷＡシ
リーズ（三菱化学社製）、ダウエックスＷＧＲシリーズ
（室町化学工業社製）、セファデックスシリーズ（ファ
ルマシア社製）等が挙げられる。

【００１２】本発明においては、まず、このような陰イ
オン交換材料にＦ２，６Ｐ２含有液を接触させて、Ｆ
２，６Ｐ２を材料に吸着させる。接触の方法としては、
例えば樹脂を用いる場合にはカラム法、バッチ法のいず
れの方法でもよい。また、膜を用いる場合には、加圧通
液、減圧通液、自然通液のいずれの方法でもよい。

【００１３】接触させるＦ２，６Ｐ２含有液の量として
は、Ｆ２，６Ｐ２の量が陰イオン交換材料中の陰イオン
交換基の数と同量又は少なくなることが好ましい。

【００１４】このようにしてＦ２，６Ｐ２を吸着させた
陰イオン交換材料を必要に応じて洗浄した後、一価の金
属のアルカリ塩を含む溶出液で溶出する。一価の金属と
しては、リチウム、ナトリウム、カリウム、セシウム等
のアルカリ塩が挙げられ、特にナトリウム、カリウムが
好ましい。

【００１５】また、アルカリ成分としては、水酸基が好
ましく、本発明に使用する塩としては、水酸化ナトリウ
ム又は水酸化カルシウムが特に好ましい。

【００１６】本発明においては、溶出液にこれらの塩が
少なくとも一種が含まれていればよく、複数が含まれて
いてもよいし、また、その他の塩が含まれていてもよい
が、塩濃度が高くなる（複数の塩が含まれると）と、こ
れらの塩を除去する操作に手間がかかるので好ましくな
い。

【００１７】溶出液としては、このような一価の金属の
アルカリ塩を含有するものであれば特に限定されるもの
ではなく、水溶液、リン酸、イミダゾール、ヘペス、酢
酸、グリシン等の緩衝液、有機溶媒との混合溶液等を用
いることができる。

【００１８】溶出液の一価の金属のアルカリ塩の濃度と
しては、１〜５００ｍＭであることが好ましく、特に１
０〜１００ｍＭであることが好ましい。

【００１９】本発明において、一価の金属のアルカリ塩
の溶液の代わりに中性塩の溶液を用いるとＦ２，６Ｐ２
を溶出するには数百ｍＭ〜数Ｍの濃度の溶液を用いるこ
とが必要となり、このため、脱塩操作が困難になる。ま
た、二価以上の金属塩を利用すると溶出中にＦ２，６Ｐ
２が析出してしまう。

【００２０】このようにして精製されたＦ２，６Ｐ２の
溶出液は、電気透析や逆浸透膜等により容易に脱塩を行
うことができる。また、凍結乾燥等を行うことにより粉
末状で得ることができる。

【００２１】

【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。

【００２２】参考例１（ＰＦＫ２の精製） ＰＦＫ２組み換え酵母サッカロミセス・セレビジエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）ＢＪ２１６８／ｐＡＢ１０
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５２１０）をグルコース（石津製薬
社製、品番０３６−００６４）２重量％、カザミノ酸
（日水製薬社製、品番０５８３４）０．５重量％、アミ
ノ酸非含有窒素源（ＤＩＦＣＯ社製、品番０９１９−１
５−３）０．６７重量％、Ｌ−ロイシン（石津製薬社
製、品番０１２−４０２１）３０ｍｇ／リットル、Ｌ−
トリプトファン（石津製薬社製、品番０１５−３３１
１）３０ｍｇ／リットルを含む培地（ｐＨ５．２）２０
リットルに植菌し、３０℃で３０リットルジャーファー
メンターを用いて培養した。この培養液２０リットル
を、ガラクトース（石津製薬社製、品番０１２−３３０
３）２重量％、カザミノ酸０．５重量％、アミノ酸非含
有窒素源０．６７重量％、Ｌ−ロイシン３０ｍｇ／リッ
トル、Ｌ−トリプトファン３０ｍｇ／リットルを含む培
地（ｐＨ５．２）４００リットルに加え、３０℃で５０
０リットルジャーファーメンターを用いて２４時間培養
することにより４．２Ｋｇの菌体を得た。

【００２３】次に、得られた菌体２００ｇをバッファー
Ａ〔５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（石津製薬社製、品番
３２５−２０７０）、２０ｍＭのＫＣｌ（石津製薬社
製、品番０３４−５２８３）、２ｍＭのβ−メルカプト
エタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、石津製
薬社製、品番０４３−０４６１）、２ｍＭのＥＤＴＡ
（石津製薬社製、品番０４２−０６２１）を含む、ｐＨ
７．５〕５００ミリリットルに懸濁し、この懸濁液をＤ
ＹＮＯ−ＭＩＬＬ破砕機（ｔｙｐｅ ＫＤＬ、シンマル
エンタープライゼス社製）と直径０．２５ｍｍのガラス
ビーズ（シンマルエンタープライゼス社製）を用いてガ
ラスビーズ破砕をした。得られた菌体破砕液のＰＦＫ２
活性は７５ユニットであった。この菌体破砕液に高分子
凝集剤（ユニフロッカーＵＦ−３０４、ユニチカ社製）
の１．５重量％溶液を、破砕液量の１２％相当分を加え
た。５分間撹拌した後、この液を遠心分離（４℃、５
分、８０００ｒｐｍ）し、上清を回収した。得られた上
清をデアエセファロースＦＦ（DEAE-SepharoseFF、ファ
ルマシア製）及びブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（Blue
-Sepharose CL-6B、ファルマシア製）を直列につないだ
カラムに充填した後、バッファーＡのＫＣｌ濃度を２Ｍ
にした溶液により、ＰＦＫ２を溶出した。この時のＰＦ
Ｋ２活性は８ユニットであり、ＰＦＫ１の活性は検出限
界以下であった。

【００２４】参考例２（Ｆ２，６Ｐ２の酵素合成） ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（石津製薬社製、品番３２
５−２０７０）、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂ （石津製薬社
製、品番０１３−３０４３）、１５ｍＭのＡＴＰ（シグ
マ社製、品番Ａ−５３９４）、１０ｍＭのＦ６Ｐを含む
反応液（ｐＨ９．０）５０ミリリットルに、参考例１で
精製したＰＦＫ２を５０ミリユニット／ミリリットルと
なるように加えて３０℃で反応を行った。反応開始から
４．５時間後、反応液を煮沸して反応を停止した結果、
反応収率４１％でＦ２，６Ｐ２が合成されていた。

【００２５】このＦ２，６Ｐ２合成液をＨＣｌによりｐ
Ｈを８．０に調節し、１ｍＭのＮＡＤＨ（ベーリンガー
社製、品番１２８０２３）を添加した。これに、１０ユ
ニット／リットルのアルドラーゼ（ベーリンガー社製、
品番１０２６５２）、２０ユニット／リットルのトリオ
ースリン酸イソメラーゼ（ベーリンガー社製、品番１０
９７５４）及び１０ユニット／リットルのグリセロール
−３−リン酸脱水素酵素（ベーリンガー社製、品番１２
７７５２）を添加し、２８℃で反応を行った。反応開始
から１時間後、反応液を煮沸して反応を停止した。反応
停止後、反応液中のＦ１，６Ｐ２の量を測定したところ
Ｆ１，６Ｐ２は検出されなかった。

【００２６】活性炭（ダイヤホープＳ８０、三菱化学社
製）１０ミリリットルをカラムに充填し、蒸留水１００
ミリリットルで洗浄した後、蒸留水で２倍に希釈した上
記のＦ１，６Ｐ２を分解除去した反応液をアプライし、
蒸留水２００ミリリットルでＦ２，６Ｐ２含有液を溶出
することにより、反応溶液からアデノシン、ＡＴＰ、Ａ
ＭＰなどのアデノシンを有する化合物を除去した。

【００２７】実施例１ 参考例２で得られたＦ２，６Ｐ２含有液を陰イオン交換
樹脂ダイアイオン ＷＡ１０（ＤＩＡＩＯＮ ＷＡ１
０、三菱化学社製、ＯＨ型）４ミリリットルを充填した
カラムにアプライし、０．０２ＭのＮａＣｌ水溶液（石
津製薬社製）１００ミリリットルでＦ２，６Ｐ２を溶出
した。その結果を図１に示す。図１は、陰イオン交換樹
脂ダイアイオン ＷＡ１０を用いてＦ２，６Ｐ２含有液
を精製したときの結果を示す図であり、縦軸に濃度を、
横軸にフラクションナンバーを示している。図１から、
ＮａＣｌの水溶液を用いることにより低い濃度の溶液で
も効率よくＦ２，６Ｐ２とＦ６Ｐを分離することができ
るとがわかる。

【００２８】このようにして精製したＦ２，６Ｐ２含有
液を、逆浸透膜（ＮＴＲ−７２５０、日東電工社製）を
用いて電気伝導度が１０ｍｍｈｏになるまで蒸留水で脱
塩濃縮した。脱塩作用に要した時間は２時間であった。
この濃縮液を、４℃で５０時間凍結乾燥することにより
４３ｍｇのＦ２，６Ｐ２の粉末を得た。

【００２９】比較例１ 溶出液として０．５ＭのＮａＨＣＯ₃ 水溶液を用いる以
外は実施例１と同様にしてＦ２，６Ｐ２の精製を行った
ところ、逆浸透膜による脱塩操作に４０時間かかった。
以上の結果から、溶出液をＮａＨＣＯ₃ の水溶液からＮ
ａＣｌの水溶液に代えることにより脱塩に要する時間を
約２０分の１に短縮することができることがわかる。

【００３０】

【発明の効果】本発明によれば、Ｆ２，６Ｐ２を塩濃度
の低い溶液を用いて精製することが可能となるので，の
ちの脱塩に要する時間を非常に短縮することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】陰イオン交換樹脂ダイアイオン ＷＡ１０を用
いてＦ２，６Ｐ２を精製したときの結果を示す図であ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フルクトース−２，６−ビスリン酸含有
   液から陰イオン交換材料を用いてフルクトース−２，６
   −ビスリン酸を精製するに際し、溶出液として一価の金
   属のアルカリ塩の溶液を用いることを特徴とするフルク
   トース−２，６−ビスリン酸の精製方法。