JPH10316698A - フルクトース−２，６−ビスリン酸の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 フルクトース−２，６−ビスリン酸の合成副
生成物であり、フルクトース−２，６−ビスリン酸との
分離が非常に困難であるフルクトース−１，６−ビスリ
ン酸を容易に除去することができ、高純度のフルクトー
ス−２，６−ビスリン酸を取得することができるフルク
トース−２，６−ビスリン酸の精製方法を提供する。 【解決手段】 フルクトース−２，６−ビスリン酸とフ
ルクトース−１，６−ビスリン酸とを含有する溶液から
フルクトース−２，６−ビスリン酸を精製するに際し、
フルクトース−２，６−ビスリン酸とフルクトース−
１，６−ビスリン酸とを含有する溶液に、アルドラーゼ
と、アルドラーゼの作用によりフルクトース−１，６−
ビスリン酸から生成する生成物に作用する酵素とを作用
させることを特徴とするフルクトース−２，６−ビスリ
ン酸の精製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フルクトース−
２，６−ビスリン酸（以下、Ｆ２，６Ｐ２と略記する）
の精製方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生体における糖代謝の調節機構として
は、例えば、インスリンホルモンによる調節、グルカゴ
ンやアドレナリンによる調節、セカンドメッセンジャー
と呼ばれるサイクリックアデノシン５’−モノリン酸に
よる調節、アデノシン５’−モノリン酸（以下、ＡＭＰ
と略記する）、アデノシン５’−トリリン酸（以下、Ａ
ＴＰと略記する）、クエン酸による調節、Ｆ２，６Ｐ２
による調節等が報告されている。

【０００３】生体における糖代謝は解糖系と呼ばれる一
連の経路により行われ、この経路において、ホスホフル
クトキナーゼ１酵素（ Ｅ．Ｃ．２．７．１．１１ ：
以下、ＰＦＫ１と略記する）は重要な調節因子である。
このＰＦＫ１を活性化するＦ２，６Ｐ２が糖代謝に関す
る因子として重要であることが、近年確認されている。
さらに、Ｆ２，６Ｐ２は、糖尿病、糖尿病合併症治療剤
及び肝細胞増殖促進剤として有用であることが報告され
ている（特開平２―２０２８２２号公報参照）。

【０００４】従来、Ｆ２，６Ｐ２の製造方法としては、
（１）フルクトース−１，６−ビスリン酸（以下、Ｆ
１，６Ｐ２と略記する）から、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを触媒としてフルクトース−１，２−サイクリ
ック−６−ビスリン酸（以下、ＦＣＰと略記する）を
得、さらにこのＦＣＰをアルカリで部分分解することに
より製造する方法〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー誌、１１７巻、３１９頁（１９８１
年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー誌、２５６巻、８６７９頁（１９８１年）、特開昭６
０−１６１９９４号公報参照〕と、（２）酵母の菌体破
砕液からポリエチレングリコール沈殿、セファクリルブ
ルー（Sephacryl-blue）樹脂、ＣＭセファデックス（CM
-Sephadex ）樹脂を用いて精製したホスホフルクトキナ
ーゼ２酵素（ Ｅ．Ｃ．２．７．１．１０５ ：以下、
ＰＦＫ２と略記する）をフルクトース−６−リン酸（以
下、Ｆ６Ｐと略記する）とＡＴＰとに作用させることに
より製造する方法〔バイオケミストリー誌、３２巻、１
１１４７頁（１９９３年）参照〕が知られている。

【０００５】しかし、上記の方法のうち、（１）の方法
ではＦＣＰからＦ２，６Ｐ２への変換（アルカリによる
分解）効率が１５％と低く、８５％が副生成物であるＦ
１，６Ｐ２に変換されてしまうという問題があった〔ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
誌、１１７巻、３２０頁（１９８１年）〕。また、
（２）の方法でも、酵母の菌体破砕液からＰＦＫ２を精
製する工程でＰＦＫ１が十分に除去できていないと、Ｐ
ＦＫ１がＦ６ＰとＡＴＰとからＦ１，６Ｐ２を合成して
しまうという問題があった。このようにして、Ｆ２，６
Ｐ２を合成する際に副生成物としてＦ１，６Ｐ２が生成
するため、高純度のＦ２，６Ｐ２を得るにはＦ２，６Ｐ
２からＦ１，６Ｐ２を分離することが必要となるが、Ｆ
１，６Ｐ２はＦ２，６Ｐ２の位置異性体であり、両者は
非常に似た構造を有しているため、カラム等を用いて両
者を分離することは非常に困難である。

【０００６】Ｆ２，６Ｐ２からＦ１，６Ｐ２を分離する
方法としては、Ｆ１，６Ｐ２をフルクトース−１，６−
ホスファターゼにより、Ｆ６Ｐとリン酸に分解し、その
後イオン交換樹脂を用いてＦ２，６Ｐ２を分離精製する
方法が知られている〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー誌、１１７巻、３２１頁（１９８
１年）〕。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかし、この方法では
溶液中のＦ２，６Ｐ２がフルクトース−１，６−ホスフ
ァターゼを不活性化するため、Ｆ１，６Ｐ２の分解が十
分に進まず、このため、高純度のＦ２，６Ｐ２を得るこ
とができないという問題があった。本発明は、Ｆ２，６
Ｐ２とＦ１，６Ｐ２が共存する溶液から高純度のＦ２，
６Ｐ２を精製する方法を提供することを目的とするもの
である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意検討の結果、Ｆ２，６Ｐ２
の合成液中に存在する副生成物であるＦ１，６Ｐ２にア
ルドラーゼと、Ｆ１，６Ｐ２のアルドラーゼ分解物に作
用する酵素とを作用させることにより、Ｆ１，６Ｐ２を
効率よく分解することができるということを見出し、本
発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、Ｆ２，
６Ｐ２とＦ１，６Ｐ２とを含有する溶液からＦ２，６Ｐ
２を精製するに際し、Ｆ２，６Ｐ２とＦ１，６Ｐ２とを
含有する溶液に、アルドラーゼと、アルドラーゼの作用
によりＦ１，６Ｐ２から生成する生成物に作用する酵素
とを作用させることを特徴とするＦ２，６Ｐ２の精製方
法を要旨とするものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１０】Ｆ２，６Ｐ２は、近年動物組織中に微量物
質として発見された下記一般式で表わされる糖リン酸化
合物である。

【００１１】

【化１】

【００１２】一方、Ｆ１，６Ｐ２は下記一般式で表わさ
れるＦ２，６Ｐ２の位置異性体である。

【００１３】

【化２】

【００１４】本発明に用いられるアルドラーゼは、下記
反応式に示すようにＦ１，６Ｐ２をグリセルアルデヒド
−３−リン酸（以下、ＧＡＰと略記する）とジヒドロキ
シアセトンリン酸（以下、ＤＡＰと略記する）とに分解
する酵素である。

【００１５】

【化３】

【００１６】アルドラーゼは解糖系を有する生物に広く
分布しており、本発明に用いられるアルドラーゼとして
は、パン酵母、ウシの肝、ウサギの筋肉及び肝から抽出
されたもの等が挙げられるが、特にＦ１，６Ｐ２への基
質特異性の高さから、ウサギの筋肉から抽出したアルド
ラーゼを用いることが好ましい。

【００１７】本発明においては、アルドラーゼによるＦ
１，６Ｐ２分解反応を促進させるため、アルドラーゼの
作用によって生成してくるＧＡＰ又はＤＡＰを他の化合
物に代える酵素を同時に作用させ、反応の平衡をＦ１，
６Ｐ２の分解反応に傾かせる。

【００１８】このような酵素のうち、ＧＡＰに作用する
酵素としては、トリオースリン酸イソメラーゼ（以下、
ＴＩＭと略記する）が、ＤＡＰに作用する酵素としては
グリセロール−３−リン酸脱水素酵素（以下、ＧＤＨと
略記する）が挙げられ、下記反応式に示すようにＴＩＭ
はＧＡＰに作用してＤＡＰを、ＧＤＨはＤＡＰに作用し
てグリセロール−３−リン酸（以下、Ｇ３Ｐと略記す
る）を生成する。

【００１９】

【化４】

【００２０】本発明においてＧＡＰ、ＤＡＰに作用する
酵素はこれらの酵素に限定されるものではなく、この
他、ＧＡＰに作用する酵素としては、グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸脱水素酵素、ＤＡＰに作用する酵素とし
ては、ジヒドロキシアセトンリン酸ホスホリアーゼ、ジ
ヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼ等
が挙げられる。

【００２１】本発明においては、これらの酵素の一種以
上をアルドラーゼと共存させることが必要であり、特に
ＧＡＰに作用する酵素と、ＤＡＰに作用する酵素を共に
共存させることが好ましい。

【００２２】本発明に用いるアルドラーゼの濃度として
は、１ｍＭのＦ１，６Ｐ２に対して、１ユニット／リッ
トル以上であることが好ましく、特に１０ユニット／リ
ットル〜５０ユニット／リットルであることが好まし
い。また、本発明に用いるＧＡＰ又はＤＡＰに作用する
酵素の濃度としては、１ｍＭのＦ１，６Ｐ２に対して２
ユニット／リットル以上であることが好ましく、特に５
ユニット／リットル〜２００ユニット／リットルである
ことが好ましく、ＴＩＭとＧＤＨを用いる場合には、Ｔ
ＩＭが２ユニット／リットル以上でＧＤＨが５ユニット
／リットル以上であることが好ましく、特にＴＩＭが２
０ユニット／リットル〜１００ユニット／リットルでＧ
ＤＨが１０ユニット／リットル〜５０ユニット／リット
ルであることが好ましい。

【００２３】その他に、ＧＤＨを使用する場合には、Ｇ
ＤＨによって触媒される反応を促進させるため、ＮＡＤ
ＨをＦ１，６Ｐ２と同じ濃度以上添加することが好まし
く、特に１〜５倍量添加することが好ましい。

【００２４】反応温度としては、２５〜３５℃が好まし
く、特に２８〜３２℃が好ましい。また、反応時間とし
ては、Ｆ１，６Ｐ２が十分分解する時間であれば特に制
限されないが、１０分以上が好ましく、特に２０〜６０
分が好ましい。

【００２５】このような酵素反応により、溶液中のＦ
１，６Ｐ２はほぼ完全に分解され、一方、Ｆ２，６Ｐ２
はほとんど分解されない。このようにしてＦ１，６Ｐ２
を分解除去した溶液からさらにＦ２，６Ｐ２を精製する
には、Ｆ１，６Ｐ２の分解物であるＧＡＰ、ＤＡＰ及び
Ｇ３Ｐはいずれも１個のリン酸基を有する化合物である
のに対してＦ２，６Ｐ２は２個のリン酸基を有する化合
物であるため、両者の陰イオン交換樹脂に対する吸着力
の異なることを利用して、陰イオン交換樹脂により容易
に行うことができる。

【００２６】このようにして精製されたＦ２，６Ｐ２
は、電気透析又は逆浸透膜等による脱塩操作によりさら
に精製してもよく、また凍結乾燥等を行うことにより粉
末状で得ることができる。

【００２７】

【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。

【００２８】参考例１（ＰＦＫ２の精製） ＰＦＫ２組み換え酵母サッカロミセス・セレビジエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）ＢＪ２１６８／ｐＡＢ１０
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５２１０）をグルコース（石津製薬
社製、品番０３６−００６４）２重量％、カザミノ酸
（日水製薬社製、品番０５８３４）０．５重量％、アミ
ノ酸非含有窒素源（ＤＩＦＣＯ社製、品番０９１９−１
５−３）０．６７重量％、Ｌ−ロイシン（石津製薬社
製、品番０１２−４０２１）３０ｍｇ／リットル、Ｌ−
トリプトファン（石津製薬社製、品番０１５−３３１
１）３０ｍｇ／リットルを含む培地（ｐＨ５．２）２０
リットルに植菌し、３０℃で３０リットルジャーファー
メンターを用いて培養した。この培養液２０リットル
を、ガラクトース（石津製薬社製、品番０１２−３３０
３）２重量％、カザミノ酸０．５重量％、アミノ酸非含
有窒素源０．６７重量％、Ｌ−ロイシン３０ｍｇ／リッ
トル、Ｌ−トリプトファン３０ｍｇ／リットルを含む培
地（ｐＨ５．２）４００リットルに加え、３０℃で５０
０リットルジャーファーメンターを用いて２４時間培養
することにより４．２Ｋｇの菌体を得た。

【００２９】次に、得られた菌体２００ｇをバッファー
Ａ〔５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（石津製薬社製、品番
３２５−２０７０）、２０ｍＭのＫＣｌ（石津製薬社
製、品番０３４−５２８３）、２ｍＭのβ−メルカプト
エタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、石津製
薬社製、品番０４３−０４６１）、２ｍＭのＥＤＴＡ
（石津製薬社製、品番０４２−０６２１）を含む、ｐＨ
７．５〕５００ミリリットルに懸濁し、この懸濁液をＤ
ＹＮＯ−ＭＩＬＬ破砕機（ｔｙｐｅ ＫＤＬ、シンマル
エンタープライゼス社製）と直径０．２５ｍｍのガラス
ビーズ（シンマルエンタープライゼス社製）を用いてガ
ラスビーズ破砕をした。得られた菌体破砕液のＰＦＫ２
活性は７５ユニットであった。この菌体破砕液に高分子
凝集剤（ユニフロッカーＵＦ−３０４、ユニチカ社製）
の１．５重量％溶液を、破砕液量の１２％相当分を加え
た。５分間撹拌した後、この液を遠心分離（４℃、５
分、８０００ｒｐｍ）し、上清を回収した。得られた上
清をデアエセファロースＦＦ（DEAE-SepharoseFF、ファ
ルマシア製）及びブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（Blue
-Sepharose CL-6B、ファルマシア製）を直列につないだ
カラムに充填した後、バッファーＡのＫＣｌ濃度を２Ｍ
にした溶液により、ＰＦＫ２を溶出した。この時のＰＦ
Ｋ２活性は８ユニットであり、ＰＦＫ１の活性は検出限
界以下であった。

【００３０】参考例２（Ｆ２，６Ｐ２の酵素合成） ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（石津製薬社製、品番３２
５−２０７０）、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂ （石津製薬社
製、品番０１３−３０４３）、１５ｍＭのＡＴＰ（シグ
マ社製、品番Ａ−５３９４）、１０ｍＭのＦ６Ｐを含む
反応液（ｐＨ９．０）５０ミリリットルに、参考例１で
精製したＰＦＫ２を５０ミリユニット／ミリリットルと
なるように加えて３０℃で反応を行った。反応開始から
４．５時間後、反応液を煮沸して反応を停止した。この
間の反応液中のＦ２，６Ｐ２及びＦ１，６Ｐ２の量を経
時的に測定した。

【００３１】その結果を図１に示す。図１はＦ２，６Ｐ
２及びＦ１，６Ｐ２の合成量の経時変化を示す図であ
り、縦軸にＦ２，６Ｐ２及びＦ１，６Ｐ２の合成量を、
横軸に反応時間を示している。図１から、反応開始から
４．５時間後にＦ２，６Ｐ２が反応収率４１％で合成さ
れていることがわかる。また、ＰＦＫ１非存在下でＦ
２，６Ｐ２合成を行ったつもりであったが、Ｆ１，６Ｐ
２が反応収率５％で合成されていることがわかる。これ
は、合成されてきたＦ２，６Ｐ２が溶液中の極微量存在
するＰＦＫ１を活性化し、Ｆ１，６Ｐ２の合成を促進し
たためであると思われる。

【００３２】実施例１ 参考例２の方法で得たＦ２，６Ｐ２合成液をＨＣｌによ
りｐＨを８．０に調節し、１ｍＭのＮＡＤＨ（ベーリン
ガー社製、品番１２８０２３）を添加した。これに、１
０ユニット／リットルのアルドラーゼ（ベーリンガー社
製、品番１０２６５２）、２０ユニット／リットルのＴ
ＩＭ（ベーリンガー社製、品番１０９７５４）及び１０
ユニット／リットルのＧＤＨ（ベーリンガー社製、品番
１２７７５２）を添加し、２８℃で反応を行った。反応
開始から１時間後、反応液を煮沸して反応を停止した。
この間の反応液中のＦ１，６Ｐ２の量を経時的に測定し
た。

【００３３】その結果を図２に示す。図２は溶液中に残
存するＦ１，６Ｐ２量の経時変化を示す図であり、縦軸
にＦ１，６Ｐ２の残存量を、横軸に反応時間を示してい
る。図２から、Ｆ１，６Ｐ２にアルドラーゼとＴＩＭ、
ＧＤＨを作用させることによりＦ１，６Ｐ２を完全に分
解することができることがわかる。

【００３４】活性炭（ダイヤホープＳ８０、三菱化学社
製）１０ミリリットルをカラムに充填し、蒸留水１００
ミリリットルで洗浄した後、蒸留水で２倍に希釈した上
記のＦ１，６Ｐ２を分解除去した反応液をアプライし、
蒸留水２００ミリリットルでＦ２，６Ｐ２含有液を溶出
することにより、反応溶液からアデノシン、ＡＴＰ、Ａ
ＭＰなどのアデノシンを有する化合物を除去した。

【００３５】さらに、陰イオン交換樹脂ダイアイオン
ＷＡ１０（ＤＩＡＩＯＮ ＷＡ１０、三菱化学社製、Ｏ
Ｈ型）５ミリリットルを充填したカラムに、この溶出液
をアプライし、蒸留水２０ミリリットル及び０．２Ｍの
ＮａＨＣＯ₃ （石津製薬社製、品番０３４―５９３３）
１００ミリリットルで洗浄した後、０．５ＭのＮａＨＣ
Ｏ₃ １００ミリリットルでＦ２，６Ｐ２を溶出した。そ
の結果を図３に示す。図３は、陰イオン交換樹脂ダイア
イオン ＷＡ１０を用いてＦ２，６Ｐ２含有液を精製し
たときの結果を示す図であり、縦軸に濃度を、横軸にフ
ラクションナンバーを示している。図３から、陰イオン
交換樹脂ダイアイオン ＷＡ１０を用いることによりＦ
２，６Ｐ２とＦ１，６Ｐ２の分解物及びＦ６Ｐを効率よ
く分離することができ、高純度のＦ２，６Ｐ２を得るこ
とができることがわかる。

【００３６】このようにして精製したＦ２，６Ｐ２含有
液を、逆浸透膜（ＮＴＲ−７２５０、日東電工社製）を
用いて電気伝導度が１０ｍｍｈｏになるまで蒸留水で脱
塩濃縮した。この濃縮液を、４℃で５０時間凍結乾燥す
ることにより４３ｍｇのＦ２，６Ｐ２の粉末を得た。

【００３７】

【発明の効果】本発明によれば、Ｆ２，６Ｐ２の合成副
生成物であり、Ｆ２，６Ｐ２との分離が非常に困難であ
るＦ１，６Ｐ２をほぼ完全に分解することができるの
で、カラム等によりＦ２，６Ｐ２を高収率で容易に精製
でき、さらに、高純度のＦ２，６Ｐ２を取得することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｆ６ＰからＰＦＫ２を用いてＦ２，６Ｐ２を合
成したときのＦ２，６Ｐ２及びＦ１，６Ｐ２の生成量の
経時変化を示す図である。

【図２】Ｆ１，６Ｐ２をアルドラーゼ、ＴＩＭ及びＧＤ
Ｈで分解したときのＦ１，６Ｐ２残存量の経時変化を示
す図である。

【図３】陰イオン交換樹脂ダイアイオン ＷＡ１０を用
いてＦ２，６Ｐ２を精製したときの結果を示す図であ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フルクトース−２，６−ビスリン酸とフ
   ルクトース−１，６−ビスリン酸とを含有する溶液から
   フルクトース−２，６−ビスリン酸を精製するに際し、
   フルクトース−２，６−ビスリン酸とフルクトース−
   １，６−ビスリン酸とを含有する溶液に、アルドラーゼ
   と、アルドラーゼの作用によりフルクトース−１，６−
   ビスリン酸から生成する生成物に作用する酵素とを作用
   させることを特徴とするフルクトース−２，６−ビスリ
   ン酸の精製方法。