JPH1033182A - ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子 - Google Patents
ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子Info
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- JPH1033182A JPH1033182A JP8195080A JP19508096A JPH1033182A JP H1033182 A JPH1033182 A JP H1033182A JP 8195080 A JP8195080 A JP 8195080A JP 19508096 A JP19508096 A JP 19508096A JP H1033182 A JPH1033182 A JP H1033182A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 アルカリゲネス(Alcaligenes)属由来の
ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を有
する調節因子およびそれをコードする遺伝子DNA並びに
この遺伝子及びニトリラーゼ遺伝子を含む形質転換体を
用いてニトリラーゼを製造する方法 【効果】 本調節因子をコードする遺伝子およびプロモ
ーター領域を含むニトリラーゼ遺伝子を宿主細菌内に共
存させることにより、ニトリラーゼの生産が可能とな
る。また、本調節遺伝子とニトリラーゼ遺伝子プロモー
ターの利用により、異種タンパク質のニトリル化合物に
よる発現調節が可能となる。
ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を有
する調節因子およびそれをコードする遺伝子DNA並びに
この遺伝子及びニトリラーゼ遺伝子を含む形質転換体を
用いてニトリラーゼを製造する方法 【効果】 本調節因子をコードする遺伝子およびプロモ
ーター領域を含むニトリラーゼ遺伝子を宿主細菌内に共
存させることにより、ニトリラーゼの生産が可能とな
る。また、本調節遺伝子とニトリラーゼ遺伝子プロモー
ターの利用により、異種タンパク質のニトリル化合物に
よる発現調節が可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ニトリラーゼ遺伝
子の発現に関わる調節因子およびそれをコードする遺伝
子DNAに関する。さらに、詳しくはアルカリゲネス フ
ェカリス( Alcaligenes faecalis)JM3株に由来し、ニト
リラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を有する
調節因子およびそれをコードする遺伝子DNAに関する。
子の発現に関わる調節因子およびそれをコードする遺伝
子DNAに関する。さらに、詳しくはアルカリゲネス フ
ェカリス( Alcaligenes faecalis)JM3株に由来し、ニト
リラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を有する
調節因子およびそれをコードする遺伝子DNAに関する。
【０００２】
【従来の技術】ニトリル化合物から対応する有機酸を製
造する際の触媒として、微生物あるいは微生物由来の酵
素（例えばニトリラーゼ）を用いることにより、温和な
条件で有機酸を生成させることができる（特開昭58-201
992、同61-40795号、特開平2-84198号、3-251192各公報
参照）。
造する際の触媒として、微生物あるいは微生物由来の酵
素（例えばニトリラーゼ）を用いることにより、温和な
条件で有機酸を生成させることができる（特開昭58-201
992、同61-40795号、特開平2-84198号、3-251192各公報
参照）。
【０００３】クローン化されたニトリラーゼ遺伝子を有
する組換え体によるニトリルの加水分解では、菌体内に
同遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生
物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させるこ
とが期待できる。既に、本発明者らはより高い触媒活性
を持つ微生物触媒を調製する目的で、Alcaligenes faec
alis JM3株のニトリラーゼ遺伝子をクローニングし、大
腸菌ラクトースプロモーターの下流に本遺伝子を挿入し
たプラスミドを作製している（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90, 247-251(1993)）。本プラスミドを導入した大
腸菌はＩＰＴＧ（イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトシ
ド）存在下で培養することにより、高いニトリラーゼ活
性を示した。一方、本ニトリラーゼ遺伝子を含む約4 kb
の断片を挿入したプラスミドを有する大腸菌では、微弱
な活性しか認められずIPTGによる誘導も認められなかっ
た。
する組換え体によるニトリルの加水分解では、菌体内に
同遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生
物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させるこ
とが期待できる。既に、本発明者らはより高い触媒活性
を持つ微生物触媒を調製する目的で、Alcaligenes faec
alis JM3株のニトリラーゼ遺伝子をクローニングし、大
腸菌ラクトースプロモーターの下流に本遺伝子を挿入し
たプラスミドを作製している（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90, 247-251(1993)）。本プラスミドを導入した大
腸菌はＩＰＴＧ（イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトシ
ド）存在下で培養することにより、高いニトリラーゼ活
性を示した。一方、本ニトリラーゼ遺伝子を含む約4 kb
の断片を挿入したプラスミドを有する大腸菌では、微弱
な活性しか認められずIPTGによる誘導も認められなかっ
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ニトリラー
ゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子並びに
この遺伝子及びニトリラーゼ遺伝子を含む形質転換体を
用いてニトリラーゼを製造する方法を提供することを目
的とする。
ゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子並びに
この遺伝子及びニトリラーゼ遺伝子を含む形質転換体を
用いてニトリラーゼを製造する方法を提供することを目
的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らはニトリラー
ゼ発現が殆どんど認められないのは、ニトリラーゼ遺伝
子のプロモーターが機能しておらず、プロモーターが機
能するために必要な調節因子をコードする遺伝子（以下
調節遺伝子）がJM3株染色体DNA上のどこかに存在するの
ではないかと考えた。上記の約4 kbの断片を挿入したプ
ラスミドを有する大腸菌をイソバレロニトリル存在下で
培養することにより顕著なニトリラーゼ活性が発現する
ことを見いだし、調節遺伝子がこの断片上に存在するこ
とを明らかにした。更に、調節遺伝子の位置を同定した
後、ニトリラーゼ遺伝子と調節遺伝子を別々のプラスミ
ドに挿入し、これらを同じ大腸菌に導入することによ
り、調節遺伝子としての働きを確認し、本発明を完成す
るに至った。
ゼ発現が殆どんど認められないのは、ニトリラーゼ遺伝
子のプロモーターが機能しておらず、プロモーターが機
能するために必要な調節因子をコードする遺伝子（以下
調節遺伝子）がJM3株染色体DNA上のどこかに存在するの
ではないかと考えた。上記の約4 kbの断片を挿入したプ
ラスミドを有する大腸菌をイソバレロニトリル存在下で
培養することにより顕著なニトリラーゼ活性が発現する
ことを見いだし、調節遺伝子がこの断片上に存在するこ
とを明らかにした。更に、調節遺伝子の位置を同定した
後、ニトリラーゼ遺伝子と調節遺伝子を別々のプラスミ
ドに挿入し、これらを同じ大腸菌に導入することによ
り、調節遺伝子としての働きを確認し、本発明を完成す
るに至った。
【０００６】すなわち、ニトリラーゼ遺伝子プロモータ
ーを活性化する作用を持ち、配列番号１のアミノ酸配列
を有する調節因子をコードする遺伝子DNAである。そし
て、上記調節因子をコードする遺伝子DNAとしては、例
えば配列番号２の塩基配列からなるDNAがが挙げられ
る。さらに、本発明は上記遺伝子DNA及びニトリラーゼ
遺伝子DNAを含むプラスミドで形質転換された形質転換
体である。さらに、本発明は上記遺伝子DNAを含むプラ
スミド及びニトリラーゼ遺伝子DNAを含むプラスミドで
形質転換された形質転換体である。
ーを活性化する作用を持ち、配列番号１のアミノ酸配列
を有する調節因子をコードする遺伝子DNAである。そし
て、上記調節因子をコードする遺伝子DNAとしては、例
えば配列番号２の塩基配列からなるDNAがが挙げられ
る。さらに、本発明は上記遺伝子DNA及びニトリラーゼ
遺伝子DNAを含むプラスミドで形質転換された形質転換
体である。さらに、本発明は上記遺伝子DNAを含むプラ
スミド及びニトリラーゼ遺伝子DNAを含むプラスミドで
形質転換された形質転換体である。
【０００７】さらに、本発明は上記形質転換体を培地中
でニトリル類の存在下に培養し、培養物からニトリラー
ゼを採取することを特徴とするニトリラーゼの製造法で
ある。上記ニトリル類としては、プロピオニリル、Ｎ−
ブチロニトリル、イソブチロニトリル、イソバレロニト
リル、ベンゾニトリル、３−シアノピリジンなどが挙げ
られる。さらに、本発明はニトリラーゼ遺伝子プロモー
ターを活性化する作用を持ち、配列番号１のアミノ酸配
列を有する調節因子ポリペプチドである。以下に、本発
明を詳細に説明する。本発明は、下記の工程により実施
されるものである。
でニトリル類の存在下に培養し、培養物からニトリラー
ゼを採取することを特徴とするニトリラーゼの製造法で
ある。上記ニトリル類としては、プロピオニリル、Ｎ−
ブチロニトリル、イソブチロニトリル、イソバレロニト
リル、ベンゾニトリル、３−シアノピリジンなどが挙げ
られる。さらに、本発明はニトリラーゼ遺伝子プロモー
ターを活性化する作用を持ち、配列番号１のアミノ酸配
列を有する調節因子ポリペプチドである。以下に、本発
明を詳細に説明する。本発明は、下記の工程により実施
されるものである。
【０００８】1）ニトリラーゼ遺伝子および調節因子を
コードする遺伝子を含むプラスミドの調製、及び該プラ
スミドを導入した大腸菌形質転換体の作製 2）培地へのニトリル化合物の添加によるニトリラーゼ
活性の誘導 3）欠失プラスミドの作製およびこれらを含む大腸菌形
質転換体のニトリラーゼ活性測定 4）塩基配列の決定 5）ニトリラーゼ遺伝子、調節遺伝子を別々のプラスミ
ドに挿入し、同じ大腸菌に導入することによる形質転換
体の作成及びこの形質転換体を用いたニトリルによるニ
トリラーゼの誘導発現の確認
コードする遺伝子を含むプラスミドの調製、及び該プラ
スミドを導入した大腸菌形質転換体の作製 2）培地へのニトリル化合物の添加によるニトリラーゼ
活性の誘導 3）欠失プラスミドの作製およびこれらを含む大腸菌形
質転換体のニトリラーゼ活性測定 4）塩基配列の決定 5）ニトリラーゼ遺伝子、調節遺伝子を別々のプラスミ
ドに挿入し、同じ大腸菌に導入することによる形質転換
体の作成及びこの形質転換体を用いたニトリルによるニ
トリラーゼの誘導発現の確認
【０００９】なお、ニトリラーゼの誘導発現において、
上記形質転換体としてはニトリラーゼ遺伝子及び調節遺
伝子を同一のプラスミドに導入したものも用いられる。
本発明で用いられるアルカリゲネス フェカリス（Alca
ligenes faecalis）JM3 株はFERM P-13277として工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。本ニト
リラーゼ遺伝子を含むプラスミドpNJM30は、これを有す
る組換え体エッシエリキア コリ ( Escherchia coli)J
M105/pNJM30 （FERM P-13278）およびエッシエリキア
コリ ( Escherchia coli)JM109/pNJM30 （FERM P-1327
9）としてとして寄託されている。また、本調節因子を
コードする遺伝子は、配列番号3の情報を元にして、ア
ルカリゲネス フェカリス( Alcaligenes faecalis)JM3
株の染色体DNAを鋳型としてPCR（ポリメラーゼ連鎖反
応）法により容易に増幅させることができる。
上記形質転換体としてはニトリラーゼ遺伝子及び調節遺
伝子を同一のプラスミドに導入したものも用いられる。
本発明で用いられるアルカリゲネス フェカリス（Alca
ligenes faecalis）JM3 株はFERM P-13277として工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。本ニト
リラーゼ遺伝子を含むプラスミドpNJM30は、これを有す
る組換え体エッシエリキア コリ ( Escherchia coli)J
M105/pNJM30 （FERM P-13278）およびエッシエリキア
コリ ( Escherchia coli)JM109/pNJM30 （FERM P-1327
9）としてとして寄託されている。また、本調節因子を
コードする遺伝子は、配列番号3の情報を元にして、ア
ルカリゲネス フェカリス( Alcaligenes faecalis)JM3
株の染色体DNAを鋳型としてPCR（ポリメラーゼ連鎖反
応）法により容易に増幅させることができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、実施例により詳細に説明す
る。ただし、本発明はこれらの実施例により限定される
ものではない。なお、以下の実施例で用いられる制限酵
素及びベクターは市販のものである。
る。ただし、本発明はこれらの実施例により限定される
ものではない。なお、以下の実施例で用いられる制限酵
素及びベクターは市販のものである。
【００１１】
１）イソバレロニトリルによる酵素誘導 JM3株ニトリラーゼ遺伝子（特開平６-153968号公報参
照) を含むSphI断片をベクターpUC19に挿入して得られ
たプラスミドpNJM20（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,
247-251(1993)）を大腸菌JM109株に導入し形質転換体
を得た。大腸菌の形質転換は以下のように行った。大腸
菌JM109株（宝酒造(株)製）をLB培地（1%トリプトン、
0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム）10mLに37℃で12
時間培養後、新規な同培地に1%植菌し2時間培養した。
遠心により集菌した後、冷80 mM CaCl2溶液を 5mL加
え、0℃で20分間放置後、再度遠心し、冷80 mM CaCl2溶
液0.5 mLに懸濁した。これに上記反応液60μLを加え、0
℃で30分間放置後、42℃で2分間ヒートショックを与
え、LB培地0.8 mLを加え37℃にて60分間振盪培養した。
100 μLずつをアンピシリン50μg / mL含有LB寒天培地
にまき、37℃で培養した。寒天培地上に生育したコロニ
ーをアンピシリン50μg / mL含有LB培地1 mLにて培養
し、プラスミドを抽出し、pNJM20が導入されているかど
うかを確認した。プラスミドの抽出はBirnboimとDoly
( Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)) の方法により
行った。
照) を含むSphI断片をベクターpUC19に挿入して得られ
たプラスミドpNJM20（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,
247-251(1993)）を大腸菌JM109株に導入し形質転換体
を得た。大腸菌の形質転換は以下のように行った。大腸
菌JM109株（宝酒造(株)製）をLB培地（1%トリプトン、
0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム）10mLに37℃で12
時間培養後、新規な同培地に1%植菌し2時間培養した。
遠心により集菌した後、冷80 mM CaCl2溶液を 5mL加
え、0℃で20分間放置後、再度遠心し、冷80 mM CaCl2溶
液0.5 mLに懸濁した。これに上記反応液60μLを加え、0
℃で30分間放置後、42℃で2分間ヒートショックを与
え、LB培地0.8 mLを加え37℃にて60分間振盪培養した。
100 μLずつをアンピシリン50μg / mL含有LB寒天培地
にまき、37℃で培養した。寒天培地上に生育したコロニ
ーをアンピシリン50μg / mL含有LB培地1 mLにて培養
し、プラスミドを抽出し、pNJM20が導入されているかど
うかを確認した。プラスミドの抽出はBirnboimとDoly
( Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)) の方法により
行った。
【００１２】得られた形質転換体をイソバレロニトリル
を添加した10mlのLB培地で37℃、8時間培養した。対照
実験として無添加の培地を用いて培養した。培養液より
遠心分離により集菌し、150 mM塩化ナトリウム溶液で洗
浄後、10mMジチオスレイトールを含む0.1Mリン酸カリウ
ム緩衝液(pH7.0)に菌体を懸濁した。ニトリラーゼ活性
測定は以下のように行った。適当に水で希釈した菌体懸
濁液0.1 mLに50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を0.12
5 mL、20mMのチオフェン-2-アセトニトリルを0.5 mL加
え20℃にて10,20,30分間反応後、1N HClを0.2 mL加える
ことにより反応を停止させた。酵素反応により生成した
酸をHPLCにより分析した。その結果、イソバレロニトリ
ルによる顕著な酵素誘導が認められた。
を添加した10mlのLB培地で37℃、8時間培養した。対照
実験として無添加の培地を用いて培養した。培養液より
遠心分離により集菌し、150 mM塩化ナトリウム溶液で洗
浄後、10mMジチオスレイトールを含む0.1Mリン酸カリウ
ム緩衝液(pH7.0)に菌体を懸濁した。ニトリラーゼ活性
測定は以下のように行った。適当に水で希釈した菌体懸
濁液0.1 mLに50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を0.12
5 mL、20mMのチオフェン-2-アセトニトリルを0.5 mL加
え20℃にて10,20,30分間反応後、1N HClを0.2 mL加える
ことにより反応を停止させた。酵素反応により生成した
酸をHPLCにより分析した。その結果、イソバレロニトリ
ルによる顕著な酵素誘導が認められた。
【００１３】２）欠失プラスミドの作製とイソバレロニ
トリルによる誘導 上記プラスミドpNJM20（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
0, 247-251(1993)）からニトリラーゼ遺伝子(nitA)の上
流領域、下流領域を欠失させたプラスミドを以下のよう
にして作製した（図１参照）。pNJM20を制限酵素SphIで
切断し、SphIで切断したpUC19ベクターに挿入しpSS10お
よびpSS10Rを作製した。pSS10を制限酵素XbaIおよびKpn
Iで切断後、Kilo-Sequence用Deletion Kit（宝酒造
（株）製）を用いて種々の欠失を起こさせ、ライゲーシ
ョン後、工程１）と同様にして大腸菌JM109株に導入し
形質転換体を得た。形質転換体よりプラスミドを抽出し
欠失プラスミドpSS20〜pSS50を得た。同様にして、pSS1
0RよりpSS60R〜pSS90Rを作製した。
トリルによる誘導 上記プラスミドpNJM20（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
0, 247-251(1993)）からニトリラーゼ遺伝子(nitA)の上
流領域、下流領域を欠失させたプラスミドを以下のよう
にして作製した（図１参照）。pNJM20を制限酵素SphIで
切断し、SphIで切断したpUC19ベクターに挿入しpSS10お
よびpSS10Rを作製した。pSS10を制限酵素XbaIおよびKpn
Iで切断後、Kilo-Sequence用Deletion Kit（宝酒造
（株）製）を用いて種々の欠失を起こさせ、ライゲーシ
ョン後、工程１）と同様にして大腸菌JM109株に導入し
形質転換体を得た。形質転換体よりプラスミドを抽出し
欠失プラスミドpSS20〜pSS50を得た。同様にして、pSS1
0RよりpSS60R〜pSS90Rを作製した。
【００１４】制限酵素による切断は以下のように行っ
た。プラスミド溶液10μL、制限酵素用緩衝液（10倍濃
度）3 μL、制限酵素を 2μL、滅菌水 15μLを加え37℃
にて２時間反応させた。反応液に等量のＴＥ飽和フェノ
ールを加え撹拌後遠心し上層（水層）と下層に分離させ
た。上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量の
クロロホルムを加え同様の抽出操作を2回繰り返した。
上層に3μLの3M酢酸ナトリウムと90μLのエタノールを
加え、-80℃にて30分間放置後遠心し、乾燥してTEに溶
解した。ライゲーションはDNA Ligation Kit（宝酒造
（株）製）を用いて行った。
た。プラスミド溶液10μL、制限酵素用緩衝液（10倍濃
度）3 μL、制限酵素を 2μL、滅菌水 15μLを加え37℃
にて２時間反応させた。反応液に等量のＴＥ飽和フェノ
ールを加え撹拌後遠心し上層（水層）と下層に分離させ
た。上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量の
クロロホルムを加え同様の抽出操作を2回繰り返した。
上層に3μLの3M酢酸ナトリウムと90μLのエタノールを
加え、-80℃にて30分間放置後遠心し、乾燥してTEに溶
解した。ライゲーションはDNA Ligation Kit（宝酒造
（株）製）を用いて行った。
【００１５】これらのプラスミドを大腸菌JM109株に導
入し形質転換体を得、工程１）と同様に培養し活性測定
した。結果を図１に示した。この図において、JM3株DNA
断片上におけるふたつの矢印は、ニトリラーゼ遺伝子及
び本発明において見いだされた調節遺伝子の位置と方向
を示す。それぞれのプラスミドにおいて記された領域は
ベクターpUC19に挿入されたJM3株由来のDNA領域を示
し、矢印はベクターpUC19上のlacプロモータの位置と方
向を示す。ニトリラーゼ活性の強さを+で現した。-は活
性が検出されなかったことを示した。この図１の結果よ
りニトリラーゼ遺伝子の上流約0.3 kb、下流約1.5 kbの
領域がイソバレロニトリルによるニトリラーゼの誘導発
現に必要であることが明らかとなった。
入し形質転換体を得、工程１）と同様に培養し活性測定
した。結果を図１に示した。この図において、JM3株DNA
断片上におけるふたつの矢印は、ニトリラーゼ遺伝子及
び本発明において見いだされた調節遺伝子の位置と方向
を示す。それぞれのプラスミドにおいて記された領域は
ベクターpUC19に挿入されたJM3株由来のDNA領域を示
し、矢印はベクターpUC19上のlacプロモータの位置と方
向を示す。ニトリラーゼ活性の強さを+で現した。-は活
性が検出されなかったことを示した。この図１の結果よ
りニトリラーゼ遺伝子の上流約0.3 kb、下流約1.5 kbの
領域がイソバレロニトリルによるニトリラーゼの誘導発
現に必要であることが明らかとなった。
【００１６】３）塩基配列の決定 ニトリラーゼ遺伝子を含むMspIからMluI部位の1727 bp
の塩基配列は既に本発明者らにより報告されている（特
開平６-153968号公報参照) 。更に、本発明においてMlu
I部位からEcoRI部位までの910 bpの配列を決定した。塩
基配列の決定はTth DNA polymeraseを用いたチェーンタ
ーミネーション法（Sanger F. Science 214, 1205-121
0 (1980)）により行った。ニトリラーゼ遺伝子下流のEc
oRV部位からEcoRI部位までの1127 bpの長さの塩基配列
を配列番号3に示した。
の塩基配列は既に本発明者らにより報告されている（特
開平６-153968号公報参照) 。更に、本発明においてMlu
I部位からEcoRI部位までの910 bpの配列を決定した。塩
基配列の決定はTth DNA polymeraseを用いたチェーンタ
ーミネーション法（Sanger F. Science 214, 1205-121
0 (1980)）により行った。ニトリラーゼ遺伝子下流のEc
oRV部位からEcoRI部位までの1127 bpの長さの塩基配列
を配列番号3に示した。
【００１７】その結果、この領域には一つのオープンリ
ーディングフレーム（以下ORF）が見いだされ、このORF
にコードされるポリペプチドについてタンパク質データ
ベース(SWISS PROT)をホモロジー検索したところ、シュ
ードモナス プチダ(Pseudomonas putida ) のキシレン
代謝系遺伝子の誘導発現を調節するXylSや大腸菌のラム
ノース代謝系遺伝子の誘導発現を調節するRhaSとホモロ
ジーを有することが見いだされた。このORFはニトリラ
ーゼ遺伝子nitAの調節遺伝子と考えられたことからnitR
と命名した。
ーディングフレーム（以下ORF）が見いだされ、このORF
にコードされるポリペプチドについてタンパク質データ
ベース(SWISS PROT)をホモロジー検索したところ、シュ
ードモナス プチダ(Pseudomonas putida ) のキシレン
代謝系遺伝子の誘導発現を調節するXylSや大腸菌のラム
ノース代謝系遺伝子の誘導発現を調節するRhaSとホモロ
ジーを有することが見いだされた。このORFはニトリラ
ーゼ遺伝子nitAの調節遺伝子と考えられたことからnitR
と命名した。
【００１８】４）nitRの調節遺伝子としての確認 nitA、nitRを別々のプラスミドに挿入し、同じ大腸菌に
導入してイソバレロニトリルによるニトリラーゼの誘導
発現を調べた。nitAはベクターpSTV28およびpSTV29に、
nitRはベクターpUC18,pUC19に挿入した。即ち、pNA28お
よびpNA29はそれぞれnitAをベクターpSTV28およびpSTV2
9に挿入して得られた。pNR18およびpNR19はそれぞれnit
RをベクターpUC18,pUC19に挿入して得られた。これらプ
ラスミドの作製と構造を図２に示した。pNA28とpNR18、
pNA28とpNR19、pNA29とpNR18およびpNA29とpNR19を同時
に含む形質転換体を作製し、工程１）と同様にして活性
測定した。結果を図３に示した。IPTGの添加によりnitR
を高発現させるとニトリラーゼ活性が上昇した。この場
合にはイソバレロニトリルの添加効果は認められなくな
っていたが、nitRを高発現させない場合にはイソバレロ
ニトリル添加によりニトリラーゼ活性は上昇した。これ
らの結果より、nitRがニトリラーゼ発現の調節遺伝子で
あることが確認された。
導入してイソバレロニトリルによるニトリラーゼの誘導
発現を調べた。nitAはベクターpSTV28およびpSTV29に、
nitRはベクターpUC18,pUC19に挿入した。即ち、pNA28お
よびpNA29はそれぞれnitAをベクターpSTV28およびpSTV2
9に挿入して得られた。pNR18およびpNR19はそれぞれnit
RをベクターpUC18,pUC19に挿入して得られた。これらプ
ラスミドの作製と構造を図２に示した。pNA28とpNR18、
pNA28とpNR19、pNA29とpNR18およびpNA29とpNR19を同時
に含む形質転換体を作製し、工程１）と同様にして活性
測定した。結果を図３に示した。IPTGの添加によりnitR
を高発現させるとニトリラーゼ活性が上昇した。この場
合にはイソバレロニトリルの添加効果は認められなくな
っていたが、nitRを高発現させない場合にはイソバレロ
ニトリル添加によりニトリラーゼ活性は上昇した。これ
らの結果より、nitRがニトリラーゼ発現の調節遺伝子で
あることが確認された。
【００１９】
配列番号１： 配列の長さ：327 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：アルカリゲネス フェカリス（Alcaligenes fa
ecalis） 株名：ＪＭ３ 配列： ＭｅｔＧｌｕＧｌｎＴｒｐＳｅｒＴｈｒＴｈｒＡｌａＶａｌＰｒ
ｏＡｌａＩｌｅＡｒｇＡｒｇＡｌａ １５ ＰｒｏＴｙｒＴｒｐＭｅｔＧｌｕＡｌａＶａｌＡｓｎＬｙｓＡｌ
ａＴｙｒＶａｌＧｌｎＬｅｕＧｌｕ ３０ ＣｙｓＡｌａＶａｌＰｒｏＳｅｒＡｒｇＳｅｒＳｅｒＡｌａＰｒ
ｏＰｈｅＰｈｅＧｌｙＡｌａＩｌｅ ４５ ＴｈｒＡｒｇＡｒｇＧｌｕＬｅｕＡｌａＡｌａＶａｌＳｅｒＬｅ
ｕＳｅｒＨｉｓＩｌｅＴｈｒＳｅｒ ６０ ＴｈｒＴｈｒＧｌｎＴｈｒＶａｌＬｅｕＡｒｇＴｈｒＰｒｏＬｅ
ｕＧｌｎＩｌｅＳｅｒＡｒｇＡｌａ ７５ ＳｅｒＧｌｕＡｓｐＩｌｅＰｈｅＬｅｕＬｅｕＳｅｒＩｌｅＧｌ
ｎＶａｌＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙ ９０ ＬｙｓＬｅｕＶａｌＧｌｎＡｓｐＧｌｕＬｙｓＴｈｒＡｌａＨｉ
ｓＬｅｕＬｙｓＰｒｏＧｌｙＡｓｐ １０５ ＬｅｕＡｌａＬｅｕＴｙｒＡｓｐＳｅｒＴｈｒＡｒｇＰｒｏＴｙ
ｒＧｌｎＬｅｕＬｅｕＰｈｅＡｓｐ １２０ ＨｉｓＡｓｐＰｈｅＧｌｕＧｌｎＴｙｒＶａｌＬｅｕＳｅｒＬｅ
ｕＰｒｏＧｌｙＳｅｒＩｌｅＬｅｕ １３５ ＡｒｇＬｙｓＡｒｇＬｅｕＨｉｓＡｓｎＡｌａＧｌｕＡｓｐＭｅ
ｔＴｈｒＡｌａＣｙｓＬｙｓＩｌｅ １５０ ＴｈｒＳｅｒＡｌａＧｌｎＳｅｒＧｌｙＴｈｒＡｌａＡｒｇＬｅ
ｕＬｅｕＳｅｒＨｉｓＭｅｔＶａｌ １６５ ＳｅｒＧｌｕＬｅｕＭｅｔＡｓｐＣｙｓＰｒｏＰｒｏＳｅｒＧｌ
ｙＧｌｙＰｒｏＩｌｅＶａｌＡｓｐ １８０ ＬｅｕＳｅｒＬｅｕＡｌａＡｓｐＳｅｒＬｅｕＶａｌＧｌｙＩｌ
ｅＬｅｕＶａｌＡｌａＡｌａＬｅｕ １９５ ＡｌａＧｌｕＡｓｎＬｅｕＧｌｙＳｅｒＬｅｕＰｒｏＬｅｕＳｅ
ｒＡｓｐＡｓｐＴｈｒＧｌｙＳｅｒ ２１０ ＶａｌＡｒｇＡｒｇＡｓｐＡｒｇＩｌｅＬｙｓＡｌａＴｙｒＶａ
ｌＬｅｕＬｙｓＡｓｎＬｅｕＡｒｇ ２２５ ＡｓｐＰｒｏＧｌｕＬｅｕＡｓｎＩｌｅＧｌｙＬｙｓＩｌｅＡｌ
ａＬｙｓＡｒｇＬｅｕＴｈｒＬｅｕ ２４０ ＴｈｒＡｌａＳｅｒＴｈｒＶａｌＨｉｓＡｒｇＡｌａＴｒｐＧｌ
ｕＧｌｙＧｌｕＡｌａＡｓｐＳｅｒ ２５５ ＬｅｕＴｈｒＡｓｎＴｒｐＩｌｅＴｒｐＳｅｒＭｅｔＡｒｇＬｅ
ｕＬｙｓＧｌｙＡｌａＧｌｕＧｌｎ ２７０ ＡｓｐＬｅｕＡｒｇＡｒｇＬｅｕＡｌａＨｉｓＨｉｓＡｓｎＬｙ
ｓＴｈｒＩｌｅＴｈｒＧｌｕＩｌｅ ２８５ ＡｌａＴｙｒＨｉｓＴｒｐＧｌｙＰｈｅＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｌ
ａＨｉｓＰｈｅＳｅｒＡｒｇＡｌａ ３００ ＰｈｅＡｒｇＧｌｎＨｉｓＰｈｅＧｌｙＶａｌＰｒｏＰｒｏＬｙ
ｓＧｌｕＡｌａＡｒｇＧｌｕＳｅｒ ３１５ ＭｅｔＡｒｇＡｌａＬｅｕＶａｌＧｌｎＳｅｒＡｓｐＳｅｒＭｅ
ｔＰｒｏＶａｌ ３２７
ecalis） 株名：ＪＭ３ 配列： ＭｅｔＧｌｕＧｌｎＴｒｐＳｅｒＴｈｒＴｈｒＡｌａＶａｌＰｒ
ｏＡｌａＩｌｅＡｒｇＡｒｇＡｌａ １５ ＰｒｏＴｙｒＴｒｐＭｅｔＧｌｕＡｌａＶａｌＡｓｎＬｙｓＡｌ
ａＴｙｒＶａｌＧｌｎＬｅｕＧｌｕ ３０ ＣｙｓＡｌａＶａｌＰｒｏＳｅｒＡｒｇＳｅｒＳｅｒＡｌａＰｒ
ｏＰｈｅＰｈｅＧｌｙＡｌａＩｌｅ ４５ ＴｈｒＡｒｇＡｒｇＧｌｕＬｅｕＡｌａＡｌａＶａｌＳｅｒＬｅ
ｕＳｅｒＨｉｓＩｌｅＴｈｒＳｅｒ ６０ ＴｈｒＴｈｒＧｌｎＴｈｒＶａｌＬｅｕＡｒｇＴｈｒＰｒｏＬｅ
ｕＧｌｎＩｌｅＳｅｒＡｒｇＡｌａ ７５ ＳｅｒＧｌｕＡｓｐＩｌｅＰｈｅＬｅｕＬｅｕＳｅｒＩｌｅＧｌ
ｎＶａｌＡｌａＧｌｙＡｌａＧｌｙ ９０ ＬｙｓＬｅｕＶａｌＧｌｎＡｓｐＧｌｕＬｙｓＴｈｒＡｌａＨｉ
ｓＬｅｕＬｙｓＰｒｏＧｌｙＡｓｐ １０５ ＬｅｕＡｌａＬｅｕＴｙｒＡｓｐＳｅｒＴｈｒＡｒｇＰｒｏＴｙ
ｒＧｌｎＬｅｕＬｅｕＰｈｅＡｓｐ １２０ ＨｉｓＡｓｐＰｈｅＧｌｕＧｌｎＴｙｒＶａｌＬｅｕＳｅｒＬｅ
ｕＰｒｏＧｌｙＳｅｒＩｌｅＬｅｕ １３５ ＡｒｇＬｙｓＡｒｇＬｅｕＨｉｓＡｓｎＡｌａＧｌｕＡｓｐＭｅ
ｔＴｈｒＡｌａＣｙｓＬｙｓＩｌｅ １５０ ＴｈｒＳｅｒＡｌａＧｌｎＳｅｒＧｌｙＴｈｒＡｌａＡｒｇＬｅ
ｕＬｅｕＳｅｒＨｉｓＭｅｔＶａｌ １６５ ＳｅｒＧｌｕＬｅｕＭｅｔＡｓｐＣｙｓＰｒｏＰｒｏＳｅｒＧｌ
ｙＧｌｙＰｒｏＩｌｅＶａｌＡｓｐ １８０ ＬｅｕＳｅｒＬｅｕＡｌａＡｓｐＳｅｒＬｅｕＶａｌＧｌｙＩｌ
ｅＬｅｕＶａｌＡｌａＡｌａＬｅｕ １９５ ＡｌａＧｌｕＡｓｎＬｅｕＧｌｙＳｅｒＬｅｕＰｒｏＬｅｕＳｅ
ｒＡｓｐＡｓｐＴｈｒＧｌｙＳｅｒ ２１０ ＶａｌＡｒｇＡｒｇＡｓｐＡｒｇＩｌｅＬｙｓＡｌａＴｙｒＶａ
ｌＬｅｕＬｙｓＡｓｎＬｅｕＡｒｇ ２２５ ＡｓｐＰｒｏＧｌｕＬｅｕＡｓｎＩｌｅＧｌｙＬｙｓＩｌｅＡｌ
ａＬｙｓＡｒｇＬｅｕＴｈｒＬｅｕ ２４０ ＴｈｒＡｌａＳｅｒＴｈｒＶａｌＨｉｓＡｒｇＡｌａＴｒｐＧｌ
ｕＧｌｙＧｌｕＡｌａＡｓｐＳｅｒ ２５５ ＬｅｕＴｈｒＡｓｎＴｒｐＩｌｅＴｒｐＳｅｒＭｅｔＡｒｇＬｅ
ｕＬｙｓＧｌｙＡｌａＧｌｕＧｌｎ ２７０ ＡｓｐＬｅｕＡｒｇＡｒｇＬｅｕＡｌａＨｉｓＨｉｓＡｓｎＬｙ
ｓＴｈｒＩｌｅＴｈｒＧｌｕＩｌｅ ２８５ ＡｌａＴｙｒＨｉｓＴｒｐＧｌｙＰｈｅＳｅｒＳｅｒＳｅｒＡｌ
ａＨｉｓＰｈｅＳｅｒＡｒｇＡｌａ ３００ ＰｈｅＡｒｇＧｌｎＨｉｓＰｈｅＧｌｙＶａｌＰｒｏＰｒｏＬｙ
ｓＧｌｕＡｌａＡｒｇＧｌｕＳｅｒ ３１５ ＭｅｔＡｒｇＡｌａＬｅｕＶａｌＧｌｎＳｅｒＡｓｐＳｅｒＭｅ
ｔＰｒｏＶａｌ ３２７
【００２０】配列番号２： 配列の長さ：981 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源： 生物名：アルカリゲネス フェカリス（Alcaligenes fa
ecalis） 株名：JM3 配列： ATG GAG CAA TGG TCC ACC ACG GCA GTT CCC GCT ATC CGG CGC GCG 45 CCC TAT TGG ATG GAG GCC GTC AAC AAG GCC TAT GTG CAA CTG GAA 90 TGC GCC GTT CCC TCC CGC TCC AGC GCC CCT TTC TTC GGA GCC ATT 135 ACG CGT CGT GAA CTG GCG GCC GTC AGC CTC TCT CAT ATC ACC TCG 180 ACC ACA CAG ACG GTA CTG CGC ACG CCT TTG CAA ATT TCC AGA GCA 225 TCC GAG GAT ATT TTT CTG CTC AGC ATT CAG GTG GCC GGA GCA GGA 270 AAA CTG GTT CAG GAC GAA AAA ACT GCT CAC CTG AAA CCC GGT GAC 315 CTG GCC CTG TAC GAC TCC ACC CGC CCC TAT CAG CTC TTG TTT GAC 360 CAT GAC TTC GAG CAG TAT GTG CTT TCT TTG CCC GGC TCC ATC TTG 405 CGC AAG CGT TTA CAC AAT GCC GAG GAC ATG ACA GCC TGC AAA ATC 450 ACC AGC GCC CAA TCG GGC ACG GCA CGT TTG CTC TCC CAT ATG GTC 495 AGC GAA CTG ATG GAC TGC CCA CCC TCC GGT GGC CCA ATT GTA GAT 540 TTG TCG CTT GCC GAC AGC CTG GTC GGT ATT CTG GTC GCC GCG CTG 585 GCA GAA AAT CTG GGC AGC CTG CCT TTA AGC GAC GAT ACG GGG TCT 630 GTC CGA CGC GAC CGC ATC AAA GCC TAT GTG CTG AAA AAT CTG CGC 675 GAC CCG GAG CTG AAT ATA GGC AAG ATT GCC AAA CGT TTG ACC CTG 720 ACG GCC AGC ACC GTG CAT CGC GCC TGG GAG GGC GAA GCC GAT TCA 765 CTG ACA AAC TGG ATT TGG TCC ATG CGC CTG AAA GGC GCT GAA CAG 810 GAT TTG CGC CGG CTG GCC CAC CAC AAC AAG ACC ATC ACG GAA ATT 855 GCT TAC CAC TGG GGG TTC AGC AGC TCT GCC CAT TTC AGC CGG GCA 900 TTT CGG CAG CAC TTT GGT GTG CCG CCC AAA GAG GCC CGC GAA AGT 945 ATG CGG GCC CTG GTT CAA TCA GAC TCG ATG CCT GTC 981
ecalis） 株名：JM3 配列： ATG GAG CAA TGG TCC ACC ACG GCA GTT CCC GCT ATC CGG CGC GCG 45 CCC TAT TGG ATG GAG GCC GTC AAC AAG GCC TAT GTG CAA CTG GAA 90 TGC GCC GTT CCC TCC CGC TCC AGC GCC CCT TTC TTC GGA GCC ATT 135 ACG CGT CGT GAA CTG GCG GCC GTC AGC CTC TCT CAT ATC ACC TCG 180 ACC ACA CAG ACG GTA CTG CGC ACG CCT TTG CAA ATT TCC AGA GCA 225 TCC GAG GAT ATT TTT CTG CTC AGC ATT CAG GTG GCC GGA GCA GGA 270 AAA CTG GTT CAG GAC GAA AAA ACT GCT CAC CTG AAA CCC GGT GAC 315 CTG GCC CTG TAC GAC TCC ACC CGC CCC TAT CAG CTC TTG TTT GAC 360 CAT GAC TTC GAG CAG TAT GTG CTT TCT TTG CCC GGC TCC ATC TTG 405 CGC AAG CGT TTA CAC AAT GCC GAG GAC ATG ACA GCC TGC AAA ATC 450 ACC AGC GCC CAA TCG GGC ACG GCA CGT TTG CTC TCC CAT ATG GTC 495 AGC GAA CTG ATG GAC TGC CCA CCC TCC GGT GGC CCA ATT GTA GAT 540 TTG TCG CTT GCC GAC AGC CTG GTC GGT ATT CTG GTC GCC GCG CTG 585 GCA GAA AAT CTG GGC AGC CTG CCT TTA AGC GAC GAT ACG GGG TCT 630 GTC CGA CGC GAC CGC ATC AAA GCC TAT GTG CTG AAA AAT CTG CGC 675 GAC CCG GAG CTG AAT ATA GGC AAG ATT GCC AAA CGT TTG ACC CTG 720 ACG GCC AGC ACC GTG CAT CGC GCC TGG GAG GGC GAA GCC GAT TCA 765 CTG ACA AAC TGG ATT TGG TCC ATG CGC CTG AAA GGC GCT GAA CAG 810 GAT TTG CGC CGG CTG GCC CAC CAC AAC AAG ACC ATC ACG GAA ATT 855 GCT TAC CAC TGG GGG TTC AGC AGC TCT GCC CAT TTC AGC CGG GCA 900 TTT CGG CAG CAC TTT GGT GTG CCG CCC AAA GAG GCC CGC GAA AGT 945 ATG CGG GCC CTG GTT CAA TCA GAC TCG ATG CCT GTC 981
【００２１】配列番号３： 配列の長さ：１１２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源： 生物名：アルカリゲネス フェカリス（Alcaligenes fa
ecalis） 株名：JM3 配列： EcoRV GATATCTTGCCTGATACTTAGTCAGTCCAGTTGATCGCAGTCCCTGCCGTCAGCCTTTGG 60 AACCAAGACGGAGAGGTCATCAATGGAGCAATGGTCCACCACGGCAGTTCCCGCTATCCG 120 MetGluGlnTrpSerThrThrAlaValProAlaIleArg GCGCGCGCCCTATTGGATGGAGGCCGTCAACAAGGCCTATGTGCAACTGGAATGCGCCGT 180 ArgAlaProTyrTrpMetGluAlaValAsnLysAlaTyrValGlnLeuGluCysAlaVal TCCCTCCCGCTCCAGCGCCCCTTTCTTCGGAGCCATTACGCGTCGTGAACTGGCGGCCGT 240 ProSerArgSerSerAlaProPhePheGlyAlaIleThrArgArgGluLeuAlaAlaVal CAGCCTCTCTCATATCACCTCGACCACACAGACGGTACTGCGCACGCCTTTGCAAATTTC 300 SerLeuSerHisIleThrSerThrThrGlnThrValLeuArgThrProLeuGlnIleSer CAGAGCATCCGAGGATATTTTTCTGCTCAGCATTCAGGTGGCCGGAGCAGGAAAACTGGT 360 ArgAlaSerGluAspIlePheLeuLeuSerIleGlnValAlaGlyAlaGlyLysLeuVal TCAGGACGAAAAAACTGCTCACCTGAAACCCGGTGACCTGGCCCTGTACGACTCCACCCG 420 GlnAspGluLysThrAlaHisLeuLysProGlyAspLeuAlaLeuTyrAspSerThrArg CCCCTATCAGCTCTTGTTTGACCATGACTTCGAGCAGTATGTGCTTTCTTTGCCCGGCTC 480 ProTyrGlnLeuLeuPheAspHisAspPheGluGlnTyrValLeuSerLeuProGlySer CATCTTGCGCAAGCGTTTACACAATGCCGAGGACATGACAGCCTGCAAAATCACCAGCGC 540 IleLeuArgLysArgLeuHisAsnAlaGluAspMetThrAlaCysLysIleThrSerAla CCAATCGGGCACGGCACGTTTGCTCTCCCATATGGTCAGCGAACTGATGGACTGCCCACC 600 GlnSerGlyThrAlaArgLeuLeuSerHisMetValSerGluLeuMetAspCysProPro CTCCGGTGGCCCAATTGTAGATTTGTCGCTTGCCGACAGCCTGGTCGGTATTCTGGTCGC 660 SerGlyGlyProIleValAspLeuSerLeuAlaAspSerLeuValGlyIleLeuValAla CGCGCTGGCAGAAAATCTGGGCAGCCTGCCTTTAAGCGACGATACGGGGTCTGTCCGACG 720 AlaLeuAlaGluAsnLeuGlySerLeuProLeuSerAspAspThrGlySerValArgArg CGACCGCATCAAAGCCTATGTGCTGAAAAATCTGCGCGACCCGGAGCTGAATATAGGCAA 780 AspArgIleLysAlaTyrValLeuLysAsnLeuArgAspProGluLeuAsnIleGlyLys GATTGCCAAACGTTTGACCCTGACGGCCAGCACCGTGCATCGCGCCTGGGAGGGCGAAGC 840 IleAlaLysArgLeuThrLeuThrAlaSerThrValHisArgAlaTrpGluGlyGluAla CGATTCACTGACAAACTGGATTTGGTCCATGCGCCTGAAAGGCGCTGAACAGGATTTGCG 900 AspSerLeuThrAsnTrpIleTrpSerMetArgLeuLysGlyAlaGluGlnAspLeuArg CCGGCTGGCCCACCACAACAAGACCATCACGGAAATTGCTTACCACTGGGGGTTCAGCAG 960 ArgLeuAlaHisHisAsnLysThrIleThrGluIleAlaTyrHisTrpGlyPheSerSer CTCTGCCCATTTCAGCCGGGCATTTCGGCAGCACTTTGGTGTGCCGCCCAAAGAGGCCCG 1020 SerAlaHisPheSerArgAlaPheArgGlnHisPheGlyValProProLysGluAlaArg CGAAAGTATGCGGGCCCTGGTTCAATCAGACTCGATGCCTGTCTGATCAGGCAATGGCCT 1080 GluSerMetArgAlaLeuValGlnSerAspSerMetProVal*** EcoRI TGCCGTCATTCAAGGCCAGCAGGCCTTTGATCAGGCGGTACGAATTC 1127
ecalis） 株名：JM3 配列： EcoRV GATATCTTGCCTGATACTTAGTCAGTCCAGTTGATCGCAGTCCCTGCCGTCAGCCTTTGG 60 AACCAAGACGGAGAGGTCATCAATGGAGCAATGGTCCACCACGGCAGTTCCCGCTATCCG 120 MetGluGlnTrpSerThrThrAlaValProAlaIleArg GCGCGCGCCCTATTGGATGGAGGCCGTCAACAAGGCCTATGTGCAACTGGAATGCGCCGT 180 ArgAlaProTyrTrpMetGluAlaValAsnLysAlaTyrValGlnLeuGluCysAlaVal TCCCTCCCGCTCCAGCGCCCCTTTCTTCGGAGCCATTACGCGTCGTGAACTGGCGGCCGT 240 ProSerArgSerSerAlaProPhePheGlyAlaIleThrArgArgGluLeuAlaAlaVal CAGCCTCTCTCATATCACCTCGACCACACAGACGGTACTGCGCACGCCTTTGCAAATTTC 300 SerLeuSerHisIleThrSerThrThrGlnThrValLeuArgThrProLeuGlnIleSer CAGAGCATCCGAGGATATTTTTCTGCTCAGCATTCAGGTGGCCGGAGCAGGAAAACTGGT 360 ArgAlaSerGluAspIlePheLeuLeuSerIleGlnValAlaGlyAlaGlyLysLeuVal TCAGGACGAAAAAACTGCTCACCTGAAACCCGGTGACCTGGCCCTGTACGACTCCACCCG 420 GlnAspGluLysThrAlaHisLeuLysProGlyAspLeuAlaLeuTyrAspSerThrArg CCCCTATCAGCTCTTGTTTGACCATGACTTCGAGCAGTATGTGCTTTCTTTGCCCGGCTC 480 ProTyrGlnLeuLeuPheAspHisAspPheGluGlnTyrValLeuSerLeuProGlySer CATCTTGCGCAAGCGTTTACACAATGCCGAGGACATGACAGCCTGCAAAATCACCAGCGC 540 IleLeuArgLysArgLeuHisAsnAlaGluAspMetThrAlaCysLysIleThrSerAla CCAATCGGGCACGGCACGTTTGCTCTCCCATATGGTCAGCGAACTGATGGACTGCCCACC 600 GlnSerGlyThrAlaArgLeuLeuSerHisMetValSerGluLeuMetAspCysProPro CTCCGGTGGCCCAATTGTAGATTTGTCGCTTGCCGACAGCCTGGTCGGTATTCTGGTCGC 660 SerGlyGlyProIleValAspLeuSerLeuAlaAspSerLeuValGlyIleLeuValAla CGCGCTGGCAGAAAATCTGGGCAGCCTGCCTTTAAGCGACGATACGGGGTCTGTCCGACG 720 AlaLeuAlaGluAsnLeuGlySerLeuProLeuSerAspAspThrGlySerValArgArg CGACCGCATCAAAGCCTATGTGCTGAAAAATCTGCGCGACCCGGAGCTGAATATAGGCAA 780 AspArgIleLysAlaTyrValLeuLysAsnLeuArgAspProGluLeuAsnIleGlyLys GATTGCCAAACGTTTGACCCTGACGGCCAGCACCGTGCATCGCGCCTGGGAGGGCGAAGC 840 IleAlaLysArgLeuThrLeuThrAlaSerThrValHisArgAlaTrpGluGlyGluAla CGATTCACTGACAAACTGGATTTGGTCCATGCGCCTGAAAGGCGCTGAACAGGATTTGCG 900 AspSerLeuThrAsnTrpIleTrpSerMetArgLeuLysGlyAlaGluGlnAspLeuArg CCGGCTGGCCCACCACAACAAGACCATCACGGAAATTGCTTACCACTGGGGGTTCAGCAG 960 ArgLeuAlaHisHisAsnLysThrIleThrGluIleAlaTyrHisTrpGlyPheSerSer CTCTGCCCATTTCAGCCGGGCATTTCGGCAGCACTTTGGTGTGCCGCCCAAAGAGGCCCG 1020 SerAlaHisPheSerArgAlaPheArgGlnHisPheGlyValProProLysGluAlaArg CGAAAGTATGCGGGCCCTGGTTCAATCAGACTCGATGCCTGTCTGATCAGGCAATGGCCT 1080 GluSerMetArgAlaLeuValGlnSerAspSerMetProVal*** EcoRI TGCCGTCATTCAAGGCCAGCAGGCCTTTGATCAGGCGGTACGAATTC 1127
【図１】JM3株ニトリラーゼ遺伝子周辺の制限酵素地
図、本発明において作製されたプラスミド、およびそれ
らのプラスミドを含む組換え体のニトリラーゼ活性を示
す図。
図、本発明において作製されたプラスミド、およびそれ
らのプラスミドを含む組換え体のニトリラーゼ活性を示
す図。
【図２】プラスミドpNA28,pNA29,pNR18およびpNR19の構
築図を示す図。
築図を示す図。
【図３】２種のプラスミドを同時に含む形質転換体のニ
トリラーゼ活性を示す図。
トリラーゼ活性を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】 ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性
化する作用を持ち、配列番号１のアミノ酸配列を有する
調節因子をコードする遺伝子DNA。 - 【請求項２】 前記調節因子をコードする遺伝子DNAが
配列番号２の塩基配列を有する請求項１記載の遺伝子DN
A。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載の遺伝子DNA及びニ
トリラーゼ遺伝子DNAを含むプラスミドで形質転換され
た形質転換体。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載の遺伝子DNAを含む
プラスミド及びニトリラーゼ遺伝子DNAを含むプラスミ
ドで形質転換された形質転換体。 - 【請求項５】 請求項３記載の形質転換体を培地中でニ
トリル類の存在下に培養し、培養物からニトリラーゼを
採取することを特徴とするニトリラーゼの製造法。 - 【請求項６】 ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性
化する作用を持ち、配列番号１のアミノ酸配列を有する
調節因子ポリペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19508096A JP3798474B2 (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19508096A JP3798474B2 (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1033182A true JPH1033182A (ja) | 1998-02-10 |
| JP3798474B2 JP3798474B2 (ja) | 2006-07-19 |
Family
ID=16335226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19508096A Expired - Lifetime JP3798474B2 (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3798474B2 (ja) |
-
1996
- 1996-07-24 JP JP19508096A patent/JP3798474B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3798474B2 (ja) | 2006-07-19 |
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