JPH10337193A - 肝炎ｇｂウイルスエピトープに対する抗体及びその使用 - Google Patents

肝炎ｇｂウイルスエピトープに対する抗体及びその使用

Info

Publication number
JPH10337193A
JPH10337193A JP10111629A JP11162998A JPH10337193A JP H10337193 A JPH10337193 A JP H10337193A JP 10111629 A JP10111629 A JP 10111629A JP 11162998 A JP11162998 A JP 11162998A JP H10337193 A JPH10337193 A JP H10337193A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hgbv
seq
sequence
clone
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP10111629A
Other languages
English (en)
Inventor
John N Simons
ジヨン・エヌ・シモンズ
Tami J Pilot-Matias
タミ・ジエイ・パイロツト−マテイアス
George J Dawson
ジヨージ・ジエイ・ドーソン
George G Schlauder
ジヨージ・ジー・シユラウダー
Suresh M Desai
サーレツシユ・エム・デサイ
Thomas P Leary
トマス・ピー・リアリー
Anthony Scott Muerhoff
アンソニー・スコツト・ミユーホフ
James Carl Erker
ジエイムズ・カール・エルカー
Sheri L Buijk
シエリ・エル・ビユイジク
Isa K Mushahwar
イサ・ケイ・マツシユアワー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abbott Laboratories
Original Assignee
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Publication of JPH10337193A publication Critical patent/JPH10337193A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 種々の診断及び治療用途に有用な肝炎ＧＢウ
イルス（ＨＧＢＶ）特異的に結合する抗体、及び、ＨＧ
ＢＶ核酸またはアミノ酸配列からポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体を製造する方法を提供する。 【解決手段】 少なくとも１種の肝炎ＧＢウイルス（Ｈ
ＧＢＶ）エピトープに対する抗体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明は、ヒトにおいて肝炎を惹起する一群の感染性ウ
イルス性物質、特にかかるウイルス群から誘導されるポ
リヌクレオチド、それらにコードされるポリペプチド、
かかるポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに、
かかる材料を使用する診断薬及びワクチンに係わる。
【０００２】肝炎は、血液製剤の輸血、臓器移植及び血
液透析によってドナーからレシピエントに感染される最
も重要な疾患の１つである。また肝炎は、汚染された食
物及び水の摂取や、人同士の接触によっても感染し得
る。ウイルス性肝炎は固有のウイルス遺伝子及び複製モ
ードを有する一群のウイルス性物質を含み、種々の感染
経路で肝損傷の程度は様々であるが、肝炎を惹起するこ
とが知られている。急性ウイルス性肝炎は、黄疸、肝圧
痛及び、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳ
Ｔ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びイソ
クエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＳＤ）のごとき肝トラン
スアミナーゼレベルの上昇を含む特定の患者症状によっ
て臨床診断される場合もあるが、臨床的に顕在化しない
こともあり得る。ウイルス性肝炎物質としては、肝炎Ａ
型ウイルス（ＨＡＶ）、肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）、
肝炎Ｃ型ウイルス（ＨＣＶ）、肝炎δ型ウイルス（ＨＤ
Ｖ）、肝炎Ｅ型ウイルス（ＨＥＶ）、エプスタイン−バ
ールウイルス（ＥＢＶ）、及びサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）が挙げられる。
【０００３】１９６０年代後期に使用可能となった、献
血血液をＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の存在について
スクリーニングする特異的血清アッセイは、血液レシピ
エントの輸血後肝炎（ＰＴＨ）の発生を低減させること
において良い結果を与えてはいるが、ＰＴＨは相変わら
ず有意な率で発生している。Ｈ．Ｊ．Ａｌｔｅｒら，Ａ
ｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．７７：６９１−６９９（１９７
２）；Ｈ．Ｊ．Ａｌｔｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：８
３８−８４１（１９７５）。研究者らは、これまでヒト
において肝炎を惹起することが知られているウイルス
（ＨＡＶ、ＨＢＢ、ＣＭＶ及びＥＢＶ）への暴露と関係
なくウイルス性肝炎を惹起する、「非Ａ非Ｂ型肝炎」
（ＮＡＮＢＨ）と名付けられた新規の物質を探し始め
た。例えばＳ．Ｍ．Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅら，Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９２：７６７−７７０（１９７
５）；編者無記名，Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：６４−６５
（１９７５）；Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓのＦ．Ｂ．Ｈｏｌ
ｌｉｎｇｅｒ及びＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅら，Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ
ｐ２２３９−２２７３（１９９０）参照。
【０００４】静脈内薬物使用者における急性ＮＡＮＢＨ
の多発性発症；輸血後ＮＡＮＢＨを獲得した患者の固有
の感染後潜伏期間；チンパンジー交差攻撃（ｃｒｏｓｓ
−ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）実験の結果；感染チンパンジー
の超微細構造肝病理分析；及び疑似患者のクロロホルム
に対する抵抗性の差など、幾つかの疫学的及び実験的な
証拠により１種以上の非経口感染ＮＡＮＢ物質の存在が
示されている。Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｇａｓｔｒ
ｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８５：４３９−４６２（１９
８３）；Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎ
ｔｅｒｏｌｏｇｙ ８５，７４３−７６８（１９８
３）；Ｆ．Ｂ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｄｉｓ．１４２：４００−４０７（１９８０）；
Ｆ．ＣｈｉｓａｒｉのＤ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙ編，Ａｄ
ｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，Ｍａｓｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６
８−２８０（１９８４）；及び、Ｄ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅ
ｙら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４８：２５４−２
６５（１９８３）。
【０００５】急性肝炎を発症した外科医から得た血清試
料は、タマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓｓｐｅｃｉｅｓ）に
接種すると肝炎を誘発することが示された。４匹のタマ
リンのうち４匹ともが接種後数週間以内に肝酵素の上昇
を生じ、これから、該外科医の血清中の物質がタマリン
に肝炎を誘発した可能性があることが判る。種々の非ヒ
ト霊長目動物において順次継代されることにより、この
肝炎は感染性物質によって惹起されることが判り、濾過
実験からはこの物質がウイルス性であることが示され
た。上記外科医及びタマリンにおいて肝炎の原因となっ
た感染性物質は「ＧＢ物質（ＧＢ ａｇｅｎｔ）」と名
付けられた。Ｆ．Ｄｅｉｎｈａｒｄｔら，Ｊ．Ｅｘｐｅ
ｒ．Ｍｅｄ．１２５：６７３−６８８（１９６７）；
Ｆ．Ｄｉｅｎｈａｒｄｔら，Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅ
ｄ．，前出；Ｅ．Ｔａｂｏｒら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏ
ｌ．５：１０３−１０８（１９８０）；Ｒ．Ｏ．Ｗｈｉ
ｔｔｉｎｇｔｏｎら，Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ Ｎｏｎｈ
ｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２２１−２２
４（１９８３）。
【０００６】ＧＢ物質はヒトにおいてＮＡＮＢＨを惹起
する物質であり得ること、及びＧＢ物質は種々の実験室
で研究された既知のＮＡＮＢＨ物質とは関連のないこと
が示されているが、ＧＢ物質に関する決定的な、また最
終的な研究は知られておらず、ウイルス性物質は発見さ
れていないし、分子学的に特性分析されてもいない。
Ｆ．Ｄｅｉｎｈａｒｄｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃ
ｉ．２７０：７３−８０（１９７５）；及びＪ．Ｌ．Ｄ
ｉｅｎｓｔａｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２６４：２６０−２
６１（１９７６）。更にＥ．Ｔａｂｏｒら，Ｊ．Ｍｅ
ｄ．Ｖｉｒｏｌ．，前出；Ｅ．Ｔａｂｏｒら，Ｊ．Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４０：７９４−７９７（１９７
９）；Ｒ．Ｏ．Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎら，前出；及び
Ｐ．Ｋａｒａｙｉａｎｎｉｓら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ
９：１８６−１９２（１９８９）参照。
【０００７】初期の研究では、ＧＢ物質はいかなる既知
のヒト肝炎ウイルスとも無関係であるとされていた。
Ｓ．Ｍ．Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １８
２：１０２６−１０２８（１９７３）；Ｐ．Ｊ．Ｐｒｏ
ｖｏｓｔら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍ
ｅｄ．１４８；５３２−５３９（１９７５）；Ｊ．Ｌ．
Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ １８：
１０５−１０６（１９８２）；Ａ．Ｗ．Ｈｏｌｍｅｓ
ら，Ｎａｔｕｒｅ ２４３：４１９−４２０（１９７
３）；及び、Ｆ．Ｄｅｉｎｈａｒｄｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｓｃｉ．，前出。しかしながら、ＧＢ物質がヒト
において肝炎感染を誘発するウイルスであるのか、また
はＧＢ血清によって活性化され、一旦活性化されると他
のタマリンに容易に継代してそれらに肝炎を誘発する潜
在的タマリンウイルスであるのかが問題とされた。ま
た、ＧＢ陽性血清を接種されたマーモセットの極一部は
臨床上肝炎を発症せず（５２匹のうち４匹，７．６
％）、かかる動物は自然免疫を有していた可能性があ
り、従ってＧＢ物質はマーモセットウイルスであり得る
ことも示された。Ｗ．Ｐ．Ｐａｒｋｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｄｉｓ．１２０：５３９−５４７（１９６９）；
Ｗ．Ｐ．Ｐａｒｋｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１
２０：５４８−５５９（１９６９）。形態的研究は不明
瞭であり、ある報告書の免疫電子顕微鏡調査では、ＧＢ
物質は、パルボウイルスの球構造と類似の、寸法分布が
２０〜２２ｎｍの免疫複合体を形成していると示されて
いるが、他の研究では、ＧＢ陽性タマリンの肝ホモジネ
ートから得られた免疫電子顕微鏡データから正二十面体
対称構造の３４〜３６ｎｍの凝集体（ａｇｇｒｅｇａｒ
ｅｓ）が検出され、ＧＢ物質はカリチ様ウイルスである
と報告されている。例えばＪ．Ｄ．Ａｌｍｅｉｄａら，
Ｎａｔｕｒｅ ２６１：６０８−６０９（１９７６）；
Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇら，Ｎａｔｕｒｅ，前出参
照。
【０００８】主に非経口感染によって生じるＨＣＶと、
腸内感染するＨＥＶとの２種類の肝炎を惹起するウイル
スが最近になって発見され報告された。例えば、Ｑ．
Ｌ．Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３５９−３
６２（１９８９），Ｇ．Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４４：３６２−３６４（１９８９），欧州特許出願公開
第０３１８２１６号明細書（１９８９年３月３１日公
開），Ｇ．Ｒ．Ｒｅｙｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
７：１３３５−１３３９（１９９０）参照。ＨＣＶは、
ＮＡＮＢＨ物質が原因とみられるＰＴＨの大部分及び輸
血によるものでない急性ＮＡＮＢＨの多くに関与してい
る。編者無記名，Ｌａｎｃｅｔ ３３５：１４３１−１
４３２（１９９０）；Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｇａ
ｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９９：１１７７−１１
８０（１９９０）；及び、Ｍ．Ｊ．Ａｌｔｅｒら，ＪＡ
ＭＡ ２６４：２２３１−２２３５（１９９０）。
【０００９】ドナー試料中のＨＣＶ抗体を検出すること
により、血液供給系におけるＮＡＮＢＨ感染血液の７０
〜８０％が除外されるが、ＨＣＶの発見及び検出によっ
て肝炎感染が完全に予防されているわけではない。Ｈ．
Ａｌｔｅｒら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：
１４９４−１５００（１９８９）。最近の文献で、別の
肝炎物質がＰＴＨ、並びにＰＴＨと関連のない集団獲得
急性及び／または慢性肝炎の原因であり得るかどうかが
問題とされた。例えば、１９８８〜１９９０年にフラン
スで行われた予測臨床標本調査においてモニターとなっ
た１８１人の患者のうち、調査人は全部で１８のＰＴＨ
症例を記載している。これら１８人の患者のうちの１３
人は、抗ＨＣＶ抗体、ＨＢｓＡｇ、ＨＢＶ及びＨＣＶ核
酸について陰性であった。筆者らにはＰＴＨを惹起する
非Ａ非Ｂ非Ｃ型物質の潜在的な重要性が推量された。
Ｖ．Ｔｈｉｅｒｓら，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １
８：３４−３９（１９９３）。１９８５〜１９８８年に
ドイツで行われた別の調査でモニターとなった１，４７
６人の患者のうち、記録された２２のＰＴＨ症例はＨＢ
ＶまたはＨＣＶ感染とは関係なかった。Ｔ．Ｐｅｔｅｒ
ｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３９：１３９−１４５
（１９９３）。
【００１０】肝炎を惹起する新規の固有のウイルス群か
ら誘導される物質、例えばポリヌクレオチド、そこにコ
ードされている組換え及び合成ポリペプチド、かかるポ
リペプチドに特異的に結合する抗体、並びにかかる物質
を使用する診断薬及びワクチンを同定及び提供すること
は有利となろう。このような物質により、急性及び／ま
たは慢性ウイルス性肝炎をより正確に診断する医療機関
の能力が著しく向上し、提供された血液及び臓器におい
て非Ａ、非Ｂ及び非Ｃ型肝炎を検出することにより、よ
り安全な血液及び臓器を供給し得るであろう。
【００１１】発明の要約 本発明は、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）のゲノムまた
はその相補体に選択的にハイブリダイズし得るＨＧＢＶ
から誘導された精製ポリヌクレオチドまたはそのフラグ
メントであって、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧ
ＢＶ−Ｃからなる群から選択されるアミノ酸配列と少な
くとも３５％の一致率（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、より好ま
しくは４０％の一致率、更に好ましくは６０％の一致
率、最も好ましくは８０％の一致率を有するアミノ酸配
列を含むポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲ
Ｆ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする精製ポリヌク
レオチドまたはそのフラグメントを提供する。更に、肝
炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）のゲノムまたはその相補体
に選択的にハイブリダイズし得るＨＧＢＶから誘導され
る組換えポリヌクレオチドまたはそのフラグメントも提
供されるが、ここで、前記ヌクレオチドはＨＧＢＶの少
なくとも１つのエピトープをコードする配列を含んでお
り、前記組換えヌクレオチドは、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢ
Ｖ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃからなる群から選択されるアミ
ノ酸配列と少なくとも３５％の一致率を有するアミノ酸
配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲ
Ｆ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする。かかる組換
えポリヌクレオチドは組換えベクター内に含まれ、更に
前記ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を構成す
る。
【００１２】本発明は更に、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢ
Ｖ）ゲノムから誘導されるヌクレオチド配列を含むＨＧ
ＢＶ組換えポリヌクレオチドまたはそのフラグメントで
あって、組換えベクター内に含まれ、更に前記ベクター
を用いて形質転換された宿主細胞を構成し、前記配列が
ＨＧＢＶのエピトープをコードするＨＧＢＶ組換えポリ
ヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。ＨＧ
ＢＶ組換えポリヌクレオチドは、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢ
Ｖ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃからなる群から選択されるアミ
ノ酸配列と少なくとも３５％の一致率を有するアミノ酸
配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲ
Ｆ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする。本発明は、
肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）から誘導されるＤＮＡま
たはＲＮＡの読取り枠を含む組換え発現系であって、前
記読取り枠がＨＧＢＶゲノムまたはｃＤＮＡの配列を含
んでおり、且つ前記読取り枠が所望の宿主と適合性のあ
る制御配列に操作可能に結合されている組換え発現系を
提供し、更に、前記組換え発現系を用いて形質転換され
た細胞及び、前記細胞によって産生される長さが少なく
とも約８個のアミノ酸のポリペプチドを提供する。
【００１３】本発明は更に、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢ
Ｖ）ポリペプチドまたはそのフラグメントの調製物、即
ち、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃから
なる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも３５％
の一致率、より好ましくは４０％の一致率、更に好まし
くは６０％の一致率を有するアミノ酸配列を含むポリプ
ロテインをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む正鎖Ｒ
ＮＡゲノムを特徴とするアミノ酸配列またはそのフラグ
メントを含む組換えポリペプチドを含む精製ＨＧＢＶを
提供する。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗
体、並びに、少なくとも１種の肝炎ＧＢウイルス（ＨＧ
ＢＶ）ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む融合
ポリペプチド、真核性または原核性宿主内で産生された
ときに粒子を形成し得るアミノ酸配列を有する非ＨＧＢ
Ｖポリペプチドと、少なくとも１つのＨＧＢＶエピトー
プとを含む、肝炎ＧＢ（ＨＧＢＶ）感染に対して免疫原
性である粒子、及び、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及び
ＨＧＢＶ−Ｃからなる群から選択されるアミノ酸配列と
少なくとも３５％の一致率を有するアミノ酸配列を含む
ポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む
正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする、肝炎ＧＢウイルス（Ｈ
ＧＢＶ）に対するポリヌクレオチドプローブが提供され
る。
【００１４】少なくとも１つの肝炎ＧＢウイルス（ＨＧ
ＢＶ）エピトープを含むポリペプチドを製造するための
アッセイキット及び方法であって、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧ
ＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃからなる群から選択されるア
ミノ酸配列と少なくとも３５％の一致率を有するアミノ
酸配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠（Ｏ
ＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とするポリペプチ
ドをコードする配列を含む発現ベクターを用いて形質転
換された宿主細胞をインキュベートすることからなるア
ッセイキット及び方法も提供される。更には、固相、組
換えもしくは合成ペプチド、またはプローブを使用する
方法を含む、検査試料中のＨＧＢＶ核酸、抗原及び抗体
を検出する方法も提供される。更に、ワクチン、肝炎Ｇ
Ｂウイルス（ＨＧＢＶ）に感染させた組織培養増殖細
胞、免疫応答を生じるのに十分な量の少なくとも１つの
ＨＧＢＶエピトープを含む単離免疫原性ポリペプチドま
たはそのフラグメントを個体に投与することからなる、
肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）に対する抗体を製造する
方法も提供される。更に、ポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチドまたはこれらのフラグメントを含む診断試薬
も提供される。
【００１５】発明の詳細 本発明は、新たに確認された病因物質である非Ａ、非
Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、及び非Ｅ型肝炎を惹起する物質、総称
して「肝炎ＧＢウイルス」または「ＨＧＢＶ」の特性分
析法を提供する。本発明は、ＨＧＢＶ病因物質の存在を
判定する方法、ＨＧＢＶに感染したヒトまたはタマリン
の個体由来の感染血清、血漿または肝ホモジネートから
生成された病因物質の核酸を得、これまでに単離されて
いないウイルス性物質のゲノムから新たに合成される抗
原を検出し、非感染個体と比較して感染個体のみに認め
られる生成物を産生したクローンを選択する方法を提供
する。
【００１６】ＨＧＢＶから誘導される核酸配列の部分
は、検査試料中のＨＧＢＶの存在を判定するため、及び
天然変種を単離するためのプローブとして有用である。
かかる配列により、ＨＧＢＶゲノム内にコードされてい
るＨＧＢＶ抗原のポリペプチド配列を得ることもできる
し、診断試験の標準または試薬として及び／またはワク
チンの成分として有用なポリペプチドを製造することも
できる。かかるポリペプチド配列内に含まれる少なくと
も１つのエピトープに対するモノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体もまた、診断試験及び治療薬に、抗ウ
イルス性物質のスクリーニングに、かかる核酸配列が誘
導されるＨＧＢＶ物質の単離に有用である。ＨＧＢＶゲ
ノムのその他の部分の単離及び配列決定も、かかる核酸
配列から誘導されるプローブまたはＰＣＲプライマーを
使用することにより行うことができ、従って、ＨＧＢＶ
の診断及び／または治療において予防薬及び治療薬とし
て有用となろうＨＧＢＶの別のプローブ及びポリペプチ
ドを製造することができる。
【００１７】本発明の１つの態様によれば、精製ＨＧＢ
Ｖポリヌクレオチド、組換えＨＧＢＶポリヌクレオチ
ド、ＨＧＢＶゲノムから誘導された配列を含む組換えポ
リヌクレオチド、ＨＧＢＶのエピトープをコードする組
換えポリペプチド、ＨＧＢＶのエピトープをコードする
合成ペプチド、上記組換えポリペプチドのいずれかを含
む組換えベクター、及び、かかるベクターを用いて形質
転換された宿主細胞が提供される。これらの組換えポリ
ペプチド及び合成ペプチドは単独でも組合せても使用す
ることができるし、或いは、ＨＧＢＶのエピトープを与
える他の物質と一緒に使用することもできる。
【００１８】本発明の別の態様においては、精製ＨＧＢ
Ｖ、精製ＨＧＢＶ由来のポリペプチドの調製物、精製Ｈ
ＧＢＶポリペプチド、ＨＧＢＶに含まれるエピトープと
免疫学的に同一であるエピトープを含む精製ポリペプチ
ドが提供される。
【００１９】本発明の更に別の態様においては、所望の
宿主と適合性である制御配列に操作可能に連結されてい
る、ＨＧＢＶゲノムまたはＨＧＢＶ ｃＤＮＡから誘導
されたＤＮＡの読取り枠（ＯＲＦ）を含む組換え発現
系、該組換え発現系を用いて形質転換された細胞、及
び、該形質転換細胞によって産生されたポリペプチドが
提供される。
【００２０】本発明の別の態様は、少なくとも１つの組
換えＨＧＢＶポリペプチド、ＨＧＢＶゲノムまたはＨＧ
ＢＶ ｃＤＮＡから誘導された配列を含む少なくとも１
つの組換えポリペプチド、ＨＧＢＶエピトープを含む少
なくとも１つの組換えポリペプチド、ＨＧＢＶポリペプ
チドを含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む。
【００２１】更に本発明は、ＨＧＢＶの少なくとも１つ
のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を
製造する方法、少なくとも１つのＨＧＢＶエピトープに
特異的に結合するポリクローナル抗体の精製調製物、並
びに、診断、予防及び治療用途を含む、かかる抗体を使
用する方法を提供する。 本発明の更に別の態様におい
ては、真核性宿主中で産生されたときに粒子を形成し得
るアミノ酸配列を有する非ＨＧＢＶポリペプチドと、Ｈ
ＧＢＶエピトープとを含む、ＨＧＢＶ感染に対して免疫
原性の粒子が提供される。
【００２２】更に、ＨＧＢＶに対するポリヌクレオチド
プローブも提供される。
【００２３】本発明は、適当な容器に入った、ＨＧＢＶ
から誘導されたポリヌクレオチドの存在及び／または量
を検出するために使用し得る試薬であって、約８個また
はそれ以上のヌクレオチドからなるＨＧＢＶ由来のヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチドプローブを含む試
薬；適当な容器に入った、ＨＧＢＶ抗原の存在及び／ま
たは量を検出するための試薬であって、検出すべきＨＧ
ＢＶ抗原に対する抗体を含む試薬；及び、適当な容器に
入った、ＨＧＢＶ抗原に対する抗体の存在及び／または
量を検出するための試薬であって、ＨＧＢＶ抗原中に存
在するＨＧＢＶエピトープを含むポリペプチドを含む試
薬を含むキットを提供する。種々のアッセイ形式のため
の他のキットも本明細書に記載の本発明によって提供さ
れる。
【００２４】本発明の他の態様として、固相に付着され
た少なくとも１種のＨＧＢＶエピトープを含むポリペプ
チドと、固相に付着されたＨＧＢＶエピトープに対する
抗体とが挙げられる。更に、ＨＧＢＶエピトープを含む
ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターを用
いて形質転換された宿主細胞を、該ポリペプチドの発現
が可能となる条件下でインキュベートすることからな
る、ＨＧＢＶエピトープを含むポリペプチドを製造する
方法と、該方法によって製造されたＨＧＢＶエピトープ
を含むポリペプチドも本発明に含まれる。
【００２５】本発明は更に、本発明の組換えまたは合成
ポリペプチド及び本発明の抗体を、いずれもシグナル生
成化合物を使用し得る種々の形式で使用するアッセイを
提供する。検出手段を与えるためのシグナル生成化合物
を使用しないアッセイも提供される。記載の全てのアッ
セイは、通常は抗原もしくは抗体のいずれかまたは両方
を検出するものであり、検査試料を少なくとも１種の本
発明の試薬と接触させて少なくとも１種の抗原／抗体複
合体を形成させ、該複合体の存在を検出することを含
む。かかるアッセイについては詳述する。
【００２６】ＨＧＢＶエピトープを含む免疫原性ペプチ
ド、もしくはＨＧＢＶの不活化調製物、もしくはＨＧＢ
Ｖの弱毒化調製物を含むＨＧＢＶ感染治療用ワクチン、
または、ＨＧＢＶエピトープを発現する組換えワクチン
の使用、並びに／または合成ペプチドの使用も本発明に
含まれる。有効なワクチンにはこれらの免疫原性ペプチ
ドの組合せが使用され得る（例えば、組換え抗原、合成
ペプチド及び天然ウイルス性抗原のカクテルが同時にま
たは異なる時点で投与される）。これらのなかには、単
独で使用し得るものもあるし、後で免疫原性エピトープ
を別に与えて補い得るものもある。更に本発明には、Ｈ
ＧＢＶに対する抗体を産生させる方法であって、個体
に、接種個体において免疫応答を生起するのに十分な量
のＨＧＢＶエピトープを含む単離免疫原性ポリペプチド
を投与することからなる方法も含まれる。
【００２７】更に、ＨＧＢＶに感染した組織培養増殖細
胞も本発明によって提供される。
【００２８】本発明の更に別の態様においては、同定さ
れていない感染性物質のゲノムから誘導されたＤＮＡま
たはｃＤＮＡを単離する方法が提供されるが、該方法は
代表相違分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄ
ｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＲＤＡ）の他
に類のない改良方法であって、これについては後述す
る。
【００２９】定義 本明細書において使用される「肝炎ＧＢウイルス」また
は「ＨＧＢＶ」なる用語は、ヒトにおいて非Ａ、非Ｂ、
非Ｃ、非Ｄ、非Ｅ型肝炎を惹起するウイルス種、及びそ
れらから誘導される弱毒化株または欠陥干渉粒子を総称
的に示す。これには更に、汚染された食物、飲料水など
によって感染された急性ウイルス性肝炎；（性行為、呼
吸及び非経口経路伝染を含む）人同士の接触または静脈
内薬物使用によって感染されるＨＧＢＶに起因する肝炎
も含まれる。本発明方法により、ＨＧＢＶを獲得した個
体の同定が可能となる。個々には、ＨＧＢＶ単離体を特
に「ＨＧＢＶ−Ａ」、「ＨＧＢＶ−Ｂ」及び「ＨＧＢＶ
−Ｃ」と表記する。本明細書においてＨＧＢＶゲノムは
ＲＮＡからなる。ＨＧＢＶのヌクレオチド配列及び推定
アミノ酸配列の分析から、このウイルス群はＦｌａｖｉ
ｒｉｄａｅファミリーと類似のゲノム構成を有すること
が明らかである。絶対的ではないが、基本的には、ゲノ
ム構成の類似性に基づき、ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｔａｘ
ｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓは、このファミリー
がＦｌａｖｉｖｉｒｕｓ、Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ及び肝
炎Ｃ型グループの３つの属からなると勧告している。ア
ミノ酸レベルでの類似性を探すと、肝炎ＧＢウイルスサ
ブクローンの配列は、少しではあるが一部が肝炎Ｃ型ウ
イルスのものと類似であることが判る。ここで与えられ
る情報は、ＨＧＢＶの他の株を分類するのに十分であ
る。
【００３０】ＨＧＢＶ−ＣはＨＣＶの一遺伝子型ではな
いことを示す幾つかの証拠が挙がっている。第１に、Ｈ
ＧＢ−Ｃ配列を含む血清においてＨＣＶ抗体の存在を試
験した。ＨＣＶに暴露されたかまたは感染した個体の常
套検出方法は、ＨＣＶ−１由来の３つ以上の領域から誘
導される抗原を使用する抗体試験に依存する。かかる試
験により、ＨＣＶの既知の遺伝子型に対する抗体を検出
し得る（例えばＳａｋａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉ
ｒｏｌ．７５：１７６１−１７６８（１９９４）及びＳ
ｔｕｙｖｅｒら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１０
９３−１１０２（１９９３）参照）。ＨＣＶ特異的ＥＬ
ＩＳＡでは８つのうち６つのケースでＧＢ−Ｃ配列を含
む血清を検出できなかった。第２に、ＨＣＶ抗体に対し
て血清反応陰性の幾つかのヒト血清は、高感度ＲＴ−Ｐ
ＣＲアッセイによるとＨＣＶゲノムＲＮＡに対して陽性
であることが判った（Ｓｕｇｉｔａｎｉ，Ｌａｎｃｅｔ
３３９：１０１８−１０１９（１９９２））。このアッ
セイでは、ＨＧＢ−Ｃ配列を含む８つの血清のうち７つ
でＨＣＶ ＲＮＡを検出できなかった（表Ａ）。即ち、
血清学的アッセイ及び分子学的アッセイのいずれによっ
てもＨＧＢＶ−ＣはＨＣＶの一遺伝子型ではない。
【００３１】ヘリカーゼ領域内のＨＧＢ−Ｃの推定翻訳
産物の一部をＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、ＨＣＶ−
１、及びＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅの別のメンバーの相
同領域と並べ、一致した配列を系統発生学的に分析する
と、ＨＧＢＶ−ＣはＨＣＶグループの他のメンバーより
ＨＧＢＶ−Ａに密接に関係することが判る。進化距離
（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｓｔａｎｃｅ）０．
４２を示すＨＧＢＶ−ＣとＨＧＢＶ−Ａの配列は、進化
距離０．９２を示すＨＧＢＶ−ＣとＨＧＢＶ−Ｂほどは
離れていない（表３３、後記）。即ち、ＨＧＢＶ−Ａと
ＨＧＢＶ−ＣはＧＢウイルスの１つのサブグループのメ
ンバーであり、ＨＧＢＶ−Ｂはそれ自体で１つのサブグ
ループのメンバーであると考えられる。種々のＨＣＶ単
離体由来のヘリカーゼ配列を系統発生学的に分析する
と、それらは、最大進化距離が０．２０である分岐の小
さいグループを形成していることが判る（表３２、後
記）。ＨＣＶグループとＨＧＢＶグループとを比較する
と、各グル−プからの任意の２つの配列の最小進化距離
は０．６９であることが判る。上記の距離の値を使用
し、図４２に表す系統樹を作成した。これらのウイルス
の分岐度が比較的高いことから、ＧＢウイルスは単に肝
炎Ｃ型グループ内のタイプまたはサブタイプをなすので
はなく、独自の系統発生学的グループを構成することが
判る。ＨＣＶウイルスゲノムの小部分から誘導される配
列情報を使用した系統発生学的分析は、新規の単離体を
遺伝子型グループに割当てる容認可能な方法であること
が示されている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら，Ｈｅｐａｔｏｌ
ｏｇｙ １９：１３２１−１３２４（１９９４））。最
近の分析では、代表的なＨＣＶ単離体由来のヘリカーゼ
遺伝子内の１１０個のアミノ酸からなる配列を使用すれ
ば、それらは、それぞれの遺伝子型に適当に分類される
（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７
５：１０５３−１０６１（１９９４））。従って、示さ
れた進化距離は、多分、ＧＢウイルスと肝炎Ｃ型ウイル
スとの高度の分岐を正しく反映している。
【００３２】先行特許出願において、「ＨＧＢＶ株はポ
リペプチドレベルで同定可能であり、ＨＧＢＶ株はポリ
ペプチドレベルで４０％以上が相同、好ましくは約６０
％以上が相同、更に好ましくは約８０％以上が相同であ
る」と述べられていた。「相同」なる用語は、使用され
てはいるが、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド配列の関連の度合いを示す場合に曖昧であり、実際に
は進化上の関連性を示唆するものである。当分野の最近
の慣例によれば、「相同性」なる用語はもはや使用され
ず、代わりに、「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」及
び／または「一致性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」なる用語を
使用して２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配
列の関連の度合いを示している。アミノ酸配列の「類似
性」及び／または「一致性」を決定する方法は当分野に
おいて公知であるが、例えば、アミノ酸配列を直接決定
し、それを本明細書に与えられた配列と比較したり、推
定ＨＧＢＶのゲノム材料のヌクレオチド配列を（通常は
ｃＤＮＡ中間体を介して）決定し、そこにコードされて
いるアミノ酸配列を決定し、対応領域を比較するなどが
挙げられる。通常、「一致性」とは、各ゲノム上の適当
な場所においてＨＧＢＶのヌクレオチド配列と別の株の
ヌクレオチド配列、またはＨＧＢＶのアミノ酸配列と別
の株のアミノ酸配列が正確に一致することを意味する。
通常、「類似性」とは、適当な場所においてＨＧＢＶの
アミノ酸配列と別の株のアミノ酸配列が正確に一致する
ことを意味するが、その場合、アミノ酸は同一または類
似の化学的及び／または物理的特性、例えば電荷または
疎水性を有する。（ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍ
ｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ，５３７１１から入手可能な）Ｗｉｓｃｏｎｓ
ｉｎ ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａ
ｇｅ，バージョン８において使用可能なプログラム、例
えばＧＡＰプログラムにより、２つのポリヌクレオチド
または２つのポリペプチドの配列間の一致率及び類似率
を計算し得る。２つの配列間の一致率及び類似率を計算
する他のプログラムも当分野において公知である。
【００３３】更に、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂまたは
ＨＧＢＶ−Ｃの株を同定することにおいて、以下のパラ
メーターを単独または組合せて使用し得る。ＨＧＢＶ株
は好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以
上の遺伝的関連性があり得ると考えられることから、Ｈ
ＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢまたはＨＧＢＶ−Ｃとこれら
の肝炎ＧＢウイルスの１つの株との間のヌクレオチド配
列全体の一致率は約４５％以上であると推定される。
【００３４】更に、ＨＧＢＶ株は好ましくは約４０％以
上、より好ましくは約６０％以上、更に好ましくは約８
０％以上の遺伝的関連性があり得ると考えられることか
ら、ＨＧＢＶ−ＡのゲノムとＨＧＢＶ−Ａのある株のゲ
ノムとのアミノ酸レベルでの配列全体の一致率は約３５
％以上であろうと推定される。更に、２つ以上の連続配
列の組合せで与えられているであろう、少なくとも約１
３ヌクレオチドからなる対応連続配列がある。また、Ｈ
ＧＢＶ株は好ましくは約４０％以上、より好ましくは約
６０％以上、更に好ましくは約８０％以上の遺伝的関連
性があり得ると考えられることから、ＨＧＢＶ−Ｂのゲ
ノムとＨＧＢＶ−Ｂのある株のゲノムとのアミノ酸レベ
ルでの配列全体の一致率は約３５％以上であると推定さ
れる。更に、２つ以上の連続配列の組合せで与えられて
いるであろう、少なくとも１３ヌクレオチドからなる対
応連続配列がある。また、ＨＧＢＶ株は好ましくは約４
０％以上、より好ましくは約６０％以上、更に好ましく
は約８０％以上の遺伝的関連性があり得ると考えられる
ことから、ＨＧＢＶ−ＣのゲノムとＨＧＢＶ−Ｃのある
株のゲノムとのアミノ酸レベルでの配列全体の一致率は
約３５％以上であろうと推定される。更に、２つ以上の
連続配列の組合せで与えられているであろう、少なくと
も約１３ヌクレオチドからなる対応連続配列がある。
【００３５】本発明の組成物及び方法により、ＨＧＢＶ
及びその存在し得る株の増殖、同定、検出及び単離が可
能となる。更に本発明の組成物及び方法により、ＨＧＢ
Ｖの存在し得る種々の株に対する診断薬及びワクチンの
製造が可能となり、抗ウイルス性物質のスクリーニング
処理に有用となる。情報は、ウイルス分類学者が該種に
属する他の株を同定するのに十分となろう。本発明者ら
は、ＨＧＢＶが本明細書に含まれる配列をコードすると
考えている。かかる配列の存在をアッセイする方法は当
分野において公知であり、例えばリガーゼ連鎖反応（Ｌ
ＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリ
ダイゼーションといった増幅方法が挙げられる。更に、
かかる配列は、免疫原性ウイルスエピトープを見い出し
得る読取り枠を含む。このエピトープは、他の既知の肝
炎誘発ウイルスと比較し、ＨＧＢＶに固有である。エピ
トープの固有性は、ＨＧＢＶに対する免疫学的反応性
と、肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ型ウイルスに対する免疫
学的反応性の欠如とによって判定し得る。免疫学的反応
性を判定する方法は当分野において公知であり、例えば
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着ア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）、血球凝集反応（ＨＡ）、蛍光偏
光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）が挙げられるが、適当な
方法の幾つかの例を本明細書に記載する。
【００３６】特定の配列、例えばＨＧＢＶ ｃＤＮＡま
たはＨＧＢＶゲノム「から誘導された」ポリヌクレオチ
ドとは、特定のヌクレオチド配列の領域に対応する、即
ち類似であるかまたは相補的である、おおよそ少なくと
も約６個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個
のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１
２個のヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５
〜２０個のヌクレオチドの配列からなるポリヌクレオチ
ド配列を指す。ポリヌクレオチドを誘導する領域の配列
は、ＨＧＢＶゲノムに固有の配列に類似または相補的で
あるのが好ましい。配列がＨＧＢＶゲノムに固有の配列
に相補的または類似であるか否かは、当業者には公知の
方法で判断し得る。特定の配列の固有性を決定する方法
として、例えばデータバンクにある配列との比較を行い
得る。配列を誘導し得る領域としては、限定的ではない
が、特異的エプトープをコードする領域、並びに非翻訳
及び／または非転写領域が挙げられる。
【００３７】誘導ポリヌクレオチドは必ずしもＨＧＢＶ
のヌクレオチド配列から物理的に誘導される必要はな
く、限定的ではないが、ポリヌクレオチドを誘導する領
域の塩基配列により与えられる情報に基づいた化学的合
成、複製、または逆転写もしくは転写を含む任意の方法
で生成し得る。更に、特定の配列に対応する領域の組合
せは、当分野において公知の方法で所期の用途に応じて
変更し得る。
【００３８】特定の核酸配列またはＨＧＢＶゲノムから
誘導される「ポリペプチド」または「アミノ酸配列」と
は、配列内にコードされているポリペプチドと同一のア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、または、少なくとも
３〜５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１
０個のアミノ酸、更に好ましくは１５〜２０個のアミノ
酸からなり、配列内にコードされているポリペプチドと
免疫学的に一致し得る前記ポリペプチドの一部を指す。
【００３９】本明細書において使用される「組換えポリ
ペプチド」とは少なくとも、起源または操作によって、
天然もしくはライブラリーの形態で関連するポリペプチ
ドの全部または一部と関連せず、及び／またはそれが天
然で結合しているもの以外のポリヌクレオチドに結合し
ている、ゲノム、半合成または合成のポリペプチドを意
味する。組換えまたは誘導ポリペプチドは必ずしもＨＧ
ＢＶの特定の核酸配列またはＨＧＢＶゲノムから翻訳さ
れる必要はない。組換えまたは誘導ポリペプチドは、化
学的合成もしくは組換え発現系の発現、または突然変異
ＨＧＢＶからの単離を含む任意の方法で生成することも
できる。
【００４０】本明細書において使用される「合成ペプチ
ド」なる用語は、当業者には公知の方法で化学的に合成
し得る、任意の長さの重合形態のアミノ酸を意味する。
かかる合成ペプチドは種々の用途に有用である。
【００４１】本明細書において使用される「ポリヌクレ
オチド」なる用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシ
リボヌクレオチドいずれかの任意の長さの重合形態のヌ
クレオチドを意味する。この用語は分子の一次構造のみ
を指す。従って該用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ並
びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。更に、メチル
化及び／またはキャップ付加による修飾形態のポリヌク
レオチド、並びに未修飾形態のポリヌクレオチドも含ま
れる。
【００４２】「ｃＤＮＡに対応する配列を含むＨＧＢ
Ｖ」とは、ＨＧＢＶが、特定のＤＮＡ内の配列と類似ま
たは相補的なポリヌクレオチド配列を含むことを意味す
る。該ｃＤＮＡに対する類似または相補の程度は約５０
％以上、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましく
は少なくとも約９０％である。対応する配列の長さは少
なくとも約７０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約
８０ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約９０ヌ
クレオチドである。ＨＧＢＶとｃＤＮＡの対応は当分野
において公知の方法によって決定し得るが、例えば、配
列決定した物質を記載のｃＤＮＡと直接比較したり、ハ
イブリダイズし一本鎖ヌクレアーゼにより消化し、消化
されたフラグメントのサイズを決定することなどが挙げ
られる。
【００４３】「精製ウイルスポリヌクレオチド」とは、
ウイルスポリヌクレオチドが天然で関連するポリペプチ
ドを実質的に含まない、即ちその約５０％未満、好まし
くは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含ま
ないＨＧＢＶゲノムまたはそのフラグメントを指す。ウ
イルスポリヌクレオチドを精製する方法は当分野におい
て公知であり、例えば、カオトロピック（ｃｈａｏｔｒ
ｏｐｉｃ）剤を用いて粒子を破壊し、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密
度沈降によってポリヌクレオチド及びポリペプチドを分
離することが挙げられる。「精製ウイルスポリペプチ
ド」とは、ウイルスポリペプチドが天然で関連する細胞
成分を実質的に含まない、即ちその約５０％未満、好ま
しくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含
まないＨＧＢＶポリペプチドまたはそのフラグメントを
意味する。精製方法は当業者には公知である。
【００４４】本明細書において使用される「ポリペプチ
ド」とはアミノ酸の分子鎖を指し、特定の長さ産物を指
すものではない。従って、ペプチド、オリゴペプチド及
びタンパク質がポリペプチドの定義に含まれる。しかし
ながらこの用語には、ポリペプチドの発現後の修飾、例
えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などは含まれ
ないものとする。
【００４５】「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細
胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、及び単細胞物質と
して培養された微生物または高等真核細胞系を示す他の
同様の用語は、組換えベクターまたは他の移入ＤＮＡの
レシピエントとして使用され得る、または使用された細
胞を指し、トランスフェクトされた元の細胞の本来の子
孫をも含む。
【００４６】本明細書において使用される「レプリコ
ン」とは、細胞内でポリヌクレオチド複製の自立単位と
して挙動する、プラスミド、染色体またはウイルスとい
った任意の遺伝子エレメントを意味する。即ちレプリコ
ンはそれ自体の制御下で複製し得る。
【００４７】「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセ
グメントが複製及び／または発現し得るように付加され
たレプリコンである。
【００４８】「制御配列」なる用語は、それらが結合し
ているコーディング配列の発現を行うのに必要なポリヌ
クレオチド配列を指す。制御配列の特性は宿主生物に応
じて異なる。原核細胞においては制御配列は一般にプロ
モーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含
み、真核細胞においては制御配列は一般にプロモータ
ー、ターミネーター、及び場合によってはエンハンサー
を含む。従って「制御配列」なる用語は、少なくともそ
の存在が発現に必要な全ての成分を含んでいるものと
し、更には、存在すれば有利な追加成分、例えばリーダ
ー配列を含んでもよい。
【００４９】「操作可能に結合された」とは、上記成分
が予定通りに機能し得る関係にある状況を指す。従って
例えば、コーディング配列に「操作可能に結合された」
制御配列は、制御配列に適合する条件下でコーディング
配列の発現が行われるように連結されている。
【００５０】「読取り枠」または「ＯＲＦ」なる用語
は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の
領域を指す。この領域はコーディング配列の一部または
全コーディング配列を与え得る。
【００５１】「コーディング配列」は、適当な調節配列
の制御下に置かれたときにｍＲＮＡに転写される、及び
／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配
列である。コーディング配列の境界は、５’末端にある
翻訳開始コドンと３’末端にある翻訳終結コドンとによ
って決定される。コーディング配列としては、限定的で
はないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組換えポリヌクレ
オチド配列が挙げられる。
【００５２】「〜を用いて／として免疫学的に同定可能
な」なる用語は、特定のポリペプチド、通常はＨＧＢＶ
タンパク質中に存在し、これに固有であるエピトープ及
びポリペプチドが存在することを指す。免疫学的な一致
（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、抗体結合及び／または結合の
競合によって判定し得る。かかる方法は当業者には公知
であるし、本明細書にも記載される。エピトープの固有
性は、公知のデータバンク、例えばＧｅｎＢａｎｋにお
いてエピトープをコードするポリヌクレオチド配列をコ
ンピューター検索するか、または他の既知のタンパク質
とアミノ酸配列を比較することにより判定し得る。
【００５３】本明細書において使用される「エピトー
プ」とはポリペプチドの抗原決定基を意味する。恐ら
く、エピトープは、３個のアミノ酸をそのエピトープに
固有の空間的配置で含み得る。通常エピトープは少なく
とも５個のこのようなアミノ酸からなり、より一般的に
は少なくとも８〜１０個のアミノ酸からなる。空間的配
置を調査する方法は当分野において公知であり、例えば
Ｘ線結晶分析及び２次元核磁気共鳴が挙げられる。
【００５４】ポリペプチド内に含まれる特定のエピトー
プを抗体が認識したことから抗体に結合するとき、該ポ
リペプチドは該抗体に対して「免疫学的に反応性であ
る」。免疫学的反応性は、抗体結合、特に抗体結合速
度、及び／または、該抗体に対するエピトープを含む既
知のポリペプチドを競合物質として使用する結合の競合
によって判定し得る。ポリペプチドが抗体に対して免疫
学的に反応性であるかどうかを決定する方法は当分野に
おいて公知である。
【００５５】本明細書において使用される「ＨＧＢＶエ
ピトープを含む免疫原性ポリペプチド」なる用語は、天
然ＨＧＢＶポリペプチドまたはそのフラグメント、並び
に、他の手段、例えば化学的合成または組換え微生物中
でのポリペプチドの発現によって製造されたポリペプチ
ドを意味する。
【００５６】「形質転換」なる用語は、挿入方法に関係
なく、外来ポリヌクレオチドを宿主細胞中に挿入するこ
とを指す。例えば、直接取込み、形質導入またはｆ−交
配（ｆ−ｍａｔｉｎｇ）が含まれる。外来ポリヌクレオ
チドは、非組込みベクター、例えばプラスミドとして維
持することもできるし、或いは、宿主ゲノム中に組込む
こともできる。
【００５７】「治療」とは予防及び／または加療を指
す。
【００５８】本明細書において使用される「個体」なる
用語は、動物、特に哺乳動物種のものを指し、限定的で
はないが、家畜、競技用動物、霊長目及びヒトを含む
が、特に該用語はタマリン及びヒトを指す。
【００５９】本明細書において使用される「正鎖」（ま
たは「＋」）は、ポリペプチドをコードする配列を含む
核酸を示す。「負鎖」（または「−」）は、「正」鎖の
配列と相補的な配列を含む核酸を示す。
【００６０】ウイルスの「陽性鎖ゲノム」は、ＲＮＡで
あろうとＤＮＡであろうと、ゲノムが一本鎖であり、ウ
イルスポリペプチドをコードすることを示す。
【００６１】「検査試料」とは、被分析物（例えば問題
の抗体または問題の抗原）のソースとなる個体の成分を
指す。かかる成分は当分野において公知である。検査試
料には本発明の方法によって試験し得る生物試料が含ま
れるが、ヒト及び動物の体液、例えば全血、血清、血
漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、並びに、呼吸管、胃腸管
及び尿生殖管の種々の外分泌物、涙、唾液、乳、白血
球、ミエローマなど、並びに、生物学的液体、例えば細
胞培養液上清、固定組織試料、固定細胞試料が挙げられ
る。
【００６２】「精製ＨＧＢＶ」とは、ウイルスが通常関
連する細胞構成物質、及び感染組織中に存在し得る他の
タイプのウイルスから単離されたＨＧＢＶの調製物を指
す。ウイルスを単離する方法は当業者には公知であり、
例えば遠心及びアフィニティークロマトグラフィーが挙
げられる。
【００６３】「ＰＮＡ」は、ある処理、例えばターゲッ
トの存在を判定するようなアッセイに使用し得る「ペプ
チド核酸類縁物」を指す。ＰＮＡは、ＲＮＡターゲット
またはＤＮＡに対する電気的に中性の物質である。例え
ばＤＮＡプローブの代わりにアッセイに使用されるＰＮ
Ａプローブは、ＤＮＡプローブを使用したときには得ら
れない利点を与える。かかる利点としては、製造可能
性、大規模標識、再現性、安定性、イオン強度の変化に
対する低感度性、及び、ＤＮＡまたはＲＮＡを使用する
方法に存在する酵素分解に対する抵抗性が挙げられる。
ＰＮＡは、フルオレセイン、放射性核種、化学発光化合
物などのシグナル生成化合物で標識することができる。
このようにＰＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡの代わりに方
法に使用し得る。本明細書にはＤＮＡを使用するアッセ
イを記載するが、必要であればアッセイ試薬を適当に変
更し、ＰＮＡをＲＮＡまたはＤＮＡの代わりに使用する
ことも常法の範囲内である。
【００６４】一般用途 本発明の特定の組換えタンパク質、合成ペポチド、また
は精製ウイルスポリペプチドを製造したならば、その組
換えまたは合成ペプチドを使用し、ＨＧＢＶに対する抗
原または抗体の存在を検出する本明細書に記載のごとき
固有のアッセイを開発することができる。またかかる組
成物を使用し、所望するＨＧＢＶの免疫学的エピトープ
に特異的に結合する特異的組換えタンパク質または合成
ペプチドを用い、モノクローナル及び／またはポリクロ
ーナル抗体を開発することができる。少なくとも１種の
本発明のポリヌクレオチドを使用して、当分野において
公知の方法に従ってワクチンを開発することも考えられ
る。
【００６５】アッセイに使用される試薬は、アッセイに
使用されるモノクローナル抗体もしくはモノクローナル
抗体の混合物または（組換えもしくは合成）ポリペプチ
ドといった試薬を各々が含む１つ以上の容器、例えばバ
イアルやボトルを包含する試験キットの形態で提供され
得ると考えられる。当業者には公知の緩衝液、対照など
の他の構成成分をかかる試験キットに含めてもよい。
【００６６】「固相」（「固体支持体」）は当業者には
公知であり、反応トレーのウェルの壁、試験管、ポリス
チレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロースストリッ
プ、膜、微粒子（例えばラテックス粒子）、ヒツジ（ま
たは他の動物）の赤血球、Ｄｕｒａｃｙｔｅｓ／−Ｅ
（Abbott Laboratories、Abbott Park.ILより入手可能
な誘導体化赤血球）などが挙げられる。「固相」は限定
的なものではなく、当業者によって選択され得る。即
ち、ラテックス粒子、微粒子、磁性または非磁性ビー
ズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェ
ルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジ（または
他の適当な動物）の赤血球、及びＤｕｒａｃｙｔｅｓ／
−Ｅは全てが適当な例である。ペプチドを固相上に固定
する適当な方法としては、イオン性、疎水性、共有結合
性の相互作用などが挙げられる。本明細書において使用
される「固相」とは、不溶性であるかまたは後続反応に
よって不溶性にし得る任意の材料を指す。固相は、捕獲
剤を引き付けて固定する固有の能力において選択され得
る。或いは固相は、捕獲剤を引き付けて固定する能力を
有する補助的レセプターを保持し得る。補助的レセプタ
ーは、捕獲剤自体または捕獲剤に結合している帯電物質
とは反対の電荷を有する帯電物質を含み得る。或いはま
たレセプター分子は、固相上に固定（付着）されてお
り、特異的結合反応によって捕獲剤を固定する能力を有
する任意の特異的結合メンバーとすることもできる。ア
ッセイ実施前またはアッセイ実施中に、レセプター分子
によって捕獲剤を固相材料に間接的に結合することがで
きる。固相は、プラスチック、誘導体化プラスチック、
磁性または非磁性金属、ガラスまたはシリコン表面を備
えた試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビー
ズ、微粒子、チップ、ヒツジ（または他の適当な動物）
の赤血球、Ｄｕｒａｃｙｔｅｓ／Ｅ、並びに、当業者に
は公知の他の構成とし得る。
【００６７】固相が、検出抗体がアクセスし得るに十分
な多孔性及び抗原を結合するのに適当な表面親和性を有
する任意の適当な多孔質材料からなることも考えられ、
本発明の範囲内である。一般には微孔質構造が好ましい
が、水和状態でゲル構造を有する材料も使用し得る。か
かる有用な固体支持体としては、天然ポリマー炭水化物
及びそれらの合成変性、架橋または置換誘導体、例えば
寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換架橋グアゴ
ム、特に硝酸及びカルボン酸とのセルロースエステル、
混合セルロースエステル、セルロースエーテル；窒素を
含む天然ポリマー、例えば架橋または変性ゼラチンを含
むタンパク質及び誘導体；天然炭化水素ポリマー、例え
ばラテックス及びゴム；適当な多孔質構造を有するよう
製造され得る合成ポリマー、例えばポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸
ビニルを含むビニルポリマー及びその部分加水分解誘導
体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、上記ポ
リ縮合物のコポリマー及びターポリマー、例えばポリエ
ステル、ポリアミド、及び他のポリマー、例えばポリウ
レタンまたはポリエポキシド；多孔質無機材料、例えば
アルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩または炭酸
塩（例えば硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシ
ウム）、アルカリ及びアルカリ土類金属、アルミニウム
並びにマグネシウムのケイ酸塩；並びに、アルミニウム
またはケイ素の酸化物または水和物、例えばクレー、ア
ルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲルま
たはガラス（これらの材料は上記ポリマー材料と一緒に
充填剤として使用し得る）；並びに、これらの混合物ま
たはコポリマー、例えば既存の天然ポリマー上で合成ポ
リマーの重合を開始することにより得られるグラフトコ
ポリマーが挙げられる。これらの材料は全てが、フィル
ム、シート、またはプレートといった適当な形状で使用
することもできるし、紙、ガラス、プラスチックフィル
ム、またはファイバーといった適当な不活性担体に被
覆、接着または積層することもできる。
【００６８】ニトロセルロースの多孔質構造は、モノク
ローナル抗体を含む広範囲の試薬に対して優れた吸収性
及び吸着性を示す。ナイロンも同様の特性を有してお
り、やはり適当である。上述のごとき多孔質固体支持体
は厚さが約０．０１〜０．０５ｍｍ、好ましくは約０．
１ｍｍのシートの形態であると考えられる。孔径は広範
囲で変えることができるが、約０．０２５〜１５μ、特
に約０．１５〜１５μであるのが好ましい。かかる支持
体の表面は、抗原または抗体と支持体との共有結合を惹
起する化学処理によって活性化し得る。一般には、あま
り理解されていない疎水性の力によって多孔質材料上に
吸着することにより、抗原または抗体は不可逆的に結合
される。適当な固体支持体は米国特許出願第２２７，２
７２号明細書にも記載されている。
【００６９】「指示薬」は、ＨＧＢＶの特異的結合メン
バーに結合（付着）した、外部手段によって検出し得る
測定可能シグナルを生成し得るまたは生成する「シグナ
ル生成化合物」（標識）を含む。本明細書において使用
される「特異的結合メンバー」とは特異的結合対、即ち
一方の分子が化学的または物理的手段を介して第２の分
子に特異的に結合する２つの分子のメンバーを意味す
る。ＨＧＢＶに対する特異的結合対の抗体メンバーであ
るほか、指示薬は、ハプテン−抗ハプテン系、例えばビ
オチンまたは抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、炭
水化物またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフ
ェクター分子またはレセプター分子、酵素補因子及び酵
素、酵素阻害物質または酵素などとし得る。免疫反応性
特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイにおいて
はＨＧＢＶに、競合アッセイにおいては捕獲剤に、また
間接アッセイにおいては任意の特異的結合メンバーに結
合し得る、抗体、抗原、または抗体／抗原複合体であり
得る。
【００７０】考えられる種々の「シグナル生成化合物」
（標識）としては、色原体、酵素のごとき触媒、フルオ
レセイン及びローダミンのごとき発光化合物、ジオキセ
タン、アクリジニウム、フェナントリジニウム及びルミ
ノールのごとき化学発光化合物、放射性元素、直接可視
標識が挙げられる。酵素の例としてはアルカリ性ホスフ
ァターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼなどが挙げられる。特定の標識の選択は限定的
ではなく、標識はそれ自体でまたは１種以上の他の物質
と一緒になってシグナルを生成することができる。
【００７１】本発明は、特異的結合メンバーを使用する
アッセイを提供する。本明細書において使用される「特
異的結合メンバー」は特異的結合対、即ち一方の分子が
化学的または物理的手段を介して第２の分子に特異的に
結合する２種類の異なる分子のメンバーである。従っ
て、一般的なイムノアッセイの抗原及び抗体特異的結合
対のほかに、他の特異的結合対として、ビオチンとアビ
ジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、
エフェクター分子とレポーター分子、補因子と酵素、酵
素阻害物質と酵素などを挙げ得る。特異的結合対には更
に、元の特異的結合対の類似物、例えば被分析物質類似
物であるメンバーも含まれ得る。免疫反応性特異的結合
メンバーとしては、組換えＤＮＡ分子によって形成され
るものを含み、抗原、抗原フラグメント、モノクローナ
ル及びポリクローナル抗体及び抗体フラグメント、これ
らの複合体が挙げられる。本明細書において使用される
「ハプテン」なる用語は、抗体に結合することはできる
が、担体タンパク質に結合していなければ抗体形成を誘
起し得ない部分抗原または非タンパク質結合メンバーを
指す。 本明細書において使用される「被分析物質」
は、検査試料中に存在し得る検出すべき物質である。被
分析物質は、それに対して天然特異的結合メンバー（例
えば抗体）が存在するかまたはそれに対して特異的結合
メンバーを調製し得る物質であり得る。即ち、被分析物
質は、アッセイにおいて１つ以上の特異的結合メンバー
に結合し得る物質である。「被分析物質」としては、任
意の抗原性物質、ハプテン、抗体、及びこれらの組合せ
が挙げられる。特異的結合対のメンバーとして、被分析
物質は天然特異的結合パートナー（対）によって検出す
ることができ、例えば、ビタミンＢ１２の測定には特異
的結合対のメンバーとして固有因子タンパク質が使用さ
れ、葉酸を測定するには葉酸塩結合タンパク質が使用さ
れ、炭水化物の測定には特異的結合対のメンバーとして
レクチンが使用される。被分析物質としてはタンパク
質、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチドターゲットなど
が挙げられる。
【００７２】種々の他の固相を使用する他の実施態様も
考えられ、それらも本発明の範囲内である。例えば、欧
州特許出願公開第０３２６１００号明細書に対応する同
時係属米国特許出願第１５０，２７８号明細書及び米国
特許出願第３７５，０２９号明細書（欧州特許出願公開
第０４０６４７３号明細書）に記載の、負電荷を有する
ポリマーを用いて固定可能な反応複合体を固定するイオ
ン捕獲法を本発明に従って使用し、高速液相（ｆａｓｔ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｐｈａｓｅ）免疫化学反応を行う
ことができる。固定可能な免疫複合体は、負電荷を有す
るポリアニオン／免疫複合体と予め処理して正電荷をも
たせた多孔質マトリックスとのイオン相互反応によって
反応混合物の残りの部分から分離し、ＥＰＯ特許出願公
開第０，２７３，１１５号明細書に対応する同時係属米
国特許出願第９２１，９７９号明細書に記載のごとき化
学発光シグナル測定に記載のものを含む、文献明記の種
々のシグナル生成系を使用して検出し得る。
【００７３】また本発明方法は、固相が（磁性または非
磁性）微粒子からなる自動化及び半自動化系を含む、微
粒子技術を使用する系での使用にも適合し得る。このよ
うな系として、ＥＰＯ特許出願公開第０ ４２５ ６３
３号明細書及び同第０ ４２４ ６３４号明細書にそれ
ぞれ対応する係属米国特許出願第４２５，６５１号明細
書及び同第４２５，６４３号明細書に記載のものが挙げ
られる。
【００７４】イムノアッセイ用の走査型プローブ顕微鏡
（ＳＰＭ）を使用すると、本発明のモノクローナル抗体
を容易に適合し得る。走査型プローブ顕微鏡、特に原子
力（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ）顕微鏡においては、捕
獲相、例えば少なくとも１種の本発明のモノクローナル
抗体を固相に付着させ、走査型プローブ顕微鏡を使用
し、固相の表面に存在し得る抗原／抗体複合体を検出す
る。走査型トンネル顕微鏡を使用すると、抗原／抗体複
合体を検出するために多くのイムノアアッセイ系に通常
は使用せねばならない標識が必要でなくなる。このよう
な系は係属米国特許出願第６６２，１４７号明細書に記
載されている。特異的結合反応をモニターするためにＳ
ＰＭは多くの態様で使用され得る。１つの実施態様にお
いては、特異的結合パートナーの１つのメンバー（本発
明のモノクローナル抗体である被分析物質特異的物質）
を走査に適した表面に付着させる。被分析物質特異的物
質の付着は、当業者には公知の方法に従って、プラスチ
ックまたは金属表面の固相からなる試験片に吸着させる
ことにより行い得る。或いは、誘導体化プラスチック、
金属、シリコン、またはガラスの固相からなる試験片に
特異的結合パートナー（被分析物質特異的物質）を共有
結合させることもできる。共有結合方法は当業者には公
知であり、特異的結合パートナーを試験片に不可逆的に
結合する種々の手段を含む。試験片がシリコンまたはガ
ラスである場合、特異的結合パートナーを付着させる前
に表面を活性化する必要がある。トリエトキシアミノプ
ロピルシラン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）、トリエ
トキシビニルシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）及び（３−メ
ルカプト−プロピル）−トリメトキシシラン（Ｓｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）といった活性化シラン化合物を使用し、それぞれア
ミノ、ビニル及びチオールといった反応性の基を導入す
ることができる。このような活性化表面を使用して結合
パートナーを（アミノまたはチオールの場合には）直接
に結合することもできるし、活性化表面を更に、グルタ
ルアルデヒド、ビス（スクシンイミジル）スベレート、
ＳＰＰＤ９（スクシンイミジル ３−［２−ピリジルジ
チオ］プロピオネート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル
−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−
カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（スクシンイミジル［４
−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）及びＳＭＰＢ
（スクシンイミジル４−［１−マレイミドフェニル］ブ
チレート）といったリンカーと反応させ、結合パートナ
ーを表面から離すこともできる。ビニル基は、酸化して
共有結合手段を与えることもできるし、特異的結合パー
トナーに対して複数の付着点を与え得るポリアクリル酸
のごとき種々のポリマーを重合するためのアンカーとし
て使用することもできる。アミノ表面を種々の分子量の
酸化デキストランと反応させ、種々のサイズ及び結合能
の親水性リンカーを与えることもできる。酸化可能なデ
キストランの例として、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−４０（分
子量４０，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−１
１０（分子量１１０，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａ
ｎＴ−５００（分子量５００，０００ダルトン）、Ｄｅ
ｘｔｒａｎ Ｔ−２Ｍ（分子量２，０００，０００ダル
トン）（これら全てはＰｈａｒｍａｃｉａから入手可
能）、またはＦｉｃｏｌｌ（分子量７０，０００ダルト
ン）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）が挙げられる。また、１
９８８年１月２９日出願係属米国特許出願第１５０，２
７８号明細書及び１９８９年７月７日出願同第３７５，
０２９号明細書に記載の方法及び化学物質を使用し、高
分子電解質相互作用を使用して特定的結合パートナーを
試験片の表面に固定することもできる。好ましい付着方
法は共有結合によるものである。特異的結合メンバーを
付着させたあと、非特異的結合を最少限に抑えるために
表面を更に、血清、タンパク質、または他のブロッキン
グ剤で処理してもよい。該表面がアッセイに適している
か検証するため、それを製造場所または使用時点で走査
してもよい。走査方法は、試験片の特異的結合特性を変
化させないものとする。
【００７５】「サンドイッチ」イムノアッセイ及びプロ
ーブアッセイを含む種々の他のアッセイ形式を使用し得
る。例えば、本発明のモノクローナル抗体を種々のアッ
セイ系に使用して、検査試料中のＨＧＢＶタンパク質の
存在を、もしあるとするならば判定することができる。
与えられるかかるモノクローナル抗体のフラグメントを
使用してもよい。例えば高速アッセイ形式においては、
固相に被覆したポリクローナルもしくはモノクローナル
抗ＨＧＢＶ抗体またはそのフラグメントまたはこれらの
抗体の組合せを、ＨＧＢＶタンパク質を含み得る検査試
料と接触させ、混合物を形成する。この混合物を、抗原
／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でイ
ンキュベートする。シグナル生成化合物を付着させた、
ＨＧＢＶ領域に特異的に結合するモノクローナルもしく
はポリクローナル抗体またはそのフラグメントまたはこ
れらの抗体の組合せを含む指示薬を、抗原／抗体複合体
と接触させて第２の混合物を形成する。この第２の混合
物を、抗体／抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時
間及び条件下でインキュベートする。検査試料中に存在
しており固相上に捕獲されたＨＧＢＶ抗原の存在は、も
しあるとすれば、シグナル生成化合物によって生成され
る測定可能なシグナルを検出することにより判定され
る。検査試料中に存在するＨＧＢＶ抗原の量は生成され
たシグナルに比例する。
【００７６】或いは、固体支持体に結合させたポリクロ
ーナルもしくはモノクローナル抗ＨＧＢＶ抗体またはそ
のフラグメントまたはこれらの抗体の組合せと、検査試
料と、シグナル生成化合物を付着させた、ＨＧＢＶ抗原
に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクロー
ナル抗体またはそのフラグメントまたはこれらの抗体の
組合せを含む指示薬とを接触させて混合物を形成する。
この混合物を、抗体／抗原／抗体複合体を形成するのに
十分な時間及び条件下でインキュベートする。検査試料
中に存在しており固相上に捕獲されたＨＧＢＶタンパク
質の存在は、もしあるとすれば、シグナル生成化合物に
よって生成される測定可能なシグナルを検出することに
より判定される。検査試料中に存在するＨＧＢＶタンパ
ク質の量は生成されたシグナルに比例する。
【００７７】更に別のアッセイ形式においては、１種ま
たは２種以上組合せた本発明のモノクローナル抗体を、
ＨＧＢＶタンパク質に対する抗体を検出するための競合
プローブとして使用し得る。例えばＨＧＢＶタンパク質
を単独でまたは組合せて固相に被覆することができる。
次いで、ＨＧＢＶ抗原に対する抗体を含む疑いのある検
査試料を、シグナル生成化合物と少なくとも１種の本発
明モノクローナル抗体とを含む指示薬と一緒に、検査試
料及び指示薬と固相、または指示薬と固相とで、抗原／
抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でイン
キュベートする。モノクローナル抗体の固相への結合の
低下を定量的に測定し得る。非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、
非Ｅ型肝炎陰性が確認されている検査試料から生成され
るシグナルと比較してシグナル低下が測定され得るなら
ば、検査試料中に抗ＨＧＢＶ抗体が存在することが判
る。
【００７８】更に別の検出方法においては、本発明のモ
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の各々を、
免疫組織化学分析による固定組織片及び固定細胞におけ
るＨＧＢＶ抗原の検出に使用し得る。かかる抗体を直接
標識する（フルオレセイン、コロイド金、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）か、
または（本明細書に例示した種々の標識を用いた）第２
標識抗種抗体を使用して標識して疾患の履歴を追跡する
細胞化学分析も本発明の範囲内である。
【００７９】更に、モノクローナル抗体をＣＮＢｒ活性
化セファロースと類似のマトリックスに結合し、細胞培
養物、または血液及び肝といった生物組織由来の特異的
ＨＧＢＶタンパク質のアフィニティー精製に使用し、組
換えまたは天然ウイルスＨＧＢＶ抗原及びタンパク質を
精製することもできる。 本発明のモノクローナル抗体
は、治療を目的とするキメラ抗体の生成や、他の類似の
用途に使用することもできる。 モノクローナル抗体ま
たはそのフラグメントは、ＨＧＢＶ抗原を検出するため
に個々に提供され得る。本明細書において与えられるモ
ノクローナル抗体（及びそのフラグメント）の組合せ
は、少なくとも１種の本発明の抗ＨＧＢＶ抗体と、他の
ＨＧＢＶ領域に対する抗体との混合物または「カクテ
ル」中の、各々が異なる結合特異性を有する成分として
一緒に使用され得る。即ちこのカクテルは、ＨＧＢＶタ
ンパク質に対する本発明のモノクローナル抗体と、ＨＧ
ＢＶゲノムの他の抗原決定基に対する他のモノクローナ
ル抗体とを含み得る。
【００８０】かかるアッセイ形式に使用し得るポリクロ
ーナル抗体またはそのフラグメントは、アッセイに使用
される特異的ＨＧＢＶ領域または他のＨＧＢＶタンパク
質に特異的に結合すべきである。使用されるポリクロー
ナル抗体は哺乳動物由来のものであるのが好ましく、ヒ
ト、ヤギ、ウサギまたはヒツジの抗ＨＧＢＶポリクロー
ナル抗体を使用し得る。最も好ましくは、ポリクローナ
ル抗体はウサギポリクローナル抗ＨＧＢＶ抗体である。
アッセイに使用されるポリクローナル抗体は単独でもポ
リクローナル抗体のカクテルとしても使用し得る。アッ
セイ形式に使用されるカクテルは異なるＨＧＢＶ特異性
を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
いずれかからなるので、それらは、ＨＧＢＶ感染の診
断、評価及び予防に、並びにＨＧＢＶタンパク質の分化
及び特異性の研究に有用となろう。
【００８１】全てのＨＧＢＶウイルスに共通な合成、組
換えまたは天然ペプチドを使用することにより、ＨＧＢ
Ｖ群のウイルスがアッセイにおいて検出可能となり得る
ことが考えられ、本発明の範囲内である。ＨＧＢＶ−
Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、ＨＧＢＶ−Ｃ、更には他のＨＧＢＶ
ウイルス由来の種々のエピトープを同定する種々の合
成、組換えまたは天然ペプチドをアッセイ形式に使用し
得ることも本発明の範囲内である。後者の場合、それら
を１つの固相に被覆してもよいし、各ペプチドをそれぞ
れ別個の固相、例えば微粒子上に被覆し、それらを合わ
せて、あとでアッセイに使用し得るペプチドの混合物を
形成してもよい。このようなアッセイ形式の変形は当業
者には公知であり、後述する。
【００８２】別のアッセイ形式においては、ＨＧＢＶに
対する抗体及び／または抗原の存在を以下のように同時
アッセイにおいて検出し得る。検査試料を、固相に付着
された第１被分析物質に特異的な第１結合メンバーを含
む第１被分析物質用捕獲剤と、第２固相に付着された第
２被分析物質に対する第１結合メンバーを含む第２被分
析物質用捕獲剤とに同時に接触させ、それによって混合
物を形成する。この混合物を、捕獲剤／第１被分析物質
複合体及び捕獲剤／第２被分析物質複合体を形成するの
に十分な時間及び条件下でインキュベートする。このよ
うに形成された複合体を、シグナル生成化合物で標識さ
れた第１被分析物質に特異的な結合対のメンバーを含む
指示薬と、シグナル生成化合物で標識された第２被分析
物質に特異的な結合対のメンバーを含む指示薬とに接触
させ、第２混合物を形成する。この第２混合物を、捕獲
剤／第１被分析物質／指示薬複合体及び捕獲剤／第２被
分析物質／指示薬複合体を形成するのに十分な時間及び
条件下でインキュベートする。１種以上の被分析物質の
存在は、検査試料中の１種以上の被分析物質の存在の指
標として、いずれか一方または両方の固相上に形成され
た複合体に関連して生成されたシグナルを検出すること
により判定される。このアッセイ形式においては、ヒト
発現系から誘導されたタンパク質を、本明細書に記載の
ごとき哺乳動物発現系から誘導されたタンパク質から生
成されるモノクローナル抗体と同様に使用し得る。かか
るアッセイ系は、欧州特許出願公開第０４７３０６５号
明細書に対応する係属米国特許出願第０７／５７４,８
２１号明細書、発明の名称“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ
Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＯｎｅＯ
ｒ Ｍｏｒｅ Ａｎａｌｙｔｅｓ”に詳述されている。
【００８３】更に別のアッセイ形式においては、組換え
タンパク質及び／または合成ペプチドを使用して検査試
料中の抗ＨＧＢＶの存在を検出し得る。例えば、検査試
料を、少なくとも１種の組換えタンパク質または合成ペ
プチドを付着させた固相と一緒にインキュベートする。
これらを、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間
及び条件下で反応させる。インキュベーション後、抗原
／抗体複合体を検出する。選択したアッセイ系に従い、
指示薬を使用して検出を容易にし得る。別のアッセイ形
式においては、検査試料を、本明細書に記載のごとく製
造された組換えタンパク質または合成ペプチドを付着さ
せた固相と接触させ、更に、好ましくは指示薬で標識さ
れた、該タンパク質に特異的なモノクローナルまたはポ
リクローナル抗体と接触させる。抗体／抗原複合体が形
成されるのに十分な時間及び条件下でインキュベートし
た後、固相を遊離相から分離し、ＨＧＢＶ抗体の存在の
指標としての標識を固相または遊離相において検出す
る。本発明のタンパク質を使用する他のアッセイ形式も
考えられる。それらには、検査試料を、第１供給源由来
の少なくとも１種の抗原を付着させた固相と接触させ、
固相及び検査試料を、抗原／抗体複合体を形成するのに
十分な時間及び条件下でインキュベートし、次いで固相
を、第１供給源とは異なる第２供給源から誘導された標
識抗原と接触させることを含む。例えば、Ｅ.ｃｏｌｉ
のごとき第１供給源から誘導された組換えタンパク質を
固相上の捕獲抗原として使用し、検査試料をこのように
調製された固相に添加し、異なる供給源（即ちＥ.ｃｏ
ｌｉ以外）から誘導された組換えタンパク質を指示薬の
一部として使用する。同様に、固相上の組換え抗原と指
示薬相中の合成ペプチドとを組合せることもできる。第
１供給源由来のＨＧＢＶに特異的な抗原を捕獲抗原とし
て使用し且つ異なる第２供給源由来のＨＧＢＶに特異的
な抗原を使用するアッセイ形式も考えられる。組換え抗
原の種々の組合せ、並びに合成ペプチド、精製ウイルス
タンパク質の使用などが本発明の範囲に含まれる。この
ようなアッセイその他が本出願人名義の米国特許第５,
２５４,４５８号明細書に記載されており、その内容は
参照により本明細書に包含されるものとする。
【００８４】他のアッセイ系では、ウイルスゲノム（ま
たはそのフラグメント）を含むＨＧＢＶウイルス粒子ま
たはサブウイルス粒子に、特異的抗体とウイルスタンパ
ク質（ペプチドなど）の接触によって特異的に結合する
（ポリクローナル、モノクローナルまたは天然）抗体が
使用される。次いでこの捕獲された粒子をＬＣＲまたは
ＰＣＲなどの方法によって分析し、ウイルスゲノムが検
査試料中に存在するかどうかを判定することができる。
該方法に従って分析し得る検査試料としては、血液、
肝、痰、尿、便、唾液などが挙げられる。かかる抗原捕
獲増幅法を使用する利点は、特異的抗体を使用して検査
試料中のウイルスゲノムを他の分子から分離し得ること
である。このような方法は係属米国特許出願第０８／１
４１,４２９号明細書に記載されている。
【００８５】本発明を固相を使用する場合について記載
したが、本発明の抗体、タンパク質及びペプチドといっ
た試薬は非固相アッセイ系においても使用し得ると考え
られる。このようなアッセイ系は当業者には公知であ
り、本発明の範囲に含まれるものとする。
【００８６】材料及び方法 一般方法 特に記載のない限り、本発明の実施には、分子生物学、
微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の分野における慣用
的な公知の技術及び方法が使用される。このような技術
は文献に詳述されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；
Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏ
ｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５）；Ｍ．Ｊ．
Ｇａｉｔ編，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ，（１９８４）；Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓら
編，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ，（１９８４）；Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓら編，Ｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉ
ｏｎ，（１９８４）；Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，Ａ
ｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，（１９８
６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ
Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；
Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄ
ｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，（１
９８４）；シリーズ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｊ．Ｈ．Ｍｉ
ｌｌｅｒら編，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．
Ｙ．（１９８７）；Ｗｕら編，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５４及び１５５；Ｍ
ａｙｅｒら編，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌ
ｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．；及び、Ｄ．Ｗｅｉｒら
編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＶ（１９８
６）；Ｎ．Ｌｉｓｉｔｉｓｙｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
５９：９４６−９５１（１９９３）参照。
【００８７】本発明の試薬及び方法は、本明細書に記載
のごとく改良された代表相違分析によって単離された、
タマリンまたはヒトであるＨＧＢＶ感染個体の血漿、血
清または肝ホモジネート中に存在する極めて関連性のあ
るヌクレオチド配列群を与えることにより実現可能とな
る。このヌクレオチド配列群は、未感染個体由来のヒト
またはタマリンゲノムＤＮＡにはハイブリダイズしない
こと、ＨＧＢＶ感染個体の肝（または肝ホモジネー
ト）、血漿または血清中にしか存在しないこと、及びＧ
ｅｎＢａｎｋに存在しないことから、ヒトまたはタマリ
ンに由来するものではない。更に、該配列群は、ＨＡ
Ｖ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ及びＨＥＶゲノム内に含ま
れる配列と核酸レベルで有意な一致を示さず、翻訳産物
でも一致レベルは有意とは考えられないほど低い。ＨＧ
ＢＶ感染ヒト由来の感染性血清、血漿または肝ホモジネ
ートはかかるポリヌクレオチド配列を含むが、未感染ヒ
ト由来の血清、血漿または肝ホモジネートはかかる配列
を含まない。これらのポリヌクレオチド配列の幾つかを
含む感染肝をノーザンブロット分析すると、それらがウ
イルスゲノムと同様のサイズの大きなＲＮＡ転写物から
誘導されていることが判る。ＨＧＢＶ感染ヒト由来の血
清、血漿または肝ホモジネートはこのポリペプチドに結
合する抗体を含むが、未感染ヒト由来の血清、血漿また
は肝ホモジネートはこのポリペプチドに対する抗体を含
まず、かかる抗体は、急性非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び
非Ｅ感染後の個体において誘起されている。これらを基
準にすると該配列は、非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び非Ｅ
型肝炎を惹起する、またはこれに関連のあるウイルスの
配列であると考えられる。
【００８８】この核酸配列群を使用し得ることにより、
ＨＧＢＶ感染に起因する非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、非Ｅ
型肝炎を診断したり、血液ドナー、献血血液、血液製剤
及び個体を感染についてスクリーニングすることにおい
て有用なＤＮＡプローブ及びポリペプチドを構築し得
る。例えば、該配列から、例えばウイルスを保有する疑
いのある被験者の血清中のウイルスゲノムの存在を検出
するためのハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣ
Ｒプライマーとして有用であったり、また献血血液中の
ウイルスの存在をスクリーニングするために有用な、約
８〜１０またはそれ以上のヌクレオチドのＤＮＡオリゴ
マーを合成し得る。当該核酸配列群により、ＨＧＢＶに
感染した際に生成される抗体の存在に対する診断試薬と
して有用な、ＨＧＢＶ特異的ポリペプチドを設計及び製
造し得る。該核酸配列から誘導される精製ポリペプチド
に対する抗体を使用し、感染個体及び血液中のウイルス
性抗原を検出することもできる。かかる核酸配列によ
り、ＨＧＢＶに対するワクチンとして、及び抗体を製造
するために使用し得るポリペプチドを設計及び製造する
ことが可能となり、そうすればそれを疾患の予防及び／
またはＨＧＢＶ感染個体の治療に使用し得る。
【００８９】かかる核酸配列群により、ＨＧＢＶゲノム
を更に特性分析することも可能となる。かかる配列から
誘導されるポリヌクレオチドプローブを使用し、ゲノム
またはｃＤＮＡライブラリーを別の重複核酸配列につい
てスクリーニングし、更にそれを使用して重複した配列
を得ることができる。ゲノムがセグメント化されていて
もセグメントが共通配列を欠いていることがなければ、
この方法を使用して全ゲノムの配列を得ることができ
る。しかしながら、ゲノムがセグメント化されている場
合、記載のごときＲＤＡクローニング処理を繰り返して
後述のごとく修飾するか、後述のごとくλ−ｇｔ１１血
清学的スクリーニング処理を繰り返して後述のクローン
を単離するか、或いは、精製ＨＧＢＶ粒子からゲノムを
単離することにより、ゲノムの他のセグメントを得るこ
とができる。
【００９０】上記配列から誘導されるｃＤＮＡ配列及び
ポリペプチド、並びにかかるポリペプチドに対する抗体
も、ＨＧＢＶ原因物質の単離及び同定に有用である。例
えば、かかる核酸配列から誘導されるポリペプチド中に
含まれるＨＧＢＶエピトープに対する抗体をアフィニテ
ィークロマトグラフィーに基づく方法に使用し、ウイル
スを単離することができる。或いは、抗体を使用し、他
の方法で単離されたウイルス粒子を同定することもでき
る。単離されたウイルス粒子中のウイルス性抗原及びゲ
ノム物質を更に特性分析することもできる。
【００９１】ＨＧＢＶゲノムを更に配列決定すること、
ＨＧＢＶ抗原を更に特性分析すること、及びゲノムを特
性分析することにより得られる情報により、ＨＧＢＶに
誘発される非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、非Ｅ型肝炎の診
断、予防及び治療に、並びに感染血液及び血液関連製剤
のスクリーニングに使用し得る別のプローブ及びポリペ
プチド並びに抗体を設計及び合成することができる。
【００９２】かかる核酸配列群が誘導されるゲノムから
誘導される抗原、抗体及びポリヌクレオチドを含む、Ｈ
ＧＢＶに対するプローブが得られれば、ＨＧＢＶの生物
学的特性を明らかにすることに特に使用される組織培養
系の開発が可能となる。一旦これが既知となれば、ＨＧ
ＢＶの複製またはその感染を優先的に阻害する抗ウイル
ス性化合物をベースにして新規の治療方法を開発し得る
と考えられる。
【００９３】ＨＧＢＶの病因物質を同定及び単離するた
めに使用した１方法では、Ｎ．Ｌｉｓｉｔｓｙｎら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ．２５９：９４６−９５１（１９９３）に
より報告されているような再現相違分析（ＲＤＡ）とし
て知られる公知方法の変法によりＧＢ物質のクローニン
グ／単離を行った。この方法は控除ハイブリダイゼーシ
ョンの原理に基づいて２つの複合哺乳動物ゲノム間のＤ
ＮＡ相違をクローニングする。要約すると、この方法で
は２つの被験ゲノムを（該当ターゲット配列を含む）
「テスター」及び（正常ＤＮＡに相当する）「ドライバ
ー」と属的に区別する。ＲＤＡに関するＬｉｓｉｔｓｙ
ｎらの記述は類似する複合ＤＮＡバックグラウンド間の
ＤＮＡ相違の同定及びクローニングに限られている。こ
れらの相違は特定の細胞系、血液、血漿又は組織サンプ
ル中に存在し且つ非感染細胞系、血液、血漿又は組織サ
ンプル中に不在の任意の大きいＤＮＡウイルス（例えば
≧２５，０００ＤＮＡ塩基対）を含み得る。ＨＧＢＶは
≦１０，０００塩基のＤＮＡ又はＲＮＡゲノムを含む小
さいウイルスであるらしいと先行文献に示されているの
で、小さいウイルスを検出できるようにＲＤＡプロトコ
ルを修正した。方法の主要段階を以下に記載し、図１３
に示す。
【００９４】要約すると、段階１では市販キットを使用
して全核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を単離する。ＲＤＡで
はサンプルが高度に整合していることが必要である。理
想的には、テスター及びドライバー核酸サンプルを同一
源（動物、ヒト等）から得るべきである。高度に関連す
るものであれば、非同一材料をテスター及びドライバー
核酸源に使用してもよい。ＲＮＡのランダムに開始され
る逆転写とそれに続いてランダムに開始されるＤＮＡ合
成により全核酸から２本鎖ＤＮＡを生成する。この処理
は、１本鎖ＲＮＡウイルス及び１本鎖ＤＮＡウイルスを
ＲＤＡに使用可能な２本鎖ＤＮＡ分子に変換するもので
ある。未知ウイルスがＤＮＡ又はＲＮＡゲノムの一方を
有すると仮定するならば、文献に記載されているように
ＤＮＡ単独又はＲＮＡ単独抽出手順を使用して２本鎖Ｄ
ＮＡを生成することができる。
【００９５】段階２ではテスター及びドライバー核酸を
増幅し、予備接種及び感染性血漿源から抽出された全核
酸に相当する大量の材料（即ちテスターアンプリコン及
びドライバーアンプリコン）を生成する。これは、４ｂ
ｐ認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼ（例えばＳ
ａｕ３ＡＩ）で上記のように調製した２本鎖ＤＮＡを開
裂することにより達せられる。ＤＮＡフラグメントをオ
リゴヌクレオチドアダプター（セット＃１）に連結す
る。ＤＮＡフラグメントを末端充填し、ＰＣＲ増幅す
る。ＰＣＲ増幅後、オリゴヌクレオチドアダプター（セ
ット＃１）を制限エンドヌクレアーゼ消化（例えばＳａ
ｕ３Ａ Ｉ）により除去し、その後の控除ハイブリダイ
ゼーション法で使用する大量のテスター及びドライバー
核酸を遊離させる。
【００９６】段階３の実験の目的はテスターゲノムに固
有のＤＮＡを集積することである。これは控除ハイブリ
ダイゼーション及び動的集積を単一段階として組み合わ
せることにより達せられる。要約すると、オリゴヌクレ
オチドアダプターセット（＃２又は＃３）をテスターア
ンプリコンの５’末端に連結する。テスターアンプリコ
ンと過剰のドライバーアンプリコンを混合し、変性さ
せ、２０時間ハイブリダイズさせる。テスター及びドラ
イバーＤＮＡ間で共通して保存される大量の配列がこの
時間中にアニールする。更に、テスターアプリコンに特
有な配列が再アニールする。しかし、ハイブリダイゼー
ション時間が制限されているため、多少の１本鎖テスタ
ー及びドライバーＤＮＡが残存する。
【００９７】段階４では、再アニールしたテスター及び
ドライバーＤＮＡの３’末端を文献に記載されているよ
うに高温で熱安定ＤＮＡポリメラーゼで充填する。テス
ターに固有の再アニールした配列はアニールした配列の
両鎖上に連結されたアダプターを含む。こうしてこれら
の分子の３’末端充填により２つのＤＮＡ鎖上にＰＣＲ
プライマーに相補的な配列が生成される。従って、これ
らのＤＮＡ種はＰＣＲにかけると指数的に増幅される。
これとは対照的にテスター及びドライバーアンプリコン
間で共通に保存された配列を含む比較的大量のハイブリ
ッド分子（即ち一方の鎖はテスターアンプリコンに由来
し、一方の鎖はドライバーアンプリコンに由来する）は
ＰＣＲにより直線的に増幅される。これは、（テスター
アンプリコンに由来する）鎖のみが連結されたアダプタ
ー配列を含み、３’末端充填がドライバーアダプターに
由来する鎖上にＰＣＲプライマーに相補的な配列のみを
生起するためである。
【００９８】段階５では、ＰＣＲを１０増幅サイクル使
用して該当２本鎖ＤＮＡを定量的に増量する。段階４で
記載したように、再アニールしたテスター配列は指数的
に増幅され、テスター及びドライバーアニール間で共通
して保存された配列は直線的に増幅される。
【００９９】段階６では、文献に記載されているように
ヤエナリヌクレアーゼを使用して１本鎖ＤＮＡヌクレア
ーゼ消化により残存する１本鎖ＤＮＡを除去する。
【０１００】段階７では、ヌクレアーゼ消化後に残存す
る２本鎖ＤＮＡを更に１５〜２５サイクルＰＣＲ増幅す
る。
【０１０１】最後に段階８ではこれらのＤＮＡ産物を制
限エンドヌクレアーゼで開裂し、オリゴヌクレオチドア
ダプターを除去する。その後、これらのＤＮＡ産物を
（前サイクルのＲＤＡで使用されなかったオリゴヌクレ
オチドアダプターを使用して段階＃３から開始する）次
回の増幅にかけるか、又は適切なプラスミドベクターに
クローニングし、更に分析する。
【０１０２】上記ＲＤＡ法は当業者に公知の再現相違分
析の変法である。予備接種及び感染性血清源からウイル
スクローンを単離するように方法を変形した。これらの
変形をテスター及びドライバーＤＮＡのアンプリコンの
調製に関して以下に説明する。まず第１に、出発材料は
従来報告されているように哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡ
から得た２本鎖ＤＮＡではなく、タマリンから得た感染
性予備接種生物血液サンプルから抽出した全核酸であっ
た。他の生物サンプル（例えば臓器、組織、胆汁、糞便
又は尿）を核酸源として使用してテスター及びドライバ
ーアンプリコンを生成してもよい。第２に、出発核酸の
量は文献に記載されているよりも実質的に少量である。
第３に、６ｂｐでなく４ｂｐ認識部位を有する制限エン
ドヌクレアーゼを使用した。これは従来技術と実質的に
相違する。Ｌｉｓｉｔｓｙｎらの教示によると、ＲＤＡ
はアンプリコン（即ち再現物）の生成がハイブリダイズ
（即ち控除）されるＤＮＡの複合度を低下させるという
理由で有効である。
【０１０３】従来技術では、６ｂｐ認識部位を有する制
限酵素を使用してゲノムを分画した。これらの制限エン
ドヌクレアーゼは約４０００ｂｐ毎に開裂する。他方、
従来技術に記載されているＰＣＲ条件では配列の増幅寸
法は≦１５００ｂｐである。従って、６ｂｐ配列を認識
する制限酵素で分画されたＤＮＡの複合種（例えばゲノ
ム）のその後のＰＣＲ増幅の結果、制限エンドヌクレア
ーゼ消化後に寸法≦１５００ｂｐのＤＮＡのフラクショ
ンを含むアンプリコンが生成される。ＲＤＡのハイブリ
ダイゼーション段階が有効に行われるためにはＤＮＡ複
合度のこの低下（１０〜５０分の１と推定される）が必
要であると報告されている。複合度が低下しないなら
ば、控除段階中にテスター中の固有配列は有効にハイブ
リダイズすることができず、従って、これらの固有配列
はＲＤＡの後続ＰＣＲ段階中に指数的に増幅されない。
【０１０４】ＲＤＡを受ける核酸配列の複合度が低下す
ると、比較的小さいウイルスを単離するためにＲＤＡを
使用し難くなる。相互に１．５ｋｂ以内に２つの６ｂｐ
認識部位が存在する確率はかなり低いので、小さい（≦
１０ｋｂ）ウイルスを単離できない恐れがある（表
１）。
【０１０５】
【表１】 これに対して本発明者らは、より切断頻度の高い制限エ
ンドヌクレアーゼを使用してＲＤＡ被験ＤＮＡを分画す
るならば、小さいウイルスのクローニングにＲＤＡが有
用であることを知見した。表１に示す通り、４ｂｐ認識
部位酵素をベースとするアンプリコンは、約２５０ｂｐ
毎に４ｂｐ認識部位フラグメントＤＮＡを有する制限エ
ンドヌクレアーゼのように、如何なる小さいウイルスか
らも数個のフラグメントをほぼ確実に含む。他方、ＤＮ
Ａ種のほぼ全部は４ｂｐ認識制限エンドヌクレアーゼに
よる消化後に≦１５００ｂｐで即ちＰＣＲ増幅されるの
で、アンプリコンはその生成起源である核酸源と同程度
の複合度であると思われる。相対ウイルス配列コピー数
は任意の特定又は内在配列コピー数よりも多いと予想さ
れるので、テスターアンプリコン中に存在する固有ウイ
ルス配列はハイブリダイゼーション段階（上記段階３）
中に２本鎖分子を形成できるはずである。従って、これ
らの配列は上記のように指数的に増幅される。相対ウイ
ルス配列コピー数がバックグラウンド又は内在核酸配列
コピー数に近づくので、重複６ｂｐ配列を認識し（例え
ばＢｓｔＹＩ又はＨｉｎｃＩＩ）且つ約１０００ｂｐ毎
に開裂する制限エンドヌクレアーゼを使用するか、又は
６ｂｐ配列を認識する数個の制限エンドヌクレアーゼを
同時に使用して、ＰＣＲによる増幅前にＤＮＡを分画す
ることができると推論される。こうして、テスターアン
プリコンからウイルス配列を排除する危険を最小限にし
ながら、ＲＤＡを受けるアンプリコンの複合度を適度に
低下させることができる。この方法の有用性は、本明細
書中に記載する感染性タマリン血漿からのＨＧＢＶ配列
のクローニングにより立証される。
【０１０６】ＨＧＢＶ免疫反応性エピトープを同定する
ための免疫スクリーニング 以下に記載するような免疫スクリーニングも、ＨＧＢＶ
配列を同定する付加的手段であった。急性又は慢性ＨＧ
ＢＶ感染を有する下記パラメーター内で基準に合致する
個体からの個々の血清、血漿又は肝臓ホモジネート又は
そのプールを使用してウイルス粒子を単離する。これら
の粒子から単離した核酸をゲノムライブラリー及び／又
はウイルスゲノムに対するｃＤＮＡライブラリーの構築
で鋳型として使用する。推定ＨＧＢＶ粒子を単離し、当
業者に公知のλ−ｇｔ１１又は類似のシステムでゲノム
及び／又はｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用
する手順を以下に説明する。λ−ｇｔ１１はβ−ガラク
トシダーゼとの融合ポリペプチドとして挿入ｃＤＮＡを
特異的に発現させ、規定抗原に対する特異抗血清で以っ
て多数の組換えファージをスクリーニングするために開
発されたベクターである。ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡプー
ルから生成されるλ−ｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリー
を、非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び非Ｅ肝炎既往個体から
の血清と特異的に結合することが可能なコード化エピト
ープについてスクリーニングする。Ｖ．Ｈｕｎｙｈら，
Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒ
ｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎ
ｇｌａｎｄ，ｐｐ．４９−７８（１９８５）を参照され
たい。約１０6〜１０7個のファージをスクリーニングし
て陽性ファージを同定、精製後、ＨＧＢＶ物質に先に感
染した各個体からの血清と結合する特異性を試験する。
下記基準に合致する患者に由来し且つこれらの基準に合
致しない患者には存在しない血清又は血漿と選択的に結
合するファージがその後の試験に好適である。オーバー
ラップする核酸配列を単離する方法を使用することによ
り、付加的な上流及び下流ＨＧＢＶ配列を含むクローン
が得られる。単離クローン内でコードされるＨＧＢＶ核
酸配列のヌクレオチド配列を分析し、複合配列が１つの
長い連続ＯＲＦを含むか否かを決定する。
【０１０７】本明細書に記載するようなＨＧＢＶ配列か
ら回収される配列（及びその相補体）及びその配列又は
任意部分は、合成法を使用して調製してもよいし、本明
細書に記載すると同様の方法を使用して合成法を部分配
列の回収と組み合わせることにより調製してもよい。こ
の記載は、完全ＨＧＢＶゲノムに対応するゲノム又はｃ
ＤＮＡ配列を単離することが可能な方法に関する。しか
しながら、これらの配列を単離するための他の方法も当
業者に自明であり、本発明の範囲内であるとみなされ
る。
【０１０８】菌株寄託 ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリーからの複製株（クローン
２、４、１０、１６、１８、２３及び５０）はブダペス
ト条約に基づき１９９４年２月１０日付けで１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に所在のＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに寄託し、寄託日から３０年間、最新の試料分譲請
求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれ
か最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記
載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎ
ず、本明細書中の教示に鑑みて本発明を実施するために
必要ではない。全寄託材料中のＨＧＢＶ ｃＤＮＡ配列
は参考資料として本明細書の一部とする。プラスミドは
以下のＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号を付託された。クロー
ン２はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５５６、クローン
４はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５５７、クローン１
０はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５５８、クローン１
６はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５５９、クローン１
８はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５６０、クローン２
３はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５６１、クローン５
０はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５６２を付与され
た。
【０１０９】ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリーからの複製
株（クローン１１、１３、４８及び１１９）はブダペス
ト条約に基づき１９９４年４月２９日付けで１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に所在のＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに寄託し、寄託日から３０年間、最新の試料分譲請
求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれ
か最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記
載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎ
ず、本明細書中の教示に鑑みて本発明を実施するために
必要ではない。全寄託材料中のＨＧＢＶ ｃＤＮＡ配列
は参考資料として本明細書の一部とする。プラスミドは
以下のＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号を付託された。クロー
ン１１はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６１３、クロー
ン１３はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６１１、クロー
ン４８はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６１０、クロー
ン１１９はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６１２を付与
された。
【０１１０】ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリーからの付加
的株（クローン４−Ｂ１．１、６６−３Ａ１．４９、７
０−３Ａ１．３７及び７８−１Ｃ１．１７）はブダペス
ト条約に基づき１９９４年７月２８日付けで１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に所在のＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに寄託し、寄託日から３０年間、最新の試料分譲請
求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれ
か最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記
載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎ
ず、明細書中の教示に鑑みて本発明を実施するために必
要ではない。全寄託材料中のＨＧＢＶ ｃＤＮＡ配列は
参考資料として本明細書の一部とする。プラスミドは以
下のＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号を付与された。クローン
４−Ｂ１．１はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６６６、
クローン６６−３Ａ１．４９はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番
号６９６６５、クローン７０−３Ａ１．３７はＡ．Ｔ．
Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６６４、クローン７８−１Ｃ１．
１７はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６６３を付与され
た。
【０１１１】クローンｐＨＧＢＶ−Ｃクローン＃１はブ
ダペスト条約に基づき１９９４年１１月８日付けで１２
３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に所在のＡｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎに寄託し、寄託日から３０年間、最新の試料分
譲請求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのい
ずれか最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書
に記載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過
ぎず、本明細書上の教示に鑑みて本発明を実施するため
に必要ではない。ｐＨＧＢＶ−Ｃクローン＃１はＡ．
Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９７１１を付与された。全寄託
材料中のＨＧＢＶ ｃＤＮＡ配列は参考資料として本明
細書の一部とする。
【０１１２】ウイルスポリペプチド及びフラグメントの
調製 核酸配列を入手できることにより、いずれかの鎖でコー
ドされるポリペプチドの抗原活性領域をコードする発現
ベクターを構築することができる。これらの抗原活性領
域は、例えばポリヌクレオチド結合タンパク質、ポリヌ
クレオチドポリメラーゼ、及びウイルス粒子の複製及び
／又はアセンブリに必要な他のウイルスタンパク質を含
むウイルスの非構造領域以外に、例えばエンベロープ
（コート）又はコア抗原を含むウイルスの構造領域から
誘導され得る。所望のポリペプチドをコードするフラグ
メントは慣用制限消化又は合成法によりゲノム又はｃＤ
ＮＡクローンから得られ、例えばβ−ガラクトシダーゼ
（β−ｇａｌ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）又はＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ（ＣＫＳ）等の融
合配列の部分を含み得るベクターに連結される。ＳＯＤ
の融合配列を含むポリペプチドの製造に有用な方法及び
ベクターは１９８６年１０月１日付け公開ＥＰＯ第０１
９６０５６号に記載されており、ＣＫＳの融合配列を含
むポリペプチドの製造に有用な方法及びベクターは１９
８９年９月１３日付け公開ＥＰＯ第０３３１９６１号に
記載されている。いずれかの方向の鎖においてオープン
リーディングフレームを含む核酸配列の任意の所望部分
は成熟又は融合タンパク質等の組換えタンパクとして得
られ、あるいはＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡでコードさ
れるポリペプチドを化学的合成により提供することもで
きる。
【０１１３】融合又は成熟形態のいずれかに関係なく、
また分泌を可能にするシグナル配列を含むか否かに関係
なく、所望のポリペプチドをコードする核酸配列を任意
の適当な宿主に適切な発現ベクターに連結することがで
きる。当該技術分野では真核及び原核両者の宿主系を使
用して組換えタンパク質を形成することができ、本明細
書にはこれらの宿主のいくつかを挙げる。次に溶解細胞
又は培地からポリペプチドを単離し、所期用途に必要な
程度まで精製する。精製は当業者に公知の方法により実
施することができ、特に塩析、イオン交換樹脂クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心
分離等を使用することができる。このようなポリペプチ
ドは診断薬として又は受動的免疫療法に使用することが
できる。更に、これらのポリペプチドに対する抗体は、
ＨＧＢＶ粒子を単離及び同定するために有用である。Ｈ
ＧＢＶ抗原はＨＧＢＶ粒子からも単離することができ
る。これらウイルス粒子は組織培養物又は感染個体中の
ＨＧＢＶ感染細胞中で増殖させることができる。
【０１１４】抗原性ポリペプチドの調製及び固相との結
合 ポリペプチドの抗原性領域又はフラグメントは比較的小
さく、通常約８〜１０アミノ酸長又はそれ以下である。
５アミノ酸程度のフラグメントでも抗原性領域を特徴付
けることができる。これらのセグメントはＨＧＢＶ抗原
の領域に対応し得る。ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡ配列
を基本として使用することにより、ＨＧＢＶポリペプチ
ドの短いセグメントをコードする核酸配列を融合タンパ
ク質又は単離ポリペプチドとして組換えにより発現させ
ることができる。これらの短いアミノ酸配列は、化学的
合成によっても得られる。化学的に合成された小さいポ
リペプチドは、得られた合成ポリペプチドが適正なエピ
トープを提供するように適正に配置されており且つ抗原
性となるには小さ過ぎる場合に適切なキャリヤー分子に
結合され得る。結合方法は当業者に公知であり、非限定
的な例としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピ
リジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスクシン
イミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサ
ン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を使用する。シ
ステイン残基を加えることにより、スルフヒドリル基を
もたないポリペプチドを修飾することができる。これら
の物質は、該物質と一方のタンパク質上のペプチドシス
テイン残基の間にジスルフィド結合を生成し、他方のタ
ンパク質中のリジン上のε−アミノ又は他の遊離アミノ
基を介してアミド結合を生成する。このような種々のジ
スルフィド／アミド形成物質は公知である。他の２官能
カップリング剤はジスルフィド結合でなくチオエステル
を形成する。これらのチオエーテル形成剤の多くは市販
されており、当業者に公知である。そのカルボキシ基
は、スクシンイミド又は１−ヒドロキシ−２−ニトロ−
４−スルホン酸ナトリウム塩と結合させることにより活
性化することができる。宿主に有害な抗体の産生をそれ
自体誘導しないものであれば、任意のキャリヤーを使用
することができる。適切なキャリヤーとしては、特にタ
ンパク質、多糖類（例えばラテックス官能化セファロー
ス、アガロース、セルロース、セルロースビーズ）、ポ
リマーアミノ酸（例えばポリグルタミン酸、ポリリシ
ン、アミノ酸コポリマー）及び不活性ウイルス粒子を挙
げることができる。タンパク質基質の例としては、血清
アルブミン、アオガイヘモシアニン、イムノグロブリン
分子、チログロブリン、オボアルブミン、破傷風毒素及
び当業者に公知の他のタンパク質を挙げることができ
る。
【０１１５】ＨＧＢＶエピトープを含むハイブリッド粒
子免疫原の調製 ＨＧＢＶエピトープの免疫原性は、粒子形成タンパク質
（例えばＨＢＶ表面抗原にあるような）融合又は結合し
た哺乳動物又は酵母系で調製することにより強化するこ
ともできる。粒子形成タンパク質をコードする配列にＨ
ＧＢＶエピトープを直接結合した構築物は、ＨＧＢＶエ
ピトープに対して免疫原性のハイブリッドを生成する。
更に、調製されるＨＧＢＶに対して特異的なエピトープ
を含む全てのベクターは、異なる程度の免疫原性を有す
る。ＨＧＢＶ配列を含む粒子形成タンパク質から構築さ
れる粒子はＨＧＢＶ及びＨＢＶに対して免疫原性があ
る。
【０１１６】Ｂ型肝炎表面抗原はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ及び哺乳動物細胞中で形成されて粒子に結合するこ
とが確認され、これらの粒子の形成はモノマーサブユニ
ットの免疫原性を強化することが報告されている。Ｐ．
Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，Ｎａｔｕｒｅ ２９８：３３
４（１９８２）； Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，Ｉ．
Ｍｉｌｌｍａｎら編，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ，Ｐｌｅ
ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２２５−２３６（１９８
４）。構築物はＨＢｓＡｇの免疫優性エピトープを含み
得る。このような構築物は酵母で発現可能であることが
報告されており、酵母発現のための異種ウイルス配列を
含むハイブリッドが開示されている。例えばＥＰＯ第１
７４，４４４号及びＥＰＯ第１７４，２６１号を参照さ
れたい。これらの構築物はチャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞で発現され得ることも
報告されている。Ｍｉｃｈｅｌｌｅら，Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｖｉｒａｌ
Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，１９８４を参照されたい。ＨＧ
ＢＶにおいては粒子形成タンパク質をコードする配列の
部分を、ＨＧＢＶエピトープをコードするコドンで置換
することができる。この置換では、酵母又は哺乳動物中
で免疫原性粒子を形成するための単位の凝集を媒介する
ために不要な領域を削除し、こうしてＨＧＢＶエピトー
プとの競合から付加的なＨＧＢＶ抗原部位を排除するこ
とができる。
【０１１７】ワクチン製造 ワクチンは、ＨＧＢＶ核酸配列又は該核酸配列に対応す
るＨＧＢＶゲノムに由来する１種以上の免疫原性ポリペ
プチド又は核酸から製造することができる。ワクチンは
ＨＧＢＶのエピトープを含む組換えポリペプチドを含み
得る。これらのポリペプチドは細菌、酵母又は哺乳動物
細胞中で発現させてもよいし、あるいはウイルス調製物
から単離してもよい。種々の構造タンパク質が防御抗Ｈ
ＧＢＶ抗体を誘導するＨＧＢＶのエピトープを含み得る
ことも予想される。こうして、これらのワクチンの製造
時には合成ペプチドも使用することができる。従って、
ＨＧＢＶの少なくとも１個のエピトープを含むポリペプ
チドをＨＧＢＶワクチン中で単独又は組み合わせて使用
することができる。更に、非構造タンパク質及び構造タ
ンパク質は、中和抗体を産生しないとしても、ウイルス
病原性に対する防御を提供し得ると予想される。
【０１１８】上記に鑑み、ＨＧＢＶに対する多価抗体は
１種以上の構造タンパク質及び／又は１種以上の非構造
タンパク質を含み得る。これらのワクチンは例えば組換
えＨＧＢＶポリペプチド及び／又はウイルス粒子から単
離されたポリペプチド及び／又は合成ペプチドから構成
され得る。これらの免疫原エピトープは組み合わせて使
用することができ、即ち組換えタンパク質、合成ペプチ
ド及び／又はウイルス粒子から単離されたポリペプチド
の混合物として使用することができ、これらのワクチン
は同一又は異なる時刻に投与することができる。更に、
ワクチンに不活化ＨＧＢＶを使用することも可能であり
得る。このような不活化はウイルス溶解物を調製しても
よいし、肝炎様ウイルスの不活化を生じることが当業者
に知られている他の手段、例えば有機溶媒もしくは界面
活性剤による処理、又はホルマリン処理により実施して
もよい。本発明では弱毒ＨＧＢＶ株調製物も開示する。
ＨＧＢＶにおけるタンパク質には他の公知ウイルスと交
差反応できるものもあり、従って、ＨＧＢＶと他のウイ
ルスとの間に共有エピトープが存在し、これらの病原物
質により生じる疾患の１種以上に対する防御抗体をもた
らすと予想される。この確信に基づいて多重目的ワクチ
ンを設計できることが予想される。
【０１１９】少なくとも１種の免疫原性ペプチドを活性
成分として含むワクチンの調製は当業者に公知である。
典型的には、このようなワクチンは溶液又は懸濁液とし
ての注射剤として調製される。注射前に液体に溶解又は
懸濁するのに適切な固体形態も製造可能である。調製物
を乳化してもよいし、タンパク質をリポソームに封入し
てもよい。活性免疫原性成分は多くの場合には活性成分
と適合可能な医薬的に許容可能な賦形剤と混合する。適
切な賦形剤の非限定的な例としては、水、食塩水、デキ
ストロース、グリセロール、エタノール等が挙げられ、
種々の量のこれらの賦形剤を組み合わせて使用してもよ
い。ワクチンは更に、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤及び
／又はワクチンの効力を強化するアジュバント等の少量
の補助物質も含有し得る。例えば、このようなアジュバ
ントとしては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ム
ラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ
−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニ
ル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６８７、別称ｎ
ｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル
−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’，
２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキ
シホスホリルオキシ）エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５
Ａ、別称ＭＴＰ−ＰＥ）及びＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ
＋ＣＷＳ）の２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０（登録
商標）エマルジョンが挙げられる。アジュバントの効力
は、同様に種々のアジュバントから構成されるワクチン
中のポリペプチドを投与した結果生じたＨＧＢＶ抗原配
列を含む免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定
することにより決定することができる。
【０１２０】ワクチンは通常、静脈内又は筋肉内注射に
より投与される。他の投与方法に適切な別の製剤には座
薬があり、場合によっては経口製剤でもよい。座薬の場
合、慣用バインダー及びキャリヤーの非限定的な例とし
てはポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが挙
げられる。このような座薬は約０．５％〜約１０％、好
ましくは約１％〜約２％の活性成分を含有する混合物か
ら形成することができる。経口製剤は例えば医薬グレー
ドのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マ
グネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸
マグネシウム等のような一般に使用される賦形剤を含有
する。これらの組成物は溶液、懸濁液、タブレット、ピ
ル、カプセル、徐放製剤又は散剤の形態をとることでが
き、約１０％〜約９５％、好ましくは約２５％〜約７０
％の活性成分を含有し得る。
【０１２１】ワクチン中で使用するタンパク質は中性又
は塩形態としてワクチンに配合され得る。医薬的に許容
可能な塩としては、（ペプチドの遊離アミノ基と共に形
成され且つ）無機酸（例えば塩酸又はリン酸）又は有機
酸（酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸）と共に形成され
る酸付加塩や、当業者に公知の他の塩を使用することが
できる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は無機
塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸
化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化鉄（III）
等）及び有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメ
チルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジ
ン、プロカイン）及び当業者に公知の他の塩基から誘導
され得る。
【０１２２】ワクチンは剤形に適合可能な方法で且つ予
防及び／又は治療上有効な量を投与される。投与量は一
般に１回に抗原約５μｇ〜約２５０μｇであり、被投与
患者、患者の免疫系の抗体合成能力及び所望の防御度に
依存する。投与するために必要な活性成分の厳密な量は
処方医の判断にも依存し、患者毎に異なる。ワクチンは
単一投与スケジュールで投与してもよいし、多重投与ス
ケジュールで投与してもよい。多重投与では、１〜１０
回に分けて一次ワクチン接種過程を実施した後、免疫応
答を維持及び／又は強化するために必要な期間後、例え
ば１〜４カ月後に二次投与を実施し、個体が必要とする
場合には更に数カ月後にも投与する。投与計画は少なく
とも一部には個体の必要により決定され、処方医の判断
による。免疫原性ＨＧＢＶ抗原を含有するワクチンは他
の免疫調節剤、例えば免疫グロブリンと併用投与し得る
ことが予想される。
【０１２３】ＨＧＢＶエピトープに対する抗体の製造 本明細書中に記載するように調製した免疫原性ペプチド
を使用してポリクローナル又はモノクローナル抗体を製
造する。ポリクローナル抗体を製造する際には、選択し
た哺乳動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を
少なくとも１種のＨＧＢＶエピトープを有する免疫原性
ポリペプチドで免疫感作する。免疫感作した動物からの
血清を適当なインキュベーション時間後に収集し、公知
手順に従って処理する。ＨＧＢＶエピトープに対するポ
リクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗
体を含有する場合には、例えばイムノアフィニティーク
ロマトグラフィーによりポリクローナル抗体を精製する
ことができる。ポリクローナル抗体を製造及び処理する
ための方法は当業者に公知であり、特にＭａｙｅｒとＷ
ａｌｋｅｒ編，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｌｏｎｄｏｎ （１９８７）に記載されている。ポリク
ローナル抗体は先にＨＧＢＶに感染した哺乳動物からも
得られる。アフィニティークロマトグラフィーを使用し
てＨＧＢＶに感染した個体の血清からＨＧＢＶエピトー
プに対する抗体を精製するための方法の１例をここに記
載する。
【０１２４】ＨＧＢＶエピトープに対するモノクローナ
ル抗体も当業者により製造することができる。このよう
な抗体を製造するための一般方法は周知であり、例えば
ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５
６：４９４（１９７５）に記載されており、Ｊ．Ｇ．
Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ編，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｃｏ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ
（１９８２）に考察されており、Ｌ．Ｔ．Ｍｉｍｍｓ
ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６：６０４−６１９（１９９
０）により教示されている。不死化抗体産生細胞系は細
胞融合により作成することができ、オンコジーンＤＮＡ
によるＢリンパ球の直接形質転換又はエプスタイン−バ
ールウイルスによるトランスフェクション等の他の方法
により作成することもできる。同様にＭ．Ｓｃｈｒｅｉ
ｅｒら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
Ｓｃｏｐｅｓ （１９８０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄＰｒ
ａｃｔｉｃｅ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）； Ｈａｍｍｅｒｌ
ｉｎｇら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （１９８０）を参照された
い。モノクローナル抗体の使用及び技術の例は米国特許
出願第７４８，２９２号、７４８，５６３号、６１０，
１７５号、６４８，４７３号、６４８，４７７号及び６
４８，４７５号に開示されている。
【０１２５】こうして開発されたＨＧＢＶエピトープに
対するモノクローナル及びポリクローナル抗体は診断及
び予後用途に有用であり、更に中和抗体は受動的免疫療
法で有用である。モノクローナル抗体は特に抗イディオ
タイプ抗体を製造するために使用することができる。こ
れらの抗イディオタイプ抗体は防御が所望される感染物
質の抗原の「内部像」を有するイムノグロブリンであ
る。例えば、Ａ．Ｎｉｓｏｎｏｆｆら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．２１：３９７−４
０６（１９８１）及びＤｒｅｅｓｍａｎら，Ｊ．Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５１：７６１（１９８５）を参照さ
れたい。このようなイディオタイプ抗体を誘導するため
の方法は当業者に公知であり、例えばＧｒｙｃｈら，Ｎ
ａｔｕｒｅ３１６：７４（１９８５）； ＭａｃＮａｍ
ａｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：１３２５（１９８
４）；及びＵｙｔｄｅｈａａｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３４：１２２５（１９８５）に例示されている。
これらの抗イディオタイプ抗体はＨＧＢＶ感染の治療及
びＨＧＢＶ抗原の免疫原性領域の解明にも有用であり得
る。
【０１２６】診断オリゴヌクレオチドブローブ及びキッ
ト 単離したＨＧＢＶ核酸配列の所定部分を基材として用い
て、ＨＧＢＶゲノムとハイブリダイズし、ウイルス剤の
同定、ウイルスゲノムの更なる特性分析、及び羅患した
個体でのウイルス検出に有用である約８ヌクレオチド以
上のオリゴマーを切り出し又は合成により産生すること
ができる。ＨＧＢＶポリヌクレオチド用の天然又は誘導
プローブは、ハイブリダイゼーションによる単一ウイル
ス配列の検出を可能とする長さである。６〜８ヌクレオ
チドが処理可能な長さであり得るが、１０〜１２ヌクレ
オチドの配列が好ましく、約２０ヌクレオチドの配列が
最も好ましいものであり得る。これらの配列が異質性に
欠けた領域から誘導されることが好ましい。これらのプ
ローブは、自動化オリゴヌクレオチド合成方法を含む常
用の標準的な方法を用いて製造することができる。ＨＧ
ＢＶゲノムの任意の単一部分の相補体は満足すべきもの
であろう。完全相補性は、断片長さが増せば不要であり
得るが、プローブとして使用するには望ましい。
【０１２７】診断試薬として使用するときには、血液又
は血清のような分析すべき試験試料を処理してもよく、
例えば試料内に含まれる核酸を抽出する。試料から得ら
れた核酸をゲル電気泳動又は他のサイズ分離技術に付し
てもよいし、核酸試料をサイズ分離せずにドットブロッ
トしてもよい。次いで、プローブを標識する。ラベルを
プローブに付着させるための適切なラベル及び方法は当
業界では公知であり、ニックトランスレーション又はキ
ナーゼ反応（kinasing）により取り込まれる放射性ラベ
ル、ビオチン、蛍光及び化学発光プローブが含まれる
が、これらに限定はされない。これらのラベルの例は多
数本明細書に開示されている。次いで、試料から抽出し
た核酸を、適切な厳密度のハイブリダイゼーション条件
下にて標識プローブで処理する。
【０１２８】プローブをＨＧＢＶゲノムに対して完全に
相補的にすることができる。従って、通常は偽陽性を回
避するために厳密度の高い条件が望ましい。しかしなが
ら、厳密度の高い条件は、プローブが異質性に欠けたＨ
ＧＢＶゲノムの領域に相補的である場合にのみ使用すべ
きである。ハイブリダイゼーションの厳密度は、洗浄手
順中の幾つかの要素（例えば温度、イオン強度、時間及
びホルムアミド濃度）により決定される。例えばＪ．Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ（上掲）を参照されたい。ハイブリダイ
ゼーションは幾つかの様々な技術により実施することが
できる。増幅は、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｑ−βレプリカー
ゼ、ＮＡＳＢＡ等により実施することができる。
【０１２９】ＨＧＢＶゲノム配列は、例えば約１０2〜
１０3個の配列／ｍｌの比較的低レベルで、感染した個
体の血清中に存在し得ると考えられる。このレベルで
は、ハイブリダイゼーションアッセイで、リガーゼ連鎖
反応又はポリメラーゼ連鎖反応のような増幅技術を使用
する必要があり得る。このような技術は当業界では公知
である。例えば、“バイオブリッジ”系は末端デオキシ
ヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、非改変３’
−ポリ−ｄＴ−テールを核酸プローブに付加する（Ｅｎ
ｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．）。ポリ−ｄＴ−テ
ールを有するプローブを標的ヌクレオチド配列にハイブ
リダイズし、次いでビオチン改変ポリ−Ａにハイブリダ
イズする。更には、被分析物質を、酵素標識オリゴヌク
レオチドと相補的な一本鎖ＤＮＡプローブにアニーリン
グし、得られたテール付き二本鎖を酵素標識オリゴヌク
レオチドにハイブリダイズするＤＮＡハイブリダイゼー
ションアッセイがヨーロッパ特許第１２４２２１号に記
載されている。ヨーロッパ特許第２０４５１０号は、被
分析物質ＤＮＡを、テール（例えばポリ−ｄＴ−テー
ル）を有するプローブ、及びプローブのテールにハイブ
リダイズする配列（例えばポリ−Ａ配列）を有し、複数
の標識鎖と結合し得るアンプリファイア鎖と接触させる
ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを記載してい
る。この技術はまず、血清中の標的ＨＧＢＶ配列を約１
０6個の配列／ｍｌに増幅することからなり得る。これ
は、Ｓａｉｋｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３（１
９８６）に記載の方法に従って実施され得る。次いで、
増幅した配列を、当業界では公知のようなハイブリダイ
ゼーションアッセイを用いて検出することができる。標
識され得るプローブ核酸配列を含む診断キットにプロー
ブをパッケージすることができる。あるいは、プローブ
を標識せずに、標識用成分をキットに含ませてもよい。
キットは更に、特定のハイブリダイゼーションプロトコ
ルに必要な又は望ましい他の適切にパッケージされた試
薬や材料、例えばアッセイ実施のための標準物や指示書
を含み得る。
【０１３０】本発明で使用できる他の公知の増幅方法に
は、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８（１
９９０）に教示され、Ｎａｔｕｒｅ：３５０（Ｎｏ．６
３１３）：９１−９２（１９９１）でも議論されている
いわゆる“ＮＡＳＢＡ”又は“３ＳＲ”技術や、Ｑ−β
レプリカーゼが含まれるが、これらに限定はされない。
【０１３１】本明細書に記載する試薬を用いて、蛍光イ
ンシトウハイブリダイゼーション（“ＦＩＳＨ”）を実
施することもできる。インシトウハイブリダイゼーショ
ンは、核酸ハイブリダイゼーション法により形態の損な
われていない組織、細胞又は染色体を採取して、特殊な
遺伝情報の存在や、個体細胞内での前記情報の特定位置
を実証することからなる。これは細胞の均質化及び標的
配列の抽出を必要としないので、細胞集団中での配列の
正確な位置や分布が判明する。インシトウハイブリダイ
ゼーションは、細胞中に集中して含まれる問題の配列を
同定し得、更には該配列を含む異質細胞集団中の細胞の
タイプやフラクションを同定し得る。ＤＮＡ及びＲＮＡ
を同一のアッセイ試薬で検出することができる。ＰＮＡ
をＦＩＳＨ法で使用して、増幅せずに標的を検出するこ
とができる。シグナルの増加が望ましければ、多数の発
蛍光団を使用してシグナルを増し、方法の感度を高める
ことができる。多数のオリゴヌクレオチドを用いる一工
程法又は従来の多工程法を含む様々なＦＩＳＨ法が知ら
れている。これらのタイプの方法を様々な手段（例えば
フローサイトメトリー及び画像分析）により自動化でき
ることは本発明の範囲内である。
【０１３２】イムノアッセイ及び診断キット ＨＧＢＶ抗体及びその複合体を含む血清と免疫反応する
ポリペプチド、及びこれらのポリペプチド中のＨＧＢＶ
特異エピトープに対する抗体は共に、生物試験試料中で
のＨＧＢＶ抗体の存在又はウイルス及び／もしくはウイ
ルス抗原の存在を検出するイムノアッセイで有用であ
る。これらのイムノアッセイの設計は変形を受けること
が多く、これらの変形は当業界では公知である。これら
の変形は本明細書に記載する。イムノアッセイは、１個
のウイルス抗原（例えばＨＧＢＶ核酸配列を含むクロー
ン、又はこれらのクローン中のＨＧＢＶ核酸配列に由来
する複合核酸配列、又はこれらのクローン中の核酸配列
のソースであるＨＧＢＶゲノムから誘導されるポリペプ
チド）を使用し得る。あるいは、このイムノアッセイ
は、これらのソースから誘導されるウイルス抗原を組み
合わせて使用してもよい。イムノアッセイは例えば、同
一ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体、又は異な
るウイルス抗原に対するポリクローナル抗体を使用し得
る。アッセイには、競合アッセイ、直接反応アッセイ又
はサンドイッチ型アッセイに基づくものが含まれるが、
これらに限定はされない。アッセイは、固相を使用して
もよいし、免疫沈殿又は固相を使用しない他の任意の方
法で実施してもよい。ラベルをシグナル生成化合物とし
て使用するアッセイや、これらのラベルの例は本明細書
に記載する。シグナルは更に、係属中の米国特許出願第
６０８，８４９号、第０７０，６４７号、第４１８，９
８１号、及び第６８７，７８５号に記載のビオチン及び
アビジン、酵素ラベル又はビオチン抗ビオチン系を使用
して増幅してもよい。ＨＧＢＶの免疫優性領域に由来す
るエピトープを含む組換えポリペプチドは、感染個体の
生物試験試料でウイルス抗体を検出するのに有用であり
得る。抗体は、急性感染と非急性感染とを識別するのに
有用であり得るとも考えられる。適切な材料（例えばＨ
ＧＢＶエピトープ又はＨＧＢＶエピトープに対する抗体
を含む本発明のポリペプチド）を、アッセイの実施に必
要な他の試薬や材料、及び適切なアッセイ指示書と一緒
に適切な容器にパッケージングすることにより、適切な
試薬を含んだ免疫診断に適したキットを製造する。
【０１３３】本明細書に詳述する組換えタンパク質を使
用するアッセイ方式を設計することができる。本発明者
らはＣＫＳタンパク質を記載しているが、本発明でスー
パーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）等のような他の発
現系を使用して、様々な方法で使用できる融合タンパク
質、例えばイムノアッセイの抗原、抗体産生用免疫原等
を産生できるとも考えられる。ヒト試験試料中の特異被
分析物質（例えばウイルスのような感染物質）に対する
抗体の存在を検出するためのアッセイ方式では、ヒト試
験試料を、少なくとも１種の組換えタンパク質（ポリペ
プチド）でコーティングした固相と接触させてインキュ
ベートする。試験試料中に抗体が存在すれば、この抗体
は抗原ポリペプチドと複合体を形成して、固相に固定化
する。複合体の形成後、固相を洗浄して未結合の物質や
試薬を除去する。複合体を指示試薬と反応させて、第２
の複合体形成のための時間及び条件下でインキュベート
する。生成したシグナルを検出して、試験試料中でのＣ
ＫＳ組換えポリペプチドに対する抗体の存在を調べる。
カットオフ値より高いシグナル生成は、試験試料中に被
分析物質に対する抗体が存在することを示す。酵素のよ
うな多数の指示試薬を用いると、存在する抗体の量は生
成するシグナルに比例する。試験試料の種類によって
は、試験試料を適切な緩衝試薬で希釈してもよいし、濃
縮してもよいし、操作せずに（“ニート”）固相と接触
させてもよい。例えば通常は、予め希釈した血清もしく
は血漿試料を試験するか又は尿のような試料を濃縮し
て、抗体の存在及び／又は存在する抗体の量を調べるこ
とが好ましい。
【０１３４】更には、研究中の感染物質のウイルスゲノ
ムの様々な抗原エピトープに対するＣＫＳ融合タンパク
質を使用して特異感染物質に対する抗体の存在を試験す
る前述のアッセイ方式では、２種以上の組換えタンパク
質を使用することができる。従って、特異ウイルス抗原
領域内のエピトープと、ウイルスゲノム由来の他の抗原
領域に由来するエピトープとを含んでいる組換えポリペ
プチドを使用して、１種のエピトープに由来するポリペ
プチドを用いるよりも感度が増し、恐らくは特異性の高
いアッセイを提供することが好ましいであろう。このよ
うなアッセイは、確認（confirmatory）アッセイとして
使用することができる。この特定のアッセイ方式では、
既知量の試験試料を、組換えタンパク質／抗体複合体を
形成するのに十分な時間及び条件下で少なくとも１種の
組換えタンパク質でコーティングされた既知量の少なく
とも１種の固相と接触させる。反応を生起するための時
間、適切な条件下で、複合体を既知量の適切な指示試薬
と接触させる。生成したシグナルを陰性試験試料と比較
して、試験試料中での被分析物質に対する抗体の存在を
調べる。微粒子のようなある種の固相を使用するときに
は、アッセイで使用される各組換えタンパク質が、個々
の微粒子や、種々の被覆微粒子を合わせて製造される前
記微粒子の混合物に付着して、各アッセイのために最適
化され得る。
【０１３５】前述のアッセイ方式の変形には、各被分析
物質に対する抗体の存在を検出するための同一又は異な
る固相に付着した種々の被分析物質のＣＫＳ組換えタン
パク質（例えば同一又は異なる固相上にコーティングさ
れた１種の感染物質のある抗原領域に特異的なＣＫＳ組
換えタンパク質）を、異なる感染物質のある抗原領域に
特異的なＣＫＳ組換えタンパク質と共に取り込んで、一
方（又は両方）の感染物質の存在を検出することが挙げ
られる。
【０１３６】他のアッセイ方式としては、抗原エピトー
プを含むＣＫＳ組換えタンパク質が、中和アッセイのよ
うな競合アッセイで有用である。中和アッセイを実施す
るには、ウイルスのような感染物質の抗原領域のエピト
ープを示す組換えポリペプチドを可溶化し、試料希釈液
と混合して、０．５〜５０．０μｇ／ｍｌの最終濃度に
する。所要により希釈した既知量の試験試料（好ましく
は１０μｌ）を反応ウェルに添加し、次いで組換えポリ
ペプチドを含む試験希釈液４００μｌを添加する。所望
とあれば、混合物を約１５分〜２時間プレインキュベー
トしてもよい。次いで、本明細書に記載のＣＫＳ組換え
タンパク質でコーティングした固相を反応ウェルに加
え、約４０℃で１時間インキュベートする。洗浄後、既
知量の指示試薬、例えば結合希釈液中のペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ ２００μｌを添加し、４０℃
で１時間インキュベートする。洗浄後、前述のような酵
素結合体を使用するときには、酵素基質（例えばＯＰＤ
基質）を添加して、室温で３０分間インキュベートす
る。１Ｎ硫酸のような停止剤を反応ウェルに添加して、
反応を停止させる。４９２ｎｍで吸光度を読み取る。特
異ポリペプチドに対する抗体を含む試験試料では、溶液
中でのペプチドと前記抗体との競合結合によるシグナル
生成は減少する。競合結合のパーセンテージは、組換え
ポリペプチドの存在下での試料の吸光度値を、同一希釈
度の組換えポリペプチドの不在下でアッセイした試料の
吸光度値と比較して計算することができる。従って、組
換えタンパク質の存在下の試料と、組換えタンパク質の
不在下の試料との間で生じるシグナルの差は、抗体の存
在又は不在を調べるために使用する尺度となる。
【０１３７】他のアッセイ方式としは、イムノドットブ
ロットアッセイ系で組換えタンパク質を使用することが
できる。イムノドットブロットアッセイ系は、ニトロセ
ルロース固相担体上に並置された精製組換えポリペプチ
ドのパネルを使用する。製造した固相担体を試料と接触
させ、組換えタンパク質（他の特異結合要素）に対する
特異抗体（特異結合要素）を捕捉して、特異結合要素対
を形成する。捕捉した抗体は、指示試薬と反応させて検
出する。１９８８年８月２日出願の米国特許出願第０７
／２２７，４０８号に記載されている機器内でレフレク
タンスオプチックスアセンブリーを用いて、結合体特異
反応を定量することが好ましい。関連米国特許出願第０
７／２２７，５８６号及び第０７／２２７，５９０号
（共に１９８８年８月２日出願）は更に、本出願人によ
るものであり、参考として本明細書に組み入れる米国特
許第５，０７５，０７７号（１９８８年８月２日出願の
米国特許出願第０７／２２７，２７２号）と同様に、イ
ムノドットアッセイを実施するのに有用な特定方法や装
置を記載している。簡潔に言えば、ニトロセルロースベ
ースの試験カートリッジを多数の抗原ポリペプチドで処
理する。各ポリペプチドは、試験カートリッジ上の特異
反応ゾーン内に含まれている。全ての抗原ポリペプチド
がニトロセルロース上に置かれた後に、ニトロセルロー
ス上の過剰結合部位を阻止する。次いで、試験カートリ
ッジを試験試料と接触させて、試験試料が適切な抗体を
含めば各反応ゾーンの各抗原ポリペプチドが反応するよ
うにする。反応後、試験カートリッジを洗浄し、よく知
られた適切な試薬を用いて、任意の抗原抗体反応を同定
する。本明細書に引用した特許及び特許出願に記載され
ているように、全プロセスは自動化可能である。イムノ
ドットブロットアッセイを実施するための方法及び装置
に関連する前記出願明細書は参考として本明細書に組み
入れる。
【０１３８】試験試料中に被分析物質の特異抗原に対す
る抗体を検出するために後述する第１及び第２の固相担
体を使用するアッセイでＣＫＳ融合タンパク質を使用す
ることができる。このアッセイ方式では、試験試料の第
１のアリコートを、組換えタンパク質／被分析物質抗体
複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、被分析
物質に特異的なＣＫＳ組換えタンパク質でコーティング
された第１の固相担体と接触させる。次いで、複合体
を、組換え抗原に特異的な指示試薬と接触させる。指示
試薬を検出して、試験試料中での組換えタンパク質に対
する抗体の存在を調べる。その後、試験試料の第２のア
リコートを、組換えタンパク質／第２の抗体の複合体を
形成するのに十分な時間及び条件下で、第２の抗体に特
異的なＣＫＳ組換えタンパク質でコーティングされた第
２の固相担体と接触させて、同一被分析物質の異なる抗
原決定基の存在を調べる。複合体を、複合体の抗体に特
異的な第２の指示試薬と接触させる。シグナルを検出し
て、試験試料中での抗体の存在を調べる。一方又は両方
の被分析物質組換えタンパク質に対する抗体の存在は、
試験試料中に抗被分析物質が存在することを示してい
る。固相担体を同時に試験できるとも考えられる。
【０１３９】ハプテンの使用は当業界では公知である。
ＣＫＳ融合タンパク質を用いるアッセイでハプテンを使
用して、アッセイの性能を高めることもできると考えら
れる。
【０１４０】プローブを用いたＨＧＢＶゲノム、ビリオ
ン及びウイルス抗原の更なる特性分析 ＨＧＢＶ核酸配列を使用して、ＨＧＢＶゲノムの配列、
並びにＨＧＢＶ剤の同定及び単離について更なる情報を
得ることができる。従って、この知識は、ＨＧＢＶの特
性（例えばＨＧＢＶゲノムの種類、ウイルス粒子の構
造、及びＨＧＢＶを構成する抗原の種類）の分析に役立
つと考えられる。この情報により、付加的なポリヌクレ
オチドプローブ、ＨＧＢＶゲノムに由来するポリペプチ
ド、及びＨＧＢＶエピトープに対する抗体を得ることが
できる。これらは、ＨＧＢＶにより発病する非Ａ型、非
Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型及び非Ｅ型肝炎の診断及び／又は
治療に有益である。
【０１４１】核酸配列情報は、ＨＧＢＶゲノムの非確定
領域に由来する更なる核酸配列を単離するためのプロー
ブ又はＰＣＲプライマーの設計に有用である。例えば、
８個以上、好ましくは２０個以上のヌクレオチドの配列
を含み、ＨＧＢＶ核酸配列ファミリーの５’末端又は
３’末端に近い領域に由来するＰＣＲプライマー又は標
識プローブを使用して、重複核酸配列をＨＧＢＶゲノム
又はｃＤＮＡライブラリーから単離してもよいし、ウイ
ルス核酸から直接単離してもよい。次いで、ＨＧＢＶ核
酸配列と重複するが、該ＨＧＢＶ核酸配列のソースでは
ないゲノムの領域に由来する配列を更に含んでいる前記
配列を使用して、必ずしもクローン中の核酸配列とは重
複しない他の重複断片を同定するためのプローブを合成
してもよい。ＨＧＢＶゲノムがセグメント化されていて
も共通配列が欠けていれば、ウイルスゲノムに由来する
重複核酸配列の単離技術を使用して、全ウイルスゲノム
の配列を決定することが可能である。あるいは、精製し
たＨＧＢＶ粒子から単離したウイルスゲノムから、ゲノ
ムセグメントの特性分析を行うことができる。ＨＧＢＶ
粒子を精製し、精製手順中に該粒子を検出する方法は本
明細書に記載する。ウイルス粒子からポリヌクレオチド
ゲノムを単離する手順は当業界ではよく知られている。
次いで、単離したゲノムセグメントをクローニングして
配列決定することができる。従って、ＨＧＢＶゲノムを
その種類とは関係なくクローニングして配列決定するこ
とが可能である。
【０１４２】ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡライブラリー
の構築方法は当業界では公知であり、このために有用な
ベクターも当業界では公知である。これらのベクターに
は、λ−ｇｔ１１、λ−ｇｔ１０等が含まれる。単離し
たポリヌクレオチドを適切な制限酵素で消化して、ＨＧ
ＢＶゲノム又はｃＤＮＡ由来のプローブにより検出され
るＨＧＢＶ由来の核酸配列をクローンから単離し、配列
決定してもよい。
【０１４３】これらの重複ＨＧＢＶ核酸配列に由来する
配列情報は、ウイルスゲノム内の相同性エリア及び異質
性エリアを決定するのに有用である。これは、種々のゲ
ノム株及び／又は欠陥粒子集団の存在を示し得る。これ
は、本明細書に記載の技術を使用して、ＨＧＢＶの単離
中に、生物試料中のＨＧＢＶ又はＨＧＢＶ抗原又はＨＧ
ＢＶ核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプロ
ーブの設計にとっても有用である。重複核酸配列を使用
して、ＨＧＢＶゲノム由来のポリペプチドに対する発現
ベクターを産生してもよい。ＨＧＢＶに対してユニーク
であると考えられるエピトープを含む抗原が核酸配列フ
ァミリー内にコードされている。即ち、これらの抗原に
対する抗体は、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＥＶに感
染した個体には存在せず、ＧｅｎＢａｎｋのゲノム配列
と、これらの核酸配列及び前記ソースのポリヌクレオチ
ド配列との間の相同性は小さいと考えられる。従って、
ＨＧＢＶ核酸配列でコードされた抗原に対する抗体を使
用して、感染個体から単離した非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ
型、非Ｄ型及び非Ｅ型粒子を同定してもよい。更には、
これらはＨＧＢＶ物質の単離にも有用である。
【０１４４】ＨＧＢＶ粒子は、例えばサイズ識別をベー
スとする技術（例えば沈降もしくは排除法）、又は密度
をベースとする技術（例えば密度勾配超遠心分離、もし
くはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような物質に
よる沈殿、もしくはアニオンもしくはカチオン交換材料
や、疎水性相互反応により結合する材料、及び親和性カ
ラムのような様々な材料でのクロマトグラフィー）を含
む当業界で公知の任意の方法により、感染個体の血清又
は細胞培養物から単離することができる。単離手順中
に、ＨＧＢＶ核酸配列に由来するプローブを用いて抽出
ゲノムのハイブリダイゼーション分析を行って、又はＨ
ＧＢＶ核酸配列ファミリー内にコードされたＨＧＢＶ抗
原に対する抗体をプローブとして使用するイムノアッセ
イによりＨＧＢＶの存在を検出することができる。抗体
はポリクローナルであっても、モノクローナルであって
もよく、抗体をイムノアッセイで使用する前に精製する
ことが所望され得る。固相に固定化したＨＧＢＶ抗原に
対する前記抗体は、イムノアフィニティークロマトグラ
フィーによるＨＧＢＶの単離に有用である。イムノアフ
ィニティークロマトグラフィー法は当業界では公知であ
り、免疫選択活性を保持するように抗体を固相に固定化
する方法を含んでいる。これらの方法には、吸着及び共
有結合が含まれる。抗体の抗原結合部位が接近可能なま
まであるように、二官能価カップリング剤にスペーサー
基を含ませてもよい。
【０１４５】精製手順中に、ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮ
Ａ配列ファミリー、及び重複ＨＧＢＶ核酸配列に由来す
るポリヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして使
用して、ＨＧＢＶの存在を核酸ハイブリダイゼーション
又はＰＣＲにより検出及び／又は検証してもよい。ウイ
ルス粒子の破壊を引き起こす条件下で、例えばキレート
化剤の存在下で洗剤を使用して画分を処理し、ウイルス
核酸の存在をハイブリダイゼーション技術又はＰＣＲに
より調べる。個体（好ましくはタマリン）に単離したウ
イルス粒子を感染させ、次いで本明細書に記載の非Ａ
型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型及び非Ｅ型肝炎の症状が感
染によるものかどうかを調べることにより、単離した粒
子がＨＧＢＶ感染誘発物質である別の確証が得られ得
る。
【０１４６】次いで、精製した調製物から得た前述のウ
イルス粒子の特性を更に分析することができる。ゲノム
核酸を精製すれば、これを試験して、ＲＮＡｓｅ又はＤ
ＮＡｓｅＩに対する感度を調べることができる。これら
の試験に基づいて、ＨＧＢＶをＲＮＡゲノム又はＤＮＡ
ゲノムとして調べてもよい。当業界で公知の方法によ
り、例えば電子鏡検法による可視化、密度勾配による移
動及び沈降特性により、鎖の数及び環状性又は非環状性
を調べることができる。ＨＧＢＶゲノムのハイブリダイ
ゼーションから、精製核酸の陰性又は陽性鎖数（strand
edness）を調べることができる。更には、ゲノム材料が
ＲＮＡならば、公知の技術（例えば逆転写酵素）により
精製核酸をクローニングして配列決定することができ
る。次いで、ウイルス粒子に由来する核酸を用いて、全
ゲノムをセグメント化の如何を問わず配列決定すること
が可能である。
【０１４７】保存された配列を含むポリペプチドの決定
は、ＨＧＢＶゲノムと結合するプローブ選択に有用であ
り、それはプローブを単離することにつながる。更に
は、保存された配列を、ＨＧＢＶ核酸配列に由来する配
列と一緒に使用して、ゲノム配列を増幅する系で使用す
るプライマーを設計してもよい。更には、ＨＧＢＶの構
造を調べて、その成分を単離してもよい。例えば電子鏡
検法により形態及び寸法を調べることができる。抗原が
主要ウイルス成分中に存在するのか、少量ウイルス成分
中に存在するのかを確かめ、単離した核酸配列内にコー
ドされた特異抗原に対する抗体をプローブとして使用し
て、特異ウイルスポリペプチド抗原［例えばエンベロー
プ（コート）抗原又は内部抗原（例えば核酸結合タンパ
ク質もしくはコア抗原）］や、ポリヌクレオチドポリメ
ラーゼを同定して位置を調べることもできる。この情報
は、診断及び治療用途に有用であり得る。例えば、ワク
チン調製物中に外部抗原を含めることが好ましく、又は
恐らく多価ワクチンは、構造タンパク質をコードするゲ
ノムに由来するポリペプチド、及びゲノムの他の部分に
由来するポリペプチド（例えば非構造ポリペプチド）か
らなり得る。
【０１４８】ＨＧＢＶ複製用の細胞培養系及び動物モデ
ル系 一般に、ＨＧＢＶの培養に適した細胞又は細胞系は、サ
ル腎臓細胞（例えばＭＫ２及びＶＥＲＯ）、ブタ腎臓細
胞系（例えばＰＳ）、ハムスター乳児腎臓細胞系（例え
ばＢＨＫ）、マウスマクロファージ細胞系（例えばＰ３
８８Ｄ１、ＭＫ１及びＭｍ１）、ヒトマクロファージ細
胞系（例えばＵ−９３７）、ヒト末梢血白血球、ヒト付
着単球、肝細胞又は肝細胞系（例えばＨＵＨ７及びＨｅ
ｐＧ２）、胚もしくは胚細胞（例えばニワトリ胚線維芽
細胞）、又は無脊椎動物、好ましくは昆虫に由来する細
胞系（例えばショウジョウバエ細胞系）、更に好ましく
は節足動物に由来する細胞系（例えば蚊細胞系もしくは
マダニ細胞系）を含み得る。一次肝細胞を培養し、次い
でこれにＨＧＢＶを感染させることも可能である。ある
いは、肝細胞培養物を、感染個体（ヒト又はタマリン）
の肝臓から誘導することができる。後者の場合は、ｉｎ
ｖｉｖｏ感染させてｉｎ ｖｉｔｒｏ継代させた細胞
系の例である。更には、種々の不死化方法を使用して、
肝細胞培養物に由来する細胞系を得ることができる。例
えば、（肝細胞集団の増菌前後の）一次肝臓培養物を種
々の細胞と融合して、安定性を維持することができる。
更には、培養物に形質転換ウイルスを感染させるか、形
質転換遺伝子をトランスフェクトして、永続的な又は半
永続的な細胞系を生成してもよい。更には、肝臓培養物
中の細胞を融合して、ＰｅｈＧ２のような確定した細胞
系にしてもよい。細胞融合方法は当業者にはよく知られ
ており、とりわけＰＥＧ及びセンダイウイルスのような
融合剤の使用を含んでいる。
【０１４９】細胞系のＨＧＢＶ感染は、細胞内へのウイ
ルス侵入を可能とする条件下で、細胞をウイルス調製物
と共にインキュベートするような技術により達成され得
ると考えられる。細胞に、単離したウイルスポリヌクレ
オチドをトランスフェクトさせてウイルス調製物を得る
ことも可能であり得る。組織培養細胞をトランスフェク
トする方法は当業界では公知であり、エレクトロポレー
ション及びＤＥＡＥ−デキストラン又はリン酸カルシウ
ムによる沈殿を使用する技術が含まれるが、これに限定
はされない。クローニングしたＨＧＢＶゲノム又はｃＤ
ＮＡによるトラスフェクションでウイルスが複製され、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖する。培養した細胞の他に、ウイ
ルス複製に動物モデル系を使用してもよい。従って、Ｈ
ＧＢＶ複製はチンパンジー、更には例えばマーモセット
及び乳児マウスで生起し得る。
【０１５０】ＨＧＢＶ抗ウイルス剤のスクリーニング ＨＧＢＶ用の細胞培養系及び動物モデル系が利用できる
ことから、ＨＧＢＶ複製を阻害する抗ウイルス剤、特に
好ましくはウイルス複製を阻害しつつ細胞増殖を可能と
する物質のスクリーニングも可能となる。これらのスク
リーニング方法は当業界では公知である。一般に、ウイ
ルス複製を支える細胞培養系で抗ウイルス剤がウイルス
複製の阻止に及ぼす作用、次いで感染性又はウイルス病
原性の阻害、また低レベルの毒性について、抗ウイルス
剤を様々な濃度で動物モデル系にて検査する。本明細書
に記載するＨＧＢＶ抗原及びＨＧＢＶポリヌクレオチド
の検出のための方法及び組成物は、抗ウイルス剤のスク
リーニングに有用である。何故ならば、これらは、抗ウ
イルス剤のウイルス複製への作用の検出については、細
胞プラークアッセイ又はＩＤ50アッセイよりも恐らく高
感度の代替手段となるからである。例えば、本明細書に
記載するＨＧＢＶポリヌクレオチドプローブを使用し
て、細胞培養物中に産生されるウイルス核酸の量を定量
してもよい。これは、感染細胞核酸を標識したＨＧＢＶ
ポリヌクレオチドプローブでハイブリダイズ又は競合ハ
イブリダイズすることにより実施され得る。更には、抗
ＨＧＢＶ抗体を使用して、本明細書に記載するイムノア
ッセイにより、細胞培養物中のＨＧＢＶ抗原を同定、定
量してもよい。更には、競合アッセイにより感染細胞培
養物中のＨＧＢＶ抗原を定量することが所望され得るの
で、本明細書に記載するＨＧＢＶ核酸配列内にコードさ
れるポリペプチドはこれらのアッセイで有用である。一
般に、ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡに由来する組換えＨ
ＧＢＶポリペプチドを標識し、細胞培養系で産生された
抗原による、前記標識ポリペプチドとＨＧＢＶポリペプ
チドとの結合の阻害を監視する。これらの方法は、ＨＧ
ＢＶが細胞死を起こさずに細胞系で複製し得る場合に特
に有用である。
【０１５１】ＨＧＢＶ弱毒化株の調製 本明細書に記載する組織培養系及び／又は動物モデル系
を用いて、ＨＧＢＶ弱毒化株を単離することが可能であ
り得る。これらの弱毒化株は、ワクチンとして又はウイ
ルス抗原の単離に有用である。弱毒化株は、細胞培養物
及び／又は動物モデルに何度も継代させた後に単離する
ことができる。感染した細胞又は個体での弱毒化株の検
出は、当業界で公知の以下の方法に従って達成可能であ
り、検出には、ＨＧＢＶにコードされた１種以上のエピ
トープに対する抗体のプローブとしての使用、又は長さ
が少なくとも約８ヌクレオチドのＨＧＢＶ配列を含むポ
リヌクレオチドのプローブとしての使用が含まれ得る。
これに加え又はこれに代わって、本明細書に記載するＨ
ＧＢＶのゲノム情報を使用し、また組換え技術を使用し
て弱毒化株を構築してもよい。通常、ウイルス複製では
なく、病原性に関連するポリペプチドをコードするゲノ
ムの領域を欠失させる。ゲノムを構築すれば、ＨＧＢＶ
に対する中和抗体を産生するエピトープを発現させるこ
とができる。次いで、変性ゲノムを使用して、ＨＧＢＶ
複製を可能とする細胞を形質転換して、細胞をウイルス
複製を可能とする条件下で増殖させることができる。弱
毒化ＨＧＢＶ株はワクチン用としてだけでなく、ウイル
ス抗原の商業的産生のソースとしても有用である。何故
ならば、これらのウイルスの処理は、ウイルス産生及び
／又はウイルス製品の製造に係わる従業員に対してそれ
ほど厳密な保護措置を必要としないからである。
【０１５２】宿主及び発現制御配列 ゲノムをウイルスから抽出し、ゲノムライブラリーを作
成、プロービングし、クローンの配列を決定し、発現ベ
クターを構築し、細胞を形質転換し、免疫アッセイを実
施し、培養物中で細胞を増殖させるために使用する一般
的な技術は当業界では公知であり、本発明に包含する。
【０１５３】指定の宿主と適合する適切な制御配列を使
用するときには、原核宿主細胞及び真核宿主細胞の両方
を、所望のコード化配列の発現のために使用することが
できる。原核宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉが最も頻繁に
使用される。原核生物の発現制御配列には、場合によっ
てオペレーター部分を含むプロモーターや、リボソーム
結合部位が含まれる。原核宿主と適合するトランスファ
ーベクターは通常、アンピシリン耐性及びテトラサイク
リン耐性を付与するオペロンを含むプラスミドｐＢＲ３
２２や、更に抗生物質耐性マーカーを付与する配列を含
む種々のｐＵＣベクターから誘導される。これらのマー
カーを使用して、選択により良好な形質転換細胞を得る
ことができる。通常使用される原核生物制御配列には、
β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロ
モーター系（Ｃｈａｎｇ等，Ｎａｔｕｒｅ １９８：１
０５６［１９７７］）、（Ｇｏｅｄｄｅｌ等，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ８：４０５７［１９８０］
により報告されている）トリプトファンプロモーター
系、λ誘導Ｐ１プロモーター及びＮ遺伝子リボソーム結
合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ等，Ｎａｔｕｒｅ ２９
２：１２８［１９８１］）、並びにｔｒｐ及びｌａｃＵ
Ｖ５プロモーターの配列に由来するハイブリッドＴａｃ
プロモーター（Ｄｅ Ｂｏｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２９２：１２８［１９
８３］）が含まれる。前述の系は、特にＥ．ｃｏｌｉに
適合し得るが、所望とあれば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ株又は
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株のような他の原核宿主を対応
する制御配列と共に使用してもよい。
【０１５４】真核宿主は、培養系の酵母及び哺乳動物細
胞を含んでいる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａ
ｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓが最も一般的に使用されてい
る酵母宿主であり、好都合な真菌宿主である。酵母適合
性ベクターは、栄養要求突然変異株を原栄養性とするか
又は野生型株に重金属耐性を付与して良好な形質転換細
胞の選択を可能とするマーカーを保有する。酵母適合性
ベクターは、２ミクロン複製オリジン（Ｂｒｏａｃｈ
等，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１；３０７［１９８
３］）、ＣＥＮ３とＡＲＳ１の組み合わせ、又は複製を
行うための他の手段（例えば宿主細胞ゲノム内への適切
な断片の取り込みをもたらす配列）を使用し得る。酵母
ベクターの制御配列は当業界では公知であり、３−ホス
ホフィセレートキナーゼ（phosphophycerate kinase）
用プロモーターを含む解糖酵素合成用プロモーターを含
んでいる。例えば、Ｈｅｓｓ等，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９（１９６８）、Ｈｏｌｌａｎ
ｄ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：４９００（１
９７８）及びＨｉｔｚｅｍａｎ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５５：２０７３（１９８０）を参照されたい。Ｈ
ｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１３
８５（１９８１）に報告されているエノラーゼ遺伝子に
由来するようなターミネーターも含まれ得る。特に有用
な制御系は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター又はアルコ
ールデヒドロゲネーゼ（ＡＤＨ）調節可能プロモータ
ー、更にＧＡＰＤＨから誘導されるターミネーター、ま
た分泌が望ましければ、酵母αファクターに由来するリ
ーダー配列を含む系であると考えられる。更には、操作
可能に連結した転写調節領域及び転写開始領域は、野生
型生物で先天的に関連しないようなものであり得る。
【０１５５】発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞
系は当業界では公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可
能な多数の不滅化細胞系が含まれる。これらには、Ｈｅ
Ｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞、ハムスター乳児腎臓（ＢＨＫ）細胞等が含まれる。
哺乳動物細胞に適したプロモーターも当業界では公知で
あり、Ｓｉｍｉａｎウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス
肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、
ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）、サイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）に由来するようなウイルスプロモーターが含
まれる。哺乳動物細胞は更に、ターミネーター配列及び
ポリＡ付加配列を必要とし得る。発現を増加させるエン
ハンサー配列を含めてもよいし、遺伝子の増幅を誘発す
る配列も所望され得る。これらの配列は当業界では公知
である。哺乳動物細胞の複製に適したベクターは、ウイ
ルスレプリコン、又は非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ
型、非Ｅ型エピトープをコードする適切な配列の宿主ゲ
ノム内への取り込みを確実にする配列を含み得る。ＨＣ
Ｖの哺乳動物発現系の一例は、１９９２年１月３１日出
願の米国特許出願第０７／８３０，０２４号に記載され
ている。
【０１５６】形質転換 形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入する
ための公知の方法によって可能であり、ポリヌクレオチ
ドをウイルス内に組み込んだウイルスによる宿主細胞の
形質導入、及びポリヌクレオチドの直接取り込みを含
む。選択する形質転換手順は、形質転換すべき宿主に依
存する。直接の取り込みによる細菌の形質転換は一般
に、塩化カルシウム又は塩化ルビジウムによる処理を使
用する。Ｃｏｈｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０（１９７２）。Ｇｒａ
ｈａｍ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：５２６（１９７
８）のリン酸カルシウム沈殿法又はその変形を用いて、
直接の取り込みによる酵母形質転換を実施してもよい。
【０１５７】ベクター構築 ベクター構築は当業界で公知の方法を使用する。一般に
は、市販酵素の製造業者により一般に規定されている条
件下にて、適切な制限酵素で処理して、部位特異的ＤＮ
Ａ開裂を実施する。通常、約２０μｌの緩衝溶液中の１
〜１０単位の酵素を用いて３７℃で１〜２時間インキュ
ベートすることにより、約１マイクログラム（μｇ）の
プラスミド又はＤＮＡ配列を開裂する。制限酵素と共に
インキュベートした後に、フェノール／クロロホルム抽
出によりタンパク質を除去し、エタノールと共に沈殿さ
せてＤＮＡを回収する。開裂断片は、当業者に公知の方
法により、ポリアクリルアミド又はアガロースゲル電気
泳動法を用いて分離してもよい。
【０１５８】混合物中に存在する適切なデオキシヌクレ
オチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下で，Ｅ．
ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１（クレノウ）を用いて
付着端開裂断片をブラント末端にしてもよい。Ｓ１ヌク
レアーゼによる処理を使用して、一本鎖ＤＮＡ部分を加
水分解してもよい。
【０１５９】Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及びＡＴＰを用い、
標準的な緩衝液及び温度条件下で結合する。付着端結合
は、ブラント末端結合ほどＡＴＰやリガーゼを必要とし
ない。ベクター断片を結合混合物の一部として使用する
ときは、ベクター断片をしばしば細菌アルカリ性ホスフ
ァターゼ（ＢＡＰ）又は仔ウシ腸アルカリ性ホスファタ
ーゼで処理して、５’−ホスフェートを除去し、ベクタ
ーの再結合を妨げる。あるいは、所望しない断片の制限
酵素消化を使用して、結合を妨げることができる。結合
混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉや、抗生物質耐性を含む方法に
より選択された良好な形質転換細胞のような適切なクロ
ーニング宿主内に形質転換し、次いで正しい構築につい
てスクリーニングする。
【０１６０】望ましいＤＮＡ配列の構築 Ｗａｒｎｅｒ，ＤＮＡ ３：４０１（１９８４）が記載
するような自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて、
合成オリゴヌクレオチドを産生してもよい。所望とあれ
ば、標準的な反応条件を用いて、32Ｐ−ＡＴＰの存在下
にてポリヌクレオチドキナーゼで処理して、合成鎖を32
Ｐで標識することができる。ＤＮＡ配列（例えばゲノム
又はｃＤＮＡライブラリーから単離したＤＮＡ配列）
を、公知の方法［例えばＺｏｌｌｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）に記
載の特定部位の突然変異誘発］により改変してもよい。
簡潔に言えば、改変すべきＤＮＡを一本鎖配列としてフ
ァージ内にパッケージングし、改変すべきＤＮＡ部分に
相補的であり、自身の配列に所望の改変を含む合成オリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＤＮＡポリメ
ラーゼで二本鎖ＤＮＡに変換する。ファージの各鎖の複
製域を含む形質転換細菌の培養物を寒天平板培養して、
プラークを得る。理論的には新しいプラークの５０％
が、突然変異配列を有するファージを含み、残りの５０
％は元の配列を有する。非改変配列ではなく、正しい鎖
とのハイブリダイゼーションに適した温度及び条件下
で、プラーク複製物を標識した合成プローブにハイブリ
ダイズする。ハイブリダイゼーションにより同定された
配列を回収して、クローニングする。
【０１６１】プローブとのハイブリダイゼーション Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：３９６１
（１９７５）に記載の手順を用いて、ＨＧＢＶゲノム又
はＤＮＡライブラリーをプロービングしてもよい。簡潔
に言えば、プロービングすべきＤＮＡをニトロセルロー
スフィルター上に固定化し、変性し、０〜５０％ホルム
アミド、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナト
リウム、それぞれ０．０２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）、ポリビニルピロリドン及びＦｉｃｏ
ｌｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．
１％ＳＤＳ並びに１００μｇ／ｍｌキャリヤー変性ＤＮ
Ａを含む緩衝液でプレハイブリダイズする。緩衝液中の
ホルムアミドのパーセンテージ、及びプレハイブリダイ
ゼーションやその後のハイブリダイゼーション工程の時
間／温度条件は、必要とされる厳密度に依存する。厳密
度条件が低くてもよいオリゴマープローブは一般に、ホ
ルムアイドを低率に、温度をより低く、ハイブリダイゼ
ーション時間をより長くして使用する。ｃＤＮＡ又はゲ
ノム配列から誘導されるような３０又は４０個以上のヌ
クレオチドを含むプローブは一般に、例えば約４０〜４
２℃のより高温と、例えば５０％と高率のホルムアミド
を使用する。プレハイブリダイゼーションの後に、32Ｐ
標識オリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に添加し、ハ
イブリダイゼーション条件下でフィルターをこの混合物
中でインキュベートする。洗浄後、被処理フィルターを
オートラジオグラフィーにかけて、ハイブリダイズした
プローブの位置を示す。元の寒天プレート上の対応位置
にあるＤＮＡを所望のＤＮＡのソースとして使用する。
【０１６２】構築の検証及び配列決定 標準的なベクター構築では、結合混合物をＥ．ｃｏｌｉ
株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ又は他の適切な宿主内に形質転換
し、良好な形質転換細胞を抗生物質耐性又は他のマーカ
ーにより選択する。次いで、通常はＣｌｅｗｅｌｌ等，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１０：６６７（１９７２）
に記載のようなクロラムフェニコール増幅の後に、Ｃｌ
ｅｗｅｌｌ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ６２：１１５９（１９６９）の方法で、形質
転換細胞由来のプラスミドを産生する。ＤＮＡを単離
し、通常は制限酵素分析及び／又は配列決定により分析
する。Ｍｅｓｓｉｎｇ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．９：３０９（１９８１）にも記載されているＳ
ａｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３（１９７７）のよく知られ
たジデオキシ法により、又はＭａｘａｍ等，Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５：４９９（１
９８０）に記載の方法により、配列決定してもよい。Ｇ
Ｃに富む領域で時々観察されるバンド圧縮の問題は、Ｂ
ａｒｒ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：４２８（１
９８６）に記載の方法により、Ｔ−デアゾグアノシンを
用いて克服される。
【０１６３】エンザイムリンクドイムノソーベントアッ
セイ エンザイムリンクドイムノソーベントアッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）を使用して、抗原濃度又は抗体濃度を測定するこ
とができる。この方法は、酵素ラベルと抗原又は抗体と
の結合に依存し、結合酵素活性（生成シグナル）を定量
ラベル（測定可能な生成シグナル）として使用してい
る。酵素をラベルとして使用する方法、及びこのような
酵素ラベルの例は本明細書に記載する。
【０１６４】ＨＧＢＶ核酸配列の作成 非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型、非Ｅ型物質のソース
は、本明細書に記載する臨床的及び実験的基準に合致す
るＨＧＢＶウイルスに感染したヒト又はタマリンからの
個々の血漿、血清もしくは肝臓ホモジネート又はそのプ
ールである。あるいは、以下に記載する基準に合致する
非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｅ型肝炎に羅患した他の個
体の血液をタマリンに実験的に感染させることができ
る。高レベルのアラニントランスフェラーゼ活性を含む
個々の血漿、血清又は肝臓ホモジネート試料を多数合わ
せてプールを調製することができる。この活性は、ＨＧ
ＢＶ感染による肝炎性損傷によるものである。本発明者
らの実験のひとつで計算したウイルスのＴＩＤ（タマリ
ン感染価）は４×１０5個／ｍｌ以上であった（以下の
実施例２を参照）。
【０１６５】例えば、高力価であることが好ましいが、
必ずしもそうでなくてもよい血漿、血清又は肝臓ホモジ
ネートに由来する核酸ライブラリーを以下の方法で作成
する。まず血漿、血清又は肝臓ホモジネートからウイル
ス粒子を単離する。次いで、アリコートを緩衝溶液（例
えば５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝溶液）中に希
釈する。例えば１５，０００×ｇ、２０℃で２０分間の
遠心分離により破片を除去する。次いで、当業者により
慣用的に決定され得る適切な条件下で遠心分離を行っ
て、得られた上清中のウイルス粒子をペレット化する。
ウイルスゲノムを放出するために、ペレットをＳＤＳ懸
濁液［例えば１％ＳＤＳ、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含み、更に２ｍｇ
／ｍｌのプロテイナーゼＫを含んでいる懸濁液］のアリ
コート中に懸濁させ、次いで適切な条件下で、例えば４
５℃で９０分間インキュベートして粒子を破壊する。例
えば０．８μｇ ＭＳ２バクテリオファージＲＮＡをキ
ャリヤーとして添加し、この混合物をフェノール：クロ
ロホルム［０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
０．１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、０．１
％（ｗ／ｖ）ヒドロキシキノロンで飽和させたフェノー
ル］の１：１混合物で４回抽出し、次いでクロロホルム
で２回抽出して核酸を単離する。水性相を例えば１−ブ
タノールで濃縮した後に、２．５容量の無水エタノール
と共に−２０℃で一晩沈殿させる。例えばＢｅｃｋｍａ
ｎ ＳＷ４１ローターにて、４０，０００ｒｐｍ、４℃
で９０分間遠心分離にかけて核酸を回収し、これを水に
溶解し、０．０５％（ｖ／ｖ）ジエチルピロカーボネー
トで処理して、オートクレーブ処理する。
【０１６６】前記手順により得られた核酸を、例えば１
７．５ｍＭ ＣＨ3ＨｇＯＨで変性し、次いでこの変性
核酸を鋳型として用いてｃＤＮＡを合成し、例えばＨｕ
ｙｎｈ（１９８５、上掲）に記載の方法を用いてファー
ジλ−ｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位内にクローニングす
る。但し、逆転写酵素により第１核酸鎖の合成中にラン
ダムプライマーをオリゴ（ｄＴ）１２−１８に代える
（Ｔａｙｌｏｒ等，［１９７６］参照）。得られた二本
鎖核酸配列を、例えばセファロースＣＬ−４Ｂカラム上
でのサイジングにより分別する。平均寸法が約４００、
３００、２００及び１００塩基対の溶離材料をゲノムプ
ール内にプールする。少なくとも１つのプール内のｃＤ
ＮＡから、λ−ｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーを作成
する。あるいは、病因物質がＤＮＡウイルスの場合、ゲ
ノムＤＮＡのクローニング方法が有用であり、これは当
業者には公知である。
【０１６７】このようにして作成されたλ−ｇｔ１１ゲ
ノムライブラリーを、非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｅ型
肝炎既往個体（以下で説明する基準に合致する）からの
血清、血漿又は肝臓ホモジネートと特異結合し得るエピ
トープについてスクリーニングする。Ｈｕｙｎｇ等（上
掲）の方法を用いて、約１０4〜１０7個のファージを血
清、血漿又は肝臓ホモジネートを用いてスクリーニング
する。125Ｉ又は他の適切なリポーター分子（例えばＨ
ＲＰＯ、アルカリ性ホスファターゼ等）で放射性標識し
たヒツジ抗ヒトＩｇ抗血清で結合ヒト抗体を検出するこ
とができる。陽性ファージを同定して、精製する。次い
で、同一方法を用い、先にＨＧＢＶ物質に感染した所定
人数の各ヒトの血清との結合の特異性について、前記フ
ァージを試験する。理想的には、ファージは、試験する
血清、血漿又は肝臓ホモジネートの全て又は大半と反応
するポリペプチドをコードし、ＨＧＢＶ物質やＡ型、Ｂ
型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎について本明細書に記載した
基準により“陰性”であることが確定した個体からの血
清、血漿又は肝臓ホモジネートとは反応しない。これら
の手順に従って、非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型、非
Ｅ型であると同定された患者からの血清、血漿又は肝臓
ホモジネートにより免疫学的に特異認識されるポリペプ
チドをコードするクローンを単離することができる。
【０１６８】以下で本発明を実施例により説明する。こ
れらの実施例は例示的であって、本発明の範囲を限定す
るものではない。
【０１６９】
【実施例】本明細書に記載されている実施例は、ＨＧＢ
Ｖ群のウイルスの発見方法を詳細に記載するものであ
る。該実施例は、ＨＧＢＶ群のＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ
−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃウイルスの発見をたどり得るよう
に年代順に記載されている。一般的には、先ず伝播性及
び感染性の研究が行われた。本明細書に記載されている
これらの研究及びその後の研究により、ＨＧＢＶとして
ＧＢ−Ａ及びＧＢ−Ｂの２種のＨＣＶ様ウイルスの存在
が実証された。さらに、これも本明細書に詳細に記載さ
れている退化性（degenerative）プライマーを用いたそ
の後の実験によりＨＧＢＶ−Ｃが発見された。血清研究
により実証された該ウイルス群のヒトにおける罹患率、
該ウイルス群のウイルス特性分析、その特定の属におけ
る他のウイルスとの関連性及びＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ
−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃの相互関連性も教示する。
【０１７０】実施例１．ＨＧＢＶの伝播性 Ａ．実験プロトコル。伝播性及び感染性研究用に、ＬＥ
ＭＳＩＰ（Laboratory for Experimental Medicine and
Surgery in Primates, Tuxedo, New York）から１６匹
のタマリン（Saguinus labiatsu）を入手した。動物全
てをＬＥＭＳＩＰにより承認されたプロトコルに従って
ＬＥＭＳＩＰで維持且つ監視した（注：動物１匹が自然
死し、もう１匹の病弱な動物は感染力実験の開始前に安
楽死させた）。血清肝酵素アラニントランスアミナーゼ
（ＡＬＴ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧ
Ｔ）及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）につ
いて、２〜３週間の間、１週間に一度又は２週間に一度
得た血清試料に基づいて基準血清肝酵素値を決定した。
接種に先立って各動物につき最低８つの血清肝酵素値を
得た。平均肝酵素値＋標準偏差の３．７５倍に基づき、
各動物についてカットオフ値（ＣＯ）を決定した。カッ
トオフ値を超える肝臓酵素値は異常であり、肝臓が損傷
を受けているとみなした。数匹のタマリンに以下に記載
のように接種し、ＡＬＴ、ＧＧＴ及びＩＣＤ血清レベル
における変化を監視した。その後、監視過程の間の特定
時期に、その後の実験用の血清及び組織を得るべく動物
数匹を殺した。
【０１７１】Ｂ．動物の接種（初期実験）。ＨＧＢＶを
接種した９匹のタマリンから肝炎の初期急性期（接種後
１９〜２４日）の間に採取した血清から、既知の感染性
タマリンＧＢ血清プール（Ｈ２０５ ＧＢパス１１とし
て示される１１回継代）を調製した。該プールは、既に
記載（J.L. Dienstagら, Nature 264，前出; E.Tabor
ら,J. Med. Virol. 5, 前出）されており、関連病因物
質を決定するために研究された。該プールのアリコート
は、この実験研究に用いられるまでAbbott Laboratorie
s（North Chicago, IL60064）において液体窒素貯蔵条
件下に維持されていた。ＨＧＢＶの他のアリコートはAm
erican Type Culture Collection（A.T.C.C.），12301
Parklawn Drive, Rockville, MD20852から、A.T.C.C.受
託番号第VR-806号の下に入手し得る。
【０１７２】第１日目に、初期群の残りの１４匹中４匹
のタマリン、認識番号Ｔ−１０５３、Ｔ−１０４８、Ｔ
−１０５７及びＴ−１０６１に、前以て１：５０に希釈
しておいたプールＨ２０５、１１回継代０．２５ｍｌを
静脈内接種した。これらの動物を肝酵素ＡＬＴ、ＧＧＴ
及びＩＣＤの変化について毎週監視した。表２は、これ
ら４匹のタマリン（Ｔ−１０５３、Ｔ−１０４８、Ｔ−
１０５７及びＴ−１０６１）に関する接種前及び接種後
の肝酵素データを示す。
【０１７３】
【表２】 図１〜４は、接種前及び接種後のこれら４匹のタマリン
のＡＬＴレベル及びＩＣＤレベルを示している。該デー
タが示しているように、プールＨ２０５の１：５０の希
釈物を接種した４匹のタマリンのＡＬＴ、ＧＧＴ及びＩ
ＣＤにＣＯを超える有意な上昇が得られた。
【０１７４】同日（第１日目）、１匹のタマリン（Ｔ−
１０４７）に、プールされた正常タマリン血清０．２５
ｍｌを静脈内接種して陰性対照として用い、もう１匹の
タマリン（Ｔ−１０４２）には、プールされた正常ヒト
血清を静脈内接種して追加の陰性対照とした。図５及び
図６並びに表３は、２匹の対照タマリン（Ｔ−１０４７
及びＴ−１０４２）の接種前及び接種後のＡＬＴ及びＩ
ＣＤレベルを示す。
【０１７５】
【表３】 データが示しているように、該２匹の対照タマリンにお
いては８週の間にＡＬＴ又はＩＣＤに全く上昇が見られ
なかった。
【０１７６】同日（第１日目）、１匹のタマリン（Ｔ−
１０４４）に、急性肝炎の発生から約３週間後の前記外
科医（ＧＢ起源）から得た回復期血清０．２ｍｌを静脈
内接種した。この標本は−２０℃で貯蔵されていた〔F.
Deinhardtら, J. Exper. Med. 125:673-688 (196
7)〕。もう１匹のタマリン（Ｔ−１０３４）に、該回復
期血清０．１ｍｌを接種した。
【０１７７】
【表４】 図７及び図８並びに表４に示されているように、接種後
１１週の間には、これらのタマリンの血清肝酵素に上昇
が全く見られなかった。従って、これらのデータは、元
の患者から採取し、−２０℃で貯蔵されていた回復期血
清には感染性ＨＧＢＶが検出されなかったことを示して
おり、それは、患者が感染から回復しており、且つ、ウ
イルスが患者の血清から除去されているか、又はウイル
スタイターが−２０℃での貯蔵により検出不能なレベル
にまで減少していたことを示し得る。
【０１７８】Ｃ．その後の実験。タマリンＴ−１０５３
は、接種後１週間で血清肝酵素に有意な上昇を示し、接
種後１１日目に肝酵素に関して再テストを行った。１２
日目に、血清肝酵素に有意な上昇が存在することが測定
され、該動物をその日に殺した。その後の実験用に、血
漿、肝臓及び脾臓の組織試料を得た。Ｔ−１０５３由来
の血漿を以下の実施例３に記載のＲＤＡ手順用の出発物
質とし、肝組織を以下の実施例８に用いた。
【０１７９】タマリンＴ−１０４８、Ｔ−１０５７及び
Ｔ−１０６１を血清肝臓酵素について監視した。該動物
は全て、接種後２週間以内に肝臓酵素レベルが上昇した
ことが認められた。これらの上昇値は接種後６週間以降
に見られた。３匹のタマリンは全て、接種後８４日目ま
でに血清肝酵素レベルがＣＯを下回るレベルに減少した
ことが認められた。接種後９７日目に、これら３匹のタ
マリン（Ｔ−１０４８、Ｔ−１０５７及びＴ−１０６
１）を、タマリンＴ−１０５３由来のニート血漿０．１
０ｍｌ（感染性であると判明した、実施例２参照）を用
いて再チャレンジし、血清肝酵素の上昇として示される
肝炎が再誘発され得たかどうかを測定した。そのデータ
を表２、図１、図３及び図４に示す。データが示してい
るように、２匹のタマリン（Ｔ−１０５７及びＴ−１０
６１）の血清肝酵素レベルは、接種後３週間ではＣＯを
下回るレベルに留まった。１匹のタマリン（Ｔ−１０４
８）は、再接種直後の２週間に血清肝酵素レベルに緩や
かな上昇を示した。Ｔ−１０４８における緩やかな上昇
は、ＨＧＢＶによる肝臓組織の再感染によるものか又は
Ｈ２０５の初期接種から完全に回復していないことによ
るものと推定された。
【０１８０】実施例２．感染性実験 Ａ．実験プロトコル。実施例１（Ａ）に記載のようにし
て４匹のタマリンに関する基準読み取り値を得た。接種
前に各動物について簡単に基準血清肝臓酵素（ＡＬＴ、
ＧＧＴ及びＩＣＤ）の値を決定した。平均肝酵素値＋標
準偏差の３．７５倍に基づいて各動物についてカットオ
フ値（ＣＯ）を決定した。カットオフ値を超える肝酵素
は異常であり、肝臓に損傷があるとみなされた。
【０１８１】Ｂ．タマリンの接種。接種後１２日目に殺
したタマリンＴ−１０５３由来の血漿（実施例１〔Ｃ〕
参照）をその後の実験用の接種材料として用いた。１日
目に、１匹のタマリン（Ｔ−１０５５）に、Ｔ−１０５
３のニート血漿０．２５ｍｌを静脈内接種した。同日、
２匹のタマリン（Ｔ−１０３８及びＴ−１０５１）に、
プールされた正常タマリン血漿中に１０-4（Ｔ−１０３
８）又は１０-5（Ｔ−１０５１）に順次希釈しておいた
Ｔ−１０５３血漿０．２５ｍｌを静脈内接種した。同
日、タマリンＴ−１０４９に、減少孔径（０．８μｍ、
０．４５μｍ、０．２２μｍ及び０．１０μｍ）の一連
のフィルターを介して濾過し、プールされた正常タマリ
ン血漿に１０-4に希釈しておいたＴ−１０５３血漿０．
２５ｍｌを静脈内接種した。
【０１８２】血清肝酵素ＡＬＴ、ＧＧＴ及びＩＣＤの変
化について実施例１に記載のようにして毎週全タマリン
（Ｔ−１０５５、Ｔ−１０３８、Ｔ−１０５１及びＴ−
１０４９）を監視した。表５は、これら４匹のタマリン
に関する接種前及び接種後の血清肝酵素データを示す。
【０１８３】
【表５】 図９は、Ｔ−１０５５の接種前及び接種後のＡＬＴ及び
ＩＣＤ値を示す。図９を参照すると、血清肝酵素ＡＬＴ
及びＩＣＤにＣＤを超える上昇が生じたことがわかる。
該タマリンを接種後１２日目に殺した。図１０及び図１
１は、それぞれタマリンＴ−１０５１及びＴ−１０３８
のＡＬＴ及びＩＣＤにおける接種前及び接種後の血清レ
ベルを示す。図１０及び図１１を参照すると、接種後１
１日目まで両動物の血清肝酵素ＡＬＴ及びＩＣＤに上昇
が生じたことをわかる。Ｔ−１０３８を接種後１４日目
に殺した。表５及び図１２は、Ｔ−１０４９に関して得
られたデータを示す。表５及び図１２からわかるよう
に、接種後１１日以内にＴ−１０４９にＣＯを超える血
清肝酵素の上昇が認められた。
【０１８４】Ｔ−１０４９に関して行われた濾過実験
は、ＨＧＢＶが０．１０μｍのフィルターを通過し得る
ことを示し、それは、ＨＧＢＶがウイルス性であり且つ
直径が０．１μｍ未満であり得ることを示唆している。
さらに、Ｔ−１０３８に関して行われた感染性滴定実験
は、Ｔ−１０５３血清が１ｍｌ当たり少なくとも４×１
０5のタマリン感染量を含んでいることを示している。
【０１８５】単一のＨＧＢＶ病原体の伝播性を示すため
に、タマリンＴ−１０４４に、Ｈ２０５接種７日後に採
取し、正常なタマリン血清に１：５００希釈しておいた
Ｔ−１０５７血清からなる接種材料０．２５ｍｌを接種
した。接種後１４〜６３日からＡＬＴレベルにカットオ
フを超える緩やかな上昇（即ち、８２〜１０６の範囲の
上昇）が認められた。
【０１８６】接種後１４日目に採取し、正常なタマリン
血清に１：２希釈しておいたＴ−１０４４の血清０．２
５ｍｌをタマリンＴ−１０４７及びＴ−１０５６に順次
接種した。先ず、接種後４２日目にＴ−１０４７及びＴ
−１０５６にカットオフを超えるＡＬＴレベルの上昇が
認められたが、それぞれ接種後６４日目及び９１日目に
正常レベルに戻った。タマリンＴ−１０５８に、Ｔ−１
０５３血清を用いてチャレンジ後２２日目に採取したＴ
−１０５７のニート血清０．２５ｍｌを接種した。接種
後１１２日の間にはＡＬＴレベルに上昇は認められなか
った。
【０１８７】実施例３．代表相違分析（控除ハイブリダ
イゼーション） Ａ．アンプリコン用二本鎖ＤＮＡの産生 本明細書の上記材料及び方法に記載され、図１３に参照
されている手順を用い、Ｈ２０５血清（実施例１Ｃ及び
２Ｂ参照）の接種後１２日目に採取したタマリンＴ−１
０５３感染性血漿（実施例１Ａ参照）由来の総核酸から
テスターアンプリコンを合成した。接種前１７〜３０日
の間にプールされたタマリンＴ−１０５３の接種前血漿
からドライバーアンプリコンを合成した。簡単に言え
ば、両血漿を実施例２Ｂに記載のように０．１μｍのフ
ィルターを介して濾過した。次いで、市販のキット〔Un
ited States Biochemical (USB), Cleveland, OH, cat.
#73750〕及び担体として１０μｇの酵母ｔＲＮＡを用
い、５０μｌの濾過血漿を抽出した。この核酸をランダ
ムに開始して逆転写し、次いで市販のキットを用いラン
ダム開始してＤＮＡ合成した。簡単に言えば、ランダム
ヘキサマーを用いて、製造業者に指示されたＰｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ'ｓ（Norwalk, CT）ＲＮＡ ＰＣＲキッ
ト（cat.#N808-0017）を用いて８０μｌの逆転写反応を
行い、２０℃で１０分間インキュベートし、次いで４２
℃で２時間インキュベートした。次いで反応を停止し、
ｃＤＮＡ／ＲＮＡ重複部（duplexes）を９９℃で２分間
インキュベートして変性させた。反応材料に、総量２０
μｌの１０μｌの１０×ＲＰ緩衝液〔１００ｍＭのＮａ
Ｃｌ、４２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ
のＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ〕、２５０ｐｍｏ
ｌのランダムヘキサマー及び１３単位のＳｅｑｕｅｎａ
ｓｅ（登録商標）バージョン２．０ポリメラーゼ（US
B，cat.#70775）を補った。反応材料を２０℃で１０分
間、次いで３７℃で２時間インキュベートした。フェノ
ール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させた
後、製造業者により指示されたように、これらの反応の
二本鎖ＤＮＡ産物を３０μｌの反応材料容量中４単位の
制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３ＡＩ（NewEngland Bio
labs [NEB], cat.#169L）で３０分間消化した。
【０１８８】Ｂ．アンプリコンの合成 Ｓａｕ３ＡＩ消化ＤＮＡを上記のように抽出、沈殿させ
た。反応材料を５０〜５５℃の乾燥加熱ブロックに入
れ、４℃で１時間インキュベートすることにより、Ｓａ
ｕ３ＡＩ消化産物全体を、１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩
衝液（ＮＥＢ）中で緩衝した３０μｌの反応材料容量中
４６５ｐｍｏｌのＲ Ｂｇｌ２４（配列番号１）及び４
６５ｐｍｏｌのＲ Ｂｇｌ １２（配列番号２）にアニー
リングした。４００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（NEB,
cat.#202S）を添加してアニーリングされた産物を連結
した。１６℃で１４時間インキュベートした後、小規模
のＰＣＲを行った。１０μｌの連結反応材料を、６０μ
ｌのＨ2Ｏ、２０μｌの５×ＰＣＲ緩衝液（３３５ｍＭ
のＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）、８０ｍＭの〔ＮＨ4〕2ＳＯ
4、２０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５μｇ／ｍｌのウシ血清
アルブミン及び５０ｍＭの２−メルカプトエタノー
ル）、８μｌの４ｍＭｄＮＴＰ株、２μｌ（１２４ｐｍ
ｏｌ）Ｒ Ｂｇｌ ２４（配列番号３）及び３．７５単位
のＡｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ
（Perkin Elmer, cat.#N808-1012）に加えた。Ｇｅｎｅ
Ａｍｐ（登録商標）９６００サーモサイクラー（Perkin
Elmer）中でＰＣＲ増幅を行った。試料を７２℃で５分
間インキュベートし、連結されたアダプターの５'突出
末端を充填した。試料を２５〜３０サイクル（９５℃で
１分及び７２℃で３分）で増幅し、次いで７２℃で１０
分間延長増幅した。アガロースゲルにより首尾よくアン
プリコンが合成されたこと（即ち、約１００ｂｐ〜１５
００ｂｐを超える範囲のＰＣＲ産物の塗抹標本）が確認
された後で、テスター及びドライバーアンプリコンの大
規模な増幅を行った。それぞれドライバー及びテスター
の合成について先に記載されたようにして、４０の１０
０μｌＰＣＲ及び８つの１００μｌＰＣＲを設定した。
１００μｌの反応材料当たり２μｌの小規模ＰＣＲ産物
は、大規模アンプリコン産生用の鋳型としての役割を果
たした。追加の１５〜２０サイクルの増幅を行うため
に、上記のようなサーモサイクリングを行った。次いで
ドライバー及びテスターＤＮＡ用のＰＣＲ反応材料をフ
ェノール／クロロホルムで２回抽出し、イソプロパノー
ルで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄、Ｓａｕ３ＡＩ
で消化してアダプターを開裂した。テスターアンプリコ
ンを低融点アガロースゲル上でさらに精製した。簡単に
言えば、テスターアンプリコンＤＮＡ１０μｇを２％Ｓ
ｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標）ゲル（FMC Bioproducts,
Rockland, ME）上で移動させた。１５０〜１５００塩
基対のフラグメントをゲルから切り出し、ゲルのスライ
スを、３ｍｌのＨ２Ｏ、４００μｌの０．５Ｍ ＭＯＰ
Ｓ及び４００μｌのＮａＣｌを用い、７２℃で２０分間
融解させた。製造業者により指示されたように、Ｑｉａ
ｇｅｎ−ｔｉｐ２０（Qiagen, Inc., Chatsworth, CA）
を用いて融解したゲルスライスからＤＮＡを回収した。
【０１８９】Ｃ．アンプリコンのハイブリッド形成及び
選択的増幅 精製されたテスターＤＮＡアンプリコン約２μｌを上記
のようにＮ Ｂｇｌ ２４（配列番号３）及びＮ Ｂｇｌ
１２（配列番号４）に連結した。最初の控除ハイブリッ
ド形成のために、Ｎ Ｂｇｌプライマーセットに連結さ
れたテスターアンプリコン（０．５μｇ）とドライバー
アンプリコン（２０μｇ）とを混合し、フェノール／ク
ロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。４μｌ
のＥＥ×３緩衝液（３０ｍＭのＥＰＰＳ、２０℃におけ
るｐＨ８．０〔Sigma, St. Louis, MO〕、３ｍＭのＥＤ
ＴＡ）にＤＮＡを再懸濁し、３５μｌの鉱油を重層し
た。加熱変性（９９℃で３分）させた後、変性したＤＮ
Ａに５ＭのＮａＣｌ１μｌを加え、ＤＮＡを６７℃で２
０時間ハイブリダイズした。水相を新しい管に移し、該
試料に８μｌのｔＲＮＡ（５ｍｇ／ｍｌ）、次いで３９
０μｌのＴＥ〔１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）及び
１ｍＭのＥＤＴＡ〕を加えた。ハイブリダイズしたＤＮ
Ａ溶液８０μｌを、Ｈ2Ｏ４８０μｌ、５×ＰＣＲ緩衝
液（上記）１６０μｌ、４ｍＭのｄＮＴＰ６４μｌ及び
ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼ６μｌ（３
０単位）に加えた。該溶液を７２℃で５分間インキュベ
ートして、連結されたＮ Ｂｇｌ ２４プライマーによっ
て形成された５'オーバーハングを充填した。Ｎ Ｂｇｌ
２４（配列番号３、２０μｌのＨ2Ｏ中１．２４ｎｍｏ
ｌ）を加え、反応材料をアリコート（１００μｌ／管）
に分け、上記のように１０サイクルの増幅を行った。反
応材料をプールし、フェノール／クロロホルムで２回抽
出し、イソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノール
で洗浄して、４０μｌのＨ2Ｏに再懸濁した。一本鎖Ｄ
ＮＡをヤエナリヌクレアーゼ（ＭＢＮ）により除去し
た。簡単に言えば、増幅されたＤＮＡ２０μｌを、販売
業者により記載のように、４０μｌの反応材料中２０単
位のＭＢＮ（NEB）で消化した。ＭＢＮ消化物に５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）１６０μｌを加えた。酵素
を９９℃で５分間熱不活化した。８０μｌのＭＢＮ消化
ＤＮＡを上記のようにしてさらに１５サイクルＰＣＲ増
幅した。再び反応材料をプールし、フェノール／クロロ
ホルムで２回抽出、イソプロパノールで沈殿させ、７０
％エタノールで洗浄、Ｈ2Ｏに再懸濁した。次いで、増
幅されたＤＮＡ（３〜５μｌ）をＳａｕ３ＡＩで消化
し、上記のように抽出、沈殿させた。最終ＤＮＡペレッ
トを１００μｌのＴＥに再懸濁した。
【０１９０】Ｄ．引き続いてのハイブリッド形成／増幅
段階 上記のようにして、先のハイブリッド形成／選択的増幅
材料由来のＤＮＡ１００ｎｇをＪ Ｂｇｌプライマーセ
ット（配列番号５及び配列番号６）に連結した。このＤ
ＮＡ（５０ｎｇ）を２０μｇのドライバーアンプリコン
と混合し、上記のようにしてハイブリッド形成及び増幅
手順を繰り返したが、但し、サーモサイクリングの間の
延長温度は７０℃であって、Ｎ Ｂｇｌプライマーセッ
ト（配列番号３及び配列番号４）の場合の７２℃ではな
く、最終増幅段階（ＮＢＮ消化後の）は２５サイクルで
あった。次いで２回目のハイブリッド形成−増幅産物１
００ｎｇをＮ Ｂｇｌプライマーセット（配列番号３及
び配列番号４）に連結し、この材料２００ｐｇと２０μ
ｇのドライバーアンプリコンとを混合し、上記のように
して３回目のハイブリッド形成／増幅を行ったが、最終
増幅は２５サイクルであった。ＨＧＢＶ接種前及び急性
期Ｔ−１０５３血漿に体して行われた代表相違分析（Ｒ
ＤＡ）から得られた産物の２％アガロースゲルを図１４
に示す。図１４を参照すると、レーン１は、適切なサイ
ズ（ｂｐ）のＤＮＡフラグメントを有する１５０ｎｇの
ＨａｅIII消化Ｐｈｉ−Ｘ１７４ＤＮＡマーカー（ＮＥ
Ｂ）を含んでいる。ドライバーアンプリコン（レーン
２）及びテスターアンプリコン（レーン３）の複合性
は、試料中に見られるＤＮＡ産物の塗抹標本によって実
証されている。この複合性は、テスター配列が１回目
（レーン４）、２回目（レーン５）又は３回目（レーン
６）のハイブリッド形成／選択的増幅を受けると劇的に
低下する。
【０１９１】Ｅ．相違産物のクローニング 相違産物を、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫ
Ｓ＋（Stratagene, LaJolla, CA, cat.#212207）のＢａ
ｍＨＩ部位にクローニングした。０．５μｇのｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔIIをＢａｍＨＩ（１０単位、NEB）で消
化し、販売業者により指示されたように子牛腸管ホスフ
ァターゼ（１０単位、NEB）を用いて５'脱リン酸化し
た。プラスミドをフェノール：クロロホルムで抽出し、
エタノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄、１０
μｌのＨ2Ｏに再懸濁した（最終濃度：１μｌ当たり約
５０ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII）。２回目のハイ
ブリッド形成／増幅産物由来の４つの最大バンドを上記
のようにして２％低融点アガロースゲルから切り出し
た。ＴａｋａｒａＤＮＡ連結反応キット（Takara Bioch
emical, Berkeley, CA）を用い、融解した（７２℃、５
分）ゲルスライス４μｌを、５０μｌの反応材料中５０
ｎｇのＢａｍＨＩ−カット、脱リン酸化ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔIIに連結した。１６℃で３．５時間インキュベ
ートした後、８μｌの連結反応材料を用いて、販売業者
に指示されたように、 Ｅ．ｃｏｌｉコンピテントＸＬ−
１Ｂｌｕｅ細胞（Stratagene）を形質転換した。アンピ
シリン（１５０μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に
形質転換混合物をのせ、３７℃で一晩インキュベートし
た。得られたコロニーを液体培養中で増殖させ、ミニプ
レプ（miniprep）プラスミドＤＮＡを当該分野に記載の
ようにして分析し、クローニング産物の存在を確認し
た。
【０１９２】２回目のハイブリッド形成／増殖段階から
得られた４つの最大産物のクローニングに加えて、３回
目のハイブリッド形成／増殖段階から得られた産物の全
集団をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIにクローニングした。
５０ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIベクター（上記の
ように合成した）を、上記のようにして、５０μｌの反
応材料中１０ｎｇの３回目のハイブリッド形成／増殖産
物に連結した。１６℃で２時間インキュベートした後、
１０μｌの連結反応産物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉコンピ
テントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。得られた
形質転換産物由来の６０のコロニーを増殖させ、ミニプ
レプＤＮＡを合成し、上記のような当該分野において公
知の方法で分析した。制限エンドヌクレアーゼ消化及び
ドットブロットハイブリッド形成法をユニーククローン
を特定するために用いた。
【０１９３】実施例４．ＨＧＢＶゲノムの抗原領域をコ
ードするｃＤＮＡクローンの免疫分離 Ａ．クローニング材料源としての濃縮ウイルスの調製 実施例３に示されている方法に加えて、以下の分離手順
を用いて、ＨＧＢＢＶゲノムを分離した。３匹のタマリ
ン（Ｔ−１０５５、Ｔ−１０３８及びＴ−１０４９）
に、実施例２に記載のタマリンＴ−１０５３から調製し
た血清を接種した。表５を参照すると、接種後１１日目
までに３匹全てのタマリンに肝酵素値の上昇が見られ
た。タマリンＴ−１０５５を接種後１２日目に殺し、タ
マリンＴ−１０３８及びＴ−１０４９を接種後１４日目
に殺した。これら３匹のタマリンそれぞれから由来の血
清約３〜４ｍｌをプールし、全量約１１．３ｍｌを得
た。プールされた血清を１５℃で１５分間１０，０００
×ｇで遠心して清澄化した。次いでこれを連続的に０．
８、０．４５、０．２及び０．１μｍの注射器フィルタ
ーに通した。次いで該濾過された材料を、ＳＷ４１−Ｔ
ｉローター中、４℃で６８分間、４１，０００ｒｐｍ
で、０．３ｍｌのＣｓＣｌクッション〔密度：１０ｍＭ
のＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）中１．６ｇ／ｍｌ〕を介して遠心して濃
縮した。約０．６ｍｌのＣｓＣｌ層を遠心後に取り出
し、３つの０．２ｍｌアリコートに分け、−７０℃で貯
蔵した。
【０１９４】次いで、タマリンＴ−１０３４にこのペレ
ット化材料（正常なタマリン血清中で調製した）の１０
-6希釈物０．２５ｍｌを接種した。先ず、接種後２週間
でＴ−１０３４にＡＬＴ肝酵素値の上昇が認められ、該
値はその後７週間上昇を継続し、最終的に接種後１０週
までに正常化した（図３０、実施例１４を参照された
い）。この実験は、プールされたタマリン血清から濃縮
した材料の感染性を示した。該材料は比較的高いタイタ
ーを有することが示されたので、このウイルス濃縮源
を、以下に記載のような、ｃＤＮＡライブラリー構築用
の核酸源として用いた。
【０１９５】Ｂ．ｃＤＮＡライブラリーの構築 販売業者の指示により市販のＲＮＡ抽出キット（Strata
gene, La Jolla, CA）を用いて、濃縮ウイルス（上記）
のアリコート（０．２ｍｌ）からＲＮＡを抽出した。最
終沈殿段階の前に、試料を４つの等量のアリコートに分
け、次いで５μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡの存在下に沈殿
させた。これらのアリコートの中一つだけをｃＤＮＡ合
成用に用いた。他のものは−８０℃で貯蔵した。製造業
者に指示されたように、市販のキット（Stratagene, La
Jolla, CA）を用いて、ＲＮＡから、リン酸化され、ブ
ラント末端化二本鎖ｃＤＮＡを合成した。次いで、製造
業者に指示されたように、Ｔ４ＤＮＡリガーゼキット
（Stratagene, La, Jolla, CA）を用いて、１０μｌの
反応材料容量中で二本鎖リンカー／プライマーをｃＤＮ
Ａ末端（センスストランド、配列番号７；アンチセンス
ストランド、配列番号８）に連結した。これによって、
全てのｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素認
識部位を含む同一の５'及び３'末端を有する混合物とし
て得た〔G. Reyes及びJ. Kim, Mol. Cell. Probes 5:47
3-481 (1991); A. Akowitz及びL. Manuelidis, Gene 8
1:295-306 (1989); 並びにG. Inchauspeら, Viral Hepa
titis andLiver Disease, F.B. Hollingerら, Eds., 38
2-387ページ(1991)〕。次いで、全ｃＤＮＡがそれらの
配列とは無関係に増幅されるように、リンカー／プライ
マーのセンスストランドオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反
応におけるプライマーとして用いた。この手順により、
全ｃＤＮＡ集団内に存在する微量ｃＤＮＡが、効率的に
クローニングされるレベルにまで増幅され、それによっ
て出発材料内の配列を表すｃＤＮＡライブラリーが形成
された。
【０１９６】製造業者により指示されたＧｅｎｅＡｍｐ
ＰＣＲキット（Perkin-Elmer）を用いて、ＰＥ−９６
００サーモサイクラー中で、センスストランドオリゴヌ
クレオチドプライマーの存在下に上記連結材料の１μｌ
アリコートに対してＰＣＲを行った（最終濃度：１μ
Ｍ；反応材料容量：５０μｌ）。以下のようにして３０
サイクルのＰＣＲを行った：９４℃で０．５分間の変
性、５５℃で０．５分間のアニーリング及び７２℃で
１．５分間の延長。次いで、得られた産物の１μｌアリ
コートを上記のようにして再増幅した。次いで、最終Ｐ
ＣＲ反応産物を等量のフェノール−クロロホルム（１：
１、ｖ／ｖ）で１回、等量のクロロホルムで１回抽出
し、次いで、酢酸ナトリウム（最終濃度、０．３Ｍ）及
び２．５容量の無水エタノールを加えて、ドライアイス
上で１０分間沈殿させた。得られたＤＮＡペレットを水
に再懸濁し、製造業者に指示されたように、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ（New England Biolabs）で消化した。次い
で、製造業者に指示されたようにＤＮＡ結合樹脂（Prep
-a-Gene, BioRad Laboratories）を用いて、消化された
ｃＤＮＡを反応混合物から精製し、２０μｌの蒸留水中
で溶離した。
【０１９７】ｃＤＮＡ（８μｌ）を、３０μｌの反応材
料容量中３μｇのラムダ ｇｔ１１ベクターＤＮＡアー
ム（Stratagen, La Jolla, CA）に４℃で１〜５日の間
に連結した。製造業者に指示されたようにＧｉｇａＰａ
ｃｋIIIＧｏｌｄパッケージ抽出物（Stratagene, 前
出）を用いて、連結材料１１μｌをファージヘッドにパ
ッケージした。得られたライブラリーは、組換え頻度が
８９．３％で、平均インサートサイズが約３５０塩基対
の合計約１７３万メンバー（ＰＦＵ）を含んでいた。
【０１９８】Ｃ．組換えＧＢ ｃＤＮＡライブラリーの
免疫スクリーニング ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニングに用いた抗
血清は、接種後に血清肝酵素レベルに上昇を示したタマ
リンから採取した。免疫スクリーニングには、２つの別
個の抗血清プールを用いた。第１のプールは、２匹の動
物（Ｔ−１０４８及びＴ−１０５１；それぞれ実施例
１、表２と、実施例２、表５を参照されたい）由来の血
清を含み、第２のプールは、１匹の動物（Ｔ−１０３
４；図３０、実施例１４を参照されたい）由来の血清を
含むものであった。用いられた特定の血清を表６に示
す。
【０１９９】ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニン
グに用いるためにこれらの試料を選択した時点では、こ
れらの試料は、１．４又は１．７組換えＣＫＳタンパク
質（実施例１３）とのそれらの免疫反応性について試験
されていなかった。従って、本明細書に示されている結
果は、用いられた抗血清中のこれらの組換えタンパク質
に対するＨＧＢＶ抗体の有無に関するいずれの情報とも
関係なく得られたものである。
【０２００】
【表６】 組換えファージの免疫分離に用いた手順は、Young及びD
avisにより記載された方法〔R.A. Young及びR.W. Davi
s, PNAS 80:1194-1198 (1983)〕に基づき、以下のよう
に変更を加えたものであった。一方は、Ｔ−１０４８及
びＴ−１０５１からプールした抗血清を用い、他方はＴ
−１０３４由来の抗血清を用いた２回の免疫スクリーニ
ング実験を行った。いずれに場合にも、抗体とＥ．ｃｏ
ｌｉタンパク質との非特異的相互作用を低減させるため
に、使用前に一次抗血清をＥ．ｃｏｌｉ抽出物に予備吸
着させた。最初の実験では、Ｔ−１０４８／Ｔ−１０５
１抗血清プールを用いて１２９万個の組換えファージを
免疫スクリーニングした。２回目の実験では、Ｔ−１０
３４抗血清を用いて３０万個の組換えファージを免疫ス
クリーニングした。組換えファージライブラリーをＥ．
ｃｏｌｉストランドＹ１０９０r-のローン上に置き、３
７℃で３．５時間増殖させた。次いで、プレートをＩＰ
ＴＧ（１０ｍＭ）で飽和したナイロンフィルターで覆
い、４２℃で３．５時間インキュベートした。次いでフ
ィルターを、１％のＢＳＡ、１％のゼラチン及び３％の
Ｔｗｅｅｎ−２０（「ブロッキング緩衝液」）を含むＴ
ｒｉｓ−塩水緩衝液中、２２℃で１時間ブロックした。
次いでフィルターを一次抗血清（ブロッキング緩衝液中
の１：１００希釈物）中、４℃で１６時間インキュベー
トした。次いで一次抗血清を取り出して次回のプラーク
精製用に取って置き、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む
Ｔｒｉｓ−塩水中でフィルターを４回洗浄した。次い
で、フィルターを１２５−Ｉ−標識（又はアルカリ−ホ
スファターゼ結合）ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson Immuno
Research, West Grove, PAから入手可能）を含むブロッ
キング緩衝液中２２℃で６０分間インキュベートし、上
記のように洗浄し、次いでＸ線フィルムに暴露（又はJ.
Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manua
l, 第2版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Ha
rbor, N.Y., 1989におけるような確定した手順に従って
発色）した。このライブラリーから５種の免疫陽性ファ
ージ（４−３ＢＩ、４８−１Ａ１、６６−３Ａ１、７０
−３Ａ１、７８−１Ｃ１）を分離し、次いで、上記の方
法を用いて３匹の感染タマリン（Ｔ−１０４８、Ｔ−１
０５１、Ｔ−１０３４）由来の抗血清に対する結合特異
性についてテストした。これらの組換え体は、３匹の感
染タマリンそれぞれに由来する回復期血清と反応したが
予備接種した血清とは反応しなかったポリペプチドをコ
ードした（データは示さず）。
【０２０１】組換えファージによりコードされたポリペ
プチドの免疫学的反応性の特異性を証明するために、Ｅ
ｃｏＲＩクローニング部位に対して５'位に位置するプ
ライマー（配列番号９）及び３'位に位置するプライマ
ー（配列番号１０）を用いて、ＰＣＲにより、各ｃＤＮ
Ａをラムダファージゲノムから回収した。次いで、ＰＣ
Ｒ産物をＥｃｏＲＩで消化し、実施例１３に記載のよう
にして、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＪＯ２０１に次
いで連結した。該ｃＤＮＡをｐＪＯ２０１のＥｃｏＲＩ
部位に挿入することにより、このｃＤＮＡの翻訳読み取
り枠をラムダファージクローン中にあるがままに維持し
た。ｐＪＯ２０１発現ベクター中のサブクローンを、４
−３Ｂ１．１、４８−１Ａ１．１、６６−３Ａ１．４
９、７０−３Ａ１．３７及び７８−１Ｃ１．１７とし
た。タマリンＴ−１０３４、Ｔ−１０４８及びＴ−１０
５１由来の回復期血清（１：１００希釈物）を含むこれ
らのｃＤＮＡを発現する培養物から調製されたＥ．ｃｏ
ｌｉ溶解物の免疫ブロット分析（実施例１３におけるよ
うな）により、各ＣＫＳ融合タンパク質について予測さ
れたサイズのタンパク質との特異的免疫学的反応性が示
された（データは示していない）。該ｃＤＮＡそれぞれ
のＤＮＡ配列を決定したが、これらのクローンはＨＧＢ
Ｖ−Ｂウイルス（配列番号１１）の配列とほぼ１００％
の配列同一性を有していることが見いだされた。４−３
Ｂ１．１インサート（配列番号１２及び１３）の配列
は、その全体は決定されなかったが、配列決定部分は、
塩基対６８３４−７４５８由来のＨＧＢＶ−Ｂ（配列番
号１１）中の配列部分との９９．５％の配列同一性を示
す。クローン４−３Ｂ１．１から得られた配列との同一
性を示すＨＧＢＶ−Ｂ（配列番号１１）配列のこの領域
は、＋１読み取り枠に翻訳され、配列番号１４として配
列リストに示されている。４８−１Ａ１．１インサート
（配列番号１５）の配列は、塩基対４５２３−４７５２
由来のＨＧＢＶ−Ｂ（配列番号１１、実施例９を参照さ
れたい）の配列の部分との１００％配列同一性を示す。
配列番号１５に対応するＤＮＡ配列は＋１読み取り枠に
翻訳され、配列番号１６として配列リストに示されてい
る。６６−３Ａ１．４９インサート（配列番号１７）の
配列は、クローン４８−１Ａ１．１の配列と実質的に１
００％の配列同一性を示し、従って、配列リストにはタ
ンパク質翻訳は示さない。７０−３Ａ１．３７インサー
ト（配列番号１８）の配列は、塩基対６４５０−６７３
２由来のＨＧＢＶ−Ｂ（配列番号１１）の配列の部分と
１００％の配列同一性を示すが、但し、ＨＧＢＶ−Ｂ配
列（配列番号１１）の塩基６６３０−６６３２に対応す
る３つの塩基対がかけている。配列番号１８に対応する
ＤＮＡ配列は＋２読み取り枠に翻訳され、配列番号１９
として配列リストに示されている。７８−１Ｃ１．１７
インサート（配列番号２０）の配列は、クローン７０−
３Ａ１．３７の配列と１００％の配列同一性を示し、従
って、配列リストにはタンパク質の翻訳は示さない。こ
れらのデータは、ラムダｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリー
から分離されたｃＤＮＡクローンがＨＧＢＶ病原体のゲ
ノムから誘導され、該ライブラリーがＧＢ感染タマリン
由来の血清によって免疫学的に特異的に認識されたポリ
ペプチドをコードすることを示している。クローン４８
−１Ａ１．１（「クローン４８」）４−３Ｂ１．１、６
６−３Ａ１．４９、７０−３Ａ１．３７及び７８−１Ｃ
１．１７は、前記のAmerican Type Culture Collection
に寄託されている。
【０２０２】実施例５．ＨＧＢＶクローンのＤＮＡ配列
分析 実施例３で得られたユニーククローンをキット形態〔Se
quenase（登録商標）バージョン2.0, USB〕のジデオキ
シヌクレオチド鎖停止法（Sangerら, 前出）を用いて配
列形態した。これらの配列はオーバーラップしておら
ず、クローン４（配列番号２１）、クローン２（配列番
号２２）、クローン１０（配列番号２３）、クローン１
１（配列番号２４）、クローン１３（配列番号２５）、
クローン１６（配列番号２６）、クローン１８（配列番
号２７）、クローン２３（配列番号２８）、クローン５
０（配列番号２９）及びクローン１１９（配列番号３
０）として配列リストに示されている。クローン４、
２、１０、１１、１３、１６、１８、２３、５０及び１
１９はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託されている。クローン２
はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５５６、クローン４は
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５５７、クローン１０は
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５５８、クローン１６は
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５５９、クローン１８は
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５６０、クローン２３は
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５６１、クローン５０は
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５６２、クローン１１は
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９６１３、クローン１３は
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９６１１、及びクローン１
１９はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９６１２が付与され
た。
【０２０３】配列は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Alts
chulら, J. Mol. Biol. 215:403-410[1990]）を用い
て、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで検索した。これらの
配列はいずれもＧｅｎＢａｎｋでは見つからなかった
が、これは、これらの配列がまだ文献において特性分析
されていないことを示している。該ＤＮＡ配列は６つの
可能な読み取り枠に翻訳され、配列リスト（配列番号２
１は配列番号３１〜３６に、配列番号２２は配列番号３
７〜４２に、配列番号２３は配列番号４３〜４８に、配
列番号２６は配列番号４９〜５４に、配列番号２７は配
列番号５５〜６０に、配列番号２８は配列番号６１〜６
６に、配列番号２９は配列番号６７〜７２に翻訳する）
に示されている。配列番号２４は配列番号７３（実施例
９に記載）に含まれ、配列番号７４〜７９に翻訳されて
いる。配列番号２５〜３０は配列番号８０（実施例９に
記載）に含まれ、配列番号８１〜８６に翻訳されてい
る。ＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Gishら, Nature Genet
ics 3:266-272 [1993]）を用い、翻訳された配列をＳＷ
ＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースの検索に用いた。ここで
も、これらの配列はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴでは見つから
ず、それは、これらの配列がまだ文献において特性分析
されていないことを示している。
【０２０４】ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＦＡＳＴ
ｄｂアルゴリズムを用いて相同体を検索すると、肝炎の
Ｃウイルスと低くはあっても幾分かの配列類似性が示さ
れる（以下の表７）。特に、クローン４（配列番号３
５）、１０（配列番号４４）、１１（ＧＢ−４の残基１
〜１６６、枠３〔配列番号７６〕）、１６（配列番号５
０）、２３（配列番号６５）、５０（配列番号７０及び
７２）並びに１１９（ＧＢ−Ａの残基９１２〜９８８、
枠３〔配列番号８３〕）の翻訳は、アミノ酸レベルでの
種々のＨＣＶ分離体に対する２４．１〜４５．１％の範
囲の相同性がある。特に重要なのは、クローン１０（配
列番号４４）の翻訳体が、ＨＣＶの推定ＲＮＡ依存性Ｒ
ＮＡポリメラーゼに対してわずかな相同性を示したこと
である。他の正鎖ウイルスの推定ＲＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼ中に存在する保存アミノ酸（Jiangら, PNAS
90:10539-10543 [1993]）とクローン１０（配列番号４
４）の推定アミノ酸翻訳体との比較により、他のＲＮＡ
依存性ＲＮＡポリメラーゼの保存アミノ酸残基もクロー
ン１０（配列番号４４）中に保存されていることが明ら
かになった。これには、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー
ゼの正準（canonical）ＧＤＤ（Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ）シグネチャー配列が含まれている。従って、クロー
ン１０（配列番号４４）は、ウイルス性ＲＮＡ依存性Ｒ
ＮＡポリメラーゼをコードするものと思われる。驚くべ
きことには、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いた場合、
クローン１０（配列番号４４）のみが、ヌクレオチドレ
ベルでＨＣＶとの配列相同性を示した。アミノ酸レベル
で低いＨＣＶ相同性を有するクローン４（配列番号２
１）、１６（配列番号２６）、２３（配列番号２８）及
び５０（配列番号２９）並びに１１９（配列番号３０）
は、ＧｅｎＢａｎｋの検索において、ＢＬＡＳＴＮでは
検出されなかった。さらに、クローン２（配列番号３７
〜４２）、１３（配列番号２５及び３７〜４２）並びに
１８（配列番号２７及び５５〜６０）は、上記のＧｅｎ
Ｂａｎｋ又はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴＯで検索した場合
に、ＨＣＶに対する有意なヌクレオチド又はアミノ酸相
同性は、下記のように示さなかった。
【０２０５】
【表７】 実施例６．ＨＧＢＶクローンの外因性 ＨＧＢＶクローンは、正常又はＨＧＢＶ感染タマリン肝
臓ＤＮＡ、正常なヒトリンパ球ＤＮＡ、酵母ＤＮＡ又は
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡには検出されなかった。これは、サ
ザン法によりＨＧＢＶクローン２（配列番号２２）及び
１６（配列番号２６）について示された。さらに、全Ｈ
ＧＢＶクローンをゲノムＰＣＲで分析して、タマリン、
ヒト、酵母及びＥ．ｃｏｌｉゲノムに関するＨＧＢＶ配
列の外因性起源を確認した。これらのデータは実施例５
に記載のＨＧＢＶ配列のウイルス性性質と一致してい
る。
【０２０６】Ａ．サザンブロット法分析 ＨＧＢＶ感染タマリン及び正常なタマリンの肝臓ホモジ
ネートを低速ペレット化してタマリンの肝臓の核を得た
（以下に記載）。販売業者に指示されたように市販のキ
ット（USB cat.#73750）を用いて核からＤＮＡを抽出し
た。タマリンＤＮＡを抽出過程の間にＲＮａｓｅで処理
した。ヒト胎盤ＤＮＡ（Clontech, PaloAlto, CA）、酵
母ＤＮＡ（Saccharomyces cerevisiae, Clontech）及び
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡ（Sigma）を市販源から得た。
【０２０７】販売業者の指示に従って各ＤＮＡ試料をＢ
ａｍＨＩ（NEB）で消化した。消化されたＤＮＡ（１０
μｇ）及びＲＮＡ産物（実施例３Ｂからそれぞれ０．５
μｇずつ）を１％アガロースゲル上で電気泳動させ、Sa
mbrookらにより記載（ｐｐ．９．３４ｆｆ）のようにＨ
ｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブラン（Amersham, Arli
ngton Heights, IL）にキャピラリーでブロットした。
ＤＮＡをメンブラン販売業者により指示されたようにア
ルカリ処理してメンブランに固定した。メンブランをＲ
ａｐｉｄ Ｈｙｂ溶液（Amersham）中、６５℃で３０分
間プレハイブリダイズした。
【０２０８】ＨＧＢＶ配列の放射線標識プローブをＰＣ
Ｒにより調製した。１×ＰＣＲ緩衝液II（Perkin Elme
r）、２ｍＭのＭｇＣｌ2、２０μＭのｄＮＴＰ、それぞ
れ１μＭのクローン特異性センス及びアンチセンスプラ
イマー（クローン２については、配列番号８７及び８
８；クローン４については、配列番号８９及び９０；ク
ローン１０については、配列番号９１及び９２；クロー
ン１６については、配列番号９３及び９４；クローン１
８については、配列番号９５及び９６；クローン２３に
ついては、配列番号９７及び９８；クローン５０につい
ては、配列番号９９及び１００）、１ｎｇのＨＧＢＶク
ローンプラスミド（実施例３〔Ｅ〕に記載）、６０μＣ
ｉα−32Ｐ−ｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び
１．２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ポリメラ
ーゼ（Perkin Elmer）を用いて５０μｌのＰＣＲを形成
した。反応材料を、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒及
び７２℃で３０秒インキュベートして、合計３０サイク
ルの増幅を行い、次いで７２℃で３分間最終延長した。
組み込まれなかった標識を、販売業者に指示されたよう
にＱｕｉｃｋ−Ｓｐｉｎ（登録商標）Ｇ−５０スピンカ
ラム（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）によ
り除去した。プレハイブリダイズしたメンブランに添加
する前にプローブを変性させた（９９℃、２分）。
【０２０９】プレハイブリダイズしたメンブラン（２×
１０6ｄｐｍ／ｍｌ）に、放射線標識したプローブを加
え、Ｒａｐｉｄ Ｈｙｂ（登録商標）販売業者に指示さ
れたように、フィルターを６５℃で２．５時間ハイブリ
ダイズした。ハイブリダイズしたメンブランを、緩やか
な厳格さ（１×ＳＳＣ、６５℃で０．１％ＳＤＳ）で洗
浄し、次いで増感板を用い、−８０℃で７２時間オート
ラジオグラフフィルムに暴露した。これらの条件は、類
似の放射線標識プローブを用いて単一コピーの遺伝子を
検出するために考案された。 結果は、クローン２（配
列番号２２）及びクローン１６（配列番号２６）配列
が、正常又はＨＧＢＶ感染タマリンの肝臓由来のＤＮＡ
（それぞれ図１５及び図１６、レーン１Ｂ及び３Ｂ）、
ヒトＤＮＡ（図１５及び図１６、レーン１Ａ）、酵母Ｄ
ＮＡ（図１５及び図１６、レーン２Ａ）又はＥ．ｃｏｌ
ｉＤＮＡ（図１５及び図１６、レーン３Ａ）にハイブリ
ダイズしなかったことを示している。さらに、ドライバ
ーアンプリコンＤＮＡ（図１５及び図１６、レーン４
Ａ、実施例２．Ｂ．に記載の予備ＨＧＢＶ接種されたタ
マリン血漿から誘導された）の場合にもハイブリッド形
成は全く検出されなかった。対比的に、テスターアンプ
リコン（図１５及び図１６、レーン６Ａ、実施例２．Ｂ
に記載の総核酸抽出及び逆転写ステップを用いた感染性
ＨＧＢＶタマリン血漿から誘導された）及び３回の控除
／選択的増幅の産物（それぞれ１回目、２回目及び３回
目の控除／選択的増幅からの産物に関する図１５及び図
１６、レーン７Ａ、８Ａ及び４Ｂ）の場合には強力なハ
イブリッド形成シグナルが認められた。これらのデータ
は、ＨＧＢＶクローン２（配列番号２２）及び１６（配
列番号２６）が感染源から増幅された核酸配列中に検出
され、ＨＧＢＶクローン２（配列番号２２）及び１６
（配列番号２６）が、タマリン、ヒト、酵母又はＥ．ｃ
ｏｌｉゲノムＤＮＡ配列からは誘導されないことを示し
ている。
【０２１０】Ｂ．ゲノムのＰＣＲ分析 さらにＨＧＢＶ配列の外因性を示し且つそれらのウイル
ス起源を支持するために、タマリン、ヒト、酵母及び
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行っ
た。前出のJ. Sambrookらによる記載のようにして、 正
常なタマリンの腎臓及び肝臓組織由来のＤＮＡを合成し
た。酵母、アカゲザルの腎臓及びヒト胎盤ＤＮＡをClon
otechから得た。Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡはSigmaから得た。
【０２１１】販売業者に指示されたように主としてPerk
in-Elmer-Cetus製のＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）試薬を
用いてＰＣＲを行った。各１００μｌの反応材料に対し
て３００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いた。ＨＧＢＶクロー
ン化配列（クローン２については、配列番号８７及び８
８；クローン４については、配列番号８９及び９０；ク
ローン１０については、配列番号９１及び９２；クロー
ン１６については、配列番号９３及び９４；クローン１
８については、配列番号９５及び９６；クローン２３に
ついては、配列番号９７及び９８；クローン５０につい
ては、配列番号９９及び１００）由来のＰＣＲプライマ
ーを０．５μＭの最終濃度で用いた。ＰＣＲを３５サイ
クル（９４℃で１分；５５℃で１分；７２℃で１分）行
い、次いで、７２℃で７分の伸長サイクルを行った。Ｐ
ＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、臭化
エチジウムを用いて核酸を直接染色した後で紫外線照射
するか及び／又はサザン法によりニトロセルロースフィ
ルターへトランスファーした後で放射線標識プローブに
ハイブリダイズして視覚化した。実施例６Ａに記載のよ
うにしてプローブを形成した。Digene（Belstville, M
D）製のＦａｓｔ−Ｐａｉｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中でフィルターを３〜５時間プ
レハイブリダイズし、次いで１００−２００ｃｐｍ／ｃ
ｍ2を用い、４２℃で１５〜２５時間Ｆａｓｔ−Ｐａｉ
ｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中
でハイブリダイズした。G.G. Schlauderら, J. Virol.
Methods37:189-200 (1992)に記載のようにしてフィルタ
ーを洗浄し、 増感板を用い、−７０℃で１５〜７２時
間、Ｋｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍａｔ−ＡＲフィルムに暴露し
た。
【０２１２】図１７は、臭化エチジウム染色した１．５
％アガロースゲルを示している。図１８は、クローン１
６（配列番号２６）由来の放射線標識プローブにハイブ
リダイズした後の同一ゲルからのサザンブロット法によ
るオートラジオグラムを示す。正常なタマリン肝臓及び
腎臓ＤＮＡに０．０５ゲノム当量（レーン１７及び１
８）でスパイクされたクローン１６（配列番号２６）配
列を検出することは可能であるにも拘わらず、クローン
１６（配列番号２６）配列は、その外因性と一致して、
ゲノムＰＣＲ分析により、タマリン（図１７及び図１
８、レーン９及び１０）、アカゲザル（レーン１１）又
はヒトゲノムＤＮＡ（レーン１２）中にも、酵母又は
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡ（データは示さず）中にも検出され
なかった。さらに、ヒトドーパミンＤ１レセプター遺伝
子由来のプライマー、１０００−１０１９塩基対（セン
スプライマー）及び１５３３−１５５２塩基対（アンチ
センスプライマー）（GenBankアクセス番号：X55760、
R.K. Sunaharaら, Nature 347:80-83[1990]）は、霊長
類ゲノムＤＮＡ（タマリン腎臓、タマリン肝臓、アカゲ
ザル及びヒトのＤＮＡに対応する図１７、レーン２、
３、４及び５、）由来のドーパミンＤ１レセプターＤＮ
Ａを首尾よく増幅し、それは、低コピー数（即ち、単一
コピー）配列を検出するこの方法の有用性を示してい
る。レーン１及び８は、それぞれドーパミンＤ１レセプ
ター及びクローンの１６プライマー（配列番号９３及び
９４）に対するＨ2Ｏ対照である。レーン６は、ドーパ
ミンレセプタープライマーで増幅した１００ｆｇのクロ
ーン１６（配列番号２６）プラスミドＤＮＡを含む。レ
ーン１４、１５、１６及び２０は、それぞれ１、３、１
０及び１００ｆｇのクローン１６（配列番号２６）プラ
スミドＤＮＡを含む。レーン７及び１９はマーカーであ
る。上記のクローン２、４、１０、１８、２３及び５０
に特異的なＰＣＲプライマーを用いて類似の結果を得た
（データは示さず）。クローン２（配列番号２２）、４
（配列番号２１）、１０（配列番号２３）、１８（配列
番号２７）、２３（配列番号２８）及び５０（配列番号
２９）はこの時点では結果が出ていない。しかし、クロ
ーン４（配列番号２１）、１０（配列番号２３）、１８
（配列番号２７）及び５０（配列番号２９）配列は、タ
マリン、ヒト、酵母及びＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ（アカゲザ
ルは試験しなかった）には検出されず、これは、これら
の配列が試験したゲノムＤＮＡ源に対して外因性であ
り、これらの配列のウイルス起源を支持するものである
ことを示している。
【０２１３】実施例７．タマリン血清におけるＨＧＢＶ
配列の存在 接種前及び急性期Ｔ−１０５３血漿のＨＧＢＶクローン
配列の存在をＰＣＲにより調べた。ＨＧＢＶゲノムはＤ
ＮＡ又はＲＮＡであり得るので、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣ
Ｒを行った。特に、全核酸を実施例３（Ａ）に記載のよ
うにして血漿から抽出した。実施例６（Ｂ）に記載のよ
うにして当量の５μｌの血漿核酸に対してＰＣＲを行
い、主として製造者の指示に従いPerkin-Elmer-Cetus製
のＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡ ＰＣＲキットを
用いて、ＰＣＲ中１μＭ濃度のプライマー（クローン２
については、配列番号８７及び８８；クローン４につい
ては、配列番号８９及び９０；クローン１０について
は、配列番号９１及び９２；クローン１６については、
配列番号９３及び９４；クローン１８については、配列
番号９５及び９６；クローン２３については、配列番号
９７及び９８；クローン５０については、配列番号９９
及び１００）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ランダム
ヘキサマーを用いてｃＤＮＡ合成を開始した。
【０２１４】ＰＣＲ産物の臭化エチジウムによる染色及
びハイブリッド形成により、急性期Ｔ−１０５３血漿に
は、ＨＧＢＶクローン配列２（配列番号２２）、４（配
列番号２）、１０（配列番号２３）、１６（配列番号２
６）、１８（配列番号２７）、２３（配列番号２８）及
び５０（配列番号２９）が存在したが、予備接種Ｔ−１
０５３血漿には存在しないことが示された（データは示
さず）。さらに、ＨＧＢＶクローン２（配列番号２
２）、４（配列番号２１）、１０（配列番号２３）、１
８（配列番号２７）、２３（配列番号２８）及び５０
（配列番号２９）配列は、タマリンＴ−１０５３に注入
されたＨＧＢＶ接種材料であるＨ２０５中に検出するこ
とができた（実施例ＩＢ参照）。これらの結果を表８に
要約する。
【０２１５】
【表８】 ＨＧＢＶクローン配列は急性期血漿においてＲＴ−ＰＣ
Ｒによってのみ検出されたことに留意されたい。ＨＧＢ
Ｖクローン配列が、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換するための
逆転写段階後に初めてＰＣＲにより急性期血漿中に検出
されたという事実は、これらのクローンのあるものとＨ
ＣＶ分離体との低い相同性、及びＨＧＢＶクローン１０
（配列番号２３；実施例５）のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリ
メラーゼ中に認められた保存アミノ酸をコードする配列
の存在と共に、ＨＧＢＶがＲＮＡウイルスであることを
示唆している。
【０２１６】ＨＧＢＶクローン１６配列（配列番号２
６）を有するタマリン血漿パネルのＲＴ−ＰＣＲ分析を
行って、実験的にＨＧＢＶに感染させた他の個体中のＨ
ＧＢＶクローン１６（配列番号２６）の存在を確認し
た。先に記載（G.G. Schlauderら, J. Virological Met
hods 37:189-200 [1992]）のようにして、Ｈ２０５の接
種材料で実験的に感染させる前と感染させた後で得られ
たタマリン由来の血漿２５μｌから核酸を分離した。エ
タノールで沈殿させた核酸を３μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ2
Ｏに再懸濁した。主として製造業者の指示に従って、Pe
rkin-Elmer-Cetus製のＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡ ＰＣＲキ
ットを用いて、ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲを行った。ラン
ダムヘキサマーを用いてｃＤＮＡ合成を開始した。得ら
れたｃＤＮＡをクローン１６プライマー（配列番号９３
及び９４）を用い、０．５μＭの最終濃度でＰＣＲにか
けた。ＰＣＲを３５サイクル（９４℃で１分；５５℃で
１分；７２℃で１分）行い、次いで７２℃で７分間延長
サイクルを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳
動により分離し、核酸を臭化エチジウムで直接染色した
後で紫外線照射するか、及び／又は実施例６Ｂに記載の
ようにサザンブロット法によりニトロセルロースフィル
ターにトランスファーした後で放射線標識したプローブ
にハイブリダイズして視覚化した。
【０２１７】図１９は、臭化エチジウム染色した１．５
％アガロースゲルを示す。図２０は、クローン１６（配
列番号２６）由来の放射線標識プローブにハイブリダイ
ズした後の同一ゲルからのサザンブロット法によるオー
トラジオグラムを示す。Ｈ2Ｏ及びヒトの正常血清がレ
ーン１及び２に示されている。レーン３、１９及び２０
はマーカーである。レーン４、８、１２及び１６は非感
染タマリン血清由来であり、レーン６、１０、１４及び
１８は感染タマリン血清由来である。これらの結果は、
ＨＧＢＶクローン１６配列（配列番号２６）が、タマリ
ンＴ−１０５３の外に、ＨＧＢＶに感染した他の個体に
も検出されたが、非感染個体には検出されなかったこと
を示している。５匹のＨ２０５感染動物由来の急性期血
清をテストした。クローン１６配列（配列番号２６）
は、これらの動物の中の３匹〔レーン１０、Ｔ−１０４
９、接種後１４日目（ｄｐｉ）；レーン１４、Ｔ−１０
５１，２８ｄｐｉ；レーン１８、Ｔ−１０５５、１６ｄ
ｐｉ〕由来の血清中に検出された。クローン１６配列
（配列番号２６）は、５匹の動物（レーン４、Ｔ−１０
４８；レーン８、Ｔ−１０４９；レーン１２、Ｔ−１０
５１；レーン１６、Ｔ−１０５５；Ｔ−１０５７は示さ
ず）のいずれの接種前血清からも検出されなかった。こ
れらの結果は、クローン１６配列（配列番号２６）が感
染性ＨＧＢＶ病原体由来であり得ることを示唆してい
る。５種の急性期血漿中の２種（レーン６、Ｔ−１０４
８、２８ｄｐｉ；Ｔ−１０５７、１４ｄｐｉ、図示せ
ず）に、クローン１６配列（配列番号２６）が不在であ
ることは、タマリンにおけるＨＧＢＶ感染の急性分解性
質とあいまったクローン１６ＲＴ−ＰＣＲの比較的低い
感受性（クローン１６配列（配列番号２６）の約≧１０
００コピーを検出し得ると想定される）から説明し得
る。従って、２匹の陰性動物由来の急性期血漿は、用い
られたＲＴ−ＰＣＲアッセイの検出レベルを下回るＨＧ
ＢＶのタイターを含み得る。これら２匹の動物がクロー
ン４（配列番号２１）に対して陽性であったというＲＴ
−ＰＣＲによる観察結果（実施例１４）は、１つのウイ
ルス（クローン４を含む）のＲＮＡ配列の存在及び第２
のウイルス（クローン１６を含む）由来の検出可能なＲ
ＮＡ配列の不在を反映している可能性がある。
【０２１８】実施例８．感染タマリンの肝臓におけるHG
BV配列のノーザンブロット分析 HGBVクローン配列が、急性期タマリン血漿中でのRT−PC
R とH205接種とにおいて検出できたことにより、これら
の配列がHGBVゲノムを起源とする可能性が高まった。さ
らに別のRT−PCR 検査によって、H205感染タマリン T−
1053から抽出した肝臓RNA にHGBV配列が存在することが
実証された（データは示されていない）。従って、HGBV
ゲノムのサイズを知るために、H205感染及び非感染タマ
リンの肝臓RNA とのノーザンブロット分析を行った。RN
A 単離キット(Stratagene, La Jolla, CA)をその推奨使
用法に従って用い、H205感染タマリン T−1053の肝臓
1.25 g と対照非感染タマリン T−1040の肝臓 1.0 gと
から全細胞RNA を抽出した。全RNA(30μg)を、0.6Mホル
ムアルデヒドを含む1%アガロースゲルを通して電気泳動
し(R.M. Fourney らFocus 10:5−7,[1988]) 、更に、上
記の通りに20×SCC(pH7.0) 中で毛管作用によってHybon
d−N ナイロン膜(Amersham)に移した。J.Sambrookら,Mo
lecular Cloning− A Laboratory Manual, 第２版(198
9)。そのRNA を上記ナイロン膜に対してUV架橋し、上記
ナイロン膜を真空炉内で80℃で60分間焼き付けた。PIPE
S 0.05M とリン酸ナトリウム50mMとNaCl 100 mM とEDTA
1mMとSDS 5%とを含む溶液25ml中で、60℃で２時間、こ
のブロットに前ハイブリッド形成させた。G.D. Virca
ら,Biotechniques8:370 −371 (1990)。放射能標識化DN
A プローブとのハイブリッド形成の前に、上記溶液を取
り除き、新鮮な溶液 10 mlを加えた。ハイブリッド形成
に使用したプローブは、クローン４ (配列番号21; 221
bp) とクローン 50(配列番号29; 337 bp) とヒトβ−ア
クチンに対応する2000bp cDNAだった。P. Gunning, らM
ol. and Cell. Biol. 3:787−795 (1983)。ランダムプ
ライマー標識化キット(Stratagene, La Jolla, CA)を推
奨使用法に従って用い、 [α−32P]dATPの存在下でプロ
ーブ(50ng)を放射能標識化した。各プローブの比放射能
は約109 cpm/μg だった。ブロットを60℃で16時間ハイ
ブリッド形成させ、上記の通りに洗浄し(G.D. Virca
ら、前出）、−80℃で Kodak X−Omat−ARフィルムに対
して露出した。得られたオートラジオグラフの写真を図
21Aに示した。レーン1 とレーン3 とレーン5 は、 T−1
040からの肝臓RNA を含み、レーン2 とレーン4 とレー
ン６は、 T−1053からの肝臓RNA を含む。レーン1 とレ
ーン2 は、ヒトβ−アクチンcDNAプローブとハイブリッ
ド形成し、レーン3 とレーン4 はクローン4 プローブ
(配列番号21) とハイブリッド形成し、レーン5とレーン
6 はクローン50プローブ (配列番号29) とハイブリッド
形成した。露出時間は、レーン1 とレーン2 とが−80℃
で5 時間であり、レーン3 からレーン6までが−80℃で5
6時間であった。28S リボゾームRNA の位置と18S リボ
ゾームRNA の位置は矢印で示されている。これらのリボ
ゾームRNA の相対サイズは、各々6333ヌクレオチドと23
66ヌクレオチドである。J. Sambrook ら、前出。
【０２１９】クローン4 プローブ (配列番号21) とクロ
ーン50プローブ (配列番号29) は、感染タマリン(T−10
53) の肝臓から抽出したRNA 中に含まれるRNA 種とハイ
ブリッド形成した (図21A 、レーン4 とレーン6)。この
ハイブリッド形成可能なRNA種のサイズは、28S リボゾ
ームRNA と18S リボゾームRNA と比べての相対移動度に
基づいて約8300ヌクレオチドと計算された。上記両プロ
ーブは同一のRNA 種とハイブリッド形成したと考えられ
る。上記両プローブは非感染タマリン(T−1040) の肝臓
から抽出したRNA とはハイブリッド形成しなかった (図
21A 、レーン3とレーン5)。これらの結果は、クローン4
(配列番号21) 配列とクローン50 (配列番号29) 配列と
が同じ8.3Kb 転写物内に存在していることを示してい
る。
【０２２０】HGBV RNAゲノムの鎖形成度(strandedness)
を知るために、鎖特異性(Strand-specific) 放射能標識
化DNA プローブを、Perkin−Elmer からの GeneAmp（登
録商標） PCRキットを推奨使用法に従って用い、非対称
PCR によって調製した。精製クローン50 DNA (配列番号
29) を、クローン50に陰性な鎖特異性プライマー (配列
番号99) 又はクローン50に陽性な鎖特異性プライマー
(配列番号100)のどちらかを含む別々の反応の中で、 1
μM の最終濃度となるよう鋳型として使用した。この反
応混合物は、こうした反応混合物中に通常含まれるdATP
の代わりに、 {α32P −dATP](Amersham; 3000Ci/mmol)
を含んでいた。上記鋳型を30回線形増幅した後に、非取
込み [α32P −dATP] を Quick−Spin（登録商標） Sep
hadex G50スピンカラム(Boehringer −Mannheim，India
napolis, IN) を推奨使用法に従って用い、取り除い
た。二重鎖クローン50 DNA (配列番号29) の10倍ずつ希
釈した液を含むDNA ドットブロットに放射能標識化プロ
ーブをハイブリッド形成させ、上記両プローブが概ね同
等の感度を有することを認めた（データは示していな
い）。上記の通りに非感染タマリン T−1040から抽出し
た肝臓RNA と感染タマリンT−1053から抽出した肝臓RNA
とを合計で30μg 含むRNA ブロットと共に、放射能標
識化プローブをハイブリッド形成させた。得られたオー
トラジオグラフの写真を図21B に示す。レーン1 とレー
ン3 は T−1040からの肝臓RNA を含み、レーン2 とレー
ン4 は T−1053からの肝臓RNA を含む。レーン1 とレー
ン2 はクローン50に陽性な鎖プローブと共にハイブリッ
ド形成し (即ち、陽性鎖が放射能標識化され、陰性鎖を
検出した：配列番号100)、レーン3 とレーン4 はクロー
ン50に陰性な鎖プローブと共にハイブリッド形成した
（即ち、陰性鎖が放射能標識化され、陽性鎖を検出し
た：配列番号99）。ブロットを−80℃で18時間露出し
た。28S リボゾームRNA の位置と18S リボゾームRNA の
位置とが矢印で示されている。
【０２２１】図21B に示すように、クローン50に陽性及
び陰性な鎖プローブ（各々配列番号100 と99）は、感染
タマリン T−1053の肝臓から抽出した約8.3 キロベース
のRNA 種とはハイブリッド形成した（図21B 、レーン２
とレーン４）が、非感染タマリン T−1040の肝臓から抽
出したRNA とはハイブリッド形成しなかった（図21B、
レーン１とレーン3 ）。これは、上記で示したクローン
4(配列番号21) 及びクローン50 (配列番号29) 二重鎖プ
ローブを使用して得られたノーザンブロット結果と一致
していた。より強いシグナルがクローン50に陰性な鎖プ
ローブ (配列番号99) を用いて得られた（図21B 、レー
ン4 対レーン2 ）ことは、感染タマリンの肝臓中に存在
する優勢なRNA 種が陽性（即ち、コード化）鎖であるこ
とを示唆していた。
【０２２２】実施例９．HGBVクローン配列の伸長 Ａ． HGBV配列の生成 既述の実施例3 の通りに得られ且つ実施例５の通りに配
列決定されたクローンの各々は、HGBVゲノムの別々の領
域から得られたと考えられた。従って、既に同定したク
ローンの間に残るHGBVゲノムの別の領域から配列を得る
ために、及び、そのRNA クローンの配列を確認するため
に、幾つかのPCR 移動実験(PCR walkingexperiment)を
行った。
【０２２３】全核酸を実施例3(A)で説明した通りに感染
T−1053血漿の50μl アリコートから抽出した。簡単に
言えば、沈殿した核酸をDEPC処理した H2O 10μl 中に
再懸濁させた。 GeneAmp（登録商標） RNA PCRキット(P
erkin −Elmer)で推奨使用法に従って標準RT−PCR を行
った。簡潔に言えば、2mM MgCl2と 1μM プライマーに
よる抽出核酸のランダム感作逆転写反応のcDNA生成物に
対して、PCR を行った。反応物に対して35サイクルの変
性−アニーリング−伸長（94℃、30秒；55℃、30秒；72
℃、 2分）を行い、その後で72℃で３分間の伸長を行っ
た。アガロースゲル分析の前に反応物を 4℃に維持し
た。これらの生成物を慣用手法によりpT7Blue T−ベク
タープラスミド(Novagen）の中にクローン化した。表９
は、上記反応を行った時に得られた結果を表している。
【０２２４】
【表９】 Sorensenら(J. Virol, 67:7118−7124[1993]) によって
説明されているPCR 移動手法を変形した方法を、追加HG
BV配列を得るために使用した。簡単に述べると、全核酸
を感染タマリン T−1053血漿から抽出し、逆転写した。
得られたcDNAを、MgCl22mMを使用したことを除いてはSo
rensenら（前出）の手順と同様に、50μl PCR 反応物(P
CR 1) 中で増幅した。これらの反応物に対して35回の変
性−アニーリング−伸長（94℃、30秒；55℃、30秒；72
℃、 2分）を行い、その後72℃で３分間の伸長を行っ
た。Sorensenら（前出）が説明している通りに、ストレ
プタビジンで被覆した常磁性ビーズ(Promega) を使用し
てビオチニル化生成物を単離した。Sorensenらが説明し
ている通りに、合計で20〜35回の変性−アニーリング−
伸長し、ストレプタビジンで精製した生成物に対して
「入れ子(nested)」PCR(PCR 2)を行った。得られた生成
物と、それらを生成するために使用したPCR プライマー
とを表10に示す。
【０２２５】
【表１０】 これらの生成物を、慣用手法により低融点アガロースゲ
ルから単離し、pT7 Blue T−ベクタープラスミド(Novag
en) の中にクローン化した。
【０２２６】上記の通りに、ウイルスゲノムRNA から5'
末端配列を得るために、RNA リガーゼ仲介5' RACE(cDNA
末端の高速増幅：R apidA mplification of c DNA E nd
s)を使用した。簡単に述べると、5' AmpliFINDER（登録
商標） RACE キット(Clontech, Palo Alto, CA) を推奨
使用法に従って使用した。ウイルスRNA の供給源は、上
記の通りに抽出した急性期 T−1053血漿であった。逆転
写（RT）のために使用した個々のウイルス種に固有のオ
リゴヌクレオチドと、第１のPCR 増幅(PCR 1)と第２のP
CR 増幅(PCR 2) とを、表11に示す。結合アンカープラ
イマーとその相補的PCR プライマーは上記製造者から提
供を受けた。GeneAmp RNA PCR キット(Perkin Elmer)を
使用して推奨使用法に従ってPCR を行った。
【０２２７】
【表１１】 RNA リガーゼ仲介5' RACE によって生成された生成物
を、上記の通りに低融点アガロースゲルから単離し、pT
7 Blue T−ベクタープラスミド(Novagen) の中にクロー
ン化した。
【０２２８】．０HGBV−B 配列の5'末端と3'末端とにお
ける別の配列を得るために（下記の「HGBV内の２種類の
HCV 様フラビウイルスの存在の証拠」を参照された
い）、RNA環化実験(RNA circularization experiment)
を行った。（この方法は、C.W. Mandlら(1991) Biotech
niques, Vol 10 (4): 485 −486 に説明されている方法
に基づいている。）（沈殿中にtRNAをグリコーゲン 1μ
g で置き換えたことを除いてH205接種後14日目の） T−
1057血漿50μl から全核酸を精製した。核酸ペレットを
DEPC処理した水16.3μl の中に再溶解し、 2×TAP 緩衝
液(1×=50 mM NaOAc、pH 5.0、1 mM EDTA 、10mM 2−メ
ルカプトエタノール、 2mM ATP)25 μl と、タバコ酸ピ
ロホスファターゼ（20 単位; Sigma) 8.7μl とを加え
た。混合物を37℃で60分間温置した。（水で飽和させ
た）フェノールを使用し更にクロロホルムを使用して試
料を抽出し、グリコーゲン(1μg)の存在下でNaOAc/EtOH
を用いて沈殿させた。そのペレットをDEPC水83μl 中に
溶解し、10×RNA リガーゼ緩衝液(New England Biolab
s, NEB)10μl とRNase インヒビター(Perkin Elmer) 2
μl とT4 RNAリガーゼ(NEB)5μl とを加えた。混合物を
4℃で16時間温置した。上記と同様にフェノールを使用
し更にクロロホルムを使用して試料を抽出し、NaOAc/Et
OHを用いて沈殿させた。
【０２２９】Superscript RT (GIBCO/BRL)をその推奨使
用法に従って使用し且つ配列番号146 をプライマーとし
て用いる逆転写酵素(RT)反応で、結合RNA の1/10を使用
した。RT反応混合物の半分を、ビオチニル化オリゴヌク
レオチドプライマー (配列番号146)と第２のオリゴヌク
レオチドプライマー (配列番号133)との存在下でPCR1の
ために上記の通り使用した。Sorensenら（前出）の通り
にストレプタビジン被覆磁性ビーズを使用して、PCR1生
成物を反応混合物から精製した。精製したPCR1生成物
（30μl の中から 2μl ）をPCR2のための鋳型として使
用した。オリゴヌクレオチドプライマー (配列番号147,
154)を使用するPCR2によって、1200 bp 生成物を得、こ
の生成物をpT7 Blue T−ベクタープラスミドの中にクロ
ーン化し、下記の通りに配列決定した。この実験からの
２つの独立したクローンの配列分析によって、（一方の
クローンが18個のT 残基の配列を有し、他方のクローン
が27個のT 残基の配列を有したが）既知の配列と重複す
る領域では100%の同一性を示し、さらに追加の塩基270
個の新たな配列とが明らかになった。
【０２３０】上記環化実験は、標準的な3'−RACE手法又
は5'−RACE手法では得られなかったHGBV−B ウイルスゲ
ノムの5'末端と3'末端の両方からの配列を与えた。しか
し、新たに得られた配列から設計したプライマーを使用
して行った別のPCR 実験の後でさえ、正確な5'−3'結合
部を発見することは困難だった。従って、HGBV−B RNA
ゲノムの5'末端をより適切に定性するために、 T−1053
の肝臓から単離したRNA を使用してプライマー伸長実験
を行った。
【０２３１】実施例７で説明した通り、 T−1053の肝臓
と対照( 即ち、非感染）動物(T−1040) の肝臓とから全
細胞RNA を単離した。アンチセンスオリゴヌクレオチド
(配列番号155)を、T ４ポリヌクレオチドキナーゼ(NE
B) を使用して約9.39×107CPM/μg の比放射能にγ−32
P −ATP で末端標識化した(Sambrook ら）。プライマー
を別々の反応において T−1053肝臓RNA と T−1040肝臓
RNA との30μl にアニーリングし、上記(Sambrook ら）
の通りにMMLV逆転写酵素(Perkin −Elmer)を使用して伸
長した。生成物を6%シークエンシングゲル上で分析し
た。プライマー伸長のために使用したプライマーと同一
のプライマーを使用したHGBV−B 環化クローンの１つか
ら生成したシーケンスラダー(sequence ladder) が、サ
イズ標準としての役割を果たした。176bp のプライマー
伸長生成物を T−1053から得た。非感染動物(T−1040)
から抽出した肝臓RNA を使用したプライマー伸長では、
こうした生成物は得られず、従って、HGBV−B ゲノムか
ら得られた生成物を示した。得られたこれらの生成物の
長さは、感染動物の肝臓内に存在するそれのような上記
ゲノムの5'末端が、AUG 開始コドンから442 ヌクレオチ
ド長だけ上流に位置することを示した。
【０２３２】上記環化実験で得られた配列の3'位置を確
認するために、予測される3'末端に対応するプライマー
を使用してRT−PCR を行った（表２の反応1.25を参照さ
れたい）。配列番号156 と配列番号157 とを使用した
（上記の通りの）感染 T−1053血漿のRT−PCR では450b
p の生成物が得られた。これとは対照的に、配列番号15
7 の相補と配列番号147 とを使用するRT−PCR では、検
出可能なPCR 生成物が得られなかった（データは示して
いない）。これらのデータは上記ゲノムの3'末端がポリ
T系の50ヌクレオチド長下流に位置することを示唆して
いる。
【０２３３】表9 、表10、表11と上記RNA 環化実験とか
らのクローン化生成物を、実施例５で既に説明した通り
に配列決定した。興味深いことに、反応1.4 、1.6 、1.
9 、1.10、1.11のクローン化生成物がその末端において
上記２つのプライマー配列の一方だけしか含まないこと
が発見され、このことは、これらの生成物が、誤ったラ
ンダムな合成開始事象(priming event) の結果として生
じたことを示唆していた。PCR ／配列決定実験によっ
て、生成物1.4 、1.6 、1.9 、1.10、1.11中で検出した
配列が、クローン４ (配列番号21) 及び／又はクローン
50 (配列番号29)とに関連付けられた。加えて、反応の
各々から得られた配列は、HCV との同一性が限定されて
いた。従って、これらの生成物は、PCR 生成物の一方の
末端における誤った合成開始(priming) の結果ではあっ
ても、真正のHGBV配列を含むと考えられた。反応1.14か
ら得られた生成物も誤った合成開始の結果であると考え
られた。この場合に、配列番号160 の相補が、反応1.14
から得た生成物の5'末端に発見された (図22、GB−B)。
GB−A 内にある配列番号161 から配列番号160 が得られ
ているので、このことは予想外であった。しかし、反応
1.14から得た生成物と反応2.8 から得た生成物との間の
配列の同一性が、別のPCR ／配列決定実験（データは示
していない）と共に、反応1.14が真正HGBV配列を含むこ
とを実証した。配列番号160 の相補が配列番号162 の上
流にあって、GB−B 配列に対してPCR プライマーとして
働くのに十分な同一性を有することが明らかである。
【０２３４】上記の表9 と表10と表11とに示した生成物
から得られた配列と、上記RNA 環化実験から得られた配
列とを、GCG Package (Version 7) プログラムを使用し
てコンティグ(contig)の形にアセンブルした。このアセ
ンブルしたコンティグの概要を図22に示す。GBコンティ
グA(GB−A)は長さ9493bpであり、その全てが配列決定さ
れており、配列番号163 に示す。GB−A は、クローン２
(配列番号22) とクローン16 (配列番号26) とクローン
23 (配列番号28) とクローン18 (配列番号27)とクロー
ン11 (配列番号24) とクローン10 (配列番号23) とを含
む。配列番号163 は３つの読み可能枠に翻訳され、配列
番号164 −392 としての配列表の形で示されている。GB
コンティグB(GB−B)は9143 bp であり、配列番号393 に
示す。GB−B(配列番号393)は、クローン４ (配列番号2
1) とクローン50 (配列番号29) とクローン119(配列番
号30) とクローン13 (配列番号25) とを含んでいる。配
列番号393 は１つの開放読み枠に翻訳され、配列番号39
6 、397 として配列表の形で示されている。5'末端と3'
末端とからのUTR の各々を６つの読み枠に翻訳すること
が可能である。
【０２３５】Ｂ． HGBV内の２種類のHCV 様ウイルスの
存在に関する証拠 １． ２つの互いに異なったRNA 種を表すGB−A とGB−
B との証拠 GB−A(配列番号163)及びGB−B(配列番号393)とHCV −1
(GenBank accession#M67463)との比較によって、GB−A
(配列番号163)及びGB−B(配列番号393)と HCV−1 とが
全て異なった配列であることを示す。GB−A(配列番号16
3)及びGB−B(配列番号393)とHCV −1 との核酸配列のド
ットプロット分析を、GCG Package(Version 7)を使用し
て行った。21のウィンドウサイズと14のストリンジェン
シー(stringency)とを使用して、GB−A(配列番号163)及
びGB−B(配列番号393)と HCV−1 とが互いに明らかに異
なったヌクレオチド配列を含むことが発見された（図2
3）。従って、GB−A(配列番号163)及びGB−B(配列番号3
93)は、HCV の異なる株又は遺伝子型を表すものではな
く、互いに異なる株又は遺伝子型を表すものでもない。
この分析によって、限定されたヌクレオチド同一性を有
する短い領域が、GB−A(配列番号163)とGB−B(配列番号
393)のNS3 様配列とNS5b様配列との中に、並びにHCV の
NS3 配列とNS5b配列の中に発見された。しかし、推定上
のNTP 結合へリカーゼとRNA 依存性RNA ポリメラーゼの
各々がNS3 とNS5bとに対応し、これが全てのフラビウイ
ルス中に保存されているので、上記領域内のヌクレオチ
ド同一性は驚くには値しない（下記参照）。GB−A(配列
番号163)とGB−B(配列番号393)が別々のRNA 分子を表
し、これらが同じRNA 分子の別々の領域でもないという
ことが、5' RACE 実験（上記）によって実証され、（実
施例８で説明した）ノーザンブロットデータによって立
証された。最初に、5' RACE 実験によって、GB−A(配列
番号163)とGB−B(配列番号393)との5'末端がそれぞれ異
なることが示された。RNA 分子の5'末端は１種だけだか
ら、GB−A(配列番号163)とGB−B(配列番号393)とは別々
のRNA 分子を表す。第２に、クローン４とクローン50
（両方ともGB−B[配列番号393]から得られた配列番号2
1、29、実施例８を参照されたい）を用いてノーザンブ
ロット法によって感染タマリンの肝臓RNA 中に検出され
た8300塩基のRNA 分子は、GB−B(配列番号393 、9143 b
p)のサイズに概ね一致した。GB−A とGB−B とが同一の
RNA 分子のそれぞれ一部であるとすれば、少なくとも1
7,000個の塩基を有するノーザンブロット生成物がなけ
ればならない。これらのデータは、GB−A(配列番号163)
とGB−B(配列番号393)とが、HCV の変形でもなく又は互
いの変形でもない、２つの互いに異なったRNA 分子のヌ
クレオチド配列であることを示す。
【０２３６】T−1053のノーザンブロット分析とPCR 調
査によれば、GB−A(配列番号163)とGB−B(配列番号393)
とにそれぞれ対応する２つのRNA 種は、 T−1053の肝臓
中に相等しい含量で存在するわけではないことが判明し
た。上記のように、いずれもGB−B(配列番号393)から得
られたクローン４とクローン50（各々配列番号21、29)
が、（実施例8 で説明した通り） T−1053の感染肝臓中
に存在する8.3 kb RNA種とハイブリッド形成した。これ
とは対照的に、いずれもGB−A(配列番号163)から得られ
たクローン２ (配列番号22) とクローン10 (配列番号2
3) とクローン16(配列番号26) とクローン23 (配列番号
28) は、同一の実験において T−1053肝臓RNA とのハイ
ブリッド形成を全く示さなかった（データは示していな
い）。加えて、クローン4 PCR とクローン16 PCRとが同
等の感度を有することがプラズミド鋳型を使用して実証
された（データは示していない）にもかかわらず、クロ
ーン16 PCRは、エチジウム染色によって T−1053肝臓RN
A から生成されたcDNA上において、クローン４PCR に比
べて著しく少ない生成物しか生成しなかった。これは、
動物を犠牲にした時点で T−1053血漿中において発見さ
れた状況とは対照的だった。 T−1053血漿RNA から生成
されたcDNA上におけるクローン４(GB −B(配列番号393
) に特異的）PCR とクローン６(GB −A(配列番号163)
に特異的）PCRに関するPCR 滴定実験は、相等しい量のG
B−A(配列番号163)RNA とGB−B(配列番号393)RNA とが
T−1053血漿中に存在することを示唆した (実施例4 、
E.2)。従って、GB−A(配列番号163)RNA とGB−B(配列番
号393) RNA とが T−1053血漿中に相等しい含量で存在
していたにもかかわらず、動物を犠牲にした時点の T−
1053肝臓中には、GB−A(配列番号163)RNA よりも多い量
のGB−B(配列番号393)RNAが存在すると考えられた。こ
れらの結果はさらに、 T−1053血漿中にGB−A(配列番号
163)とGB−B(配列番号393)とに対応する２つの互いに異
なったRNA 分子が存在することの更に別の証拠であり、
これらのRNA が必ずしも感染タマリン肝臓RNA 中に相等
しい含量で存在するわけではないということを示唆し
た。従って、GB−A(配列番号163)とGB−B(配列番号393)
とが単一のウイルスゲノムの別々のセグメントを形成す
るとは考え難い。
【０２３７】２． GB−A(配列番号163)とGB−B(配列番
号393)とが２つの互いに異なるウイルスのゲノムを表す
ということの証拠 感染力(infectivity) とPCR の検討により、GB−A(配列
番号163)とGB−B(配列番号393)のウイルス性質に関する
証拠が得られる。具体的には、濾過(0.1μm)されて10-4
に希釈された又は濾過されずに10-5に希釈された T−10
53血漿を接種されたタマリン T−1049とタマリン T−10
51は、いずれもクローン４(GB −B[配列番号393]）配列
とクローン16(GB −A[配列番号163]）配列の両方に関し
て陽性だった。接種の前は、これらの動物は二匹ともク
ローン４とクローン16とに対して陰性だった（実施例
４、E.4 、E.5 ）。従って、GB−A とGB−B とに対応す
る急性相 T−1053血漿中に含まれる２つのRNA 種を、濾
過し、希釈して、他の動物に当該のGB−A(配列番号163)
とGB−B(配列番号393)とのウイルスに予期される性質を
維持するよう継代接種することが可能だった。GB−A と
GB−B とが別個のウイルス粒子からのRNA 分子を表すこ
とは、H205接種タマリンのPCR 調査によって明らかにな
った。具体的には、H205接種後にRT−PCR によって４匹
のタマリンが全てクローン4(GB−B[配列番号393]）に対
して陽性になった。これとは対照的に、４匹のH205接種
タマリンの内の１匹(T−1053) だけがクローン 16(GB−
B[配列番号163]）に対して陽性になったにすぎなかった
（実施例4 、E.2 ）。従って、GB−A(配列番号163)配列
は T−1048と T−1057と T−1061には本当に存在しない
と仮定し、且つ、クローン16 PCRの結果が陰性であるこ
とが感染力の低さに起因するわけではないと仮定する
と、GB−B(配列番号393)配列に対応するウイルス（即
ち、肝炎GBウイルスB[HGBV−B]）が、GB−A(配列番号16
3)配列とは無関係に単独で継代接種されうると考えられ
た。 T−1057からのHGBV−B のみの試料を、更に２回継
代接種した（実施例４）。これらの動物では、GB−A(配
列番号163)配列はRT−PCR によって検出されなかった。
加えて、これらの動物において肝臓酵素のレベルが有意
に上昇するとされており（実施例4 ）、このことは、HG
BV−B だけでもタマリンに肝炎を発症せしめることを示
した。GB−B(配列番号393)配列が検出限界未満のタマリ
ンにおいて、GB−A(配列番号163)配列が確認された。具
体的には、GB−B のみの動物(T−1048、 T−1057、 T−
1061）に T−1053血漿で誘導すると、クローン16に特異
的なRT−PCR によって検出されるような、GB−A(配列番
号163)のみのウイルス血症が発症した。 T−1057からの
GB−A のみの血漿を更に１回継代接種した（実施例
４）。従って、GB−A(配列番号163)配列に対応するウイ
ルス（肝炎GBウイルス A[HGBV −A]）はHGBV−B とは無
関係に単独で複製するものと考えられた。HGBV−B の不
在下でHGBV−A の継代接種を更に続けている。現在まで
のところ、HGBV−A がタマリンの肝炎を引き起こすか否
かは判明していない。しかし、 T−1053誘導タマリンに
HGBV−A ウイルス血症を伴う肝臓酵素のレベル上昇がな
いことや、 T−1057からのHGBV−A のみの血清を継代接
種しても肝臓酵素のレベル上昇のないことは、タマリン
におけるHGBV−B の肝好性とは対照的である。
【０２３８】急性相 T−1053血漿中の２種類のウイルス
の存在は、H205接種物に基づくと考えられる。具体的に
は、実施例７のデータは、クローン16（配列番号26、GB
−A[配列番号163]からのもの）が７匹の検査対象タマリ
ンからの接種前の血漿中にはいずれにも存在しなかった
ことを示した。加えて、クローン2 、10、18、23（各々
配列番号22、23、27、28、全てGB−A[配列番号163]から
のもの）も、検査したHGBV接種タマリン血漿の何れにお
いても検出されなかった（実施例７）。接種前のタマリ
ンの血漿をクローン4 とクローン50（各々配列番号21、
29、全てGB−B[配列番号393]からのもの）に関して検査
した時にも、同様の陰性の結果が得られた。従って、HG
BV−A とHGBV−B はいずれも接種前のタマリンの血漿中
に存在しなかった。これに対し、上記クローンの全て
（即ち、GB−A[配列番号163]からのクローン2 、10、1
6、18、23と、GB−B[配列番号393]からのクローン4 、5
0）が、H205接種物中に検出された（表７）。興味深い
ことに、T −1053肝臓から作られたcDNA（上記）に見ら
れるように、H205からランダムに合成開始された同一の
cDNAを使用した場合に、GB−A(配列番号163)中の幾つか
の別々のPCR 標的は全て、GB−B(配列番号393)中の同様
のPCR 標的の場合よりも生成物が少なかった（データは
示していない）。従って、当初のGB接種物であるH205中
には、HGBV−A 及びHGBV−B が存在すると結論付けられ
た。しかし、H205中にはHGBV−A よりも多くのHGBV−B
が含まれると考えられる。H205接種物中のHGBV−A が相
対的に少ないことが、H205接種後に４匹のタマリンの中
の１匹だけがHGBV−A に対して陽性であったこと (実施
例４、E.2)の理由と考えられる。
【０２３９】３．HGBV−A とHGBV−B とがフラビウイル
ス科(Flaviviridae)に属することの証拠 実施例５で説明したGB−A(配列番号165 −268 、270 −
384 ，386 −392)の３つの枠翻訳生成物とGB−B(配列番
号397)とをSWISS −PROTデータベースで検索すると、HC
V の様々な菌株との、限定されてはいるが顕著なアミノ
酸配列の相同性を示した。GB−A(配列番号164)とGB−B
(配列番号393)とからの翻訳生成物は、様々なHCV 単離
物（即ち、NS2 、NS3 、NS4 、NS5 ）の非構造タンパク
領域に対して最も近いホモロジーを示した。例えば、図
24に示されるように、フラビウイルスの推定上のNTP 結
合ヘリカーゼドメインにおける保存残基（＊で表す）
（図24A ）と、全てのウイルス性RNA 依存性RNA ポリメ
ラーゼのRNA 依存性RNA ポリメラーゼドメインにおける
保存残基（＊で表す）（図24B ）は、同様に HCV−１ N
S3及びNS5b（SWISS −PROT accession number p26664)
と、GB−A(配列番号390)及びGB−B(配列番号397)の予期
される翻訳生成物のいずれにも保持されていた。（Choo
ら, PNAS 88:2451−2455 [1991] とDomierら, Virology
158:20 −27 [1987] を参照されたい。）従って、GB−
A ウイルスとGB−B ウイルスとはいずれも機能NTP 結合
ヘリカーゼ(functional NTP −binding helicase) とRN
A 依存性RNA ポリメラーゼとをコードすると考えられ
た。しかし、GB−A(配列番号390)とGB−B(配列番号397)
は、その間に完全なアミノ酸同一性があるわけではな
く、及び／又は、HCV NS3 及びNS5bの他の領域内におい
てHCV とも完全なアミノ酸同一性がない。具体的には、
図24A に示されるNS3 の残基200 個に亙って、GB−A(配
列番号390 、残基1252−1449) ウイルスとHCV −１ (配
列番号398)は47％同一であり、GB−B(配列番号397 、残
基1212−1408) ウイルスとHCV −１ (配列番号398)は55
％同一であり、GB−A(配列番号390 、残基1252−1449)
ウイルスとGB−B(配列番号397 、残基1212−1408) ウイ
ルスは43.5％同一だった。加えて、図24B に示されるNS
3 の残基 100個に亙って、GB−A(配列番号390 、残基26
44−2739) ウイルスと HCV−１ (配列番号398)は36％同
一であり、GB−B(配列番号397 、残基2513−2612) ウイ
ルスとHCV −１ (配列番号398)は41％同一であり、GB−
A(配列番号390 、残基2644−2739) ウイルスとGB−B(配
列番号397 、残基2599−2698)ウイルスは44％同一だっ
た。HCV と比較した場合に、GB−A(配列番号390)とGB−
B(配列番号397)との他の推定上の非構造遺伝子にも、ホ
モロジーは比較的低かった。Genbank に登録された種々
のHCV 配列と比較しても、GB−A ウイルスとGB−B ウイ
ルスとの推定上の非構造タンパク質のホモロジーの全体
的レベルは、GB−A(配列番号164)とGB−B (配列番号39
3)の両方はフラビウイルス科の２つの互いに異なったメ
ンバーから得られることを示唆している。フラビウイル
ス類は、１つのNTP 結合ヘリカーゼドメインと１つのRN
A 依存性RNA ポリメラーゼドメインとに対応する単一の
ゲノムRNA 分子を含む。推定上のRNA ヘリカーゼドメイ
ンと推定上のRNA 依存性RNA ポリメラーゼドメインとを
各々に含む２つのコンティグの存在は、急性相 T−1053
血漿中の２つのHCV 様フラビウイルスの存在と一致する
ものである。
【０２４０】実施例10．PCR HGBVとC 型肝炎ウイルスとの配列相関性を検出するため
に、PCR に基づく実験を次のように行った。様々な位置
的起源からのHCV 単離体(Cha, T.−A.ら, J. Clin. Mic
robiol. 29:2528 −2534[1991]) において高度に保存さ
れている、HCVゲノムの5'−非翻訳領域(UTR) 配列に基
づくPCR プライマー(J.H. Han, PNAS 88:1711 −1715
[1991])を、H205感染タマリン T−1053肝臓RNA におけ
る類似の配列を検出するために使用した。実施例8Aで説
明した通りに、全細胞RNA を感染タマリン T−1053の肝
臓と非感染タマリン(T−1040) の肝臓とから抽出した。
Perkin−Elmer から入手可能なキットを使用し、その推
奨使用法に概ね従って、各RNA の試料30μg を逆転写し
PCR 増幅した。HCV 5'−UTR の塩基 249−268 を含むア
ンチセンスプライマー（プライマー１）を上記逆転写酵
素反応に使用した。プライマー１と、HCV 5'−UTR の塩
基13−46を含むプライマー（プライマー２）とを、介在
配列のPCR 増幅のために使用した。サーモサイクリング
(thermocycling) の条件はCha ら（前出）による。H205
感染タマリン T−1053のHCV 5'−UTR 配列の検出感度を
増大させるために、上記PCR 反応に対して、「入れ子」
PCR プライマーを使用した第２の増幅反応を生じさせ
た。そのためのプライマーは、HCV5'−UTR 内における
上記プライマー１の配列と上記プライマー２の配列との
間にある配列から得た。プライマー３はHCV 5'−UTR の
塩基47−69からの配列を含み、アンチセンスプライマー
であるプライマー４はHCV 5'−UTR の塩基 188−210を
含んでいた。この「入れ子」PCR 反応では、第１のPCR
反応からのPCR 生成物（反応体積合計100 μl から2μl
）をDNA 鋳型源として使用した。アニーリング温度が6
0℃でなく55℃であったことを除いてサーモサイクリン
グ条件は上記と概ね同一だった。第２のPCR 反応で得ら
れたPCR 生成物を、アガロースゲル電気泳動と臭化エチ
ジウム染色とを使用して所期のDNA 生成物に関して分析
した。HCV 5'−UTR 配列に基づくこの所期のDNA フラグ
メントのサイズ（Han ら、前出）は、第１のPCR 反応の
生成物に関しては 253bpであり、入れ子PCR 反応の生成
物に関しては 163bpであった。所期サイズのPCR 生成物
が、実施例8Aで説明したHCV 感染チンパンジーの肝臓か
ら抽出した全細胞RNA 30μg を使用して行った対照実験
において得られ（データは示していない）、これは、こ
の実験手順でHCV の5'−UTR を検出できることを示す。
しかし、 T−1053肝臓 RNA 又は T−1040肝臓RNA の一
方を使用した場合には、どちらの所期生成物も、生じた
臭化エチジウム染色アガロースゲル上に発見できなかっ
た（データは示していない）。このように所期の結果が
得られなかったのは、(i) 上記試薬の5'−UTR の配列が
HCV のそれと大きく異なっていたために、使用したオリ
ゴヌクレオチドプライマーが効率的にアニールされず、
従って、PCR 増幅が不可能になったということ、又は、
(ii)上記試薬に5'−UTR が欠如していたということを示
唆する。どちらの場合にも、上記試薬のヌクレオチド配
列がHCV のそれと大きく異なっていることが、この結果
から推定される。
【０２４１】HCV の実験的感染の急性相中に得られたチ
ンパンジー血漿プールから核酸を実施例７で説明した通
り単離した(G.Schlauderら，J. Clin. Microbiology 2
9:2175−2179[1991]) 。クローン16プライマー (配列番
号93、94) を使用してRT−PCRを実施例７の通り行っ
た。これらのプライマーに関する所期サイズのバンド
は、臭化エチジウム染色によっても検出されず、クロー
ン16に特異的なプローブに対するハイブリッド形成後に
も検出されなかった（データは示していない）。こうし
た結果は、HCV に対するクローン16配列 (配列番号26)
の無関係性を立証する。
【０２４２】実施例11．他の肝炎ウイルスに対するHGBV
感染血清の反応性 H205接種物(T−1048、 T−1057、 T−1061) 又は T−10
53接種物(T−1051) を使用したHGBV接種の前と後に血清
標本を得、既知の肝炎ウイルスに接触した後に検出され
ることが多い抗体に関する検査を行った。A 型肝炎ウイ
ルスに対する抗体（本出願人から入手可能なHAVAB 検定
を使用）と、B 型肝炎コアの核タンパク質（本出願人か
ら入手可能な Corzyme（登録商標）検査を使用）と、E
型肝炎ウイルス(HEV) （本出願人から入手可能なHEV EI
A を使用）と、C 型肝炎ウイルス(HCV) （本出願人から
入手可能なHCV 第２世代検査を使用）とに関して、上記
標本を検査した。これらの検査は、各検査キットのパッ
ケージに同封された説明書に従って行った。★HGBV接種
の前と後のどちらにおいても、検査したタマリンは何れ
も、HCV 又はHEV に対する抗体に関して陽性ではなかっ
た（表12を参照）。従って、HGBV感染は、HCV 又はHEV
に対する検出可能な抗血清をもたらさなかった。
【０２４３】
【表１２】 上記タマリンの中の１匹(T−1061) は、HGBV接種の前と
後のどちらにおいてもHAV 抗体に対して陽性であり、こ
のことは、HAV に事前に罹患していたことを示唆した
（表9 、 T−1061）。しかし、他の３匹のタマリン(T−
1048、 T−1057、T−1051) は、HGBV接種後において、H
AV に特異的な抗体を全く示さなかった。従って、HGBV
感染は抗HAV 反応を生じさせない。上記タマリンの中の
１匹(T−1048) は、HGBV接種の前と後のどちらにおいて
もHBV 抗体に対して陰性だった。上記タマリンの中の２
匹(T−1061、 T−1057) は、HGBV接種の前に陽性だっ
た。上記タマリンの中の１匹(T−1051) は、HGBV接種の
前にはHBV 抗体に対して境界近くの陽性であったが、接
種後には陰性だった。こうしたデータに基づく限り、HG
BV試薬による感染がHBV 核に対する免疫反応を誘導する
という証明は得られない。総論的に言えば、これらのデ
ータは、HGBV試薬が独特(unique)なウイルス剤であり、
ヒト肝炎に関連した一般のウイルス性試薬の何れにも関
係しないことを実証した。
【０２４４】実施例12．HGBV感染肝臓のウェスタンブロ
ット分析 上記の実施例1 と実施例２とに示したように、HGBVを接
種したタマリンには肝臓酵素値の上昇が認められた。HG
BVが実際に肝臓向性ウイルスである場合には、ウイルス
タンパク質が感染肝臓細胞内で生成され、こうしたタン
パク質に対する免疫反応が生じることが推測される。こ
の実施例では、HGBV感染タマリンから得られた肝臓に特
有(unique)のタンパク質が現れ、このタンパク質がHGBV
感染後の回復期段階に得られたタマリン血清を使用する
ウェスタンブロットによって特異的に認識されるとすべ
き根拠を示す。
【０２４５】HGBV感染タマリン肝臓と様々な対照用のタ
マリン肝臓とチンパンジー肝臓とを賽の目に切り、Omni
−mixer ホモジナイザーを使用してPBS 中にホモジナイ
ズした(5mlに対して肝臓約1g) 。得られた懸濁液を、遠
心分離（10,000×g 、１時間、4 ℃）と、 5μm フィル
タと 0.8μm フィルタと0.45μm フィルタとを通す限界
濾過とによって清澄化した。この清澄化したホモジネー
トを、100S以上の全成分のペレット化を生じさせる条件
下で遠心分離した。ペレット（100S肝臓フラクション）
を少量の緩衝液中に溶解し、−70℃で貯蔵した。
【０２４６】標準的な方法と試薬（Laemmli 不連続ゲ
ル）を使用してSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動(P
AGE)を行った。100S肝臓フラクションを、SDS と 2−メ
ルカプトエタノールとを含む試料緩衝液中に1:20に希釈
し、 5分間95℃に加熱した。30〜45分間200 ボルトで12
% アクリルアミド又は 4→15% アクリルアミド線形勾配
ゲル(7cm×8cm)のいずれかによって上記タンパク質を電
気泳動した。標準の方法と試薬を使用して、タンパク質
をニトロセルロース膜に電気転写(electro−transfer)
した。
【０２４７】標準的な方法を使用してウェスタンブロッ
トを生じさせた。概略的に言えば、ニトロセルロース膜
をTBS/Tween 中で簡単にすすぎ、 4℃のTBS/CS（100mM
Tris、150mM NaCl、10mM EDTA 、0.18% Tween −20、4.
0%仔ウシ血清、pH 8.0）中で一晩封鎖した。上記ニトロ
セルロース膜をMulti −screen装置の中に入れ、 600μ
g の血清を上記装置の溝の中に入れ、その後2 時間室温
に維持し、一晩4 ℃で温置した。 Multi−screen装置か
ら上記ニトロセルロース膜を取り除き、TBS/Twee (50mM
Tris 、150mM NaCl、0.05% Tween −20、pH8.0 ）中で
５分間ずつ３回上記ニトロセルロース膜を洗浄した。そ
のニトロセルロース膜をヤギ抗ヒト：HRPO抱合体(0.2μ
g/ml TBS/CS)15ml中で室温で１時間温置した。上記の通
りに洗浄した後に、ニトロセルロース膜をTMB 酵素基質
溶液中に温置し、水ですすぎ、乾燥した。犠牲時（GB接
種12日後）に T−1053肝臓から単離して上記の通りに吸
収転写したタンパク質は、GB接種後５週目、６週目、７
週目、９週目、又は11週目から、 T−1057血清との反応
時に約50〜80kDa の見掛け分子量を有する独特な抗原性
タンパク質を示した。GB接種前又は接種３週後の T−10
57血清と反応させた時には、上記バンドは存在しなかっ
た。上記 T−1057血清の何れかと反応させた時に、上記
バンドは、非接種タマリン(T−1040) から得られた肝臓
タンパク質を含むレーン中には現れなかった。加えて、
他のGB接種後の血清（GB接種後11週目の T−1048と、GB
接種後 8週目の T−1051）に T−1053肝臓タンパク質を
反応させた時には、同一サイズ (50〜80kDa)のタンパク
質が現れたが、同じ上記動物から得た接種前血清と T−
1053肝臓タンパク質を反応させた時には、この同一サイ
ズのタンパク質は現れなかった。
【０２４８】他のGB接種タマリンからの肝臓組織中で、
又は、HCV もしくはHBV のいずれかに感染させたチンパ
ンジーの肝臓組織の中で、上記免疫反応性バンドが検出
されるかを調べるために、更に別のウェスタンブロット
実験を行った。各々の場合、肝臓タンパク質を含むニト
ロセルロースストリップを T−1048（GB接種後5 、8、1
6週目）と T−1051（GB接種後 8、12週目）とから得た
血清プールと反応させた。上記プール中では、５つの血
清を同等の割合で混合した。50〜80kDa の反応性タンパ
ク質バンドを、GB接種タマリン（GB接種後14日目に得た
T−1038、 T−1049、 T−1055と、GB接種後12日目に得
た T−1053）から得た全てのタマリン肝臓標本において
検出した。この免疫反応性バンドは、 T−1040（非接
種）から得た肝臓標本と、チンパンジー肝臓標本 (CHAS
−457(HCV 接種前) 、CHAS−457(HCV ＋) 、 CRAIG−45
4(HCV ＋) 、MUNA−376(HBV ＋))とにおいては検出でき
なかった。
【０２４９】以上総合して、これらのデータは、HGBV感
染タマリン肝臓に特異的に結合する、約50〜80kDa の見
掛け分子量を有する免疫原性及び抗原性タンパク質の存
在を実証するものだった。このHGBV関連タンパク質の性
質（即ち、ウイルスをコードするか又は宿主起源か）は
現在調査中である。HGBV関連タンパク質の起源に関係な
く、これらの結果は、HGBV感染がHGBV感染タマリン肝臓
中に存在する抗原に対する抗体反応を誘導する事実と整
合している。
【０２５０】実施例13．CKS に基づく免疫原性HGBV−A
及びHGBV−B ポリペプチドの発現と検出 Ａ． HGBV−A 及びHGBV−B 配列のクローン化 クローン化ベクターpJO200、pJO201、pJO202により、組
換えタンパク質を CMP−KDO シンセターゼ (CKS)タンパ
ク質に融合させた。これらのプラスミドの各々はプラス
ミドpBR322由来であるが、（E.coli CKSタンパク質を構
成する全体で 248個のアミノ酸の中の最初の 239個をコ
ードする）kdsB遺伝子フラグメントに融合した修飾ラッ
クプロモーターと、kdsB遺伝子フラグメントの末端に融
合した合成リンカーとを有する。この合成リンカーは、
遺伝子挿入に要する複数の制限部位と、翻訳停止シグナ
ルと、trpA rho依存性転写ターミネーターとを含んでい
た。このリンカー領域内の特有の制限部位は、5'から3'
方向に、EcoRI 、SacI、KpnI、SmaI、BamHI 、XbaI、Ps
tI、SphI、HindIIIを含んでいた。各々のプラスミド
は、上記複数のクローン化部位内のいずれの読み枠の中
へも挿入を可能にする。タンパク質合成のCKS 方法とCK
S ベクターは、本明細書に引例として組み入れられてい
る本出願人の米国特許第 5,124,255号に開示されてお
り、一方、検定フォーマットと検査キットとにおけるCK
S 融合タンパク質の使用は、本明細書に引例として組み
入れられている本出願人の米国出願番号No. 07/903,043
に開示されている。
【０２５１】表９と表10（実施例９）で説明した移動実
験 (walking experiment) から得られたHGBV−A 配列と
HGBV−B 配列を、表13と表14に示した制限酵素（10単
位、NEB ）を使用して適切な pT7Blue T−ベクタークロ
ーンから切り離し、実施例3Bで説明した通りに1%低融点
アガロースゲルから精製した。プラスミドpJO200、pJO2
01、pJO202を同一の制限酵素（10単位、NEB ）によって
消化し、細菌性アルカリフォスフォターゼ(GIBCO BRL,
Grand Island, NY) で脱リン酸した。精製したHGBVフラ
グメントの各々を、消化し脱リン酸したpJO200、pJO20
1、pJO202の中に結合させ、実施例3Bで説明した通りに
E. coli XL1 Blueに形質転換した。標準的なミニプレプ
(miniprep)分析によって、CKS/HGBV発現ベクターの形成
の成功を確認した。
【０２５２】別の２つのPCR 生成物を、特に発現のため
に準備した。これら２つの生成物は、4.1 、4.2 と表さ
れ、各々にHGBV−B コア領域とHGBV−A コア領域とをコ
ードすると予想された（図22参照）。実施例９で説明し
たように、PCR 生成物4.1 を、プライマーコア B−s と
プライマーコア B−a1 (配列番号708 、709)を使用して
作成し、PCR 生成物4.2 を、プライマーコア A−s とプ
ライマーコア2.2.1' (配列番号710 、138)を使用して生
成した。この4.1 センス及びアンチセンスプライマー
は、末端となるように意図したEcoRI 及びBamHI 制限部
位を各々に有した。上記のように、4.1PCR生成物を消化
し、ゲル単離し、pJO200、pJO201、pJO202に結合させ
た。 4.2PCR 生成物に関するセンスプライマーは、末端
となるように意図したEcoRI 制限部位を有するが、その
アンチセンスプライマーは制限部位を持たなかった。従
って、この生成物を、EcoRI によって切断し、ゲル単離
し、既にBamHI で消化したpJO200、pJO201、pJO202に結
合させ、DNA ポリメラーゼのクレノウフラグメントとdN
TPとで末端修飾し、EcoRI で消化し、当業界で公知のよ
うに細菌性アルカリフォスフォターゼで脱リン酸した。
【０２５３】Ｂ． HGBV−A 及びHGBV−B 配列の発現 トリプトン32gm/L、酵母抽出物20gm/L、NaCl 5gm/L、pH
7.4 、アンピシリン100mg/L 、グルコース3mM を含む媒
質中で振とうしながら、CKS/HGBV発現ベクターを含むE.
coli XL1 Blue培養物を37℃で生長させた。この培養物
が 1.0〜2.0 のOD600 に達した時に、修飾ラックプロモ
ーターからの発現を誘導するためIPTGを最終濃度1mM に
なるように加えた。更に３時間振とうしながら37℃で培
養物を生長させ、集菌した。細胞ペレットを SDS/PAGE
充填緩衝液（Tris pH6.8 62.5mM、SDS 2%、グリセロー
ル 10%、 2−メルカプトエタノール5%、ブロモフェノー
ルブルー0.1mg/ml）中に10のOD600 となるよう再懸濁さ
せ、５分間沸騰させた。調製した全細胞ライゼートのア
リコートを10% SDS −ポリアクリルアミドゲル上に施
し、40% メタノール／10% 酢酸中にクーマシーブルー染
料0.2%を含む溶液で着色し、更に、バックグラウンドが
透明になるまで16.5% メタノール／5%酢酸で脱色した。
【０２５４】全細胞ライゼートを第２の10% SDS −ポリ
アクリルアミドゲル上に施し、イムノブロット検定のた
めに電気泳動によってニトロセルロースに転写した。転
写されたタンパク質を含むニトロセルロースのシートを
室温で30分間封鎖溶液（Tris緩衝塩類液中の5%Carnatio
n 無脂肪ドライミルク）中に温置し、E. coli 細胞ライ
ゼートに対して予め封鎖されたヤギ抗CKS 血清中で室温
で１時間温置し、封鎖溶液中に1:1000に希釈した。この
ニトロセルロースシートをTris緩衝塩類液(TBS) で２回
洗浄し、その後アルカリホスファターゼ抱合ウサギ抗ヤ
ギIgG と共に室温で１時間温置し、封鎖溶液中で 1：10
00に希釈した。このニトロセルロースシートをTBS で２
回洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウム(nitroblue tet
razolium) と5 −ブロモ−4 −クロロ−3 −インドリル
ホスフェートとを含むTBS 中で発色させた。各フラグメ
ントに対する適切な読み枠を、適正な予想サイズの免疫
反応性CKS 融合タンパク質の発現に基づいて定め、ベク
ター挿入結合部分についてはDNA 配列決定によって確認
した。
【０２５５】上記フラグメント各々の適切な読み枠を決
定した後に、適切な構成要素を含む培養物からの試料
を、SDS −ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタ
ンブロットとによって分析した。図25A は、上記CKS 融
合タンパク質全細胞ライゼートを含む２つのクーマシー
染色10%SDS−ポリアクリルアミドゲルを示す。レーン１
とレーン16は、左に示されるキロダルトン単位の分子量
標準を含む。ゲル１（HGBV−A 試料）上の展開順序は次
の通りだった：レーン2 、クローン1.17誘導前：レーン
3 −15、クローン4.2 、クローン1.17、クローン1.8 、
クローン1.2 、クローン1.18 (配列番号390)、クローン
1.19、クローン1.20、クローン1.21、クローン1.22 (配
列番号390)、クローン2.12、クローン1.5 、クローン1.
23、クローン2.18、各々全て誘導３時間後。ゲル2 （HG
BV−B 試料）上の展開順序は次の通りだった：レーン1
7、クローン4.1 誘導前：レーン18−29、クローン4.1
、クローン1.15、クローン1.14、クローン2.8 、クロ
ーン1.13、クローン1.12、クローン2.1 、クローン1.7
、クローン1.3 、クローン1.4 、クローン1.16、クロ
ーン2.12、各々全て誘導３時間後。これらのタンパク質
を上記と同じ順序で２つの別の10％ゲル上に施し、上記
の通りにニトロセルロースに転写した。試料を、２匹の
回復期の T−1048、 T−1051からの血清のプールを使用
したウェスタンブロットで次のように分析した。上記試
料を含むニトロセルロースシートを封鎖溶液中に30分間
温置し、E.coliライゼート 10%と、XL1 −Blue/CKSライ
ゼート6mg/mlと、表６（実施例４）で説明した回復期タ
マリン血清プールの1:100 希釈液とを含む封鎖溶液に移
した。室温で一晩温置した後、上記ニトロセルロースシ
ートをTBS 中で２回洗浄し、HRPO−抱合ヤギ抗ヒトIgG
中に室温で１時間温置し、封鎖溶液中に1:500 に希釈し
た。ニトロセルロースシートをTBS 中で２回洗浄し、4
−クロロ−1 −ナフトール 2 mg/mlと過酸化水素 0.02%
とメタノール 17%とを含むTBS 中で発色させた。図25B
に示されているように、３つのHGBV−B タンパク質、ク
ローン1.4 、1.7 、4.1 のCKS 融合が、タマリン血清プ
ールとの免疫反応を示した。クローン1.7 は、HGBV−B
免疫原性領域をコードする配列 (配列番号610)を含み、
クローン1.4 は、同じ回復期タマリン血清プールを使用
したcDNAライブラリー（実施例４）のイムノスクリーニ
ングによって発見された、２つのHGBV−B 免疫原性領域
をコードする配列 (配列番号12、13、18) を含んでい
た。
【０２５６】上記のパラグラフで説明した試料も、軍医
GB(the surgeon GB)からの急性肝炎の発病後約３週目に
得られた回復期血清の1:100 希釈液を使用して、上記の
通りにウェスタンブロットによって分析した。HGBV−A
とHGBV−B とからの融合タンパク質の上記血清に対する
反応性を表13、14に示す。HGBV−B タンパク質では１つ
(2.1) だけがこの血清に対する反応性を示したが、この
反応性は非常に低く、一方、２つのHGBV−A タンパク質
(1.22[配列番号390]、2.17）はこの血清に対する高い反
応性を示した。これら２つのHGBV−A タンパク質は40個
のアミノ酸について共通であり、このことは、１個以上
のエピトープに対する反応性を反映している可能性があ
る。これら２つのHGBV−A タンパク質を、実施例16で説
明した通りのELISA 検定で使用するために選択した。第
11代継代接種GB材料(H205 GB pass 11) に感染したタマ
リンは、幾つかのHGBV−B エピトープに対して免疫反応
を示し、HGBV−A エピトープに対しては免疫反応を示さ
なかったが、最初のGB源からの血清は、少なくとも１つ
のGBV −A エピトープに対して著しい反応性を示したと
いうことは興味深い。このことは、HGBV−A が軍医GBに
おける肝炎の原因であった可能性を示唆した。
【０２５７】1.4 、1.7 、又は2.17 ELISAS （実施例1
5、16を参照されたい）によってCKS/HGBV−A 又はCKS/H
GBV−B 融合タンパク質の１つ以上に対する抗体の存在
を示した４つの別のヒト血清を、ウェスタンブロット分
析のために選択した。これらの血清の３つ（G1−41、G1
−14、G1−31）は西アフリカ「危険」集団からのもので
あり、４番目(341C)は、非 A−E 肝炎（エジプト）標本
（これらの集団の詳細な説明については実施例15を参照
されたい）からのものだった。上記のCKS 融合タンパク
質の中の幾つかからの全細胞ライゼートを別の10% SDS
−ポリアクリルアミドゲルに施し、上記の通りニトロセ
ルロースに転写した。これらのブロットの各々を上記の
通りに予め封鎖し、E. coli ライゼート 10%と XL1−Bl
ue/CKSライゼート 6 mg/mlとを含む封鎖緩衝液中に1:10
0 に希釈したヒト血清標本の１つと共に一晩温置した。
ブロットをTBS 中で２回洗浄し、HRPO抱合ヤギ抗ヒトIg
G と反応させ、上記の通りに発色させた。
【０２５８】CKS/HGBV−B タンパク質を上記血清の２つ
（G1−41、G1−14）を使用して分析し、その反応性を表
13に示した。タマリン血清に対して反応性を示した上記
３つのタンパク質に加えて、更に別の２つのタンパク質
(1.16、2.1)が２つのヒト血清のどちらか一方に対して
反応性を示した。CKS/HGBV−A タンパク質を、上記４つ
のヒト血清全てと分析し、これらの反応性を表14に示
す。GB血清に対して反応性を示した上記２つのタンパク
質に加えて、更に別の３つのタンパク質(1.5、1.18、1.
19) がヒト血清の１つ以上に対して反応性を示した。こ
れらのタンパク質の内の２つ（1.5 、1.18）を、実施例
16で説明する通りのELISA 検定に使用するために選択し
た。ウェスタンブロットによって及び／又は２つのHGBV
−A タンパク質（1.18、2.17）と１つのHGBV−B タンパ
ク質(1.7) とに対するELISA （実施例15、16）によって
反応性を示すG1−31血清が、GB−C 配列 (配列番号673
、残基2274−2640) がそれから単離された血清である
（実施例17）ということが特に興味深い。
【０２５９】
【表１３】
【０２６０】
【表１４】 実施例14．免疫反応性HGBV−A 及びHGBV−B タンパク質
のエピトープマッピング Ａ． HGBV−B タンパク質 1.7のエピトープマッピング 免疫原性領域の位置を確認するために、HGBV−B 免疫原
性タンパク質1.7 内の重複サブクローンを、実施例７で
説明した通り T−1053血清からのRT−PCR によって実施
した。各PCR プライマーは、制限酵素消化を容易にする
ために5'末端側に余分の６つの塩基を有しており、その
後にEcoRI 部位（センスプライマー）又はHindIII部位
（アンチセンスプライマー）のいずれかが続いた。加え
て、各アンチセンスプライマーはコーディング領域の直
後に終止コドンを含んでいた。消化後に、実施例13で説
明したように、各フラグメントをEcoRI/HindIII−消化p
JO201の中にクローン化した。実施例13で説明した通
り、CKS 融合タンパク質を発現させ、タマリン T−1048
/T−1051血清を使用したウェスタンブロットによって分
析した。 1.7−1 から 1.7−5 と称する５つの重複クロ
ーンを生成した。これらのクローンは、サイズがアミノ
酸 104〜110 個分の範囲にある1.7 タンパク質の領域を
コードしている。各クローンを生成するために使用した
PCR プライマーと、コードされたポリペプチドのサイズ
と、1.7 配列内の位置と、タマリン T−1048/T−1051血
清に対する反応性とを、表15に示す。cDNAライブラリー
（実施例４）のイムノスクリーニングによって発見され
た免疫原性領域（配列番号678 ）にまたがる、更に別の
２つの重複クローンを生成した。 1.7−6 と 1.7−7 と
称されるこれらのクローンの各々は、アミノ酸75個のポ
リペプチドをコードする。使用したPCR プライマーと、
コードされたポリペプチドのサイズと、1.7 配列内の位
置と、タマリン T−1048/T−1051血清に対する反応性と
を、表15に示す。アミノ酸 507個分の長さの1.7 タンパ
ク質の中に、２つの免疫原性領域を確認した。即ち、 N
末端付近の免疫原性領域は残基 1−105 の範囲内であ
り、上記タンパク質の中央付近の免疫原性領域は残基 1
85−410 の範囲内であった。これらの領域の各々の中に
単一のエピトープ又は複数のエピトープがあるかどうか
は、更に検討を要する。
【０２６１】Ｂ． HGBV−B タンパク質1.4 のエピトー
プマッピング 免疫原性領域の位置を確認するために、HGBV−B 免疫原
性タンパク質1.4 内の重複サブクローンを、 T−1053血
清からのRT−PCR によって実施した。各PCR プライマー
は、制限酵素消化を容易にするために5'末端側に余分の
６つの塩基を有しており、その後にEcoRI 部位（センス
プライマー）又はBamHI 部位（アンチセンスプライマ
ー）のいずれかが続いた。加えて、各アンチセンスプラ
イマーはコーディング領域の直後に終止コドンを含んで
いた。消化後に、実施例13で説明したように、各フラグ
メントを EcoRI/BamHI−消化pJO201の中にクローン化し
た。実施例13で説明した通り、CKS 融合タンパク質を発
現させ、タマリン T−1048/T−1051血清を使用したウェ
スタンブロットによって分析した。 1.4−1 から 1.4−
4 と称する４つの重複クローンを生成した。これらのク
ローンは、サイズがアミノ酸 137〜138 個の範囲にある
1.4 タンパク質の領域をコードしている。各クローンを
生成するために使用したPCR プライマーと、コードされ
たポリペプチドのサイズと、1.4 配列内の位置と、タマ
リン T−1048/T−1051血清に対する反応性とを、表15に
示す。cDNAライブラリー（実施例４）のイムノスクリー
ニングによって発見された免疫原性領域にまたがる、更
に別の２つの重複クローンを生成した。 1.4−5 と 1.4
−6 とで称されるこれらのクローンの各々は、アミノ酸
75個の長さのポリペプチドをコードする。使用したPCR
プライマーと、コードされたポリペプチドのサイズと、
1.4 配列内の位置と、タマリン T−1048/T−1051血清に
対する反応性とを、表15に示す。残基 129−393 を含む
アミノ酸 265個から構成される配列が、アミノ酸 522個
分の長さの1.4 タンパク質の中の免疫原性領域であると
確認した。ライブラリーのイムノスクリーニング（実施
例４）によって上記配列内に２つの非隣接免疫原性クロ
ーンを確認したので、少なくとも２つのエピトープが上
記領域内に存在する可能性がある。
【０２６２】Ｃ． HGBV−A タンパク質1.22 (配列番号
390)及び2.17のエピトープマッピング HGBV−A タンパク質1.22（配列番号390 ）と2.17 (配列
番号613)は、いずれもウェスタンブロットによってGB血
清との免疫反応を示した（実施例13）。これらの２つの
タンパク質はアミノ酸40個分だけ重なっているので、観
察された免疫反応は、１つのエピトープによるか、又は
２つ以上のエピトープの存在の結果として生じた可能性
がある。完全な1.22／2.17配列はアミノ酸 641個分の長
さだった。免疫原性領域を発見するために、この領域内
の重複サブクローンを T−1053からRT−PCR によって実
施した。各PCR プライマーは、制限酵素消化を容易にす
るために5'末端側に余分の６つの塩基を有しており、そ
の後に、EcoRI 部位（センスプライマー）、又は、1.22
／2.17−2 から1.22／2.17−6 に関してBamHI 部位（ア
ンチセンスプライマー）のいずれかが続いた。しかし、
クローン1.22／2.17−1 は内部EcoRI 部位を有するの
で、BamHI 部位がセンスプライマーとして使用され、Hi
ndIII部位がアンチセンスプライマーとして使用され
た。加えて、各アンチセンスプライマーはコーディング
領域の直後に終止コドンを含んでいた。消化後に、実施
例13で説明したように、各フラグメントをEcoRI/BamHI
−消化（又は、1.22／2.17−1 に関してはBamHI/HindII
I−消化）pJO201の中にクローン化した。実施例13で説
明した通り、CKS 融合タンパク質を発現させ、GB血清を
使用してウェスタンブロットによって分析した。このク
ローンはアミノ酸 115−116個分のサイズ範囲の1.22/2.
17 の領域をコードした。各クローンを生成するために
使用したPCR プライマーと、コードされたポリペプチド
のサイズと、HGBV−Aポリペプチド配列内の位置と、GB
血清に対する反応性とを、表15に示す。1.22/2.17 タン
パク質の中央では、免疫原性領域はアミノ酸 220個分の
長さの領域に狭まっていた。これは、1.22と2.17の間の
アミノ酸40個分の長さの重複領域を含み、従って、２つ
のタンパク質に共通する免疫反応は、共有している１つ
のエピトープによるか、又は複数のエピトープに起因し
ていた可能性がある。
【０２６３】
【表１５】 実施例１５．ＨＧＢＶ−Ｂの血清学的研究 Ａ．組換えタンパク精製手順 ＣＫＳ融合タンパクを発現する細菌細胞培養物を凍結
し、−７０℃で保存した。三つの構築物それぞれからの
細菌細胞を解凍し、リゾチームとＤＮアーゼを用いて粉
砕処理し、次いでフッ化フェニルメタンスルホニルおよ
びその他のプロテアーゼ阻害剤の存在下、超音波処理し
て個々の組換え抗原と大腸菌タンパクの混合物を得た。
三つの培養物それぞれについて、不溶性の組換え抗原を
遠心分離により濃縮し、一連の洗浄工程に付して非組換
え大腸菌タンパクの大部分を除去した。本プロトコール
で使用した洗浄液の構成は、蒸留水、５％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、および５０ｍＭのＴｒｉｓ（８．５）であ
った。得られた沈殿物をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）の存在下、溶解した。タンパク濃度を測定したあ
と、２−メルカプトエタノールを加え、混合物をセファ
クリルＳ３００樹脂を用いたゲル濾過カラムクロマトグ
ラフィーに付し、種々のタンパクをそのサイズによって
分別、分離した。各分画を集め、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。
この電気泳動で分離されたタンパクは、次いでクーマシ
ーブリリアントブルーＲ２５０で染色し、分子量が約７
５ｋＤ（ＣＫＳ−１．７／配列番号６１０）、８０ｋＤ
（ＣＫＳ−１．４／配列番号６１１）、４２ｋＤ（ＣＫ
Ｓ−４．１／配列番号６１２）に相当するタンパクの有
無を調べた。該当するタンパクを含有する分画をプール
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって再度調査した。
【０２６４】精製抗原を含有するプール分画の免疫原性
および構造の完全性を、実施例１３に記載の方法に従っ
てニトロセルロースに対する電子移動およびイムノブロ
ット法によって決定した。適当な陽性コントロールがな
かったため、組換えタンパクは、各融合タンパクのＣＫ
Ｓ部分に対するモノクローナル抗体との反応性によって
同定した。ＣＫＳ−１．７タンパク（配列番号６１０）
について、組換え抗原を検出すべく抗−ＣＫＳモノクロ
ーナル抗体を用いてウェスタンブロット法で調べると、
約７５ｋＤのところにシングルバンドが認められた。こ
の結果はＣＫＳ−１．７タンパク（配列番号６１０）の
予想サイズに一致している。ＣＫＳ−１．４タンパク
（配列番号６１１）については、抗−ＣＫＳモノクロー
ナル抗体によって６０ｋＤと７０ｋＤの間に四重のバン
ドパターンが検出された。観察されたこれらのバンドは
完全長タンパクについて予想された長さより短く、恐ら
く欠失されたものであろうと思われる。ＣＫＳ−４．１
タンパク（配列番号５２）をウェスタンブロット法で調
べると、抗−ＣＫＳモノクローナル抗体によって組換え
抗体が約４２ｋＤにおいてシングルバンドとして検出さ
れた。この結果はＣＫＳ−４．１タンパク（配列番号６
１２）について予想されたサイズと一致している。
【０２６５】Ｂ．ポリスチレンビーズの被覆手順 上記タンパクを透析し、以下に記載のように、これらの
タンパクのポリスチレンビーズ上での抗原性を評価し
た。これとは別に、三種の精製ＨＧＢＶ組換えタンパク
（ＣＫＳ−１．７／配列番号６１０、ＣＫＳ−１．４／
配列番号６１１、およびＣＫＳ−４．１／配列番号６１
２）のそれぞれを用いてＨＧＢＶに対する抗体を検出す
べく、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行っ
た。これらのタンパクで行ったＥＬＩＳＡをそれぞれ、
１．７ＥＬＩＳＡ（ＣＫＳ−１．７（配列番号６１０）
組換えタンパク使用）、１．４ＥＬＩＳＡ（ＣＫＳ−
１．４（配列番号６１１）組換えタンパク使用）、およ
び４．１ＥＬＩＳＡ（ＣＫＳ−４．１（配列番号６１
２）組換えタンパク使用）とする。最初の研究において
は、１／４インチのポリスチレンビーズを種々の濃度の
精製タンパクで被覆（約６０ビーズ／ロット）し、無接
種のタマリンからの血清を陰性コントロール、接種した
タマリンからの回復期血清を陽性コントロールとして用
いたＥＬＩＳＡ試験（下記）により評価した。その他の
コントールとして、種々の肝炎ウイルスに対して陰性と
判定された個体から得たヒト血清のプールを含めた。追
加の陽性コントロールは、ビーズの被覆効率をモニター
するためのＣＫＳタンパクに対するモノクローナル抗体
であった。陰性コントロールシグナルに対する陽性コン
トロールシグナルの比が最も高くなるようにビーズの被
覆条件を選択し、ビーズ被覆プロセスのスケールアッセ
イに用いた。四つのＥＬＩＳＡ試験のそれぞれについ
て、１０００ビーズからなるロットを少なくとも２ロッ
ト作成し、血清学的研究に用いた。
【０２６６】簡単に述べると、ポリスチレンビーズを精
製タンパクで被覆するにあたり、洗浄したビーズをシン
チレーションバイアルに加え、ビーズを組換え抗原含有
緩衝液に浸漬した（約０．２３３ｍｌ／ビーズ）。各組
換え抗原につき種々の異なる濃度を用意し、これらをｐ
Ｈ５．０〜９．５の範囲に調整した種々の異なる緩衝液
とともに用いて評価した。次いでバイアルを４０℃のイ
ンキュベーター中の回転装置上に２時間載置し、その後
液体を吸引し、ビーズをｐＨ６．８のリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いでビーズを０．１％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて１時間、４０℃で処理
し、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、ビーズを５％ウシ血
清アルブミンでオーバーコートし、攪拌しながら４０
℃、１時間でインキュベートした。ＰＢＳでさらに洗浄
を繰り返した後、ビーズを５％ショ糖で２０分間室温で
オーバーコートし、液体は吸引除去した。最後にビーズ
を空気乾燥し、ＨＧＢＶに対する抗体を検出するための
ＥＬＩＳＡ試験に使用した。
【０２６７】Ｃ．ＨＧＢＶに対する抗体を検出するため
のＥＬＩＳＡ手順 ＥＬＩＳＡは間接アッセイ法で行った。即ち、血清また
は血漿を検体希釈剤で希釈し、固相に被覆した抗原と反
応させた。洗浄工程の後、固相と結合したタマリンまた
はヒト抗体を検出するために、ビーズをヒト免疫グロブ
リンを指向する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
Ｏ）標識抗体と反応させた。切捨て値を越えるシグナル
を生じた検体は反応性ありとした。ＥＬＩＳＡに関する
付加的な詳細を以下に記す。
【０２６８】ＥＬＩＳＡの様式は、抗原で被覆した固相
を予め検体希釈剤（動物血清と非イオン活性剤を含有す
る緩衝溶液）で希釈したタマリン血清と接触させるもの
である。この検体希釈剤の調合に当たっては、特異的抗
体が抗原で被覆された固相と結合する割合を高める一
方、固相に対する非特異的な免疫グロブリンの結合に起
因するバックグラウンドシグナルを減少させるように調
合した。具体的には、１０μｌのタマリン血清を１５０
μｌの検体希釈剤で希釈し、回転攪拌した。この予備希
釈された検体１０μｌを反応トレイ中のウェルに添加し
た後、２００μｌの検体希釈剤と抗原被覆ポリスチレン
ビーズを加えた。この反応トレイをダイナミックインキ
ュベーター（アボットラボラトリーズ製）中でインキュ
ベートした。インキュベーターは、室温で常に攪拌し続
けた。１時間のインキュベーションの後、液体を吸引除
去し、ビーズを含有するウェルを蒸留水で３回洗浄した
（各回５ｍｌ）。次にコンジュゲート希釈剤（動物血清
と非イオン活性剤を含有する緩衝溶液）で希釈したＨＲ
ＰＯ標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを２００μｌ各ウェ
ルに添加し、反応トレイを上記のようにして再び１時間
インキュベートした。液体を吸引除去し、ビーズを含有
するウェルを蒸留水で上記のようにして３回洗浄した。
抗原及び結合免疫グロブリンを有するビーズをウェルか
ら除去し、各ビーズを試験管に入れ、０．３％ｏ−フェ
ニレンジアミン二塩酸塩の０．０２％Ｈ2Ｏ2含有０．１
Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）溶液３００μｌと反
応させた。室温で３０分保持後、１ＮのＨ2ＳＯ4を加え
て反応を停止させた。４９２ｎｍでの吸収を分光光度計
で読み取った。生じた色は、試験サンプル中に存在する
抗体の量と正比例する関係にあった。
【０２６９】ＨＧＢＶエピトープに対する抗体を含まな
いと思われる検体とＨＧＢＶエピトープに対する抗体を
含むと思われる検体とを分別するために、検体の各グル
ープに対して予備的な切捨て値を設定した。
【０２７０】Ｄ．感染個体の血清におけるＨＧＢＶ由来
ＲＮＡの検出 タマリン血清またはヒト血清／血漿中における、ＨＧＢ
Ｖ−ＲＮＡ存在下の１．７ＥＬＩＳＡおよび１．４ＥＬ
ＩＳＡの血清反応データを相互に関連付けるために、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲを既に参照して本明細書に包含した米国特許
出願第０８／２８３，３１４号の実施例７と同様に実施
した。実施にあたってはＨＧＢＶのクローン化された配
列に由来するオリゴヌクレオチドを使用した。オリゴヌ
クレオチドのＨＧＢＶ−Ｂゲノムに由来するクローン４
（実施例７参照）およびＨＧＢＶ−Ａゲノムに由来する
クローン１６に対する最終濃度は０．５μＭであった。
【０２７１】Ｅ．タマリンの血清像 ＬＥＭＳＩＰに収容されたタマリンから週単位で採血し
て血清を得、肝臓の酵素レベルを検査した。検体血清の
残量はさらなる調査のためにアボットラボラトリーズに
送った。
【０２７２】１．タマリンについてのＥＬＩＳＡの結果
（初期感染性の研究） ４匹のタマリン（Ｔ−１０５３、Ｔ−１０４８、Ｔ−１
０５７、およびＴ−１０６１）にＧＢ血清（Ｈ２０５Ｇ
Ｂ継代数１１と称する）を接種した。接種後（ＰＩ）の
最初１週間の間、タマリンＴ−１０５３では肝酵素の上
昇が認められた。このタマリンは、ＰＩ１２日で安楽死
させた。タマリンＴ−１０４８、Ｔ−１０５７、および
Ｔ−１０６１は、接種後２週間までの間に肝酵素の上昇
を示した。この上昇はＰＩ８〜９週まで続いた（図２〜
４）後、接種前のレベルに戻った。ＰＩ１４週におい
て、これら３匹のタマリンに対し、タマリンＴ−１０５
３（この個体は感染力を有することが判明している−実
施例２）から得た希釈していない血清０．１０ｍｌでの
再接種を行った。
【０２７３】この３匹のタマリン（タマリンＴ−１０４
８、Ｔ−１０５７、およびＴ−１０６１）の回復期の血
清がＣＫＳ−１．７（配列番号６１０）組換えタンパ
ク、ＣＫＳ−１．４（配列番号６１１）組換えタンパ
ク、ＣＫＳ−４．１（配列番号６１２）組換えタンパク
に対する抗体を有するか否かについて、ＥＬＩＳＡ（図
３、４、５）を個々に行って検討した。１．７（配列番
号６１０）、１．４（配列番号６１１）、４．１（配列
番号６１２）、あるいは１．５（配列番号６１４）の各
組換えタンパクに対する特異抗体は、どの接種前の検体
からも検出されなかった。
【０２７４】図２６に示すように、Ｔ−１０４８の血清
においては、１．７および１．４ＥＬＩＳＡの試験によ
ってＰＩ５６〜８４日で特異抗体が検出されたが、ＰＩ
９７および１３７日では検出されなかった。また、Ｔ−
１０４８の血清は、４．１ＥＬＩＳＡの試験では特異抗
体を検出しなかった。図２７に示すよ うに１．７タン
パク（配列番号６１０）に対する抗体がＴ−１０５７の
血清においてＰＩ５６および６３日に検出されたが、Ｐ
Ｉ６３日よりも後は検出されなかった。４．１タンパク
（配列番号６１２）に対する抗体がＰＩ２８〜６３日に
検出されたが、ＰＩ８４〜９７では検出されなかった。
上記のように、各タマリンに対し、ＰＩ９７日に接種剤
Ｈ２０５で再接種を行った。４．１タンパク（配列番号
６１２）に対する特異抗体がＰＩ１１２日およびＰＩ１
２６日に検出されたが、これは接種に対する既往反応を
示唆するものである。１．４組換えタンパク（配列番号
６１１）については抗体反応は認められなかった。組換
え１．４タンパク（配列番号６１１）に対する特異抗体
がタマリンＴ−１０６１の血清においてＰＩ８４日から
ＰＩ１１２日の間で検出されたが、ＰＩ１２６日以降で
は検出されなかった。図２８に示すように、タマリンＴ
−１０６１の血清は１．７タンパク（配列番号６１０）
および４．１タンパク（配列番号６１２）に対する抗体
に関してＰＩ３５０日で陰性であった。
【０２７５】２．タマリンについてのＰＣＲの結果（初
期感染性の研究）タマリンＴ−１０４８およびＴ−１０
５７の血清を選択し、実施例７に記載のクローン４から
得たプライマーと実施例７に記載のクローン１６から得
たプライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲによってＨＧＢＶ−
ＲＮＡを調べた。
【０２７６】ＨＧＢＶ−ＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによっ
ては接種前１０日および接種前１７日の血清中のプライ
マーのいずれにおいても（Ｔ−１０４８）（図２６）、
あるいは接種前１７、３７、５９日の血清中のプライマ
ーのいずれにおいても（Ｔ−１０５７）（図２７）検出
されなかった。Ｔ−１０４８については、ＨＧＢＶ−Ｒ
ＮＡが、ＰＩ７〜１３７日の間に得た１７の異なった血
清のうちの１５に関してクローン４からのプライマーを
用いて検出された。ＨＧＢＶ−ＲＮＡは、ＰＩ７〜９７
日の期間に得た１０種血清のいずれかにあっても、クロ
ーン１６から得たプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによ
っては検出されなかった。Ｔ−１０５３の血漿を接種す
ると、接種後８日および４０日の期間に採取した血清５
検体のうち４検体がクローン１６に対して陽性であっ
た。Ｔ−１０５７については、ＲＴ−ＰＣＲの結果が陽
性であったのは、図２７に示すようにＰＩ７日から２８
日に採取した４検体で、クローン４からのプライマーを
用いたものであった。各検体に対して行ったＲＴ−ＰＣ
Ｒの結果は、ＰＩ２８日後においては弱いハイブリダイ
ゼーションシグナルを示した２８７日目を除いては、ク
ローン４に対して陰性であった。ＰＩ７日〜９７日に得
たＴ−１０５７の６つの検体のいずれもが、クローン１
６からのプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲが陽性であっ
た。しかしながら、Ｔ−１０５３の接種後８日〜８５日
の間の血清は、クローン１６からのプライマーの使用で
陽性であった。
【０２７７】３．タマリンについてのＥＬＩＳＡの結果
（力価検定／伝播性の研究） 実施例２に記載のように、タマリンＴ−１０５３の血清
を４匹のタマリンに接種した。これら４匹のタマリンの
うち３匹を疾病の急性期（ＰＩ１２日から１４日の間）
に安楽死させた。これら３匹のタマリンについて得たＲ
Ｔ−ＰＣＲの結果を以下に記す。生き残ったタマリン
（Ｔ−１０５１）は最初ＰＩ１４日までに肝酵素値が上
昇し、この上昇値は少なくともＰＩ８週まで持続した。
タマリンＴ−１０５１の検体を１．７ＥＬＩＳＡおよび
１．４ＥＬＩＳＡで試験した。結果を図２９に示す。特
異抗体は接種後の最初の４１日間に採取された血清にお
いても接種前の血清においても検出されなかった。しか
しながら、１．４タンパク（配列番号６１１）および
１．７タンパク（配列番号６１０）に対する抗体反応が
ＰＩ４９日とＰＩ１１３日の間に、また４．１タンパク
（配列番号６１２）に対する抗体反応がＰＩ２８日とＰ
Ｉ１０５日の間に認められた。タマリンはＰＩ１１３日
目に安楽死させた。
【０２７８】タマリン（Ｔ−１０３４）は、実施例１お
よび表４に記載のように最近罹患した肝炎感染から回復
しつつある患者（最初のＧＢ源）の潜在的感染性血清
０．１ｍｌで前に接種したものである。肝酵素値の上昇
はＴ−１０３４において接種後の約１０週間認められな
かった。この理由からタマリンＴ−１０３４は付加的研
究において使用できるであろうと決定した。タマリンＴ
−１０３４はＨＧＢＶ調製物で接種した。このＨＧＢＶ
調製物は、タマリンＴ−１０５３の血清を予め接種した
３匹のタマリン（Ｔ−１０５５、Ｔ−１０３８、Ｔ−１
０４９）の血清プールから実施例４？？の記載に従って
調製したものである。
【０２７９】これらの３匹のタマリン（Ｔ−１０５５、
Ｔ−１０３８、Ｔ−１０４９）に、実施例２の記載に従
ってタマリンＴ−１０５３から調製した血清を接種し
た。ＰＩ１１日までには３匹のタマリン全てで肝酵素の
上昇が認められた。ＰＩ１２日目にタマリンＴ−１０５
５を殺した。タマリンＴ−１０３８とタマリンＴ−１０
４９はＰＩ１４日目に殺した。これらのタマリンの血清
をプールして、清澄化し、濾過した。この濾過したもの
の１０-6希釈物（健常タマリン血清中に調製）０．２５
ｍｌをタマリンＴ−１０３４に接種した。
【０２８０】Ｔ−１０３４に接種後２週間で肝酵素ＡＬ
Ｔ値の上昇が最初に認められ、続く７週間の間上昇値を
保ち、最後に接種後１０週までに正常化した。図３０に
示したように１．４（配列番号２２）組換えタンパクに
対する特異抗体応答がＰＩ４９日に最初に検出され、Ｐ
Ｉ５６日〜１１８日の間検出され続けた。４．１（配列
番号５２）組換えタンパクに対する抗体応答はＰＩ４９
日に最初に検出され、ＰＩ５６日〜７７日の間検出され
続けた。但しＰＩ８４日から１１８日の間は検出されな
かった。１．７（配列番号６１０）組換えタンパクに対
する抗体応答はＰＩ５６日に最初に検出され、ＰＩ６３
日〜１１８日の間検出され続けた。タマリンはＰＩ１１
８日目に殺した。
【０２８１】実施例２に記載のように、タマリンＴ−１
０４４は、Ｈ２０５で接種した７日後にＴ−１０５７か
らの血清で接種した。この接種物はクローン４プライマ
ーで検出された配列に対してのみ陽性であった。クロー
ン１６プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲでＰＩ１４日か
ら６３日の間、切捨て値を越えるゆるやかなＡＬＴ値の
上昇が見られた。前述のように、１．７（配列番号６１
０）組換えタンパクに対する特異抗体応答は、ＰＩ６３
日〜８４日の間、検出された。４．１（配列番号６１
２）組換えタンパクに対する抗体応答や、１．４（配列
番号６１１）組換えタンパクに対する抗体応答は検出さ
れなかった。タマリンは、ＰＩ１６１日目に殺した。
【０２８２】４．タマリンについてのＰＣＲの結果（力
価検定／伝播性の研究） 接種に先立つ８週目の週にＴ−１０４９とＴ−１０５５
から採取した血清および接種の日にＴ−１０３８から得
た血清は、クローン１６（配列番号２６）およびクロー
ン４（配列番号２１）に対し、ＲＴ−ＰＣＲ陰性であっ
た。タマリンＴ−１０４９とタマリンＴ−１０５５はク
ローン４の配列（配列番号２１）に対して接種の１週間
後、ＲＴ−ＰＣＲ陽性であった（クローン１６のＰＣＲ
は実施しなかった）。殺す日に先立つ、Ｔ−１０４９
（ＰＩ１４日）並びにＴ−１０５５（ＰＩ１１日）は、
クローン４（配列番号２１）およびクローン１６の配列
（配列番号２６）のいずれに対しても、ＲＴ−ＰＣＲ陽
性であった。タマリンＴ−１０３８は、殺す日（ＰＩ１
４日）には、両プライマーのいずれでも陽性であった。
【０２８３】図３０から判るように、Ｔ−１０３４は、
接種後に採取した（ＰＩ７日）最初の血清サンプルにつ
いてクローン４プライマーで検出された配列に対しＲＴ
−ＰＣＲ陽性で、ＰＩ７０日まで陽性でありつづけた。
ＰＩ１１２日に採取したサンプルは陰性であった。これ
らのサンプル全てはクローン１６プライマーによるＲＴ
−ＰＣＲで陰性であった。接種前の７０日目および１０
１日目に採取したサンプルは両プライマーのいずれでも
陰性であった。
【０２８４】タマリンＴ−１０５１に関する図２９から
判るように、ＨＧＢＶ−ＲＮＡは、接種の８週間前に採
取した血清サンプルにおいては、両プライマー（上記の
クローン４とクローン１６からのもの）のいずれによっ
ても検出されなかった。ＨＧＢＶ− ＲＮＡは、ＰＩ７
日〜６９日の間に採取した６種の血清において、クロー
ン４からのプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲで検出され
たが、ＰＩ７７、８４、９１、あるいは１０５日に採取
した血清では検出されなかった。接種後に採取した９つ
のサンプルにおいて、クローン１６からのプライマーを
用いたＲＴ−ＰＣＲでＨＧＢＶ−ＲＮＡが検出された。
【０２８５】図７に示すように、Ｔ−１０４４は、接種
後（ＰＩ７日）に採取した最初の血清サンプルにおいて
は、クローン４プライマーで検出された配列に対し、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ陽性であり、ＰＩ ６３日まで陽性でありつ
づけた。ＰＩ７７日〜１１９日の間に採取したサンプル
は陰性であった。これらのすべてのサンプルは、クロー
ン１６プライマーに対してＲＴ−ＰＣＲ陰性であった。
接種の４２日前に採取したサンプルは、両プライマーの
いずれに対しても陰性であった。
【０２８６】タマリンＴ−１０４７とＴ−１０５６に対
し、ＰＩ１４日に採取したＴ−１０４４血清を接種し
た。これらの両動物からＰＩ７日〜６４日の間に採取し
た９種のサンプルは、クローン４プライマー（配列番号
８と９）によるＲＴ−ＰＣＲは陽性であったが、クロー
ン１６プライマーでは陰性であった。
【０２８７】タマリンＴ−１０５８に、Ｔ−１０５３血
清による誘発の２２日後に採取した無希釈のＴ−１０５
７血清を接種した。この接種物は、クローン１６プライ
マーで検出された配列に対して陽性であったが、クロー
ン４プライマーでのものには陰性であった。この動物か
ら採取した血清サンプルを、ＧＢＶ−配列［クローン１
６、クローン２、クローン１０、クローン１８］および
ＧＢ−Ｂ配列［クローン４およびクローン５０］に由来
するプライマーを用いて試験した。接種の９日前に採取
したサンプルは、全てのプライマーでいずれも陰性であ
った。ＰＩ１４日に採取したサンプルはクローン１０と
１８のプライマーのみで陽性であった。ＰＩ２１日に採
取したサンプルはクローン１６、１０、および１８のプ
ライマーのみで陽性であった。ＰＩ２８日に採取したサ
ンプルはクローン１８のプライマーのみで陽性であっ
た。ＰＩ３５日に採取したサンプルはクローン２、１
６、および１８のプライマーのみで陽性であった。ＰＩ
４１日に採取したサンプルはクローン１６および１８の
プライマーのみで陽性であった。クローン４およびクロ
ーン５０からのプライマーでは、試験した全サンプルが
陰性であった。
【０２８８】５．タマリンによる血清学的研究のまとめ ５匹のタマリンに対し、ＨＧＢＶの種々の調製物を接種
すると、接種後２週間までに肝酵素が上昇を始めた。こ
の上昇値は続く６〜８週間の間持続した。一以上のＨＧ
ＢＶ組換え抗原、１．７、１．４、および４．１に対す
る特異抗体の応答が５匹全部のタマリンで観察された。
いずれの場合も抗体はまず、ＰＩ６から１０週で検出さ
れ、さらに２週間から７週間の間持続した。一般に、抗
体レベルはピークに達し、次いで引き続く数週間の内に
急速に下降した。抗体は、肝酵素の値が正常値に戻った
後しばらくして検出可能となることがわかる。このこと
は、抗体の産生がウイルス感染の消散において何らかの
作用をしていることを示唆するものである。
【０２８９】６．タマリンでのＰＣＲ研究のまとめ ゲノムウォーキング実験の結果は、クローン４（配列番
号２１）とクローン１６（配列番号２６）が別々のＲＮ
Ａ分子上にあることを示唆している。我々は従前、ウイ
ルスゲノムには異なる２種類が存在し、その一つは一部
にクローン４（配列番号２１）を含有しもう一つは一部
にクローン１６（配列番号２６）を含有する、という仮
説を提起した。ある動物がクローン４からのプライマー
で陽性でクローン１６からのプライマーでは陰性である
という事実が観察されたことは、ウイルスゲノムに異な
る２種類が存在することを支持するものである。しかし
ながら、クローン１６（配列番号２６）の配列が感染タ
マリンの内のあるものでは検出できなかったことは、ク
ローン１６のプライマーセットとクローン４のプライマ
ーセットとの感度の下限の違いを反映している、という
議論もできるかもしれない。もしこの後者の可能性が正
しいとするならば、両方のプライマーともに陽性のタマ
リンは、これら二つのプライマーセットに関し、感度の
差を示すはずである。上記の結果は二つのウイルス種の
存在によって説明されるのであって二つのプライマーセ
ットの感度の差によるものではない、という立場を補強
するため、タマリンＴ−１０５７とＴ−１０５３のｃＤ
ＮＡの一連の希釈列を用いてＰＣＲを実施した。Ｔ−１
０５７血清はクローン４プライマーの血清当量５×１０
-3μｌで陽性、５×１０-4μｌで陰性であった。Ｔ−１
０５７血清を２０μｌという多量で用いてＲＴ−ＰＣＲ
をクローン１６プライマーで行ったが、結果は陰性であ
った。もしこの差が二つのプライマーセット（クローン
４対クローン１６）の相対感度に帰するのであれば、他
の検体もＰＣＲ試験を行ったとき４０００倍もの高い終
点希釈を示すであろうと予測される。しかしながら、Ｔ
−１０５３血清に由来するｃＤＮＡは、クローン４（配
列番号２１）およびクローン１６（配列番号２６）の両
クローンの配列に対し、いずれも血清当量２．５×１０
-4μｌで陽性で、２．５×１０-5μｌで陰性であること
が判った。よってこの結果はプライマーセットの感度の
差では説明できず、ｃｏｎｔｉｇＢ−クローン４（配列
番号２１）およびｃｏｎｔｉｇＡ−クローン１６（配列
番号２６）配列が、Ｔ−１０５７においては少なくとも
４０００倍異なる力価であるがＴ−１０５３では略等し
い力価であるような別個のウイルスゲノムの上に存在す
る、という仮定と整合する。すなわちこのデータは、異
なる検体において異なる相対終点力価を有する別個の二
つのウイルスの存在と整合するものである。
【０２９０】ＨＧＢＶ−Ｂによるウイルス血症のみで肝
酵素レベルの上昇を引き起こすのに十分であって、ＧＢ
Ｖ−Ａのみのウイルス血症段階では肝酵素レベル上昇は
認められない、という観察結果から、ＨＧＢＶ−Ｂが恐
らくこれらのタマリンにおける肝炎の原因物質であった
ことがわかった。ＨＧＢＶ−Ｂ抗原に対する免疫応答
は、精々接種後１５０日という短期間出現した。これに
対する説明としては、これらのＥＬＩＳＡアッセイにお
いて選定されたエピトープが、免疫応答が生成する主エ
ピトープからのものではなかったということが考えられ
る。他の説明として、タマリンにおいては肝炎誘発は長
期間の応答を必要とする重症ではない、ということも考
えられる。これは、急性期に殺した、あるいは急性期の
少し後で自然死した動物において、肝臓の炎症が軽症な
いし非重症に止まった（結果は示さない）という組織学
的証拠と整合する。
【０２９１】この研究で記載した６匹の動物の内の５匹
において、ＰＩ１１２日までにＨＧＢＶ−Ｂによるウイ
ルス血症が散退した。一方、タマリンＴ−１０４８は１
３６日間ウイルス血症から回復せず、死亡時（ＰＩ１３
７日）にウイルス血症が認められた。ＧＢＶ−Ａ配列に
陽性であった４匹の動物中で、３匹は、ＧＢＶ−Ａ配列
が最初に出現してから７７日後までにウイルス血症の解
消をみた。これに対し、タマリンＴ−１０６１は、犠牲
に供されるまでの２４５日間、ウイルス血症が認められ
た。加えて、タマリンＴ−１０５１は、犠牲に供される
まで（ＰＩ１１３日）ウイルス血症であったが、この持
続するウイルス血症が最初にＴ−１０５３血漿で接種し
たことによるものか、あるいはその６９日後にＴ−１０
５３血漿で追加接種した結果によるものかは不明であ
る。
【０２９２】ＨＧＢＶ−ＡおよびＨＧＢＶ−Ｂの両方に
陽性であった６匹の動物のピークＡＬＴの平均値は、Ｈ
ＧＢＶ−Ｂのみに陽性の４匹の動物の平均値より高かっ
た。加えてピーク値に達するのは、平均してＧＢＶ−Ｂ
のみに陽性の動物よりもＧＢＶ−ＡおよびＧＢＶ−Ｂの
両方に陽性の動物における方が早かった。これらの結果
は、肝炎の強さは両剤が相当量で存在することに関係す
るかもしれないことを示唆している。タマリンＴ−１０
４７とＴ−１０５６へのＧＢＶ−Ｂの追加継代接種にお
いて肝酵素値の上昇がＧＢＶ−Ｂウイルス血症でほとん
どなかったことが観察されたが、この結果は、タマリン
においては両剤がＡＬＴレベルの主たる上昇をもたらす
のに必須ではないかという仮説を支持する。ＨＧＢＶ−
Ｂ単独を用いた継代接種に加え、Ｔ−１０５８に接種物
ＨＧＢＶ−Ａを接種した時の初期の結果は、クローン４
とクローン５０のプライマーで検出可能なＧＢ−Ｂ配列
の不在によって示されるように、ＨＧＢＶ−Ａは検出可
能なＨＧＢＶ−Ｂがなくとも独立に伝染しうることを示
唆している。
【０２９３】Ｆ．ヒト集団でのＨＧＢＶへの暴露を示す
ための実験手順 種々のヒト集団から検体を得て、ＨＧＢＶ−Ｂに由来す
る組換えタンパクを用いた三種の別個のＥＬＩＳＡによ
ってＨＧＢＶに対する抗体の有無を調べた。実施例１５
Ｂのようにして１．７ＥＬＩＳＡにおいてはＣＫＳ−
１．７組換えタンパク（配列番号６１０）で固相を被覆
し、１．４ＥＬＩＳＡにおいてはＣＫＳ−１．４組換え
タンパク（配列番号６１１）で固相を被覆し、また４．
１ＥＬＩＳＡでは４．１組換えタンパク（配列番号６１
２）で固相を被覆して用いた。実施例１５Ｅでも記した
ように、ＨＧＢＶで接種したタマリンでは、これらのタ
ンパクに対して特異的ではあるが短い抗体応答が認めら
れた。この検出可能な免疫応答の短期的な性質からする
と、結果が陰性のヒト集団においてＨＧＢＶに対して従
前暴露された可能性がないとはいえない。
【０２９４】ヒトの検体で行った血清学的研究は二重の
目的を有するものであった。第一の目的は、種々のヒト
集団における本発明のＨＧＢＶ組換え抗原に対する抗体
の血清学的存在を決定することであった。これらの研究
は次の（１）〜（３）のテストを含む：（１）ＨＧＢＶ
への暴露に関し「低リスク」と考えられる集団（例えば
合衆国における健康なボランティアの血液ドナーの人
々）；（２）ＨＧＢＶへの暴露に関し「リスクあり」と
考えられる集団（例えば経静脈麻薬使用者や血友病患者
の検体は、非経口的に伝播した肝炎ウイルス（ＨＢＶお
よびＨＣＶ）に対して血清反応がしばしば陽性となる；
発展途上国に居住する個体からの検体は、経腸的に伝播
したウイルス（ＨＡＶおよびＨＥＶ）に対して血清反応
がしばしば陽性となる；（３）既知の肝炎ウイルス（Ｈ
ＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、またはＨＥＶ）への暴
露や、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）やエプスタイン
−バーウイルス（ＥＢＶ）などの肝炎関連のその他のウ
イルスへの暴露には関連のない、「非Ａ−Ｅ−肝炎」を
有する個体から得た検体グループ。非Ａ−Ｅ−肝炎とい
う一般的呼称に属するグループのメンバーの一部はＨＥ
Ｖに対する抗体に関してはテストされていない場合があ
る。よって、１．７、１．４、あるいは４．１ＥＬＩＳ
Ａで反応性を有した非Ａ−Ｅ群のすべての検体につい
て、ＨＥＶ−ＥＬＩＳＡアッセイ（本出願人から入手可
能）を行った。抗ＨＥＶは、三つの地域（パキスタン、
アメリカ合衆国、およびニュージーランド）からのサン
プルで以下に記載するように陽性の結果となった。
【０２９５】ＨＧＢＶに対する暴露に関し「低リスク」
と考えられる集団よりも、ＨＧＢＶに対する暴露の「リ
スクあり」の集団や非Ａ−Ｅ肝炎を有する個体における
方が、より高い血清学的存在率がみられることが予想さ
れる。
【０２９６】本血清学的研究の第二の目的は、一以上の
ＨＧＢＶエピトープに対する抗体について陽性であるこ
とが判った検体ＲＴ−ＰＣＲで調べ、ウイルスが血清中
に存在するかどうかを決定することであった。ＨＢＶお
よびＨＣＶは数カ月あるいは数年も持続するウイルス血
症の疾病状態を、また、一般にＨＡＶやＨＥＶは一般に
数週間持続する短期間のウイルス血症をもたらすことは
よく知られている。急性で消退しつつある肝炎である、
ＨＢＶやＨＣＶ感染の場合には、ウイルス血症の段階は
数週間という短期間の持続の場合もあろう。このように
ＲＴ−ＰＣＲは、感染個体にウイルスが存在するという
証拠を得るために用いることができる。しかしながら、
ウイルス血症の状態は短期間でありうるので、ある剤に
感染した個体でもその剤に関してＲＴ−ＰＣＲ陰性とな
ることもある。
【０２９７】Ｇ．切捨て値の決定 間接方式を利用するその他のＥＬＩＳＡアッセイにおけ
る従前の経験から、予備的な切捨て値を、研究対象のタ
ンパクに対する抗体に関して恐らく陰性であると思われ
る集団から得た吸収に基づいて算出すればよいことが判
明している。予備的切捨て値は、集団の平均吸収値と、
集団の平均値からの１０の標準偏差との合計として計算
した。切捨て値は一検査群の検査が行われるたびに用い
られるものなので、切捨てを表現するより簡便な方法
は、各アッセイのたびに５個重複して走らせる陰性コン
トロール（正常ヒト血漿プール−ＮＦＰ）から決める方
法であった。１．７、１．４、および４．１ＥＬＩＳＡ
については、陰性コントロールは、典型的には０．０３
０と０．０６０の間の吸収を有していた。以下に記載の
ように、切捨て値は約０．３００から０．６００である
と吸収であると計算されたが、これは陰性コントロール
の値の１０倍の吸収シグナルに匹敵するものであった。
よって、検体が反応性であると考えられるのは、陰性対
照（Ｎ）吸収値に対するサンプル（Ｓ）の吸収値（＝Ｓ
／Ｎ比）が１０．０以上であることを要する。
【０２９８】Ｈ．追補的試験 最初の試験で反応性であるとされた検体は、原則として
２個重複で再試験した。もし再試験時の吸収の一あるい
は二者も切捨て値より高ければ、その検体は繰り返し反
応性であると考えられた。繰り返し反応性であると考え
られた検体については、さらにＥＬＩＳＡのデータを補
充すべく追補的アッセイを行った。十分量がある場合、
繰り返し反応性検体はウェスタンブロットによって、抗
体応答がＣＫＳ１．７（配列番号６１０）ＣＫＳ１．４
（配列番号６１１）またはＣＫＳ４．１（配列番号６１
２）抗原を指向するものであって、問題とする主タンパ
クとともに固相に共に被覆されていたかもしれない大腸
菌タンパクを指向するものではないことを確認した。ウ
ェスタンブロットが陽性と考えられるためには、可視的
なバンドが１．７タンパク（配列番号６１０）に対して
８０ｋＤ、１．４タンパク（配列番号６１１）に対して
６０から７０ｋＤ、または４．１タンパク（配列番号６
１２）に対して４２ｋＤにおいて検出される必要があ
る。ウェスタンブロットはＥＬＩＳＡの感度に匹敵ない
しそれを凌駕するほど最適化されていないので、陰性の
結果が出ても直ちにＥＬＩＳＡのデータを捨てることは
しなかった。しかしながら、陽性の結果が出れば、それ
はＥＬＩＳＡによって検出された反応性を補強するもの
である。
【０２９９】繰り返し反応性のある検体で十分量あるも
のの対しては、クローン４プライマーを使用するＲＴ−
ＰＣＲ（実施例１５Ｄに記載に従って実施）を実施し、
血清中のＨＧＢＶ特異性ヌクレオチド配列を同定しても
よい。結果が陽性であれば、その検体はウイルス血症で
あることがわかり、究極的にはヒト肝炎におけるＨＧＢ
Ｖの役割を確立する一助になるであろう。しかしなが
ら、結果が陰性であってもそれはＥＬＩＳＡの結果が誤
りだったと解釈してはならない。タマリンによる研究に
おいて実施例１５Ｅに記載したように、ＲＴ−ＰＣＲの
結果は感染後の最初の数週間は陽性で、その後本発明の
ＥＬＩＳＡで抗体がまさに検出されはじめた頃には陰性
になっていた。この後の段階における検体はＲＴ−ＰＣ
Ｒ反応陰性であっても一方または両方のＥＬＩＳＡにお
いて陽性であるかもしれない。
【０３００】Ｉ．低リスク検体における血清反応データ ウィスコンシン州南東部の健康なボランティア血液供与
者から１００血清と１００血漿から成る集団を得て、上
記のＥＬＩＳＡによって１．７（配列番号６１０）、
１．４（配列番号６１１）、４．１（配列番号６１２）
の各組換えタンパクに対する抗体を検査した。血清およ
び血漿について、１．７、１．４、および４．１ＥＬＩ
ＳＡで得られた吸収の値を別々にプロットした（図９−
１４）。
【０３０１】１．７ＥＬＩＳＡでは、血清検体と血漿検
体に対する平均吸収値はそれぞれ０．０７２［標準偏差
（ＳＤ）は０．０６１］および０．０８３（ＳＤ＝０．
０５５）であった。よって１．７ＥＬＩＳＡでは血清と
血漿に対する仮の切捨て値はそれぞれ０．４９９および
０．４６８であった。上述のように陰性コントロールの
吸収値をもとにして切捨て値を表すこともできる。Ｓ／
Ｎ比が１０．０を越える検体を反応性ありとした。この
切捨て値を用いると、１．７（配列番号６１０）に対す
る抗体に対して試験した２００検体の内の０検体が反応
性であった。
【０３０２】１．４ＥＬＩＳＡでは幾つかの検体（血清
集団から３種、血漿集団から６種）が０．３００を越え
る吸収値を示した（Ｓ／Ｎ比が６から１２、予想される
切捨て値に近いかそれ以上）。再試験すると、これらの
検体の９種全部が１０．０より低いＳ／Ｎ比を示した。
血清検体と血漿検体に対する平均吸収値はそれぞれ０．
０７２（ＳＤ＝０．０５２）および０．１０８（ＳＤ＝
０．０６２）であった。１．４ＥＬＩＳＡにおける切捨
て値は、上記の式によって計算した。即ち、血清と血漿
それぞれの集団に対する切捨て値はそれぞれ０．４３６
および０．５４２であった。血清集団の中の一検体は、
最初の試験で反応性とされたが、二重にして再試験した
ときには陰性であった。血漿集団の中の２検体も最初は
試験で反応性とされたが、再試験では陰性であった。血
漿１００検体と血清１００検体からなる第二の正常検体
２００の集団を試験した。先に提案した切捨てに基づき
試験すると、血漿２検体および血清２検体が繰り返し反
応性であった。
【０３０３】４．１ＥＬＩＳＡでは血清検体と血漿検体
に対する平均吸収値はそれぞれ０．０７０［標準偏差
（ＳＤ）は０．０３７］および０．０６３（ＳＤ＝０．
０４０）であった。よって４．１ＥＬＩＳＡにおいて、
血清および血漿に対する仮の切捨て値はそれぞれ０．３
２９および０．５１１であった。上述のように陰性コン
トロールの吸収値に基づいて切捨て値を決めることもで
きる：Ｓ／Ｎ比が１０．０を越える検体を反応性ありと
した。この切捨て値を用いると、４．１（配列番号６１
２）に対する抗体について試験した１００血漿検体の内
の０検体、および１００血清検体の内の０検体が最初の
試験で反応性を有しているとされた。
【０３０４】インターステート血液銀行（オハイオ州）
から追加の７６０の血漿供与者の提供を受け、１．７Ｅ
ＬＩＳＡおよび１．４ＥＬＩＳＡの試験を行った。合計
９検体が繰り返し反応性であった。両方のＥＬＩＳＡで
同時に反応性を有する検体はなく、全９検体が１．４Ｅ
ＬＩＳＡで繰り返し反応性であった。
【０３０５】アメリカ合衆国に居住している血漿或いは
血液提供者からの合計９６０検体について、１．７タン
パクおよび１．４タンパクに対する抗体の有無を調査し
た。合計１３検体が１．４ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し
反応性であった。１．７ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を
有する検体はなかった。
【０３０６】以上まとめると、これらのデータは次のこ
とを示している。すなわち、ＨＧＢＶ−Ｂからの組換え
抗原を用いる一種以上のＥＬＩＳＡアッセイにおいて、
これまでのＥＬＩＳＡ結果によると、アメリカ合衆国の
血液提供者から採取された９６０検体のうち１３検体が
抗体反応性であった。この結果からＨＧＢＶはアメリカ
合衆国に固有のいわゆる風土病である可能性があると思
われる。
【０３０７】これらのデータを表１６に示す。
【０３０８】Ｊ．肝炎に関し「リスクあり」と考えられ
る検体 この研究でのデータを表１６に示す。
【０３０９】（ｉ）西アフリカからの検体 西アフリカから入手した１３００検体の内、合計１８１
検体が一以上のＥＬＩＳＡで繰り返し反応性であった。
３種のＥＬＩＳＡ全部で繰り返し反応性の検体が１検体
あった。合計４３検体が１．７ＥＬＩＳＡで繰り返し反
応性を有し、９１検体が１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反
応性を有し、５１検体が４．１ＥＬＩＳＡで繰り返し反
応性を有した。
【０３１０】１．７ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性であっ
た６検体のうちの一つは、１．７タンパク（配列番号６
１０）についてのウェスタンブロットで反応性であっ
た。１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性であった９検体
のうちの９検体（１００％）は、１．４タンパク（配列
番号６１１）に対する抗体についてのウェスタンブロッ
トで陽性であった。一検体が両方のタンパクについての
ウェスタンブロットで陽性であった。４．１ＥＬＩＳＡ
で繰り返し反応性であった１２検体のうちの１２検体
（１００％）は、４．１タンパク（配列番号６１２）に
関するウェスタンブロットで陽性であった。
【０３１１】繰り返し反応性であった３つの検体（１．
４ＥＬＩＳＡで陽性であった一検体と、両ＥＬＩＳＡお
よびウェスタンブロットで陽性であった一検体を含む）
について、クローン４からのプライマーを用いるＲＴ−
ＰＣＲによって上記のようにしてＨＧＢＶ−ＲＮＡの有
無を調べた。
【０３１２】得られたデータはＨＧＢＶが西アフリカの
風土病である可能性を示唆するものであった。
【０３１３】（ii）経静脈麻薬使用者（ＩＶＤＵ）から
の検体 セット１： １１２検体のうち３検体が１．４ＥＬＩＳ
Ａで陽性であった。５検体が４．１ＥＬＩＳＡで、３検
体が１．７ＥＬＩＳＡで反応性であった。２サンプル
が、２以上のＥＬＩＳＡで陽性であった。
【０３１４】セット２： 経静脈麻薬使用者の集団から
計９９検体を採取した。この試験はイリノイ州シカゴの
ハインズ退役軍人管理病院（Hines Veteran's Administ
ration Hospital ）で実施されたものの一部である。検
体のいずれも１．７あるいは４．１ＥＬＩＳＡで反応性
を有しなかった。一検体は１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し
反応性が認められた。この繰り返し反応性の検体につい
て、クローン４からのプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ
によって上記のようにしてＨＧＢＶ−ＲＮＡの有無を調
べた。この検体はＲＴ−ＰＣＲ陰性であった。
【０３１５】Ｋ．非Ａ−Ｅ肝炎の個体から採取した検体 得られたデータを表１６にまとめて示す。
【０３１６】
【表１６】 非Ａ−Ｅ肝炎と診断された個体群から種々の検体集団を
得て、実施例１５Ｃに従って１．７、１．４、および
４．１ＥＬＩＳＡを実施した。使用した検体は次のもの
を含む：日本のクリニックからの１８０検体；ニュージ
ーランドのクリニックからの５６検体；ギリシャのクリ
ニックからの７３検体；エジプトのクリニックからの１
３２検体；アメリカ合衆国テキサス州のクリニックから
の６４検体（セットＴ）；ミネソタの研究センターから
の７２検体（セットＭ）；米国からの６２検体（セット
＃１）；パキスタンのクリニックからの８２検体；イタ
リーのクリニックからの１０検体（幾つかの検体は血清
量の不足のため実行可能なＥＬＩＳＡアッセイすべては
実施しなかった）。
【０３１７】（ｉ）日本の検体 これらの１８０検体は８５人の異なる患者からのもので
あった。全１８０検体のうち二つが１．７ＥＬＩＳＡで
繰り返し反応性であった。この二つの反応性を示す検体
は２人の異なる患者からのものであった。上記２検体に
ついて、クローン４からのプライマーを用いるＲＴ−Ｐ
ＣＲによって前記のように検査した。陽性の検体はなか
った。
【０３１８】１．４ＥＬＩＳＡで陽性の検体はなかっ
た。
【０３１９】４．１ＥＬＩＳＡについては、８９検体中
７検体が４．１アッセイで繰り返し反応性を示した
（注：これら８９検体は２９人の異なる患者から得たも
のであった）。反応性の検体のうち５検体は一人の患者
からのものであった。残る２検体は別の一人の患者から
のものであった。
【０３２０】（ii）ニュージーランドの検体 ５６検体のうち計４検体が１．７、１．４、および４．
１ＥＬＩＳＡの一以上において繰り返し反応性であっ
た。これらの内、二以上のＥＬＩＳＡで反応性を示した
検体はなかった。１検体が１．７ＥＬＩＳＡで繰り返し
反応性であり、２検体が１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反
応性であった。１検体が４．１ＥＬＩＳＡで繰り返し反
応性であった。二つの繰り返し反応性の検体についてＰ
ＣＲを実施した。その結果、両検体とも陰性であった。
１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した１検体はＨ
ＥＶに対する抗体とも反応性を有した。
【０３２１】（iii）ギリシャの検体 ７３検体中の計５検体が１．７および／または１．４Ｅ
ＬＩＳＡで抗体反応性であった。これら７３検体は計１
１人の患者から採取したものであった。繰り返し反応性
の５検体中２検体は、両ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を
示したが、これらは別々の日に同一の患者から採取した
ものであった。二つの繰り返し反応性を示した検体をＲ
Ｔ−ＰＣＲで調べたところ陰性であった。これらの検体
のいずれも４．１ＥＬＩＳＡでは抗体反応性を有しなか
った。
【０３２２】（iv）エジプトの検体 １３２検体中の計１１検体が１．７、１．４、あるいは
４．１ＥＬＩＳＡで反応性を示した。８検体が１．７お
よび１．４ＥＬＩＳＡの両方で陽性であった。９検体が
１．７ＥＬＩＳＡで抗体反応性であり、９検体が１．４
ＥＬＩＳＡで反応性であった。１検体は４．１ＥＬＩＳ
Ａでは繰り返し反応性を示したが、１．７および１．４
ＥＬＩＳＡでは陰性であった。１．７ＥＬＩＳＡで繰り
返し反応性を示した１検体は、ウェスタンブロットで調
べると１．７組換えタンパク（配列番号６１０）に対す
る抗体に関し陰性であった。１．４ＥＬＩＳＡで繰り返
し反応性を示した９検体中６検体は、ウェスタンブロッ
トでは１．４組換えタンパク（配列番号６１１）に対す
る抗体に関し陽性であった。繰り返し反応性であったも
ののうち７検体についてＲＴ−ＰＣＲで試験した。どの
検体も反応性を示さなかった。これら全１３２検体は２
５人の異なる個体から別々の日に採取したものであっ
た。繰り返し反応性を示した１１検体は、異なる５個体
からのものであった。これらの個体中の一個体（患者＃
１０１）においては、免疫応答は明白にタマリン（図３
１）で観察されたそれと相似であった。図３１において
ＡＬＴレベルが医者が症状を認めた時には上昇していた
ことに注意されたい。その後の検体ではＡＬＴレベルは
低下し、１．４および１．７ＥＬＩＳＡによって抗体が
検出された。抗体応答は、タマリンで観察された血清反
応状況と同じく、その後数週間にわたって低下した。追
加の３人の患者（２５７、２６０、および３４０）は患
者＃１０１と同様の血清パターンを示した（図３２−３
４参照）。これらのデータはＨＧＢＶがこれらの肝炎の
症例において原因剤であるかもしれないという仮説を支
持するものである。
【０３２３】上の４人の患者からの７検体中、いずれの
検体もＲＴ−ＰＣＲではＨＧＢＶ−ＲＮＡ陽性ではなか
った。この結果には幾つかの理由が考えられる。第一に
ウイルス血症の段階は非常に短期間であるかもしれず、
その場合ウイルスは最初の採血の日までに血清から除去
されてしまっていた可能性がある。第二にこれらの検体
が船でエジプトから輸送されてきたことから、恐らく保
存・輸送の過程で凍結、解凍を経るかその他の変化を受
けたことが考えられ、その結果ＨＧＢＶ−ＲＮＡの検出
能力が低下した可能性がある。
【０３２４】（ｖ）アメリカ合衆国の検体（セットＴ） アメリカ合衆国の６４検体（セットＴ）で、１．７、
１．４、４．１ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性を有
するものはなかった。
【０３２５】（vi）アメリカ合衆国の検体（セットＭ） アメリカ合衆国の７２検体（セットＭ）のうち、計４検
体が一以上のＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した。２
検体は１．７および４．１ＥＬＩＳＡで反応性を示し
た。１．７ＥＬＩＳＡのみで反応性のものが１検体、
４．１ＥＬＩＳＡのみで反応性のものが１検体存在し
た。
【０３２６】(vii) アメリカ合衆国の検体（セット１） 非Ａ−Ｅ肝炎のアメリカ合衆国検体（セット１）５１検
体中、３検体が一つまたは両ＥＬＩＳＡで繰り返し反応
性を示した。１検体は両ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を
示した。１検体は１．７ＥＬＩＳＡで反応性を示し、３
検体は１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した。両
ＥＬＩＳＡで陽性の検体は、１．４組換えタンパク（配
列番号２２）に対するウェスタンブロットで陽性であっ
たが、１．７組換えタンパク（配列番号２３）では陰性
であった。追加の１検体は１．４ＥＬＩＳＡで陽性、
１．４組換えタンパク（配列番号６１１）に対してウェ
スタンブロット陽性であった。１．４ＥＬＩＳＡで繰り
返し反応性を示した１検体はＨＥＶに対する抗体に反応
性であった。
【０３２７】(viii)パキスタンの検体 ８２検体中の計４検体が、１．４および／または１．７
ＥＬＩＳＡで繰り返し抗体反応性であった。両ＥＬＩＳ
Ａで反応性を示した検体はなかった。２検体が１．７Ｅ
ＬＩＳＡで繰り返し反応性を示し、２検体が１．４ＥＬ
ＩＳＡで繰り返し反応性を示した。１．４ＥＬＩＳＡで
繰り返し反応性の２検体は、ＨＥＶに対する抗体にも反
応性であった。８２検体いずれも４．１ＥＬＩＳＡでは
陽性でなかった。
【０３２８】（ix）イタリーの検体 １０検体いずれも、１．７、１．４、および４．１ＥＬ
ＩＳＡで繰り返し反応性を示さなかった。
【０３２９】Ｌ．血清反応の結果の統計的意義 これらのデータは、ＨＧＢＶタンパクに対する特異抗体
（即ち１．７、１．４、または４．１ＥＬＩＳＡで抗体
に繰り返し反応性を示す検体）を、調査した集団の三つ
のカテゴリー全部で検出できることを示している。種々
の検体カテゴリー（「低リスク」、「リスクあり」、お
よび非Ａ−Ｅ肝炎患者）から得た血清学上の結果を合わ
せ、χ二乗検定で統計的意義について分析した。データ
は、ＨＧＢＶへの暴露に関し「リスクあり」と考えられ
る個体、あるいは分類未知の肝炎と診断された個体を含
むボランティア血液提供者において、抗−ＨＧＢＶの血
清学的有病率を比較すると有意の差異が存在することを
示した。西アフリカ検体においては血清学的有病率は１
３．９％であって、これはベースライン上のグループ
（表１７）と比べ、ｐ値０．０００の下で有意に高かっ
た。同様にＩＶＤＵのおいても、結果をボランティア提
供者のデータと比較した時、統計的に有意の差が存在し
た（ｐ値＝０．０００）。日本、ニュージーランド、ア
メリカ合衆国、エジプト、およびパキスタンを含む国々
については、アメリカ合衆国のボランティア血液提供者
に比べ、非Ａ−Ｅ肝炎患者において抗体の存在に有意の
差が存在した。
【０３３０】
【表１７】 Ｈ．まとめ これらのデータは、本明細書に記載の種々のＥＬＩＳＡ
が、日本、ニュージーランド、アメリカ合衆国、エジプ
ト、およびパキスタンを含む様々な地域におけるヒトの
肝炎診断に有用である可能性を示唆している。これらの
データは、試験した検体の全カテゴリーにおいてＨＧＢ
Ｖに対する抗体の血清学的存在を過小に評価しているよ
うに思われる。さらなるＨＧＢＶエピトープが発見さ
れ、評価されるにつれ、現在は診断を下すことができな
い患者において肝炎を診断するにあたり、ＨＧＢＶゲノ
ム（群）に基づく試験の有用性がより重要なものとなる
ことが期待される。注：これらの最初の研究ではＲＴ−
ＰＣＲの結果は陰性であったが、その後のデータから血
清反応陽性の個体の血清でフラヴィ様ウイルス配列が見
いだされた。
【０３３１】上に記載したように、２種以上のＨＧＢＶ
株が存在する。これらは本発明の範囲内のものと考えら
れ、これを「肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）」と呼ぶ。
【０３３２】実施例１６．ＨＧＢＶ−Ａの血清学的研究 Ａ．組換えタンパク精製手順 ＣＫＳ融合タンパクを発現する細菌細胞を凍結し、−７
０℃で保存した。各ＧＢＶ−Ａ構築物からの細菌細胞を
解凍し、実施例１５でＧＢＶ−Ｂ構築物について記載し
たようにして粉砕処理した。さらに、組換えタンパク
を、実施例１５でＧＢＶ−Ｂ組換えタンパクについて記
載したようにして精製した。
【０３３３】この精製手順で収集した分画を電気泳動で
分離し、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色
して、分子量が約６０ｋＤ（ＣＫＳ−１．５／配列番号
６１４）、６５ｋＤ（ＣＫＳ−２．１７／配列番号６１
３）、５５ｋＤ（ＣＫＳ−１．１８／配列番号３９
０）、および６６ｋＤ（ＣＫＳ−１．２２／配列番号３
９０）に相当するタンパクの有無を調べた。該当するタ
ンパクを含有する分画をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって再度調査した。
【０３３４】精製抗原を含有するプール分画の免疫原性
および構造の完全性を、実施例１３に記載の方法に従っ
てニトロセルロースに対する電子移動およびイムノブロ
ット法によって決定した。適当な陽性コントロールがな
かったため、組換えタンパクは、各融合タンパクのＣＫ
Ｓ部分に対するモノクローナル抗体との反応性によって
同定した。ＣＫＳ−１．５タンパク（配列番号６１４）
について、組換え抗原を検出すべく抗−ＣＫＳモノクロ
ーナル抗体を用いてウェスタンブロット法で調べると、
約６０ｋＤのところにシングルバンドが認められた。こ
の結果はＣＫＳ−１．５タンパク（配列番号６１４）の
予想サイズに対応している。同様にＣＫＳ−２．１７タ
ンパク（配列番号６１３）、ＣＫＳ−１．１８タンパク
（配列番号３９０）およびＣＫＳ−１．２２タンパク
（配列番号３９０）も、イムノブロット法で調べた結果
予想されたサイズを有していた。
【０３３５】Ｂ．ポリスチレンビーズの被覆手順 上記タンパクを透析し、実施例１５の記載に従って、こ
れらのタンパクのポリスチレンビーズ上での抗原性を評
価した。
【０３３６】Ｃ．ＨＧＢＶに対する抗体を検出するため
のＥＬＩＳＡの手順各種ＥＬＩＳＡは実施例１５の記載
に従って実施した。
【０３３７】Ｄ．感染個体の血清におけるＨＧＢＶ−Ｒ
ＮＡの検出 各ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した検体について、
実施例１５のセクションＤの記載に従ってＨＧＢＶ−Ｒ
ＮＡの有無を調べた。
【０３３８】Ｅ．タマリンの血清像 すべてＨＧＢＶ−Ａゲノム由来のＣＫＳ１．５タンパ
ク、ＣＫＳ２．１７タンパク、ＣＫＳ１．１８タンパ
ク、あるいはＣＫＳ１．２２タンパクを用いたＥＬＩＳ
Ａアッセイにおいて、タマリンからの血清はいずれも特
異免疫反応を示さなかった。しかしながら、先の実施例
に記載のように、感染タマリンの内のあるものではＨＧ
ＢＶ−ＡのＲＮＡが検出された（実施例１５中タマリン
の血清像についてのまとめ参照）。
【０３３９】Ｆ．ヒト集団についての血清学的研究のた
めの実験手順 実施例１５では、ＨＧＢＶ−Ｂに由来する組換え抗原を
用いたＥＬＩＳＡによって種々のヒトの集団におけるＨ
ＧＢＶ−Ｂに対する抗体の存在を評価した。その後、同
じ検体の多くについて、ＣＫＳ１．５組換えタンパク
（配列番号６１４）を用いた１．５ＥＬＩＳＡ、ＣＫＳ
２．１７組換えタンパク（配列番号６１３）を用いた
２．１７ＥＬＩＳＡ、ＣＫＳ１．１８組換えタンパク
（配列番号３９０）を用いた１．１８ＥＬＩＳＡ、およ
びＣＫＳ１．２２組換えタンパク（配列番号３９０）を
それぞれ用いたＥＬＩＳＡによって、ＨＧＢＶ−Ａに対
する抗体の有無を調べた。各タンパクは実施例１５のよ
うに固相に被覆して用いた。実施例１５に記載のよう
に、ＨＧＢＶを接種された回復期のタマリン５匹全部
が、ＨＧＢＶ−Ｂ組換えタンパクに対して特異的抗体反
応を示したが、短期間しか持続しなかった（１．７、
１．４、および４．１ＥＬＩＳＡで検出）。１．５、
２．１７、１．１８、あるいは１．２２ＥＬＩＳＡにお
いては、どのタマリンも検出可能な抗体反応を示さなか
ったが、西アフリカからのヒト検体の幾つかは、ウェス
タンブロットでこれらの組換えタンパクの一以上のもの
について特異的抗体反応を示し、ある外科医（ＧＢ剤の
供給者）の提供になる肝炎発症２２日目に採取した検体
の一つは、ウェスタンブロットで試験したとき２．１７
組換えタンパクに対する特異的抗体反応を示した（実施
例３参照）。本実施例では、様々なヒトの集団において
抗体を検出するに際しての、１．５、２．１７、１．１
８、および１．２２ＥＬＩＳＡの有用性を評価した。
【０３４０】Ｇ．切捨て値の決定 １．５、２．１７、１．１８、および１．２２ＥＬＩＳ
Ａにおける切捨て値を、実施例１５に記載のようにして
決定した。
【０３４１】Ｈ．追補的試験 実施例１５に記載したように、最初反応性を示した検体
については、原則として再試験を行った。ある検体が２
回目も反応性を示した場合、ＥＬＩＳＡによるデータを
さらに補充すべく追加の試験（例えばウェスタンブロッ
ト）を実施した。ウェスタンブロットの結果が陽性と考
えられるためには、観察可能ななバンドが１．５タンパ
ク（配列番号６１４）に対して６０ｋＤ、２．１７タン
パク（配列番号６１３）に対して６５ｋＤ、１．１８タ
ンパク（配列番号３９０）に対して５５ｋＤ、および
１．２２タンパク（配列番号３９０）に対して６６ｋＤ
において検出される必要がある。ウェスタンブロットは
ＥＬＩＳＡの感度に匹敵ないしはそれを凌駕するほど最
適化されていないので、陰性の結果が出ても直ちにＥＬ
ＩＳＡのデータを捨てることはしなかった。しかしなが
ら、陽性の結果が出れば、それはＥＬＩＳＡによって検
出された反応性を補強するものである。 実施例１５で
記載したように、繰り返し反応性のある検体で十分量あ
るものの対しては、プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ
（実施例１５の記載に従って実施）を実施し、血清中の
ＨＧＢＶ特異性ヌクレオチド配列を同定してもよい。
【０３４２】Ｉ．低リスク検体における血清学的データ 計２５２本の血漿検体をオハイオ州のインターステート
血液銀行から入手し、１．５組換えタンパク（配列番号
６１４）を用いた１．５ＥＬＩＳＡで抗体の有無を検査
した。この集団での平均吸収値は０．０３６（ＳＤ＝
０．０２２）であった。切捨て値は０．１６８と計算さ
れた。これはＳ／Ｎ比＝１０．０に対応する。７６０本
の血漿検体（切捨て値決定のために用いた２５２検体を
含む）について、１．５ＥＬＩＳＡで抗体の有無を検査
した。繰り返し反応性を示す検体はなかった。加えて、
１００本の血漿検体をウィスコンシン州南東部から入手
し、１．５ＥＬＩＳＡで抗体の有無を検査した。繰り返
し反応性を示す検体はなかった。
【０３４３】このように、１．５タンパクに対する抗体
の存在を示す証拠はアメリカ合衆国の血液提供者におい
ては見いだされなかった。２００本の検体をウィスコン
シンの血液提供者から入手し、２．１７組換えタンパク
（配列番号６０）を用いる２．１７ＥＬＩＳＡによって
抗体の有無を検査した。この集団での平均吸収値は０．
０５８（ＳＤ＝０．０２５）であった。切捨て値は０．
２０８と計算された。これはＳ／Ｎ比＝１０．０にほぼ
対応する。検体の一つは繰り返し反応性を示した。この
ように、アメリカ合衆国の血液提供者（Ｎ＝２００）に
おける血清学的有病率(seroprevalence)は比較的低かっ
た。
【０３４４】上のパラグラフに記載のものと同じ２００
検体について、１．１８および１．２２ＥＬＩＳＡで抗
体の有無を検査した。どの検体も繰り返し反応性を示さ
なかった。このように、ボランティアの血液提供者から
の検体については、１．５、２．１７、１．１８、およ
び１．２２ＥＬＩＳＡから判断するかぎり、ＨＧＢＶ−
Ａタンパクに関して抗体陽性であるという証拠はなかっ
た。
【０３４５】Ｊ．肝炎に関し「リスクあり」と考えられ
る検体 この研究でのデータを表１８にまとめて示す。
【０３４６】
【表１８】 （ｉ）西アフリカからの検体 １３００検体の内、５８検体が１．５ＥＬＩＳＡで反応
性を示した。繰り返し反応性であった１８検体のうちの
１２検体は、１．５タンパク（配列番号６１４）に対す
る抗体についてのウェスタンブロットで陽性であった。
８１７検体中４３検体が２．１７ＥＬＩＳＡで反応性で
あった。これらの繰り返し反応性の検体については、
２．１７タンパク（配列番号６１３）に対する抗体に関
するウェスタンブロットは行わなかった。
【０３４７】８１７検体中６検体が１．２２ＥＬＩＳＡ
で反応性であった。３５３検体中９検体が１．１８ＥＬ
ＩＳＡで反応性であった。２．１７ＥＬＩＳＡで反応性
の２１検体をウェスタンブロットで試験したところ、１
３検体が反応性であった。１．１８ＥＬＩＳＡで繰り返
し反応性の８検体がウェスタンブロットで陽性であっ
た。
【０３４８】これらのデータはＨＧＢＶが西アフリカの
風土病である可能性を示唆するものである。
【０３４９】（ii）経静脈麻薬使用者からの検体 経静脈麻薬使用者の集団から全１１２検体を採取した。
この試験はイリノイ州シカゴのハインズ退役軍人管理病
院で実施されたものの一部である。１検体は２．１７Ｅ
ＬＩＳＡで繰り返し反応性が認められた。追加の１検体
は１．１８ＥＬＩＳＡで反応性を示した。これらの検体
のいずれも１．５あるいは１．２２ＥＬＩＳＡでは陽性
ではなかった。
【０３５０】Ｋ．非Ａ−Ｅ肝炎の個体から採取した検体 得られたデータを表１８にまとめて示す。
【０３５１】
【表１９】 非Ａ−Ｅ肝炎の個体群から種々の検体集団（実施例１５
Ｋに記載）を得て、１．５、２．１７、１．１８、およ
び１．２２ＥＬＩＳＡ（実施例１５Ｃに記載）を実施し
た。幾つかの検体は血清量の不足のため全部のＥＬＩＳ
Ａアッセイは実施しなかった。
【０３５２】（ｉ）日本の検体 ８９検体中の計４検体は、１．５ＥＬＩＳＡで繰り返し
反応性を示した。そのうちの３検体は１個人から、１検
体は別の個人からのものであった。１．５ＥＬＩＳＡ、
１．１８ＥＬＩＳＡ、および１．２２ＥＬＩＳＡで陰性
であった１検体は、２．１７ＥＬＩＳＡでは反応性を示
した。１．１８ＥＬＩＳＡで反応性を示した検体はなか
った。これらの検体は、１．２２ＥＬＩＳＡでは検査し
なかった。
【０３５３】（ii）ニュージーランドの検体 ５６検体のうち１．５ＥＬＩＳＡで反応性を示したもの
はなかった。これらの検体は２．１７ＥＬＩＳＡ、１．
１８ＥＬＩＳＡ、あるいは１．２２ＥＬＩＳＡでは検査
しなかった。
【０３５４】(iii)ギリシャの検体 ６７検体（１０人の患者からのもの）のいずれもが１．
５、２．１７、あるいは１．２２ＥＬＩＳＡでは反応性
を示さなかった。
【０３５５】（iv）エジプトの検体 １３２検体中に１．５ＥＬＩＳＡに反応性の検体はなか
った。検査可能であった１３２検体中、計７検体が２．
１７ＥＬＩＳＡで反応性を有した。これらの検体は急性
の非Ａ−Ｅ肝炎患者２５名からのものであった。２５名
の患者のうち３名が２．１７ＥＬＩＳＡで肝炎の発症の
あと１日以上たったとき血清反応陽性であった。１．１
８、あるいは１．２２ＥＬＩＳＡで反応性の検体は存在
しなかった。
【０３５６】（ｖ）アメリカ合衆国の検体（セットＭ） ７２検体のいずれも１．５ＥＬＩＳＡで反応性を示さな
かった。７２検体中３検体は１．１８ＥＬＩＳＡで反応
性を示した。２検体が２．１７ＥＬＩＳＡで、また４検
体が１．２２ＥＬＩＳＡで反応性を示した。２サンプル
は一以上のＥＬＩＳＡで反応性を示した。
【０３５７】（vi）アメリカ合衆国の検体（セットＴ） ６４検体のいずれも１．５、１．２２、あるいは２．１
７ＥＬＩＳＡで反応性を示さなかった。１検体は１．１
８で反応性を有した。
【０３５８】(vii) アメリカ合衆国の検体（セット１） ６２検体中の計３検体が一以上のＧＢＶ−ＡのＥＬＩＳ
Ａで反応性を示した。２．１７および１．２２ＥＬＩＳ
Ａの両者で繰り返し反応性を示したものが１検体存在し
た。２．１７ＥＬＩＳＡのみに反応性の検体が１検体あ
り、別の１検体は１．２２ＥＬＩＳＡのみに反応性を示
した。１．５あるいは１．１８ＥＬＩＳＡに反応性の検
体は存在しなかった。
【０３５９】上に述べたように、2以上のＨＧＢＶ株が
あり、あるいは、２以上の別種のウイルスを本明細書に
記載の配列によって表すことができる。それらは本発明
の範囲内のものと考えられ、これを「肝炎ＧＢウイルス
（ＨＧＢＶ）」と呼ぶ。
【０３６０】Ｌ．血清反応の結果の統計的意義 これらのデータによって、ＨＧＢＶ−Ａタンパクに対す
る特異抗体（即ち１．５、２．１７、１．１８および
１．２２ＥＬＩＳＡで抗体に繰り返し反応性を示す検
体）は、ＨＧＢＶへの暴露に関し「リスクあり」と考え
られる個体および非Ａ−Ｅ肝炎と診断された個体におい
て検出されたが、アメリカ合衆国のボランティアからも
売血者からもそれほど高頻度には検出されることがなか
ったことが示された。表１９において、種々のカテゴリ
ーの検体（表１８の「低リスク」、「リスクあり」、お
よび非Ａ−Ｅ肝炎患者）からの血清反応の結果を合わ
せ、χ二乗検定で統計的意義について分析した。表１８
は検査した検体の総数におけるＨＧＢＶタンパクに対す
る抗体の血清学的存在をまとめたものであるが、これと
異なり、表１９のデータは、異なる個体（人）からの結
果を示している。ＧＢＶ−ＡのＥＬＩＳＡについては、
抗−ＨＧＢＶの血清学的存在をボランティア血液提供者
とＨＧＢＶへの暴露に関し「リスクあり」と考えられる
個体（西アフリカ、但しＩＶＤＵではないもの）との間
で比較すると、有意の差（ｐ値＝０．０００）が存在す
ることを示している。加えて、ボランティアの血液提供
者と比較した場合、エジプトとアメリカ合衆国における
非Ａ−Ｅ肝炎患者におけるＨＧＢＶ−Ａに対する抗体の
血清学的存在には、統計的に有意の差があった。このデ
ータは、ＨＧＢＶ−Ａに対する暴露と非Ａ−Ｅ肝炎とに
関連があることを示唆している。注：これらの最初の研
究ではＲＴ−ＰＣＲの結果は陰性であったが、その後の
データによって血清反応陽性の個体の血清においてフラ
ヴィ様ウイルス配列が見いだされた（実施例１９参
照）。
【０３６１】Ｍ．まとめ これらのデータは、本発明に記載のＥＬＩＳＡが西アフ
リカに居住している個体および非Ａ−Ｅ肝炎の個体にお
いて抗体を検出するのに有用であることを示唆するもの
である。西アフリカの個体群においては肝炎に罹患する
リスクは比較的高い。人々のほぼ８５％近くが肝炎Ｂウ
イルスに対する抗体に血清反応陽性であり、約５％が肝
炎Ｃウイルスに対する抗体に陽性である。これらのデー
タは、試験した検体の全カテゴリーにおいてＨＧＢＶに
対する抗体の血清学的存在を過小に評価しているように
思われる。さらなるＨＧＢＶエピトープが発見され、評
価されるにつれ、現在は診断を下すことができない患者
において肝炎を診断するにあたり、ＨＧＢＶゲノム
（群）に基づく試験の有用性がより重要なものとなるこ
とが期待される。
【０３６２】実施例１８．ヒトにおけるＧＢ関連ウイル
スの同定 Ａ．理論 ＨＧＢＶ−ＡおよびＨＧＢＶ−Ｂの両者のエピトープが
同定された（実施例３）。これらを血清学的マーカーと
して用いてヒトの血清および血漿サンプルをスクリーニ
ングした（実施例５および６）。これらのマーカーのう
ちの幾つかについての血清学的活性と非Ａ−Ｅ肝炎の発
症頻度との間に顕著な相関があったが、これはＨＧＢＶ
−Ｂがヒトにおける非Ａ−Ｅ肝炎の病因物質であること
を示唆している（実施例５Ｇ）。しかしながら、ＧＢヒ
ト血清をウェスタンブロットで分析してみるとＨＧＢＶ
−Ｂエピトープに対する反応性は示されなかった（実施
例３）。そのかわり、ＧＢヒト血清に少なくとも一つの
ＨＧＢＶ−Ａエピトープが同定された。これはＨＧＢＶ
−ＡがＧＢにおける肝炎の病因物質であったことを示唆
するものである。ＨＧＢＶ−Ａ配列もＨＧＢＶ−Ｂ配列
も、ＲＴ−ＰＣＲでは非Ａ−Ｅ肝炎の患者では同定され
なかった（実施例５Ｅ）。そこで非Ａ−Ｅ肝炎に罹患し
ているヒトにおけるＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢ
Ｖ−Ｂ感染の証拠を定める必要がいまだ残っている。
【０３６３】ヒト血清あるいは血漿源におけるＨＧＢＶ
−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂ配列の同定が失敗に終
わったことには幾つかの要因が考えられる。第一に、我
々がＲＴ−ＰＣＲによって検査したのは限られた数のＨ
ＧＢＶ−Ａ血清陽性および／またはＨＧＢＶ−Ｂ血清陽
性サンプルであって、これらのサンプルの多くは保存歴
が不明である。よってこれらのサンプル中に存在したウ
イルス性のＲＮＡが不適当な保存の影響を受けた可能性
がある。第二に、ＧＢ感染は自然に快癒するように見受
けられる。そのため、ＧＢ配列が感染した個体の血清中
に存在する期間幅は非常に狭い可能性がある。即ちＧＢ
配列を含有する血清サンプルを得る機会は極端に低いも
のとなろう。最後に、ＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧ
ＢＶ−Ｂ配列を探すにあたって、限られた数のＰＣＲプ
ライマーセットを用いたことが挙げられる。ＨＧＢＶ−
Ａおよび／またはＨＧＢＶ−ＢはＲＮＡウイルスである
ため、突然変異の率が高い傾向がある（ホランドら（１
９８２年）サイエンス２１５：１５７７−１５８５）。
即ち、検査したヒト血清中のＨＧＢＶ−Ａおよび／また
はＨＧＢＶ−Ｂ配列が我々のＰＣＲプライマーの配列と
は異なっていて、そのためＨＧＢＶ−Ａおよび／または
ＨＧＢＶ−Ｂが検出されない可能性がある。
【０３６４】ＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂ
のゲノムの変異性のために我々のＰＣＲ研究においてこ
れらのウイルスが妨害された可能性を示すため、ＨＧＢ
Ｖ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂの高度に保存された
ＮＳ３様の領域（図１７参照）に合わせ、変性ＰＣＲプ
ライマーを設計配置した。これらの高度に保存された領
域がウイルスの複製サイクルにおいて必要な機能を果た
しているからである。よってこれらの配列はＨＧＢＶ−
Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂ変異体においても保存さ
れているはずである。この領域内に設計配置されたＰＣ
Ｒプライマーは、ＲＴ−ＰＣＲによってＨＧＢＶ−Ａお
よび／またはＨＧＢＶ−ＢのゲノムＲＮＡを検出できる
はずである。加えて、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂおよ
びＨＣＶ配列を特異的に増幅することのできる変性ＰＣ
Ｒプライマーを設計すれば、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−
ＢおよびＨＣＶに関連するウイルスから得た配列を増幅
することができるかもしれないと我々は判断した。よっ
て、もし別々のＨＧＢＶ−Ａ関連ウイルスまたはＨＧＢ
Ｖ−Ｂ関連ウイルスの抗原と交差反応する抗体が存在す
るために、ヒトの血清および血漿サンプル（実施例５お
よび６）で血清反応があまり検出されなかったのである
ならば、我々はこれらのＧＢ関連ウイルスから配列を得
ることができるであろう。［これはニコルと彼の同僚が
最近米国南西部における急性呼吸器疾患の大流行に関連
する特殊なハンタウイルスを同定するために採用した実
験手法に類似のものである。ニコルら、サイエンス２６
２：９１４−９１７（１９９３）］ Ｂ．肝炎ＧＢウイルスＣ（ＨＧＢＶ−Ｃ）のＮＳ３様領
域のクローニング ウイルス感染のモデルでは、感染の初期段階でウイルス
血症が起こり、これがウイルスタンパクに対するＩｇＭ
抗体の検出と相関していることが多い。実施例５、６で
記載したように、ＨＧＢＶ−Ａ及びＨＧＢＶ−Ｂに由来
する組換えタンパクに対するＩｇＧ抗体が検出された検
体は、ＥＬＩＳＡにおいて免疫反応性を有していた。更
に追加のＥＬＩＳＡを実施し、ＩｇＭ抗体がこれらのタ
ンパクについて検出されるかどうかを調べた。西アフリ
カの個体（実施例５Ｅ−ｉ）の血清反応陽性の検体の内
のあるものは、組換えタンパクに対するＩｇＭ抗体に関
して反応性であった（データ省略）。これらの検体はウ
イルスを含有する可能性が高いと考えられた。加えて、
急性肝炎に罹患しているＨＧＢＶ−Ａ陽性およびＨＧＢ
Ｖ−Ｂ陽性のエジプトの個体（実施例５Ｆ−vii ）で、
ＨＧＢＶ−ＡまたはＨＧＢＶ−Ｂ組換えタンパクに対す
るＩｇＭ抗体が検出されない検体についても、急性肝臓
疾患はウイルスの存在と関連している可能性があること
から検査を実施した。これらのサンプルの核酸につい
て、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、及びＨＣＶ−１の各
配列を増幅する変性オリゴヌクレオチドプライマーを用
いて“半入れ子”(hemi-nested) ＲＴ−ＰＣＲを実施し
た。使用機器は ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡＰ
ＣＲキット（パーキンエルマー製）を用い、製造業者の
使用説明書に従って実施した。簡単に言えば、増幅の第
一セットは、２ｍＭのＭｇＣｌ2 および１μＭのプライ
マーｎｓ３．１−ｓとｎｓ３．１−ａ（配列番号はそれ
ぞれ６７１および６７２）で抽出した核酸のランダム−
プライムド逆転写反応によるｃＤＮＡ産物について行っ
た。反応物に対し、変性−アニーリング−伸展［（９４
℃、３０秒；３７℃、３０秒；２分かけて７２℃；７２
℃、３０秒）を３サイクル行い、次いで（９４℃、３０
秒；５５℃、３０秒；７２℃、３０秒）を３７サイクル
行う］を４０回行い、最後に７２℃で１０分間伸展させ
た。反応が終了したものは、４℃で保存した。増幅の第
二セットは、最初のＰＣＲ産物の４％を鋳型として使用
し、ｎｓ３．１−ｓおよびｎｓ３−ａ（配列番号はそれ
ぞれ６７１および６７３）を“ヘミネスティッド”プラ
イマーセットとして用いた他は上記と同様であった。Ｐ
ＣＲの第一及び第二のセットの産物をゲル濾過で分析し
た。
【０３６５】西アフリカの１サンプルは、約３８６ｂｐ
（ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、またはＨＣＶ産物の予
想されるサイズ）にぼやけた半入れ子反応に由来するＰ
ＣＲ産物を有していた。この産物を、本技術分野の書物
に記載されているｐＴ７ブルーＴ−ベクタープラスミド
（ノヴァゲン製）にクローニングした。このクローンか
ら得た配列（ＧＢｃｏｎｔｉｇＣ［ＧＢ−Ｃ］、配列番
号６７３、残基２２７４−２６４０）をＧＢｃｏｎｔｉ
ｇＡ（ＧＢ−Ａ、配列番号１６３、残基４４３８−４８
０４）、ＧＢｃｏｎｔｉｇＢ（ＧＢ−Ｂ、配列番号３９
３、残基４２１８−４５８７）、およびＨＣＶ−１（配
列番号３９８）と比較した。図３６は、これらの配列の
ヌクレオチド配列を示し、一方、表２０はこれらの配列
間の％相同性を示す。
【０３６６】
【表２０】 図３６と表２０に示すように、ＧＢ−Ａ、ＧＢ−Ｂ、お
よびＨＣＶ−１のヌクレオチドの比較の結果、これらの
配列は４７．９９〜６１．６６％互いに類似している。
このことは、これらのウイルスのＮＴＰ結合性ヘリカー
ゼに存在する保存されたアミノ酸残基を考えると特に驚
くべきことではない（実施例２Ｂ３、図１７Ａ）。西ア
フリカのサンプル（ＧＢ−Ｃ、配列番号６７３、残基２
２７４−２６４０）から得たＮＳ３ＰＣＲ産物のヌクレ
オチドと他のウイルスのヌクレオチドを比較すると、Ｇ
Ｂ−Ａ（配列番号１６３、残基４４３８−４８０４）、
ＧＢ−Ｂ（配列番号３９３、残基４２１８−４５８
７）、およびＨＣＶ−１（配列番号３９８）からのＮＳ
３配列に関連しているが、明確に異なっていることが示
唆されている。ウィスコンシン配列分析パッケージ（バ
ージョン８）中の核酸およびタンパクデータベースとＧ
Ｂ−Ｃ（配列番号６７３、残基２２７４−２６４０）と
のＢＬＡＳＴＩＮおよびＢＬＡＳＴＸ解析の結果、ＨＣ
Ｖの株の幾つかは配列の同一性に限界があることが判明
した。ヌクレオチドおよびアミノ酸に関するもっとも高
いＰ値（すなわち偶然に配列が整合した確率）はそれぞ
れ１．９×１０-20と５．３×１０-31であった（データ
省略）。以上を合わせると、これらのデータは、ＧＢ−
Ｃ（配列番号６７３、残基２２７４−２６４０）がＨＧ
ＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂおよび我々がここでＨＧＢＶ−
Ｃと標記するＨＣＶに関連するユニークなＧＢ様のウイ
ルスに由来するものであるかもしれないことを示唆して
いる。
【０３６７】Ｃ．ＧＢ−Ｃは外因性である ＧＢ−Ｃ配列に対するＰＣＲプライマーを用い、上記の
ように、即ち例えば実施例６Ｂに記載の手順によって、
この配列がヒト、アカゲザル、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅおよびＥ．ｃｏｌｉのゲノム中に検出されるかどうか
を決定した。ＰＣＲはパーキン−エルマー−シータスの
ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）を使用し、基本的に製造者
の指示書に従って実施した。即ち、３００ｎｇのゲノム
ＤＮＡを各１００μｌの反応物に対して使用した。ＰＣ
Ｒプライマー（配列番号６７５および６７６）を最終濃
度１．０μＭで使用した。ＰＣＲは４０サイクル行い
（９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、３０
秒）、次いで７２℃で１０分間伸展させた。ＰＣＲ産物
をアガロースゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウムで
核酸を直接染色したのちＵＶ照射で可視化し、さらにサ
ザントランスファーでＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンフィ
ルターに移してから放射標識プローブとハイブリダイズ
した。図３７は、ＧＢ−Ｃ（配列番号６７３、残基２２
７４−２６４０）から調製した放射線標識プローブとハ
イブリダイズした後、ＰＣＲ産物をサザンブロットして
得たＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅ（モレキュラー・ダイナ
ミクス社、カリフォルニア州サニーヴェイル）である。
ＧＢ−Ｃ（配列番号６７３）は、３００ｎｇのヒトゲノ
ムＤＮＡ中にＧＢ−Ｃプラスミド鋳型の〜３５０ｆｇ
（１ゲノムコピー当量、レーン５）および〜３５ｆｇ
（０．１ゲノムコピー当量、レーン６）が検出された以
外、ヒト（図１９、レーン１）、アカゲザル（レーン
２）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（レーン３）、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ（レーン４）の各ゲノムＤＮＡには検出されなか
った。（レーン７は〜３．５ｆｇ［０．０１ゲノムコピ
ー当量］のＧＢ−Ｃプラスミド鋳型からのＰＣＲ産物を
３００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ中に含有する。）このよ
うに、０．１ゲノムコピー当量を検出できるゲノムＰＣ
Ｒを使用してもＧＢ−Ｃ（配列番号６７３）はヒト、ア
カゲザル、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＥ．ｃｏｌ
ｉのゲノム中に検出できない。この結果は、ＧＢ−Ｃ
（配列番号６７３）が外因性（即ちウイルス性）起源で
あるという予想と一致している。
【０３６８】Ｄ．ＧＢ−Ｃは追加のヒト血清サンプル中
に検出できる 追加のＨＧＢＶ−ＡおよびＨＧＢＶ−Ｂ免疫反応性ヒト
血清サンプルにＲＴ−ＰＣＲを適用し、ＧＢ−Ｃ配列の
存在について調べた。実施例７に記載のように、血清サ
ンプルから抽出した核酸をランダムヘキサマーで逆転写
し、ｃＤＮＡに対して３５−４０サイクルの増幅を行い
（９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、３０−９
０秒）、次いで７２℃で１０分間伸展させた。ＧＢ−Ｃ
に特異的なＰＣＲプライマー（ｇ１３１−ｓｌとｇ１３
１−ａｌ、配列番号６７５と６７６）を濃度１．０μＭ
で使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分
離し、臭化エチジウムで核酸を直接染色したのちＵＶ照
射で可視化し、サザンブロットでＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナ
イロンフィルターに移してから放射標識プローブとハイ
ブリダイズした。西アフリカからの計４８本のＨＧＢＶ
−免疫陽性サンプルを試験した。ＧＢ−Ｃが同定された
最初のサンプルを含む西アフリカからの８サンプルは、
ＧＢ−Ｃ配列に陽性であることがＲＴ−ＰＣＲで判っ
た。ＧＢ血清反応陰性の西アフリカ血清サンプルを計１
０本試験したが、いずれも検出可能なＧＢ−Ｃ配列は有
していなかった。陽性サンプル４本からのＰＣＲ産物を
クローニングし、前記のように配列決定した。１５６に
わたるヌクレオチドを調べた所、試験した４クローンの
内の２つがＧＢ−Ｃ配列（配列番号６７３、残基２２７
４−２６４０）と同一であり、２クローン（配列番号６
７７および６７８）がＧＢ−Ｃ（配列番号６７３、残基
２２７４−２６４０）と８８．４％および８３．６％相
同の配列を含有していた（図３８）。しかしながら、ヌ
クレオチドレベルにおけるダイバージェンスにもかかわ
らず、各クローンは非常に類似しており、配列番号６７
８の予想された翻訳中にはただ一つのアミノ酸の相違が
見られただけであることが、予想された翻訳で示され
た。
【０３６９】ギリシャ、エジプトおよびアメリカ合衆国
の非Ａ−Ｅ肝炎の個体から追加の血清サンプルを得て、
前記のようにしてＧＢ−Ｃ配列について検査した。これ
らのサンプルはいずれもＧＢ−Ｃ配列は含有していなか
った。サンプル中にＧＢ−Ｃ配列が検出されなかったこ
とには幾つかの理由が考えられる（上記、理論の項参
照）。しかしながら、ＧＢ−Ｃ（配列番号６７３、残基
２２７４−２６４０）と二つのＧＢ−Ｃ変異体（配列番
号 ６７８と６７７）との間における上述の配列変化
は、もし密接に関連している西アフリカからのＨＧＢＶ
−Ｃがヌクレオチドレベルで１５．１％異なることがあ
るならば、ＧＢ−Ｃに特異的なＰＣＲプライマー（ｇ１
３１−ｓｌ、ｇ１３１−ａｌ、配列番号６７５と６７
６）が地理的に別個の隔離体であるＧＢ−Ｃウイルス
と、検出可能なＰＣＲ産物を産生するほどには十分ハイ
ブリダイズしないかもしれないことを示唆している。こ
の場合、ゲノムのより高度に保存された領域（５’ＵＴ
Ｒ）に設計されたＰＣＲプライマーによって、ＧＢ−Ｃ
配列を西アフリカ血清サンプル中に検出できるかもしれ
ない。
【０３７０】Ｅ．ＨＧＢＶ−Ｃ配列の伸展 実施例２Ａに記載のＰＣＲウォーキング法によって追加
のＧＢ−Ｃ配列を得た。即ち、当初ＧＢ−Ｃ（配列番号
６７３、残基２２７４−２６４０）を同定するために用
いた西アフリカのヒト血清から全核酸を抽出した。この
核酸を前記のようにして逆転写した。その結果得られた
ｃＤＮＡを、２ｍＭのＭｇＣｌ2を用いたこと以外はソ
レンセンらによって記載された方法に従って５０μｌの
ＰＣＲ反応物（ＰＣＲ１）中で増幅した。反応物を３５
サイクルの変性−アニーリング−伸展工程（９４℃、３
０秒；５５℃、３０秒；７２℃、９０秒）に付し、次い
で７２℃で１０分間伸展させた。ソレンセンらによって
記載された方法に従ってストレプトアビジン被覆常磁性
ビーズ（プロメガ社）によってビオチン化産物を単離し
た。次いでソレンセンらの記載する方法に従ってこのス
トレプトアビジンで精製した産物に上記と同じ全３５サ
イクルの変性−アニーリング−伸展によってネスティッ
ドＰＣＲ（ＰＣＲ２）を行った。得られた産物およびこ
れを精製するために用いたＰＣＲプライマーを表２１に
示す。
【０３７１】
【表２１】 さらに、上記のＰＣＲ１の条件下でオリゴヌクレオチド
プライマー（配列番号６６９および６７０）を用いて
１．３ｋｂ産物（Ｃ．１６）を生成した。この産物を表
２１に記載のものと共にアガロースゲルから単離し、本
技術分野で周知の方法によってｐＴ７ブルーＴ−ベクタ
ープラスミド（ノヴァゲン社）中にクローニングした。
【０３７２】クローニングした産物は、実施例５に記載
のようにして配列決定した。ＧＣＧパッケージ（バージ
ョン７）のプログラムによって配列を組み立てた。構築
されたｃｏｎｔｉｇの概略を図３９に示す。ＧＢ−Ｃは
長さが９０３４ｂｐで、その全長が配列決定された。こ
れを配列番号４００−６０６に示す。これらの配列番号
は三つの前進翻訳フレームと対応している。
【０３７３】実施例１９．ＣＫＳに基づいた発現と免疫
原性ＨＧＢＶ−Ｃポリペプチドの検出 実施例１７（表１３）に記載のウォーキング試験で得た
ＨＧＢＶ−Ｃ配列を、実施例１３の記載にしたがって表
２２（１０ユニット、ＮＥＢ）に掲載の制限酵素を用い
てＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００、ｐＪＯ２０１およ
びｐＪＯ２０２にクローニングした。追加のＰＣＲクロ
ーン２種、Ｃ３／２およびＣ８／１２、も発現した（図
３９）。配列番号６８１のプライマーによってＰＣＲ産
物Ｃ３／２を生成し、ＰＣＲ産物Ｃ８／１２と配列番号
６８５の補体を、実施例９の記載に従ってプライマー
（配列番号６９３とその補体）を用いて生成した。この
ＰＣＲ産物を前記のようにしてｐＴ７ブルー中にクロー
ニングし、次いで表２２に掲載した制限酵素で遊離さ
せ、上記のｐＪＯ２００、ｐＪＯ２０１およびｐＪＯ２
０２中にクローニングした。
【０３７４】一以上のＣＫＳ／ＨＧＢＶ−ＡあるいはＣ
ＫＳ／ＨＧＢＶ−Ｂ融合タンパクに対する抗体の存在が
１．７、４．１、または２．１７ＥＬＩＳＡ（実施例１
５、１６参照）によって示唆された二つのヒト血清を選
択し、ウェスタンブロットによって分析した。これらの
血清のうちの一つ（２４０Ｄ）は非Ａ−Ｅ肝炎（エジプ
ト）の個体からのものであり、他方（Ｇ８−８１）は西
アフリカの個体のものでＨＧＢＶへの暴露について「リ
スクあり」（実施例１５参照）のものであった。ＣＫＳ
／ＨＧＢＶ−Ｃ融合タンパクを発現し、これを前記のよ
うにしてニトロセルロースシートに移した。記載された
ようにブロットをプレブロックし、１０％のＥ．ｃｏｌ
ｉ溶解物と６ｍｇ／ｍｌのＸＬ１−ブルー／ＣＫＳ溶解
物を含有するブロッキングバッファーで１：１００に希
釈されたヒト血清サンプルの一つで一夜インキュベート
した。ブロットはＴＢＳで２回洗浄し、ＨＲＰＯ−接合
ヤギ抗−ヒトＩｇＧと反応させ、上記のように展開させ
た。結果を表２２に示す。
【０３７５】ＨＧＢＶ−Ｃタンパクの内この二つの血清
の一方あるいは他方と反応性を示したものがいくつかあ
り、その三つ（Ｃ．１、Ｃ．６、Ｃ．７）を選んでＥＬ
ＩＳＡアッセイ（実施例２０参照）に付した。このよう
にして、ＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂタン
パクと反応性を示すことが既に判っているサンプルは、
ＨＧＢＶ−Ｃタンパクとも反応することが判明した。三
つのＨＧＢＶウイルスからの複数のタンパクとの反応性
は、ウイルス間でエピトープが共有された結果の交差反
応によるものであるかもしれない。あるいは、これは複
数種のウイルスの感染によるものかもしれず、さらには
その他の同定されていない要因によるものである可能性
もある。
【０３７６】
【表２２】 実施例２０．ＧＢＶ−Ｃの血清学的研究 Ａ．組換えタンパク精製手順 ＣＫＳ融合タンパクを発現する細菌細胞を凍結し、−７
０℃で保存した。各ＧＢＶ−Ｃ構築物からの細菌細胞を
解凍し、実施例１５でＧＢＶ−Ｂ構築物について記載し
たようにして破砕処理した。さらに、組換えタンパク
を、実施例１５でＧＢＶ−Ｂ組換えタンパクについて記
載したようにして精製した。
【０３７７】この精製手順で収集した分画を電気泳動で
分離し、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色
して、分子量が約７５ｋＤ（ＣＫＳ−Ｃ．１／配列番号
４０４）、７１ｋＤ（ＣＫＳ−Ｃ．６／配列番号４０
４）、および４９ｋＤ（ＣＫＳ−Ｃ．７／配列番号４０
４）であるタンパクの存否を調べた。予想された分子量
のタンパクを示すバンドが、ＣＫＳ−Ｃ．６およびＣＫ
ＳＣ．７組換えタンパクについて観察された。ＣＫＳ−
Ｃ．１タンパクについては、予想された分子量７５ｋＤ
の所ではなく、分子量６２ｋＤに対応する箇所にバンド
が認められた。なぜ予想されたバンドと観察されたバン
ドが異なるのかは不明である。興味の対象のタンパクを
含有する分画をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって再
度調査した。
【０３７８】精製抗原を含有するプール分画の免疫原性
および構造の完全性を、実施例１３に記載の方法に従っ
てニトロセルロースに対する電子移動およびイムノブロ
ット法によって決定した。適切な陽性対照がなかったた
め、組換えタンパクは、各融合タンパクのＣＫＳ部分に
対するモノクローナル抗体との反応性によって同定し
た。ＣＫＳ−Ｃ．１タンパク（配列番号４０４）の組換
え抗原を検出すべく抗−ＣＫＳモノクローナル抗体を用
いてウェスタンブロット法で調べると、約６５ｋＤのと
ころにシングルバンドが認められた。この結果はＣＫＳ
−Ｃ．１タンパク（配列番号４０４）の予想サイズの７
５ｋＤとは異なっている。なお、ＣＫＳ−Ｃ．６タンパ
ク（配列番号４０４）およびＣＫＳ−Ｃ．７タンパク
（配列番号４０４）については、イムノブロット法で調
べた結果予想されたサイズを有していた。
【０３７９】Ｂ．ポリスチレンビーズの被覆手続き 上記タンパクを透析し、実施例１５の記載に従って、こ
れらのタンパクのポリスチレンビーズ上での免疫原性を
評価した。Ｃ．ＨＧＢＶに対する抗体を検出するための
ＥＬＩＳＡの手順各種ＥＬＩＳＡは実施例１５の記載に
従って実施した。
【０３８０】Ｄ．感染個体の血清におけるＨＧＢＶ−Ｒ
ＮＡの検出 各ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した検体について、
実施例１５のセクションＤの記載に従ってＨＧＢＶ−Ｒ
ＮＡを調べた。
【０３８１】Ｅ．タマリンの血清像 ＨＧＢＶ−Ｃゲノム由来のＣＫＳＣ．１タンパク、ＣＫ
ＳＣ．６タンパク、あるいはＣＫＳＣ．７タンパクを用
いたＥＬＩＳＡアッセイにおいて、タマリンからの血清
はいずれも特異的免疫反応を示さなかった。実施例１５
中のタマリンの血清像についての記載参照。
【０３８２】Ｆ．追補的試験 実施例１５に記載したように、最初反応性を示した検体
については、典型的には再試験を行った。ある検体が繰
り返し反応性を示した場合、ＥＬＩＳＡによるデータを
さらに補充すべく追加の試験（例えばウェスタンブロッ
ト）を実施することができる。ウェスタンブロットの結
果が陽性と考えられるためには、観察可能なバンドが
Ｃ．１タンパク（配列番号４０４）に対して６５ｋＤ、
Ｃ．６タンパク（配列番号４０４）に対して７１ｋＤ、
またはＣ．７タンパク（配列番号４０４）に対して４９
ｋＤにおいて検出される必要がある。ウェスタンブロッ
トはＥＬＩＳＡの感度に匹敵しあるいはそれを越えるほ
ど最適化されていないので、陰性の結果が出ても直ちに
ＥＬＩＳＡのデータを捨てることはしなかった。しかし
ながら、陽性の結果が出ればそれはＥＬＩＳＡによって
検出された反応性を補強するものである。
【０３８３】実施例１５で記載したように、繰り返し反
応性のある検体で十分量あるものに対しては、ＲＴ−Ｐ
ＣＲ（配列番号８と９に対応するプライマーを用い、実
施例１０の記載に従って実施）によって血清中のＨＧＢ
Ｖ−Ｃ特異性ヌクレオチド配列を同定することができ
る。
【０３８４】Ｇ．実験手順 実施例１５では、種々のヒト個体群におけるＨＧＢＶ−
ＢとＨＧＢＶ−Ａに対する抗体の存在を評価するため
に、ＨＧＢＶ−Ｂからの組換え抗原を使用したＥＬＩＳ
Ａを利用した。実施例１４に記載したように、固相の上
に被覆したＣＫＳ−Ｃ．１組換えタンパク（配列番号４
０４）を用いたＣ．１ＥＬＩＳＡ、ＣＫＳ−Ｃ．６組換
えタンパク（配列番号４０４）を用いたＣ．６ＥＬＩＳ
Ａ、およびＣＫＳ−Ｃ．７組換えタンパク（配列番号４
０４）を用いたＣ．７ＥＬＩＳＡを利用し、ＨＧＢＶ−
Ｃに対する抗体についての試験を同じ検体の多くについ
て行なった。実施例１５に述べたように、ＨＧＢＶを接
種した回復期にあるタマリンの５匹全てが、（１．７、
１．４および４．１ＥＬＩＳＡを用いて検出されたよう
に）ＨＧＢＶ−Ｂ組換えタンパクに応答する特異的では
あるが短命の抗体を産生した。Ｃ．１、Ｃ．６および
Ｃ．７ＥＬＩＳＡに応答する検出可能な抗体を産生した
タマリンはなかったが、ヒトの検体の幾つかは、ウエス
タンブロット法（実施例１３参照）によって試験したと
き、Ｃ．１、Ｃ．６およびＣ．７組換えタンパクに反応
する特異的な抗体を産生した。本実施例では、種々のヒ
ト個体群における抗体を検出する上でのＣ．１、Ｃ．６
およびＣ．７ＥＬＩＳＡの有用性を評価した。
【０３８５】Ｈ．切捨て値の決定 Ｃ．１、Ｃ．６およびＣ．７ＥＬＩＳＡの切捨て値を実
施例１５に記載したようにして決定した。
【０３８６】Ｉ．低リスク検体を用いて得た血清学的デ
ータ ウイスコンシン州南西部に住む健康なボランティアのド
ナーから１００本の血清と１００本の血漿を含む集団を
得るとともに、Ｃ．１ＥＬＩＳＡにおけるＣＫＳ−Ｃ．
１（配列番号４０４）タンパク、Ｃ．６ＥＬＩＳＡにお
けるＣＫＳ−Ｃ．６（配列番号４０４）タンパク、およ
びＣ．７ＥＬＩＳＡにおけるＣＫＳ−Ｃ．７（配列番号
４０４）タンパクを含むＨＧＢＶ−Ｃからの三種の組換
えタンパクに対する抗体について試験を行なった。
【０３８７】Ｃ．１ＥＬＩＳＡについては、血清および
血漿の検体の平均吸収値が、それぞれ０．０４９（標準
偏差（ＳＤ）＝０．０４０）と０．０３８（ＳＤ＝０．
０２９）であった。血清と血漿についての切捨て値はそ
れぞれ０．２１４と０．２８６と計算された。上記のよ
うに、切捨て値は、陰性対照の吸収値の関数として表す
こともでき、１０．０を越えるＳ／Ｎ値を有する検体は
反応性であると考えられた。この切捨て値を用いたとこ
ろ、１００の血漿検体にはＣ．１タンパク（配列番号４
０４）に対する抗体に初期反応性および繰り返し反応性
がみとめられたものはなく、１００の血清検体の内の一
つでは、Ｃ．１タンパク（配列番号４０４）に対する抗
体に初期反応性および繰り返し反応性が認められた。
【０３８８】Ｃ．６ＥＬＩＳＡについては、血清および
血漿の検体の平均吸収値が、それぞれ０．１０２（標準
偏差（ＳＤ）＝０．０４６）と０．１０５（ＳＤ＝０．
０４７）であった。１０以上のＳ／Ｎ値を有する検体が
反応性であると判断されるように切捨て値を設定した。
この切捨て値を用いたところ、３個の検体（２個は血清
の集団からで、１個は血漿の集団から）ではＣ．６タン
パク（配列番号４０４）に対する抗体に対して繰り返し
反応性がみとめられた。
【０３８９】Ｃ．７ＥＬＩＳＡについては、血清および
血漿の検体の平均吸収値が、それぞれ０．０６１（標準
偏差（ＳＤ）＝０．０４０）と０．０５０（ＳＤ＝０．
０５５）であった。１０以上のＳ／Ｎ値を有する検体が
反応性であると判断されるように切捨て値を設定した。
この切捨て値を用いたところ、Ｃ．７タンパク（配列番
号４０４）に対する抗体に対して繰り返し反応性である
と考えられる検体は無かった。
【０３９０】したがって、米国人の血液提供者（Ｎ＝２
００）の約１％にＣ１、Ｃ６またはＣ．７タンパクに対
する抗体が存在することが証明された。
【０３９１】Ｊ．肝炎に対し「リスクあり」と考えられ
る検体 この研究のデータを表２３にまとめて示す。
【０３９２】
【表２３】 （ｉ）西アフリカからの検体 １３７個の検体の内の計２０個が、ＧＢＶ−Ｃタンパク
を用いたＥＬＩＳＡの一種またはそれ以上において反応
性であった。９７個の内の合計１２個がＣ．１ＥＬＩＳ
Ａにおいて繰り返し反応性であることが認められ、５２
個の内の３個がＣ．６ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応
性であることが認められ、１３７個の検体の内の５個が
Ｃ．７ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であることが
認められた。Ｃ．１において反応性であった検体の内の
３個をウエスタンブロット法で試験し、反応性であるこ
とが分かった。
【０３９３】これらのデータは、ＨＧＢＶが西アフリカ
の風土病であることを示唆している。
【０３９４】（ii）経静脈麻薬使用者の検体 イリノイ州シカゴのハインズ退役軍人管理病院において
行なわれた研究の一環として、経静脈麻薬使用者の集団
から合計１１２個の検体を得た。１１２個の検体の内の
計２個が一種またはそれ以上のタンパクに対して繰り返
し反応性を有していた。１個の検体がＣ．１ＥＬＩＳＡ
において繰り返し反応性であることがみとめられ、１個
の検体がＣ．７ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であ
ることがみとめられた．Ｃ．６ＥＬＩＳＡにおいて陽性
であった検体は無かった。
【０３９５】Ｋ．非Ａ−Ｅ肝炎の個体から得た検体 この研究のデータを表２３にまとめて示す。
【０３９６】非Ａ−Ｅ肝炎を有する個体から種々の検体
の集団（実施例１５．Ｋに記載）を得、１．５、２．１
７、１．１８、および１．２２ＥＬＩＳＡ（実施例１
５．Ｃに記載）によって試験した。検体の量が不十分で
あったため、検体の全てを全てのＥＬＩＳＡにおいて試
験できなかった。
【０３９７】（ｉ）日本の検体 合計８９個の検体の内、Ｃ．１ＥＬＩＳＡにおいて繰り
返し反応性であるとみとめられたものは無かった。検体
の量が少なかったため、Ｃ６またはＣ．７ＥＬＩＳＡで
の抗体についての試験は行なわなかった。
【０３９８】（ii）ギリシャの検体 合計６７個の検体をＣ．１およびＣ．７ＥＬＩＳＡを用
いて試験した。反応性のみとめられた検体は無かった。
【０３９９】（iii）エジプトの検体 １３２個の検体の内の計１８個が一つ以上のＥＬＩＳＡ
において反応性であるとみとめられた。Ｃ．１ＥＬＩＳ
Ａにおいて反応性であるとみとめられたものは無かっ
た。計１５個の検体がＣ．６ＥＬＩＳＡにおいて反応性
であるとみとめられ、３個の検体がＣ．７ＥＬＩＳＡに
おいて反応性であるとみとめられた。
【０４００】（iv）米国の検体（Ｍセット） 合計６個の検体が一以上のＥＬＩＳＡにおいて反応性で
あると認められた。２個の検体がＣ．１ＥＬＩＳＡにお
いて繰り返し反応性であると認められた。４個の検体が
Ｃ．６ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であると認め
られた。Ｃ．７ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性の検
体は無かった。
【０４０１】（ｖ）米国からの検体（Ｔセット） ６４個の検体の内で、Ｃ．１ＥＬＩＳＡまたはＣ．６Ｅ
ＬＩＳＡにおいて反応性であると認められたものは無か
った。１個の検体がＣ．７ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し
反応性であった。
【０４０２】（vi）米国の種々の臨床現場からの検体
（セット１） 総計すると、６２個の検体の内の３個が一以上のＥＬＩ
ＳＡで反応性であると認められた。１個の検体がＣ．１
ＥＬＩＳＡおよびＣ．６ＥＬＩＳＡの両方において繰り
返し反応性であると認められた。２個の検体がＣ．７Ｅ
ＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であると認められた。
【０４０３】上記のように、ＨＧＢＶには二以上の株が
存在する可能性があり、即ち二以上の別個のウイルスを
本明細書に開示した配列によって表すことができる。こ
れらは本発明の範囲内であると考えられ“肝炎ＧＢウイ
ルス（“ＨＧＢＶ”）”と称す。
【０４０４】Ｌ．血清反応の結果の統計的意義 これらのデータは、ＨＧＢＶに晒されるリスクがあると
考えられる個人、および非Ａ−Ｅ肝炎であると診断され
た個人からは、ＨＧＢＶ−Ｃタンパク（即ち、Ｃ．１、
Ｃ．６およびＣ．７ＥＬＩＳＡの抗体に対して繰り返し
反応性である検体）に特異的な抗体が検出され、米国か
らのボランティアまたは売血血液提供者からはこれらの
抗体が低い割合で検出された。表２４に、種々のカテゴ
リーの検体（表２３に示す“低リスク”、“リスク有
り”、および非Ａ−Ｅ肝炎患者）について得られた血清
反応の結果をグループ分けして示し、χ二乗検定によっ
て統計的意義を分析した。試験した検体の総数における
ＨＧＢＶタンパクに対する抗体の血清学的にみた存在を
まとめた表２３のデータと異なり、表２４のデータは、
異なる個体（人）について得られた結果を反映してい
る。ＧＢＶ−ＣのＥＬＩＳＡについては、そのデータ
は、ボランティアの血液提供者における抗ＨＧＢＶの血
清学的にみた存在と、ＩＶＤＵではなくＨＧＢＶに晒さ
れる“リスクあり”と考えられる個体（西アフリカ）と
の比較においては有意差（ｐ値＝０．０００）があるこ
とを示している。また、エジプトと米国の非Ａ−Ｅ肝炎
に罹患している個体におけるＨＧＢＶ−Ｃに対する血清
学的にみた抗体の存在は、ボランティアの血液提供者と
比較した場合、統計的有意差があった。これらのデータ
によれば、ＨＧＢＶ−Ｃに晒されることは非Ａ−Ｅ肝炎
と関連していることが示唆される。注：これらの初期の
研究ではＲＴ−ＰＣＲの結果は陰性であったが、その後
に得られたデータによって、血清学的に陽性の個体（実
施例１９参照）の血清におけるフラヴィ様ウイルス配列
が判明した。
【０４０５】
【表２４】 実施例２１．非Ａ−Ｅ肝炎のヒトにおけるＨＧＢＶ−Ｃ
の存在 ＨＧＢＶ−Ｃに特異的なＥＬＩＳＡの生成により、非Ａ
−Ｅ肝炎に罹患している患者の免疫的に陽性の血清（Ｈ
ＧＢＶ−Ｃ血清学の実施例）を同定できるようになっ
た。この血清を、非Ａ−Ｅ肝炎であると立証された個体
（表２５）から得た幾つかの免疫的に陽性のＨＧＢＶ−
ＡとＨＧＢＶ−Ｂと共に、ＨＧＢＶ−Ｃ配列についてＲ
Ｔ−ＰＣＲによって試験した。ＨＧＢＶ−Ｃの異型もな
るべく検出できるよう、第１回目の増幅において変性Ｎ
Ｓ３オリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＴ−Ｐ
ＣＲを行ない、これに続き、ネスト化されたＧＢ−Ｃ特
異性プライマーを用いて第２回目の増幅を行なった。具
体的には、第１回目の増幅は、２ｍＭのＭｇＣｌ2 、お
よび１μＭのプライマーｎｓ３．２−ｓ１、ｎｓ３．２
−ａ１（配列番号はそれぞれ７１１と７１２）を使用
し、実施例６で述べたようにして調製された血清ｃＤＮ
Ａ製品を用いて行なった。反応物に対して変性−アニー
リング−伸展を４０回繰り返し〔（９４℃で３０秒、３
７℃で３０秒、２分間かけて７２℃に温度上昇、７２℃
で３０秒）というサイクルを３回繰り返し、その後（９
４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒）のサ
イクルを３７回〕、これに続き７２℃で１０分間伸展を
行なった。得られた反応物を４℃に維持した。第２回目
の増幅は、２ｍＭのＭｇＣｌ2、１μＭのＧＢ−Ｃ特異
性のプライマー（配列番号６７５と６７６）、および鋳
型としての４％の第１のＰＣＲ製品を使用して行なっ
た。第２回目の増幅では、増幅すべき鋳型との塩基対の
不適合を含んでいるようなオリゴヌクレオチドプライマ
ーを有する特定の生成物をも増幅するために設計された
温度循環計画を採用した〔Ｒｏｕｘ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ、１６：８１２〜８１４（１９９４
年）〕。即ち、反応は、温度循環（９４℃で２０秒、５
５℃（各サイクル毎に０．３℃低下）で３０秒、７２℃
で１分）を４３回行なった後、（９４℃で２０秒、４０
℃で３０秒、７２℃で１分）で１０回行い、最終伸展を
７２℃で１０分行なった。ＰＣＲ産物をアガロースゲル
電気泳動法により単離し、臭化エチジウムを用いて核酸
を直接染色した後、紫外線照射によって可視化し、サザ
ントランスファーでＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンフィル
ターに移した後、ＧＢ−Ｃに対する放射線標識化プロー
ブにハイブリダイゼーションを行なった。ＰＣＲ産物
を、当分野において述べられたようにクローン化すると
ともに配列決定した。
【０４０６】上記の方法を用い、ＧＢ−Ｃ．４、ＧＢ−
Ｃ．５、ＧＢ−Ｃ．６、およびＧＢ−Ｃ．７を得た。こ
れらの配列は、８２．１〜８６．６％の割合でＧＢ−Ｃ
（配列番号４００、塩基４１６７〜４３６５）と相同で
ある。図４０は、予期されたコドントリプレットにおけ
る、ＧＢ−Ｃと相同な領域に整合したＧＢ−Ｃ．４、Ｇ
Ｂ−Ｃ．５、ＧＢ−Ｃ．６、およびＧＢ−Ｃ．７の配列
の相違を示す。この図に示すように、ヌクレオチドの相
違の殆どは、ＧＢ−Ｃからのアミノ酸の変化を引き起こ
さない。このアミノ酸レベルでの全体的な配列の維持
は、ＧＢ−Ｃ．４、ＧＢ−Ｃ．５、ＧＢ−Ｃ．６、およ
びＧＢ−Ｃ．７が同じウイルスの異なった株であるＨＧ
ＢＶ−Ｃから得られたものであることを示唆している。
さらに、ヌクレオチドレベルでの配列の相違の程度は、
これらのＰＣＲ産物が以前に同定されたＧＢ−Ｃ配列の
何れかによる汚染の結果生じたものではないことを示し
ている。
【０４０７】これらの個体の内の三つ（ＧＢ−Ｃ．４、
ＧＢ−Ｃ．５、ＧＢ−Ｃ．６、およびＧＢ−Ｃ．７源）
については、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、またはＣ型肝炎に感
染している証拠はなかった。病因が未知の肝炎に罹患し
ている個体におけるＧＢ−Ｃ配列の存在は、ヒト肝炎の
原因物質の一つがＨＧＢＶ−Ｃであることを示唆してい
る。個体の内の２つ（ＧＢ−Ｃ．４とＧＢ−Ｃ．５を含
んでいる）については経時的試料が利用可能であった。
これらの試料中のＨＧＢＶ−Ｃの配列を追跡するため
に、クローン特異性のＲＴ−ＰＣＲを開発した。即ち、
血清から抽出した核酸を、実施例７において行なったよ
うにランダムヘキサマーによって逆転写した。得られた
ｃＤＮＡを、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃
で３０秒の条件での増幅を４０回行い、その後、伸展を
７２℃で１０分行なった。ＧＢ−Ｃ．４とＧＢ−Ｃ．５
に特異的なＰＣＲプライマー（ＧＢ−Ｃ．４−ｓ１とＧ
Ｂ−Ｃ．４−ａ１、またはＧＢ−Ｃ．５−ｓ１とＧＢ−
Ｃ．５−ａ１）を１．０μＭの濃度で使用した。ＰＣＲ
産物をアガロースゲル電気泳動法により単離し、臭化エ
チジウムを用いて核酸を直接染色した後、紫外線照射に
よって可視化し、サザントランスファーでＨｙｂｏｎｄ
−Ｎ＋ナイロンフィルターに移した後、放射線標識プロ
ーブにハイブリダイズした。
【０４０８】急性非Ａ−Ｅ肝炎に罹患しているエジプト
人の患者の血清においてＧＢ−Ｃ．４が見いだされた。
この患者はＨＧＢＶ−Ａタンパクについ血清反応陽性で
あった（ＨＧＢＶ−Ａ ＥＬＩＳＡの実施例参照）。こ
のエジプト人の患者から得た５個の一連の試料のＲＴ−
ＰＣＲはウイルス血症を示し、これは血清ＡＬＴ値が正
常になった後少なくも２０日の間持続した（表２６）。
血清ＡＬＴが正常になった後におけるＧＢ−Ｃ配列の存
在は、人によっては慢性の感染につながることを示唆し
た。しかし、この患者の試料はそれ以上は得られなかっ
たため、ＨＧＢＶ−Ｃの慢性化について結論を出すこと
はできない。この問題を解決するため追加の試料を求め
ている段階である。
【０４０９】ＧＢ−Ｃ．５は、肝炎に関連する再生不良
貧血に罹患していたカナダ人の患者から得た。この患者
の各試料は、Ｃ．７ＥＬＩＳＡにおいて血清学的に陽性
であった（実施例２０）。カナダ人の患者から再生不良
貧血の間（症状の顕出後１３日目）および死亡時（１４
日目、図４１）において得た試料から、ＧＢ−Ｃ．５特
異性のプライマー（ＧＢ−Ｃ．５−ｓ１とＧＢ−Ｃ．５
−ａ１）を用いてＧＢ−Ｃ．５を検出した。しかし、Ｇ
Ｂ−Ｃ．５特異性のＰＣＲは、症状の発生時（０日目、
急性肝炎）および３日目（肝不全）においてＧＢ−Ｃ．
５配列を検出できなかった。したがって、最初の試料中
にＧＢ−Ｃ．５が検出限界以下のレベルで存在していた
か否かは不明である。もし、存在していたとしたら、Ｈ
ＧＢＶ−Ｃは、その患者の再生不良貧血の原因物質であ
ったであろう。しかし、ＧＢ−Ｃ．５は、再生不良の危
期においてのみＲＴ−ＰＣＲによって検出されたため、
ＧＢ−Ｃ．５は、貧血の対処のために投与された血液製
品から混入したものかもしれない。この場合、再生不良
貧血へのＨＧＢＶ−Ｃの関連はＨＣＶと類似したもので
あろう〔ヒブス（Hibbs ）ら、ＪＡＭＡ、２６７、２０
５１〜２０５４（１９９２年）〕。
【０４１０】ＨＧＢＶ−ＣとＨＣＶとの関係が遠いこと
に鑑み、ＨＣＶ感染を検出するための現在の方法によ
り、ＨＧＢＶ−Ｃを含むヒトの試料を認識できるか否か
は興味の対象であった。ＨＣＶに暴露または感染した個
体の通常の検査法は、ＨＣＶ−１の３つまたはそれ以上
の領域から得た抗原を利用する抗体試験によるものであ
る。この試験により、殆どの個体におけるＨＣＶの既知
の遺伝子型の全てに対する抗体を検出できる〔サカモト
ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５、１７６１〜１７６
８（１９９４年）、スチュイバー（Stuyver ）ら、Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４、１０９３〜１１０２（１９
９３年）〕。ＨＣＶのための第２世代のＥＬＩＳＡを、
実施例１０（表２５）に記載されたＨＧＢＶ−Ｃを含む
試料に対して実施した。ＨＧＢＶ−Ｃを含む４つの試料
の内の一つがＨＣＶ抗原に対して血清反応陽性であっ
た。ＨＣＶに対して血清反応陰性のヒト血清中の限られ
たものだけが、非常に感度の高いＲＴ−ＰＣＲアッセイ
により、ＨＣＶゲノムＲＮＡに対して陽性であることが
示された〔スギタニ、１９９２年、＃６５〕。類似のＲ
Ｔ−ＰＣＲアッセイ（実施例９に記載されたような）
は、血清反応陽性の試料中のＨＣＶウイルス血症の存在
を確認した。しかし、血清反応ＨＣＶ陰性の試料にはＨ
ＣＶウイルス血症であるものは存在しなかった。したが
って、ＨＧＢＶ−Ｃ配列を含む４つの個体の内の一つは
ＨＣＶ感染の証拠を有しているものの、ＨＣＶの存在に
関する本アッセイは、ＨＧＢＶ−Ｃの存在を正確に予測
できなかった。この一人のＨＣＶ陽性の患者はＨＧＢＶ
−Ｃにも感染していたようである。この患者の肝炎がＨ
ＣＶ、ＨＧＢＶ−Ｃ、または両方のウイルスの存在によ
るものであったかは不明確である。同じ患者においてＨ
ＣＶとＨＧＢＶ−Ｃが発見されることは、これらの感染
を受ける共通のリスクが存在することを示唆するもので
あろう。
【０４１１】上記のＰＣＲ手順を使用し、１９９４年に
２人のボランティアの米国人提供者から得た血液の“正
常（normal）”ユニット中に、ＧＢ−Ｃ配列（図４１に
示した先のＧＢ−Ｃ分離株と〜８５％相同、データは示
していない）を同定した。これらのユニットは、試験の
結果ＨＢＶ、ＨＣＶについて陰性であるとされ、正常な
血清ＡＬＴ値を有していた。しかし、これらのユニット
は１．４ＥＬＩＳＡでの試験の結果、陽性とされた。免
疫的にスクリーニングされた〜１０００ユニットの内の
少なくとも２つの“正常”血液ユニットにＨＧＢＶ−Ｃ
が発見されたことは、このウイルスが現在、米国の血液
供給に存在していることを示唆している。しかし、我々
はＨＧＢＶタンパクから開発されたＥＬＩＳＡおよびＨ
ＧＢＶ配列からのヌクレオチドプローブを使用して、こ
れらの血液ユニットを同定できることを示す。
【０４１２】種々のＨＧＢＶ配列（図４１）には、多数
の配列のバリエーションがあることに留意しなければな
らない。ウイルス性の核酸に対するＰＣＲに基づくアッ
セイは、非常に敏感ではあるものの、オリゴヌクレオチ
ドプライマーとウイルス鋳型との間の配列の一致に依存
する。したがって、本研究で利用したＰＣＲプライマー
は、種々の分離物において十分保存されていないＨＧＢ
Ｖ−Ｃゲノムの領域に位置していたため、試験したＨＧ
ＢＶ−Ｃウイルス血症の試料の全てを、ここで採用した
ＲＴ−ＰＣＲによって検出できなかったのであろう。Ｈ
ＣＶ５’の翻訳されていない領域中に発見されたように
〔チャ（Cha ) ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．、２９、２５２８〜２５３４（１９９１年）〕、Ｈ
ＧＢＶ−Ｃゲノムの良く保存された領域からのＰＣＲプ
ライマーを利用することにより、ＨＧＢＶ−Ｃウイルス
血症の試料をより正確に検出できるようになろう。
【０４１３】
【表２５】
【０４１４】
【表２６】 実施例２２．配列の比較と系統的分析 ヌクレオチドと予測したアミノ酸配列の比較、即ちアラ
イメントを行なうことによってウイルスの近親性の程度
についての情報を得ることができる。ＨＧＢＶ配列と他
のウイルスの配列とのアライメントを行なうことによ
り、配列間の類似性と相同性の程度を量的に評価するこ
とができる。この情報は、ＨＧＢＶウイルスの分類のた
めの原理を開発するのに使用できる。一般に、二つのア
ミノ酸配列の間の類似性の計算は、アライメント中のア
ミノ酸対の側鎖の間の類似度程度に基づいて行なわれ
る。類似度は、アミノ酸の側鎖の物理化学的特徴、即
ち、寸法、形状、電荷、水素結合の能力、および化学的
反応性に基づいている。即ち類似したアミノ酸は類似の
物理化学的特徴を備えた側鎖を有している。例えば、フ
ェニルアラニンとチロシンは共に芳香性の側鎖を含んで
おり、したがって化学的に類似であると見做すことがで
きる。アミノ酸の化学についての議論は基礎的な生化学
の教科書、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３
版、ルバート・スタイヤー（Lubert Stier）編、Ｗ．
Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニュー
ヨーク、１９８８年に見ることができる。整列した２つ
のアミノ酸配列の間の相同性の計算は、一般的にアライ
メント中の同一のアミノ酸対の数を計数し、この数をア
ライメント中の配列の長さで割るという算術計算であ
る。アミノ酸配列のアライメントに使用する方法と同様
に、アライメントした２つのヌクレオチド配列の間の相
同性の程度の決定は、アライメント中の同一のヌクレオ
チド塩基対の数を計数し、この数をアライメント中の配
列の長さで割るという算術計算である。アラインした２
つのヌクレオチド配列の間の類似性の計算は、アライメ
ント中の種々の位置における対になった（即ち、整合し
た）対の間における遷移および転換に対して時として異
なる値を用いる。しかし、一対のヌクレオチド配列間の
類似性と相同性の点数は通常非常に接近しており、即ち
１〜２％以内である。
【０４１５】前に述べたように、ＨＧＢＶ作用物質とＣ
型肝炎遺伝子型のアミノ酸配列の間の相同性は限られた
ものである。ＨＧＢＶ作用物質とＨＣＶとの間の近親性
の程度をより精度良く決定するために、ＨＧＢＶ−Ａ、
ＢおよびＣの全体的な大きな開放読み枠（ＯＲＦ）の配
列、および幾つかの代表的なＨＣＶ分離物の大きなＯＲ
Ｆのアミノ酸配列を用いてアミノ酸配列アライメントを
行った。さらに、ヌクレオチドレベルにおけるＨＧＢＶ
作用物質とＨＣＶの間の近親性の程度は、ＨＧＢＶ−
Ａ、ＢおよびＣの全体的なゲノムヌクレオチド配列、お
よび幾つかの代表的なＨＣＶ分離物の全体的なゲノムヌ
クレオチド配列を用いて決定した。アミノ酸配列とヌク
レオチド配列の間のアライメントは、５３７１１、ウイ
スコンシン州マジゾン、サイエンスドライブ５７５にあ
るジェネティック・コンピュータ・グループ社から入手
可能なウイスコンシン配列分析パッケージ（バージョン
８）のプログラムＧＡＰを用いて行なった。ギャップ作
成とギャップ延長のペナルティーは、核酸配列のアライ
メントに対してはそれぞれ５．０と０．３であり、アミ
ノ酸配列の比較に対してはそれぞれ３．０と０．１であ
った。ＧＡＰプログラムは、アラインされている２つの
配列の間の百分率で表した類似性と相同性の程度を計算
するために、ニードルマン（Needleman ）とワンシュ
（Wunsch）のアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４
８、４４３〜４５３、１９７０年）を使用している。
【０４１６】選択された数の主要なＣ型肝炎のウイルス
（ＨＣＶ）遺伝子型のヌクレオチド配列とアミノ酸配列
をＧｅｎＢａｎｋから入手した。これをそれらの登録番
号とともに下記に示す。
【０４１７】
【表２７】 大きな開放読み枠（即ち推定の前駆体ポリタンパク）の
予想されるアミノ酸配列と、上記ＨＣＶ遺伝子型の各々
とＨＧＢＶ分離物との間のヌクレオチド配列との間の対
毎の比較結果を表２８と２９にそれぞれ示す。各ＨＣＶ
分離物の遺伝子型の指定を一番上の行に示す。この遺伝
子型の指定は、シモンズ・ピー（Simmonds, P ）ら（１
９９４年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９、１３２１〜１
３２４に記載されたＨＣＶ分離物のための命名法に基づ
く。
【０４１８】表２８に示すデータは、ＨＣＶ遺伝子型の
間におけるアミノ酸配列の相同性の下限が６９％である
ことを示している。この値は、シモンズら〔シモンズ・
ピー（Simmonds, P ）ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１
９、１３２１〜１３２４（１９９４年）〕が示した値に
非常に近い。シモンズらは、２つの主要な群からの８個
の完全なＨＣＶゲノムのコード化領域を比較して、６
７．１％〜６８．６％のアミノ酸配列の類似度を示し
た。しかし、この著者は、類似度を計算した方法を記載
しなかった。この値（６９％）は、ＨＣＶ−Ｊ８と他の
主要なＨＣＶ分離物との比較についてオコモト（Okomot
o ）ら〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８８、３３１〜３４１、
１９９２〕が報告した値にも非常に近い。しかし、これ
らの研究者も、相同性を計算した方法を述べなかった。
ＨＧＢＶポリタンパク配列と各ＨＣＶ遺伝子型との比較
は、ＨＧＢＶによってコードされたポリタンパクの配列
は、ＨＣＶポリタンパク（表２８）の何れのものに対し
ても３３％以下の相同性しか示さないことを明らかにし
ている。ヌクレオチド配列（表２９）の比較により、任
意のＨＧＢＶと任意のＨＣＶ分離物との間では最大で４
４．２％の相同性があり、これに対し、ＨＣＶの分離物
の間では最小でもヌクレオチド配列の相同性が６４．９
％である。したがって、ＨＧＢＶ−Ａ、ＢおよびＣとＨ
ＣＶとの間では、そのヌクレオチドと予想されるアミノ
酸配列の相同性が、既知のＨＣＶ遺伝子型について確立
された相同性の範囲から大きく外れたものであるため、
ＨＧＢＶウイルスはＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型である
と考えることはできない。
【０４１９】
【表２８】
【０４２０】
【表２９】 Ｃ型肝炎ウイルスとＧＢ型肝炎のウイルスとの間の関係
は、それらのアラインされたヌクレオチド、推定された
アミノ酸配列（即ち、大きな開放読み枠）、またはこれ
らの配列の一部について系統的分析を行なうことによっ
て調べることができる。この方法をＣ型肝炎ウイルスに
適用したところ、ＨＣＶ分離物の可変性により配列の６
つの均等に発散した主グループを描写することが示され
た〔シモンズ・ピー（Simmonds, P ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．（１９９３年）７４、２３９１〜２３９９
およびシモンズ・ピー(Simmonds, P) ら、Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．（１９９４年）７５、１０５３〜１０６
１〕。この分析の結果、Ｃ型肝炎ウイルスのための命名
法が確立された〔シモンズ・ピー(Simmonds, P )ら、Ｈ
ｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９、１３２１〜１３２４（１９
９４年）〕、この命名法では、分離物を配列間の進化論
的隔たりに基づいて遺伝子型に分類している。
【０４２１】ＧＢ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスと
の間の系統的関係を決定するために、ＮＳ３の推定ヘリ
カーゼ遺伝子およびＮＳ５Ｂの推定ＲＮＡ−依存ＲＮＡ
−ポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）内のアミノ酸配列のアライ
メントを行なった。また、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ内
の他のウイルスからの関連する配列、およびヘリカーゼ
遺伝子およびポリメラーゼ遺伝子内においてＦｌａｖｉ
ｖｉｒｉｄａｅのメンバーに対する進化論的近親性を有
することが示されているウイルスもアライメントに含め
た〔クーニン・イー・ヴイ(Koonin, E. V.) およびドル
ジャ・ブイ・ヴイ(Dolja, V. V )（１９９３年）、Ｃｒ
ｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
８、３７５〜４３０、およびクーニン・イー・ヴイ(Koo
nin, E.V.) （１９９１年）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．７２、２１７９〜２２０６〕。
【０４２２】アミノ酸配列のアライメントは、ウイスコ
ンシン配列分析パッケージ（バージョン８）のプログラ
ムＰＩＬＥＵＰを用いて行なった。アラインされた一対
の配列の間の系統的な距離は、ジェイ・フェルセンスタ
イン（J. Felsenstein）〔フェルセンスタイン・ジェイ
（１９８９年）、Ｃｌａｄｉｓｔｉｃｓ５、１６４〜１
６６〕のご好意により提供を受けたＰＨＹＬＩＰパッケ
ージ（バージョン３．５ｃ、１９９３年）のＰＲＯＴＤ
ＩＳＴプログラムを用いて決定した。この計算した距離
は、プログラムＮＥＩＧＨＢＯＲ（隣接結合設定）を使
用して系統図（phylogenetic trees）を組み立てるのに
使用した。プログラムＤＲＡＷＴＲＥＥを用いて系統図
をプロットした。使用したウイルスの配列とそれらに対
応するゲンバンク登録番号を表３０に示す。ヘリカー
ゼ、ＲｄＲｐ、または完全な大きな開放読み枠内で行な
ったアライメントのための各ＨＣＶ遺伝子型と各ＨＧＢ
Ｖウイルスとの間の旋回距離を、表３１、３２および３
３にそれぞれ示す。ＨＣＶ遺伝子型と、ＨＧＢＶウイル
スおよび表３０に列挙した他のウイルスとの間で計算し
た距離は示していない。ヘリカーゼ、ＲｄＲｐ、または
完全な大きな開放読み枠配列のアミノ酸アライメントに
ついて作られた系統図を図４２、４３および４４にそれ
ぞれ示す。
【０４２３】
【表３０】
【０４２４】
【表３１】
【０４２５】
【表３２】 ＨＧＢＶ−Ａ、ＢおよびＣの、ＮＳ５Ｂ領域内でコード
された、推定ＲｄＲｐと、幾つかのＨＣＶ遺伝子型のＲ
ｄＲｐ、伝染性ウイルス二種、幾つかの代表的なフラヴ
ィウイルス、および幾つかのポジティプストランドのＲ
ＮＡ植物ウイルスとの間でのアミノ酸配列のアライメン
トは、それらがポジティプストランドＲＮＡウイルスの
ＲｄＲｐに関連する保存された配列の特色を有すること
を示した（データは示していない）。類似の分析に基づ
き、ＨＧＢＶ−ＡとＨＧＢＶ−Ｂでコードされたヘリカ
ーゼは、これらのポジティプストランドのＲＮＡウイル
スのヘリカーゼと著しい相同性を示す（データは示して
いない）。例外は、ヘリカーゼ遺伝子を保有していない
と推定されるＣＡＲＭＶ、ＴＣＶ、およびＭＮＳＶであ
る〔グイレー・エッチ(Guilley, H)ら、（１９８５年）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３、６６６３
〜６６７７〕。これらの結果は、以前の系統的分析によ
って示された、これらのウイルスのヘリカーゼとＲｄＲ
ｐ遺伝子のスーパーグループへの関連に鑑みると予期で
きない結果ではなかった〔クーニン・イー・ヴイ（Koon
in, E. V. ）およびドルジャ・ブイ・ヴイ（Dolja, V.
V ）（１９９３年）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８、３７５〜４３０〕。しか
し、ヘリカーゼまたはＲｄＲｐ配列（表３１および３
３）の配列に基づくＨＧＢＶ分離物とＨＣＶ分離物の間
の系統的距離の調査は、これら２群の間には相当な隔た
りがあることを示している。計算された隔たりは、ＨＣ
Ｖ遺伝子型の間における近い関係を示し、２つの遺伝子
型の間での最大距離は０．３６９６（ＲｄＲｐ距離）で
ある。しかし、ＨＧＢＶ−Ａ、−Ｂ、または−ＣとＨＣ
Ｖ群の任意のメンバーとの間のＲｄＲｐから計算された
距離は、０．９６０４２〜１．４６２６１である。同様
に、任意の２つのＨＣＶ遺伝子型についてのヘリカーゼ
アライメントから計算された値は０．０４４５５５〜
０．１９７０６の範囲であるのに対し、ＨＣＶ群の任意
のメンバーとＨＧＢＶ−Ａ、−Ｂ、または−Ｃとの間の
距離は０．６９１３０〜０．８７１２０の範囲である。
また、ＨＣＶ遺伝子型とＧＢウイルスの完全な大きな開
放読み枠の予想されるアミノ酸配列のアライメントは、
ＨＣＶ分離物の進化論的隔たりの範囲は狭く（０．１７
９１８〜０．３９６４６）、一方、任意のＧＢウイルス
と任意のＨＣＶ分離物の間の距離は最小でも１．６８６
５０であることを示す。したがって、ＧＢ肝炎ウイルス
は、Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型が示す範囲から外れた
進化論的隔たりを示す。
【０４２６】ＨＧＢＶおよびＨＣＶの配列の系統的分析
は、“ＨＣＶ配列からのＨＧＢＶ配列のダイバージェン
スをＨＣＶ配列の間でのダイバージェンスとどの様にし
て比較できるか？特に、ＨＣＶ配列相互のダイバージェ
ンスよりもＨＣＶ配列からのＨＧＢＶ配列のダイバージ
ェンスの方が少ないのであろうか？”という疑問に答え
ようとするものである。もしＨＣＶ配列相互のダイバー
ジェンスよりもＨＧＢＶ配列のＨＣＶ配列からのダイバ
ージェンスが小さいとしたら、満足しなければならない
条件は、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、および／または
ＨＧＢＶ−Ｃの配列が、ＨＣＶ配列の最も距離的に関連
する対と同じ程度に、ＨＣＶ配列の少なくとも一つと接
近していることである（即ち、任意のＨＧＢＶ配列から
任意にＨＣＶ配列までの最小距離は、ＨＣＶ配列の間で
観察される最大値と等しいか小さい）。現在の配列デー
タはこの条件を満たしていない。表３１（ＲｂＲｐアラ
イメント）においては、最小ＨＣＶ−ＨＧＢＶ距離は、
最大ＨＣＶ−ＨＣＶの距離の２．８３倍であり、表３２
においては、最小ＨＣＶ−ＨＧＢＶ距離は、最大ＨＣＶ
−ＨＣＶの距離の３．５１倍である。したがって、デー
タは、ＨＧＢＶ配列は、前に特徴づけしたＨＣＶ群のメ
ンバーによってダイバージェンスが制限された群のメン
バーであるとする着想を支持するものではない。
【０４２７】これらの相対距離は、ブートストラップに
基づく試験を用いて調べることができる〔エフロン・ビ
ー（Efron, B. ）（１９８２年）、“ジャックナイフ、
ブートストラップ、および他の再サンプリング計画”、
Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、フィラデルフィ
ヤ、エルトン・ビー(Elton, B.) およびゴング・ジー
（Gong, G.）、１９８３年）“ジャックナイフ、ブート
ストラップ、およびクロスバリデーションの楽しい研
究”Ａｍ．Ｓｔａｔ．３７、３６〜４８〕。ブートスト
ラップサンプリングから得られた結果を表３２に示す。
この表は、ＨＣＶ−ＨＧＢＶのダイバージェンス（全て
のＨＣＶ−ＨＧＢＶ距離の内の最小値）のＨＣＶダイバ
ージェンス（全てのＨＣＶ−ＨＣＶ距離の内の最大値）
に対する比較を示すもので、ＰＲＯＴＤＩＳＴプログラ
ムを用いて計算したＰＡＭ距離に基づいている。配列ア
ライメントにおけるカラムの１０００のブートストラッ
プ再サンプリングにおいて、ＨＣＶ間の最大のダイバー
ジェンスは、ＨＣＶ配列からのＨＧＢＶ配列のダイバー
ジェンスの最小値を越えることは無かった（表３４）。
したがって、２つの分離した遺伝子からのコード領域の
アライメントに基づく個々の測定においては、ＨＣＶ遺
伝子型の遺伝子配列のダイバージェンスの範囲内にＨＧ
ＢＶの配列が入るという例は一つもない。慎重気味に推
測するとしても、ＨＧＢＶのためのデータを、ＨＣＶ配
列と同じ配列プールから引き出せる可能性は１００，０
００に一つ未満である。
【０４２８】
【表３３】 本研究で利用したＨＣＶ配列が、ＨＣＶ遺伝子型の最も
大きくダイバージェンスしたものを代表していると仮定
すると、これらの結果は、ＨＧＢＶ−Ａ、Ｂ、およびＣ
がＨＣＶの遺伝子型でないことを示している。また、Ｈ
ＧＢＶ−ＡとＨＧＢＶ−Ｃの間の関係は、それらのＨＧ
ＢＶ−Ｂに対する関係に比べより近いようであり、これ
は、ＨＧＢＶ−ＡとＨＧＢＶ−Ｃが異なったウイルスの
系列を代表するものであることを示唆している。同様に
ＨＧＢＶ−Ｂは、その独自のウイルス系列を代表する唯
一のものである。分析されたウイルス配列の間の相対旋
回距離は、図４５および４６に示した根のない系統図を
調べることによって容易に明らかになる。系統図におい
て枝の長さは進化論的距離に比例している。ＨＣＶウイ
ルスが近い進化論的関係を持つことは明らかであり、分
析を行なうにあたりコード化されたゲノム配列の一部を
使用するか、ゲノムの全体を使用するかを選択すること
と一致している（図４４）。ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−
Ｂ、およびＨＧＢＶ−Ｃと、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ
の他のメンバーとの間のダイバージェンスの程度が大き
いことは、Ｃ型肝炎ウイルスに最も緊密に関係している
ものの、ＧＢ作用物質はＨＣＶの遺伝子型とは考えるこ
とはできず、実際にはフラヴィウイルス科内の新しいグ
ループを代表するものであろうことを示している。
【０４２９】本発明は、試験試料中におけるＨＧＢＶ−
Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、およびＨＧＢＶ−Ｃの存在を決定す
るための試薬と方法を提供するものである。本明細書に
記載したＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、およびＨＧＢＶ
−Ｃに特異的なポリヌクレオチドまたはポリペプチド
（またはその断片）、またはこれらのポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドから産生される抗体は、一般に使用
されているアッセイ用試薬と組み合わせることができ、
また上記のウイルスに対する抗体を検出するための本ア
ッセイ手順に組み込むことができ、これは本発明の範囲
内と考えられるものである。あるいは、本明細書に記載
したＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、およびＨＧＢＶ−Ｃ
に特異的なポリヌクレオチドまたはポリペプチド（また
はその断片）、またはこれらのポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチド（またはその断片）から産生される抗体
は、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、およびＨＧＢＶ−Ｃ
ウイルスを検出するためにそれぞれ別個に使用できる。
【０４３０】本発明の他の用途または変種は、本明細書
の開示を検討すれば当業者にとって明らかなもである。
したがって、本発明は添付の請求の範囲のみによって限
定されることを意図するものである。
【０４３１】
【配列表】
【０４３２】
【化１】
【０４３３】
【化２】
【０４３４】
【化３】
【０４３５】
【化４】
【０４３６】
【化５】
【０４３７】
【化６】
【０４３８】
【化７】
【０４３９】
【化８】
【０４４０】
【化９】
【０４４１】
【化１０】
【０４４２】
【化１１】
【０４４３】
【化１２】
【０４４４】
【化１３】
【０４４５】
【化１４】
【０４４６】
【化１５】
【０４４７】
【化１６】
【０４４８】
【化１７】
【０４４９】
【化１８】
【０４５０】
【化１９】
【０４５１】
【化２０】
【０４５２】
【化２１】
【０４５３】
【化２２】
【０４５４】
【化２３】
【０４５５】
【化２４】
【０４５６】
【化２５】
【０４５７】
【化２６】
【０４５８】
【化２７】
【０４５９】
【化２８】
【０４６０】
【化２９】
【０４６１】
【化３０】
【０４６２】
【化３１】
【０４６３】
【化３２】
【０４６４】
【化３３】
【０４６５】
【化３４】
【０４６６】
【化３５】
【０４６７】
【化３６】
【０４６８】
【化３７】
【０４６９】
【化３８】
【０４７０】
【化３９】
【０４７１】
【化４０】
【０４７２】
【化４１】
【０４７３】
【化４２】
【０４７４】
【化４３】
【０４７５】
【化４４】
【０４７６】
【化４５】
【０４７７】
【化４６】
【０４７８】
【化４７】
【０４７９】
【化４８】
【０４８０】
【化４９】
【０４８１】
【化５０】
【０４８２】
【化５１】
【０４８３】
【化５２】
【０４８４】
【化５３】
【０４８５】
【化５４】
【０４８６】
【化５５】
【０４８７】
【化５６】
【０４８８】
【化５７】
【０４８９】
【化５８】
【０４９０】
【化５９】
【０４９１】
【化６０】
【０４９２】
【化６１】
【０４９３】
【化６２】
【０４９４】
【化６３】
【０４９５】
【化６４】
【０４９６】
【化６５】
【０４９７】
【化６６】
【０４９８】
【化６７】
【０４９９】
【化６８】
【０５００】
【化６９】
【０５０１】
【化７０】
【０５０２】
【化７１】
【０５０３】
【化７２】
【０５０４】
【化７３】
【０５０５】
【化７４】
【０５０６】
【化７５】
【０５０７】
【化７６】
【０５０８】
【化７７】
【０５０９】
【化７８】
【０５１０】
【化７９】
【０５１１】
【化８０】
【０５１２】
【化８１】
【０５１３】
【化８２】
【０５１４】
【化８３】
【０５１５】
【化８４】
【０５１６】
【化８５】
【０５１７】
【化８６】
【０５１８】
【化８７】
【０５１９】
【化８８】
【０５２０】
【化８９】
【０５２１】
【化９０】
【０５２２】
【化９１】
【０５２３】
【化９２】
【０５２４】
【化９３】
【０５２５】
【化９４】
【０５２６】
【化９５】
【０５２７】
【化９６】
【０５２８】
【化９７】
【０５２９】
【化９８】
【０５３０】
【化９９】
【０５３１】
【化１００】
【０５３２】
【化１０１】
【０５３３】
【化１０２】
【０５３４】
【化１０３】
【０５３５】
【化１０４】
【０５３６】
【化１０５】
【０５３７】
【化１０６】
【０５３８】
【化１０７】
【０５３９】
【化１０８】
【０５４０】
【化１０９】
【０５４１】
【化１１０】
【０５４２】
【化１１１】
【０５４３】
【化１１２】
【０５４４】
【化１１３】
【０５４５】
【化１１４】
【０５４６】
【化１１５】
【０５４７】
【化１１６】
【０５４８】
【化１１７】
【０５４９】
【化１１８】
【０５５０】
【化１１９】
【０５５１】
【化１２０】
【０５５２】
【化１２１】
【０５５３】
【化１２２】
【０５５４】
【化１２３】
【０５５５】
【化１２４】
【０５５６】
【化１２５】
【０５５７】
【化１２６】
【０５５８】
【化１２７】
【０５５９】
【化１２８】
【０５６０】
【化１２９】
【０５６１】
【化１３０】
【０５６２】
【化１３１】
【０５６３】
【化１３２】
【０５６４】
【化１３３】
【０５６５】
【化１３４】
【０５６６】
【化１３５】
【０５６７】
【化１３６】
【０５６８】
【化１３７】
【０５６９】
【化１３８】
【０５７０】
【化１３９】
【０５７１】
【化１４０】
【０５７２】
【化１４１】
【０５７３】
【化１４２】
【０５７４】
【化１４３】
【０５７５】
【化１４４】
【０５７６】
【化１４５】
【０５７７】
【化１４６】
【０５７８】
【化１４７】
【０５７９】
【化１４８】
【０５８０】
【化１４９】
【０５８１】
【化１５０】
【０５８２】
【化１５１】
【０５８３】
【化１５２】
【０５８４】
【化１５３】
【０５８５】
【化１５４】
【０５８６】
【化１５５】
【０５８７】
【化１５６】
【０５８８】
【化１５７】
【０５８９】
【化１５８】
【０５９０】
【化１５９】
【０５９１】
【化１６０】
【０５９２】
【化１６１】
【０５９３】
【化１６２】
【０５９４】
【化１６３】
【０５９５】
【化１６４】
【０５９６】
【化１６５】
【０５９７】
【化１６６】
【０５９８】
【化１６７】
【０５９９】
【化１６８】
【０６００】
【化１６９】
【０６０１】
【化１７０】
【０６０２】
【化１７１】
【０６０３】
【化１７２】
【０６０４】
【化１７３】
【０６０５】
【化１７４】
【０６０６】
【化１７５】
【０６０７】
【化１７６】
【０６０８】
【化１７７】
【０６０９】
【化１７８】
【０６１０】
【化１７９】
【０６１１】
【化１８０】
【０６１２】
【化１８１】
【０６１３】
【化１８２】
【０６１４】
【化１８３】
【０６１５】
【化１８４】
【０６１６】
【化１８５】
【０６１７】
【化１８６】
【０６１８】
【化１８７】
【０６１９】
【化１８８】
【０６２０】
【化１８９】
【０６２１】
【化１９０】
【０６２２】
【化１９１】
【０６２３】
【化１９２】
【０６２４】
【化１９３】
【０６２５】
【化１９４】
【０６２６】
【化１９５】
【０６２７】
【化１９６】
【０６２８】
【化１９７】
【０６２９】
【化１９８】
【０６３０】
【化１９９】
【０６３１】
【化２００】
【０６３２】
【化２０１】
【０６３３】
【化２０２】
【０６３４】
【化２０３】
【０６３５】
【化２０４】
【０６３６】
【化２０５】
【０６３７】
【化２０６】
【０６３８】
【化２０７】
【０６３９】
【化２０８】
【０６４０】
【化２０９】
【０６４１】
【化２１０】
【０６４２】
【化２１１】
【０６４３】
【化２１２】
【０６４４】
【化２１３】
【０６４５】
【化２１４】
【０６４６】
【化２１５】
【０６４７】
【化２１６】
【０６４８】
【化２１７】
【０６４９】
【化２１８】
【０６５０】
【化２１９】
【０６５１】
【化２２０】
【０６５２】
【化２２１】
【０６５３】
【化２２２】
【０６５４】
【化２２３】
【０６５５】
【化２２４】
【０６５６】
【化２２５】
【０６５７】
【化２２６】
【０６５８】
【化２２７】
【０６５９】
【化２２８】
【０６６０】
【化２２９】
【０６６１】
【化２３０】
【０６６２】
【化２３１】
【０６６３】
【化２３２】
【０６６４】
【化２３３】
【０６６５】
【化２３４】
【０６６６】
【化２３５】
【０６６７】
【化２３６】
【０６６８】
【化２３７】
【０６６９】
【化２３８】
【０６７０】
【化２３９】
【０６７１】
【化２４０】
【０６７２】
【化２４１】
【０６７３】
【化２４２】
【０６７４】
【化２４３】
【０６７５】
【化２４４】
【０６７６】
【化２４５】
【０６７７】
【化２４６】
【０６７８】
【化２４７】
【０６７９】
【化２４８】
【０６８０】
【化２４９】
【０６８１】
【化２５０】
【０６８２】
【化２５１】
【０６８３】
【化２５２】
【０６８４】
【化２５３】
【０６８５】
【化２５４】
【０６８６】
【化２５５】
【０６８７】
【化２５６】
【０６８８】
【化２５７】
【０６８９】
【化２５８】
【０６９０】
【化２５９】
【０６９１】
【化２６０】
【０６９２】
【化２６１】
【０６９３】
【化２６２】
【０６９４】
【化２６３】
【０６９５】
【化２６４】
【０６９６】
【化２６５】
【０６９７】
【化２６６】
【０６９８】
【化２６７】
【０６９９】
【化２６８】
【０７００】
【化２６９】
【０７０１】
【化２７０】
【０７０２】
【化２７１】
【０７０３】
【化２７２】
【０７０４】
【化２７３】
【０７０５】
【化２７４】
【０７０６】
【化２７５】
【０７０７】
【化２７６】
【０７０８】
【化２７７】
【０７０９】
【化２７８】
【０７１０】
【化２７９】
【０７１１】
【化２８０】
【０７１２】
【化２８１】
【０７１３】
【化２８２】
【０７１４】
【化２８３】
【０７１５】
【化２８４】
【０７１６】
【化２８５】
【０７１７】
【化２８６】
【０７１８】
【化２８７】
【０７１９】
【化２８８】
【０７２０】
【化２８９】
【０７２１】
【化２９０】
【０７２２】
【化２９１】
【０７２３】
【化２９２】
【０７２４】
【化２９３】
【０７２５】
【化２９４】
【０７２６】
【化２９５】
【０７２７】
【化２９６】
【０７２８】
【化２９７】
【０７２９】
【化２９８】
【０７３０】
【化２９９】
【０７３１】
【化３００】
【０７３２】
【化３０１】
【０７３３】
【化３０２】
【０７３４】
【化３０３】
【０７３５】
【化３０４】
【０７３６】
【化３０５】
【０７３７】
【化３０６】
【０７３８】
【化３０７】
【０７３９】
【化３０８】
【０７４０】
【化３０９】
【０７４１】
【化３１０】
【０７４２】
【化３１１】
【０７４３】
【化３１２】
【０７４４】
【化３１３】
【０７４５】
【化３１４】
【０７４６】
【化３１５】
【０７４７】
【化３１６】
【０７４８】
【化３１７】
【０７４９】
【化３１８】
【０７５０】
【化３１９】
【０７５１】
【化３２０】
【０７５２】
【化３２１】
【０７５３】
【化３２２】
【０７５４】
【化３２３】
【０７５５】
【化３２４】
【０７５６】
【化３２５】
【０７５７】
【化３２６】
【０７５８】
【化３２７】
【０７５９】
【化３２８】
【０７６０】
【化３２９】
【０７６１】
【化３３０】
【０７６２】
【化３３１】
【０７６３】
【化３３２】
【０７６４】
【化３３３】
【０７６５】
【化３３４】
【０７６６】
【化３３５】
【０７６７】
【化３３６】
【０７６８】
【化３３７】
【０７６９】
【化３３８】
【０７７０】
【化３３９】
【０７７１】
【化３４０】
【０７７２】
【化３４１】
【０７７３】
【化３４２】
【０７７４】
【化３４３】
【０７７５】
【化３４４】
【０７７６】
【化３４５】
【０７７７】
【化３４６】
【０７７８】
【化３４７】
【０７７９】
【化３４８】
【０７８０】
【化３４９】
【０７８１】
【化３５０】
【０７８２】
【化３５１】
【０７８３】
【化３５２】
【０７８４】
【化３５３】
【０７８５】
【化３５４】
【０７８６】
【化３５５】
【０７８７】
【化３５６】
【０７８８】
【化３５７】
【０７８９】
【化３５８】
【０７９０】
【化３５９】
【０７９１】
【化３６０】
【０７９２】
【化３６１】
【０７９３】
【化３６２】
【０７９４】
【化３６３】
【０７９５】
【化３６４】
【０７９６】
【化３６５】
【０７９７】
【化３６６】
【０７９８】
【化３６７】
【０７９９】
【化３６８】
【０８００】
【化３６９】
【０８０１】
【化３７０】
【０８０２】
【化３７１】
【０８０３】
【化３７２】
【０８０４】
【化３７３】
【０８０５】
【化３７４】
【０８０６】
【化３７５】
【０８０７】
【化３７６】
【０８０８】
【化３７７】
【０８０９】
【化３７８】
【０８１０】
【化３７９】
【０８１１】
【化３８０】
【０８１２】
【化３８１】
【０８１３】
【化３８２】
【０８１４】
【化３８３】
【０８１５】
【化３８４】
【０８１６】
【化３８５】
【０８１７】
【化３８６】
【０８１８】
【化３８７】
【０８１９】
【化３８８】
【０８２０】
【化３８９】
【０８２１】
【化３９０】
【０８２２】
【化３９１】
【０８２３】
【化３９２】
【０８２４】
【化３９３】
【０８２５】
【化３９４】
【０８２６】
【化３９５】
【０８２７】
【化３９６】
【０８２８】
【化３９７】
【０８２９】
【化３９８】
【０８３０】
【化３９９】
【０８３１】
【化４００】
【０８３２】
【化４０１】
【０８３３】
【化４０２】
【０８３４】
【化４０３】
【０８３５】
【化４０４】
【０８３６】
【化４０５】
【０８３７】
【化４０６】
【０８３８】
【化４０７】
【０８３９】
【化４０８】
【０８４０】
【化４０９】
【０８４１】
【化４１０】
【０８４２】
【化４１１】
【０８４３】
【化４１２】
【０８４４】
【化４１３】
【０８４５】
【化４１４】
【０８４６】
【化４１５】
【０８４７】
【化４１６】
【０８４８】
【化４１７】
【０８４９】
【化４１８】
【０８５０】
【化４１９】
【０８５１】
【化４２０】
【０８５２】
【化４２１】
【０８５３】
【化４２２】
【０８５４】
【化４２３】
【０８５５】
【化４２４】
【０８５６】
【化４２５】
【０８５７】
【化４２６】
【０８５８】
【化４２７】
【０８５９】
【化４２８】
【０８６０】
【化４２９】
【０８６１】
【化４３０】
【０８６２】
【化４３１】
【０８６３】
【化４３２】
【０８６４】
【化４３３】
【０８６５】
【化４３４】
【０８６６】
【化４３５】
【０８６７】
【化４３６】
【図面の簡単な説明】
【図１】タマリンＴ−１０５３のグラフを示し、個々の
タマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ／
ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットしたグ
ラフである。グラフ中、ＡＬＴ ＣＯはＡＬＴのカット
オフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を示
している。
【図２】タマリンＴ−１０４８のグラフを示し、個々の
タマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ／
ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットしたグ
ラフである。グラフ中、ＡＬＴ ＣＯはＡＬＴのカット
オフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を示
している。
【図３】タマリンＴ−１０５７のグラフを示し、個々の
タマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ／
ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットしたグ
ラフである。グラフ中、ＡＬＴ ＣＯはＡＬＴのカット
オフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を示
している。
【図４】タマリンＴ−１０６１のグラフを示し、個々の
タマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ／
ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットしたグ
ラフである。グラフ中、ＡＬＴ ＣＯはＡＬＴのカット
オフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を示
している。
【図５】タマリンＴ−１０４７のグラフを示し、個々の
タマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ／
ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットしたグ
ラフである。グラフ中、ＡＬＴ ＣＯはＡＬＴのカット
オフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を示
している。
【図６】タマリンＴ−１０４２のグラフを示し、個々の
タマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ／
ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットしたグ
ラフである。グラフ中、ＡＬＴ ＣＯはＡＬＴのカット
オフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を示
している。
【図７】タマリンＴ−１０４４のグラフを示し、個々の
タマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ／
ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットしたグ
ラフである。グラフ中、ＡＬＴ ＣＯはＡＬＴのカット
オフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を示
している。
【図８】タマリンＴ−１０３４のグラフを示し、個々の
タマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ／
ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットしたグ
ラフである。グラフ中、ＡＬＴ ＣＯはＡＬＴのカット
オフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を示
している。
【図９】タマリンＴ−１０５５のグラフを示し、個々の
タマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ／
ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットしたグ
ラフである。グラフ中、ＡＬＴ ＣＯはＡＬＴのカット
オフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を示
している。
【図１０】タマリンＴ−１０５１のグラフを示し、個々
のタマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ
／ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットした
グラフである。グラフ中、ＡＬＴ ＣＯはＡＬＴのカッ
トオフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を
示している。
【図１１】タマリンＴ−１０３８のグラフを示し、個々
のタマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ
／ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットした
グラフである。グラフ中、ＡＬＴ ＣＯはＡＬＴのカッ
トオフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を
示している。
【図１２】タマリンＴ−１０４９のグラフを示し、個々
のタマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ
／ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットした
グラフである。グラフ中、ＡＬＴ ＣＯはＡＬＴのカッ
トオフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を
示している。
【図１３】クローンの同定に使用される代表相違分析
（representational difference analysis，ＲＤＡ）に
含まれるステップの流れ図を示す。
【図１４】接種前及び急性ＨＧＢＶ感染タマリンの血漿
に実施した代表相違分析（ＲＤＡ）で得られた生成物の
エチジウムブロミド染色２.０％アガロースゲルを示
す。
【図１５】最初の３回の控除（subtraction）／ハイブ
リダイゼーションで得られた、ゲノムＤＮＡ、アンプリ
コン（amplicon）ＤＮＡ、及び産物のサザンブロットの
オートラジオグラムを示す。
【図１６】図１５に示したのと同じオートラジオグラム
であるが、但し、別の放射性標識プローブを使用した。
【図１７】ゲノムＤＮＡ由来のポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）増幅産物のエチジウムブロミド染色１.５％
アガロースゲルを示す。
【図１８】図１７の１.５％アガロースゲルのサザンブ
ロットで得られたオートラジオグラムを示す。
【図１９】正常ヒト血清並びに接種前及び急性タマリン
血漿から得られたＲＴ−ＰＣＲ産物のエチジウムブロミ
ド染色１.５％アガロースゲルを示す。
【図２０】図１９に示したのと同じゲルのサザンブロッ
トで得られたオートラジオグラムを示す。
【図２１Ａ】未感染タマリン及びＨＧＢＶ感染タマリン
の肝臓から抽出された全細胞ＲＮＡのノーザンブロット
のオートラジオグラムを示す。
【図２１Ｂ】未感染タマリン及びＨＧＢＶ感染タマリン
の肝臓から抽出された全細胞ＲＮＡのノーザンブロット
のオートラジオグラムを示す。
【図２２】各組換えポリヌクレオチド単離体が連続ＲＮ
Ａ種に存在することを示す図である。
【図２３】ＡはＨＧＢＶ−Ａのドットブロット比較を示
し、核酸配列のドットプロット分析を示し、ＢはＨＧＢ
Ｖ−Ｂのドットブロット比較を示し、核酸配列のドット
プロット分析を示し、ＣはＨＧＢＶ−Ａ対ＨＧＢＶ−Ｂ
のドットブロット比較を示し、核酸配列のドットプロッ
ト分析を示す。
【図２４】ＡはＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＣＶ
−１ ＮＳ３の推定翻訳産物の推定ＮＴＰ結合ヘリカー
ゼドメインにおける保存残基を示し、ＢはＨＧＢＶ−
Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＣＶ−１ ＮＳ５ｂの推定翻訳
産物のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼドメインの保存
残基を示す。
【図２５】Ａ、ＢはＣＫＳ融合タンパク質全細胞溶解物
のクーマシー染色１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ルを示す。３つのＣＫＳ融合タンパク質がＨＧＢＶ感染
タマリン血清に対して免疫反応性を示している。
【図２６】タマリンＴ−１０４８のグラフを示し、個々
のタマリンの、１）時間（接種後の週数）に対する肝酵
素（ＡＬＴ）の量（ｍＵ／ｍｌ）（実線で示す）；２）
ＣＫＳ−１.７組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値
（点線で結ばれた黒丸で示す）；３）ＣＫＳ−１.４組
換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた白
丸で示す）；４）ＣＫＳ−４.１組換えタンパク質のＥ
ＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた＋で示す）；５）配列
番号２１のプライマーを使用した陰性ＰＣＲ結果（中白
の四角で示す）；６）配列番号２１のプライマーを使用
した陽性ＰＣＲ結果（中黒の四角で示す）；７）配列番
号２６のプライマーを使用した陰性ＰＣＲ結果（中白の
菱形で示す）；８）配列番号２６のプライマーを使用し
た陽性ＰＣＲ結果（中黒の菱形で示す）；９）接種デー
タ（矢頭で示す）をプロットしたグラフである。
【図２７】タマリンＴ−１０５７のグラフを示し、個々
のタマリンの、１）時間（接種後の週数）に対する肝酵
素（ＡＬＴ）の量（ｍＵ／ｍｌ）（実線で示す）；２）
ＣＫＳ−１.７組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値
（点線で結ばれた黒丸で示す）；３）ＣＫＳ−１.４組
換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた白
丸で示す）；４）ＣＫＳ−４.１組換えタンパク質のＥ
ＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた＋で示す）；５）配列
番号２１のプライマーを使用した陰性ＰＣＲ結果（中白
の四角で示す）；６）配列番号２１のプライマーを使用
した陽性ＰＣＲ結果（中黒の四角で示す）；７）配列番
号２６のプライマーを使用した陰性ＰＣＲ結果（中白の
菱形で示す）；８）配列番号２６のプライマーを使用し
た陽性ＰＣＲ結果（中黒の菱形で示す）；９）接種デー
タ（矢頭で示す）をプロットしたグラフである。
【図２８】タマリンＴ−１０６１のグラフを示し、個々
のタマリンの、１）時間（接種後の週数）に対する肝酵
素（ＡＬＴ）の量（ｍＵ／ｍｌ）（実線で示す）；２）
ＣＫＳ−１.７組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値
（点線で結ばれた黒丸で示す）；３）ＣＫＳ−１.４組
換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた白
丸で示す）；４）ＣＫＳ−４.１組換えタンパク質のＥ
ＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた＋で示す）；５）配列
番号２１のプライマーを使用した陰性ＰＣＲ結果（中白
の四角で示す）；６）配列番号２１のプライマーを使用
した陽性ＰＣＲ結果（中黒の四角で示す）；７）配列番
号２６のプライマーを使用した陰性ＰＣＲ結果（中白の
菱形で示す）；８）配列番号２６のプライマーを使用し
た陽性ＰＣＲ結果（中黒の菱形で示す）；９）接種デー
タ（矢頭で示す）をプロットしたグラフである。
【図２９】タマリンＴ−１０５１のグラフを示し、個々
のタマリンの、１）時間（接種後の週数）に対する肝酵
素（ＡＬＴ）の量（ｍＵ／ｍｌ）（実線で示す）；２）
ＣＫＳ−１.７組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値
（点線で結ばれた黒丸で示す）；３）ＣＫＳ−１.４組
換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた白
丸で示す）；４）ＣＫＳ−４.１組換えタンパク質のＥ
ＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた＋で示す）；５）配列
番号２１のプライマーを使用した陰性ＰＣＲ結果（中白
の四角で示す）；６）配列番号２１のプライマーを使用
した陽性ＰＣＲ結果（中黒の四角で示す）；７）配列番
号２６のプライマーを使用した陰性ＰＣＲ結果（中白の
菱形で示す）；８）配列番号２６のプライマーを使用し
た陽性ＰＣＲ結果（中黒の菱形で示す）；９）接種デー
タ（矢頭で示す）をプロットしたグラフである。
【図３０】タマリンＴ−１０３４のグラフを示し、個々
のタマリンの、１）時間（接種後の週数）に対する肝酵
素（ＡＬＴ）の量（ｍＵ／ｍｌ）（実線で示す）；２）
ＣＫＳ−１.７組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値
（点線で結ばれた黒丸で示す）；３）ＣＫＳ−１.４組
換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた白
丸で示す）；４）ＣＫＳ−４.１組換えタンパク質のＥ
ＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた＋で示す）；５）配列
番号２１のプライマーを使用した陰性ＰＣＲ結果（中白
の四角で示す）；６）配列番号２１のプライマーを使用
した陽性ＰＣＲ結果（中黒の四角で示す）；７）配列番
号２６のプライマーを使用した陰性ＰＣＲ結果（中白の
菱形で示す）；８）配列番号２６のプライマーを使用し
た陽性ＰＣＲ結果（中黒の菱形で示す）；９）接種デー
タ（矢頭で示す）をプロットしたグラフである。
【図３１】患者１０１のグラフを示し、ヒト検査試料
の、１）時間（接種後の週数）に対する肝酵素（ＡＬ
Ｔ）の量（ｍＵ／ｍｌ）（実線で示す）；２）ＣＫＳ−
１.７組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結
ばれた黒丸で示す）；３）ＣＫＳ−１.４組換えタンパ
ク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた白丸で示す）
をプロットしたグラフである。
【図３２】患者２５７のグラフを示し、ヒト検査試料
の、１）時間（接種後の週数）に対する肝酵素（ＡＬ
Ｔ）の量（ｍＵ／ｍｌ）（実線で示す）；２）ＣＫＳ−
１.７組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結
ばれた黒丸で示す）；３）ＣＫＳ−１.４組換えタンパ
ク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた白丸で示す）
をプロットしたグラフである。
【図３３】患者２６０のグラフを示し、ヒト検査試料
の、１）時間（接種後の週数）に対する肝酵素（ＡＬ
Ｔ）の量（ｍＵ／ｍｌ）（実線で示す）；２）ＣＫＳ−
１.７組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結
ばれた黒丸で示す）；３）ＣＫＳ−１.４組換えタンパ
ク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた白丸で示す）
をプロットしたグラフである。
【図３４】患者３４０のグラフを示し、ヒト検査試料
の、１）時間（接種後の週数）に対する肝酵素（ＡＬ
Ｔ）の量（ｍＵ／ｍｌ）（実線で示す）；２）ＣＫＳ−
１.７組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結
ばれた黒丸で示す）；３）ＣＫＳ−１.４組換えタンパ
ク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた白丸で示す）
をプロットしたグラフである。
【図３５】ＡはＣｏｎｔｉｇ．Ａ、Ｃｏｎｔｉｇ．Ｂ及
びＨＣＶ−１ ＮＳ３の推定翻訳産物の推定ＮＴＰ結合
ヘリカーゼドメインの保存残基を示し、Ｂは Ｃｏｎｔ
ｉｇ．Ａ、Ｃｏｎｔｉｇ．Ｂ及びＨＣＶ−１ ＮＳ５ｂ
の推定翻訳産物のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼドメ
インの保存残基を示す。
【図３６】ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、ＨＧＢＶ−Ｃ
及びＨＣＶ−１のヌクレオチドの整列を示す。
【図３７】ＧＢ−Ｃ由来の放射性標識プローブを用いて
ハイブリダイズした後のＰＣＴ産物のサザンブロットか
ら得られたＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）
を示す。
【図３８】ＨＧＢＶ−Ｃと２種の変種クローンとのヌク
レオチド整列を示す。
【図３９】ＨＧＢＶ−Ｃの集成後のＣｏｎｔｉｇの概略
を表わす。
【図４０】ＨＧＢＶ−Ｃと４種の変種クローンとのヌク
レオチド整列を示す。
【図４１】カナダ人患者ＧＢ−Ｃ.５.由来の放射性標識
プローブを用いてハイブリダイズした後のカナダ人肝炎
患者から生成されたＰＣＴ産物のサザンブロットのＰｈ
ｏｓｐｈｏＩｍａｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａ
ｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を示す。
【図４２】記載のウイルスのヘリカーゼドメインの整列
から生成された系統樹を示す。
【図４３】ＳＣＯＴＴ、記載のウイルスのＲＮＡ依存性
ＲＮＡポリメラーゼドメインの整列から生成された系統
樹を示す。
【図４４】記載のウイルスの大読取り枠（推定前駆体ポ
リプロテイン）の整列から生成された系統樹を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/29 ＡＤＹ 39/29 ＡＤＹ 39/395 Ｄ 39/395 Ｓ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/576 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 タミ・ジエイ・パイロツト−マテイアス アメリカ合衆国、イリノイ・60048、グリ ーン・オークス、クランブルツク・ロー ド・2100 (72)発明者 ジヨージ・ジエイ・ドーソン アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイビル、サウス・ダイモンド・ロード・ 914 (72)発明者 ジヨージ・ジー・シユラウダー アメリカ合衆国、イリノイ・60076、スコ キー、カーラブ・7640 (72)発明者 サーレツシユ・エム・デサイ アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイビル、アミー・レーン・1408 (72)発明者 トマス・ピー・リアリー アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、 ケノーシヤ、ワンハンドレツドセブンス・ アベニユー・6820 (72)発明者 アンソニー・スコツト・ミユーホフ アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、 ケノーシヤ、シツクステイエイス・プレイ ス・611 (72)発明者 ジエイムズ・カール・エルカー アメリカ合衆国、イリノイ・60030、ハイ ネスビル、ノース・ホワイト・テイル・ド ライブ359 (72)発明者 シエリ・エル・ビユイジク アメリカ合衆国、イリノイ・60073、ラウ ンド・レイク、イースト・プリンストン・ コート・660 (72)発明者 イサ・ケイ・マツシユアワー アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレ イスレイク、アーバー・ブルバード・ 18790

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１種の肝炎ＧＢウイルス（Ｈ
    ＧＢＶ）エピトープに対する抗体。
  2. 【請求項２】 前記抗体がポリクローナルである請求項
    １に記載の抗体。
  3. 【請求項３】 前記抗体がモノクローナルである請求項
    １に記載の抗体。
  4. 【請求項４】 検査試料中の肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢ
    Ｖ）抗原または抗体の存在を判定するためのキットであ
    って、ＨＧＢＶの配列と少なくとも６０％の配列類似率
    を有する配列によってコードされるＨＧＢＶエピトープ
    を含むＨＧＢＶ抗原に特異的に結合する抗体を含む容器
    を包含するキット。
  5. 【請求項５】 前記抗体が固相に付着されている請求項
    ４に記載のキット。
  6. 【請求項６】 肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）を含む疑
    いのある検査試料中のＨＧＢＶ抗原を検出する方法であ
    って、 ａ．前記検査試料を、少なくとも１種のＨＧＢＶ抗原に
    特異的に結合する抗体またはそのフラグメントと、抗体
    ／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で接
    触させ； ｂ．前記抗体を含む複合体を検出することからなる方
    法。
  7. 【請求項７】 前記抗体が固相に付着されている請求項
    ６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記抗体がモノクローナル抗体またはポ
    リクローナル抗体である請求項６に記載の方法。
  9. 【請求項９】 肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）に対する
    抗体を製造する方法であって、個体に、免疫応答を生起
    するのに十分な量の少なくとも１つのＨＧＢＶエピトー
    プを含む単離免疫原性ポリペプチドまたはそのフラグメ
    ントを投与することからなる方法。
JP10111629A 1994-02-14 1998-03-31 肝炎ｇｂウイルスエピトープに対する抗体及びその使用 Pending JPH10337193A (ja)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19603094A 1994-02-14 1994-02-14
US196030 1994-02-14
US24265494A 1994-05-13 1994-05-13
US242654 1994-05-13
US28331494A 1994-07-29 1994-07-29
US283314 1994-07-29

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP52144195A Division JP3580822B2 (ja) 1994-02-14 1995-02-14 非ａ非ｂ非ｃ非ｄ非ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH10337193A true JPH10337193A (ja) 1998-12-22

Family

ID=27393563

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP52144195A Expired - Fee Related JP3580822B2 (ja) 1994-02-14 1995-02-14 非ａ非ｂ非ｃ非ｄ非ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法
JP10111629A Pending JPH10337193A (ja) 1994-02-14 1998-03-31 肝炎ｇｂウイルスエピトープに対する抗体及びその使用
JP2004176507A Expired - Fee Related JP3848663B2 (ja) 1994-02-14 2004-06-15 非ａ非ｂ非ｃ非ｄ非ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP52144195A Expired - Fee Related JP3580822B2 (ja) 1994-02-14 1995-02-14 非ａ非ｂ非ｃ非ｄ非ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004176507A Expired - Fee Related JP3848663B2 (ja) 1994-02-14 2004-06-15 非ａ非ｂ非ｃ非ｄ非ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法

Country Status (1)

Country Link
JP (3) JP3580822B2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001278894A (ja) * 2000-03-29 2001-10-10 Osamu Ozawa 血液循環障害予防および／または治療用医薬用組成物並びにその有効成分であるペプチド
JP2009075128A (ja) * 2000-11-30 2009-04-09 Boston Probs Inc 微生物の分類および／または決定のための方法および組成物

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0806801D0 (en) * 2008-04-15 2008-05-14 Immunodiagnostic Systems Ltd Substrate
CN111190001B (zh) * 2020-01-10 2024-03-26 苏州睿瀛生物技术有限公司 免疫组化抗体专用稀释液及其制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001278894A (ja) * 2000-03-29 2001-10-10 Osamu Ozawa 血液循環障害予防および／または治療用医薬用組成物並びにその有効成分であるペプチド
JP2009075128A (ja) * 2000-11-30 2009-04-09 Boston Probs Inc 微生物の分類および／または決定のための方法および組成物

Also Published As

Publication number Publication date
JP2005041862A (ja) 2005-02-17
JP3580822B2 (ja) 2004-10-27
JP3848663B2 (ja) 2006-11-22
JPH09511137A (ja) 1997-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2809956B2 (ja) Ｎａｎｂｖの診断用薬
JP2809987B2 (ja) Ｎａｎｂｖの診断用薬
WO1994018217A1 (en) Non-a, non-b, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
WO1995021922A2 (en) Non-a, non-b, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
JP3061258B2 (ja) 非ａ非ｂ非ｃ非ｄ非ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法
US6451578B1 (en) Non-A, non-B, non-C, non-D, non-E hepatitis reagents and methods for their use
US6720166B2 (en) Non-a, non-b, non-c, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
JPH0940694A (ja) 肝炎ｇｂウイルスの合成ペプチド及びその使用
JP3580822B2 (ja) 非ａ非ｂ非ｃ非ｄ非ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法
US6586568B1 (en) Non-A, non-B, non-C, non-D, non-E hepatitis reagents and methods for their use
US6558898B1 (en) Non-A, non-B, non-C, non-D, non-E hepatitis reagents and methods for their use
EP0745129B1 (en) Non-a, non-b, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
WO2003068810A1 (en) A dna sequence and encoded polypeptide useful in the diagnosis of hepatitis disease

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20040511

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20040804

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20040809

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20050201