JPH1036395A

JPH1036395A - 新規膜蛋白質

Info

Publication number: JPH1036395A
Application number: JP8194467A
Authority: JP
Inventors: Tomoyuki Miyabayashi; 朋之宮林; Seiji Sakano; 誠治坂野
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1996-07-24
Filing date: 1996-07-24
Publication date: 1998-02-10

Abstract

(57)【要約】【課題】脳、神経系組織に特異的に発現する新規膜蛋
白質を得るものである。【解決手段】脳、神経系組織に特異的に発現する新規
膜蛋白質をコードする新規なＤＮＡ、そのＤＮＡがコー
ドするポリペプチド、及びそのＤＮＡを有する発現ベク
ター、さらに該膜蛋白質を特異的に認識する抗体からな
る。【効果】脳、神経系組織及び腫瘍細胞に特異的に発現
する新規膜蛋白質、およびその遺伝子、およびその製造
方法、および該膜蛋白質を特異的に認識する抗体が得ら
れ、脳、神経系に特異的な疾患及び癌の診断への使用が
期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規膜蛋白質に関
し、更に詳しくは、ヒト由来細胞が発現する新規膜蛋白
質、及びその製造方法に関する。本発明はまた、遺伝子
工学的技術を用いてクローニングされた該膜蛋白質の遺
伝子に関する。また本発明は該膜蛋白質のアミノ酸配列
から合成されたＤＮＡ断片並びにＲＮＡ断片に関する。
また本発明は遺伝子工学的技術を応用して作製される該
膜蛋白質をコードするＤＮＡとベクターＤＮＡからなる
組換えＤＮＡ体に関する。本発明はまた、遺伝子工学的
技術を応用して作製される該膜蛋白質を発現する形質転
換細胞に関する。更に本発明は、遺伝子工学の技術を応
用した、該膜蛋白質の製造方法に関する。更にまた本発
明は、該膜蛋白質と特異的に結合することを特徴とする
抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】高等脊椎動物の脳・神経系の形成は胎生
期に完了し、その損傷に対する再生は極めて困難であ
る。脳・神経系の形成過程を理解し、これに関連する分
子の各種脳・神経疾患への臨床応用が検討されている。
近年、神経系の発生および神経回路形成に関わる多くの
細胞−細胞間相互作用分子、もしくは細胞−基質間相互
作用分子が見出されている。これらの分子は、細胞−細
胞間で情報を伝達する細胞膜結合型リセプター分子とそ
のリガンド分子（リセプター−リガンド分子）、細胞−
細胞間の基質物質である細胞外マトリックス分子、およ
び細胞−細胞間もしくは細胞−基質間の接着を担当する
細胞接着分子に大別されている。

【０００３】リガンド分子の例として液性因子の神経成
長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、
ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）（特開平５−１６１
４９３号公報）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤ
ＮＦ）、毛様体由来神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ネトリ
ン（Ｎｅｔｒｉｎ）（Ｓｅｒａｆｉｎｉら，Ｃｅｌｌ，
７８，４０９−４２４，１９９４）、コラプシン（Ｃｏ
ｌｌａｐｓｉｎ）（Ｌｕｏら，Ｃｅｌｌ，７５，２１７
−２２７，１９９３）、また、膜結合型因子としてノッ
チ（Ｎｏｔｃｈ）ファミリーのリガンド分子であるデル
タ（Ｄｅｌｔａ）およびセレイト（Ｓｅｒｒａｔｅ）、
Ｅｐｈファミリーのリガンド分子群などが知られてい
る。これらの分子のいくつかは医薬としての開発研究が
なされている。

【０００４】細胞外マトリックス分子は、特に神経系に
限定されないコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン
のほか、主に中枢神経系に分泌されるリーリン（Ｒｅｅ
ｌｉｎ）（Ｄ’Ａｒｃｈａｎｇｅｌｏら，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３７４，７１９−７２３，１９９５）や主に末梢神
経系に分泌されるアグリン（Ａｇｒｉｎ）（Ｒｕｐｐ
ら，Ｎｅｕｒｏｎ，６，８１１−８２３，１９９１）な
ど神経系に特異的な分子が知られている。また、細胞接
着分子の例としてＮ−カドヘリン、ＰＢ−カドヘリン、
Ｎ−ＣＡＭ、Ｌ１、インテグリン、ファシクリン（Ｆａ
ｓｃｉｃｌｉｎ）などが知られている（平野，蛋白質核
酸酵素，４０，７２４−７３５，１９９５）。

【０００５】ここでは分類上３つに大別したが、厳密な
意味で分類できるものではない。例えば、ここではリセ
プター−リガンド分子と分類したデルタは、ノッチに情
報を伝達する因子であると同時に、接着分子としての機
能を有することが知られている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−
Ｔｓａｋｏｎａｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，２２５
−２３２，１９９５およびＦｅｈｏｎら，Ｃｅｌｌ，６
１，５２３−５３４，１９９０）。また他の例では、接
着分子と分類したインテグリンは、細胞外マトリックス
のＲＧＤ（Arg Gly Asp）配列を認識し、細胞内に情報
を伝達しうるリセプター分子としての役割を果たす（原
著Ｗａｔｓｏｎら，監訳松原ら，細胞の分子生物学第３
版，教育社，９９５−１０００，１９９５）。したがっ
て、リセプター−リガンド分子、細胞外マトリックス分
子、細胞接着分子の分類は便宜上のものであり、これら
の分子の神経系の発生および神経回路形成に対する重要
性は、この分類によって区別されるものではない。そこ
で、本発明ではこれらの分子を細胞作用分子と総称す
る。

【０００６】上記のような複数の細胞作用分子が多様に
作用することにより、神経細胞の発生、分化、組織構
築、局在化、神経繊維の伸長、神経軸索の束形成、神経
回路網の形成が連続的、同時並行して行われ、複雑でか
つ特異的な脳・神経系が構成されると考えられている。
しかしながら、多種の細胞作用分子が見出されているに
もかかわらず、神経系の発生および神経回路形成は不明
な点が多く、いまだ生物学的に最も未知な分野のひとつ
である。これは神経系の臓器が非均一な細胞群から構成
され、これらの細胞群を統合するために非常に多数の細
胞作用分子が存在し、さらにこれらの分子の濃度・密度
・親和性および時間・空間的発現が重要な働きをするた
めと考えられているが、これに対して見出された細胞作
用分子の種類およびその機能解析が十分でないためであ
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は脳・神経系に
発現する、新規細胞作用分子を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】神経系の発生および神経
回路形成に、細胞−細胞間および細胞−基質間相互作用
が重要であることは述べた。神経系に限らず細胞のこれ
らの相互作用にかかわる分子の多くは構造上、接着・結
合のための保存されたドメイン構造を有する。このドメ
イン構造には、イムノグロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、
カドヘリンモチーフ、III 型フィブロネクチンリピート
（ＦＮIII 型リピート）、ＬＲＲ（ｌｅｕｃｉｎｅｒ
ｉｃｈｒｅｐｅａｔ）配列、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍ
ａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ：上皮増殖因子）モ
チーフなどが知られている。Ｉｇ様ドメインはイムノグ
ロブリン・スーパーファミリーに属する多数の分子に含
まれ、神経細胞を含む各種細胞に発現する細胞接着分子
のＮ−ＣＡＭ、Ｌ１、II型ファシクリンは共に５つのＩ
ｇ様ドメインを有する（前出，細胞の分子生物学第３
版，９６８−９６９）。

【０００９】カドヘリンモチーフは神経冠細胞に発現す
るＮカドヘリンをはじめ、カドヘリンファミリーに通常
５つのドメイン構造で含まれる（前出，細胞の分子生物
学第３版，９６６−９６８）。ＦＮIII 型リピートはII
I 型フィブロネクチンやテネシンなどの細胞外マトリッ
クス分子、Ｎ−ＣＡＭやＬ１などの細胞接着分子に含ま
れる。（前出，細胞の分子生物学第３版，９８６−９８
８）ＬＲＲ配列は最近報告されたマウス神経系細胞に発現す
るＮＬＲＲ−１（Ｔａｇｕｃｈｉら，ＭｏｌＢｒａｉ
ｎＲｅｓ，３５，３１−４０，１９９６）、ＮＬＲＲ
−３（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，ＭｏｌＢｒａｉｎＲ
ｅｓ，３６，４５−５２，１９９６）に含まれ、結晶解
析により立体構造が明らかにされている（Ｋｏｂｅら，
Ｎａｔｕｒｅ，３７４，１８３−１８６，１９９５）。
またＬＲＲ配列を有するいくつかの分子において、ＬＲ
Ｒ配列のＮ末側、Ｃ末側にも保存領域が存在することが
報告されている（Ｒｏｔｈｂｅｒｇら，ＧｅｎｅＤｅ
ｖ，４，２１６９−２１８７，１９９０）。

【００１０】ＥＧＦモチーフは外胚葉のニューロブラス
トへの分化を抑制するノッチ、デルタなどのリセプター
−リガンド分子やテネシン、ラミニンなどの細胞外マト
リックス分子に含まれるモチーフであり、３ヶ所のジス
ルフィド結合と１ヶ所のＣａ ^{2 +}結合部位を有する。Ｅ
ＧＦモチーフの立体構造は結晶解析により明らかにされ
ている（Ｒａｏら，Ｃｅｌｌ，８２，１３１−１４１，
１９９５）。これらの分子のいくつかはＥＧＦモチーフ
がタンデムに並んだ構造を有し、ノッチの例では３６個
のＥＧＦモチーフがリピート構造を取り、その１１番目
と１２番目のＥＧＦモチーフがリガンドとの結合に関与
していることが明らかになっている（Ｆｅｈｏｎら，Ｃ
ｅｌｌ，６１，５２３−５３４，１９９０）。本発明者
らはこれらモチーフのうち、ＥＧＦモチーフが、脳・神
経系の発生および神経回路形成に関わる重要な細胞作用
分子のいくつかに見出されている分子構造であることか
ら、特に重要なモチーフであると考え、脳・神経系に特
異的に発現し、ＥＧＦモチーフを有する新規な細胞作用
分子の発見に努めた。

【００１１】その方法として、我々は遺伝子配列のデー
ターベース上を検索する手法を用いた。すなわち、ＥＧ
ＦモチーフをコードするＤＮＡ配列を有すると予想され
る遺伝子配列を、遺伝子配列データーベースＧｅｎｂａ
ｎｋのランダムなヒトｃＤＮＡ配列の遺伝子断片のデー
ターベースであるＥＳＴ（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑ
ｕｅｎｃｅＴａｇ）から、遺伝子配列検索ソフトウエ
アＧｅｎｅｔｙｘ／ＣＤ（ソフトウエア開発社製）を用
いて見いだし、これらの短い遺伝子断片をＰＣＲにてク
ローニングした。次いで、これらの遺伝子断片をプロー
ブとしてノザンハイブリイゼーションを行い、ヒト脳、
神経系組織に特異的に発現するプローブを見出した。次
に、ヒト胎児ｃＤＮＡライブラリーなどから、該プロー
ブを用いてこれより長い遺伝子断片のクローニングを試
み、全長の遺伝子を取得し、配列の決定に成功した。

【００１２】この遺伝子配列から推定されるアミノ酸配
列から、ＥＧＦモチーフを１０個有する全く新規な配列
であることを明らかにした。このＥＧＦモチーフのアミ
ノ酸配列はノッチのＥＧＦモチーフと最も近かったが、
約４０％の相同性を有するにすぎなかった。また、２番
目と３番目のＥＧＦモチーフの間には約１７０アミノ酸
の挿入配列があり、内部にシステインを２個有してい
た。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅらの方法（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５、１９８２）に従って、
該アミノ酸配列から疎水性部分、親水性部分を解析し
た。その結果、本発明の分子は細胞膜蛋白質として細胞
上に発現することが予想された。

【００１３】上記膜蛋白質をコードするＤＮＡのアンチ
センス断片を用いてノザンブロッティングを行った結
果、該膜蛋白質遺伝子の発現は全身の臓器中で脳、脊
髄、副腎のみに特異的に認められ、該膜蛋白質が神経組
織に特異的に発現している分子であることを明らかにし
た。さらに脳内の分布を詳しく調べたところ、大脳、間
脳、中脳、小脳、延髄など解析した全ての部位で発現が
認められた。さらに本発明者らは該膜蛋白質のポリペプ
チド全長をコードするＤＮＡを用いて、該膜蛋白質の発
現系を作製し、該ポリペプチドのリコンビナント標品を
作製した。該膜蛋白質のアミノ酸配列及びそれをコード
する核酸配列は、配列表の配列番号１から３に示した。
更に、該リコンビナント標品を免疫原として抗体を作製
し、精製法を確立し本発明が完成した。

【００１４】即ち本発明によれば、配列表の配列番号１
で表されるアミノ酸配列を含む新規なポリペプチドが提
供される。また、本発明の他の態様によれば、配列表の
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有する配列表の
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む新規なポリペ
プチドが提供される。また、本発明の他の態様によれ
ば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列のＣ末
端に、特異的な抗体で認識可能な任意のアミノ酸配列を
有するポリペプチドを有するポリペプチドが提供され
る。また、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番
号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、そ
れ以外のポリペプチドとの複合体の形態を有するポリペ
プチドが提供される。また、本発明の他の態様によれ
ば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有
するポリペプチドをコードするＤＮＡが提供される。

【００１５】また、本発明の他の態様によれば、配列表
の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡが提供される。更にまた、本
発明の他の態様によれば、配列表の配列番号１で表され
るアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを含む塩基配列と、宿主細胞中で発現可能なベクタ
ーＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡ体が提供され
る。更にまた、本発明の他の態様によれば、配列表の配
列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを含む塩基配列と、宿主細胞中で
発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮ
Ａ体が提供される。更にまた、本発明の他の態様によれ
ば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有
するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む塩基配列
と、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡとを連結し
てなる組換えＤＮＡ体により形質転換された細胞が提供
される。更にまた、本発明の他の態様によれば、配列表
の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡを含む塩基配列と、宿主細胞
中で発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換え
ＤＮＡ体により形質転換された細胞が提供される。

【００１６】更にまた、本発明の他の態様によれば、配
列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドを産生し得る細胞を培地中にて培養し、その
培養液中に該ポリペプチドを産生させ、培養液から培養
上清を回収し、回収した培養上清から該ポリペプチドを
分離・精製することを含む該ポリペプチドの製造方法が
提供される。更にまた、本発明の他の態様によれば、配
列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドを産生し得る細胞を培地中にて培養し、その
培養液中に該ポリペプチドを産生させ、培養液から培養
上清を回収し、回収した培養上清から該ポリペプチドを
分離・精製することを含む該ポリペプチドの製造方法が
提供される。更にまた、本発明の他の態様によれば、配
列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列で表されるポ
リペプチドの少なくとも一部と特異的に結合する抗体が
提供される。

【００１７】更にまた、本発明の他の態様によれば、配
列表の配列番号３の塩基配列の少なくとも１８個の連続
した塩基配列を含有するセンスＤＮＡ、該センスＤＮＡ
に相補的なアンチセンスＤＮＡからなる群より選ばれる
単離されたＤＮＡ断片、及び該センスＤＮＡ及び該アン
チセンスＤＮＡを、それぞれ、メチル化、メチルフォス
フェート化、チオフォスフェート化または脱アミノ化す
ることにより得られる、該センスＤＮＡ及び該アンチセ
ンスＤＮＡの誘導体からなる群より選ばれる単離された
ＤＮＡ断片が提供される。更にまた、本発明の他の態様
によれば、配列表の配列番号３の塩基配列に相補的な少
なくとも１８個の連続した塩基配列を含有するアンチセ
ンスＲＮＡ、該アンチセンスＲＮＡに相補的なセンスＲ
ＮＡからなる群より選ばれる単離されたＲＮＡ断片、及
び該アンチセンスＲＮＡ及び該センスＲＮＡを、それぞ
れ、メチル化、メチルフォスフェート化、チオフォスフ
ェート化または脱アミノ化することにより得られる、該
アンチセンスＲＮＡ及び該センスＲＮＡの誘導体からな
る群より選ばれる単離されたＲＮＡ断片が提供される。

【００１８】本発明の新規膜蛋白質遺伝子のクローニン
グ方法について、以下に詳細に述べる。近年、ＤＮＡシ
ーケンス技術が向上し、ゲノムやｃＤＮＡをランダムに
シーケンスし、ヒト、線虫、シロイヌナズナなどの種の
全ゲノムＤＮＡおよび全ｃＤＮＡ配列の解明が試みられ
ている（ＧｅｎｏｍｅＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３７７，３Ｓ，１９９５）。ヒトのｃＤＮＡに関
して、ＴＩＧＲ（ＴｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒ
ＧｅｎｏｍｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ）によるＥＳＴプロ
ジェクト、ワシントン大学−メルクによるＥＳＴプロジ
ェクト、コロラド大学によるＳＴＳプロジェクトなどが
この事業に参入している。これらの機関から提出された
ｃＤＮＡの部分塩基配列はＧｅｎｂａｎｋおよびＥＭＢ
Ｌの遺伝子データベースに登録されており、開示されて
いる。１９９５年１０月発行のＧｅｎｂａｎｋリリース
９１によれば、ＥＳＴクローンの累積登録数は約３３万
クローンで、平均長は３４６塩基対（ｂｐ）であること
がわかる。

【００１９】これらのデータベースのデータを、既知も
しくは新たにクローニングした新規分子などの遺伝子配
列、アミノ酸配列をもとにしてホモロジー検索を行い、
その類似分子ファミリー分子の存在の可能性を知ること
ができ、部分遺伝子を配列情報を得ることができる。そ
の解析ソフトウエアとしては市販の解析ソフトでも構わ
ないし、各々のデーターベースに付属している解析ソフ
トウエア、例えばＧｅｎｂａｎｋに付属しているＢＬＡ
ＳＴを用いて解析する、すなわち米国ナショナル・セン
ター・オブ・バイオテクノロジー・インフォメーショ
ン、日本国京都大学化学研究所などにＷＷＷ（ワールド
・ワイド・ウェブ）、電子メールなどでアクセスして計
算することができる。

【００２０】このような、操作を通して、目的の遺伝子
に対して類似性の高い遺伝子断片（２００から３５０ｂ
程度の長さ）の遺伝子配列情報を入手することができ
る。このように入手した遺伝子断片配列情報には一般に
遺伝子配列情報とともに、その遺伝子のクローン名、存
在した臓器、組織の情報が記載されている。遺伝子配列
情報に関しては、ＤＮＡシークエンサーの生データ情報
に近いため、遺伝子配列が未決定でＮと記載されていた
り、遺伝子配列情報が間違っているケースが多いため、
これらの遺伝子配列情報は必ずしも確かではない。これ
らの遺伝子情報から、遺伝子配列でＮのデータが出てこ
ない領域を、最も確からしい遺伝子配列情報の部分と考
えて抜き出し、さらに比較して、この領域で有意なホモ
ロジーのある（２００ｂ程度の遺伝子ならば、遺伝子配
列の類似性として４５％前後の値以上であることが望ま
しい）遺伝子断片の同定を行う。このように同定された
遺伝子断片に関して、一部の遺伝子については、そのク
ローン名が明らかになれば米国ゲノムシステム社などか
ら購入可能であるが、発現臓器が明示されているので、
市販の発現臓器のｃＤＮＡからＰＣＲによって分離する
ことが出来る。

【００２１】しかし、本発明で示すようにＥＧＦモチー
フを有するＥＳＴクローンは多数存在し、それらから目
的とするクローンだけを選択するのは困難である。さら
に、このようにして見出されたＥＳＴクローンから得ら
れる遺伝子情報は部分的な情報であり、遺伝子部分断片
の情報のみから、全体のアミノ酸配列を推測することは
不可能である。従って、この遺伝子部分断片の情報をも
とに遺伝子全長を取得してはじめて、該断片がコードす
るアミノ酸配列の推測を可能にし、蛋白質としての生理
活性を論じることが可能となる。

【００２２】本発明者らは、前記の各種のドメイン構造
を有し、かつ神経系に発現する既知分子、約３０種類を
選出し、該当するドメイン構造をコードする塩基配列を
雛形として、遺伝子データベースのＧｅｎｂａｎｋ（Ｇ
ｅｎｅｔｙｘ−ＣＤ，ソフトウェア開発社製）に登録さ
れているＥＳＴクローンを対象にホモロジー検索を行っ
た。検索に用いたアルゴリズムはＧｅｎｅｔｙｘ−ＣＤ
ソフトウェア内蔵のプログラムを用いた。この結果、お
よそ５０％以上の遺伝子配列のホモロジーを有する約６
００のＥＳＴクローンが候補となった。これらのクロー
ンの遺伝子配列は、相補的な配列と共に１クローンにつ
き６通りのアミノ酸配列に翻訳し、該当するアミノ酸配
列を有するかどうかを調べた。このとき、ＥＳＴクロー
ンで報告されている塩基配列はしばしば欠落や重複もし
くはＮで示される不明配列があるため、アミノ酸フレー
ムの変化を考慮して注意深くアミノ酸配列を生成した。
特に配列情報の両端の数十ｂｐは、見かけ上の終止コド
ンの出現や不明配列のため、ほとんどのＥＳＴクローン
でアミノ酸フレームが全く組めず、両端合わせて約１０
０ｂｐは実質上有用な配列情報でなかった。

【００２３】また、およそ２００ｂｐ以下の短い断片情
報しか有さないＥＳＴクローンは、上記理由を考え合わ
せてスクリーニングのためのハイブリダイゼーションの
プローブとして短すぎて適さないため、候補からはずし
た。最終的に候補に残ったＥＳＴクローンについて、そ
れぞれ個々のＤＮＡ配列情報を元にＰＣＲプライマーを
作製し、ヒト胎児脳由来のｃＤＮＡ混合溶液（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ社製）をテンプレートとしてＰＣＲ反応を行っ
た。こうして得られたＰＣＲ産物はプラスミドベクター
にサブクローニングし、ＤＮＡシークエンシングによっ
て、その塩基配列がＥＳＴクローンと相同の塩基配列を
含むことを確認した。次にヒト組織における、これらＰ
ＣＲ産物がコードする遺伝子の発現を解析した。遺伝子
の発現組織の解析方法としては、一般的にノザンハイブ
リダイゼーション法や、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法などがあげられ
る。

【００２４】本発明者らはノザンハイブリダイゼーショ
ンを用いて該ＤＮＡ断片の遺伝子発現組織を確認し、
脳、神経系組織に特異的に発現するＤＮＡ断片、すなわ
ちＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｒ２４７０９のＥＳＴクロー
ンを同定した。また、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース上に
は、上記のＲ２４７０９とほぼ同一の配列を有するクロ
ーン、Ｒ３６７７４、Ｒ１２２３１、Ｔ８０５１４、Ｈ
１４７１０が存在した。

【００２５】次に、こうして得られたＤＮＡ断片を用い
て、ヒトのゲノム遺伝子ライブラリー、あるいは本発明
の新規膜蛋白質を産生している組織または細胞、例えば
脳、、脊髄あるいは副腎などの遺伝子ライブラリー（ｃ
ＤＮＡライブラリー）から該膜蛋白質をクローニングす
ることができる。遺伝子ライブラリーは目的とする細胞
からｍＲＮＡを精製し、該ｍＲＮＡから単鎖の相補ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、該相
補ＤＮＡをファージまたはプラスミドで宿主を形質転換
することにより作製することができる。ヒト脳からのＲ
ＮＡは、グアニジンチオシアネート法（Ｔ．Ｍａｎｉａ
ｔｉｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎ
ｉｎｇ２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．，１９８９）などによっ
て調製することができる。次に常法に従ってｍＲＮＡを
得る。この際、ｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用いることができる。

【００２６】この様にして得られたｍＲＮＡを鋳型と
し、例えば岡山バーグの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａ
ｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２，１６
１，１９８２及び、同誌，３，２８０，１９８３）に
従いｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡをプラスミド
に組み込む。ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、
例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ
１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（いずれも宝酒造社
販）などが挙げられるが、その他のものであっても宿主
内で複製増殖できるものであればいずれをも用いること
ができる。またｃＤＮＡを組み込むファージベクターと
しては、例えばλｇｔ１０、λｇｔ１１などが挙げられ
るが、その他のものであっても宿主内で増殖できるもの
であれば用いることができる。この様にして得られたプ
ラスミドは適当な宿主、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
属菌などにカルシウムクロライド法などを用いて導入す
る。

【００２７】上記エシェリヒア属菌の例としては、エシ
ェリヒア・コリＫ１２ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＬＥ
３９２、ＪＭ１０５などが挙げられる。上記バチルス属
菌の例としては、バチルス・サチリスＭＩ１１４などが
挙げられる。またファージベクターは、例えば増殖させ
た大腸菌にインビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７８）７１，２４４
２）を用いて導入することが出来る。上記方法により本
発明の新規膜蛋白質のｃＤＮＡを含有する該膜蛋白質産
生細胞のｃＤＮＡライブラリーを作製することが出来
る。該ｃＤＮＡライブラリーから該膜蛋白質をコードす
るＤＮＡをクローニングする方法としては、例えばファ
ージベクターλｇｔ１０を用いて作製した該膜蛋白質ｃ
ＤＮＡライブラリーと、上述の方法で選択したＥＳＴク
ローン例えばＲ２４７０９に由来するＤＮＡ断片をプロ
ーブとして用いたプラークハイブリダイゼーション法な
どが挙げられる。

【００２８】このようにして得られたＤＮＡの塩基配列
を例えばサンガーらの方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔ
ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１
９７７）７４，５４６３）によって決定する事ができ
る。以上のようにして該膜蛋白質をコードするＤＮＡが
得られる。該膜蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ
の塩基配列を配列表の配列番号３に示した。

【００２９】本発明者らは実施例３に示したごとく、Ｐ
ＣＲによって得られたＤＮＡ断片をラジオアイソトープ
でラベルし、ハイブリダイゼーションプローブとし、ス
クリーニングライブラリーとしてヒト胎児脳由来ｃＤＮ
Ａを用いてスクリーニングを行い、得られた複数のクロ
ーンのＤＮＡ配列を決定したところ、これらは配列表の
配列番号３に示すＤＮＡ塩基配列からなるクローンであ
った。本ＤＮＡ配列には８４番目に始まる開始コドン
（ＡＴＧ）から２２９７番目で終わる終止コドン（ＴＡ
Ａ）まで、７３７個のアミノ酸配列をコードしうるオー
プンリーディングフレームが存在した。該オープンリー
ディングフレームから翻訳したアミノ酸配列を配列番号
２に示した。尚、該オープンリーディングフレームを含
むプラスミドｐＢＥＲＴは大腸菌株ＪＭ１０９（東洋紡
社製）に遺伝子導入した。これらの配列を遺伝子データ
ベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）で比較したところ、これらは
全く新規な配列であった。

【００３０】配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を
Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，１５７：１０５，１９８２）に従って、アミ
ノ酸配列から疎水性部分、親水性部分を解析した。その
結果、本発明のポリペプチドはシグナルペプチドを有
し、細胞膜通過部分を有する膜蛋白質であることが推定
された。つまりこの解析結果によれば、該膜蛋白質前駆
体のアミノ酸配列は配列表の配列番号３に示す７３７ア
ミノ酸残基からなるポリペプチドであり、シグナルペプ
チド領域は同配列表のアミノ酸配列の−２６番のメチオ
ニンから−１番のアラニンにあたる２６アミノ酸残基、
細胞外部分は１番のグリシンから６１２番のセリンにあ
たる６１２アミノ酸残基、膜貫通ドメインが６１３番の
ロイシンから６３８番のイソロイシンにあたる２６アミ
ノ酸残基、細胞内部分が６３９番目のセリンから７１１
番目のロイシンにあたる７３アミノ酸残基から構成され
ることが推定された。ただし、これらの各部分はあくま
でもアミノ酸配列から予想された各ドメイン構造であ
り、実際に細胞上並びに溶液中でに存在形態は、上記の
構成と若干異なることも十分考えられ、上記に一応規定
された各ドメインの構成アミノ酸が５から１０アミノ酸
前後することも考えられる。

【００３１】またアミノ酸配列から予想されることとし
て、糖鎖が付加される部分はＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンがＮ−グリコシド結合可能な部分として、配列表
の配列番号１のアミノ酸配列の８１番、１７８番、１８
２番、１９７番、２６０番、３３５番、３４９番、４１
６番、４２９番、５２３番および５３８番の１１個のア
スパラギン残基が挙げられる。一般に、糖鎖が付加され
た蛋白質の方がポリペプチドそのものよりも生体内での
分解に対して安定であり、また強い生理活性を有してい
ると考えられている。配列表の配列番号２に記載したア
ミノ酸配列のドメイン構造の解析により、該膜蛋白質は
ポリペプチドのほぼ全体が緻密なドメイン構造で構成さ
れていることが明らかになった。すなわち新規膜蛋白質
のＮ末から順に、ＥＧＦモチーフが２個タンデムに並
び、次にイムノグロブリンループ様モチーフを１個挟ん
で、その後再びＥＧＦモチーフが８個並び、膜貫通ドメ
イン、細胞内ドメイン、Ｃ末になる。

【００３２】さらに詳しく説明すれば、第１ＥＧＦモチ
ーフは同配列表の２２番システインから６５番システイ
ン、第２ＥＧＦモチーフは同配列表の７２番システイン
から１０６番システイン、第３ＥＧＦモチーフは同配列
表の２８１番システインから３２１番システイン、第４
ＥＧＦモチーフは同配列表の３２７番システインから３
６３番システイン、第５ＥＧＦモチーフは同配列表の３
７０番システインから４０１番システイン、第６ＥＧＦ
モチーフは同配列表の４０８番システインから４３９番
システイン、第７ＥＧＦモチーフは同配列表の４４６番
システインから４７６番システイン、第８ＥＧＦモチー
フは同配列表の４８３番システインから５１４番システ
イン、第９ＥＧＦモチーフは同配列表の５２１番システ
インから５５２番システイン、第１０ＥＧＦモチーフは
同配列表の５５９番システインから５９０番システイン
の間で構成される。イムノグロブリンループ様モチーフ
は同配列表の１７６番システインと２２４番システイン
によって構成されると予想される。

【００３３】なお、本発明者らが明らかにした配列表の
配列番号２に記載の塩基配列を用いて、ヒト由来のＥＳ
Ｔクローンを対象にホモロジー検索を行ったところ、９
０％以上の相同性を有するクローンは本発明のクローニ
ングに使用したＲ２４７０９を含めて、ＨＵＭ４００Ｅ
０８Ｂ、ＨＵＭ０９３Ｅ１０Ｂ、Ｒ３６７７４、Ｒ１２
２３１、Ｔ８０５１４、Ｈ３９６８９、Ｈ１４７１０の
計８クローンが該当した。また、６０％以上、９０％未
満の相同性を示すものは認められなかった。また、５０
％以上、６０％未満の相同性を示すクローンは多数認め
られた。９０％以上の相同性を有する８クローンのう
ち、ＨＵＭ４００Ｅ０８Ｂ、ＨＵＭ０９３Ｅ１０Ｂ、Ｈ
３９６８９の３クローンは、配列表の配列番号３に記載
のＤＮＡ配列の３’非翻訳領域部分にほぼ一致した。ま
た、残りのＲ２４７０９、Ｒ３６７７４、Ｒ１２２３
１、Ｔ８０５１４、Ｈ１４７１０の５クローンについて
は、さらにアミノ酸配列に翻訳し、配列表の配列番号１
または２のアミノ酸配列と比較したところ、これらは全
て本発明の新規膜蛋白質に一致すると考えられた。

【００３４】本発明の新規膜蛋白質は、配列表の配列番
号１または２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドを含有してなるが、自然界で生じることが知られてい
る生物種内変異、アレル変異等の突然変異によって生じ
る、ポリペプチドの相同変異体も本発明に含まれる。ま
た本発明の新規膜蛋白質は配列表の配列番号１または２
に記載のアミノ酸配列の一部を欠くものであり得るし、
ポイントミューテーションにより部分的に変異させるこ
ともできるものであって、いずれにせよ本発明の新規膜
蛋白質の配列表の配列番号１または２の性質を失わない
ものは本発明に含まれる。また、そのアミノ酸配列のＮ
末もしくはＣ末に多少のアミノ酸残基、ペプチド残基が
付加されることもあり得る。更にまた、そのアミノ酸配
列中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンやＮ−アセチル
−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖が、Ｎ−グリコシドあ
るいはｏ−グリコシド結合してなるものも本発明に含ま
れる。上記の該化合物の変異体と該化合物のアミノ酸配
列の相同性は、通常６０％以上であることが好ましく、
特に７０％以上が好ましく、更に８０％以上が好まし
く、とりわけ９０％以上である場合が好ましい。

【００３５】本発明者らが明らかにした塩基配列を用い
れば、本発明の新規膜蛋白質の発現・機能に関して、近
年の遺伝子操作技術、発生工学技術を応用した詳細な解
析が可能である。すなわち、配列表の配列番号３の一部
もしくは全部の塩基配列を有する１２ｍｅｒから１６ｍ
ｅｒ以上、好ましくは１８ｍｅｒ以上の相補し得る核
酸、つまりアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらが
メチル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、また
はチオフォスフェート化された誘導体によって行うこと
が出来る。更に、ゲノム上の遺伝子のクローニングも同
様に可能である。本発明者らは、本発明の新規膜蛋白質
のｍＲＮＡ発現部位を調べるために実施例４に示すごと
く、配列表の配列番号２記載の塩基配列情報を使用して
プローブを作製し、これをアイソトープラベルしてヒト
由来の臓器のノザンブロッティングを行った。その結
果、胎生では脳で最も強い発現が見られたほか、腎臓で
も弱い発現が観察された。成体では脊髄、脳、副腎で強
い発現が認められた。

【００３６】また、腎臓、膵臓、小腸、大腸、胃、気管
で極めて微弱な発現が認められた。それ以外の臓器での
発現は観察されなかった。さらに脳内での発現の分布を
詳しく調べたところ、大脳、間脳、中脳、小脳など解析
した全ての部位で高い発現が認められた。以上の結果か
ら本発明の新規膜蛋白質は脳、神経系の組織に特異的に
強く発現する分子であることを明らかにした。また各種
癌細胞株では、ヒト子宮脛部癌細胞ＨｅＬａｃｅｌｌ
Ｓ３株、ヒト悪性黒色腫細胞株Ｇ３６１といずれも上
皮系の癌細胞に該膜蛋白質が発現することを明らかにし
た。

【００３７】本発明のヒト新規膜蛋白質の塩基配列情報
を用いれば、他の脊椎動物の該膜蛋白質ホモログ遺伝子
のクローニングが可能であることが予想される。従っ
て、実験動物の該膜蛋白質ホモログの遺伝子を取得し、
該遺伝子断片を用いて、組織切片を用いたｉｎｓｉｔ
ｕハイブリダイゼーション、アンチセンスオリゴマーや
ドミナントネガティブによる発現制御、トランスジェニ
ックマウス、ジーンターゲッティングマウス、本遺伝子
と関連する遺伝子を共に不活化したダブルノックアウト
などのあらゆる方法を用いることにより、詳細に脊椎動
物における該膜蛋白質の発現・機能を解析することが可
能である。また、該膜蛋白質の塩基配列情報を用いるこ
とでゲノム上の染色体マッピングとゲノム配列決定、そ
れに引き続いてプロモータおよびエンハンサー領域の解
析、スプライシング構造の解析が可能である。ゲノム上
の異常があれば、遺伝子診断、遺伝子治療への応用が可
能である。

【００３８】近年、脳・神経細胞の遺伝子治療用ベクタ
ーに関して、アデノウィルスベクター、ヘルペス単純ウ
ィルスベクター等のウィルスベクターやリポソームを使
用した神経細胞系への遺伝子導入が可能になっている。
脳細胞への遺伝子導入に関してもカテーテルを用いて特
定の部位にデリバリーする事ができる。また、プロモー
タ領域の改良によって任意に遺伝子発現を制御する技術
が開発されている。こうした周辺技術がさらに進めば、
ゲノム上に異常がなくても、脳機能の改善や痴呆等の治
療、神経細胞の再生の目的で積極的に遺伝子治療を行う
ことが可能となる。

【００３９】また該膜蛋白質のｍＲＮＡは脳、神経系組
織以外の正常細胞ではほとんど発現が認められず、ある
種の癌細胞で発現することから、該膜蛋白質の塩基配列
情報を癌の遺伝子診断に使用することが可能である。す
なわち、採血やパイオプシーで得られる臓器の一部より
ｍＲＮＡを抽出し、ノザンブロッティング等により該膜
蛋白質に特異的なプローブで検出したり、このｍＲＮＡ
を逆転写酵素によりｃＤＮＡに逆転写し、該膜蛋白質の
塩基配列情報を基に作製されたプライマーを用いてＰＣ
Ｒやその他のＤＮＡポリメラーゼによって遺伝子断片を
増幅することにより、該膜蛋白質のｍＲＮＡを検出し、
癌の診断に使用できる。上記のようにしてクローン化さ
れた本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、目的
によりそのまま、あるいは所望により制限酵素で消化し
て使用することができる。クローン化されたＤＮＡから
発現させたい領域を切り出し、発現に適したベクター中
のプロモーターの下流に連結して発現型ベクターを得る
ことができる。

【００４０】実施例５及び７に記載したように、本発明
の新規膜蛋白質の発現させる形態としては、配列表の配
列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするｃＤＮＡを用いる方法でもよいが、この状態
では膜結合型であり、精製、製剤化などをより効率的に
行うべく、実施例６及び８に記載したように、配列表の
配列番号１に記載したアミノ酸配列、すなわち該ポリペ
プチドの細胞外部分のみを発現させることができる。し
たがって、細胞外部分を含有する形態を配列表の配列番
号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用い、
分泌型で発現、生産させることも可能である。また、さ
らにその形態としては単独のポリペプチドでもかまわな
いが、複合体の形態を有するポリペプチドでも可能であ
る。本発明で使用する”複合体”は２種類以上の物質を
単に混ぜ合わせた混合物ではなく、１種類もしくは２種
類以上のポリペプチドが共有結合を含む何らかの結合様
式を有してなるポリペプチド、コンジュゲート、または
コンプレックスの総称を意味する。

【００４１】その例としては、イムノグロブリンとのキ
メラタンパクのジスルフィド結合による共有結合を介し
た複合体、または実施例８で作製されたＦＬＡＧ配列を
有するポリペプチドと抗ＦＬＡＧ抗体による抗原抗体反
応を介した複合体などの形態が挙げられる。さらに、ヒ
トＩｇＧのＦｃ部分とのキメラタンパク質として発現さ
せて抗体のヒンジ部分によりジスルフィド結合をした多
量体として発現させる方法、また、抗体認識部位をＣ末
端もしくはＮ末端に発現するキメラタンパクとして発現
させ、発現させた該ポリペプチドの細胞外部分を含むポ
リペプチドをＣ末端もしくはＮ末端の抗体認識部位を特
異的に認識する抗体と反応させることにより多量体を形
成させる方法が挙げられる。

【００４２】さらに、別の方法として、抗体のヒンジ領
域部分のみとの融合タンパクを発現させて、ジスルフィ
ド結合にて２量体を形成させる方法、もしくはその他の
該ポリペプチドの活性に何等影響を与えない方法でジス
ルフィド結合を生じさせる形のペプチドをＣ末端、Ｎ末
端もしくはその他の部位に発現するように作成された融
合タンパクから構成された２量体以上の高い比活性を有
する多量体型該ポリペプチドを得ることもできる。ま
た、さらに配列表の配列番号１のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡをアミノ酸に翻訳する際にフレームの合う形
で２つ以上直列に並べ多量体構造を発現させる方法など
もある。その他、現在知られている２量体以上の多量体
構造を持たせるあらゆる方法が適応可能である。したが
って、遺伝子工学的な技術により２量体もしくはそれ以
上の形態を有する形の該ポリペプチド、もしくは配列表
の配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列の１部も
しくは全部を含有してなるポリペプチドに関しても本発
明に含まれる。

【００４３】かくして得られた新規膜蛋白質を用いれ
ば、研究用試薬として新規膜蛋白質の生理活性探索が可
能である。該膜蛋白質は脳、脊髄、副腎に特異的に高い
発現が認められる。これらの部位の組織を分離し、ある
いは各種細胞株を利用して、該膜蛋白質を作用させるこ
とにより、インビトロの生理活性探索が可能である。さ
らにこのアッセイ系を応用すれば、該膜蛋白質の作用を
阻害する化合物のスクリーニングが可能である。本発明
の新規膜蛋白質をコードするＤＮＡはその５’末端に翻
訳開始コドンを有し、又３’末端には翻訳終結コドンを
有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終結
コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加す
ることもできる。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその
上流にプロモーターを接続する。開始コドン及び終止コ
ドンを含む例は配列表の配列番号３に例示されている。

【００４４】ベクターとしては上記の大腸菌由来のプラ
スミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来プラスミ
ド、或いはλファージなどのバクテリオファージおよび
レトロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィル
スなどが挙げられる。本発明で用いられるプロモーター
としては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプ
ロモーターであればいかなるものでもよい。形質転換す
る際の宿主がエシェリヒア属菌である場合はｔａｃプロ
モーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターな
どが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロ
モーター、ＳＰＯ２プロモーターなど、宿主が酵母であ
る場合は、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーターＡ
ＤＨプロモーターなどが好ましい。

【００４５】宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０
由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、
メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモ
ーターなどがそれぞれ利用できる。この様にして構築さ
れた該膜蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発現プラ
スミドを用いて、形質転換体を製造する。宿主としては
例えばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細
胞などが挙げられる。動物細胞としては、例えばサル細
胞であるＣＯＳ−１、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスタ
ー細胞ＣＨＯ、カイコ細胞ＳＦ９などが挙げられる。こ
のようにして本発明の新規膜蛋白質をコードするＤＮＡ
を含有する発現プラスミドで形質転換された形質転換体
が得られる。各形質転換体をそれぞれ公知の方法によ
り、適当な培地中で適当な培養条件により培養すること
によって該膜蛋白質を製造することができる。

【００４６】上記培養物から該膜蛋白質を分離精製する
には、例えば下記の方法により行うことができる。該膜
蛋白質を培養菌体或いは細胞から抽出するに際しては、
培養後、公知の方法で菌体或いは細胞を集め、これを適
当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または
凍結融解などによって菌体或いは細胞を破壊した後、遠
心分離や濾過により該膜蛋白質の粗抽出液を得る方法な
どが適宜用い得る。緩衝液中に尿素や塩酸グアニジンな
どの蛋白変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性
剤が含まれていてもよい。培養液中に該膜蛋白質が分泌
される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌
体或いは細胞と上清とを分離し上清を集める。この様に
して得られた培養上清、或いは抽出液中に含まれる該膜
蛋白質は、実施例１１に記載した方法により得た該膜蛋
白質に対する抗体により精製することができる。

【００４７】本発明の新規膜蛋白質はポリペプチドを基
本骨格とする。したがって、医薬品として用いるなら
ば、上記に示した形態を有する本発明の新規膜蛋白質を
適当な安定化剤、例えばヒト血清アルブミンなどと共に
凍結乾燥品を作製し、用時注射用蒸留水にて溶解もしく
は懸濁して使用し得る形状が望ましい。例えば、１から
１０００μｇ／ｍｌの濃度に調製した注射剤、点滴剤と
して提供することができる。本発明者らは本発明の新規
膜蛋白質１ｍｇ／ｍｌ、ヒト血清アルブミン１ｍｇ／ｍ
ｌとなるようにバイアルに小分けし、本発明の新規膜蛋
白質の安定性をしらべた結果、長期にわたって該膜蛋白
質の物理的、化学的性状は保持された。また、該膜蛋白
質の毒性については、マウスに対して１０ｍｇ／Ｋｇを
腹腔内投与したがマウスの死亡例は確認されなかった。

【００４８】また本発明の膜蛋白質インビボの生理活性
は、あらゆる疾患モデルマウス、またはそれらに準ずる
疾患に似た症状を呈するラット、サル等の動物をモデル
として投与を行い、その身体的、生理的な機能の回復、
異常を調べることにより可能となる。あるいは実験動物
を用いて、学習能力や空間認識等の行動生理のモデル系
を用いれば、高次脳機能への作用を調べることが可能で
ある。勿論、これらの結果が人にも外挿できるため、本
発明の新規膜蛋白質の薬効としての評価として有効なデ
ータを得ることが出来る。

【００４９】本発明の膜蛋白質を医薬品として利用する
場合、その適応分野として、あらゆる神経疾患、疾患が
対象となる。成人１回当りの投与量は、年齢、性別、体
重、症状などによって異なるが、一般に約０．１μｇ〜
１００ｍｇ／ｋｇであり、１日当り１回または必要に応
じて数回投与することができる。また脳内へ投与する際
の投与方法はカテーテルなどを使用することができる。
また本発明の新規な膜蛋白質を注射剤として用いる場
合、ショ糖、グリセリン、メチルセルロース、カルボキ
シメチルセルロース等の増粘剤、各種無機塩のｐＨ調整
剤等を添加剤として加えることができる。

【００５０】また、本発明の新規膜蛋白質遺伝子を用い
て、ゲノムから該膜蛋白質遺伝子の発現を制御し得るプ
ロモーター配列を取得することが可能であり、該プロモ
ーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター
遺伝子を連結し、適当な細胞にトランスフェクトし、該
細胞を各種の検体、例えば任意の配列を有するペプチ
ド、または各種のポリペプチド、または各種の微生物に
よる発酵生産物などを用いて刺激し、レポーター遺伝子
の発現を比較することにより該膜蛋白質遺伝子の発現を
誘導する因子、或いは阻害する因子をスクリーニングす
ることが可能である。

【００５１】また、本発明の新規膜蛋白質は細胞治療方
法への適応として固定化することが可能である。固定化
の方法としては該膜蛋白質のアミノ基、カルボキシル基
を利用したり、適当なスペーサーを用いたり、上記の架
橋剤を用いたりして、培養容器に該膜蛋白質を共有結合
させることができる。したがって、固体表面に存在する
形態を有し、さらに少なくとも新規ポリペプチド活性を
有し、さらに配列表の配列番号１及び２からなる群より
選ばれるアミノ酸配列の一部もしくは全部のアミノ酸配
列を含有するポリペプチドに関しても本発明に含まれ
る。

【００５２】また、実施例４に示したように配列表の配
列番号３の遺伝子配列の一部もしくは全部をコードする
ＤＮＡを用いれば、ノザンブロットが可能である。した
がって、本遺伝子の発現を調べる方法として、配列表の
配列番号３の一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒから
１６ｍｅｒ以上、好ましくは１８ｍｅｒ以上の相補し得
る核酸、つまりアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれ
らがメチル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、
またはチオフォスフェート化された誘導体によって行う
ことが出来る。またこれらのセンス及びアンチセンスオ
リゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法でも本遺
伝子の発現を調べることが可能である。さらに、実施例
２に示した方法と同様な方法、もしくはＰＣＲ法でマウ
ス、ラット等の他の生物の本遺伝子のホモログの検出や
遺伝子クローニングができる。

【００５３】またさらに人を含めたゲノム上の遺伝子の
クローニングも同様に可能である。従って、そのように
してクローニングされたこれら遺伝子を用いれば、本発
明の新規膜蛋白質の更に詳細な機能も明らかにすること
が出来る。例えば、近年の遺伝子操作技術を用いれば、
トランスジェニックマウス、ジーターゲッティングマウ
ス、また、本遺伝子と関連する遺伝子を共に不活化した
ダブルノックアウトなどのあらゆる方法を用いることが
出来る。また、本遺伝子のゲノム上の異常があれば、遺
伝子診断、遺伝子治療への応用も可能である。

【００５４】また、本発明の該膜蛋白質を特異的に認識
する抗体は実施例１１に示したように作製することがで
きる。また成書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗｅｔ
ａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺
伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブ
リン遺伝子を用いて、細胞に発現させた遺伝子組換え体
抗体によっても作製することができる。このように作製
された抗体は該膜蛋白質の精製に利用できる。すなわ
ち、実施例１１に示したごとく、該膜蛋白質を特異的に
認識する抗体を用いれば、該膜蛋白質の検出、測定が可
能であり、上記に示した疾患などの診断薬として使用で
き得る。また脳、脊髄、副腎以外の正常細胞に発現が見
られず、子宮脛部癌細胞株、悪性黒色腫細胞株に該膜蛋
白質が発現することから、該抗体は癌の診断薬として使
用できる。

【００５５】また、本発明に述べたあらゆる形態をとっ
た該ポリペプチド、すなわち配列表の配列番号１及び２
からなる群より選ばれるアミノ酸配列の一部もしくは全
部のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、およびそれ
らから構成される複合体を組み合わせてなるものは本発
明に含まれるものとする。尚、本明細書に記載されてい
るＤＮＡ、組換え体宿主としての大腸菌の取扱いに必要
な一般的な操作は当業者間で通常行われているものであ
り、例えばＭａｎｉａｔｉｓらの実験操作書（Ｔ．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ１９８２，１９８９）に従えば容易に実
施できる。使用する酵素、試薬類もすべて市販の製品を
用いることができ、特に断らない限り、製品で指定され
ている使用条件に従えば、完全にそれらの目的を達成す
ることができる。

【００５６】

【発明の実施の形態】本発明を実施例により詳細に説明
するが、本発明のはこれらの実施例のみに限定されるも
のではない。実施例１プローブの作製Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｒ２４７０９のクローンに相同
な塩基配列を有するＤＮＡ断片を取得し、ｃＤＮＡスク
リーニングのプローブとするために、Ｒ２４７０９に対
応するＰＣＲプライマーとして、センスプライマーＲ２
４７０９Ｓ：５’−ＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＴＡＣ
ＴＧＴＧ−３’（配列表の配列番号４に記載）、および
アンチセンスプライマーＲ２４７０９Ａ：５’−ＡＧＡ
ＴＧＣＡＣＧＴＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧ−３’（配列表の
配列番号５に記載）（共に２０ｍｅｒ）の配列を有する
合成オリゴＤＮＡを作製した。

【００５７】合成オリゴヌクレオチドは固相法を原理と
する全自動ＤＮＡ合成機を使用して作製した。全自動Ｄ
ＮＡ合成機としてはアプライドバイオシステム社３９１
ＰＣＲ−ＭＡＴＥを使用した。ヌクレオチド、３'-ヌク
レオチドを固定した担体、溶液、および試薬は同社の指
示に従って使用した。所定のカップリング反応を終了
し、トリクロロ酢酸で５’末端の保護基を除去したオリ
ゴヌクレオチド担体を濃アンモニア中にて室温で１時間
放置することにより担体からオリゴヌクレオチドを遊離
させた。次に、核酸及びりん酸の保護基を遊離させるた
めに、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル内におい
て濃アンモニア溶液中で５５℃にて１４時間以上放置し
た。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレオチ
ドの精製をアプライドバイオシステム社のＯＰＣカート
リッジを使用して行い、２％トリフルオロ酢酸で脱トリ
チル化した。精製後のプライマーは最終濃度が１００ｐ
ｍｏｌ／μｌとなるように脱イオン水に溶解してＰＣＲ
に使用した。

【００５８】ＰＣＲによる増幅は以下のように行った。
ヒト胎児脳由来ｃＤＮＡ混合溶液（ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏ
ｎｅｃＤＮＡ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μｌを使用
し、１０×緩衝液（５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭＭｇＣｌ
₂ 、０．０１％ゼラチン）５μｌ、ｄＮＴＰＭｉｘｔ
ｕｒｅ（宝酒造社製）４μｌ、前述のセンスプライマー
Ｒ２４７０９Ｓ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）およびアンチ
センスプライマーＲ２４７０９Ａ（１００ｐｍｏｌ／μ
ｌ）を各０．２５μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（ＡｍｐｌｉＴａｑ：宝酒造社製、５Ｕ／μｌ）０．２
μｌを加え、最後に蒸留水を加えて全量を５０μｌとし
て、９５℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃を２
分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を３５
サイクル行い最後に７２℃にて７分間放置してＰＣＲを
行った。このＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電
気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社
製）にて染色後、紫外線下で観察し、約２１０ｂｐのｃ
ＤＮＡが増幅されていることを確認した。

【００５９】こうして得られたＲ２４７０９に対応する
ＰＣＲプライマーによるＰＣＲ産物の全量は、低融点ア
ガロース（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）にて作製した２％
アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド
にて染色後、紫外線照射下にて約２１０ｂｐのバンドを
切り出し、ゲルと同体積の蒸留水を加え、６５℃にて１
０分間加熱し、ゲルを完全に溶かしたのち、等量のＴＥ
飽和フェノール（日本ジーン社製）を加えて、１５００
０ｒｐｍ５分間遠心分離後上清を分離し、さらに同様な
分離作業をＴＥ飽和フェノール：クロロフォルム（１：
１）溶液、さらにクロロフォルムにて行った。最終的に
得られた溶液からＤＮＡをエタノール沈澱して回収し
た。

【００６０】プラスミドベクターとしてｐＣＲII Ｖｅ
ｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製、以下ｐＣＲII
と示す）を用い、このプラスミドベクターと先のＤＮＡ
のモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）にてプラ
スミドベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込
まれたｐＣＲIIを大腸菌ＯｎｅＳｈｏｔＣｏｍｐｅ
ｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に遺
伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μ
ｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地
のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れ
てきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリン
を含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、１８
時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザー
ドミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の
説明書に従ってプラスミドベクターを分離した。

【００６１】このプラスミドベクターを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩにて消化して、約２１０ｂｐのＤＮＡが切り出され
てくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確
認し、確認されたプラスミドベクタークローンについ
て、組み込まれているＤＮＡの塩基配列を螢光ＤＮＡシ
ークエンサー（アプライドバイオシステム社、モデル３
７３Ｓ）にて調べ、上記プライマーによって挟まれるＲ
２４７０９の塩基配列と相同であることを確認した。こ
のＥＳＴクローンＲ２４７０９と相同の塩基配列を有す
るＤＮＡ断片を「プローブ￥７」と称する。また、プロ
ーブ￥７を有するこのプラスミドをｐＣＲ￥７と名付け
た。

【００６２】実施例２プローブ￥７を用いたノザンハイブリダイゼーション実施例１に記載した方法によって取得したプローブ￥７
がコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現を調べるため、あ
らかじめｍＲＮＡが転写されているフィルターであるＣ
ｌｏｎｔｅｃｈ社ＨｕｍａｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴ
ｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ、Ｈｕｍａｎ
ＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎ
Ｂｌｏｔ II 、ＨｕｍａｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉ
ｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ IIIを用いてノザ
ンブハイブリダイゼーションを行った。実施例１に記載
の方法で取得したプローブ￥７を、ＤＮＡラベリングキ
ット（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡｌａｂｅｌｉｎｇ
ｓｙｓｔｅｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて放射
性同位元素³²Ｐにて標識してノザンハイブリダイゼーシ
ョン用プローブとした。

【００６３】すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液
５μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸
騰水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝
液１０μｌ、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４Ｄ
ＮＡポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３
７℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカ
ラム（ＱｕｉｃｋＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎＳｅｐｈ
ａｄｅｘＧ−５０：ベーリンガーマンハイム社製）で
精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷後使用
した。次いで、以下に述べる条件で前記のフィルターと
ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーシ
ョンは、各々の成分の最終濃度が５倍濃度の（以下５×
と示す）ＳＳＰＥ溶液、５倍濃度のデンハルト液（和光
純薬社製）、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、
５０％ホルムアミド及び１００μｇ／ｍｌの沸騰水浴に
より変性したサケ精子ＤＮＡであるプレハイブリダイゼ
ーション液中に浸し、４２℃にて２時間振とうしたの
ち、前述の方法で³²Ｐ標識されたプローブを含むプレハ
イブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダイゼー
ション液に浸し、４２℃にて１６時間振とうして行っ
た。

【００６４】次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む
２×ＳＳＰＥ溶液に浸し、室温にて１５分間振とうして
洗浄し、それを４回行った。洗浄を終了したフィルター
を増感スクリーンを使用して、７２時間オートラジオグ
ラフィーを行った。その結果、ヒト成人組織のうちで
脳、脊髄、副腎で顕著な発現が認められた。しかし、他
の臓器ではほとんど発現が認められず、プローブ￥７が
コードする遺伝子は脳、神経系組織に特異的に発現する
遺伝子あることを明らかにした。

【００６５】実施例３ｃＤＮＡクローニングと同定プローブ￥７を実施例２に記載の方法と同様の方法を用
いて放射性同位元素³²Ｐにて標識して、ｃＤＮＡスクリ
ーニング用プローブとした。ヒト胎児脳のλファージｃ
ＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）のファー
ジ液の一部をとりＳＭバッファー（０．１ＭＮａＣ
ｌ、８ｍＭＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％ｇｅｌａｔｉ
ｎ）で数種の希釈度で希釈したものを、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＮＭ５１４から作製したファージプレーティングセルに
感染させ、Ｌ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％ＮａＣｌ）の寒天プレートにプラークを形
成させることによりタイトレーションした結果、タイタ
ーは２×１０⁵ｐｆｕ／ｍｌであった。

【００６６】上記ライブラリーのλｇｔ１０組換え体約
９０万クローンを、前述の放射性同位元素³²Ｐで標識し
たＤＮＡプローブを用いてプラークハイブリダイゼーシ
ョンによりスクリーニングし２４個のポジティブクロー
ンを得た。即ち、上記ライブラリーのファージ液２ｍｌ
をＥ．ｃｏｌｉＮＭ５１４に感染させてＬ培地の寒天
プレート上に形成させた９×１０⁵個のプラークを、ナ
イロンフィルター（ＨｙｂｏｎｄＮ＋：Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ社製）に転写し、転写したナイロンフィルターをア
ルカリ処理（１．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＮａＯＨ
を染み込ませた濾紙上に７分間放置）し、次いで中和処
理（１．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．２）、１ｍＭＥＤＴＡを染み込ませた濾紙
上に３分間放置）を２回行い、次にＳＳＰＥ溶液（０．
３６ＭＮａＣｌ、０．０２Ｍりん酸ナトリウム（ｐＨ
７．７）、２ｍＭＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間振
とう後洗浄し、風乾した。その後、０．４ＭＮａＯＨ
を染み込ませた濾紙上に２０分間放置し、５倍濃度のＳ
ＳＰＥ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。

【００６７】次いで、放射性同位元素³²Ｐで標識したＤ
ＮＡプローブと以下に述べる条件でハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーションは各々の成分の
最終濃度が５倍濃度の（以下５×と示す）ＳＳＰＥ溶
液、５倍濃度のデンハルト液（和光純薬社製）、０．５
％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、及び２０μｇ／
ｍｌの沸騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡであるプ
レハイブリダイゼーション液中に浸し、５０℃にて２時
間振とうしたのち、前述の方法で³²Ｐ標識されたプロー
ブを含むプレハイブリダイゼーション液と同一組成のハ
イブリダイゼーション液に浸し、５０℃にて１６時間振
とうして行った。

【００６８】次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む
２×ＳＳＰＥ溶液に浸し、室温にて１５分間振とうして
洗浄し、それを４回行った。洗浄を終了したフィルター
を増感スクリーンを使用して、２４時間オートラジオグ
ラフィーを行った。その結果強く露光された部分に相応
する寒天領域よりファージを抽出し、再度上記の工程に
従ってプラークハイブリダイゼーションを行い２４種の
純化λｇｔ１０組換え体を得た。これら２４種の組換え
体からグロスバーガーらの方法（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅ
ｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓｅａｒｃｈ（１９８７）１５，６７３７）に従ってλ
ｇｔ１０組換え体ＤＮＡを抽出した。

【００６９】次に、得られたλｇｔ１０組換え体ＤＮＡ
のひとつである＃７０をＥｃｏＲＩで切断後、アガロー
スゲル電気泳動を行ったところ約２．９ｋｂのインサー
トｃＤＮＡが認められ、このｃＤＮＡ断片を含むゲル断
片を切りだした。ゲル断片からＧｅｎｅｃｌｅａｎ II
（ＢＩＯ１０１社製）を用いて添付のプロトコールに従
いＤＮＡを抽出した。得られた約２．９ｋｂのＤＮＡ断
片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII KS ＋（東洋紡社製）の
ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてプラスミドｐ＃
７０とした。塩基配列決定のためにディレーションミュ
ータント（ｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔ）を作製し
た。ミュータントの作製にはキロシーケンス用ディレー
ションキット（宝酒造社製）を用いた。各ミュータント
の塩基配列をサンガーらの方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，
ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（１９７７）７４，５４６３）によって決定し、２．９
ｋｂｃＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した。決定した塩
基配列を配列表の配列番号３に示した。塩基配列の決定
はＤＮＡ蛍光シーケンサー（アプライドバイオシステム
社製：ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用い、
添付のマニュアルに従って行なった。

【００７０】本ＤＮＡ配列には８３番目に始まる開始コ
ドン（ＡＴＧ）から２２９７番目で終わる終止コドン
（ＴＧＡ）まで、７３７個のアミノ酸配列をコードし得
るオープンリーディングフレームが存在した。該オープ
ンリーディングフレームから翻訳したアミノ酸配列を配
列表の配列番号２に示した。プラスミドｐ＃７０の遺伝
子の方向は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIベクターのｌａ
ｃＺ遺伝子と逆方向、即ち、配列表の配列番号３に示し
た５’側がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII KS ＋ベクターの
マルチクローニングサイトのＳａｃＩ側に存在した。

【００７１】実施例４ノザンブロッティングによるｍＲＮＡの発現本新規膜蛋白質のｍＲＮＡの発現を調べるため、あらか
じめｍＲＮＡが転写されているフィルターであるＣｌｏ
ｎｔｅｃｈ社ＨｕｍａｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓ
ｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ、ＨｕｍａｎＭｕ
ｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏ
ｔ II 、ＨｕｍａｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅ
ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ III、ＨｕｍａｎＣａ
ｎｃｅｒＣｅｌｌＬｉｎｅＭｕｌｔｉｐｌｅＴ
ｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ、Ｈｕｍａｎ
ＦｅｔａｌＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏ
ｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ、ＨｕｍａｎＢｒａｉｎＭ
ｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢ
ｌｏｔ、ＨｕｍａｎＢｒａｉｎＭｕｌｔｉｐｌｅ
ＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ II 、Ｈｕ
ｍａｎＢｒａｉｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅ
ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔIII を用いた。

【００７２】プローブは、５’−ＴＣＣＣＡＧＴＣＴＣ
ＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ
（プライマー￥７−１０Ｓ、配列表の配列番号１５に記
載）と５’−ＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＴＡＡＧＣＧ
Ｃ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマー￥７−
１１Ａ、配列表の配列番号１６に記載）をプライマーと
して用いて、プラスミドｐ＃７０を鋳型としてＰＣＲを
行った。およそ５００ｂｐのＤＮＡ（配列表の配列番号
３のＤＮＡ配列の４９１番目から９９０番目）が増幅さ
れていることをアガロースゲル電気泳動で確認した。こ
のＰＣＲ産物を含むゲル断片を切り出し、Ｇｅｎｅｃｌ
ｅａｎ II （ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製した遺伝
子断片を前掲のＤＮＡラベリングキット（ＭｅｇａＰｒ
ｉｍｅＤＮＡｌａｂｅｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ：Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ社製）にて前述の方法で³²Ｐ標識し発現を
調べた。

【００７３】その結果、ヒト成人組織のうちで脳、脊
髄、副腎で顕著な発現が認められた。また、心臓、腎
臓、膵臓、前立腺、小腸、大腸、胃、気管で極めて微弱
な発現が認められた。しかしながら、胎盤、肺、肝臓、
骨格筋、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、末梢血白血球、甲状
腺、リンパ節、骨髄においては全く発現が認められなか
った。また、ヒト胎児組織においては脳、腎臓に発現が
認められたが、心臓、肺、肝臓では全く発現が認められ
なかった。さらに、ヒト成人脳における発現部位を詳細
に解析した。小脳扁桃、尾状核、脳梁、海馬、視床下
部、中脳黒質、視床下核、視床、小脳、大脳皮質、脊
髄、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻における発現を調べ
たところ全ての部位で顕著な発現が認められた。また、
ひと癌細胞においては、子宮脛部癌細胞株ＨｅＬａｃ
ｅｌｌＳ３、黒色腫細胞株Ｇ３６１において発現が認
められた。しかしながら、前骨髄球白血病細胞株ＨＬ−
６０、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２、リンパ芽球
白血病細胞株ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫細胞株
Ｒａｊｉ、結腸直腸腺癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株
Ａ５４９では全く発現が認められなかった。

【００７４】実施例５新規膜蛋白質の全長遺伝子発現プラスミドの作製実施例３に記した方法によって得られる本発明の新規膜
蛋白質全長の遺伝子を動物細胞に導入するため、配列表
の配列番号２に記載のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、およびコダック社製ＩＢＩＦＬＡＧを用いて、配
列表の配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端に８アミノ
酸、すなわちアミノ酸配列としてＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓを持つポ
リペプチド（以下ＦＬＡＧ、配列表の配列番号１４に記
載）を付加したポリペプチドをコードするＤＮＡをプラ
スミドｐＳＶＫ３（ファルマシア社製）のマルチクロー
ニング部位に各々別々につなぎ、それぞれ新規免疫関連
因子の全長発現プラスミドｐＳＶＢｅｒｔＦｕ、ｐＳＶ
ＢｅｒｔＦｕＦＬＡＧを作製した。

【００７５】配列表の配列番号２のアミノ酸配列を含有
するポリペプチド発現細胞の発現ベクター作製にあたっ
て、配列表の配列番号３の５’非転写領域を除き制限酵
素ＸｂａＩサイトを付加するため、５’−ＡＡＴＣＴＡ
ＧＡＴＧＣＡＧＣＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＡ−３’の
配列であるオリゴＤＮＡ（プライマーＡ、配列表の配列
番号６に記載）、５’−ＣＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＣＣＡ
ＧＧＧＡＧＣＴ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プラ
イマーＢ、配列表の配列番号７に記載）をプライマーと
して用いて、ｐ＃７０をテンプートとして用いてＰＣＲ
を行った。およそ１１０ｂｐのＤＮＡが増幅されている
ことをアガロースゲル電気泳動で確認後、このＰＣＲ産
物を実施例１に記載の方法にて精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ
ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし
た。その後、３クローンのコロニーからプラスミドＤＮ
Ａを精製して、シークエンスをして遺伝子配列を確認
し、遺伝子配列に誤りがなく目的の遺伝子配列、すなわ
ち配列表の配列番号３のＤＮＡ配列の８４番から１９４
番の配列を持ったフラグメントであることを確認した。
以下、本フラグメントを有するプラスミドをｐＢｅｒｔ
−１とする。

【００７６】次に、配列表の配列番号３の新規膜蛋白質
遺伝子の３’非転写領域を除き制限酵素ＸｈｏＩサイト
を付加するため、５’−ＡＴＣＣＡＴＣＣＧＧＣＡＴＧ
ＣＣＡＧＧＴＴ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プラ
イマーＣ、配列表の配列番号８に記載）、５’−ＡＡＣ
ＴＣＧＡＧＡＴＴＡＣＡＡＡＴＣＴＴＴＡＧＴＴＴＴＡ
ＡＴＣＡＧ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマ
ーＤ、配列表の配列番号９に記載）をプライマーとして
用いて、プラスミドｐ＃７０をテンプレートとしてＰＣ
Ｒを行った。およそ１３０ｂｐのＤＮＡが増幅されてい
ることをアガロースゲル電気泳動で確認後、このＰＣＲ
産物を実施例１記載の方法にて精製して、ｐＴ７Ｂｌｕ
ｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニング
した。その後、４クローンのコロニーからプラスミドＤ
ＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列を確認
し、遺伝子配列に誤りがなく目的の遺伝子配列、すなわ
ち配列表の配列番号３のＤＮＡ配列の２１６８番から２
２９７番の配列を持ったフラグメントであることを確認
した。以下、本フラグメントを有するプラスミドをｐＢ
ｅｒｔ−２とする。

【００７７】さらに、配列表の配列番号２の新規膜蛋白
質全長アミノ酸配列のＣ末端に８アミノ酸、すなわちア
ミノ酸配列としてＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓを持つポリペプチド（Ｆ
ＬＡＧ、配列表の配列番号１４に記載）を付加したポリ
ペプチドをコードする遺伝子配列を持つ発現ベクターの
作製にあたって、同様な方法で上記のプライマーＣ、
５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴ
ＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＴＴＡＧＴ
ＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧ−３’の配列であるオリゴ
ＤＮＡ（プライマーＥ、配列表の配列番号１０に記載）
をプライマーとして用いて、プラスミドｐ＃７０をテン
プレートとしてＰＣＲを行い、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター
にサブクローニングして、４クローンをシークエンス
し、遺伝子配列を確認して、目的の遺伝子配列、すなわ
ち配列表の配列番号３のＤＮＡ配列の２１６８番から２
２９４番の配列の３’端に５’−ＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧ
ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＴＧＡ−３’（ＦＬＡ
Ｇ：配列表の配列番号１４に記載）がつながった配列を
有するフラグメントであることを確認した。以下、本フ
ラグメントを有するベクターをｐＢｅｒｔ−３とする。

【００７８】次に、ｐ＃７０を制限酵素ＸｂａＩ及び、
ＢａｌＩで消化し、実施例３と同様な方法で精製したお
よそ５．９ｋｂｐのＤＮＡ断片、すなわち配列表の配列
番号３のＤＮＡ配列の１８４番から３２３０番の配列を
含むＤＮＡ断片の３’末端の先に、マルチクローニング
サイトのＥｃｏＲＩサイトからＸｂａＩサイトまでの配
列が除かれたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIがＥｃｏＲＩを
介してつながっているフラグメントに、上記と同様にｐ
Ｂｅｒｔ−１を制限酵素ＸｂａＩ及び、ＢａｌＩで消化
して得た１１０ｂｐの断片をＤＮＡＬｉｇａｉｏｎ
ＫｉｔＶｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結してプ
ラスミドｐＢｅｒｔ−４とした。さらに、ｐＢｅｒｔ−
４を制限酵素を制限酵素ＳｐｈＩとＸｈｏＩにて消化
し、アガロースゲル電気泳動にておよそ５ｋｂｐのフラ
グメント、すなわち配列表の配列番号３のＤＮＡ配列の
８４番から２１８１番の配列の５’末端の先に、マルチ
クローニングサイトのＸｈｏＩサイトからＸｂａＩサイ
トまでの配列が除かれたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIが、
制限酵素サイトのＸｂａＩを介してつながっているフラ
グメントを切り出し、前述の方法で精製した。この遺伝
子断片をＦ１とする。

【００７９】同様に、ｐＢｅｒｔ−２、及び、ｐＢｅｒ
ｔ−３について制限酵素ＳｐｈＩ及びＸｈｏＩ消化を行
い、それぞれ約１２０ｂｐ、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片
を精製した。これらのＤＮＡ断片を各々Ｆ２、Ｆ３とす
る。そして、Ｆ１とＦ２、Ｆ１とＦ３を各々前述の方法
でつなぎ、制限酵素ＸｂａＩ及びＸｈｏＩで、配列表の
配列番号２のポリペプチドをコードする部分の遺伝子断
片が切り出されるプラスミドｐＢＳＢｅｒｔＦｕ１、及
び、制限酵素ＸｂａＩ及びＸｈｏＩで配列表の配列番号
２のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードする部分に対応する遺伝子断
片が切り出されるプラスミドｐＢＳＢｅｒｔＦｕ２を作
製した。

【００８０】このようにして作製されたプラスミドｐＢ
ＳＢｅｒｔＦｕ１、ｐＢＳＢｅｒｔＦｕ２を制限酵素Ｘ
ｂａＩ、ＸｈｏＩにて消化し、電気泳動にて各々およそ
２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片、すなわち新規ポリペプチド
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片部分を含むＤＮ
Ａ断片を分離し精製した。この２種のＤＮＡ断片を、前
掲のｐＳＶＫ３を制限酵素ＸｂａＩ及びＸｈｏＩで処理
して、実施例３に記載の方法で精製した約３．９ｋｂの
ＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）に
て連結し、新規ポリペプチドの発現プラスミドを構築し
た。以上のように作製されたＦＬＡＧ配列を含まない発
現プラスミドをｐＳＶＢｅｒｔＦｕ、ＦＬＡＧ配列を含
む発現プラスミドをｐＳＶＢｅｒｔＦｕＦＬＡＧとす
る。

【００８１】実施例６新規膜蛋白質の細胞外部分遺伝子発現プラスミドの作製実施例３に記載した方法によって得られる新規遺伝子が
コードする新規膜蛋白質の細胞外部分のＣ末端、つまり
配列表の配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端に、ＦＬＡ
Ｇ配列を付加したポリペプチドを動物細胞に産生させる
発現プラスミドｐＳＶＢｅｒｔＥｃＦＬＡＧ、及び、該
膜蛋白質の細胞外部分のＣ末端、つまり配列表の配列番
号１のアミノ酸配列のＣ末端にヒトイムノグロブリンＩ
ｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ部分のアミノ酸配列を付
加したポリペプチドを動物細胞に産生させる発現プラス
ミドｐＳＶＢｅｒｔＥｃＩｇを構築した。

【００８２】ｐＳＶＢｅｒｔＥｃＦＬＡＧ、すなわち、
配列表の配列番号１の新規ポリペプチド細胞外部分アミ
ノ酸配列のポリペプチドのＣ末端に８アミノ酸、すなわ
ちアミノ酸配列としてＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ
−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓを持つポリペプチド
（ＦＬＡＧ：配列表の配列番号１４に記載）を付加した
ポリペプチドをコードする遺伝子配列を持つ発現プラス
ミドの作製にあたって、全長の場合と同様な方法で、
５’−ＴＧＴＡＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＧＣＴＡＡ
−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマーＦ、配列
表の配列番号１１に記載）、５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴ
ＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴ
ＣＧＧＡＧＴＧＣＣＧＴＧＧＣＡＴＧＴＴＧＧ−３’の
配列であるオリゴＤＮＡ（プライマーＧ、配列表の配列
番号１２に記載）をプライマーとして、配列表の配列番
号３の遺伝子を含むプラスミドｐ＃７０をテンプレート
として用いてＰＣＲを行った。およそ３２０ｂｐのＤＮ
Ａが増幅されていることをアガロースゲル電気泳動で確
認後、このＰＣＲ産物を実施例１記載の方法にて精製し
て、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターにサブクローニングした。

【００８３】その後、５クローンのコロニーからプラス
ミドＤＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列
を確認し、遺伝子配列に誤りがなく目的の遺伝子配列、
すなわち配列表の配列番号３のＤＮＡ配列の１７０８番
から１９９７番の配列の３’端に５’−ＧＡＴＴＡＴＡ
ＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＴＧＡ−３’（配
列表の配列番号１４に記載）がつながった配列を有する
フラグメントであることを確認し、プラスミドｐＢｅｒ
ｔ−５とした。前述のプラスミドｐＢｅｒｔ−４を制限
酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ（宝酒造社製）にて消化
し、配列表の配列番号３のＤＮＡ配列の１７１９番以降
の配列のＤＮＡ断片を除去した約４．５ｋｂｐのＤＮＡ
断片に、同様に、ｐＢｅｒｔ−５を制限酵素ＢａｍＨＩ
およびＸｈｏＩで消化して得た約３１０ｂｐのＤＮＡ断
片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結してプラスミドｐＢＳ
ＢｅｒｔＥｃＦＬＡＧを得た。

【００８４】このようにして作製されたプラスミドｐＢ
ＳＢｅｒｔＥｃＦＬＡＧを制限酵素ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ
にて消化し、電気泳動にておよそ２ｋｂｐのＤＮＡ断
片、すなわち新規ポリペプチドの細胞外領域のアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を分離し
精製した。このＤＮＡ断片を、前掲の発現ベクターｐＳ
ＶＫ３を、同様に制限酵素ＸｂａＩ及びＸｈｏＩで処理
後、精製して得た約３．９ｋｂのベクターＤＮＡ断片
と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）にて連結し、
新規ポリペプチドの配列表の配列番号１のアミノ酸配列
のＣ末端にＦＬＡＧ配列を有するポリペプチドを産生し
うるプラスミドを作製した。以上のように作製された発
現プラスミドをｐＳＶＢｅｒｔＥｃＦＬＡＧとする。

【００８５】次に、ｐＳＶＢｅｒｔＥｃＩｇ、すなわ
ち、配列表の配列番号１の新規ポリペプチド細胞外部分
アミノ酸配列のポリペプチドのＣ末端にヒトＩｇＧのヒ
ンジ部分以下のＦｃ部分のアミノ酸配列を付加したポリ
ペプチドをコードする遺伝子配列を有する発現プラスミ
ドの作製にあたって、配列表の配列番号の１のアミノ酸
配列のポリペプチドのＣ末端に制限酵素ＢｇｌIIサイト
を付加するため、上記の場合と同様な方法で上記のプラ
イマーＦ、５’−ＡＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＴＧＣＣＧＴ
ＧＧＣＡＴＧＴＴＧＧ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ
（プライマーＨ、配列表の配列番号１３に記載）をプラ
イマーとして、配列表の配列番号３の遺伝子を含むプラ
スミドｐ＃７０をテンプレートとして用いてＰＣＲを行
った。およそ３００ｂｐのＤＮＡが増幅されていること
をアガロースゲル電気泳動で確認後、このＰＣＲ産物を
実施例１に記載の方法にて精製して、ｐＴ７Ｂｌｕｅベ
クター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位にサブ
クローニングした。

【００８６】その後、１０クローンのコロニーからプラ
スミドＤＮＡを精製して、シークエンスをしてＤＮＡ配
列を確認し、ＤＮＡ配列に誤りがなく目的のＤＮＡ配
列、すなわち配列表の配列番号３のＤＮＡ配列の１７０
８番から１９９６番の配列の３’末端に制限酵素Ｂｇｌ
IIがつながった配列を有するフラグメントであることを
確認し、かつ、該ＤＮＡ断片が、その翻訳方向がｐＴ７
ＢｌｕｅベクターのｌａｃＺ遺伝子と逆方向となるよう
に連結されたクローン、すなわち、該ＤＮＡ断片の配列
表の配列番号３の１７０８番の５’末端がｐＴ７Ｂｌｕ
ｅベクターのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩサ
イト側に連結されたクローンを選択し、ｐＢｅｒｔ−６
とした。

【００８７】次に、イムノグロブリンＦｃタンパクとの
融合タンパクの作製はＺｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ（Ｚｅｔ
ｔｌｍｅｉｓｓｌｅｔａｌ．，ＤＮＡｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．，９．３４７−３５４，１９９０）らの方法
に従って、イントロンを含むゲノムＤＮＡを用いた遺伝
子を利用した。すなわち、イントロンを含む、ヒトＩｇ
Ｇ１Ｆｃをコードする遺伝子を有するプラスミドｐＢＳ
ｈＩｇＦｃ（国際公開番号ＷＯ９６／１１２１２）を
制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（宝酒造社製）にて消
化し、実施例３に記載の方法にて精製し、約１．４ｋｂ
のヒトＩｇＧ１のヘビーチェーンのヒンジ部分にあたる
ゲノムＤＮＡ（配列はＫａｂａｔｅｔａｌ．，Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎ
ｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ
９１−３２４２，１９９１を参照）を得た。次に、前述
のプラスミドｐＢｅｒｔ−６を制限酵素ＢｇｌII及びＸ
ｂａＩにて消化し、電気泳動にて分離した約３．２ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片、すなわち、ｐＢｅｒｔ−６のｐＴ７Ｂ
ｌｕｅベクター配列のマルチクローニングサイトのＥｃ
ｏＲＶサイトからＸｂａＩサイトまでの約２０ｂｐを除
去したＤＮＡ断片に、前述の約１．４ｋｂｐのヒトＩｇ
Ｇ１Ｆｃ部分をコードするゲノムＤＮＡ断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造社製）で連結してプラスミドｐＢ
ｅｒｔ−７を得た。

【００８８】次に、上記プラスミドｐＢｅｒｔ−７を制
限酵素ＳａｃＩ及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）にて消化
し、電気泳動にて分離した約４．６ｋｂｐのＤＮＡ断
片、すなわち、ｐＢｅｒｔ−７のｐＴ７Ｂｌｕｅベクタ
ー配列のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＶサイト
からＳａｃＩサイトまでの約２０ｂｐ及び、配列表の配
列番号３の１７０８番から１７１５番の制限酵素Ｂａｍ
ＨＩサイトまでのＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片およそ
８ｂｐを除去したＤＮＡ断片に、前述のプラスミドｐＢ
ｅｒｔ−４を、同様に制限酵素ＳａｃＩ及びＢａｍＨＩ
にて処理し電気泳動により分離した約１．６ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片、すなわち、配列表の配列番号３の８４番から
１７１５番の制限酵素ＢａｍＨＩサイトまでのＤＮＡ配
列を有するＤＮＡ断片と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造社製）で連結してプラスミドｐＴ７ＢｅｒｔＥｃＩｇ
を得た。

【００８９】このようにして作製されたプラスミドｐＴ
７ＢｅｒｔＥｃＩｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ
（宝酒造社製）にて消化し、電気泳動にておよそ３．３
ｋｂｐのＤＮＡ断片、すなわち新規ポリペプチドの細胞
外領域のＣ末端に、ヒトＩｇＧ１Ｆｃタンパクを付加し
た融合タンパクのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
を含むＤＮＡ断片を分離し精製した。このＤＮＡ断片
を、前掲の発現ベクターｐＳＶＫ３を、同様に制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで処理後、精製して得た約３．
９ｋｂのベクターＤＮＡ断片と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）にて連結し、新規ポリペプチドの配列表
の配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端にヒトＩｇＧ１Ｆ
ｃタンパクを有するポリペプチドを産生しうるプラスミ
ドを作製した。以上のように作製された発現プラスミド
をｐＳＶＢｅｒｔＥｃＩｇとする。

【００９０】実施例７プラスミドによるＢａｌｂ／３Ｔ３細胞の形質転換マウス繊維芽細胞Ｂａｌｂ／３Ｔ３ｃｌｏｎｅＡ３
１（理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．
ＲＣＢ０００５）を実施例５に記載した方法で得た発現
プラスミドｐＳＶＢｅｒｔＦｕ、並びにｐＳＶＢｅｒｔ
ＦｕＦＬＡＧを用いて形質転換させた。即ち、Ｄ−ＭＥ
Ｍ（ダルベッコ改編ＭＥＭ培地、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社
製）１０％ＦＣＳにて培養した上記細胞を、形質転換前
日に培地を交換し、細胞数を直径１０ｃｍの細胞培養用
ディッシュあたり５×１０⁶個にして１０ｍｌの上記培
地を加え一晩培養した。翌日、遠心分離にて細胞を沈澱
させ、ＰＢＳ（−）にて２回遠心洗浄後、１ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂、ＰＢＳ（−）に１×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌと
なるようにして細胞を調製した。遺伝子導入はＢｉｏ−
Ｒａｄ社製遺伝子導入装置用いたエレクトロポレーショ
ン法で行った。

【００９１】上記の細胞懸濁液５００μｌをエレクトロ
ポレーション専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現プラ
スミドｐＳＶＢｅｒｔＦｕまたはｐＳＶＢｅｒｔＦｕＦ
ＬＡＧ及び、ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１５０）
を各々２０μｇ加え、氷中で５分間放置する。その後、
あいだを１分間室温で放置して、２回の３μＦ、４５０
Ｖの電圧をかけた。その後、氷中で５分間放置後、直径
１０ｃｍ細胞培養用ディッシュで上記の培地１０ｍｌで
３日間培養を行った。３日後、上記の培地にＧ４１８
（Ｓｉｇｍａ社製）を４００μｇ／ｍｌとなるように加
えた培地に交換し、その後２日おきに培地の１／３を交
換して１０日間ほど培養を続けた。１０日後、ディッシ
ュ上に形成されたコロニーをトリプシン溶液（ＧＩＢＣ
Ｏ−ＢＲＬ社製）を使ってはがし、クローン化された遺
伝子の安定発現細胞株を得た。

【００９２】以降は、このようにして作製されたＢａｌ
ｂ／３Ｔ３の配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
を含有するポリペプチドの安定発現細胞株をＢａｌｂ／
ＦＵＬＬと示し、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸
配列を含有するポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧアミノ
酸配列を有するポリペプチドの安定発現細胞株をＢａｌ
ｂ／ＦＵＬＬＦＬＡＧと示す。また、同時に同じ方法で
ｐＳＶ２−ｎｅｏのみを遺伝子導入したコントロールの
形質転換細胞株を作製しこれをＢａｌｂ／ＣＯＮと示
す。

【００９３】実施例８プラスミドによるＣＯＳ−７細胞の形質転換ＣＯＳ−７（理化学研究所、細胞開発銀行から入手可
能、ＲＣＢ０５３９）を実施例６に記載の方法で得たプ
ラスミドｐＳＶＢｅｒｔＥｃＦＬＡＧ、並びにｐＳＶＢ
ｅｒｔＥｃＩｇを用いて、実施例７に記載の方法と同様
の方法にて形質転換させた。即ち、Ｄ−ＭＥＭ（ダルベ
ッコ改編ＭＥＭ培地、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）１０％
ＦＣＳにて培養した上記細胞を、形質転換前日に培地を
交換し、細胞数を直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシュ
あたり５×１０⁶ 個にして１０ｍｌの上記培地を加え一
晩培養した。翌日、遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢ
Ｓ（−）にて２回遠心洗浄後、１ｍＭＭｇＣｌ₂、Ｐ
ＢＳ（−）に１×１０⁷ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように
して細胞を調製した。遺伝子導入はＢｉｏ−Ｒａｄ社製
遺伝子導入装置用いたエレクトロポレーション法で行っ
た。

【００９４】上記細胞懸濁液５００μｌをエレクトロポ
レーション専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現プラス
ミドｐＳＶＢｅｒｔＥｃＦＬＡＧ、またはｐＳＶＢｅｒ
ｔＥｃＩｇを、各々２０μｇ加え、氷中で５分間放置す
る。その後、間を１分間室温で放置して、２回の３μ
Ｆ、４５０Ｖの電圧をかけた。その後、氷中で５分間放
置後、直径１０ｃｍ細胞培養用ディッシュで上記の培地
１０ｍｌで培養を行った。遺伝子導入の翌日、培地を無
血清のＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）に置換
し、以後４日間おきに交換し、２週間にわたって培養上
清を分取した。分取した培養上清を各々セントリコン３
０（アミコン社製）にてバッファーを培地からＰＢＳ
（−）に交換及び１０倍に濃縮した。

【００９５】実施例９組換え型蛋白のウェスタンブロットを用いた検出実施例８に記載の方法で作製した形質転換細胞上清中に
配列表の配列番号１に示すポリペプチドを含有するポリ
ペプチドが産生されていることを確認するため、以下の
ようにウエスタンブロットにて確認した。すなわち、濃
縮した培養上清をＡＣＩジャパン社製のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ用電気泳動槽及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルア
ミドゲル（グラディエントゲル５〜１０％）を用い、添
付の取扱い説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなっ
た。サンプルは２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）
を加え過熱処理した還元条件下のサンプルと、その処理
を行わなかった非還元条件下のサンプルについて行い、
マーカーとしてはＡｍｅｒｓｈａｍ社製レインボーマー
カー（高分子量用）を用い、サンプルバッファー、泳動
バッファーについては添付の取扱い説明書に従って作製
した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、アクリルアミドゲルを
ＰＶＤＦメンブランフィルター（ＢｉｏＲａｄ社製）に
ＢｉｏＲａｄ社製ミニトランスブロットセルにより転写
した。

【００９６】このように作製されたフィルターを５％Ｂ
ＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭＴｒ
ｉｓ、１３７ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１％
Ｔｗｅｅｍ２０）に４℃一晩揺すりながらブロッキン
グした。目的のタンパクがＦＬＡＧ融合タンパクの場合
は一次抗体としてマウスモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−
ＦＬＡＧＭ２（コダック社製）、二次抗体としてペル
オキシダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ社製）を反応させた。またＩｇＧＦｃ融合タンパクの
場合は、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇ羊抗体（アマ
シャム社製）を反応させた。抗体の反応時間は各々室温
で一時間反応させ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて１０分間
室温で揺すり洗浄する操作を３回づつ繰り返した。最後
の洗浄後、フィルターをＡｍｅｒｓｈａｍ社製ＥＣＬウ
エスタンブロッティング検出システムの反応液に五分間
浸し、サランラップに包んでＸ線フィルムに感光させ
た。

【００９７】その結果、ＦＬＡＧ融合タンパク（以下Ｅ
ｃＦＬＡＧ−ＰＴＮとする）の場合は、還元条件、還元
条件ともおよそ８０ｋダルトン程度の蛋白が検出でき
た。また、ＩｇＧＦｃ融合タンパク（以下ＥｃＩｇ−Ｐ
ＴＮとする）の場合は、還元条件ではおよそ１１０ｋダ
ルトン、非還元条件ではおよそ２２０ｋダルトンのタン
パクが検出できた。以上の結果から、目的とする、配列
表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの産生細胞を得ることができた。検出された本発
明蛋白の細胞外部分を有する組換え型タンパクの分子量
は、アミノ酸組成から予想される分子量よりともにおよ
そ１５ｋダルトン大きく、糖鎖付加されていると予想さ
れた。

【００９８】実施例１０組換え型細胞外部分蛋白の精製実施例８に記載した方法で作製した、発現プラスミドｐ
ＳＶＢｅｒｔＥｃＦＬＡＧ及びｐＳＶＢｅｒｔＥｃＩｇ
を用いて形質転換したＣＯＳ−７細胞の培養上清を、各
々５リットル作製した。これらの培養上清をＡｎｔｉ−
ＦＬＡＧＭ２ＡｆｆｉｎｉｔｙＧｅｌカラム（コダ
ック社製）及びＰｒｏｔｅｉｎＧセファロースカラム
（ファルマシア社製）もしくはＰｒｏｔｅｉｎＡセ
ファロースカラム（ファルマシア社製）に通して、各々
の組換えタンパクをカラムに吸着させた。カラムのサイ
ズは共に１ｃｍ×３ｃｍで容積はおよそ２ｍｌであり、
流速は全て１ｍｌ／ｍｉｎ．で行った。吸着後、カラム
をＰＢＳ（−）２０ｍｌで洗浄し、その後、０．５ＭＴ
ｒｉｓーグリシン（ｐＨ３．０）で溶出した。

【００９９】溶出画分を２ｍｌずつ分取し、０．５ＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）２００μｌずつ加えて、
各々の画分を上記の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
泳動が終わった後、銀染キットワコーＩＩ（和光純薬社
製）で添付の説明書に従い染色した。その結果、ＥｃＦ
ＬＡＧ−ＰＴＮ、ＥｃＩｇ−ＰＴＮとも実施例９に記載
したウエスタンブロットの結果と同様の大きさのバンド
に精製タンパクが得られていることが確認できた。この
結果から、ＥｃＦＬＡＧ−ＰＴＮ、すなわち、配列表の
配列番号１に記載のアミノ酸配列のＣ末端にＦＬＡＧ配
列有するポリペプチド、並びにＥｃＩｇ−ＰＴＮ、すな
わち、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のＣ末
端にＩｇＧＦｃタンパクを有するポリペプチドをそれぞ
れ純品で得ることが出来た。

【０１００】より高純度なポリペプチドを得るために、
上記の方法で精製されたＥｃＦＬＡＧ−ＰＴＮ、ＥｃＩ
ｇ−ＰＴＮを各々ゲル濾過にて精製を行った。アフィニ
ティーカラムからの溶離液をアミコン社製セントリコン
３０にて濃縮及びＰＢＳ（−）へのバッファー交換を行
い、ゲル濾過はＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製）
を用い、同社のＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムにて行っ
た。実施例９の非還元条件下におけるウエスタンブロッ
ト結果と同様の分子量の位置に溶離されるメインピーク
を分取した。

【０１０１】実施例１１新規膜蛋白質を認識するモノクローナル抗体の樹立精製されたＥｃＦＬＡＧ−ＰＴＮを免疫原として、成書
の方法に従いマウスモノクローナル抗体を作成した。即
ち、実施例１０で作製した精製組換えポリペプチドＥｃ
ＦＬＡＧ−ＰＴＮをＢａｌｂ／ｃマウス（日本エスエル
シー社製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免役し
た。２回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上
昇を認めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓
細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａ
ｇ８（ＡＴＣＣＴＩＢ９）とポリエチレングリコール
法にて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（日本免疫生物研
究所製）にてハイブリドーマを選択し、酵素抗体法にて
ＥｃＦＬＡＧ−ＰＴＮ、並びにＥｃＩｇ−ＰＴＮをとも
に認識する抗体を培地中に産生しているハイブリドーマ
株を分離し、新規膜蛋白質の細胞外部分を特異的に認識
するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ株が樹立された。

【０１０２】このようにして樹立されたハイブリドーマ
の培養上清をファルマシア社製ＭａｂＴｒａｐＧ II
を用いて、添付のプロトコールに従って抗該膜蛋白質モ
ノクローナル抗体を精製し作製した。本モノクローナル
抗体を用いて実施例１０で精製されたポリペプチドを実
施例９に記載の条件でウェスタンブロットを行った。そ
の結果実施例９で示したウェスタンブロット結果と同様
の分子量の単一バンドが検出でき、本モノクローナル抗
体は新規膜蛋白質を特異的に認識できることが明らかに
なった。

【０１０３】

【発明の効果】本発明により、脳、神経系組織及び腫瘍
細胞に特異的に発現する新規膜蛋白質、およびその遺伝
子、およびその製造方法、および該膜蛋白質を特異的に
認識する抗体が提供され、脳、神経系に特異的な疾患及
びガンの診断への使用が可能である。

【０１０４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：６１２配列の型：アミノ酸トポロジー：不明配列の種類：ペプチド起源生物名：ヒト配列 Gly Pro Arg Gly Ser Ser Leu Ala Asn Pro Val Pro Ala Ala Pro Leu 1 5 10 15 Ser Ala Pro Gly Pro Cys Ala Ala Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Val 20 25 30 Cys Thr Ser Arg Pro Glu Pro Asp Pro Gln His Pro Ala Pro Ala Gly 35 40 45 Glu Pro Gly Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Ala Gly Ile Ser Gly Ala Asn 50 55 60 Cys Gln Leu Val Ala Asp Pro Cys Ala Ser Asn Pro Cys His His Gly 65 70 75 80 Asn Cys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Gly Tyr Leu Cys Ile 85 90 95 Cys Asn Glu Gly Tyr Glu Gly Pro Asn Cys Glu Gln Ala Leu Pro Ser 100 105 110 Leu Pro Ala Thr Gly Trp Thr Glu Ser Met Ala Pro Arg Gln Leu Gln 115 120 125 Pro Val Pro Ala Thr Gln Glu Pro Asp Lys Ile Leu Pro Arg Ser Gln 130 135 140 Ala Thr Val Thr Leu Pro Thr Trp Gln Pro Lys Thr Gly Gln Lys Val 145 150 155 160 Val Glu Met Lys Trp Asp Gln Val Glu Val Ile Pro Asp Ile Ala Cys 165 170 175 Gly Asn Ala Ser Ser Asn Ser Ser Ala Gly Gly Arg Leu Val Ser Phe 180 185 190 Glu Val Pro Gln Asn Thr Ser Val Lys Ile Arg Gln Asp Ala Thr Ala 195 200 205 Ser Leu Ile Leu Leu Trp Lys Val Thr Ala Thr Gly Phe Gln Gln Cys 210 215 220 Ser Leu Ile Asp Gly Arg Ser Val Thr Pro Leu Gln Ala Ser Gly Gly 225 230 235 240 Leu Val Leu Leu Glu Glu Met Leu Ala Leu Gly Asn Asn His Phe Ile 245 250 255 Gly Phe Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Ile Val Ala Leu Arg Leu 260 265 270 Thr Leu Val Val Lys Val Ser Thr Cys Val Pro Gly Glu Ser His Ala 275 280 285 Asn Asp Leu Glu Cys Ser Gly Lys Gly Lys Cys Thr Thr Lys Pro Ser 290 295 300 Glu Ala Thr Phe Ser Cys Thr Cys Glu Glu Gln Tyr Val Gly Thr Phe 305 310 315 320 Cys Glu Glu Tyr Asp Ala Cys Gln Arg Lys Pro Cys Gln Asn Asn Ala 325 330 335 Ser Cys Ile Asp Ala Asn Glu Lys Gln Asp Gly Ser Asn Phe Thr Cys 340 345 350 Val Cys Leu Pro Gly Tyr Thr Gly Glu Leu Cys Gln Ser Lys Ile Asp 355 360 365 Tyr Cys Ile Leu Asp Pro Cys Arg Asn Gly Ala Thr Cys Ile Ser Ser 370 375 380 Leu Ser Gly Phe Thr Cys Gln Cys Pro Glu Gly Tyr Phe Gly Ser Ala 385 390 395 400 Cys Glu Glu Lys Val Asp Pro Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Asn 405 410 415 Gly Thr Cys Tyr Val Asp Gly Val His Phe Thr Cys Asn Cys Ser Pro 420 425 430 Gly Phe Thr Gly Pro Thr Cys Ala Gln Leu Ile Asp Phe Cys Ala Leu 435 440 445 Ser Pro Cys Ala His Gly Thr Cys Arg Ser Val Gly Thr Ser Tyr Lys 450 455 460 Cys Leu Cys Asp Pro Gly Tyr His Gly Leu Tyr Cys Glu Glu Glu Tyr 465 470 475 480 Asn Glu Cys Leu Ser Ala Pro Cys Leu Asn Ala Ala Thr Cys Arg Asp 485 490 495 Leu Val Asn Gly Tyr Glu Cys Val Cys Leu Ala Glu Tyr Lys Gly Thr 500 505 510 His Cys Glu Leu Tyr Lys Asp Pro Cys Ala Asn Val Ser Cys Leu Asn 515 520 525 Gly Ala Thr Cys Asp Ser Asp Gly Leu Asn Gly Thr Cys Ile Cys Ala 530 535 540 Pro Gly Phe Thr Gly Glu Glu Cys Asp Ile Asp Ile Asn Glu Cys Asp 545 550 555 560 Ser Asn Pro Cys His His Gly Gly Ser Cys Leu Asp Gln Pro Asn Gly 565 570 575 Tyr Asn Cys His Cys Pro His Gly Trp Val Gly Ala Asn Cys Glu Ile 580 585 590 His Leu Gln Trp Lys Ser Gly His Met Ala Glu Ser Leu Thr Asn Met 595 600 605 Pro Arg His Ser 610

【０１０５】配列番号：２配列の長さ：７３７配列の型：アミノ酸トポロジー：不明配列の種類：ペプチド起源生物名：ヒト配列 Met Gln Pro Arg Arg Ala Gln Ala Pro Gly Ala Gln Leu Leu Pro Ala -25 -20 -15 Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Gly Pro Arg Gly Ser Ser -10 -5 1 5 Leu Ala Asn Pro Val Pro Ala Ala Pro Leu Ser Ala Pro Gly Pro Cys 10 15 20 Ala Ala Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Val Cys Thr Ser Arg Pro Glu 25 30 35 Pro Asp Pro Gln His Pro Ala Pro Ala Gly Glu Pro Gly Tyr Ser Cys 40 45 50 Thr Cys Pro Ala Gly Ile Ser Gly Ala Asn Cys Gln Leu Val Ala Asp 55 60 65 70 Pro Cys Ala Ser Asn Pro Cys His His Gly Asn Cys Ser Ser Ser Ser 75 80 85 Ser Ser Ser Ser Asp Gly Tyr Leu Cys Ile Cys Asn Glu Gly Tyr Glu 90 95 100 Gly Pro Asn Cys Glu Gln Ala Leu Pro Ser Leu Pro Ala Thr Gly Trp 105 110 115 Thr Glu Ser Met Ala Pro Arg Gln Leu Gln Pro Val Pro Ala Thr Gln 120 125 130 Glu Pro Asp Lys Ile Leu Pro Arg Ser Gln Ala Thr Val Thr Leu Pro 135 140 145 150 Thr Trp Gln Pro Lys Thr Gly Gln Lys Val Val Glu Met Lys Trp Asp 155 160 165 Gln Val Glu Val Ile Pro Asp Ile Ala Cys Gly Asn Ala Ser Ser Asn 170 175 180 Ser Ser Ala Gly Gly Arg Leu Val Ser Phe Glu Val Pro Gln Asn Thr 185 190 195 Ser Val Lys Ile Arg Gln Asp Ala Thr Ala Ser Leu Ile Leu Leu Trp 200 205 210 Lys Val Thr Ala Thr Gly Phe Gln Gln Cys Ser Leu Ile Asp Gly Arg 215 220 225 230 Ser Val Thr Pro Leu Gln Ala Ser Gly Gly Leu Val Leu Leu Glu Glu 235 240 245 Met Leu Ala Leu Gly Asn Asn His Phe Ile Gly Phe Val Asn Asp Ser 250 255 260 Val Thr Lys Ser Ile Val Ala Leu Arg Leu Thr Leu Val Val Lys Val 265 270 275 Ser Thr Cys Val Pro Gly Glu Ser His Ala Asn Asp Leu Glu Cys Ser 280 285 290 Gly Lys Gly Lys Cys Thr Thr Lys Pro Ser Glu Ala Thr Phe Ser Cys 295 300 305 310 Thr Cys Glu Glu Gln Tyr Val Gly Thr Phe Cys Glu Glu Tyr Asp Ala 315 320 325 Cys Gln Arg Lys Pro Cys Gln Asn Asn Ala Ser Cys Ile Asp Ala Asn 330 335 340 Glu Lys Gln Asp Gly Ser Asn Phe Thr Cys Val Cys Leu Pro Gly Tyr 345 350 355 Thr Gly Glu Leu Cys Gln Ser Lys Ile Asp Tyr Cys Ile Leu Asp Pro 360 365 370 Cys Arg Asn Gly Ala Thr Cys Ile Ser Ser Leu Ser Gly Phe Thr Cys 375 380 385 390 Gln Cys Pro Glu Gly Tyr Phe Gly Ser Ala Cys Glu Glu Lys Val Asp 395 400 405 Pro Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Asn Gly Thr Cys Tyr Val Asp 410 415 420 Gly Val His Phe Thr Cys Asn Cys Ser Pro Gly Phe Thr Gly Pro Thr 425 430 435 Cys Ala Gln Leu Ile Asp Phe Cys Ala Leu Ser Pro Cys Ala His Gly 440 445 450 Thr Cys Arg Ser Val Gly Thr Ser Tyr Lys Cys Leu Cys Asp Pro Gly 455 460 465 470 Tyr His Gly Leu Tyr Cys Glu Glu Glu Tyr Asn Glu Cys Leu Ser Ala 475 480 485 Pro Cys Leu Asn Ala Ala Thr Cys Arg Asp Leu Val Asn Gly Tyr Glu 490 495 500 Cys Val Cys Leu Ala Glu Tyr Lys Gly Thr His Cys Glu Leu Tyr Lys 505 510 515 Asp Pro Cys Ala Asn Val Ser Cys Leu Asn Gly Ala Thr Cys Asp Ser 520 525 530 Asp Gly Leu Asn Gly Thr Cys Ile Cys Ala Pro Gly Phe Thr Gly Glu 535 540 545 550 Glu Cys Asp Ile Asp Ile Asn Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys His His 555 560 565 Gly Gly Ser Cys Leu Asp Gln Pro Asn Gly Tyr Asn Cys His Cys Pro 570 575 580 His Gly Trp Val Gly Ala Asn Cys Glu Ile His Leu Gln Trp Lys Ser 585 590 595 Gly His Met Ala Glu Ser Leu Thr Asn Met Pro Arg His Ser Leu Tyr 600 605 610 Ile Ile Ile Gly Ala Leu Cys Val Ala Phe Ile Leu Met Leu Ile Ile 615 620 625 630 Leu Ile Val Gly Ile Cys Arg Ile Ser Arg Ile Glu Tyr Gln Gly Ser 635 640 645 Ser Arg Pro Ala Tyr Glu Glu Phe Tyr Asn Cys Arg Ser Ile Asp Ser 650 655 660 Glu Phe Ser Asn Ala Ile Ala Ser Ile Arg His Ala Arg Phe Gly Lys 665 670 675 Lys Ser Arg Pro Ala Met Tyr Asp Val Ser Pro Ile Ala Tyr Glu Asp 680 685 690 Tyr Ser Pro Asp Asp Lys Pro Leu Val Thr Leu Ile Lys Thr Lys Asp 695 700 705 710 Leu

【０１０６】配列番号：３配列の長さ：３２３０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ起源生物名：ヒト組織の種類：ｆｅｔａｌｂｒａｉｎ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：８４．．２２９４特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：ｓｉｇｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：８４．．１６１特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１６２．．２２９４特徴を決定した方法：Ｓ配列 GCT CTCGCAGCTC TCGTCGCCAC 23 TGCCACCGCC GCCGCCGTCA CTGCGTCCTG GCTCCGGCTC CCGCGCCCTC CCGGCCGGCC 83 ATG CAG CCC CGC CGC GCC CAG GCG CCC GGT GCG CAG CTG CTG CCC GCG 131 Met Gln Pro Arg Arg Ala Gln Ala Pro Gly Ala Gln Leu Leu Pro Ala -25 -20 -15 CTG GCC CTG CTG CTG CTG CTG CTC GGA GCG GGG CCC CGA GGC AGC TCC 179 Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Gly Pro Arg Gly Ser Ser -10 -5 1 5 CTG GCC AAC CCG GTG CCC GCC GCG CCC CTG TCT GCG CCC GGG CCG TGC 227 Leu Ala Asn Pro Val Pro Ala Ala Pro Leu Ser Ala Pro Gly Pro Cys 10 15 20 GCC GCG CAG CCC TGC CGG AAT GGG GGT GTG TGC ACC TCG CGC CCT GAG 275 Ala Ala Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Val Cys Thr Ser Arg Pro Glu 25 30 35 CCG GAC CCG CAG CAC CCG GCC CCC GCC GGC GAG CCT GGC TAC AGC TGC 323 Pro Asp Pro Gln His Pro Ala Pro Ala Gly Glu Pro Gly Tyr Ser Cys 40 45 50 ACC TGC CCC GCC GGG ATC TCC GGC GCC AAC TGC CAG CTT GTT GCA GAT 371 Thr Cys Pro Ala Gly Ile Ser Gly Ala Asn Cys Gln Leu Val Ala Asp 55 60 65 70 CCT TGT GCC AGC AAC CCT TGT CAC CAT GGC AAC TGC AGC AGC AGC AGC 419 Pro Cys Ala Ser Asn Pro Cys His His Gly Asn Cys Ser Ser Ser Ser 75 80 85 AGC AGC AGC AGC GAT GGC TAC CTC TGC ATT TGC AAT GAA GGC TAT GAA 467 Ser Ser Ser Ser Asp Gly Tyr Leu Cys Ile Cys Asn Glu Gly Tyr Glu 90 95 100 GGT CCC AAC TGT GAA CAG GCA CTT CCC AGT CTC CCA GCC ACT GGC TGG 515 Gly Pro Asn Cys Glu Gln Ala Leu Pro Ser Leu Pro Ala Thr Gly Trp 105 110 115 ACC GAA TCC ATG GCA CCC CGA CAG CTT CAG CCT GTT CCT GCT ACT CAG 563 Thr Glu Ser Met Ala Pro Arg Gln Leu Gln Pro Val Pro Ala Thr Gln 120 125 130 GAG CCT GAC AAA ATC CTG CCT CGC TCT CAG GCA ACG GTG ACA CTG CCT 611 Glu Pro Asp Lys Ile Leu Pro Arg Ser Gln Ala Thr Val Thr Leu Pro 135 140 145 150 ACC TGG CAG CCG AAA ACA GGG CAG AAA GTT GTA GAA ATG AAA TGG GAT 659 Thr Trp Gln Pro Lys Thr Gly Gln Lys Val Val Glu Met Lys Trp Asp 155 160 165 CAA GTG GAG GTG ATC CCA GAT ATT GCC TGT GGG AAT GCC AGT TCT AAC 707 Gln Val Glu Val Ile Pro Asp Ile Ala Cys Gly Asn Ala Ser Ser Asn 170 175 180 AGC TCT GCG GGT GGC CGC CTG GTA TCC TTT GAA GTG CCA CAG AAC ACC 755 Ser Ser Ala Gly Gly Arg Leu Val Ser Phe Glu Val Pro Gln Asn Thr 185 190 195 TCA GTC AAg ATT CGG CAA GAT GCC ACT GCC TCA CTG ATT TTG CTC TGG 803 Ser Val Lys Ile Arg Gln Asp Ala Thr Ala Ser Leu Ile Leu Leu Trp 200 205 210 AAG GTC ACG GCC ACA GGA TTC CAA CAG TGC TCC CTC ATA GAT GGA CGA 851 Lys Val Thr Ala Thr Gly Phe Gln Gln Cys Ser Leu Ile Asp Gly Arg 215 220 225 230 AGT GTG ACC CCC CTT CAG GCT TCA GGG GGA CTG GTC CTC CTG GAG GAG 899 Ser Val Thr Pro Leu Gln Ala Ser Gly Gly Leu Val Leu Leu Glu Glu 235 240 245 ATG CTC GCC TTG GGG AAT AAT CAC TTT ATT GGT TTT GTG AAT GAT TCT 947 Met Leu Ala Leu Gly Asn Asn His Phe Ile Gly Phe Val Asn Asp Ser 250 255 260 GTG ACT AAG TCT ATT GTG GCT TTG CGC TTA ACT CTG GTG GTG AAG GTC 995 Val Thr Lys Ser Ile Val Ala Leu Arg Leu Thr Leu Val Val Lys Val 265 270 275 AGC ACC TGT GTG CCG GGG GAG AGT CAC GCA AAT GAC TTG GAG TGT TCA 1043 Ser Thr Cys Val Pro Gly Glu Ser His Ala Asn Asp Leu Glu Cys Ser 270 285 290 GGA AAA GGA AAA TGC ACC ACG AAG CCG TCA GAG GCA ACT TTT TCC TGT 1091 Gly Lys Gly Lys Cys Thr Thr Lys Pro Ser Glu Ala Thr Phe Ser Cys 295 300 305 310 ACC TGT GAG GAG CAG TAC GTG GGT ACT TTC TGT GAA GAA TAC GAT GCT 1139 Thr Cys Glu Glu Gln Tyr Val Gly Thr Phe Cys Glu Glu Tyr Asp Ala 315 320 325 TGC CAG AGG AAA CCT TGC CAA AAC AAC GCG AGC TGT ATT GAT GCA AAT 1187 Cys Gln Arg Lys Pro Cys Gln Asn Asn Ala Ser Cys Ile Asp Ala Asn 330 335 340 GAA AAG CAA GAT GGG AGC AAT TTC ACC TGT GTT TGC CTT CCT GGT TAT 1235 Glu Lys Gln Asp Gly Ser Asn Phe Thr Cys Val Cys Leu Pro Gly Tyr 345 350 355 ACT GGA gAG CTT TGC CAG TCC AAG ATT GAT TAC TGC ATC CTA GAC CCA 1283 Thr Gly Glu Leu Cys Gln Ser Lys Ile Asp Tyr Cys Ile Leu Asp Pro 360 365 370 TGC AGA AAT GGA GCA ACA TGC ATT TCC AGT CTC AGT GGA TTC ACC TGC 1331 Cys Arg Asn Gly Ala Thr Cys Ile Ser Ser Leu Ser Gly Phe Thr Cys 375 380 385 390 CAG TGT CCA GAA GGA TAC TTC GGA TCT GCT TGT GAA GAA AAG GTG GAC 1379 Gln Cys Pro Glu Gly Tyr Phe Gly Ser Ala Cys Glu Glu Lys Val Asp 395 400 405 CCC TGC GCC TCG TCT CCG TGC CAG AAC AAC GGC ACC TGC TAT GTG GAC 1427 Pro Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Asn Gly Thr Cys Tyr Val Asp 410 415 420 GGG GTA CAC TTT ACC TGC AAC TGC AGC CCG GGC TTC ACA GGG CCG ACC 1475 Gly Val His Phe Thr Cys Asn Cys Ser Pro Gly Phe Thr Gly Pro Thr 425 430 435 TGT GCC CAG CTT ATT GAC TTC TGT GCC CTC AGC CCC TGT GCT CAT GGC 1523 Cys Ala Gln Leu Ile Asp Phe Cys Ala Leu Ser Pro Cys Ala His Gly 440 445 450 ACG TGC CGC AGC GTG GGC ACC AGC TAC AAA TGC CTC TGT GAT CCA GGT 1571 Thr Cys Arg Ser Val Gly Thr Ser Tyr Lys Cys Leu Cys Asp Pro Gly 455 460 465 470 TAC CAT GGC CTC TAC TGT GAG GAG GAA TAT AAT GAG TGC CTC TCC GCT 1619 Tyr His Gly Leu Tyr Cys Glu Glu Glu Tyr Asn Glu Cys Leu Ser Ala 475 480 485 CCA TGC CTG AAT GCA GCC ACC TGC AGG GAC CTC GTT AAT GGC TAT GAG 1667 Pro Cys Leu Asn Ala Ala Thr Cys Arg Asp Leu Val Asn Gly Tyr Glu 490 495 500 TGT GTG TGC CTG GCA GAA TAC AAA GGA ACA CAC TGT GAA TTG TAC AAG 1715 Cys Val Cys Leu Ala Glu Tyr Lys Gly Thr His Cys Glu Leu Tyr Lys 505 510 515 GAT CCC TGC GCT AAC GTC AGC TGT CTG AAC GGA GCC ACC TGT GAC AGC 1763 Asp Pro Cys Ala Asn Val Ser Cys Leu Asn Gly Ala Thr Cys Asp Ser 520 525 530 GAC GGC CTG AAT GGC ACG TGC ATC TGT GCA CCC GGG TTT ACA GGT GAA 1811 Asp Gly Leu Asn Gly Thr Cys Ile Cys Ala Pro Gly Phe Thr Gly Glu 535 540 545 550 GAG TGC GAC ATT GAC ATA AAT GAA TGT GAC AGT AAC CCC TGC CAC CAT 1859 Glu Cys Asp Ile Asp Ile Asn Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys His His 555 560 565 GGT GGG AGC TGC CTG GAC CAG CCC AAT GGT TAT AAC TGC CAC TGc CCG 1907 Gly Gly Ser Cys Leu Asp Gln Pro Asn Gly Tyr Asn Cys His Cys Pro 570 575 580 CAT GGT TGG GTG GGA GCA AAC TGT GAG ATC CAC CTC CAA TGG AAG TCC 1955 His Gly Trp Val Gly Ala Asn Cys Glu Ile His Leu Gln Trp Lys Ser 585 590 595 GGG CAC ATG GCG GAG AGC CTC ACC AAC ATG CCA CGG CAC TCC CTC TAC 2003 Gly His Met Ala Glu Ser Leu Thr Asn Met Pro Arg His Ser Leu Tyr 600 605 610 ATC ATC ATT GGA GCC CTC TGC GTG GCC TTC ATC CTT ATG CTG ATC ATC 2051 Ile Ile Ile Gly Ala Leu Cys Val Ala Phe Ile Leu Met Leu Ile Ile 615 620 625 630 CTG ATC GTG GGG ATT TGC CGC ATC AGC CGC ATT GAA TAC CAG GGT TCT 2099 Leu Ile Val Gly Ile Cys Arg Ile Ser Arg Ile Glu Tyr Gln Gly Ser 635 640 645 TCC AGG CCA GCC TAT GAG GAG TTC TAC AAC TGC CGC AGC ATC GAC AGC 2147 Ser Arg Pro Ala Tyr Glu Glu Phe Tyr Asn Cys Arg Ser Ile Asp Ser 650 655 660 GAG TTC AGC AAT GCC ATT GCA TCC ATC CGG CAT GCC AGG TTT GGA AAG 2195 Glu Phe Ser Asn Ala Ile Ala Ser Ile Arg His Ala Arg Phe Gly Lys 665 670 675 AAA TCC CGG CCT GCA ATG TAT GAT GTG AGC CCC ATC GCC TAT GAA GAT 2243 Lys Ser Arg Pro Ala Met Tyr Asp Val Ser Pro Ile Ala Tyr Glu Asp 680 685 690 TAC AGT CCT GAT GAC AAA CCC TTG GTC ACA CTG ATT AAA ACT AAA GAT 2291 Tyr Ser Pro Asp Asp Lys Pro Leu Val Thr Leu Ile Lys Thr Lys Asp 695 700 705 710 TTG TAATCTTTTT TTGGATTATT TTTCAAAAAG ATGAGATACT ACACTCATTT 2344 Leu AAATATTTTT AAGAAAATAA AAAGCTTAAG AAATTTAAAA TGCTAGCTGC TCAAGAGTTT 2404 TCAGTAGAAT ATTTAAGAAC TAATTTTCTG CAGCTTTTAG TTTGGAAAAA ATATTTTAAA 2464 AACAAAATTT GTGAAACCTA TAGACGATGT TTTAATGTAC CTTCAGCTCT CTAAACTGTG 2524 TGCTTCTACT AGTGTGTGCT CTTTTCACTG TAGACACTAT CACGAGACCC AGATTAATTT 2584 CTGTGGTTGT TACAGAATAA GTCTAATCAA GGAGAAGTTT CTGTTTGACG TTTGAGTGCC 2644 GGCTTTCTGA GTAGAGTTAG GAAAACCACG TAACGTAGCA TATGATGTAT AATAGAGTAT 2704 ACCCGTTACT TAAAAAGAAG TCTGAAATGT TCGTTTTGTG GAAAAGAAAC TAGTTAAATT 2764 TACTATTCCT AACCCGAATG AAATTAGCCT TTGCCTTATT CTGTGCATGG GTAAGTAACT 2824 TATTTCTGCA CTGTTTTGTT GAACTTTGTG GAAACATTCT TTCGAGTTTG TTTTTGTCAT 2884 TTTCGTAACA GTCGTCGAAC TAGGCCTCAA AAACATACGT AACGAAAAGG CCTAGCGAGG 2944 CAAATTCTGA TTGATTTGAA TCTATATTTT TCTTTAAAAA GTCAAGGGTT CTATATTGTG 3004 AGTAAATTAA ATTTACATTT GAGTTGTTTG TTGCTAAGAG GTAGTAAATG TAAGAGAGTA 3064 CTGGTTCCTT CAGTAGTGAG TATTTCTCAT AGTGCAGCTT TATTTATCTC CAGGATGTTT 3124 TTGTGGCTGT ATTTGATTGA TATGTGCTTC TTCTGATTCT TGCTAATTTC CAACCATATT 3184 GAATAAATGT GATCAAGTCA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 3230

【０１０７】配列番号：４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド配列 5'-TTACCATGGCCTCTACTGTG-3'

【０１０８】配列番号：５配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド配列 5'-AGATGCACGTGCCATTCAGG-3'

【０１０９】配列番号：６配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド配列 5'-AATCTAGATGCAGCCCCGCCGCGCCCA-3'

【０１１０】配列番号：７配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド配列 5'-CACCGGGTTGGCCAGGGAGCT-3

【０１１１】配列番号：８配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド配列 5'-ATCCATCCGGCATGCCAGGTT-3'

【０１１２】配列番号：９配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド配列 5'-AACTCGAGATTACAAATCTTTAGTTTTAATCAG-3'

【０１１３】配列番号：１０配列の長さ：６０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド配列 5'-AACTCGAGTCATTTATCATCATCATCTTTATAATCCAAATCTTTAGT
TTTAATCAGTGTG-3'

【０１１４】配列番号：１１配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド配列 5'-TGTACAAGGATCCCTGCGCTAA-3'

【０１１５】配列番号：１２配列の長さ：５５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド配列 5'-AACTCGAGTCATTTATCATCATCATCTTTATAATCGGAGTGCCGTGG
CATGTTGG-3'

【０１１６】配列番号：１３配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド配列 5'-AAAGATCTGAGTGCCGTGGCATGTTGG-3'

【０１１７】配列番号：１４配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド

【０１１８】配列番号：１５配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド配列 5'-TCCCAGTCTCCCAGCCACTG-3'

【０１１９】配列番号：１６配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸；オリゴヌクレオチド配列 5'-TCACCACCAGAGTTAAGCGC-3

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 39/395 ＮＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 21/08 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ // Ａ６１Ｋ 38/00 9282−4ＢＺＮＡＡ 39/395 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
むポリペプチド。
【請求項２】配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
む、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチド。
【請求項３】配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】配列番号２で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチドをコードするＤＮＡと、宿主細胞中
で発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤ
ＮＡ体。
【請求項６】配列番号２で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチドをコードするＤＮＡと、宿主細胞中
で発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤ
ＮＡ体。
【請求項７】請求項５に記載した組換えＤＮＡ体によ
り形質転換された細胞。
【請求項８】請求項６に記載した組換えＤＮＡ体によ
り形質転換された細胞。
【請求項９】請求項１または２に記載のポリペプチド
を産生し得る細胞を培地にて培養し、産生されたポリペ
プチドを採取することを特徴とするポリペプチドの製造
方法。
【請求項１０】細胞が請求項５に記載した組換えＤＮ
Ａ体により形質転換された細胞である請求項９に記載の
製造方法。
【請求項１１】細胞が請求項６に記載した組換えＤＮ
Ａ体により形質転換された細胞である請求項９に記載の
製造方法。
【請求項１２】配列番号２に記載のポリペプチドと特
異的に結合することを特徴とする抗体。