JPH1036397A - イヌインターロイキン１２およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 イヌインターロイキン１２およびその遺伝子
工学による製造方法。 【解決手段】 配列番号：１または配列番号：１１に示
すアミノ酸配列もしくはその一部であるアミノ酸配列を
有する蛋白質と配列番号：２または配列番号：１２に示
すアミノ酸配列もしくはその一部であるアミノ酸配列を
有する蛋白質から成るイヌインターロイキン１２および
その製造法、並びにそれをコードする遺伝子、すなわ
ち、配列番号：１または配列番号：１１に示すアミノ酸
配列もしくはその一部であるアミノ酸配列をコードする
遺伝子および配列番号：２または配列番号：１２に示す
アミノ酸配列もしくはその一部であるアミノ酸配列をコ
ードする遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質の一次構造
がイヌの遺伝情報由来であるイヌインターロイキン１２
（以下、ＣａＩＬ１２と略す）を遺伝子操作技術により
量産し、以って動物用医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス・ワ
クチンアジュバント）とする事を目的とした、プラスミ
ド、形質転換体、ＣａＩＬ１２およびその製造法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン１２は、分子量約４０
ｋＤ蛋白質（以下Ｐ４０と略記する）と約３５ｋＤ蛋白
質（以下Ｐ３５と略記する）とのヘテロダイマーよりな
り、ナチュラルキラー細胞および１型ヘルパーＴ細胞を
活性化するなどの生理活性作用を有するサイトカイン
で、ＩＬ１２と略記され、例えば文献１のようにこれま
でいくつかの文献が出版されている。 遺伝子操作技術
によりヒトのＩＬ１２以外にもマウス（文献２）、ウシ
（ＧｅｎＢａｎｋ データベース 登録番号Ｕ１１８１
５およびＵ１４４１６）のＩＬ１２のｃＤＮＡもクロー
ニングされ、腫瘍やウイルス病などの治療薬として用途
開発研究が行われている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかるに、イヌのＩＬ
１２がクローニングされたという報告は未だない。

【０００４】イヌには、乳腺腫瘍など多数の腫瘍、パル
ボウイルス感染症、ジステンバー感染症など多数のウイ
ルス病、アレルギー性の皮膚炎などが知られている。

【０００５】そこで、イヌのＩＬ１２が容易に入手可能
となれば、イヌの抗腫瘍剤、抗アレルギー剤、抗ウイル
ス剤としての用途が開かれると期待される。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、かかる状況
に鑑みＣａＩＬ１２ｃＤＮＡのクローニングおよびそれ
を用いた大量生産を目的とし、創意工夫を成し、イヌの
ｃＤＮＡからＣａＩＬ１２のＰ４０とＰ３５をコードす
るそれぞれの遺伝子をクローニングすることに成功し、
更にはこれらを発現ベクターに連結した２つのプラスミ
ドを用いてＣａＩＬ１２を生産する細胞の作製に成功
し、以って簡単に大量にＣａＩＬ１２を製造する方法を
確立し、かくして本発明を完成させるに至った。

【０００７】すなわち本発明は、ＣａＩＬ１２を生産さ
せるプラスミド、これらのプラスミドを有する大腸菌の
形質転換体、およびこのプラスミドにより形質転換され
た動物細胞、並びにこれらの形質転換体から得られるＣ
ａＩＬ１２を提供するものである。さらに本発明はＣａ
ＩＬ１２蛋白質の２つのサブユニットをそれぞれコード
する遺伝子も提供する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明のＣａＩＬ１２蛋白質の２
つのサブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを組込ん
だプラスミドは例えば次のようにして製造することがで
きる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽
出した後、ｃＤＮＡを合成し、ウシやヒトのＩＬ１２の
２つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子配列を
元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以
下ＰＣＲと略す）を行うことによってＣａＩＬ１２活性
を示す２つのサブユニットをそれぞれコードする２つの
遺伝子をクローニングすることができる。また、合成し
たｃＤＮＡ組換え体よりファージライブラリーを作製
し、ＰＣＲによって得られた２つの遺伝子断片とプラー
クハイブリダイゼーションを行うことにより、ＣａＩＬ
１２Ｐ４０ｃＤＮＡとＣａＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全
長をクローニングすることができる。

【０００９】イヌの臟器や細胞、例えばマイトージェン
などで刺激されたイヌ単核球やリンパ球などよりＲＮＡ
を得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソーム
の分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法
などがあげられる。上記イヌ臟器やイヌ細胞よりＲＮＡ
を抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート
処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシ
アネート−塩化セシウム法（文献３）バナジウム複合体
を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活
性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（文献
４），グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノー
ル法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸
法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロ
ホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち
塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの
中から適当な方法を選んで行うことができる。

【００１０】イヌ臟器やマイトージェンなどで刺激され
たイヌ単核球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化
リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート
法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを
単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、Ｇ
ｕｂｌｅｒらの方法（文献５），Ｈ．Ｏｋａｙａｍａら
の方法（文献６）等によりｃＤＮＡを合成する。得られ
たｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的にはト
リ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用
いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼな
どを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成ある
いはクローニング用キットを用いるのが便利である。

【００１１】このｃＤＮＡを鋳型としてヒト、マウスお
よびウシの塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣ
Ｒを行うことによってＣａＩＬ１２活性を示すＰ４０サ
ブユニットおよびＰ３５サブユニットをコードする遺伝
子をクローニングすることができる。また、合成したｃ
ＤＮＡをλファージベクターに連結した後、インビトロ
でλファージのコート蛋白質などと混合することにより
パッケージングし、その生成されたファージ粒子を宿主
となる大腸菌に感染させる。この際、λファージの感染
した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークと
して回収される。このプラークをニトロセルロースなど
のフィルターに移し、放射標識したＰＣＲで得た遺伝子
をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、Ｃａ
ＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡおよびＣａＩＬ１２Ｐ３５ｃＤ
ＮＡの全長をクローニングすることができる。

【００１２】宿主としては原核生物又は真核生物を用い
ることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），バチルス属
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバチルス・ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いる
ことができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロ
ミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えば
サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核性微生物、昆
虫細胞、例えば、ヨガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ），キャベツルーパー細胞（Ｔｒｉ
ｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ），カイコ細胞（Ｂｏｍｂｙｘ
ｍｏｒｉ），動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、
マウス細胞等を使用することができる。本発明において
はさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイ
コ、キャベツルーパー等を用いることもできる。

【００１３】発現ベクターとしては、プラスミド、ファ
ージ、ファージミド、ウイルス（バキュロ（昆虫）、ワ
クチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター
中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例え
ば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔ
ｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターと
しては、例えばａｄｈ１プロモーター、ｐｑｋプロモー
ター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとして
はバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ｐ１０
プロモーター等、動物細胞としてはＳｉｍｉａｎ Ｖｉ
ｒｕｓ４０のｅａｒｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等
があげられるが、これらに限定されない。 発現ベクタ
ーによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られ
ている常法により行うことができ、これらの方法は例え
ば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ＆ Ｓｏｎｓ社、に記載されている。形質転換体の培
養も常法に従って行うことができる。

【００１４】産生されたＣａＩＬ１２は，非還元下、ド
デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子
量が約７０〜８０ｋＤである。

【００１５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、７０〜８０ｋＤの
バンドが、還元条件下では分子量約４０ｋＤと約３５ｋ
Ｄの２つのサブユニットを生じる。ＣａＩＬ１２は、以
下の実施例２で示すように、イヌ白血球からのイヌイン
ターフェロンγ誘導能およびフィトヘムアグルチニンン
（以下ＰＨＡと略記する）で刺激されたイヌリンパ球の
増殖促進効果により主に特性化される。その他、ＮＫ細
胞や細胞障害性Ｔ細胞を活性化してそれらの標的細胞、
例えば腫瘍由来のセルラインまたはウイルス感染した線
維芽細胞を融解する活性を有する。

【００１６】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。

【００１７】実施例１ ＣａＩＬ１２Ｐ４０、Ｐ３５遺伝子のクローニング （１）イヌｃＤＮＡの調製 イヌ肝臓、ＬＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激し
たイヌ末梢血単核球およびニワトリニューカッスル病ウ
イルスで７時間処理した（１０⁷ ｐｆｕ／ｍｌ）イヌ脾
臓由来リンパ球よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）
を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）（以下ＴＥと略記する。）に溶解し、７０℃で
５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加
えた。０．５Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリ
ゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同
緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含む
ＴＥにて洗浄後、０．０１％ＳＤＳを含む２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出
した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本
鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌ
のミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと
０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅ
ｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加
えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートし
たのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ トリス
塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μ
ｌ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴ
Ｐを１μｌおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加
え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユ
ニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ
ＩＩ ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間イ
ンキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７
０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上
に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ
ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で
２０分間インキュベートした。

【００１８】（２）イヌｃＤＮＡファージライブラリー
の調製 上記（１）で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ１μｇづつを用
い、ファルマシア社のタイムセーバーｃＤＮＡ合成キッ
トにて添付のマニュアルに従い、オリゴｄＴプライマー
を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらにＥｃｏＲＩ／
ＮｏｔＩアダプターを連結した。これを用いて、アマシ
ャム社のｃＤＮＡラピットクローニングモジュール−λ
ｇｔ１０にて添付のマニュアルに従い、組換えλｇｔ１
０ベクターを作製し、さらにアマシャム社のインビトロ
パッケージングモジュールにて添付のマニュアルに従
い、組換え体ファージ作製した。 （３）ＣａＩＬ１２Ｐ４０遺伝子のクローニング ヒトＩＬ１２Ｐ４０のＮ末端およびＣ末端の塩基配列
（文献１）をもとに、 ５´ＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴ
ＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴ３´（配列番号３） と ５´ＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣ
Ａ３´（配列番号４） の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成
した。上記（１）のイヌ肝臓およびＬＰＳ刺激イヌ末梢
血より得られたｃＤＮＡを別々の０．５ｍｌのミクロ遠
心チューブに２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍ
ｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．
５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／
ｍｌ ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１
００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プ
ライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマ
ーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラー
を用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロー
スゲルにて電気泳動し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を常
法（文献７）に従って調製した。

【００１９】このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これ
を用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質
転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次
にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを
前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、Ｇｅｎｅｓｉ
ｓ２０００ ＤＮＡａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ
（デュポン社）を用いて、ダイデオキシ法（文献９）で
ＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニット
のうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡの塩基配列を決
定した。この配列を配列番号１に示す。また、この配列
を含む、９９０ｂｐのＤＮＡ断片に宝酒造（株）のＲａ
ｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ
Ｋｉｔを用いて³²Ｐを標識し、プローブを作製した。上
記（２）で得られたイヌ肝臓ｃＤＮＡから作製した組換
え体ファージライブラリーを大腸菌ＮＭ５１４上でプラ
ークとして形成させ、アマシャム社のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ
＋に常法に従って転写した。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、５
×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＮａＨ₂
ＰＯ₄ ，５ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．４），５×デンハル
ト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロ
リドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ＳＤ
Ｓ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で２時
間インキュベートし、ついで同じ溶液中で上述のように
して作製した標識プローブ１×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌとハ
イブリダイズさせた。６５℃で１晩インキュベートした
後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を０．２×ＳＳＣ（３０ｍＭ
ＮａＣｌ，３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤ
Ｓ中１５分、３回洗浄し、富士写真フィルム（株）の富
士イメージングプレートに１２時間露出し、富士写真フ
ィルム（株）のバイオイメージングアナライザーにて解
析した。陽性のシグナルを有するプラークは常法に従
い、再スクリーニングを行った。３回のスクリーニング
の結果、陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージ
を得た。この組換え体ファージより常法に従ってファー
ジＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、
１％アガロースゲル電気泳動にて得られたＤＮＡ断片を
常法に従い調製し、宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて、宝酒造（株）の
ｐＵＣ１１８ＢＡＰ処理ＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ）
と連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを常法によ
り調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー
社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プ
ロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミ
ネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得ら
れたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、Ｃａ
ＩＬ１２Ｐ４０をコードする配列を配列番号１１に示
す。

【００２０】（４）ＣａＩＬ１２Ｐ３５遺伝子のクロー
ニング ヒトＩＬ１２Ｐ３５のＮ末端（文献１）およびウシＩＬ
１２Ｐ３５のＣ末端の塩基配列をもとに、 ５´ＡＧＣＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴ
ＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＧＣＴＡＣＣＣＴＧ３´（配列番
号５） と ５´ＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡ
ＴＣＡＴＴＣＴＧＴＣＧＡＴＧＧＴ３´（配列番号６） の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成
した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理
したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型
として上記（３）と同様にして約６７０ｂｐのＤＮＡ断
片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ＣａＩＬ１２活性
を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３
５サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列
を配列番号２に示す。また、この配列を含む約６７０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を用いて標識プローブを作製した。上記
（２）で得られた鶏ニューカッスル病ウイルスで処理し
たイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡから作製
した組換え体ファージライブラリーを上記（３）と同様
にして標識プローブとハイブリダイズさせ、スクリーニ
ングを行った。その結果得られた陽性シグナルを有する
１個の組換え体ファージよりＤＮＡを抽出し、制限酵素
ＮｏｔＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動に
て得られた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をＳＴＲＡＴＡＧ
ＥＮＥ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＮｏｔＩサイ
トに常法に従い連結した。これを用いてプラスミドＤＮ
Ａを調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用いて、得られ
たＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、ＣａＩ
Ｌ１２Ｐ３５をコードする配列を配列番号１２に示す。

【００２１】実施例２ ＣａＩＬ１２の生産 （１）ＣａＩＬ１２発現ベクターの調製 発現ベクターｐＣＤＬ−ＳＲα２９６（文献９）を制限
酵素ＥｃｏＲＩで切断し、バクテリア由来アルカリホス
ファターゼで末端を脱リン酸化した。これを１％アガロ
ースゲル電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を常法
に従い調製した。一方、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ ＤＮＡ断
片は ５´ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡ
ＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧ３´（配列番号７） と ５´ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡ
ＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴ３´（配列番号８） の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを
作製し、実施例１（２）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに
挿入したＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブ
ユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡを鋳型
として、ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマー
のアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長
条件を７２℃，３分、サイクル数３０でＰＣＲを行い、
エタノール沈殿後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、１％
アガロースゲル電気泳動にて約９９０ｂｐのＤＮＡ断片
を調製した。また、 ５´ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡ
ＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧ３´（配列番号１
３） と ５´ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡ
ＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴ３´（配列番号１
４） の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを
作製し、実施例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入
したＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを
行い、ＥｃｏＲＩで切断し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片
を調製した。得られたそれぞれのＣａＩＬ１２Ｐ４０Ｄ
ＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のようにし
て調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結した。これを
用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプ
ラスミドＤＮＡを調製し、ＣａＩＬ１２Ｐ４０を発現す
るＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４
０ＦＬを得た。また、ｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を制限酵
素ＰｓｔＩで切断し脱リン酸化後、電気泳動にて約３．
６ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。ＣａＩＬ１２Ｐ３５Ｄ
ＮＡ断片は ５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧ
ＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣ３´（配列番号９） と ５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡ
ＧＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴ３´（配列番号１
０） の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加したプライマーを作
製し、実施例１（３）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに挿
入したＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユ
ニットのうち一方のＰ３５サブユニットＤＮＡを鋳型と
して、９４℃，１分、５５℃，２分、７２℃，３分、３
０サイクルでＰＣＲを行い、エタノール沈殿後、制限酵
素ＰｓｔＩで切断した。これを１％アガロースゲル電気
泳動にて約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、 ５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧ
ＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＧ３´（配列番号１
５） と ５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡ
ＧＡＴＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴ３´（配列番号１
６） の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加したプライマーを作
製し、実施例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入し
たＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行
い、ＰｓｔＩで切断し、約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調
製した。得られたそれぞれのＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡ
断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のように、Ｐｓ
ｔＩで切断し調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結、
大腸菌形質転換、プラスミドＤＮＡ調製を行い、ＣａＩ
Ｌ１２Ｐ３５を発現するＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５および
ＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５ＦＬを得た。

【００２２】さらに、作製したこれら４つの発現プラス
ミド中のＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡおよびＣａＩＬ１２
Ｐ３５ＤＮＡの塩基配列を確認した。

【００２３】（２）サルＣＯＳ細胞でのＣａＩＬ１２の
生産 上記（１）で得られたそれぞれ５μｇのＦＯＣａＩＬ１
２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５を５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤＥ
ＡＥデキストラン（ファルマシア製）および１００μＭ
のクロロキン（シグマ社）を含む４ｍｌのＥＲＤＦ培地
（極東製薬（株）製）に加えておく。一方、直径１０ｃ
ｍのディッシュを用いて１０％ウシ胎児血清（ギブコ
社、以下ＦＢＳと略記する）を含むＥＲＤＦ培地で５０
％コンフルエントになるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄し
た後、上記で得た４ｍｌのＤＮＡ混合液を加え、５％Ｃ
Ｏ₂ 、３７℃の条件で培養した。４時間後、細胞をＰＢ
Ｓで洗浄した後、１０ｍｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培
地にて５％ＣＯ₂ ，３７℃の条件で４日間培養し、Ｃａ
ＩＬ１２が生産された培養上清を得た。

【００２４】（３）ＣａＩＬ１２の活性測定 上記（２）で生産されたＣａＩＬ１２の活性測定は以下
のようにして行った。イヌリンパ球からのイヌインタ−
フェロンγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性およ
びイヌ細胞のクラスＩＩＭＨＣ発現増強活性を測定し
た。

【００２５】イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％Ｆ
ＢＳ−ＥＲＤＦで１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に
懸濁し、このうち２．５ｍｌを６ｃｍディッシュに添加
した。これに上記（２）で得られた培養上清２．５ｍｌ
を加え、５％ＣＯ₂ 、３７℃の条件で２日間培養し、ウ
イルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉ
ｓ Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−３４）を用い、文献１０のＣＰＥ法に従って
この培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、１
０⁵ 希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が確認され
た。一方、１０μｇのｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を上記
（２）と同様にＣＯＳ−１細胞に導入したコントロール
の細胞培養液では抗ウイルス活性の誘導能は認められな
かった。

【００２６】また、クラスＩＩＭＨＣを発現したイヌ乳
腺腫瘍組織由来細胞株ＦＣＢＲ１を用いて，上記のイヌ
脾臓リンパ球培養上清のクラスＩＩＭＨＣ発現増強活性
を測定した。６ｃｍディッシュに１０⁵ ｃｅｌｌｓのＦ
ＣＢＲ１を接着させ、これにＣａＩＬ１２で刺激したイ
ヌ脾臓リンパ球培養上清５ｍｌを添加し、５％ＣＯ₂、
３７℃の条件で１晩培養した。培養後、トリプシンにて
細胞を剥離し、１．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブにて遠
心した。これに１０μｌのラット抗イヌＭＨＣクラスＩ
Ｉモノクロ−ナル抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を
添加し、さらに５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸
濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５
μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラットモノクロ−ナル抗
体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）および５０μｌの１０
％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。
ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦ
ＡＣＳｃａｎにて解析した。その結果、ＣａＩＬ１２で
刺激したイヌ脾臓リンパ球の培養上清はＦＣＢＲ１上
の、クラスＩＩＭＨＣの発現量を約２０％上昇させた。
これらのことから、ＣａＩＬ１２はイヌリンパ球に作用
して、イヌインタ−フェロンγを誘導する活性を有する
ことが判明した。

【００２７】また、芽球化したイヌリンパ球の増殖促進
活性を測定した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１
０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞
密度に懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添
加した。これにＰＨＡ（ＩＣＮ社製）を５μｇ／ｍｌの
濃度で添加し、５％ＣＯ₂、３７℃の条件で３日間培養
してリンパ球を芽球化させた。この芽球化リンパ球を１
０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞
密度に懸濁し、９６穴マイクロプレート１穴あたり、５
０μｌを添加した。これに上記（２）で得られた培養上
清を１穴あたり５０μｌ加えた。また、コントロールと
して１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦを１穴あたり５０μｌ加え
た。これらをさらに５％ＣＯ₂、３７℃の条件で３日間
培養した後、文献１１のＭＴＴアッセイ法により、Ｃａ
ＩＬ１２の芽球化リンパ球増殖促進活性を測定した。す
なわち、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（シグマ社製）溶液を１
穴あたり１０μｌづつ添加し、さらに６時間培養した。
１５０μｌの０．０４Ｎ塩酸イソプロパノ−ル溶液を加
えた後、超音波にて細胞を破砕し、マイクロプレ−トリ
−ダ−（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製Ｍｏｄｅｌ３５５０）にて
波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、コント
ロールの吸光度が平均０．６９であったのに対し、Ｃａ
ＩＬ１２は平均１．５２であり、約２倍の芽球化リンパ
球増殖促進活性が認められた。

【００２８】さらに、ＣａＩＬ１２のイヌ腫瘍に対する
抗腫瘍作用を検討した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離
し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／
ｍｌの細胞密度に懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディ
ッシュに添加した。これにベ−リンガ−マンハイム
（株）のリコンビナントヒトＩＬ２を５００Ｕ添加し、
５％ＣＯ₂、３７℃の条件で３日間培養した。一方、イ
ヌ腫瘍細胞株ＦＣＢＲ１およびＡ７２（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ−１５４２）を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでそれぞれ１
０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、９６穴プレ
−ト１穴あたり５０μｌづつ添加し、プレ−トに接着さ
せた。これにヒトＩＬ２で刺激したイヌリンパ球５０μ
ｌを加え、さらにＣａＩＬ１２を発現している上記
（２）で得られた培養上清１００μｌもしくはコントロ
−ルとして１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ１００μｌを添加
し、５％ＣＯ₂、３７℃の条件で２日間培養した。培養
後、上清を完全に取り除き、ＭＴＴアッセイを行った。
％細胞障害性を次の式にて算出した。

【００２９】 ％細胞障害性＝（１−ＯＤ₂ ／ＯＤ₁ ）×１００ ここで、ＯＤ₁＝培地のみで培養したイヌ腫瘍細胞の波
長５９５ｎｍの吸光度 ＯＤ₂ ＝イヌリンパ球と共に培養したイヌ腫瘍細胞の波
長５９５ｎｍの吸光度を表す。

【００３０】その結果、ＦＣＢＲ１ではコントロ−ルが
３４％であったのに対し、ＣａＩＬ１２は７５％の細胞
障害性を示した。また、Ａ７２ではコントロ−ルが２２
％であったのに対し、ＣａＩＬ１２は８３％の細胞障害
性を示した。これらのことから、ＣａＩＬ１２はイヌリ
ンパ球を活性化して、イヌ腫瘍細胞に対して抗腫瘍作用
を発揮することが判明した。

【００３１】参考文献 １．Ｗｏｌｆら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６，３０７
４−３０８１（１９９１）． ２．Ｓｃｈｏｅｎｈａｕｔら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
４８，３４３３−３４４０（１９９２）． ３．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１８，５２９４−５３０４（１９７９）． ４．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １
８，５１４３−５１４９（１９７９）． ５．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｎｅ ２５，２３６−２６９
（１９８３）． ６．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
２，１６１−１７０（１９８２） ＆ ３，２８０−２
８９（１９８３）． ７．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ．
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２． ８．Ｐｒｏｂｅｒら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，３３６
−３４１（１９８７）． ９．Ｔａｋｅｂｅら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
８，４６６−４７２（１９８８）． １０．Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｂａｍら：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５
４，５３６−５３９（１９７３）． １１．Ｍｏｓｍａｎｎら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ６５，５５−６３（１９８３）

【００３２】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：990 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..987 特徴を決定した方法：S 配列 ATG TGT CAC CAG CAG TTG GTC ATC TCT TGG TTT TCC CTC GTT TTG CTG 48 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Leu Leu GCG TCT CCC CTC ATG GCC ATA TGG GAA CTG GAG AAA GAT GTT TAT GTT 96 Ala Ser Pro Leu Met Ala Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val GTA GAG TTG GAC TGG CAC CCT GAT GCC CCC GGA GAA ATG GTG GTC CTC 144 Val Glu Leu Asp Trp His Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu ACC TGC CAT ACC CCT GAA GAA GAT GAC ATC ACT TGG ACC TCA GCG CAG 192 Thr Cys His Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln AGC AGT GAA GTC CTA GGT TCT GGT AAA ACT CTG ACC ATC CAA GTC AAA 240 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys GAA TTT GGA GAT GCT GGC CAG TAT ACC TGC CAT AAA GGA GGC AAG GTT 288 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Val CTG AGC CGC TCA CTC CTG TTG ATT CAC AAA AAA GAA GAT GGA ATT TGG 336 Leu Ser Arg Ser Leu Leu Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp TCC ACT GAT ATC TTA AAG GAA CAG AAA GAA TCC AAA AAT AAG ATC TTT 384 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe CTG AAA TGT GAG GCA AAG AAT TAT TCT GGA CGT TTC ACA TGC TGG TGG 432 Leu Lys Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp CTG ACG GCA ATC AGT ACT GAT TTG AAA TTC AGT GTC AAA AGT AGC AGA 480 Leu Thr Ala Ile Ser Thr Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg GGC TTC TCT GAC CCC CAA GGG GTG ACA TGT GGA GCA GTG ACA CTT TCA 528 Gly Phe Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser GCA GAG AGG GTC AGA GTG GAC AAC AGG GAT TAT AAG AAG TAC ACA GTG 576 Ala Glu Arg Val Arg Val Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val GAG TGT CAG GAG GGC AGT GCC TGC CCC TCT GCC GAG GAG AGC CTA CCC 624 Glu Cys Gln Glu Gly Ser Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro ATC GAG GTC GTG GTG GAT GCT ATT CAC AAG CTC AAG TAT GAA AAC TAC 672 Ile Glu Val Val Val Asp Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr ACC AGC AGC TTC TTC ATC AGA GAC ATC ATC AAA CCA GAC CCA CCC ACA 720 Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Thr AAC CTG CAG CTG AAG CCA TTG GAA AAT TCT CGG CAC GTG GAG GTC AGC 768 Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Glu Asn Ser Arg His Val Glu Val Ser TGG GAA TAC CCC GAC ACC TGG AGC ACC CCA CAT TCC TAC TTC TCC CTG 816 Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu ACA TTT TGC ATA CAG GCC CAG GGC AAG AAC AAT AGA GAA AAG AAA GAT 864 Thr Phe Cys Ile Gln Ala Gln Gly Lys Asn Asn Arg Glu Lys Lys Asp AGA CTC TGC GTG GAC AAG ACC TCA GCC AAG GTC GTG TGC CAC AAG GAT 912 Arg Leu Cys Val Asp Lys Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp GCC AAG ATC CGC GTG CAA GCC CGA GAC CGC TAC TAT AGT TCA TCC TGG 960 Ala Lys Ile Arg Val Gln Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp AGC GAC TGG GCA TCT GTG CCC TGC AGT TAG 990 Ser Asp Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser ***

【００３３】配列番号：2 配列の長さ：669 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..666 特徴を決定した方法：S 配列 ATG TGT CCA GCG CGC AGC CTC CTC CTT GTC GCT ACC CTG GTC CTG CTA 48 Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu AGC CAC CTG GAC CAC CTT ACT TGG GCC AGG AGC CTC CCC ACA GCC TCA 96 Ser His Leu Asp His Leu Thr Trp Ala Arg Ser Leu Pro Thr Ala Ser CCA AGC CCA GGA ATA TTC CAG TGC CTC AAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG 144 Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln Cys Leu Asn His Ser Gln Asn Leu Leu AGA GCC GTC AGC AAC ACG CTT CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTA GAA TTA 192 Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Leu TAT TCC TGC ACT TCC GAA GAG ATT GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAG GAT 240 Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp AAA ACC AGC ACA GTG GAG GCC TGC TTA CCA CTG GAA TTA ACC ATG AAT 288 Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn GAG AGT TGC CTG GCT TCC AGA GAG ATC TCT TTG ATA ACT AAC GGG AGT 336 Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg Glu Ile Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser TGC CTG GCC TCT GGA AAG GCC TCT TTT ATG ACG GTC CTG TGC CTT AGC 384 Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala Ser Phe Met Thr Val Leu Cys Leu Ser AGC ATC TAT GAG GAC TTG AAG ATG TAC CAG ATG GAA TTC AAG GCC ATG 432 Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Met Glu Phe Lys Ala Met AAC GCA AAG CTT TTA ATG GAT CCC AAG AGG CAG ATC TTT CTG GAT CAA 480 Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln AAC ATG CTG ACG GCT ATC GAT GAG CTG TTA CAG GCC CTG AAT TTC AAC 528 Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Phe Asn AGT GTG ACT GTG CCA CAG AAA TCC TCC CTT GAA GAG CCG GAT TTT TAT 576 Ser Val Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr AAA ACT AAA ATC AAG CTC TGC ATA CTT CTT CAT GCT TTC AGA ATT CGT 624 Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg GCG GTG ACC ATC GAC AGA ATG ATG AGC TAT CTG AGT TCT TCC TAG 669 Ala Val Thr Ile Asp Arg Met Met Ser Tyr Leu Ser Ser Ser ***

【００３４】配列番号：3 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATGTGTCACC AGCAGTTGGT CATCTCTTGG TTT 33

【００３５】配列番号：4 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CTAACTGCAG GGCACAGATG CCCA 24

【００３６】配列番号：5 配列の長さ：42 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AGCATGTGTC CAGCGCGCAG CCTCCTCCTT GTCGCTACCC TG 42

【００３７】配列番号：6 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CTAGGAAGAA CTCAGATAGC TCATCATTCT GTCGATGGT 39

【００３８】配列番号：7 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGGGAATTCA TGTGTCACCA GCAGTTGGTC ATCTCTTGG 39

【００３９】配列番号：8 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCCGAATTCC TAACTGCAGG GCACAGATGC CCAGTCGCT 39

【００４０】配列番号：9 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGGCTGCAGA TGTGTCCAGC GCGCAGCCTC CTCCTTGTC 39

【００４１】配列番号：10 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGGCTGCAGC TAGGAAGAAC TCAGATAGCT CATCATTCT 39

【００４２】配列番号：11 配列の長さ：990 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..987 特徴を決定した方法：S 配列 ATG CAT CCT CAG CAG TTG GTC ATC TCC TGG TTT TCC CTC GTT TTG CTG 48 Met His Pro Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Leu Leu GCG TCT CCC CTC ATG GCC ATA TGG GAA CTG GAG AAA GAT GTT TAT GTT 96 Ala Ser Pro Leu Met Ala Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val GTA GAG TTG GAC TGG CAC CCT GAT GCC CCC GGA GAA ATG GTG GTC CTC 144 Val Glu Leu Asp Trp His Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu ACC TGC CAT ACC CCT GAA GAA GAT GAC ATC ACT TGG ACC TCA GCG CAG 192 Thr Cys His Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln AGC AGT GAA GTC CTA GGT TCT GGT AAA ACT CTG ACC ATC CAA GTC AAA 240 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys GAA TTT GGA GAT GCT GGC CAG TAT ACC TGC CAT AAA GGA GGC AAG GTT 288 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Val CTG AGC CGC TCA CTC CTG TTG ATT CAC AAA AAA GAA GAT GGA ATT TGG 336 Leu Ser Arg Ser Leu Leu Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp TCC ACT GAT ATC TTA AAG GAA CAG AAA GAA TCC AAA AAT AAG ATC TTT 384 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe CTG AAA TGT GAG GCA AAG AAT TAT TCT GGA CGT TTC ACA TGC TGG TGG 432 Leu Lys Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp CTG ACG GCA ATC AGT ACT GAT TTG AAA TTC AGT GTC AAA AGT AGC AGA 480 Leu Thr Ala Ile Ser Thr Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg GGC TTC TCT GAC CCC CAA GGG GTG ACA TGT GGA GCA GTG ACA CTT TCA 528 Gly Phe Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser GCA GAG AGG GTC AGA GTG GAC AAC AGG GAT TAT AAG AAG TAC ACA GTG 576 Ala Glu Arg Val Arg Val Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val GAG TGT CAG GAG GGC AGT GCC TGC CCC TCT GCC GAG GAG AGC CTA CCC 624 Glu Cys Gln Glu Gly Ser Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro ATC GAG GTC GTG GTG GAT GCT ATT CAC AAG CTC AAG TAT GAA AAC TAC 672 Ile Glu Val Val Val Asp Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr ACC AGC AGC TTC TTC ATC AGA GAC ATC ATC AAA CCA GAC CCA CCC ACA 720 Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Thr AAC CTG CAG CTG AAG CCA TTG AAA AAT TCT CGG CAC GTG GAG GTC AGC 768 Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu Val Ser TGG GAA TAC CCC GAC ACC TGG AGC ACC CCA CAT TCC TAC TTC TCC CTG 816 Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu ACA TTT TGC ATA CAG GCC CAG GGC AAG AAC AAT AGA GAA AAG AAA GAT 864 Thr Phe Cys Ile Gln Ala Gln Gly Lys Asn Asn Arg Glu Lys Lys Asp AGA CTC TGC GTG GAC AAG ACC TCA GCC AAG GTC GTG TGC CAC AAG GAT 912 Arg Leu Cys Val Asp Lys Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp GCC AAG ATC CGC GTG CAA GCC CGA GAC CGC TAC TAT AGT TCA TCC TGG 960 Ala Lys Ile Arg Val Gln Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp AGC GAC TGG GCA TCT GTG TCC TGC AGT TAG 990 Ser Asp Trp Ala Ser Val Ser Cys Ser ***

【００４３】配列番号：12 配列の長さ：669 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..666 特徴を決定した方法：S 配列 ATG TGC CCG CCG CGC GGC CTC CTC CTT GTG ACC ATC CTG GTC CTG CTA 48 Met Cys Pro Pro Arg Gly Leu Leu Leu Val Thr Ile Leu Val Leu Leu AGC CAC CTG GAC CAC CTT ACT TGG GCC AGG AGC CTC CCC ACA GCC TCA 96 Ser His Leu Asp His Leu Thr Trp Ala Arg Ser Leu Pro Thr Ala Ser CCA AGC CCA GGA ATA TTC CAG TGC CTC AAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG 144 Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln Cys Leu Asn His Ser Gln Asn Leu Leu AGA GCC GTC AGC AAC ACG CTT CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTA GAA TTA 192 Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Leu TAT TCC TGC ACT TCC GAA GAG ATT GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAG GAT 240 Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp AAA ACC AGC ACA GTG GAG GCC TGC TTA CCA CTG GAA TTA ACC ATG AAT 288 Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn GAG AGT TGC CTG GCT TCC AGA GAG ATC TCT TTG ATA ACT AAC GGG AGT 336 Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg Glu Ile Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser TGC CTG GCC TCT GGA AAG GCC TCT TTT ATG ACG GTC CTG TGC CTT AGC 384 Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala Ser Phe Met Thr Val Leu Cys Leu Ser AGC ATC TAT GAG GAC TTG AAG ATG TAC CAG ATG GAA TTC AAG GCC ATG 432 Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Met Glu Phe Lys Ala Met AAC GCA AAG CTT TTA ATG GAT CCC AAG AGG CAG ATC TTT CTG GAT CAA 480 Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln AAC ATG CTG ACA GCT ATC GAT GAG CTG TTA CAG GCC CTG AAT TTC AAC 528 Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Phe Asn AGT GTG ACT GTG CCA CAG AAA TCC TCC CTT GAA GAG CCG GAT TTT TAT 576 Ser Val Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr AAA ACT AAA ATC AAG CTC TGC ATA CTT CTT CAT GCT TTC AGA ATT CGT 624 Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg GCG GTG ACC ATC GAT AGA ATG ATG AGT TAT CTG AAT TCT TCC TAA 669 Ala Val Thr Ile Asp Arg Met Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser ***

【００４４】配列番号：13 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGGGAATTCA TGCATCCTCA GCAGTTGGTC ATCTCCTGG 39

【００４５】配列番号：14 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCCGAATTCC TAACTGCAGG ACACAGATGC CCAGTCGCT 39

【００４６】配列番号：15 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGGCTGCAGA TGTGCCCGCC GCGCGGCCTC CTCCTTGTG 39

【００４７】配列番号：16 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGGCTGCAGT TAGGAAGAAT TCAGATAACT CATCATTCT 39

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イヌ白血球に作用して抗ウイルス活性
   因子およびイヌ腫瘍細胞のクラスＩＩＭＨＣの発現を増
   強する因子を誘導する能力、イヌ芽球化リンパ球の増殖
   を促進する能力、およびイヌ白血球を活性化してイヌ腫
   瘍細胞を障害する能力から選ばれる少なくとも１つの能
   力を有し、かつＰ４０サブユニットおよびＰ３５サブユ
   ニットからなるイヌインターロイキン１２。
2. 【請求項２】 Ｐ４０サブユニットが配列番号：１ま
   たは配列番号：１１と同じあるいはその一部であるアミ
   ノ酸配列を有する請求項１に記載のイヌインターロイキ
   ン１２。
3. 【請求項３】 Ｐ３５サブユニットが配列番号：２ま
   たは配列番号：１２と同じあるいはその一部であるアミ
   ノ酸配列を有する請求項１に記載のイヌインターロイキ
   ン１２。
4. 【請求項４】 請求項２に記載の蛋白質をコードする
   ＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 配列番号：１または配列番号：１１に
   示すＤＮＡ配列あるいはその一部を有するＤＮＡ配列で
   ある請求項４に記載のＤＮＡ配列。
6. 【請求項６】 請求項３に記載の蛋白質をコードする
   ＤＮＡ配列。
7. 【請求項７】 配列番号：２または配列番号：１２に
   示すＤＮＡ配列あるいはその一部を有するＤＮＡ配列で
   あるである請求項６に記載のＤＮＡ配列。
8. 【請求項８】 配列番号：１に示すＤＮＡ配列を含む
   組換えベクター。
9. 【請求項９】 配列番号：２に示すＤＮＡ配列を含む
   組換えベクター。
10. 【請求項１０】 配列番号：１１に示すＤＮＡ配列あ
    るいはその一部を有するＤＮＡ配列を含む組換えベクタ
    ー。
11. 【請求項１１】 配列番号：１２に示すＤＮＡ配列あ
    るいはその一部を有するＤＮＡ配列を含む組換えベクタ
    ー。
12. 【請求項１２】 配列番号：１および配列番号：２に
    示すＤＮＡ配列をそれぞれ同時に含む組換えベクター。
13. 【請求項１３】 配列番号：１１に示すＤＮＡ配列あ
    るいはその一部を有するＤＮＡ配列と配列番号：１２に
    示すＤＮＡ配列あるいはその一部を有するＤＮＡ配列を
    同時に含む組換えベクター。
14. 【請求項１４】 請求項８に記載の組換えベクターに
    より宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
15. 【請求項１５】 請求項９に記載の組換えベクターに
    より宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
16. 【請求項１６】 請求項１０に記載の組換えベクター
    により宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
17. 【請求項１７】 請求項１１に記載の組換えベクター
    により宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
18. 【請求項１８】 請求項８に記載の組換えベクターお
    よび請求項９に記載の組換えベクターにより宿主細胞を
    形質転換してなる形質転換体。
19. 【請求項１９】 請求項１０に記載の組換えベクター
    および請求項１１に記載の組換えベクターにより宿主細
    胞を形質転換してなる形質転換体。
20. 【請求項２０】 請求項１２に記載の組換えベクター
    により宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
21. 【請求項２１】 請求項１３に記載の組換えベクター
    により宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
22. 【請求項２２】 請求項１８または請求項２０に記載
    の形質転換体を培養又は飼育し、イヌインターロイキン
    １２を採取することを特徴とする、イヌインターロイキ
    ン１２の製造方法。
23. 【請求項２３】 請求項１９または請求項２１に記載
    の形質転換体を培養又は飼育し、イヌインターロイキン
    １２を採取することを特徴とする、イヌインターロイキ
    ン１２の製造方法。