JPH1042861A - 乳酸非資化性キラー酵母 - Google Patents
乳酸非資化性キラー酵母Info
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- JPH1042861A JPH1042861A JP8205092A JP20509296A JPH1042861A JP H1042861 A JPH1042861 A JP H1042861A JP 8205092 A JP8205092 A JP 8205092A JP 20509296 A JP20509296 A JP 20509296A JP H1042861 A JPH1042861 A JP H1042861A
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- yeast
- pepck
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 サイレージの好気的変敗を防止するために有
用な、乳酸を資化しないキラー酵母を得ること。 【解決手段】 ＰＥＰＣＫ遺伝子を欠損する乳酸非資化
性キラー酵母、破壊されたＰＥＰＣＫ遺伝子を有する、
宿主に乳酸非資化性を与えるプラスミド（このプラスミ
ドは、ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢａｍＨＩ部位にマーカー遺
伝子が挿入されているプラスミドであるか、またはＰＥ
ＰＣＫ遺伝子のＢｇｌＩＩ断片が欠失されて、代わりに
マーカー遺伝子が挿入されているプラスミドである）、
および上記キラー酵母を用いるサイレージの好気的変敗
を防止する方法。
用な、乳酸を資化しないキラー酵母を得ること。 【解決手段】 ＰＥＰＣＫ遺伝子を欠損する乳酸非資化
性キラー酵母、破壊されたＰＥＰＣＫ遺伝子を有する、
宿主に乳酸非資化性を与えるプラスミド（このプラスミ
ドは、ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢａｍＨＩ部位にマーカー遺
伝子が挿入されているプラスミドであるか、またはＰＥ
ＰＣＫ遺伝子のＢｇｌＩＩ断片が欠失されて、代わりに
マーカー遺伝子が挿入されているプラスミドである）、
および上記キラー酵母を用いるサイレージの好気的変敗
を防止する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サイレージの好気
的変敗を防止するための乳酸非資化性キラー酵母、その
酵母の作出のために用いられるプラスミド、およびその
酵母を用いるサイレージの変敗防止方法に関する。
的変敗を防止するための乳酸非資化性キラー酵母、その
酵母の作出のために用いられるプラスミド、およびその
酵母を用いるサイレージの変敗防止方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】サイレージは、草を乳酸発酵して保存性
を高めた反芻家畜の飼料である。サイレージの保存性の
ためには「酸性」および「嫌気」の両条件が必要であ
る。この一方が崩れた場合、サイレージは変質する。
を高めた反芻家畜の飼料である。サイレージの保存性の
ためには「酸性」および「嫌気」の両条件が必要であ
る。この一方が崩れた場合、サイレージは変質する。
【０００３】サイロが開封されると、サイレージは好気
的条件に曝される。この好気条件により、好気性微生物
が乳酸および水溶性炭水化物をＣＯ2ガスに分解し、タ
ンパク質およびアミノ酸をアミン、アミド、およびアン
モニアに分解し、そして呼吸熱を発生し、その結果、温
度およびｐＨが上昇する。酵母およびカビ（糸状菌）は
サイレージ中の乳酸を資化することによりｐＨを上昇さ
せる。その結果腐敗の原因となる細菌類が急増し、サイ
レージを腐敗させる。変敗飼料は栄養価および家畜の嗜
好性が低下するため、家畜飼養上大きな問題となってい
る。
的条件に曝される。この好気条件により、好気性微生物
が乳酸および水溶性炭水化物をＣＯ2ガスに分解し、タ
ンパク質およびアミノ酸をアミン、アミド、およびアン
モニアに分解し、そして呼吸熱を発生し、その結果、温
度およびｐＨが上昇する。酵母およびカビ（糸状菌）は
サイレージ中の乳酸を資化することによりｐＨを上昇さ
せる。その結果腐敗の原因となる細菌類が急増し、サイ
レージを腐敗させる。変敗飼料は栄養価および家畜の嗜
好性が低下するため、家畜飼養上大きな問題となってい
る。
【０００４】このようなサイレージの好気的変敗は、酵
母の乳酸代謝が第一の原因であると考えられる。サイロ
開封時にサイレージ中に乳酸資化性酵母が１０5細胞／
ｇ（乾燥重量）以上存在すると好気的変敗が急速に進む
が、乳酸資化性酵母が存在しない場合、乳酸非資化性酵
母の数がそれ以上存在しても好気的変敗は起こらないこ
とが報告されている（Jonsson, A.およびG. Pahlow, An
im. Res. Dev. 20(1984)7）。
母の乳酸代謝が第一の原因であると考えられる。サイロ
開封時にサイレージ中に乳酸資化性酵母が１０5細胞／
ｇ（乾燥重量）以上存在すると好気的変敗が急速に進む
が、乳酸資化性酵母が存在しない場合、乳酸非資化性酵
母の数がそれ以上存在しても好気的変敗は起こらないこ
とが報告されている（Jonsson, A.およびG. Pahlow, An
im. Res. Dev. 20(1984)7）。
【０００５】本発明者は、キラー酵母を用いて、変敗の
原因となる乳酸資化性の野生酵母類の増殖を抑制するこ
とによりサイレージの好気的変敗を防止することを提案
した。キラー酵母には、それ自身が生産するタンパク性
物質により他の酵母の生育を抑制する作用がある。この
キラー酵母をサイレージに用いた場合の模式図を図１に
示す。しかし、このキラー酵母自体もまた乳酸資化性で
あり、サイレージのｐＨを上昇させ得ることが分かった
（J. Dairy Sci., 76(1993)803-811）。従って、サイレ
ージの好気的変敗を防ぐための具体的な方法がないのが
現状である。
原因となる乳酸資化性の野生酵母類の増殖を抑制するこ
とによりサイレージの好気的変敗を防止することを提案
した。キラー酵母には、それ自身が生産するタンパク性
物質により他の酵母の生育を抑制する作用がある。この
キラー酵母をサイレージに用いた場合の模式図を図１に
示す。しかし、このキラー酵母自体もまた乳酸資化性で
あり、サイレージのｐＨを上昇させ得ることが分かった
（J. Dairy Sci., 76(1993)803-811）。従って、サイレ
ージの好気的変敗を防ぐための具体的な方法がないのが
現状である。
【０００６】好気条件下における酵母の糖代謝の略図を
図２に示す。酵母の乳酸代謝系では、乳酸が乳酸デヒド
ロゲナーゼ（ＬＤＨ）によってピルビン酸に変換され、
ＴＣＡサイクルを通って炭酸ガスと水に分解される。従
って、ＬＤＨ活性を失った酵母は乳酸を炭素源として利
用できない。しかし、ＬＤＨには複数のアイソザイムが
存在しており、ＬＤＨの欠損株を作製することは困難で
ある。
図２に示す。酵母の乳酸代謝系では、乳酸が乳酸デヒド
ロゲナーゼ（ＬＤＨ）によってピルビン酸に変換され、
ＴＣＡサイクルを通って炭酸ガスと水に分解される。従
って、ＬＤＨ活性を失った酵母は乳酸を炭素源として利
用できない。しかし、ＬＤＨには複数のアイソザイムが
存在しており、ＬＤＨの欠損株を作製することは困難で
ある。
【０００７】他方、酵母は、グルコースを炭素源とした
場合は、解糖系、ＴＣＡサイクルを経てエネルギーを得
る。乳酸を炭素源とした場合、菌体が生育するにはグル
コースを再合成して細胞骨格を合成する必要がある。こ
のグルコースの再合成は解糖系の逆行であり、糖新生系
として知られている。糖新生系は、オキサロ酢酸からホ
スホエノールピルビン酸を生成するホスホエノールピル
ビン酸カルボキシキナーゼ（以下、ＰＥＰＣＫと称す
る）によって制御される。
場合は、解糖系、ＴＣＡサイクルを経てエネルギーを得
る。乳酸を炭素源とした場合、菌体が生育するにはグル
コースを再合成して細胞骨格を合成する必要がある。こ
のグルコースの再合成は解糖系の逆行であり、糖新生系
として知られている。糖新生系は、オキサロ酢酸からホ
スホエノールピルビン酸を生成するホスホエノールピル
ビン酸カルボキシキナーゼ（以下、ＰＥＰＣＫと称す
る）によって制御される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このＰＥＰ
ＣＫに注目し、ＰＥＰＣＫの作用を破壊させることによ
り糖新生系をブロックし、乳酸を炭素源として生育しな
いキラー酵母を得、サイレージの好気的変敗を防止する
ことを目的とする。
ＣＫに注目し、ＰＥＰＣＫの作用を破壊させることによ
り糖新生系をブロックし、乳酸を炭素源として生育しな
いキラー酵母を得、サイレージの好気的変敗を防止する
ことを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＰＥＰＣＫ遺
伝子を欠損する乳酸非資化性キラー酵母を提供する。
伝子を欠損する乳酸非資化性キラー酵母を提供する。
【００１０】好ましい実施態様では、上記キラー酵母
は、K. lactisである。
は、K. lactisである。
【００１１】好ましい実施態様では、上記乳酸非資化性
キラー酵母は遺伝子工学的に得られる。
キラー酵母は遺伝子工学的に得られる。
【００１２】本発明はまた、乳酸非資化性キラー酵母を
作製する方法を提供する。この方法は、ＰＥＰＣＫ遺伝
子をクローニングする工程；ＰＥＰＣＫ遺伝子を改変す
る工程；および上記改変ＰＥＰＣＫ遺伝子をキラー酵母
に導入する工程を包含する。
作製する方法を提供する。この方法は、ＰＥＰＣＫ遺伝
子をクローニングする工程；ＰＥＰＣＫ遺伝子を改変す
る工程；および上記改変ＰＥＰＣＫ遺伝子をキラー酵母
に導入する工程を包含する。
【００１３】本発明はまた、宿主に乳酸非資化性を与え
るプラスミドを提供する。このプラスミドは改変された
ＰＥＰＣＫ遺伝子を有する。
るプラスミドを提供する。このプラスミドは改変された
ＰＥＰＣＫ遺伝子を有する。
【００１４】好ましい実施態様では、上記改変されたＰ
ＥＰＣＫ遺伝子は、該ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢａｍＨＩ部
位にマーカー遺伝子が挿入されることにより得られる。
ＥＰＣＫ遺伝子は、該ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢａｍＨＩ部
位にマーカー遺伝子が挿入されることにより得られる。
【００１５】別の好ましい実施態様では、上記改変され
たＰＥＰＣＫ遺伝子は、該ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢｇｌＩ
Ｉ断片が欠失されて、代わりにマーカー遺伝子が挿入さ
れることにより得られる。
たＰＥＰＣＫ遺伝子は、該ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢｇｌＩ
Ｉ断片が欠失されて、代わりにマーカー遺伝子が挿入さ
れることにより得られる。
【００１６】本発明はまた、サイレージの好気的変敗を
防止する方法を提供する。この方法は、上記乳酸非資化
性キラー酵母をサイレージに添加する工程を包含する。
防止する方法を提供する。この方法は、上記乳酸非資化
性キラー酵母をサイレージに添加する工程を包含する。
【００１７】好ましい実施態様では、上記方法は、サイ
レージにさらにラクトースを添加する工程を包含する。
レージにさらにラクトースを添加する工程を包含する。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明は、サイレージの好気的変
敗を防止するための乳酸非資化性キラー酵母を提供す
る。本発明における「乳酸非資化性」酵母とは、厳密に
言うと乳酸を炭素源として生育できない酵母である。こ
の酵母は、糖新生系がブロックされているが乳酸→ＴＣ
Ａ回路は働くので自らは乳酸を資化し得るが、乳酸を炭
素源として生育することができない。
敗を防止するための乳酸非資化性キラー酵母を提供す
る。本発明における「乳酸非資化性」酵母とは、厳密に
言うと乳酸を炭素源として生育できない酵母である。こ
の酵母は、糖新生系がブロックされているが乳酸→ＴＣ
Ａ回路は働くので自らは乳酸を資化し得るが、乳酸を炭
素源として生育することができない。
【００１９】キラー酵母とは、他の酵母の生育を選択的
に抑制するタンパク性（糖タンパク質もまた包含する）
のキラートキシンを生産する酵母をいう。本発明で用い
られるキラー酵母は、サイレージの好気的変敗に関わる
野生酵母類の増殖を抑制する菌株であればいずれでも用
いられ得る。例えば、Ｋ1タイプキラー酵母菌株、Kluyv
elomyces lactis IFO1267株、Hansenula mrakii IFO089
5株、Hansenula mrakii IFO0897株などが挙げられる。
好ましくは、K. lactis IFO1267株およびHansenula mra
kii IFO0897株が用いられ、この２株は、野生酵母類に
関して幅広いスペクトルを有し、そしてキラー活性が共
に酸性側で強く働く。最も好ましくは、K.lactis IFO12
67株が用いられる。その理由は以下の通りである。この
K. lactisIFO1267株は、キラースペクトルの幅が広いだ
けでなく、即効性である。さらに、このK. lactis IFO
1267株は、ラクトースを資化および発酵する。K. lacti
sIFO 1267株は、炭素源としてラクトースを用いること
により、ラクトース非資化性酵母に対するキラー活性が
増大することが知られている（J. Dairy Sci. 76(1993)
803-811）。他方、酵母の多くはラクトースを炭素源と
して利用できない。サイレージの詰め込み時にラクトー
スとラクトース資化性キラー酵母を添加すれば、ラクト
ースによる乳酸菌の活性化が期待され、同時に野生酵母
の増殖を選択的に抑制することが可能であると考えられ
る。
に抑制するタンパク性（糖タンパク質もまた包含する）
のキラートキシンを生産する酵母をいう。本発明で用い
られるキラー酵母は、サイレージの好気的変敗に関わる
野生酵母類の増殖を抑制する菌株であればいずれでも用
いられ得る。例えば、Ｋ1タイプキラー酵母菌株、Kluyv
elomyces lactis IFO1267株、Hansenula mrakii IFO089
5株、Hansenula mrakii IFO0897株などが挙げられる。
好ましくは、K. lactis IFO1267株およびHansenula mra
kii IFO0897株が用いられ、この２株は、野生酵母類に
関して幅広いスペクトルを有し、そしてキラー活性が共
に酸性側で強く働く。最も好ましくは、K.lactis IFO12
67株が用いられる。その理由は以下の通りである。この
K. lactisIFO1267株は、キラースペクトルの幅が広いだ
けでなく、即効性である。さらに、このK. lactis IFO
1267株は、ラクトースを資化および発酵する。K. lacti
sIFO 1267株は、炭素源としてラクトースを用いること
により、ラクトース非資化性酵母に対するキラー活性が
増大することが知られている（J. Dairy Sci. 76(1993)
803-811）。他方、酵母の多くはラクトースを炭素源と
して利用できない。サイレージの詰め込み時にラクトー
スとラクトース資化性キラー酵母を添加すれば、ラクト
ースによる乳酸菌の活性化が期待され、同時に野生酵母
の増殖を選択的に抑制することが可能であると考えられ
る。
【００２０】以下、本発明をK. lactis IFO1267株を例
にして説明する。まずＰＥＰＣＫ遺伝子のクローニング
を行う。Saccharomyces cerevisiaeのＰＥＰＣＫ遺伝子
ＰＣＫ１の塩基配列（R. Stuckaら、Nucleic Acids Re
s. 16(1988)10926）に基づいてＰＣＲで拡大したプロー
ブを用い、K. lactis IFO1267株のゲノミックサザンハ
イブリダイゼーションを行う。得られたバンドを切り出
して、これを酵母ｐＹＣ型ベクターに挿入したプラスミ
ドをＰＣＫ１欠損S. cerevisiaeに形質転換する。これ
により、乳酸を唯一の炭素源とする培地に生育する形質
転換体が得られる。この形質転換体はＰＥＰＣＫ活性を
回復する。S. cerevisiaeで相補したことにより、このD
NA断片はK. lactis IFO1267株のＰＥＰＣＫ遺伝子Ｋｌ
ＰＣＫ１を含むことが確認される。
にして説明する。まずＰＥＰＣＫ遺伝子のクローニング
を行う。Saccharomyces cerevisiaeのＰＥＰＣＫ遺伝子
ＰＣＫ１の塩基配列（R. Stuckaら、Nucleic Acids Re
s. 16(1988)10926）に基づいてＰＣＲで拡大したプロー
ブを用い、K. lactis IFO1267株のゲノミックサザンハ
イブリダイゼーションを行う。得られたバンドを切り出
して、これを酵母ｐＹＣ型ベクターに挿入したプラスミ
ドをＰＣＫ１欠損S. cerevisiaeに形質転換する。これ
により、乳酸を唯一の炭素源とする培地に生育する形質
転換体が得られる。この形質転換体はＰＥＰＣＫ活性を
回復する。S. cerevisiaeで相補したことにより、このD
NA断片はK. lactis IFO1267株のＰＥＰＣＫ遺伝子Ｋｌ
ＰＣＫ１を含むことが確認される。
【００２１】次に、ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊を行う。ＰＥ
ＰＣＫ遺伝子破壊は、以下のようにして行われ得る。上
記のようにクローニングしたＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣ
Ｋ１を、挿入、欠失などの変異を生じさせて遺伝子とし
て働き得ないように改変する。この改変遺伝子を保有す
るプラスミド（ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミド）を
作製し、これをK. lactisに遺伝子導入する。この遺伝
子の導入は、例えば、スフェロプラスト法、酢酸リチウ
ム法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン
法などのいずれの公知の方法によっても行われ得る。改
変遺伝子を導入すると、ＰＥＰＣＫ遺伝子の部分で染色
体相同組換えが起こり、その結果遺伝子破壊を生じる。
得られた形質転換酵母は乳酸を炭素源として利用し得な
い。
ＰＣＫ遺伝子破壊は、以下のようにして行われ得る。上
記のようにクローニングしたＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣ
Ｋ１を、挿入、欠失などの変異を生じさせて遺伝子とし
て働き得ないように改変する。この改変遺伝子を保有す
るプラスミド（ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミド）を
作製し、これをK. lactisに遺伝子導入する。この遺伝
子の導入は、例えば、スフェロプラスト法、酢酸リチウ
ム法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン
法などのいずれの公知の方法によっても行われ得る。改
変遺伝子を導入すると、ＰＥＰＣＫ遺伝子の部分で染色
体相同組換えが起こり、その結果遺伝子破壊を生じる。
得られた形質転換酵母は乳酸を炭素源として利用し得な
い。
【００２２】ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミドとして
は、ｐＫＰ１およびｐＫＰ２の２つのプラスミドが挙げ
られる。この両プラスミドは、K. lactisのＰＥＰＣＫ
遺伝子の内部にマーカー遺伝子が挿入されているプラス
ミドである。ｐＫＰ１は、ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢａｍＨ
Ｉ部位にマーカー遺伝子が挿入されている挿入型プラス
ミドである。ｐＫＰ２は、ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢｇｌＩ
Ｉ断片が欠失されて、代わりにマーカー遺伝子が挿入さ
れている欠失型プラスミドである。本発明で用いられ得
るマーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質Ｇ４１８
耐性、セルレニン耐性、シクロヘキシミド耐性、または
エチオニン耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定さ
れない。これらのＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミドを
用いることにより、安定した遺伝子破壊が得られ得る。
は、ｐＫＰ１およびｐＫＰ２の２つのプラスミドが挙げ
られる。この両プラスミドは、K. lactisのＰＥＰＣＫ
遺伝子の内部にマーカー遺伝子が挿入されているプラス
ミドである。ｐＫＰ１は、ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢａｍＨ
Ｉ部位にマーカー遺伝子が挿入されている挿入型プラス
ミドである。ｐＫＰ２は、ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢｇｌＩ
Ｉ断片が欠失されて、代わりにマーカー遺伝子が挿入さ
れている欠失型プラスミドである。本発明で用いられ得
るマーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質Ｇ４１８
耐性、セルレニン耐性、シクロヘキシミド耐性、または
エチオニン耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定さ
れない。これらのＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミドを
用いることにより、安定した遺伝子破壊が得られ得る。
【００２３】上記のようにして得られたＰＥＰＣＫ欠損
キラー酵母は、乳酸を炭素源として生育しないが、キラ
ー活性および糖を炭素源とした生育は元のキラー酵母と
変わりがない。従って、このキラー酵母を用いることに
より、サイレージの好気的変敗は十分に防止され得る。
キラー酵母は、乳酸を炭素源として生育しないが、キラ
ー活性および糖を炭素源とした生育は元のキラー酵母と
変わりがない。従って、このキラー酵母を用いることに
より、サイレージの好気的変敗は十分に防止され得る。
【００２４】本発明によるサイレージの好気的変敗を防
止する方法は、上記の乳酸非資化性キラー酵母をサイレ
ージに添加する工程を包含する。サイレージは、酸性お
よび嫌気条件下で調製され得るので、乳酸非資化性キラ
ー酵母は、サイレージの調製開始時に添加され得る。好
ましくは、上記サイレージに、乳酸非資化性キラー酵母
とラクトースとを添加する工程を包含する。サイレージ
の酸性および嫌気条件を維持するために、ラクトースお
よびラクトース資化性キラー酵母は、サイレージの調製
開始時に同時に添加され得る。多くの野生酵母はラクト
ース非資化性である。従って、サイレージの詰め込み時
にラクトースとラクトース資化性キラー酵母とを添加す
れば、ラクトースによる乳酸菌の活性化が期待され、同
時に野生酵母の増殖を選択的に抑制し得る。
止する方法は、上記の乳酸非資化性キラー酵母をサイレ
ージに添加する工程を包含する。サイレージは、酸性お
よび嫌気条件下で調製され得るので、乳酸非資化性キラ
ー酵母は、サイレージの調製開始時に添加され得る。好
ましくは、上記サイレージに、乳酸非資化性キラー酵母
とラクトースとを添加する工程を包含する。サイレージ
の酸性および嫌気条件を維持するために、ラクトースお
よびラクトース資化性キラー酵母は、サイレージの調製
開始時に同時に添加され得る。多くの野生酵母はラクト
ース非資化性である。従って、サイレージの詰め込み時
にラクトースとラクトース資化性キラー酵母とを添加す
れば、ラクトースによる乳酸菌の活性化が期待され、同
時に野生酵母の増殖を選択的に抑制し得る。
【００２５】本発明に従えば、サイレージの好気的変敗
が好都合に防止され得る。キラー酵母の乳酸発酵が抑制
されるため、好気的変敗の原因となる野生酵母類の増殖
は、乳酸非資化性キラー酵母によって適切に抑制され得
る。キラー酵母に加えてラクトースをサイレージに添加
することにより、キラー酵母のキラー活性が強まり、そ
して乳酸菌の活動が活性化され得る。
が好都合に防止され得る。キラー酵母の乳酸発酵が抑制
されるため、好気的変敗の原因となる野生酵母類の増殖
は、乳酸非資化性キラー酵母によって適切に抑制され得
る。キラー酵母に加えてラクトースをサイレージに添加
することにより、キラー酵母のキラー活性が強まり、そ
して乳酸菌の活動が活性化され得る。
【００２６】以下、本発明を実施例によって説明する
が、本発明は実施例に限定されない。
が、本発明は実施例に限定されない。
【００２７】
（実施例１ K. lactis IFO1267株ＰＥＰＣＫ遺伝子の
クローニング）プローブは、S. cerevisiaeのＰＥＰＣ
Ｋ遺伝子ＰＣＫ１の塩基配列（R. Stuckaら、Nucleic A
cids Res. 16(1988)10926）に基づいて、S. cerevisia
e YNN27株ゲノムDNAをテンプレートとし、プライマー１
5' ATAGGGCCCATGTCCCCTTCTAAAATGAATGCTA 3'およびプ
ライマー２ 5' CGCAAGCTTCTAACATGTTTCGTTTACTCGAATT
3'を用いてＰＣＲにより作製した。作製したプローブを
用い、常法に従って（Sambrook et al., Molecular Clo
ning: A Laboratory Manual 第２版 (1989) ColdSpring
Harbor Laboratory Press）、ECL direct nucleic aci
d labelling anddetection system (Amersham) により
K. lactis IFO1267株のゲノミックサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。得られたバンドを切り出して、プ
ラスミドベクターBluescriptII KS+（ストラタジーン社
製）にライゲーションした。ＰＣＫ１をプローブとし
て、コロニーハイブリダイゼーション（DIG標識核酸検
出キット；ベーリンガーマンハイム製：Colliquium 2(1
992)8）でＰＣＫ１と相同性の高い遺伝子断片ＫｌＰＣ
Ｋ１がサブクローニングされたプラスミドを含むコロニ
ーをスクリーニングした。ＫｌＰＣＫ１を切り出して、
これを酵母ｐＹＣ型ベクターに挿入したプラスミドをＰ
ＣＫ１欠損S. cerevisiaeに酢酸リチウム法（Ito, H.,
Fukuda, Y., Murata, K.およびKimura, A., Journal of
Bacteriology 153(1983)163）で形質転換した。形質転
換株を乳酸カルシウム（０．５ｇ／Ｌ）を炭素源として
含有する最少培地に接種して増殖させたところ、この株
は、乳酸を唯一の炭素源とする培地で生育した。さら
に、得られた形質転換株の酵素活性を測定した。この形
質転換株を、グルコースを炭素源とした培地（イースト
ナイトロジェンベースｗ／ｏアミノ酸６．７ｇ／Ｌ）に
おいて３０℃で二夜振盪培養し、次いで滅菌水で洗浄し
た。この菌体を、ＰＥＰＣＫ遺伝子の発現を誘導する条
件である、エタノール（２％ｗ／ｖ）を炭素源とした培
地（イーストナイトロジェンベースｗ／ｏアミノ酸６．
７ｇ／Ｌ）中で培養し、次に菌体をガラスビーズで破砕
した後遠心分離して、細胞抽出液を得た。コントロール
として、エタノールの代わりにグルコースを用いた培地
中での培養もまた行った。得られた細胞抽出液中のタン
パク質量をプロテインアッセイキット（BioRad）を用い
て定量した。細胞抽出液中のＰＥＰＣＫ活性はJavier P
ereaおよびCarlos Gancedo, Arch Microbiol 132(1982)
141-143に記載の方法の改法に従い、以下のように測定
した。イミダゾール溶液（ｐＨ７．０）（１００ｍＭ
イミダゾール、１００ｍＭＮａＨＣＯ3、４ｍＭ Ｍｎ
Ｃｌ2、および４ｍＭ グルコースを含有する）２８３
８μＬ、還元グルタチオン溶液（１μmol還元グルタチ
オン、１μmolＡＤＰ、０．５μmolＮＡＤＨ、および0.
1μmolＰＥＰを含有する）１００μＬ、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ（ベーリンガー１２７２４８）４μＬ（４．
８ｕ）、およびヘキソキナーゼ（ベーリンガー１２７１
７５）８μＬ（２．４ｕ）を３０℃で３分間混合した。
次いで、この混合液に５０μＬの細胞抽出液を添加し、
ＰＥＰＣＫ活性を、３４０ｎｍでの吸光度を３０℃で３
０分間経時的に測定することにより得た。この形質転換
体はＰＥＰＣＫ活性を回復した。S. cerevisiaeで相補
したことにより、このDNA断片はK. lactis IFO1267株の
ＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣＫ１を含むことが分かった。
クローニング）プローブは、S. cerevisiaeのＰＥＰＣ
Ｋ遺伝子ＰＣＫ１の塩基配列（R. Stuckaら、Nucleic A
cids Res. 16(1988)10926）に基づいて、S. cerevisia
e YNN27株ゲノムDNAをテンプレートとし、プライマー１
5' ATAGGGCCCATGTCCCCTTCTAAAATGAATGCTA 3'およびプ
ライマー２ 5' CGCAAGCTTCTAACATGTTTCGTTTACTCGAATT
3'を用いてＰＣＲにより作製した。作製したプローブを
用い、常法に従って（Sambrook et al., Molecular Clo
ning: A Laboratory Manual 第２版 (1989) ColdSpring
Harbor Laboratory Press）、ECL direct nucleic aci
d labelling anddetection system (Amersham) により
K. lactis IFO1267株のゲノミックサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。得られたバンドを切り出して、プ
ラスミドベクターBluescriptII KS+（ストラタジーン社
製）にライゲーションした。ＰＣＫ１をプローブとし
て、コロニーハイブリダイゼーション（DIG標識核酸検
出キット；ベーリンガーマンハイム製：Colliquium 2(1
992)8）でＰＣＫ１と相同性の高い遺伝子断片ＫｌＰＣ
Ｋ１がサブクローニングされたプラスミドを含むコロニ
ーをスクリーニングした。ＫｌＰＣＫ１を切り出して、
これを酵母ｐＹＣ型ベクターに挿入したプラスミドをＰ
ＣＫ１欠損S. cerevisiaeに酢酸リチウム法（Ito, H.,
Fukuda, Y., Murata, K.およびKimura, A., Journal of
Bacteriology 153(1983)163）で形質転換した。形質転
換株を乳酸カルシウム（０．５ｇ／Ｌ）を炭素源として
含有する最少培地に接種して増殖させたところ、この株
は、乳酸を唯一の炭素源とする培地で生育した。さら
に、得られた形質転換株の酵素活性を測定した。この形
質転換株を、グルコースを炭素源とした培地（イースト
ナイトロジェンベースｗ／ｏアミノ酸６．７ｇ／Ｌ）に
おいて３０℃で二夜振盪培養し、次いで滅菌水で洗浄し
た。この菌体を、ＰＥＰＣＫ遺伝子の発現を誘導する条
件である、エタノール（２％ｗ／ｖ）を炭素源とした培
地（イーストナイトロジェンベースｗ／ｏアミノ酸６．
７ｇ／Ｌ）中で培養し、次に菌体をガラスビーズで破砕
した後遠心分離して、細胞抽出液を得た。コントロール
として、エタノールの代わりにグルコースを用いた培地
中での培養もまた行った。得られた細胞抽出液中のタン
パク質量をプロテインアッセイキット（BioRad）を用い
て定量した。細胞抽出液中のＰＥＰＣＫ活性はJavier P
ereaおよびCarlos Gancedo, Arch Microbiol 132(1982)
141-143に記載の方法の改法に従い、以下のように測定
した。イミダゾール溶液（ｐＨ７．０）（１００ｍＭ
イミダゾール、１００ｍＭＮａＨＣＯ3、４ｍＭ Ｍｎ
Ｃｌ2、および４ｍＭ グルコースを含有する）２８３
８μＬ、還元グルタチオン溶液（１μmol還元グルタチ
オン、１μmolＡＤＰ、０．５μmolＮＡＤＨ、および0.
1μmolＰＥＰを含有する）１００μＬ、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ（ベーリンガー１２７２４８）４μＬ（４．
８ｕ）、およびヘキソキナーゼ（ベーリンガー１２７１
７５）８μＬ（２．４ｕ）を３０℃で３分間混合した。
次いで、この混合液に５０μＬの細胞抽出液を添加し、
ＰＥＰＣＫ活性を、３４０ｎｍでの吸光度を３０℃で３
０分間経時的に測定することにより得た。この形質転換
体はＰＥＰＣＫ活性を回復した。S. cerevisiaeで相補
したことにより、このDNA断片はK. lactis IFO1267株の
ＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣＫ１を含むことが分かった。
【００２８】（実施例２ ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラ
スミドの構築）ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミドを以
下のように構築した。実施例１により得られたK. lacti
s IFO1267株由来のＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣＫ１をコ
ードする約４．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩゲノムフラグメント
を、あらかじめマルチクローニング部位内のＢａｍＨＩ
部位を欠失させた、またはもとのままのプラスミドベク
ターBluescript II KS+（ストラタジーン社製）のＥｃ
ｏＲＩ部位にサブクローン化した。次に、これらの組換
えプラスミドを挿入断片内のＢａｍＨＩ部位（上記Ｅｃ
ｏＲＩフラグメント内に１ヶ所存在する）またはＢｇｌ
ＩＩ部位（同フラグメント内に２ヶ所存在する）で切断
し、そこにプラスミドｐＹＣＤＥ−ΔＧ１１（T. Ogata
ら, J. Gen. Appl. Microbiol., 39(1993)285-294）中
の、Saccharomyces cerevisiae由来のＡＤＨ１プロモー
ターおよびEscerichia coli由来のカナマイシン耐性遺
伝子（ＡＰＴ２）を含む３．４ＫｂのＢａｍＨＩ断片を
挿入することにより、ｐＫＰ１およびｐＫＰ２を得た。
図３に示すように、前者はマーカー遺伝子としてのＡＰ
Ｔ２フラグメントがK. lactis由来のフラグメントに挿
入された形になっており、また後者はK. lactis由来の
フラグメントの一部が欠失してＡＰＴ２フラグメントで
置換された形となっている。
スミドの構築）ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミドを以
下のように構築した。実施例１により得られたK. lacti
s IFO1267株由来のＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣＫ１をコ
ードする約４．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩゲノムフラグメント
を、あらかじめマルチクローニング部位内のＢａｍＨＩ
部位を欠失させた、またはもとのままのプラスミドベク
ターBluescript II KS+（ストラタジーン社製）のＥｃ
ｏＲＩ部位にサブクローン化した。次に、これらの組換
えプラスミドを挿入断片内のＢａｍＨＩ部位（上記Ｅｃ
ｏＲＩフラグメント内に１ヶ所存在する）またはＢｇｌ
ＩＩ部位（同フラグメント内に２ヶ所存在する）で切断
し、そこにプラスミドｐＹＣＤＥ−ΔＧ１１（T. Ogata
ら, J. Gen. Appl. Microbiol., 39(1993)285-294）中
の、Saccharomyces cerevisiae由来のＡＤＨ１プロモー
ターおよびEscerichia coli由来のカナマイシン耐性遺
伝子（ＡＰＴ２）を含む３．４ＫｂのＢａｍＨＩ断片を
挿入することにより、ｐＫＰ１およびｐＫＰ２を得た。
図３に示すように、前者はマーカー遺伝子としてのＡＰ
Ｔ２フラグメントがK. lactis由来のフラグメントに挿
入された形になっており、また後者はK. lactis由来の
フラグメントの一部が欠失してＡＰＴ２フラグメントで
置換された形となっている。
【００２９】（実施例３ 遺伝子破壊用プラスミドをキ
ラー酵母K. lactisへの導入）実施例２で構築したプラ
スミドＤＮＡを、エレクトロポーレーション法は、Manu
el Sanchezら, Appl. Environ. Microbiol., 59(1993)2
087-2092に記載の方法の改法に従い、K. lactis IFO126
7株に形質転換した。すなわち、試験管内で菌体をＹＥ
Ｄ培地５ｍＬにおいて３０℃で一夜振盪培養し、次いで
この菌体を３００ｍＬ容三角フラスコ中でＹＥＤ培地３
０ｍＬにおいて３０℃で３．５時間振盪培養した。次い
でこの菌体を冷水で２回洗浄した後、ＹＥＤ、２５ｍＭ
ＤＴＴ（ＹＥＤ７８０ｍＬ、１Ｍ ＤＴＴ ２０μＬ）
を含む培地で３０℃で３０分間、１００ｒｐｍで振盪し
た。得られた菌体を冷水で２回、次いでエレクトロポー
レーション緩衝液（１ｍＭ Tris ＨＣｌ(ｐＨ７．
５）、２７０ｍＭスクロース、および１ｍＭ ＬｉＯＡ
ｃを含有する）で洗浄し、そしてこのエレクトロポーレ
ーション緩衝液２００μＬに懸濁した。この懸濁液に実
施例１で構築したプラスミドＤＮＡ１μＬを添加し、氷
上で１５分間静置した。細胞／ＤＮＡ混合液を、４ＫＶ
／ｃｍ（２００Ｖ／０．５ｍｍ）、１６ｍＳの条件でエ
レクトロポーレーションにかけた。処理した菌体を１ｍ
ＬのＹＰＤ培地中に懸濁して氷上で１５分間静置し、次
いで３０℃で６時間インキュベートした後、Ｇ４１８
（０．１ｍｇ／ｍＬ）および寒天（２０ｇ／Ｌ）を含む
ＹＰＤ培地上に広げ、３０℃で７２時間インキュベート
した。出現したＧ４１８耐性コロニーを、乳酸カルシウ
ム（５ｇ／Ｌ）を含有する最少寒天培地（イーストナイ
トロジェンベースｗ／ｏアミノ酸６．７ｇ／Ｌ、寒天２
０ｇ／Ｌ）にレプリカし、そこで生育しない形質転換株
を選択した。形質転換実験の結果を表１に示す。
ラー酵母K. lactisへの導入）実施例２で構築したプラ
スミドＤＮＡを、エレクトロポーレーション法は、Manu
el Sanchezら, Appl. Environ. Microbiol., 59(1993)2
087-2092に記載の方法の改法に従い、K. lactis IFO126
7株に形質転換した。すなわち、試験管内で菌体をＹＥ
Ｄ培地５ｍＬにおいて３０℃で一夜振盪培養し、次いで
この菌体を３００ｍＬ容三角フラスコ中でＹＥＤ培地３
０ｍＬにおいて３０℃で３．５時間振盪培養した。次い
でこの菌体を冷水で２回洗浄した後、ＹＥＤ、２５ｍＭ
ＤＴＴ（ＹＥＤ７８０ｍＬ、１Ｍ ＤＴＴ ２０μＬ）
を含む培地で３０℃で３０分間、１００ｒｐｍで振盪し
た。得られた菌体を冷水で２回、次いでエレクトロポー
レーション緩衝液（１ｍＭ Tris ＨＣｌ(ｐＨ７．
５）、２７０ｍＭスクロース、および１ｍＭ ＬｉＯＡ
ｃを含有する）で洗浄し、そしてこのエレクトロポーレ
ーション緩衝液２００μＬに懸濁した。この懸濁液に実
施例１で構築したプラスミドＤＮＡ１μＬを添加し、氷
上で１５分間静置した。細胞／ＤＮＡ混合液を、４ＫＶ
／ｃｍ（２００Ｖ／０．５ｍｍ）、１６ｍＳの条件でエ
レクトロポーレーションにかけた。処理した菌体を１ｍ
ＬのＹＰＤ培地中に懸濁して氷上で１５分間静置し、次
いで３０℃で６時間インキュベートした後、Ｇ４１８
（０．１ｍｇ／ｍＬ）および寒天（２０ｇ／Ｌ）を含む
ＹＰＤ培地上に広げ、３０℃で７２時間インキュベート
した。出現したＧ４１８耐性コロニーを、乳酸カルシウ
ム（５ｇ／Ｌ）を含有する最少寒天培地（イーストナイ
トロジェンベースｗ／ｏアミノ酸６．７ｇ／Ｌ、寒天２
０ｇ／Ｌ）にレプリカし、そこで生育しない形質転換株
を選択した。形質転換実験の結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】これらの形質転換体の中から各シリーズに
ついて１株ずつ選択し、それらを遺伝子破壊が導入され
た候補株として、以下でより詳細な検討を実施した。
ついて１株ずつ選択し、それらを遺伝子破壊が導入され
た候補株として、以下でより詳細な検討を実施した。
【００３２】（実施例４ 形質転換体の特徴付け） １）ゲノムサザン解析：実施例３で導入された改変ＰＥ
ＰＣＫ遺伝子の存在様式を調べる目的で下記のようにサ
ザン解析を実施した。２種の形質転換体および野生株K.
lactis IFO1267株から抽出したゲノムＤＮＡ各１０μｇ
ならびに形質転換に使用した２種のプラスミドＤＮＡ各
１０ｎｇを、ＥｃｏＲＩで切断後アガロースゲル電気泳
動し、ペルオキシダーゼで標識したＰＥＰＣＫ遺伝子を
含む約４．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントをプローブ
として、常法に従って（Sambrooket al., Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual 第２版 (1989) Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press）、ECL direct nucleic a
cid labelling and detection system (Amersham) によ
りサザン解析を実施した。図４に示すように、形質転換
体由来のゲノムＤＮＡは、それぞれ遺伝子破壊に使用し
たプラスミドＤＮＡと同じハイブリダイゼーションパタ
ーンを示し、このことから、遺伝子破壊用プラスミド内
の挿入フラグメントがK. lactisゲノムに導入前の形態
を維持して導入されていることが確認された。
ＰＣＫ遺伝子の存在様式を調べる目的で下記のようにサ
ザン解析を実施した。２種の形質転換体および野生株K.
lactis IFO1267株から抽出したゲノムＤＮＡ各１０μｇ
ならびに形質転換に使用した２種のプラスミドＤＮＡ各
１０ｎｇを、ＥｃｏＲＩで切断後アガロースゲル電気泳
動し、ペルオキシダーゼで標識したＰＥＰＣＫ遺伝子を
含む約４．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントをプローブ
として、常法に従って（Sambrooket al., Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual 第２版 (1989) Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press）、ECL direct nucleic a
cid labelling and detection system (Amersham) によ
りサザン解析を実施した。図４に示すように、形質転換
体由来のゲノムＤＮＡは、それぞれ遺伝子破壊に使用し
たプラスミドＤＮＡと同じハイブリダイゼーションパタ
ーンを示し、このことから、遺伝子破壊用プラスミド内
の挿入フラグメントがK. lactisゲノムに導入前の形態
を維持して導入されていることが確認された。
【００３３】２）染色体解析：導入された改変遺伝子の
染色体上の位置を、以下の手順で検討した。野生株およ
び２種の形質転換体について、２×１０9細胞／ｍＬの
プロトプラストを含むアガロースプラグを、１％低融点
ゲル（BioRad 162-0102）、１５ｃｍのウエルに充填
し、パルスフィールド電気泳動装置（BioRad社製、CHEF
-DRII）を用いて、９〜１０℃、１３０Ｖで、パルス時
間１００秒で１６時間、次いでイニシャルパルス時間１
８０秒およびファイナルパルス時間３６０秒で５１時
間、そしてパルス時間３６０秒で６時間電気泳動した。
電気泳動後、ＰＥＰＣＫ遺伝子を含む４．８Ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＩフラグメントまたはＡＰＴ２遺伝子を含む３．４
Ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントをプローブとして上記
１）のようにサザン解析した。図５に示すように、ＡＰ
Ｔ２遺伝子を含むフラグメントは、形質転換体由来のゲ
ノムＤＮＡではＰＥＰＣＫ遺伝子を含むフラグメントと
同じ１番染色体にハイブリダイズしたが、野生株由来の
ＤＮＡにはハイブリダイズしなかった。この結果および
上記１）の結果から、ＡＰＴ２遺伝子フラグメントによ
る挿入または欠失（置換）がK.lactisゲノムのＰＥＰＣ
Ｋ遺伝子内に導入されていることが確認された。
染色体上の位置を、以下の手順で検討した。野生株およ
び２種の形質転換体について、２×１０9細胞／ｍＬの
プロトプラストを含むアガロースプラグを、１％低融点
ゲル（BioRad 162-0102）、１５ｃｍのウエルに充填
し、パルスフィールド電気泳動装置（BioRad社製、CHEF
-DRII）を用いて、９〜１０℃、１３０Ｖで、パルス時
間１００秒で１６時間、次いでイニシャルパルス時間１
８０秒およびファイナルパルス時間３６０秒で５１時
間、そしてパルス時間３６０秒で６時間電気泳動した。
電気泳動後、ＰＥＰＣＫ遺伝子を含む４．８Ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＩフラグメントまたはＡＰＴ２遺伝子を含む３．４
Ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントをプローブとして上記
１）のようにサザン解析した。図５に示すように、ＡＰ
Ｔ２遺伝子を含むフラグメントは、形質転換体由来のゲ
ノムＤＮＡではＰＥＰＣＫ遺伝子を含むフラグメントと
同じ１番染色体にハイブリダイズしたが、野生株由来の
ＤＮＡにはハイブリダイズしなかった。この結果および
上記１）の結果から、ＡＰＴ２遺伝子フラグメントによ
る挿入または欠失（置換）がK.lactisゲノムのＰＥＰＣ
Ｋ遺伝子内に導入されていることが確認された。
【００３４】３）ＰＥＰＣＫ活性の測定：試験管内での
ＰＥＰＣＫ遺伝子フラグメント中の挿入または欠失（置
換）の、キラー酵母K.lactis宿主のＰＥＰＣＫ遺伝子の
発現に及ぼす影響を、形質転換体の産生するＰＥＰＣＫ
活性を測定することにより検討した。ＰＥＰＣＫ活性
は、上述の実施例１と同様にして測定した。以下の表２
に示すように、野生株に比較して形質転換株ではＰＥＰ
ＣＫ活性はほとんど発現されなかった。
ＰＥＰＣＫ遺伝子フラグメント中の挿入または欠失（置
換）の、キラー酵母K.lactis宿主のＰＥＰＣＫ遺伝子の
発現に及ぼす影響を、形質転換体の産生するＰＥＰＣＫ
活性を測定することにより検討した。ＰＥＰＣＫ活性
は、上述の実施例１と同様にして測定した。以下の表２
に示すように、野生株に比較して形質転換株ではＰＥＰ
ＣＫ活性はほとんど発現されなかった。
【００３５】
【表２】
【００３６】４）炭素源資化性：ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊
の乳酸資化性に及ぼす影響を下記のように調べた。２種
の形質転換体および野生株を乳酸またはラクトース（そ
れぞれ２０ｇ／Ｌ）を炭素源として含有する最少培地に
接種して、増殖させた。この結果を図６に示す。図中、
▲は野生株の乳酸培地培養、●は野生株のラクトース培
地培養、△は形質転換体の乳酸培地培養、そして○は形
質転換体のラクトース培地培養を表す。図６に示すよう
に、糖であるラクトースを含有する培地中では、形質転
換体は野生株と同様に増殖した。一方、乳酸を炭素源と
して含有する培地中では、野生株は良好な増殖を示すの
に対して、形質転換体は増殖しなかった。また形質転換
体をＹＰＤ培地中で非選択条件下で約２０世代培養した
後、乳酸非資化性およびＧ４１８耐性の形質について調
べたところ、それぞれの株は両形質を安定に１００％維
持していた。これらの結果は、形質転換体ゲノム中のＰ
ＥＰＣＫ遺伝子破壊によりこれらの株の乳酸資化性が失
われ、また遺伝子破壊が安定に維持されていることを示
唆した。
の乳酸資化性に及ぼす影響を下記のように調べた。２種
の形質転換体および野生株を乳酸またはラクトース（そ
れぞれ２０ｇ／Ｌ）を炭素源として含有する最少培地に
接種して、増殖させた。この結果を図６に示す。図中、
▲は野生株の乳酸培地培養、●は野生株のラクトース培
地培養、△は形質転換体の乳酸培地培養、そして○は形
質転換体のラクトース培地培養を表す。図６に示すよう
に、糖であるラクトースを含有する培地中では、形質転
換体は野生株と同様に増殖した。一方、乳酸を炭素源と
して含有する培地中では、野生株は良好な増殖を示すの
に対して、形質転換体は増殖しなかった。また形質転換
体をＹＰＤ培地中で非選択条件下で約２０世代培養した
後、乳酸非資化性およびＧ４１８耐性の形質について調
べたところ、それぞれの株は両形質を安定に１００％維
持していた。これらの結果は、形質転換体ゲノム中のＰ
ＥＰＣＫ遺伝子破壊によりこれらの株の乳酸資化性が失
われ、また遺伝子破壊が安定に維持されていることを示
唆した。
【００３７】５）キラー活性の確認：形質転換体および
野生株のキラー活性を、検定菌としてSaccharomyces ce
revisiae IFO0304株を使用して、緩衝化メチレンブルー
培地（ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、グ
ルコース２０ｇ／Ｌ、メチレンブルー０．３ｇ／Ｌ、寒
天２０ｇ／Ｌ、１／１０McIlvaine緩衝液（McIlvaine,
T.C., J. Biol. Chem. 49(1921)183））上で２５℃２日
間好気的に培養した後観察することにより確認した。図
７に示すように、形質転換体のキラー活性は宿主である
野生株と同程度に維持されていることが確認された。
野生株のキラー活性を、検定菌としてSaccharomyces ce
revisiae IFO0304株を使用して、緩衝化メチレンブルー
培地（ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、グ
ルコース２０ｇ／Ｌ、メチレンブルー０．３ｇ／Ｌ、寒
天２０ｇ／Ｌ、１／１０McIlvaine緩衝液（McIlvaine,
T.C., J. Biol. Chem. 49(1921)183））上で２５℃２日
間好気的に培養した後観察することにより確認した。図
７に示すように、形質転換体のキラー活性は宿主である
野生株と同程度に維持されていることが確認された。
【００３８】
【発明の効果】本発明に従えば、サイレージの好気的変
敗が好都合に防止され得る。キラー酵母の乳酸発酵が抑
制されるため、好気的変敗の原因となる野生酵母類の増
殖は、乳酸非資化性キラー酵母によって適切に抑制され
得る。キラー酵母に加えてラクトースをサイレージに添
加することにより、キラー酵母のキラー活性が強まり、
そして乳酸菌の活動が活性化され得る。
敗が好都合に防止され得る。キラー酵母の乳酸発酵が抑
制されるため、好気的変敗の原因となる野生酵母類の増
殖は、乳酸非資化性キラー酵母によって適切に抑制され
得る。キラー酵母に加えてラクトースをサイレージに添
加することにより、キラー酵母のキラー活性が強まり、
そして乳酸菌の活動が活性化され得る。
【図１】図１は、サイレージの好気的変敗およびキラー
酵母による防止を示す模式図である。
酵母による防止を示す模式図である。
【図２】図２は、好気条件における酵母の糖代謝を示す
模式図である。
模式図である。
【図３】図３は、遺伝子破壊用プラスミド中の挿入フラ
グメントの構造を示す模式図である。
グメントの構造を示す模式図である。
【図４】図４は、形質転換体および野生株ゲノムＤＮＡ
内での改変ＰＥＰＣＫ遺伝子の存在状態を調べるための
サザン解析を示す電気泳動写真である。
内での改変ＰＥＰＣＫ遺伝子の存在状態を調べるための
サザン解析を示す電気泳動写真である。
【図５】図５は、形質転換体および野生株染色体におけ
る改変ＰＥＰＣＫ遺伝子の存在位置を調べるためのサザ
ン解析を示す電気泳動写真である。
る改変ＰＥＰＣＫ遺伝子の存在位置を調べるためのサザ
ン解析を示す電気泳動写真である。
【図６】図６は、形質転換体および野生株のラクトース
および乳酸を炭素源とした場合の増殖を示すグラフであ
る。
および乳酸を炭素源とした場合の増殖を示すグラフであ
る。
【図７】図７は、形質転換体および野生株の検定菌に対
するキラー活性を示す生物形態写真である。
するキラー活性を示す生物形態写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (9)
- 【請求項１】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシキ
ナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子を欠損する乳酸非資化性キ
ラー酵母。 - 【請求項２】 前記キラー酵母が、K. lactisである、
請求項１に記載の乳酸非資化性キラー酵母。 - 【請求項３】 前記乳酸非資化性キラー酵母が遺伝子工
学的に得られる、請求項１に記載の乳酸非資化性キラー
酵母。 - 【請求項４】 乳酸非資化性キラー酵母を作製する方法
であって、以下の工程を包含する、方法：ＰＥＰＣＫ遺
伝子をクローニングする工程；ＰＥＰＣＫ遺伝子を改変
する工程；および該改変ＰＥＰＣＫ遺伝子をキラー酵母
に導入する工程。 - 【請求項５】 宿主に乳酸非資化性を与えるプラスミド
であって、改変されたＰＥＰＣＫ遺伝子を有する、プラ
スミド。 - 【請求項６】 前記改変されたＰＥＰＣＫ遺伝子が、該
ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢａｍＨＩ部位にマーカー遺伝子が
挿入されることにより得られる、請求項５に記載のプラ
スミド。 - 【請求項７】 前記改変されたＰＥＰＣＫ遺伝子が、該
ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢｇｌＩＩ断片が欠失されて、代わ
りにマーカー遺伝子が挿入されることにより得られる、
請求項５に記載のプラスミド。 - 【請求項８】 請求項１に記載のキラー酵母をサイレー
ジに添加する工程を包含する、サイレージの好気的変敗
を防止する方法。 - 【請求項９】 前記サイレージにさらにラクトースを添
加する工程を包含する、請求項８に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20509296A JP3870248B2 (ja) | 1996-08-02 | 1996-08-02 | 乳酸非資化性キラー酵母 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20509296A JP3870248B2 (ja) | 1996-08-02 | 1996-08-02 | 乳酸非資化性キラー酵母 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1042861A true JPH1042861A (ja) | 1998-02-17 |
| JP3870248B2 JP3870248B2 (ja) | 2007-01-17 |
Family
ID=16501302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20509296A Expired - Lifetime JP3870248B2 (ja) | 1996-08-02 | 1996-08-02 | 乳酸非資化性キラー酵母 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3870248B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001004291A1 (en) * | 1999-07-09 | 2001-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Non-lactate-assimilating yeast for improving aerobic stability of silage |
| WO2003067997A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Sa Majesté La Reine Du Chef Du Canada | Mixed starter culture and uses thereof |
| JP2017537980A (ja) * | 2014-11-24 | 2017-12-21 | ダンスター フェルマン アーゲー | 乾草防腐剤及び乾草の保存方法 |
-
1996
- 1996-08-02 JP JP20509296A patent/JP3870248B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001004291A1 (en) * | 1999-07-09 | 2001-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Non-lactate-assimilating yeast for improving aerobic stability of silage |
| WO2003067997A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Sa Majesté La Reine Du Chef Du Canada | Mixed starter culture and uses thereof |
| JP2017537980A (ja) * | 2014-11-24 | 2017-12-21 | ダンスター フェルマン アーゲー | 乾草防腐剤及び乾草の保存方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3870248B2 (ja) | 2007-01-17 |
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