JPH0771493B2 - 遺伝子破壊または遺伝子置換のプラスミドベクター、形質転換体及びその利用 - Google Patents
遺伝子破壊または遺伝子置換のプラスミドベクター、形質転換体及びその利用Info
- Publication number
- JPH0771493B2 JPH0771493B2 JP26809788A JP26809788A JPH0771493B2 JP H0771493 B2 JPH0771493 B2 JP H0771493B2 JP 26809788 A JP26809788 A JP 26809788A JP 26809788 A JP26809788 A JP 26809788A JP H0771493 B2 JPH0771493 B2 JP H0771493B2
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- JP
- Japan
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- gene
- plasmid vector
- arginase
- transformant
- urea
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- Alcoholic Beverages (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、アルギナーゼ遺伝子（CAR1）を破壊又は置換
することのできるプラスミドベクター、それらの形質転
換体及びその利用に関する。
することのできるプラスミドベクター、それらの形質転
換体及びその利用に関する。
本発明の形質転換体はアルギナーゼの欠失によって、尿
素の生成が抑制され、尿素から誘導されるカルバミン酸
エチルの生成をなくすことができるので、本発明の形質
転換体を用いることによって、カルバミン酸エチルを含
まない酒類等を製造することができるものである。
素の生成が抑制され、尿素から誘導されるカルバミン酸
エチルの生成をなくすことができるので、本発明の形質
転換体を用いることによって、カルバミン酸エチルを含
まない酒類等を製造することができるものである。
従って、本発明は酒類、アルコール、その他醸造食品の
製造に大きく貢献するものである。
製造に大きく貢献するものである。
（発明の背景及び従来技術とその問題点） 一般に、各種醸造食品（清酒、果実酒、ビール、ウイス
キー、ブランデー、醤油、味噌等）の製造醪中には、含
量にはかなりの差があるが、尿素が存在し、それがエタ
ノールと反応して発癌物質であるカルバミン酸エチル
（ウレタン、CAE）を生成させている。
キー、ブランデー、醤油、味噌等）の製造醪中には、含
量にはかなりの差があるが、尿素が存在し、それがエタ
ノールと反応して発癌物質であるカルバミン酸エチル
（ウレタン、CAE）を生成させている。
そして、尿素を減少させることにより、カルバミン酸エ
チルも同様に減少することから、尿素が最も主要な前駆
物質と考えられているのである。この尿素は、酵母のア
ルギナーゼ（EC 3.5.3.1）によりアルギニンがオルニチ
ンに分解される時に同時に生成される。
チルも同様に減少することから、尿素が最も主要な前駆
物質と考えられているのである。この尿素は、酵母のア
ルギナーゼ（EC 3.5.3.1）によりアルギニンがオルニチ
ンに分解される時に同時に生成される。
従来、尿素を減少させる方法としてはアルギニンの酵母
菌体への取込みに関与するアルギニン透過酵素の欠失し
た変異株（アルギニンのアナログであるカナバニンに対
して耐性が生じる）を用いることにより、清酒中の尿素
量を約半量まで減少させる方法がとられてきた。
菌体への取込みに関与するアルギニン透過酵素の欠失し
た変異株（アルギニンのアナログであるカナバニンに対
して耐性が生じる）を用いることにより、清酒中の尿素
量を約半量まで減少させる方法がとられてきた。
しかし、この変異株は、野生株に比較して発酵が鈍いた
めに、他の酵母に汚染されやすく、かつ、リンゴ酸の生
成量が多いためやや酸度の多い清酒になるという問題が
ある。
めに、他の酵母に汚染されやすく、かつ、リンゴ酸の生
成量が多いためやや酸度の多い清酒になるという問題が
ある。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、酒類中の尿素が、酵母のアルギナーゼの
作用で生成することから、アルギナーゼ遺伝子（CAR1）
を破壊又は他の遺伝子で置換して尿素生成をなくし、か
つ、発酵速度及び酸生成能が親株と変らない形質転換体
を開発することを目的として、鋭意研究を行った。
作用で生成することから、アルギナーゼ遺伝子（CAR1）
を破壊又は他の遺伝子で置換して尿素生成をなくし、か
つ、発酵速度及び酸生成能が親株と変らない形質転換体
を開発することを目的として、鋭意研究を行った。
まず、本発明者らは、アルギナーゼ遺伝子の破壊又は置
換に注目し、サッカロマイセス・セレビシアエのゲノム
DNA制限酵素断片から、アルギナーゼをコードするDNA断
片をクローン化し、サッカロマイセス・セレビシアエの
宿主・ベクター系に連結し、得られたプラスミドベクタ
ーを移入することにより、アルギナーゼ遺伝子（CAR1）
が破壊又は置換される形質転換体が得られることを見出
したのである。
換に注目し、サッカロマイセス・セレビシアエのゲノム
DNA制限酵素断片から、アルギナーゼをコードするDNA断
片をクローン化し、サッカロマイセス・セレビシアエの
宿主・ベクター系に連結し、得られたプラスミドベクタ
ーを移入することにより、アルギナーゼ遺伝子（CAR1）
が破壊又は置換される形質転換体が得られることを見出
したのである。
また、ここに得られた形質転換体を用いて、アルコール
発酵を行ったところ、尿素の生成は全くみられず、発酵
速度は親株と変らないことを認め、本発明を完成するに
至った。
発酵を行ったところ、尿素の生成は全くみられず、発酵
速度は親株と変らないことを認め、本発明を完成するに
至った。
本発明は、アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプ
ラスミドベクターに関するものであり、また、アルギナ
ーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプラスミドベクターに
関するものである。
ラスミドベクターに関するものであり、また、アルギナ
ーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプラスミドベクターに
関するものである。
また、本発明は、アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のた
めのプラスミドベクターを作製し、これを直鎖状とし、
サッカロマイセス・セレビシアエに移入することによっ
て得られる尿素生成のない形質転換体に関するものであ
り、また、アルギナーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプ
ラスミドベクターを作製し、これを直鎖状とし、サッカ
ロマイセス・セレビシアエに移入することによって得ら
れる尿素生成のない形質転換体に関するものである。
めのプラスミドベクターを作製し、これを直鎖状とし、
サッカロマイセス・セレビシアエに移入することによっ
て得られる尿素生成のない形質転換体に関するものであ
り、また、アルギナーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプ
ラスミドベクターを作製し、これを直鎖状とし、サッカ
ロマイセス・セレビシアエに移入することによって得ら
れる尿素生成のない形質転換体に関するものである。
そして、本発明は、このようにして得られた形質転換体
を用いることを特徴とする酒類、アルコール等の製造法
に関するものである。
を用いることを特徴とする酒類、アルコール等の製造法
に関するものである。
（詳細な説明） 本発明に用いたゲノムDNAの供与体は、サッカロマイセ
ス・セレビシアエであり具体的には協会７号酵母であ
る。
ス・セレビシアエであり具体的には協会７号酵母であ
る。
本菌体から染色体DNAを抽出するには、たとえばJ.R.Dil
lon・A.Nasin・E.R.Nestmann編「組換えDNA実験」190頁
記載された、サッカロマイセス・セレビシアエの全DNA
の抽出法に従って行った。
lon・A.Nasin・E.R.Nestmann編「組換えDNA実験」190頁
記載された、サッカロマイセス・セレビシアエの全DNA
の抽出法に従って行った。
次に得られたDNAをBamH Iで部分分解した後、細菌アル
カリフォスファターゼで処理しリン酸を除去する。
カリフォスファターゼで処理しリン酸を除去する。
同じ接着末端を生じさせる制限酵素で処理したファージ
DNAに上記で得られたDNA断片を挿入して染色体ジーンラ
イブラリーを作製する。当該ファージとしてはEMBL3
（J.Mol.Biol.Vol 170,827〜842（1983））が用いられ
る。上記で得られた染色体ジーンライブラリーからの当
該遺伝子の単離に当っては、サッカロマイセス・セレビ
シアエのアルギナーゼ遺伝子のDNA配列（J.Bacteriolog
y,Vol 160,1078〜1087（1984））に基づいて合成したDN
Aオリゴマーを作製し、それをプローブに用いてプラー
クハイブリダイゼーションを行い、サッカロマイセス・
セレビシアエのアルギナーゼ遺伝子（CAR1）のDNAをク
ローニングする。
DNAに上記で得られたDNA断片を挿入して染色体ジーンラ
イブラリーを作製する。当該ファージとしてはEMBL3
（J.Mol.Biol.Vol 170,827〜842（1983））が用いられ
る。上記で得られた染色体ジーンライブラリーからの当
該遺伝子の単離に当っては、サッカロマイセス・セレビ
シアエのアルギナーゼ遺伝子のDNA配列（J.Bacteriolog
y,Vol 160,1078〜1087（1984））に基づいて合成したDN
Aオリゴマーを作製し、それをプローブに用いてプラー
クハイブリダイゼーションを行い、サッカロマイセス・
セレビシアエのアルギナーゼ遺伝子（CAR1）のDNAをク
ローニングする。
遺伝子破壊のためのプラスミドの作製は次にようにして
行う。
行う。
即ち、第１図に示されるように、アルギナーゼ遺伝子由
来の大きさが0.9kbのHind III−Pst Iフラグメントを、
大きさが3.1KbpのE.coli用ベクターpUC119（Gene,Vol.3
3,103〜119（1985））のHind III−Pst I部位に連結し
てプラスミドpHP−１（大きさ4.0Kbp）を作製する。こ
のpHP−１のHind III部位に酵母用プラスミドベクターY
Rp7（Gene,Vol.10,157〜166（1980））由来の大きさが
0.8KbpのTRP1を含むEcoRI−Pst Iフラグメントを組み込
んでYIp型プラスミドpEPH−２（大きさ4.8Kbp）を作製
する。
来の大きさが0.9kbのHind III−Pst Iフラグメントを、
大きさが3.1KbpのE.coli用ベクターpUC119（Gene,Vol.3
3,103〜119（1985））のHind III−Pst I部位に連結し
てプラスミドpHP−１（大きさ4.0Kbp）を作製する。こ
のpHP−１のHind III部位に酵母用プラスミドベクターY
Rp7（Gene,Vol.10,157〜166（1980））由来の大きさが
0.8KbpのTRP1を含むEcoRI−Pst Iフラグメントを組み込
んでYIp型プラスミドpEPH−２（大きさ4.8Kbp）を作製
する。
この方法の特徴は、まず破壊される遺伝子（アルギナー
ゼ）と共通な配列を持ち、かつその遺伝子上に存在する
mRNAの開始コドンと終止コドンを除いたプラスミドを作
製する。このプラスミドは、共通配列上の特異な制限酵
素部位で切断したのち、直鎖状のDNAにして形質転換に
用いられる。通常このプラスミドには選択のためのマー
カーとしてサッカロマイセス・セレビシアエのトリプト
ファン要求性を相補する遺伝子TRP1がつないであり、形
質転換体、即ち遺伝子破壊体をトリプトファンを含まな
い平板培地上で選択できるようになっている。
ゼ）と共通な配列を持ち、かつその遺伝子上に存在する
mRNAの開始コドンと終止コドンを除いたプラスミドを作
製する。このプラスミドは、共通配列上の特異な制限酵
素部位で切断したのち、直鎖状のDNAにして形質転換に
用いられる。通常このプラスミドには選択のためのマー
カーとしてサッカロマイセス・セレビシアエのトリプト
ファン要求性を相補する遺伝子TRP1がつないであり、形
質転換体、即ち遺伝子破壊体をトリプトファンを含まな
い平板培地上で選択できるようになっている。
遺伝子置換のためのプラスミドの作製は次のようにして
行う。
行う。
即ち、第２図に示されるように、pUC119のBamH I部位に
アルギナーゼ遺伝子を含む5.6Kbpのフラグメントを連結
して作製されたプラスミドベクターpCAR112を第２図で
示されるように、Sac IIで切断し、得られたSac II切断
部位を、ベクターYRp7のTRP1 geneをコードする0.8Kbp
のEcoRI−Pst Iフラグメントと連結してpREP−１を作製
する。
アルギナーゼ遺伝子を含む5.6Kbpのフラグメントを連結
して作製されたプラスミドベクターpCAR112を第２図で
示されるように、Sac IIで切断し、得られたSac II切断
部位を、ベクターYRp7のTRP1 geneをコードする0.8Kbp
のEcoRI−Pst Iフラグメントと連結してpREP−１を作製
する。
このプラスミドは共通配列上の特異な制限酵素部位で切
断し、直鎖状のDNAにして形質転換し、遺伝子置換を行
なわせるものである。
断し、直鎖状のDNAにして形質転換し、遺伝子置換を行
なわせるものである。
なお、アルギナーゼ遺伝子が破壊又は置換されたかどう
かの判定は、次の方法でアルギナーゼ活性を測定し、活
性の有無によって行う。
かの判定は、次の方法でアルギナーゼ活性を測定し、活
性の有無によって行う。
形質転換株及び親株をYEPD培地（１％酵母エキス、２％
ペプトン、２％グルコース）中で30℃、16時間培養後集
菌洗浄し、25mMグリシン−苛性ソーダ緩衝液（pH9.5）
に懸濁し、ガラスビーズで破壊する。
ペプトン、２％グルコース）中で30℃、16時間培養後集
菌洗浄し、25mMグリシン−苛性ソーダ緩衝液（pH9.5）
に懸濁し、ガラスビーズで破壊する。
このホモジネートの15000rpm、10分間の遠心上清液を酵
素液とし、アルギニンを基質として反応させ、生成する
尿素を東洋醸造（株）製尿素キットで定量し、アルギナ
ーゼ活性とした。
素液とし、アルギニンを基質として反応させ、生成する
尿素を東洋醸造（株）製尿素キットで定量し、アルギナ
ーゼ活性とした。
次に、この形質転換体を用いて、常法どおり、清酒や果
実酒、ビール、しょうちゅう、ウイスキー等の酒類を製
造することにより、尿素を含まない酒類を製造でき、ひ
いてはカルバミン酸エチルの生成しない酒類の製造が可
能となる。
実酒、ビール、しょうちゅう、ウイスキー等の酒類を製
造することにより、尿素を含まない酒類を製造でき、ひ
いてはカルバミン酸エチルの生成しない酒類の製造が可
能となる。
実施例１ 染色体DNAのジーンライブラリーの作製； サッカロマイセス・セレビシアエ、協会７号のスラント
より１白金耳をYEPD培地5ml中で対数増殖期まで増殖さ
せ、遠心によって菌体を集菌した。1.0Mソルビトール1m
l中に懸濁後、小型遠心機で30〜60秒遠心してペレット
にし、50mMリン酸カリウム（pH7.5）、14mM ２−メル
カプトエタノール、1Mソルビトールの溶液0.5mlに再懸
濁した。これに、ザイモリアーゼ60000 500μｇを加え3
0℃、30分間培養し、プロトプラスト化した。プロトプ
ラストを遠心し、50mM EDTA（pH8.5）0.5mlに再懸濁
し、10％SDS 20μｌとジエチルオキシジホルメート１μ
ｌを加えた。冷却しながら5M酢酸カリウム溶液100μｌ
を加え、更に60分間氷水中につけた。得られた溶菌液を
15000rpm、10分間冷却遠心後上清を取得し、その上清を
等量のフェノールで２回、続いて等量のクロロホルムで
２回処理して夾雑するタンパク質を除去後、２容の冷エ
タノールを加え核酸分を沈澱させた。この沈澱を凍結乾
燥後、TE溶液に溶解し、DNA溶液とした。得られたDNAを
制限酵素BamH Iで部分分解し、アルカリフォスファター
ゼで処理後、λEMBL3−BamH Iアーム（東洋紡（株））
にT4リガーゼを用いて凍結し、得られたファージDNAをi
n virtoパッケージングキット（ギガパックゴールド
（東洋紡（株）販売））を用いてパッケージング後E.co
li P2392にトランスフェクションし、染色体DNAのジー
ンライブラリーとした。
より１白金耳をYEPD培地5ml中で対数増殖期まで増殖さ
せ、遠心によって菌体を集菌した。1.0Mソルビトール1m
l中に懸濁後、小型遠心機で30〜60秒遠心してペレット
にし、50mMリン酸カリウム（pH7.5）、14mM ２−メル
カプトエタノール、1Mソルビトールの溶液0.5mlに再懸
濁した。これに、ザイモリアーゼ60000 500μｇを加え3
0℃、30分間培養し、プロトプラスト化した。プロトプ
ラストを遠心し、50mM EDTA（pH8.5）0.5mlに再懸濁
し、10％SDS 20μｌとジエチルオキシジホルメート１μ
ｌを加えた。冷却しながら5M酢酸カリウム溶液100μｌ
を加え、更に60分間氷水中につけた。得られた溶菌液を
15000rpm、10分間冷却遠心後上清を取得し、その上清を
等量のフェノールで２回、続いて等量のクロロホルムで
２回処理して夾雑するタンパク質を除去後、２容の冷エ
タノールを加え核酸分を沈澱させた。この沈澱を凍結乾
燥後、TE溶液に溶解し、DNA溶液とした。得られたDNAを
制限酵素BamH Iで部分分解し、アルカリフォスファター
ゼで処理後、λEMBL3−BamH Iアーム（東洋紡（株））
にT4リガーゼを用いて凍結し、得られたファージDNAをi
n virtoパッケージングキット（ギガパックゴールド
（東洋紡（株）販売））を用いてパッケージング後E.co
li P2392にトランスフェクションし、染色体DNAのジー
ンライブラリーとした。
実施例２ 染色体DNAジーンライブラリーからのサッカ
ロマイセス・セレビシアエのアルギネーゼ遺伝子（CAR
1）のクローニング； 実施例１に記載の染色体DNAのジーンライブラリーに保
存されたファージのプラーク形成後、プラークハイブリ
ダイゼーションによりアルギナーゼ遺伝子を含むクロー
ンの選択を行った。この一連の操作は常法（Molecular
Cloning,p63〜67,Cold Spring Harbor Laboratory（198
2））によった。プラークハイブリダイゼーションに用
いた２つのプローブは次の配列をもつ合成オリゴマー
（32〜35mer）を32Pで放射能標識したものである。
ロマイセス・セレビシアエのアルギネーゼ遺伝子（CAR
1）のクローニング； 実施例１に記載の染色体DNAのジーンライブラリーに保
存されたファージのプラーク形成後、プラークハイブリ
ダイゼーションによりアルギナーゼ遺伝子を含むクロー
ンの選択を行った。この一連の操作は常法（Molecular
Cloning,p63〜67,Cold Spring Harbor Laboratory（198
2））によった。プラークハイブリダイゼーションに用
いた２つのプローブは次の配列をもつ合成オリゴマー
（32〜35mer）を32Pで放射能標識したものである。
NR−1 5′TGGACAAATACCCCGATGCTGGTCTTTTATGG3′ NR−2 5′ATGTAACCCTGATCTGGCTATTCATGATATCCATG3′ 約20,000個のプラークよりNR−１、NR−２プローブのど
ちらにもハイブリダイゼーションする１個のクローンを
選択できた。
ちらにもハイブリダイゼーションする１個のクローンを
選択できた。
これらのクローンの中に挿入されているサッカロマイセ
ス・セレビシアエ協会７号由来のDNA断片をBamH Iで完
全消化したところ、２つのプローブでハイブリダイゼー
ションする5.6kbのDNA断片を得た。このDNA断片をE.col
iのプラスミドベクターpUC119に連結し、サブクローンp
CAR 112を得て、これから当該挿入断片の制限酵素切断
地図を作製した。（第２図のpCAR 112）結果は、Sumrad
aら（J.Bacteriology,Vol 160,1078〜1087（1984））と
同じであった。
ス・セレビシアエ協会７号由来のDNA断片をBamH Iで完
全消化したところ、２つのプローブでハイブリダイゼー
ションする5.6kbのDNA断片を得た。このDNA断片をE.col
iのプラスミドベクターpUC119に連結し、サブクローンp
CAR 112を得て、これから当該挿入断片の制限酵素切断
地図を作製した。（第２図のpCAR 112）結果は、Sumrad
aら（J.Bacteriology,Vol 160,1078〜1087（1984））と
同じであった。
実施例３ アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプ
ラスミドベクターの作製； 実施例２に記載のプラスミドベクターpCAR 112から制限
酵素Hind IIIとPst Iで切り出されるCAR1 gene由来の0.
9KbpのDNA断片をpUC119にT4DNAリガーゼを用いて連結
し、大きさが4.0KbpからなるpHP−１プラスミドベクタ
ーを作製した。
ラスミドベクターの作製； 実施例２に記載のプラスミドベクターpCAR 112から制限
酵素Hind IIIとPst Iで切り出されるCAR1 gene由来の0.
9KbpのDNA断片をpUC119にT4DNAリガーゼを用いて連結
し、大きさが4.0KbpからなるpHP−１プラスミドベクタ
ーを作製した。
このpHP−１に選択マーカーを付与するため、Hind III
部位を常法（Molecular Cloning,p395,Cold Spring Har
bor Laboratory（1982））によって平滑末端にしたもの
へ、酵母用プラスミドベクターYRp7由来の大きさが0.8K
bpのEcoR I−Pst Iフラグメントを切り出して同様に平
滑末端としたものをT4DNAリガーゼを用いて連結して、Y
Ip型プラスミドpEPH−２（大きさ4.8Kbp）を作製した。
（第１図） 実施例４ アルギナーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプ
ラスミドベクターの作製； 実施例２に記載のプラスミドベクターpCAR 112をCAR1遺
伝子上の制限酵素Sac II切断部位で切断した。これに選
択マーカーを付与するために、ベクターYRp7よりTRP1 g
eneをコードする0.8KbpのEcoR I−Pst Iフラグメントを
制限酵素で切り出し、単離した。次に、上記のベクター
およびフラグメントに各々存在する接着末端をT4DNAポ
リメラーゼを用いる常法（Molecular Cloning,p395,Col
d Spring Harbor Laboratory（1982））により平滑末端
とした。後に、両者をT4DNAリガーゼを用いて連結し、
大きさが9.5Kbpからなるアルギナーゼ遺伝子置換用プラ
スミドベクターpREP−１を作製した。（第２図） 実施例５ アルギナーゼを生産しないサッカロマイセス
・セレビシアエの作製； アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊用ベクターpEPH−２あ
るいは遺伝子置換用ベクターpREP−１を用い、サッカロ
マイセス・セレビシアエYNN27（α,trp1 ura3,gal1）及
び892（a,trp1,asp5,mak12）の２株の形質転換をItoら
の方法（J.Bacteriology,vol 153,163〜（1983））に準
じて行った。
部位を常法（Molecular Cloning,p395,Cold Spring Har
bor Laboratory（1982））によって平滑末端にしたもの
へ、酵母用プラスミドベクターYRp7由来の大きさが0.8K
bpのEcoR I−Pst Iフラグメントを切り出して同様に平
滑末端としたものをT4DNAリガーゼを用いて連結して、Y
Ip型プラスミドpEPH−２（大きさ4.8Kbp）を作製した。
（第１図） 実施例４ アルギナーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプ
ラスミドベクターの作製； 実施例２に記載のプラスミドベクターpCAR 112をCAR1遺
伝子上の制限酵素Sac II切断部位で切断した。これに選
択マーカーを付与するために、ベクターYRp7よりTRP1 g
eneをコードする0.8KbpのEcoR I−Pst Iフラグメントを
制限酵素で切り出し、単離した。次に、上記のベクター
およびフラグメントに各々存在する接着末端をT4DNAポ
リメラーゼを用いる常法（Molecular Cloning,p395,Col
d Spring Harbor Laboratory（1982））により平滑末端
とした。後に、両者をT4DNAリガーゼを用いて連結し、
大きさが9.5Kbpからなるアルギナーゼ遺伝子置換用プラ
スミドベクターpREP−１を作製した。（第２図） 実施例５ アルギナーゼを生産しないサッカロマイセス
・セレビシアエの作製； アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊用ベクターpEPH−２あ
るいは遺伝子置換用ベクターpREP−１を用い、サッカロ
マイセス・セレビシアエYNN27（α,trp1 ura3,gal1）及
び892（a,trp1,asp5,mak12）の２株の形質転換をItoら
の方法（J.Bacteriology,vol 153,163〜（1983））に準
じて行った。
つまり、酵母YNN27及び892を各々を100mlのYPD培地（１
％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、pH
5.3）で30℃で振とう培養し、対数増殖期に遠心によっ
て集菌した。TE緩衝液で洗浄後同じ緩衝液に２×108セ
ル/mlの濃度で懸濁した。この0.5mlを小試験管に移し、
等容量の0.2M酢酸リチウム溶液を添加し、１時間30℃で
振とうした。この中から0.1mlを1.8mlのエッペンドルフ
チューブに移し、プラスミドベクターpEPH−２あるいは
pREP−１を制限酵素Bgl IIで処理し直鎖状にしたDNA溶
液（670μg/ml）15μｌを加え30℃、30分間静置培養し
た。
％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、pH
5.3）で30℃で振とう培養し、対数増殖期に遠心によっ
て集菌した。TE緩衝液で洗浄後同じ緩衝液に２×108セ
ル/mlの濃度で懸濁した。この0.5mlを小試験管に移し、
等容量の0.2M酢酸リチウム溶液を添加し、１時間30℃で
振とうした。この中から0.1mlを1.8mlのエッペンドルフ
チューブに移し、プラスミドベクターpEPH−２あるいは
pREP−１を制限酵素Bgl IIで処理し直鎖状にしたDNA溶
液（670μg/ml）15μｌを加え30℃、30分間静置培養し
た。
次に殺菌した70％PEG−4000 115μｌを加え、よく混合
した。30℃で１時間静置した後、エッペンドルフチュー
ブを42℃の恒温水中で５分間静置後、菌体を直ちに室温
迄冷却し、室温で殺菌水で洗浄し、形質転換株を得た。
これらの中からまず、Trp+形質転換体を選択した。YNB
−Ｔ培地（２％グルコース、0.67％ナイトロゲンベース
W/OAA、0.002％ウラシル、1.5％寒天）でTrpなしで生育
する株が各々50〜100株得られた。
した。30℃で１時間静置した後、エッペンドルフチュー
ブを42℃の恒温水中で５分間静置後、菌体を直ちに室温
迄冷却し、室温で殺菌水で洗浄し、形質転換株を得た。
これらの中からまず、Trp+形質転換体を選択した。YNB
−Ｔ培地（２％グルコース、0.67％ナイトロゲンベース
W/OAA、0.002％ウラシル、1.5％寒天）でTrpなしで生育
する株が各々50〜100株得られた。
次に、Trp+菌株の中から、アルギナーゼ欠損株として、
アルギニンを唯一の窒素源とする培地（２％グルコー
ス、0.67％ナイトロゲンフリーカーボンベース、0.002
％ウラシル、0.5％アルギニン、1.5％寒天）で生育でき
ず、オルニチンを唯一の窒素源とする培地（２％グルコ
ール、0.67％ナイトロゲンフリーカーボンベース、0.00
2％ウラシル、0.5％オルニチン、1.5％寒天）で生育で
きる株として、YNN27からの形質転換体３株（Ｕ−1,2,
3）を得た。
アルギニンを唯一の窒素源とする培地（２％グルコー
ス、0.67％ナイトロゲンフリーカーボンベース、0.002
％ウラシル、0.5％アルギニン、1.5％寒天）で生育でき
ず、オルニチンを唯一の窒素源とする培地（２％グルコ
ール、0.67％ナイトロゲンフリーカーボンベース、0.00
2％ウラシル、0.5％オルニチン、1.5％寒天）で生育で
きる株として、YNN27からの形質転換体３株（Ｕ−1,2,
3）を得た。
アルギナーゼ欠損株Ｕ−３と親株のアルギナーゼ活性を
第３図に示したが、Ｕ−３株はアルギナーゼ活性が認め
られないことから、アルギナーゼ遺伝子の破壊株である
ことが確認された。
第３図に示したが、Ｕ−３株はアルギナーゼ活性が認め
られないことから、アルギナーゼ遺伝子の破壊株である
ことが確認された。
Ｕ−３株はFERM P−10357として微工研に寄託されてい
る。
る。
実施例６ 形質転換株による酒類の醸造； 形質転換株Ｕ−3 FERM P−10357をYPAD培地5mlで30℃、
１夜振とう培養後、集菌洗浄し、α米16g、麹4g、水40m
lおよび加工水（KH2PO4 1.3g、NaCl 0.25g及び醸造用乳
酸6mlを水で100mlとしたもの）0.25mlと混合し、100ml
容三角フラスコに入れ25℃でアルコール発酵を行った。
１夜振とう培養後、集菌洗浄し、α米16g、麹4g、水40m
lおよび加工水（KH2PO4 1.3g、NaCl 0.25g及び醸造用乳
酸6mlを水で100mlとしたもの）0.25mlと混合し、100ml
容三角フラスコに入れ25℃でアルコール発酵を行った。
アルコール発酵経過をCO2の発生による重量の減少で測
定し、アルギナーゼによるアルギニンからの尿素の生成
経過を東洋醸造（株）製尿素測定キットで測定し、結果
を第４図に示した。
定し、アルギナーゼによるアルギニンからの尿素の生成
経過を東洋醸造（株）製尿素測定キットで測定し、結果
を第４図に示した。
この結果、CO2減少による発酵経過は親株とＵ−３の間
でほぼ同一であった。一方、尿素の生成は、親株が４日
目以後直線的に増加を示すのに対し、Ｕ−３株では、最
後まで尿素の生成はみられず、尿素を含まない酒類の製
造が可能であった。
でほぼ同一であった。一方、尿素の生成は、親株が４日
目以後直線的に増加を示すのに対し、Ｕ−３株では、最
後まで尿素の生成はみられず、尿素を含まない酒類の製
造が可能であった。
第１図はアルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプラ
スミドベクターの作成説明図で（図中、H;Hind III、G;
Bgl II、P;Pst I、E;EcoR I）、第２図はアルギナーゼ
遺伝子の遺伝子置換のためのプラスミドベクターの作成
説明図で（図中、H;Hind III、G;Bgl II、P;Pst I、E;E
coR I、S;Sal I、H/S;HindIII及びSal I部位を遺伝子工
学の慣用手段によって非接着末端とした後に連結した部
位、S/E;Sal I及びEcoR I部位を遺伝子工学の慣用手段
によって非接着末端とした後に連結した部位）、第３図
は親株と形質転換体のアルギナーゼ活性を示す図で、第
４図は親株と形質転換体のアルコール発酵の経過図であ
る。
スミドベクターの作成説明図で（図中、H;Hind III、G;
Bgl II、P;Pst I、E;EcoR I）、第２図はアルギナーゼ
遺伝子の遺伝子置換のためのプラスミドベクターの作成
説明図で（図中、H;Hind III、G;Bgl II、P;Pst I、E;E
coR I、S;Sal I、H/S;HindIII及びSal I部位を遺伝子工
学の慣用手段によって非接着末端とした後に連結した部
位、S/E;Sal I及びEcoR I部位を遺伝子工学の慣用手段
によって非接着末端とした後に連結した部位）、第３図
は親株と形質転換体のアルギナーゼ活性を示す図で、第
４図は親株と形質転換体のアルコール発酵の経過図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 五味 勝也 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 原 昌道 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 吉沢 淑 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 水津 哲義 東京都北区滝野川１丁目54番18号 株式会 社醸造資源研究所内 (72)発明者 田村 學造 東京都北区滝野川１丁目54番18号 株式会 社醸造資源研究所内 (56)参考文献 特開 昭63−164876（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開286303（ＥＰ，Ａ) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，1984〔160〕 Ｐ．1078−1087
Claims (5)
- 【請求項１】下記に示す、サッカロマイセス・セレビシ
アエのアルギナーゼ遺伝子を遺伝子破壊するための、大
きさが4.8KbpのプラスミドベクターpEPH−２。 - 【請求項２】下記に示す、サッカロマイセス・セレビシ
アエのアルギナーゼ遺伝子を遺伝子置換するための、大
きさが9.5KbpのプラスミドベクターpREP−１。 - 【請求項３】特許請求の範囲第１項記載のプラスミドベ
クターpEPH−２を直鎖状とし、サッカロマイセス・セレ
ビシアエに移入することによって得られる尿素生成のな
い形質転換体。 - 【請求項４】特許請求の範囲第２項記載のプラスミドベ
クターpREP−１を直鎖状とし、サッカロマイセス・セレ
ビシアエに移入することによって得られる尿素生成のな
い形質転換体。 - 【請求項５】特許請求の範囲第３項又は第４項で得られ
た形質転換体を用いることを特徴とする酒類、アルコー
ル等の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26809788A JPH0771493B2 (ja) | 1988-10-26 | 1988-10-26 | 遺伝子破壊または遺伝子置換のプラスミドベクター、形質転換体及びその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26809788A JPH0771493B2 (ja) | 1988-10-26 | 1988-10-26 | 遺伝子破壊または遺伝子置換のプラスミドベクター、形質転換体及びその利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02117385A JPH02117385A (ja) | 1990-05-01 |
| JPH0771493B2 true JPH0771493B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=17453851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26809788A Expired - Lifetime JPH0771493B2 (ja) | 1988-10-26 | 1988-10-26 | 遺伝子破壊または遺伝子置換のプラスミドベクター、形質転換体及びその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0771493B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105273918A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-01-27 | 江南大学 | 一种可降低黄酒发酵中氨基甲酸乙酯积累的方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0697993B2 (ja) * | 1990-05-15 | 1994-12-07 | 国税庁長官 | アルギナーゼ遺伝子欠損株選択培地とそれを利用した尿素非生産性酵母の育種及びそれを用いる酒類の製造法 |
| JP4580055B2 (ja) * | 2000-03-02 | 2010-11-10 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | アミノ酸高蓄積実用パン酵母 |
| US9469863B2 (en) | 2007-11-30 | 2016-10-18 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Aminoglycoside antibiotics, process for producing the same, and pharmaceutical use thereof |
| JP5970196B2 (ja) * | 2012-02-06 | 2016-08-17 | 月桂冠株式会社 | 高酸型酵母の育種方法、及び該高酸型酵母を用いたアルコール飲料の製造方法 |
| CN105385613B (zh) * | 2015-12-21 | 2018-08-28 | 绍兴国家黄酒工程技术研究中心有限公司 | 一株低产尿素黄酒酵母菌及其应用 |
| CN105861348B (zh) * | 2016-06-14 | 2019-04-23 | 江南大学 | 一株低产尿素的酿酒酵母及其在食品生产中的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63164876A (ja) * | 1986-12-26 | 1988-07-08 | Tax Adm Agency | 清酒醸造法 |
| JPS6427477A (en) * | 1987-04-01 | 1989-01-30 | Takeda Chemical Industries Ltd | Dna and use thereof |
-
1988
- 1988-10-26 JP JP26809788A patent/JPH0771493B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８４〔１６０〕Ｐ．１０７８−１０８７ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105273918A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-01-27 | 江南大学 | 一种可降低黄酒发酵中氨基甲酸乙酯积累的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02117385A (ja) | 1990-05-01 |
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