JPH104979A - 細胞中に遺伝子を導入するための標的細胞に特異的なベクター、そのベクターを含んでなる医薬、およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子治療用ベクターの提供。 【解決手段】 生物の細胞中に少なくとも１つの遺伝子
を挿入するための、標的細胞に特異的なベクターであっ
て、ａ）挿入すべき遺伝子のための非ウイルス性キャリ
ヤー、ｂ）所望の標的細胞に特異的に結合し得るリガン
ド、ｃ）標的細胞の細胞質中にベクターを浸透させるた
めの融合タンパク質、およびｄ）導入すべき遺伝子を含
むベクター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】本発明は、特に遺伝子治療に使用され
る、標的細胞に特異的なベクター、その様な標的細胞に
特異的なベクターを含んでなる医薬、および遺伝子治療
におけるこれらのベクターの使用に関する。遺伝子治療
は、生物の細胞中に異遺伝子を挿入し、これらの細胞中
の欠陥遺伝子をスイッチ−オフし、欠陥遺伝子を無傷の
遺伝子で置き換えるか、あるいはこれらの細胞に予防的
または治療的効果を有するタンパク質を形成させること
を目的とする。

【０００２】成熟核系に使用でき、ウイルスを基にして
構築されたベクターは、先行技術で公知である。ウイル
スは、分化された系を発達させ、それを使用して外殻タ
ンパク質により細胞に特異的に結合し、エンドソーム中
に取り入れられた後、これらのエンドソームの膜に浸透
(penetrate) することができる。したがって、ウイルス
は、細胞中に異遺伝子を挿入するためのキャリヤーとし
て使用されている。この技術（その様々な変形におい
て）およびこの目的に使用されるウイルスは、すでに詳
細に記載されている［Hodgson, Bio/Technology 3, 222
(1995)およびJolly, Cancer Gene Therapy 1, 51(1994)
参照］。

【０００３】この技術の原理は、ウイルスのベクターが
作製される様に、ウイルス遺伝子の一部が所望の異遺伝
子により置き換えられることである。原則的に、この操
作のために、ウイルスベクターは最早複製することがで
きない。しかし、これらのウイルスのベクターを複製で
きるためには、ウイルスの外殻タンパク質をコードし、
これらのウイルス遺伝子の発現を調整するすべての遺伝
子が存在しなければならない。しかし、ウイルスのベク
ターは、特に人間に使用した場合に、問題を起こすこと
が分かっている。同じ品種の野生型ウイルスとの組換え
の危険性があり、その結果、病原性ウイルスが生ずるか
も知れない。その上、ウイルスの外殻タンパク質は、受
容体中で免疫反応を引き起こすことがある。ウイルスの
ベクターは、細胞中で、対応する野生型ウイルスが取る
のと同じ感染経路を取るので、異遺伝子が宿主染色体の
中に組み込まれる結果、宿主遺伝子が突然変異する危険
性がある（休止遺伝子の活性化、活性遺伝子の破壊）。

【０００４】ウイルスベクターのもう一つの欠点は、ウ
イルスの幾何学的構造が、それらの、異遺伝子を受け入
れる能力を制限することである。ウイルスベクターのこ
れらの制限および危険性のために、初期の段階で、細胞
中に遺伝子を挿入するための、ウイルスに無関係な方法
を見出だす試みがなされた。これらの方法の原理は、遺
伝子が細胞により取り込まれ、エンドソームの膜または
リソソームの膜を通して細胞質の中に浸透できる様に、
負に帯電した細胞膜を負に帯電した遺伝子と融合させる
ことである。細胞膜を変化させるための物理的方法（遺
伝子粒子の包囲、細胞膜に対する浸透、熱的または電気
的改変）または化学的方法（有機溶剤、洗剤、酵素）と
は別に、遺伝子と細胞膜の融合を仲介する遺伝子キャリ
ヤーが開発されている。これらのキャリヤーには、リポ
ソーム、陽イオン系ポリペプチド、デンドリメリック(d
endrimeric) ポリマーまたは陽イオン系両親媒性物質が
含まれる［Behr, Bioconjugate Chem. 5, 382(1994);Af
ione et al.,Clin. Pharmakokinet. 28, 181(1995)お
よびFelgner, Adv. Drug Delivery Rev. 5, 163(1990)
参照］。

【０００５】臭化ジオレオイルオキシプロピルトリメチ
ルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）の、ジオレオイルホスフ
ァチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはリポポリ
アミンとの混合物、の様な合成陽イオン系両親媒性物質
が遺伝子導入で非常に重要になっている。これらの陽イ
オン系両親媒性物質またはそれらの物質混合物の作用機
構は、過剰の陽イオン電荷のために、どちらも負に帯電
した遺伝子と複合化し、陰イオン性の細胞表面に結合す
ることである。これらのキャリヤーの両親媒性が、細胞
膜との融合を引き起こす。

【０００６】達成可能なトランスフェクション率は、ウ
イルスのベクターを使用した場合よりも著しく低い。さ
らに、非ウイルスキャリヤーおよびＤＮＡからなる複合
体上の過剰の陽イオン電荷は、生体内に投与した後、陰
イオン系の生物学的物質（タンパク質、ヘパリン等）に
より中和され、それによって細胞への結合が損なわれ
る。

【０００７】

【発明の概要】本発明は、細胞は、エンドサイトーシス
の過程を通して遺伝子を取り込むことができる、という
概念を考慮している。エンドサイトーシス過程の後は、
決まってエンドソームまたはリソソーム中で外来遺伝子
の酵素による分解が起こる。この酵素による分解を免れ
ることができ、エンドソーム／リソソームの膜を通して
細胞質の中および／または細胞核の中に浸透できる遺伝
子だけが、転写により発現されることができる。この新
規な標的細胞に特異的なベクターは、標的細胞に特異的
なリガンドを備えているので、標的細胞におけるベクタ
ーの局所濃度は生体内で増加する。

【０００８】従って、本発明は、生物の細胞中に少なく
とも１個の遺伝子を挿入するための、標的細胞に特異的
なベクターであって、下記の成分： ａ）挿入すべき遺伝子のための非ウイルス性キャリヤ
ー、 ｂ）所望の標的細胞に特異的に結合し得るリガンド、 ｃ）標的細胞の細胞質中にベクターを導入するための融
合タンパク質、およびｄ）導入すべき遺伝子 を含んでなるベクターに関する。

【０００９】

【発明の具体的説明】この新規なベクター中で、標的細
胞に特異的なベクターの個々の成分は、共有結合によ
り、および／または吸着結合により互いに結合してい
る。

【００１０】本発明により使用する遺伝子用非ウイルス
性キャリヤーは、好ましくはタンパク質、ポリペプチ
ド、多糖、リン脂質、陽イオン系脂質、糖タンパク質、
リポタンパク質またはリポポリアミンであり、これら
は、正に帯電した側鎖の導入により陽イオン化すること
ができ、非ウイルス性キャリヤーと正に帯電した側鎖の
間が吸着結合または共有結合により結合される。さら
に、親油性側鎖の吸着結合または共有結合を追加するこ
とにより、キャリヤーに両親媒性を付与することができ
る。

【００１１】特に好ましい実施態様では、非ウイルス性
キャリヤーはアルブミンまたはキシランである。本発明
により使用するリガンド（ｂ）は、動物または人の細胞
の外側膜に特異的に結合することができる。好ましい実
施態様では、リガンド（ｂ）は、内皮細胞に特異的に結
合することができ、内皮細胞に対して特異的であるモノ
クローナル抗体またはそれらの断片、末端にマンノース
を有する糖タンパク質、糖脂質または多糖、サイトカイ
ン、成長因子、および接着分子からなる群から、また
は、特に好ましい実施態様では、内皮細胞に対して走化
性を有するウイルスの外殻から得られる糖タンパク質か
ら選択される。

【００１２】別の好ましい実施態様では、リガンドは平
滑筋細胞に特異的に結合することができ、アクチンに対
して特異的なモノクローナル抗体またはそれらの断片、
細胞膜受容体および成長因子からなる群から、または、
特に好ましい実施態様では、平滑筋細胞に対して走化性
を有するウイルスの外殻から得られる糖タンパク質から
選択される。

【００１３】もう一つの好ましい実施態様では、リガン
ド（ｂ）は、マクロファージおよび／またはリンパ球に
特異的に結合することができ、マクロファージおよび／
またはリンパ球上の膜抗原に対して特異的なモノクロー
ナル抗体、マクロファージおよび／またはリンパ球上の
膜抗原に対して特異的なポリクローナルまたはモノクロ
ーナル抗体の無傷の免疫グロブリンまたはＦｃ断片、サ
イトカイン、成長因子、末端にマンノースを有するペプ
チド、タンパク質、脂質または多糖からなる群から、ま
たは、特に好ましい実施態様では、ウイルスの外殻、特
にヌクレオチド位置８７２に突然変異を有するインフル
エンザＣウイルスのＨＥＦタンパク質、または触媒的ト
ライアッド(triad) であるセリン−７１、ヒスチジン３
６８または３６９、およびアスパラギン酸２６１を含む
インフルエンザＣウイルスのＨＥＦ開裂生成物から選択
される。

【００１４】別の好ましい実施態様では、リガンド
（ｂ）は、グリア細胞に特異的に結合することができ、
グリア細胞の膜構造に特異的に結合する抗体および抗体
断片、接着分子、末端にマンノースを有するペプチド、
タンパク質、脂質または多糖、および成長因子からなる
群から、または、特に好ましい実施態様では、グリア細
胞に対して走化性を有するウイルスの外殻から得られる
糖タンパク質からの成長因子から選択される。

【００１５】別の好ましい実施態様では、リガンド
（ｂ）は、造血細胞に特異的に結合することができ、幹
細胞因子、ＩＬ−１（特に受容体型ＩまたはII）、ＩＬ
−３（特に受容体型ａまたはβ）、ＩＬ−６またはＧＭ
−ＣＳＦ受容体に対して特異的な抗体および抗体断片、
無傷な免疫グロブリン、またはこの特異性を示すＦｃ断
片、およびＳＣＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６また
はＧＭ−ＣＳＦの様な成長因子、およびそれらの、関連
する受容体に結合する断片からなる群から選択される。

【００１６】もう一つの好ましい実施態様では、リガン
ド（ｂ）は、白血病細胞に特異的に結合することがで
き、白血病細胞上の膜構造に対して特異的に結合する抗
体、抗体断片、免疫グロブリンまたはＦｃ断片、例えば
ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＡＭＡ
Ｌ、シアロシル−Ｌｅ(sialosyl-Le) 、ＣＤ５、ＣＤ１
ｅ、ＣＤ２３、Ｍ３８、ＩＬ−２受容体、Ｔ−細胞受容
体、ＣＡＬＬＡまたはＣＤ１９、および成長因子、また
はそれらに由来する断片、またはレチノイドからなる群
から選択される。

【００１７】別の好ましい実施態様では、リガンド
（ｂ）は、ウイルスに感染した細胞に特異的に結合する
ことができ、ウイルスに感染した後、その感染した細胞
の細胞膜上で発現するウイルス抗原に対して特異的な抗
体、抗体断片、無傷の免疫グロブリンまたはＦｃ断片か
らなる群から選択される。

【００１８】最後に、リガンド（ｂ）は、気管支上皮細
胞、肝臓の洞様血管細胞または肝細胞に特異的に結合す
ることができ、好ましくは標的細胞に特異的に結合す
る、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、例えば
アシアロオロソムコイド(asialoorosomucoid) 、ネオグ
リコプロテインまたはガラクトース、インシュリン、末
端にマンノースを有するペプチド、タンパク質、脂質ま
たは多糖、無傷の免疫グロブリンまたはＦｃ断片からな
る群から、および、特に好ましい実施態様では、標的細
胞に特異的に結合するウイルスの外殻から得られる糖タ
ンパク質から選択されるリガンドでもよい。

【００１９】好ましい実施態様では、融合タンパク質
（ｃ）は、インフルエンザＡまたはＢウイルスのヘマグ
ルチニン（赤血球凝集素）、インフルエンザＡまたはＢ
ウイルスの赤血球凝集素のＨＡ２成分、およびそれらの
ペプチド類似体、インフルエンザＡウイルスのＭ２タン
パク質、インフルエンザＣウイルスのＨＥＦタンパク
質、マールブルグウイルスまたはエボラウイルスの様な
フィロウイルスの膜貫通タンパク質、狂犬病ウイルス、
水疱性口内炎ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ダニ
媒介脳炎ウイルスの膜貫通糖タンパク質、ＨＩＶウイル
ス、センダイウイルス（特にＦ１成分）またはＲＳウイ
ルス（特にｇｐ３７成分）の融合タンパク質、およびこ
れらのウイルス性融合タンパク質または融合遺伝子ペプ
チドを含む膜貫通糖タンパク質の断片から選択される。

【００２０】好ましい実施態様では、導入すべき遺伝子
（ｄ）はプラスミドの形態である。

【００２１】この新規なベクターは、医薬または医薬の
成分として使用することができ、好ましくは所望の遺伝
子を特定の標的細胞中に、静脈内、動脈内、門脈内、頭
蓋内、胸膜内、腹腔内、または局所的に導入するのに使
用される。

【００２２】この新規な標的細胞に特異的なベクターを
使用することにより、ベクターを非経口的に、好ましく
は静脈内または動脈内で、投与した後、標的細胞におけ
るベクター濃度を増加させることができ、その結果、標
的細胞がトランスフェクションされる速度を増加させる
ことができる。本発明によるこの利点は、この新規なベ
クターの、個々の、相互に結合した成分の相乗効果によ
り達成される。標的細胞に特異的なリガンドは、所望の
標的細胞に対する高い特異性を示す。好ましい実施態様
では、これらのリガンドは、特定の細胞に対して特異的
なウイルスの外殻タンパク質である。好適なウイルスの
外殻タンパク質は、所望の標的細胞に応じて選択する。
これらの標的細胞に特異的なリガンド、特にウイルスの
外殻タンパク質は、所望の遺伝子に対するキャリヤーに
結合されるが、それによって所望の遺伝子が、標的細胞
に特異的なリガンドにより、標的細胞に結合し、標的細
胞中で濃縮される。

【００２３】遺伝子のための非ウイルス性キャリヤー
は、好ましくは血液中における滞留時間が長いことが分
かっている化合物である。この血液中における比較的長
い滞留時間の結果、標的細胞はできるだけ高いベクター
濃度にできるだけ長く露出され、それによって、標的細
胞に特異的なリガンドにより、ベクターが標的細胞に最
大限に結合される。特に好ましい実施態様では、負に帯
電したＤＮＡと複合体を形成できる様に、これらの非ウ
イルス性キャリヤーを陽イオン化する。さらに、この新
規なベクターは、エンドソームまたはリソソームからベ
クターを宿主細胞の細胞質中に浸透させる融合タンパク
質を示す。したがって、本発明では、融合タンパク質と
は、ベクターが標的細胞の細胞質中に入り込める様にす
るタンパク質を意味する。この性質を有する融合タンパ
ク質は、特にウイルスから公知である。

【００２４】導入すべき遺伝子は、必要であればプロモ
ーター、等、の様な適切な制御領域を備えた、対応する
遺伝子をコード化する核酸の形態でよい。好ましい実施
態様では、導入すべき遺伝子はプラスミドの形態であ
る。本発明により使用できる、遺伝子用の非ウイルス性
キャリヤーは、それ自体公知である。非ウイルス性キャ
リヤーは、Cotten et al.,Curr. Biol. 4, 705(1993)、
Behr, Acc. Chem. Res. 26, 274(1993) 、Felgner, Ad
v. Deliv. Rev. 5, 163(1990)、Behr, Bioconjugate Ch
em. 5, 382(1994) 、Ledley, Hum. Gene Ther. 6, 1129
(1995) により開示されている。本発明で使用するのが
好ましいキャリヤーは、リポソーム、中性リン脂質との
混合物中でステアリルアミンの様な陽イオン系脂質を使
用して製造される陽イオン系リポソーム、中性リン脂質
との混合物中の臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウ
ム（ＤＤＡ）、臭化Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオ
キシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウ
ム（ＤＯＴＭＡ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチ
ルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ
−Ｃｈｏｌ）、臭化１，２−ジミリスチルオキシプロピ
ル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭ
ＲＩＥ）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム
（ＤＤＡＢ）および１，２−ジオレオイルオキシ−３−
（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）であ
る。

【００２５】陽イオン系ポリペプチドおよびタンパク
質、例えばポリリシン、硫酸プロタミン、ヒストン、ポ
リオルニチンおよびポリアルギニン、陽イオン系両親媒
性リポポリアミン、例えばジオクタデシルアミドグリシ
ルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチ
ジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、Ｎ−
ｔ−ブチル−Ｎ’−テトラデシル−３−テトラデシルア
ミノプロピオンアミド（ｄｉＣ14−アミジン）、ＤｏＴ
Ｂ、ＣｈｏＴＢ、ＤｏＳＣ、ＣｈｏＳＣ、ＬＰＬＬ、Ｄ
ＥＢＤＡ、ＤＴＡＢ、ＴＴＡＢ、ＣＴＡＢまたはＴＭＡ
Ｇ、または陽イオン系多糖、例えばジエチルアミノエチ
ルデキストランおよび陽イオン系有機重合体、例えばポ
リブレン、も非ウイルス性キャリヤーとして好適であ
る。

【００２６】別の好ましい実施態様では、トランスフェ
クション速度を増加するために、陽イオン系脂質および
リポポリアミン（ＤＮＡと複合体形成した）の処方に、
さらに中性リン脂質、例えばジオレオイルホスファチジ
ルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、を混合することがで
きる。特に好ましい実施態様では、非ウイルス性キャリ
ヤーは、親物質が陽イオン系または陽イオン化した水溶
性ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタン
パク質または（適当であれば追加して）親油性基の導入
により両親媒性挙動を示す多糖である化合物である。親
物質は、好ましくは水溶性のキャリヤー、例えばタンパ
ク質、糖タンパク質、リポタンパク質または多糖であ
る。特に好ましい実施態様では、キャリヤーはアルブミ
ンまたはキシランである。正電荷を有し、親物質に結合
できる構造単位が陽イオン基として使用するのに適して
いる。好ましくは、陽イオン基は、生理学的条件下でア
ミノ、グアニジノまたはイミダゾリル官能性を示す構造
単位である。陽イオン基は、公知の複合化法を使用して
親物質に結合させることができる。例えば、エチレンジ
アミンまたはヘキサメチレンジアミンの様なジアミンと
の結合がアミノ官能基に好適である。遊離アミノ基はヨ
ウ化メチルでメチル化することもでき、あるいは片側だ
け反応したグルタルアルデヒド基をGirard T試薬と反応
させることもできる[Roser,Dissertation, Basle(199
0)]。

【００２７】グアニジノまたはイミダゾリル基は、下記
の方法を使用して対応する塩基性アミノ酸を結合するこ
とにより導入される。グルタルアルデヒドを使用してア
ルブミンに結合するのが好ましい[Roser, Dissertatio
n, Basle(1990)]。導入すべき陽イオン基の数は、キャ
リヤーと複合体形成する遺伝子またはヌクレオチド配列
の陰イオン電荷の強度により異なる。複合体は、全体と
して中性または陽イオン電荷を有するのが好ましい。有
機溶剤、例えばオクタノール、に対する溶解度を増加す
る構造単位は、すべて親油性基と見なされる。

【００２８】特に、エステルとして使用される不飽和脂
肪酸、例えばオレイン酸、酸塩化物および酸無水物は親
油性基と見なされる。親油性基は、Seebach, Angew. Ch
emie 81, 690(1969)およびSatchell, Quart.Rev. 17, 1
60(1963) に記載されている様に、公知の複合化法、例
えばアシル化、すなわち酸塩化物、酸無水物およびエス
テルと、第１級および第２級アミンの反応、を使用して
導入することができる。導入すべき親油性基の数は、親
物質の親油性の程度により異なる。

【００２９】所望の標的細胞に特異的に結合し得るリガ
ンドとしては、多くの構造が使用できる。適当なリガン
ドの選択は、ベクターが特異的であるべき標的細胞によ
り異なる。原則的にリガンドは、特定の細胞（標的細
胞）上の膜構成成分に対して高い、特異的な親和力を示
すタンパク質、ポリペプチドまたは糖タンパク質であ
る。標的細胞に応じて、本発明の範囲内で下記のリガン
ドを使用することができる。

【００３０】１）内皮細胞に対するリガンド ａ）内皮細胞、特に増殖内皮細胞、の表面に優先的に結
合する物質をリガンドとして使用する。これらの物質に
は、例えばBurrows ら[Pharmac. Ther. 64, 155(199
4)]、Hughesら[Cancer Res. 49, 6214(1989)]、およびM
aruyamaら[PNAS-USA87, 5744(1990)] に記載されている
様な、内皮細胞の膜構造に対して向けられる抗体または
抗体断片が含まれる。特に、これらの物質には、ＶＥＧ
Ｆ受容体に対する抗体が含まれる。

【００３１】ネズミのモノクローナル抗体は、ヒト化し
た形態で使用するのが好ましい。ヒト化は、Winterら[N
ature 349, 293(1991)] およびHoogenbooms ら[Rev. T
r. Transfus. Hemobiol. 36, 19(1993)] に記載されて
いる方法で行なう。抗体断片は、先行技術により、例え
ばWinter et al.,Nature 349, 293(1991) 、Hoogenboom
s et al.,Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19(199
3) 、Girol, Mol. Immunol. 28, 1379(1991) またはHus
ton et al.,Intern. Rev. Immunol. 10, 195(1993) に
より開示されている方法で製造する。

【００３２】さらに、リガンドは、内皮細胞上の膜構造
または膜受容体に結合するすべての活性化合物を含む。
例えば、これらの活性化合物には、キニン受容体に結合
するキニンおよびキニンの類似体およびホモローグ、お
よび末端にマンノースを含む物質、およびＩＬ−１また
は成長因子、または内皮細胞により発現する受容体に結
合するそれらの断片またはそれらを構成する配列、例え
ばＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦまたはＴＧＦβが含ま
れる[Pusztain et al.,J. Pathol. 169, 191(1993)]。
さらに、これらの活性化合物は、活性化された、および
／または増殖内皮細胞に結合する接着分子を含む。この
種の接着分子、例えばＳＬｅｘ、ＬＦＡ−１、ＭＡＣ−
１、ＬＥＣＡＭ−１またはＶＬＡ−４、はすでに開示さ
れている[Augustin-Vossel et al.,J. Cell. Biol. 11
9, 483(1992) 、Pauli et al.,Cancer Metast. Rev.
9, 175(1990)、Honn et al.,Cancer Metast. Rev. 11,
353(1992) に記載］。 ｂ）ウイルス性リガンド 本発明の意味におけるリガンドは、特に、内皮細胞に対
する走化性を有するウイルスの外殻から得られる糖タン
パク質を含む。これらのウイルスの例を以下に示す。

【００３３】−フィロウイルス(filovirus) 、例えば −マールブルグウイルス 外殻タンパク質ＧＰ（糖タンパク質）およびｓＧＰ（第
二糖タンパク質）を含むもの[Kiley et al.,J. General
Virology 69, 1957(1988)、Will et al.,J. Virol. 6
7, 1203(1993)、Schnittler et al.,J. Clin. Invest.
91, 1301(1993) 、Feldmann et al.,Virus Res. 24, 1
(1992)] −またはエボラウイルス それぞれの場合に外殻タンパク質ＧＰおよびｓＧＰを含
むもの[Schnittler et al.,J. Clin. Invest. 91, 1301
(1993)、Volchov et al.,Virol. 214, 421(1995)、Jahr
ling et al.,Lancet 335, 502(1990) 、Feldmann eta
l.,Arch. Virol. 7, 81(1993)、Geisbert et al.,J. Co
mp. Path. 106, 137(1992)]

【００３４】−サイトメガロウイルス 特にそのｇＢタンパク質を含むもの[Waldman et al.,Tr
ansplant. Proc. 27, 1269(1995)、Sedmak et al.,Tran
splant. 58, 1379(1994)、Sedmak et al.,Archives Vir
ol. 140, 111(1995)、Koskines, Transplant. 56, 1103
(1993)、Scholz et al.,Hum. Immunol. 35, 230(1992)
、Alcami et al.,J. Gen. Virol. 72, 2765(1991),Pol
and et al.,J. Infect. Dis. 162, 1252(1990) 、Ho et
al.,J. Infect. Dis. 150 ,956(1984)、Spaete et a
l.,J. Virol. 64, 2922(1990)]

【００３５】−単純ヘルペスウイルス１型 [Etingin et al.,PNAS 90, 5153(1993) 、Key et al.,L
ab. Invest. 68, 645(1993) 、Kubota et al.,J. Immun
ol. 138, 1137(1987)]

【００３６】−ＨＩＶ−１ウイルス [Sceylovitova et al.,Arch. Virol. 140, 951(1995)、
Lafon et al.,AIDS 8, 747 (1994)、Re et al.,Microb
iologica 14, 149(1991)]

【００３７】−麻疹ウイルス [Mazure et al.,J. Gen. Virol. 75, 2863(1994)] −ハンタウイルス(Hantaan virus) [Pensiero et al.,J. Virol. 66, 5929(1992),Zhu,Chin
ese Med. J. 68, 524(1988)] −アルファウイルス、例えばセムリキ森林ウイルス [Jakob,J. Med. Microbiol. 39, 26(1993)]

【００３８】−流行性出血熱ウイルス [Yi 、Chinese J. Pathol. 21, 177(1992)] −ポリオウイルス [Condere et al.,Virol. 174, 95(1990)] −エンテロウイルス（例えばEcho 9、Echo 12 、Coxsac
kie B3） [Kirkpatrick et al.,Am. J. Pathol. 118, 15(1985)]

【００３９】２）平滑筋細胞に対するリガンド ａ）非ウイルス性リガンド 使用するリガンドの例は、平滑筋細胞の膜構造に対して
向けられる抗体または抗体断片であり、下記の物質が含
まれる。 −抗体１０Ｆ３[Printseva et al.,Exp. Cell Res. 16
9, 85(1987)、American J. Path. 134, 305(1989)] −アクチンに対する抗体 −アンギオテンシンII受容体に対する抗体 −成長因子用受容体に対する抗体、または例えば −ＥＧＦ受容体 −ＰＤＧＦ受容体 −ＦＧＦ受容体 −エンドセリンＡ受容体 に対して向けられる抗体

【００４０】さらに、これらのリガンドは、平滑筋細胞
上の膜構造または膜受容体に結合するすべての活性物質
を含む[Pusztai et al.,J. Pathol. 169, 191(1993) 、
Harris、Current Opin. Biotechnol. 2, 260(1991)] 。
例えば、これらの活性物質は、平滑筋細胞により発現さ
れる受容体に結合する成長因子またはそれらの断片、ま
たはそれらの構成配列、例えば −ＰＤＧＦ −ＥＧＦ −ＴＧＦβ −ＴＧＦａ −ＦＧＦ −エンドセリンＡ を含む。

【００４１】ｂ）ウイルス性リガンド しかし、本発明の意味におけるリガンドは、特に、平滑
筋細胞に対する走化性を有するウイルスの外殻から得ら
れる糖タンパク質を含む。これらのウイルスの例は、サ
イトメガロウイルスである[Speir et al.,Science 265,
391(1994)］。

【００４２】３）マクロファージおよびリンパ球に対す
るリガンドの選択 ａ）非ウイルス性リガンド マクロファージおよびリンパ球の表面に特異的に結合す
るリガンドには、例えばPowelson et al.,Biotech. Ad
v. 11, 725(1993) に記載されている様に、免疫細胞の
膜構造に対して向けられる抗体または抗体断片が含まれ
る。さらに、これらのリガンドには、それらの一定領域
により、免疫細胞のＦｃ−ｇ受容体またはＦＣ−ｅ受容
体に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体または抗体断片も含み[Rojanasakul et al.,Pharm.
Res. 11, 1731(1994)］、特に、ヒトポリクローナル免
疫グロブリンを含む。この種のＦｃ断片は、例えばHaup
t et al.,Klin. Wschr. 47, 270(1969) 、Kranz et a
l.,Dev. Biol.Standard 44, 19(1979) 、Fehr et al.,A
dv. Clin. Pharmac. 6, 64(1974) 、およびMenninger e
t al.,Immunochem. 13, 633(1976)の方法により製造さ
れる。

【００４３】これらのリガンドはさらに、免疫細胞の表
面上の膜構造または膜受容体に結合するすべての物質を
含む。これらの物質の例は、この種の細胞により発現さ
れる受容体に結合する、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−
２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮ
Ｆａ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ、および成長因
子、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦまたはＰＤ
ＧＦ、またはそれらの断片またはそれらの構成配列であ
る。

【００４４】これらのリガンドは、細胞膜構造に結合す
るリガンド、例えば脾臓、肝臓、肺、その他の組織の中
にあるマクロファージ上のマンノース６−リン酸塩受容
体、も含む。これらのリガンドおよび膜構造は、Perale
s et al.,Eur. J. Biochem.226, 255 (1994)に記載さ
れている。

【００４５】ｂ）ウイルス性リガンド しかし、本発明の意味におけるリガンドは、特に、リン
パ球および／またはマクロファージに対する走化性を有
するウイルスの外殻から得られる糖タンパク質を含む。

【００４６】これらのマクロファージに感染するウイル
スの例を以下に記載する。 −ＨＩＶ−１ 特にマクロファージへの結合を増加させる、ｇｐ１２０
のＶ３領域に突然変異を有する種、例えばKim et al.,
J. Virol. 69, 1755(1995) 、Valentin et al.,J. Viro
l. 68, 6684(1994)、Collin et al.,J. Gen. Virol. 7
5, 1597(1994) 、Shoida et al.,PNAS 89, 9434(1992)
、Chesebro et al.,J. Virol. 66, 6547(1992)、Shaw
et al.,J. Virol. 66, 2577(1992)、Lie et al.,J. Vir
ol. 64, 6148(1990) 、Broder et al.,PNAS 92, 9004(1
995) 、Changue et al.,Virol. 208,779(1995)。 −ＨＩＶ−２ [Valentin et al.,J. Virol. 68, 6684(1994)] −ハンタウイルス(Hanta cirus) 、例えばPunmala ウイ
ルス [Temonen et al.,Virol. 206, 8(1995)] −サイトメガロウイルス [Fajac et al.,Am. J. Resp. Crit. Care Med. 149, 49
5(1994) 、Kondo et al.,PNAS 91, 11879(1994) 、Iban
ez et al.,J. Virol. 65, 6581(1991)] −ＲＳウイルス（呼吸器多核体ウイルス） [Becker et al.,Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 6, 369
(1992)、Roberts 、Infect. Immun. 35, 1142(1982)] −単純ヘルペスウイルス [Plaeger-Marshall et al.,Pediatric Res. 26, 135(19
89)] −フィロウイルス [Schnittler et al.,J. Clin. Invest. 91, 1301(199
3)、Zaki,Eur. Conf. Tropical Med. p2(A22),ハンブル
グ、独国(1995)

【００４７】リンパ球に感染するウイルスの例を以下に
記載する。 −水痘・帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ） ＶＺＶは特にＴ細胞に感染する[Moffat et al.,J. Viro
l. 69, 5236(1995)] −ヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６） ＨＨＶ−６は特にＴ細胞に感染する[Takahashi et al.,
J. Virol. 63, 3161(1989)、Lusso et al.,J. Exp. Me
d. 181, 1303(1995) 、Frenkel 、Adv. Exp. Med. Bio
l. 278, 1(1990)] −狂犬病ウイルス 狂犬病ウイルスの外殻タンパク質は、特にＴＨ２細胞に
結合する[Martinez-Arends et al.,Clin. Immunol. Imm
unopath. 77, 177(1995)] −ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０糖タンパク質は、Ｔ細胞のＣＤ４分子に優先
的に結合する[Heinkelein et al.,J. Virol. 69, 6925
(1995)] −ＨＴＬＶ−II ＨＴＬＶ−IIは特にＢ細胞に感染する[Casoil et al.,V
irol. 206, 1126(1995) ］−ＨＴＬＶ−Ｉ ＨＴＬＶ−Ｉは特にＴ細胞に感染する[Persaud et al.,
J. Virol. 69, 6297(1995)、Boyer et al.,Cell Immuno
l. 129, 341(1990)]

【００４８】−インフルエンザＣウイルス インフルエンザＣウイルスは、ヘマグルチニンステアラ
ーゼ融合（ＨＥＦ）タンパク質により、Ｎ−アセチル−
９−β−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５，９Ａｃ）に
結合するが、これはＢリンパ球に優先的に起こり、Ｔリ
ンパ球にはあまり、またはまったく起こらない[Herrler
et al.,EMBO-J. 4, 1503(1985) 、Kamerling et al.,B
BA 714, 351(1982) 、Rogers et al.,J. Biol. Chem. 2
61, 5947(1986)] −ヌクレオチド位置８７２（これはＨＥＦのアミノ酸配
列の２８４位置をコード化する）に突然変異、例えばイ
ソロイシンによるトレオニンの置き換え、を有するイン
フルエンザＣウイルス この突然変異を有する表面タンパク質ＨＥＦは、Ｎ−ア
セチル−９−Ｏ−アセチルノイラミン酸受容体に対する
親和力が、野生型ウイルスよりも著しく大きい。[Szepa
nski et al.,Virol. 188, 85(1992)] −Ｎ−アセチル−９−β−アセチルノイラミン酸に結合
するための構造を有する、インフルエンザＣウイルスの
ＨＥＦ開裂生成物 この結合構造は、触媒性トリアドのセリン７１、ヒスチ
ジン３６８または３６９およびアスパラギン酸２６１に
より決定される。[Pleschka et al.,J. Gen. Virol. 7
6, 2529(1995)]

【００４９】−ＥＢ(Epstein-Barr)ウイルス ＥＢウイルスは特にＢ細胞に感染する。

【００５０】[Miller-Yale、J. Biol. Med. 55, 305(19
82) 、Garzelli et al.,Immunol. Lett. 39, 277(199
4)、Counter et al.,J. Virol. 68, 3410(1994) 、Wang
et al.,J. Virol. 62, 4173(1988)] −単純ヘルペスウイルス２ 単純ヘルペスウイルス２は、特にＴ細胞に感染する[Kuc
era et al.,Viral Immun. 2, 11(1989)] −麻疹ウイルス [Jacobson et al.,J. Gen. Virol. 63, 351(1982)]

【００５１】４）グリア細胞に対するリガンドの選択 ａ）非ウイルス性リガンド グリア細胞の表面に結合する物質もリガンドと見なされ
る。これらの物質には、例えばMirskyら[Cell and Tiss
ue Res. 240, 723(1985)] により、Coakham ら[Prog. E
xp. Tumor Res. 29, 57(1985)]により、およびMcKeever
ら[Neurobiol.6, 119(1991)] により記載されている様
に、グリア細胞の膜構造に対して向けられる抗体または
抗体断片が含まれる。これらの膜構造は、さらに神経密
着細胞、例えばＮ−ＣＡＭ、特にそのポリペプチド鎖Ｃ
を含む[Nybroe et al.,J. CellBiol. 101, 2310(198
5)]。

【００５２】これらのリガンドはさらに、グリア細胞上
の膜構造または膜受容体に結合するすべての活性化合物
を含む。これらの活性化合物の例は、末端にマンノース
を有し、マンノース６−リン酸塩受容体[Perales et a
l.,Eur. J. Biochem. 226, 225(1994)]、インシュリン
およびインシュリンの様な成長因子[Merril et al.,j.C
lin. Endoclin. Metab. 71, 199(1990)] 、ＰＤＧＦ[Ek
et al.,Nature 295, 419(1982)] 、およびこれらの成
長因子の、関連する膜受容体に結合する断片に結合する
物質である。

【００５３】ｂ）ウイルス性リガンド 本発明の意味におけるリガンドは、特に、グリア細胞に
対する走化性を有するウイルスの外殻から得られる糖タ
ンパク質を含む。これらのウイルスの例を以下に記載す
る。 −ＨＳＶ−１亜型ＪＲＦ１ [Sharpless et al.,J. Virol. 66, 2588(1992)] −単純ヘルペスウイルスＩ [Xie et al.,Eye Science(Yen Ko Hsueh Pao) 10, 67(1
994)、Genis et al.,J. Exp. Med. 176, 1703(1992)]

【００５４】５）造血細胞に対する非ウイルス性リガン
ド これらのリガンドは、特に、ほんの僅かに分化した血液
細胞上で発現する受容体に対して向けられる抗体または
抗体断片を含む。この種の抗体は、下記の受容体、例え
ば −幹細胞因子受容体 −ＩＬ−１受容体（Ｉ型） −ＩＬ−１受容体（II型） −ＩＬ−３受容体ａ −ＩＬ−３受容体β −ＩＬ−６受容体 −ＧＭ−ＣＳＦ受容体 に関して記載されている。

【００５５】さらに、これらのリガンドは、一定領域に
より免疫細胞のＦＣ−ｇ受容体に結合する、モノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体または抗体断片も含
む[Rojanasakul et al.,Pharm. Res. 11, 1731(1994)]
。

【００５６】これらのリガンドは、ほんの僅かに分化し
た血液細胞の表面上にある膜構造または膜受容体に結合
するすべての物質を含む。これらの物質の例は、この種
の細胞により発現する受容体に結合する、ＳＣＦ、ＩＬ
−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６またはＧＭ−ＣＳＦの様な成
長因子またはそれらの断片またはそれらの構成配列であ
る。

【００５７】６）白血病細胞または腫瘍細胞に対する非
ウイルス性リガンド 白血病細胞の表面に結合するリガンドには、白血病細胞
の膜構造に対して向けられる抗体または抗体断片が含ま
れる。その様なモノクローナル抗体の多くが診断および
治療方法に関して開示されている[Kristensen 、Danish
Medical Bulletin 41, 52(1994)、Schranz 、Therapia
Hungarica 38, 3(1990)、Drexler et al.,Leuk. Rex.
10, 279(1986) 、Naeim ,Dis. Markers 7, 1(1989)、St
ickney et al.,Current Op. Oncol. 4, 847(1992) 、Dr
exler et al.,Blut 57, 327(1988) 、Freedment et a
l.,Cancer Invest. 9, 69(1991)]。下記のモノクローナ
ル抗体、またはそれらの抗原結合抗体断片は、例えば、
白血病の種類に応じて、リガンドとして使用するのに適
している。

【００５８】細胞 膜抗原 モノクローナル抗体の発表者、文献 ＡＭＬ ＣＤ１３ Kaneko et al.,Leuk. Lymph. 14, 219(1994) − Muroi et al.,Blood 79, 713(1992) ＣＤ１４ Ball,Bone Marrow Transplnt. 3, 387(1988) ＣＤ１５ Guyotat et al.,Bone Marrow Transplant.6,385 (1990) ＣＤ３３ Jurcic et al.,Leukemia 9, 244(1995) Caron et al.,Cancer 73, 1049(1994) ＣＡＭＡＬ Shellard et al.,Exp. Hematol. 19, 136(1991) シアロシル-Le Muroi et al.,Blood 79, 713(1992) B-CLL ＣＤ５ Kaminski et al.,Cancer Treat. Res. 38, 253(1988) Tassone et al.,Immunology Lett. 39, 137(1994) ＣＤ１ｃ Orazi et al.,Eur. J. Hematol. 47, 28(1991) ＣＤ２３ 膜免疫グロブリンのイディオタイプおよびアイソタイプ Schroeder et al.,Immunol. Today 15, 289(1994) T-CLL ＣＤ３３ Imai et al.,J. Immunol. 151, 6470(1993) IL-2受容体 Waldmann et al.,Blood 82, 1701(1993) Ｔ細胞受容体 ＡＬＬ ＣＡＬＬＡ Morishima et al.,Bone Marrow Transplant. 11, 255(1993) ＣＤ１９ Anderson et al.,Blood 80, 84(1993) 非ホジキン リンパ腫 Okazaki et al.,Blood 81, 84(1993)

【００５９】腫瘍細胞に対する非ウイルス性リガンドに
は、腫瘍細胞上の膜構造に対して向けられる抗体、およ
びこれらの抗体の断片が含まれる。この種の抗体は、例
えばSedlacek et al.,Contrib. on Oncol. 32, Kager V
erlag ミュンヘン(1988)およびContrib. on Oncol. 43,
Kager Verlag ミュンヘン(1992)に記載されている。

【００６０】その他の例は、下記の物質に対する抗体で
ある。 −シアリルルイス [Ohta et al.,Immunol. Lett. 44, 35(1995)] −Ｔ細胞により認識される腫瘍上のペプチド [Maeurer et al.,Melanoma Res. 6, 11(1996) 、Coulie
et al.,Stem Cells 13, 393(1995)、Stoh et al.,J. B
iochem. 119, 385(1996)、Slingluff et al.,Curr. Op
in. Imunol. 6, 733(1994)] −癌遺伝子から発現するタンパク質 [Cheever et al.,Immunol. Rev. 145, 33(1995) 、Tala
rico et al.,PNAS 87,4222(1990)] −ガングリオシド、例えばＧＤ３、ＧＤ２、ＧＭ２、９
−Ｏ−アセチルＧＤ３およびfucosil ＧＭ１ [Helling et al.,Cancer Res. 55, 2783(1995)、Living
ston et al.,Vaccine 11, 1199(1993)、Vaccine 12, 12
75(1994)、Livingston et al.,Cancer Immunol.Immunot
her. 29, 179(1989) 、Gnewuchi et al.,Int. J. Can
cer 8, 125(1994) 、Jennemann ら、J. Biochem. 115,
1047(1994) 、Ravindranath et al.,Cancer Res. 49, 3
891(1989)] −血液型抗原およびそれらの前駆物質 [Springer et al.,Cancer 37, 169(1976) 、Carbohydra
te Res. 179, 271(1988)、Molec. Immunol. 26, 1(198
9) 、Fung et al.,Cancer Res. 50, 4308(1990)] −多形性上皮ムチン上の抗原 [PEM、Burchell et al.,Cancer Surreys 18, 135(199
3)] −熱ショックタンパク質 [Blackere et al.,J. Immunother. 14, 352(1993)]

【００６１】ネズミのモノクローナル抗体は、好ましく
はヒト化した形態で使用する。ヒト化は、すでに説明し
た様に行なう。すでに説明した様に、抗体断片は先行技
術により製造する。

【００６２】これらのリガンドはさらに、白血病細胞ま
たは腫瘍細胞の膜構造または膜受容体に結合するすべて
の活性化合物を含む。これらの活性化合物の例は、白血
病細胞または腫瘍細胞により発現する受容体に結合する
ステロイドホルモンまたはペプチドホルモン、またはそ
の他の成長因子またはそれらの断片または構成配列であ
る。

【００６３】この種の成長因子は、すでに開示されてい
る[Cross et al.,Cell 64, 271(1991)、Aulitzky et a
l.,Drugs 48, 667(1994) 、Moor, Clin. Cancer Res.
1, 3(1995)、Van Kooten et al.,Leuk. Lymph. 12, 27
(1993)]。例えば、これらの成長因子には、 −非ホジキンリンパ腫中のＩＦＮａ −ＩＬ−２、特にＴ細胞白血病中 −Ｔ細胞単球、骨髄由来の、および巨核芽球性白血病に
おけるＦＧＦ −白血病におけるＴＧＦβ −レチノイド、例えば急逝前骨髄球白血病における「レ
チノイン酸」 が含まれる。

【００６４】７）感染した細胞に対する非ウイルス性リ
ガンド 伝染病治療用のリガンドには、感染を引き起こす要因に
対して向けられる抗体または抗体断片が含まれる。例え
ば、ウイルス性感染の場合、これらのリガンドは、ウイ
ルスにより感染した細胞の細胞膜上で発現するウイルス
性抗原である。

【００６５】この種の抗体は、例えば下記のウイルスに
より感染した細胞に関して記載されている。 −ＨＢＶ −ＨＣＶ −ＨＳＶ −ＨＰＶ −ＨＩＶ −ＥＢＶ −ＨＴＬＶ

【００６６】さらに、これらのリガンドは、それらの一
定領域により免疫細胞のＦｃ−ｇ受容体またはＦＣ−ｅ
受容体に結合するモノクローナル抗体またはポリクロー
ナル抗体、または抗体断片も含む。ネズミのモノクロー
ナル抗体は、好ましくはヒト化した形態で使用する。ヒ
ト化は、すでに説明した様に行なう。すでに説明した様
に、抗体断片は先行技術により製造する。

【００６７】これらのリガンドはさらに、ウイルスによ
り感染した細胞の表面上にある膜構造または膜受容体に
結合する物質を含む。これらの物質の例としては、この
種の細胞により発現する受容体に結合する成長因子、例
えばサイトカイン、ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＦＧＦまたはＰＤ
ＧＦ、またはそれらの断片または構成配列が含まれる。

【００６８】８）他の実質細胞に対するリガンド ａ）非ウイルス性リガンド これらのリガンドには、特定の組織に選択的な細胞膜構
造に結合するリガンドが含まれる。これらのリガンドの
例を以下に示す。

【００６９】膜構造 リガンド 組織細胞 アシアロ糖タンパク質 アシアロオロソムコイド 肝臓細胞 ネオ糖タンパク質 ガラクトース トランスフェリン受容体 トランスフェリン 肝臓、他組織の細胞 インシュリン受容体 インシュリン 脾臓、肝臓、肺および 他の組織における マクロファージ Ｆｃ−ｙ受容体 免疫グロブリンＧ 網内系および他の組織

【００７０】これらのリガンドおよび膜構造は、Perale
s et al.,Eur. J. Biochem. 226,255(1994) により概
説されている。

【００７１】ｂ）ウイルス性リガンド しかし、本発明の意味において、これらのリガンドは特
に、選択された細胞、例えば下記の細胞、に対する走化
性を有するウイルスの外殻由来の糖タンパク質を含む。

【００７２】−気管支の上皮細胞 −ＲＳウイルス [Becker et al.,Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 6, 369
(1992)] −肝臓細胞 −肝炎Ｃウイルス [Uchida et al.,Pathol. Internat. 44, 832(1994)、Ca
rloni et al.,Arch. Virol. 8, 31(1993) 、Prince et
al.,Curr. Stud. Hemat. Blood Trans. 61, 195(1994)] −フィロウイルス 肝臓細胞が、例えばアシアロ糖タンパク質受容体により
マールブルグウイルスに結合する。[Becker et al.,J.
Gen. Virol. 76, 393(1995)] −肝炎Ｂウイルス 肝臓細胞が、アシアロ糖タンパク質受容体により、ＨＢ
ＶのプレＳ２およびＳ１ドメインに優先的に結合する[S
himizu et al.,J. Med. Virol. 20, 313(1986)、Treich
el et al.,J. Gen. Virol. 75, 3021(1994) 、Gerlich
et al.,J. Hepat. 17/3, 10 (1993)、Gripon et al.,Vi
rol. 192, 534(1993) 、Pontisso et al.,Hepatol. 14,
405 (1991) 、Ochiya et al.,PNAS 86, 1875(1989)] −肝炎Ｄウイルス [Colombo et al.,J. Hepatol. 12, 64(1991)] −肝臓シヌソイド細胞 −肝炎Ｖウイルス ＨＢＶがフィブロネクチンにより結合する。[Budhowska
et al.,J. Virol. 69, 840(1995)]

【００７３】９）伝染病予防用のリガンド 伝染病の予防には、マクロファージおよび／またはリン
パ球の細胞膜構造に結合するすべての物質がリガンドと
して使用するのに好適である。この種のリガンドはすで
に開示されている。

【００７４】ウイルス性リガンドの製造 ウイルス性リガンドは、洗剤（例えばβ−Ｄ−オクチル
グルコピラノシド）を使用し、インキュベートしたウイ
ルス標本からエンベロープタンパク質を溶解させ、遠心
分離する[Mannio et al.,Bio-Techniques 6, 682(1988)
に概説］か、またはII／２／ａ−ｈ）に挙げた文献に、
例えばＨＥＦ糖タンパク質に関するPleschkaら[J. Gen.
Virol. 76, 2529(1995)] およびSzepanski ら[Virol.
188, 85(1992)]により、記載されている様な、当業者に
は公知の分子生物学的方法を使用して分離される。

【００７５】本発明により使用される融合タンパク質
（ｃ） 本発明の範囲内で、融合遺伝子特性を有するタンパク質
を使用する。この種のタンパク質は、細胞膜と直接融合
することができる。多くのウイルス、例えばパラミクソ
ウイルス、レトロウイルスおよびヘルペスウイルス、が
融合遺伝子外殻タンパク質を有する[Gaudin et al.,J.
Gen. Virol. 76, 1541(1995)] 。本発明の意味におい
て、融合遺伝子タンパク質は、エンドソーム中に内在化
された後にのみ、および酸性pHでのみ、細胞膜またはエ
ンドソームと融合する糖タンパク質も含む。

【００７６】多くのウイルスが、ウイルスの接着および
それに続く細胞膜融合の両方を引き起こす糖タンパク質
を有する[Gaudin et al.,J. Gen. Virol. 76, 1541(19
95)]。この種のタンパク質は、例えばアルファウイル
ス、ラブドウイルスおよびオルソミクソウイルスにより
形成される。

【００７７】ウイルス性融合タンパク質 本発明の意味におけるウイルス性融合タンパク質は、Hu
ghson 、Current Biol. 5, 265(1995)、Hoekstra、J. B
ioenergetics Biomembranes 22, 675(1990) 、およびWh
ite 、Ann. Rev. Physiol. 52, 675(1990)により概説さ
れている。

【００７８】本発明の意味における融合タンパク質を以
下に記載する。 −インフルエンザＡまたはＢウイルスの赤血球凝集素、
特にＨＡ２成分 [Stegmann et al.,J. Biol. Chem. 266, 18404(1991)、
Klenk et al.,Virol.68, 426(1975) 、Lazarowitz et a
l.,Virol. 68, 440(1975)、Skehel et al.,PNAS 79, 96
8(1982)、Bosch et al.,Virol. 113, 725(1981)] −インフルエンザＡウイルスのＭ２タンパク質 [Sugrue et al.,Virol. 180, 617(1991)、Lamb et al.,
Cell 40, 627(1985)、Pinto et al.,Cell 69, 517(199
2) 、Zebedee et al.,J. Virol. 56, 502(1985)、Black
et al.,J. Gen. Virol. 74, 1673(1993)、Wharton et
al.,J. Gen. Virol. 75, 945(1994)]単独で、またはイ
ンフルエンザの赤血球凝集素との、またはインフルエン
ザＡのノイラミニダーゼの突然変異体（これは酵素活性
は有していないが、赤血球凝集を起こす）との組合せ[O
huchi et al.,J. Virol. 68, 920(199)]で使用する。[H
ausmann et al.,J. Gen. Virol. 76, 1719(1995)] −インフルエンザウイルス赤血球凝集素のペプチド類似
体 [Wharton et al.,J. Gen. Virol. 69, 1847(1988)] −インフルエンザＣウイルスのＨＥＦタンパク質 ＨＥＦタンパク質の融合活性は、ＨＥＦｏをＨＥＦ１お
よびＨＥＦ２の小単位に開裂させることにより活性化さ
れる[Herrler et al.,J. Gen. Virol. 69, 839(1988)、
Kitane et al.,Arch. Virol. 73, 357(1982)、Ohuchi e
t al.,J. Virol. 42, 1076(1982)]

【００７９】−下記の様なフィロウイルスの膜貫通（ト
ランスメンブレン）糖タンパク質 −マールブルグウイルス [Feldmann et al.,Virol. 182, 353(1991)、Will et a
l.,J. Virol. 67, 1203(1993)、Kiley et al.,J. Gen.
Virol. 69, 1957(1988)、Geyer 、Glycobiol.2, 299(19
92)] −エボラウイルス [Elliott et al.,Virol. 147, 169(1985) 、Cox et a
l.,J. Infect. Dis. 147, 272(1983) 、Kiley et al.,
J. Gen. Virol. 69, 1957(1988)、Feldmann etal.,Arc
h. Virol. 7, 81(1993)、Volchkov et al.,Virol. 214,
421(1995)] −狂犬病ウイルスの膜貫通糖タンパク質 [Whitt et al.,Virol. 185, 681(1991) 、Gaudin et a
l.,J. Virol. 65, 4853(1991)、67, 1365(1993)、Virol
ogy 187, 627(1992)] −水疱性口内炎ウイルスの膜貫通糖タンパク質（Ｇ） [Balch et al.,J. Biol. Chem. 261, 14681(1986) 、Kr
eis et al.,Cell 46,929(1986) 、Doms et al.,J. Cell
Biol. 105, 1957(1987) 、Zhang et al.,J.Virol. 68,
2186(1994) 、Ohnishi 、Curr. Topics Membr. Trans
p. 32, 257(1988) 、Li et al.,J. Virol. 67, 4070(19
93)、Zagouras et al.,J. Virol. 65,1976(1991)、Herr
mann et al.,Biochem. 29, 4054(1990)]

【００８０】−ＨＩＶウイルスの融合タンパク質、特に
ｇｐ４１成分 [Stareich et al.,Cell 45, 637(1986) 、Kowalski et
al.,Science 237, 1351(1987) 、Gallaker et al.,Cell
50, 327(1987)] −センダイウイルスの融合タンパク質、特にＦ１成分 [Blumberg et al.,J. Gen. Virol. 66, 317(1985) 、Se
choy et al.,J. Biol.Chem. 262, 11519(1987) 、Homma
& Ohuchi、J. Virol. 12, 1457(1973)、Scheid & Chop
pin、Virol. 57, 470(1974)] −セムリキ森林ウイルスの膜貫通糖タンパク質、特にＥ
１成分 [Omar et al.,Virol. 166, 17(1988) 、Nieva et al.,E
MBO-J. 13, 2707(1994) 、Phalen et al.,J. Cell Bio
l. 112, 615(1991)、Lobigs et al.,J. Virol.64, 1233
+5214 (1990)、Kenney et al.,Structure 2, 823(199
4)、Garoff et al.,Nature 288, 236(1980) 、Levy-Min
tz et al.,J. Virol. 65, 4292(1991)] −ダニ誘発脳炎ウイルスの膜貫通糖タンパク質 [Guirakhoo et al.,Virol. 169, 90(1989)、J. Gen. Vi
rol. 72, 1323(1991)、Heinz et al.,Virol. 198, 109
(1994)] −ヒトＲＳウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質、特に
ｇｐ３７成分 [Collins et al.,PNAS 81, 7683(1984) 、Elangoh et a
l.,Nucl. Acids Res.13, 1559 (1985)]

【００８１】ウイルス性融合タンパク質の製造 ウイルス性融合タンパク質は、洗剤（例えばβ−Ｄ−オ
クチルグルコピラノシド）を使用し、インキュベートし
たウイルス標本から外殻タンパク質を溶解させ、遠心分
離する[Mannio et al.,Bio-Techniques 6, 682(1988)に
概説］か、または当業者には公知の分子生物学的方法を
使用して分離される。融合タンパク質の製造例は、下記
の物質に関してすでに開示されている。

【００８２】−インフルエンザ赤血球凝集素 [Bullough et al.,J. Mol. Biol. 236, 1262(1994)、Na
ture 371, 37(1994)、Daniels et al.,Cell 40, 431(19
85) 、Godley et al.,Cell 68, 635(1992)、White et a
l.,Nature 300, 658(1982)、Wiley et al.,Ann. Rev. B
iochem. 56, 365(1987) 、Kawasaki et al.,PNAS 85, 3
21(1988)、Kuroda et al.,J. Virol. 63, 1677(1989)、
EMBO-J. 5, 1359(1986) 、Naeve et al.,Virol. 129, 2
98(1983)、Porter et al.,Nature 282, 471(1972) 、Hu
ghson 、Curr. Biol. 5, 265(1995)] −インフルエンザＶのＭ２タンパク質 [Black et al.,J. Gen. Virol. 74, 1673(1993) 、Pint
o et al.,Cell 69, 517(1992) 、Zebedee et al.,J. Vi
rol. 56, 502(1985)] −インフルエンザＣのＨＥＦタンパク質 [Pfeifer et al.,Virus. Res. 1, 281(1984)、Herrler
et al.,Virol. 113, 439(1981)] −フィロウイルスの膜
間糖タンパク質、例えば −マールブルグウイルス [Will et al.,J. Virol. 67, 1203(1993) 、Feldmann e
t al.,Virus Res. 24, 1 (1992)] −エボラウイルス [Volchkow et al.,FEBS Lett. 305, 181(1992)、Virol.
214, 421(1995) 、Sanchez et al.,Virus Res. 29, 21
5(1993) 、Virol. 157, 414(1987) 、Eliottet al.,Vir
ol. 163, 169(1985)]

【００８３】−狂犬病ウイルスの膜貫通糖タンパク質 [Gaudin et al.,J. Virol. 65, 4853(1991) 、Virol. 1
87, 627(1992) 、Roseet al.,J. Virol. 43, 361(1982)
、Witte et al.,Virol. 185, 681(1991)] −水疱性口内炎ウイルスの膜貫通糖タンパク質 [Liet et al.,J. Virol. 67, 4070(1993) 、Riedel et
al.,EMBO-J. 3, 1477(1984) 、Lyles et al.,Bio. Che
m. 29, 2442(1990) 、Metsikko et al.,EMBO-J. 5, 34
29(1986)] −セムリキ森林熱ウイルスの膜貫通糖タンパク質 [Garoff et al.,Nature 288, 236(1980)、Kielian et a
l.,J. Virol. 64, 4614(1990) 、Kondor-Koch 、J. Cel
l Biol. 97, 644(1983)] −ダニ誘発脳炎ウイルスの膜貫通糖タンパク質 [Guirakkoo et al.,J. Gen. Virol. 72, 1323(1991) 、
Heinz et al.,Virol.198, 109 (1994)]

【００８４】融合遺伝子特性を有する他の分子を以下に
記載する。 −Pseudomonas exotoxin Aの転座領域（領域II）を含む
ペプチド[Weis et al.,Cancer Res. 52, 6310(1992) 、
Fominaga et al.,J. Biol. Chem. 271, 10560(1996)] −ペプチド ＧＬＦＥＡＬＬＥＬＬＥＳＬＷＥＬＬＬＥＡを含むペプ
チド[Gottschalk et al.,Gene Ther. 3, 448(1996)] −ペプチド ＡＡＬＡＥＡ［ＬＡＥＡ］₄ ＬＡＡＡＡＧＣ（Ａｃｍ）
を含むペプチド[Wang et al.,Technol. Advances in Ve
ctor Syst. for Gene Ther., May 6-7, 1996, Coronad
o, IBC Conference] −麻疹ウイルスの融合タンパク質のペプチド ＦＡＧＶ−ＶＬＡＧＡＡＬＧＶＡＡＡＡＱＩを含むペプ
チド[Yeagle et al.,Biochem. Biophys. Acta 1065, 49
(1991)]

【００８５】−インフルエンザＡのＨＡ２タンパク質の
ペプチド ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＷＧＭＩＤＧを含むペプ
チド[Lueneburg et al.,J. Biol. Chem. 270, 27606(19
95)] −ペプチド ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＬＦＧＡ
ＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧ[Burger et al.,Bioc
hem. 30, 11173(1991)] またはペプチド ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ、ＡＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ、Ｌ
ＦＬＧＡＩＡＧＦＩＥ、ＬＬＬＧＡＩＡＧＦＩＥ、ＬＩ
ＬＧＡＩＡＧＦＩＥ、ＧＩＦＧＡＩＡＧＦＩＥ、ＧＬＬ
ＧＡＩＡＧＦＩＥ、ＧＬＦＡＡＩＡＧＦＩＥ、ＧＬＦＥ
ＡＩＡＧＦＩＥ、ＧＬＦＧＡＭＡＧＦＩＥ、ＧＬＦＧＡ
ＩＡＧＬＩＥまたはペプチドＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＶ [Steinhauer et al.,J. Virol. 69, 6653(1995)] また
はペプチド ＧＬＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧまたはペプ
チド ＧＬＬＥＡＬＡＥＬＬＥＧＧＷＥＧＬＬＥＧ[Ishiguro
et al.,Biochem. 32, 9792(1993)]を含むペプチド

【００８６】キャリヤーに対するリガンドおよび融合タ
ンパク質の複合化 リガンドおよび融合タンパク質は、当業者には既知の方
法を使用してキャリヤーに複合化する。非共有結合の例 −キャリヤー−ビオチン−アビジン−Ｓ−Ｓ−リガンド Hashimoto et al.,Immunol. 132, 129(1984) −キャリヤー−bispec. 抗体−リガンド Raso et al.,Immunol. Rev. 62, 93(1982)共有結合の例 −タンパク質ＮＨ₂ 基への結合 Carlson et al.,B
iochem. J. 173, 723(1978)

【００８７】必要な試薬 プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）（ＳＰＤＰ） ＳＤＤＰ−ジチオトレイトール Carlson et al.,Biochem. J. 173, 723 (1978) ２−イミノチオラン King et al.,Biochem. 17, 1499(1978) ２，２−イミノチオラン＋４，４−ジチオピリジン King et al.,Biochem. 17, 1499(1978) ３−メチル−３−（４−ジチオピリジル）−メルカプトプロピオンイミデート Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン Reiner et al.,J. Mol. Catal. 2, 335 (1977) アセチルメルカプトコハク酸無水物＋ＮＨ₂ ＯＨ Klotz およびHeineg et al.,Arch. Biochem. Biophys. 96, 690(1979) ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル Liu et al.,Biochem. 18, 690(1979) スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド−メチルシクロヘキサン）−１−カル ボキシレート Yoshitake et al.,Eur. J. Biochem. 101, 395 (1979) Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート Rector et al.,J. Immun. Meth. 24, 321 (1978) ４−ヒドロキシ−３−ニトロメチルベンズイミデート＋アセトイミデート＋ Ｎａ₂ Ｓ₂ Ｏ₄ Mueller およびPfleideler、J. Appl. Biochem. 1, 301(1979) ４−ヒドロキシ−３−ニトロメチルベンズイミデート＋アセトイミデート＋ ＮａＮＯ₂ Mueller およびPfleideler、J. Appl. Biochem. 1, 301(1979) 酸化デキストラン＋ホウ水素化物 Hurwith et al.,Eur. J. Cancer 14, 1213 (1978)

【００８８】−タンパク質水酸基への結合必要な試薬 シスタミン＋カルボジイミド Erlanger et al.,Meth. Imm. Immunochem. 1, 144(1967) Gilliland 、Cancer Res. 40, 3564(1980) −タンパク質ＳＨ基への結合必要な試薬 タンパク質ＳＨ Ghose およびBlair 、CRC Crit. Rev. Ther.Drug Carrier Syst. 3, 263(1987) タンパク質ＳＨ＋Ｎａ₂ Ｓ₄ Ｏ₆ Masuko et al.,BBRC 90, 320(1979) Ellmanの試薬 RasoおよびGriffin 、J. Immunol. 125, 2610(1980) −タンパク質アルデヒド基への結合必要な試薬 過ヨウ素酸塩 Hurwitz et al.,Cancer Res. 35, 1175 (1975) −タンパク質ＣＯＯＨ基への結合必要な試薬 シスタミン＋カルボジイミド Gilliland 、Cancer Res. 40, 3564(1980)

【００８９】導入すべき遺伝子に対するヌクレオチド配
列の選択 キャリヤーと複合体形成するヌクレオチド配列は、ＤＮ
Ａ配列またはＲＮＡ配列でよい。最も簡単な場合、これ
らの配列は、所望のタンパク質をコードする遺伝子を含
む裸（そのままの）ヌクレオチドストランドを含んでな
る。この遺伝子は、細胞特異性またはウイルス特異性の
プロモーター配列、およびさらにプロモーターモジュー
ルで補足することができる。

【００９０】さらに、遺伝子の発現を増幅および／また
は延長するために、ウイルスのプロモーター配列および
／またはエンハンサー配列を遺伝子に加えることができ
る。この種のプロモーター配列および／またはエンハン
サー配列は、例えばDillon、TiBTech 11, 167(1993) に
より概説されている。

【００９１】この種のプロモーター配列および／または
エンハンサー配列の例を以下に示す。 −ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲ配列 −レトロウイルスのＬＴＲ配列 −ＣＭＶウイルスのプロモーター領域およびエンハンサ
ー領域 −ＡＡＶウイルスのＩＴＲ配列および／またはｐ５、ｐ
１９およびｐ４０プロモーター配列 −アデノウイルスのＩＴＲ配列および／またはプロモー
ター配列 −ワクシニアウイルスのＩＴＲ配列および／またはプロ
モーター配列 −ヘルペスウイルスのＩＴＲ配列および／またはプロモ
ーター配列 −パルボウイルスのプロモーター配列 −パピローマウイルスのプロモーター配列（上流調節領
域） 好ましくは、遺伝子はプラスミド中に取り入れる。

【００９２】複合化キャリヤーと遺伝子の複合体形成 複合化キャリヤーは、２種類の出発物質を混合すること
により、遺伝子またはヌクレオチド配列と複合体形成す
る。好ましくは、中性または陽イオン性電荷を有する複
合体が形成される混合比を選択する。好ましい混合比の
例を以下に示す。 −脂質１μモル／プラスミド２０μｇ −脂質１〜５ｍｇ／ＤＮＡ／ＲＮＡ１０〜２０μｇ −脂質６．２μｇ／ＤＮＡ１．５５〜３．１μｇ −脂質／ＤＮＡ−ペプチド（５：１） 複合体は、正に帯電したキャリヤーを、望ましい比率の
遺伝子でインキュベートすることにより行なう。混合比
は、Dittgen et al.,Pharmazie 42, 541(1987)により記
載されている様に、ゼータ電位の測定により決定する。

【００９３】

【実施例】実施例１ 内皮細胞のトランスフェクションに活性な化
合物の製造 リガンドとしてのフィロウイルス糖タンパク質の製造 フィロウイルス(filocirus) 糖タンパク質は、内皮細胞
に対して高い親和力を有する外殻タンパク質である。フ
ィロウイルス糖タンパク質は、Will et al.,J.Virol. 6
7, 1203(1993)、Feldmann et al.,Virus Res. 24, 1(19
92)、およびVolchkow et al.,FEBS Lett. 305, 181(199
2) により詳細に記載されている様にして製造する。

【００９４】エボラウイルスの製造 エボラウイルスの亜型「ザイール」(EBO, Institute fo
r Virology, SergievPosad, Russia)をmacaque 赤毛猿
を通過させ、ベロ細胞中でインキュベートし、細胞イン
キュベート液から分離する[Volchkow et al.,FEBS Let
t. 305, 181(1992)] 。

【００９５】ウイルスＲＮＡのクローニングおよび配列
決定 遺伝子ＲＮＡは、精製したウイルスから塩化セシウム勾
配を通して遠心分離により分離した[Volchkow ら(199
2)] 。このＲＮＡを使用し、ランダムプライマーおよび
ヒヨコの骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を使用してｃＤ
ＮＡライブラリーを製造した。ｃＤＮＡライブラリーか
らのＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを出発材料として使
用し、ＰＣＲおよび下記の合成プライマーを使用してＧ
Ｐ遺伝子を増幅した。

【００９６】−Ｎ１ ５’−末端ＢａｍＨ１領域を補足した、（ｍＲＮＡセン
スのヌクレオチド１１４〜１４２に相補的な）配列５’
−ＧＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡ
ＣＡＡＴＧ（配列番号１）を有する。

【００９７】−Ｎ２ ５’−末端Ｈｉｎｄ-III領域を補足した、（ｍＲＮＡセ
ンスのヌクレオチド２４９２〜２４６６に相補的な）配
列５’−ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＧＴＣ
ＡＣＴＡＡＡ（配列番号２）を有する。

【００９８】Maxam およびGilbert の方法[Methods in
Enzymology 65, 499(1980)] を使用し、ＧＰ遺伝子のＤ
ＮＡヌクレオチド配列を、両ストランドに関して分析し
た。ＥＢＯザイール種ＧＰ遺伝子の配列は遺伝子バンク
にNo. Ｕ３１０３３で寄託した[Volchkow et al.,(199
2)] 。

【００９９】ＥＢＯ ＧＰ遺伝子の配列は、Sanchez ら
[Virus Res. 29, 215(1993] により発表された配列とほ
とんど同等である。しかし、１０１９〜１０２５位置
に、連続したＡ（アデニン、ｍＲＮＡセンス）が８個で
はなく、７個しか見られない。

【０１００】ＥＢＯ−ＧＰに対して特異的なｍＲＮＡの
分離、クローニングおよび配列決定 RNeasy total RNA kit（Quiagen から）を使用し、ＥＢ
Ｏウイルスで感染させた（細胞１個あたり１〜１０ＰＦ
Ｕ、感染から１日後）約７ｘ１０⁷ Vero細胞から、ＥＢ
Ｏ−ＧＰに対するｍＲＮＡを分離した。

【０１０１】ｃＤＮＡ合成には、１０μｌのｍＲＮＡ溶
液（約１．４ｘ１０⁷ 個の感染細胞に相当）を、ヒヨコ
の骨髄芽球症ウイルスの逆転写酵素で、−Ｎ３（５’−
末端Ｈｉｎｄ-III領域で補足した配列オリゴ−ｄ（Ｔ）
２１を有する）の存在下でインキュベートした。

【０１０２】続いて、１μｇ／μｌのＲＮＡｓｅで、３
７℃で３０分間混合物をインキュベートすることによ
り、ＲＮＡを除去した。プライマーＮ１およびＮ３を使
用するＰＣＲにより、ＧＰ特異性ヌクレオチド配列を増
幅した。

【０１０３】ＰＣＲは、ＫＣｌ ５０mM、Tris- ＨＣｌ
（pH８．３）１０mM、ＭｇＣｌ₂ ２mM、各デオキシヌク
レオチド０．２mMおよび各プライマー０．３μＭ中にｃ
ＤＮＡ１〜５μｇを含む反応混合物１００μｌ中で行な
った。

【０１０４】反応混合物を９５℃に１０分間加熱し、Ｔ
ａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ／１００μｌ）を加えた。
３５サイクルのＤＮＡ増幅を行なった。サイクルプログ
ラムは、９４℃で１分間、７０℃で１分間、および７２
℃で１分間からなる。このサイクルプログラムの後、試
料を７２℃で１０分間インキュベートした（ＰＣＲの成
分はすべてPerkin-Elmer Cetusから得た）。ＰＣＲ反応
の生成物を精製（QIAQuick Spin PCR精製キット、Quiag
en から）し、このＤＮＡを配列化、反復ＰＣＲ反応ま
たはプラスミドベクターのクローニングに直接使用し
た。ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）Ｉおよび
IIでオーバーラップしているＧＰ領域のヌクレオチド配
列は、Sangerの技術[Sanger et al.,PNAS 74, 5463(19
77)]を使用し、下記の先行技術マールブルグウイルスを
使用して確認した。

【０１０５】−Ｎ４、配列 ５’−ＣＧＧＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＡＴ （配列
番号３）（ヌクレオチド１１０８〜１０９１に対して相
補的）を有する −Ｎ５、配列 ５’−ＴＣＧＴＧＧＣＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＴ （配列
番号４）（ヌクレオチド１４１２〜１３９５に対して相
補的）を有する ＰＣＲ断片をｐＧＥＭ２Ｚｆ（＋）ベクター中にクロー
ニングし、酵素配列化[Sanger et al.,PNAS 74, 5463(1
977)] により組換えプラスミドを分析した。

【０１０６】クローンのほとんどが（ｖＲＮＡとまった
く同様に）位置１０１８と１０２６（ｍＲＮＡセンス）
の間に７個の連続アデノシンを示したのに対し、８個の
連続したアデノシンはこの位置に、ＧＰ特異性ＥＢＯ
ｍＲＮＡで感染させた細胞の約２０％に見られた。８個
のアデノシンを含むｍＲＮＡは６７６ａａの完全なＧＰ
をコード化する（８番目のアデノシンはＯＲＦＩからＯ
ＲＦIIへのフレームシフトを起こすことができるた
め）。

【０１０７】対照的に、７個のアデノシンだけを含むｍ
ＲＮＡは、非構造的な第二糖タンパク質（ｓＧＰ）をコ
ードする。ｓＧＰのヌクレオチド配列と一致して、ｓＧ
Ｐは、ＯＲＦＩの末端によりコード化される追加の７０
ａａにより補足された、ＧＰのＮ末端部分（２７４ａ
ａ）と同一であると思われる。この末端はＧＰ中には存
在しない。というのは、ＧＰの場合、追加の８番目のア
デノシンがリーディングをＯＲＦＩからＯＲＦIIに移動
させ、その結果、ＯＲＦＩが末端に読み取られないため
である。

【０１０８】組換えプラスミドの構築 ＥＢＯ ＧＰ遺伝子の完全なＯＲＦを構成するＰＣＲ生
成物を制限酵素ＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｄ IIIでイン
キュベートし、ＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｄ IIIで予め
処理したプラスミドｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）中にリゲーシ
ョンした。このプラスミドは、ワクシニアウイルス／Ｔ
７ポリメラーゼ発現系を使用してＴ７ポリメラーゼを有
するＥＢＯ ＧＰ−ＲＮＡを合成するのに使用したＴ７
ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。 ＥＢＯ ｖＲＮＡの完全なＧＰヌクレオチド配列（７個
の連続アデノシン）を含むプラスミドをｐＧＥＭ−ｍＧ
Ｐ７と呼び、対応してＥＢＯ ｍＲＮＡ（８個の連続ア
デノシン）を含むプラスミドをｐＧＥＭ−ｍＧＰ８と呼
ぶ。

【０１０９】ＢａｍＨ ＩおよびＨｉｎｄ IIIを使用す
ることにより、プラスミドｐＧＥＭ−ｍＧＰ７からＧＰ
特異性ヌクレオチド配列を削除し、得られた断片の末端
を、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を使用して充填
し、次いでその配列をベクターｐＳｃ１１（Promega, M
adison, Wi. から）のＳｍａ１制限箇所に結合した。得
られた組換えプラスミド（ｐＳｃ−ｍＧＰ７およびｐＳ
ｃ−ｍＧＰ８）を、組換えワクシニアウイルスの製造に
使用した。

【０１１０】組換えワクシニアウイルスの構築 組換えワクシニアウイルスは、組換えプラスミド（ｐＳ
ｃ−ｍＧＰ７またはｐＳｃ−ｍＧＰ８）中のｔＫ領域お
よびワクシニアウイルス［ＷＲ種、Chakrabarti et a
l.,Mol. Cell. Biol. 5, 3403(1985)により開示］の遺
伝子ＤＮＡの間の同様の組換えにより、リポフェクチン
トランスフェクション法[Felgner et al.,PNAS 84, 741
3(1987)]を使用して製造した。組換えウイルスは、選別
用にβ−ガラクトシダーゼ−陽性プラークを使用し、Ｔ
Ｋ−１４３細胞上に１回、およびＣＶ−１細胞上に４回
通過させることにより精製した。

【０１１１】ｐＳｃ−ｍＧＰ７に由来する組換えワクシ
ニアウイルスはｖＳＣ−ＧＰ７と呼び、ｐＳｃ−ｍＧＰ
８に由来する組換えワクシニアウイルスはｖＳＣ−ＧＰ
８と呼ぶ。ＧＰの発現は、１ｘ１０⁶ 個のＨｅｌａ細胞
または同数のＲＫ−１３細胞に、細胞１個あたり１０ｐ
ｆｕのｖＳＣ−ＧＰ７またはｖＳＣ−ＧＰ８で感染させ
ることにより、達成した。

【０１１２】遺伝子生成物の発現は、免疫ブロット法に
より分析した。これには、１．４ｘ１０⁵ 個の感染した
Ｈｅｌａ細胞またはＲＫ−１３細胞のリゼートを１０％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ[Laemmli、Nature 227, 680(1970) に
記載］で分別し、半乾燥技術によりＰＶＤＦ膜（Millip
ore から）上に載せた。分泌されたｓＧＰは、１ｘ１０
⁶ 個の感染細胞から得た上澄み液（２ml）の２０μｌを
ゲル上に載せることにより分析した。免疫分析は、それ
ぞれの場合に西洋ワサビペルオキシシダーゼと複合化し
た、マウスの抗ＥＢＯ血清またはウマの抗ＥＢＯ血清、
および第二抗体としてウサギの抗マウスまたは抗ウマ抗
体を使用して行なった。結合した第二抗体を、ＥＣＬ技
術（Amershamから）を使用して分析した。

【０１１３】感染したＨｅｌａ細胞およびＲＫ−１３細
胞の両方の細胞リゼート中に、ＧＰおよびｓＧＰの両方
を検出することができ、ｓＧＰの比率はｖＳＣ−ＧＰ７
で感染させた後に明らかに大きく、ＧＰの比率はｖＳＣ
−ＧＰ８で感染させた後に明らかに大きかった。細胞ラ
イゼートのエンドグリコシダーゼＨ処理およびＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析により、成熟したＧＰは分子量が１２５〜
１４０ｋＤであり、（「未成熟」ＧＰと対照的に）Ｎ−
グリコシドにより結合したオリゴ糖の複合体のために、
エンドグリコシダーゼＨによる開裂に対して耐性がある
ことが分かった。

【０１１４】ＲＫ−１３細胞は、分子量１４０ｋＤの成
熟ＧＰを発現するのに対し、Ｈｅｌａ細胞は１２５ｋＤ
の成熟ＧＰを発現する。この大きさの違いは、細胞−特
異的な様式で異なるＮ−グリコシル化によるものであ
る。ＲＫ−１３細胞から得られる１４０ｋＤＧＰは、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥでエボラウイルスのＧＰと共に移動し
た。

【０１１５】ｖＳＣ−ＧＰ７を感染させた細胞は、細胞
ライゼート中にほんの少量のｓＧＰしか示さなかった。
このｓＧＰは常に分子量が５０ｋＤであった。圧倒的な
比率のｓＧＰが細胞上澄み液中に見られた（分泌された
ｓＧＰの、細胞内ｓＧＰの比率は２５：１であった）。
分泌されたｓＧＰは、分子量が５０〜５５ｋＤであり、
エンドグリコシダーゼＨに対して耐性を有する。

【０１１６】ＧＰの選択および精製 この新規な非ウイルス性ベクターを製造するためのリガ
ンドとして、ＲＫ−１３細胞から生産された、分子量１
４０ｋＤのＥＢＯ−ＧＰを選択した。ＲＫ−１３細胞
を、１０ｐｆｕのｖＳＣ−ＧＰ８／細胞で感染させた。
細胞を収穫し、感染から１６〜１８時間後に溶菌させ
た。ライゼート中のタンパク質を調整用８％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上で分別し、クーマシーブリリアントブルーで染
色した。ＧＰを削除し、ゲル部分をBio Trap(Schleiche
r and Schuell から）中に入れ、そのBio Trapを水平電
気泳動室中に置いた。電気溶離を、緩衝液（１００mgグ
リシン、２０mMＴＲＩＳおよび０．０１％ＳＤＳ）中、
４℃および一定電圧（２００Ｖ）で、１６〜２０時間行
なった。溶離液を集め、Centricon-100 マイクロ濃縮機
（Amiconから）を使用して濃縮した。

【０１１７】濃縮溶離液の試料を、１０％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上で電気泳動分別にかけ、クーマシーブリリアント
ブルーで染色し、免疫ブロッティングにより純度を調べ
た。その後、ＧＰを、逆相ＨＰＬＣ［ＷＰ３００カラム
（０．４６ｘ２５cm）、Ｃ４．５μｍ(Shandonから）］
により、アセトニトリル勾配（４０分間で０％〜１００
％Ｂ、Ａ：０．１％ＴＦＡ、１０％アセトニトリル、
Ｂ：０．１％ＴＦＡ、９０％アセトニトリル）を使用
し、６０℃、流量１ml／分で限外精製した。

【０１１８】実施例２ インフルエンザＡの融合タンパ
ク質Ｍ２の製造 Ｍ２タンパク質を、Zebedee et al.,J. Virol. 56, 502
(1985)、Pinto et al.,Cell 69, 517(1992) およびBlac
k et al.,J. Gen. Virol. 74, 1673(1993)により詳細に
記載されている様にして製造した。

【０１１９】実施例３ タンパク質（アルブミン）系陽
イオン化キャリヤーの製造 キャリヤー系を、Mueller 、Dissertation, Basle(199
4) により記載されている様にして製造し、試験した。
粒子は、Mueller 、Dissertation, Basle(1994)およびJ
unginger et al.,Pharm. Ztg. 25, 9(1991)に記載され
ている様にして、それらの大きさ（光子相関分光計）、
表面電荷（ゼータ電位測定）および形態（走査電子顕微
鏡）に関して分析した。

【０１２０】Bergmann et al.,Clin. Sci. 67, 35(198
4) およびKumagai et al.,J. Biol.Chem. 262, 15214(1
987)により詳細に記載されている様にして、アルブミン
を陽イオン化した。カルボキシル基をＮ−エチル−Ｎ’
−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩で活性化した後、ヒト血清アルブミンを、ヘキサメチ
レンジアミンの共有結合により陽性化した。未反応成分
は透析およびカラムクロマトグラフィーにより除去し
た。陽イオン化の程度は、ゼータ電位の測定および電気
泳動法により確認できる。

【０１２１】３．１ 陽イオン化した(cationized)ヒト
血清アルブミン（ｃＨＳＡ）の製造 ヒト血清アルブミンの２０％溶液５mlを、ヘキサメチレ
ンジアミンの２Ｍ溶液６７mlに加え、pHを７．８に調節
する。混合物を室温で１００ rpmで３０分間攪拌し、Ｎ
−エチル−Ｎ’−３−（ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩１ｇで処理する。再度pHを確認した
後、この混合物を、時々氷浴に漬けて過熱を避けなが
ら、室温で４時間攪拌する。Amicon濃縮装置(MWCO 30.0
00) 中、５濃縮段階で、最終生成物を濃縮し、低分子量
成分から精製する。精製過程は、光度計（２８０nm）お
よび浸透圧計で監視する。精製した誘導体は凍結させ、
４℃で保存する。

【０１２２】３．２ ｃＨＳＡの検査 陽イオン化したアルブミンは、文献から公知の電気泳動
技術を使用して分析する。均質なポリアクリルアミドゲ
ル（５％Ｔ、３％Ｃ）およびｐＩ領域３〜９のPharmaly
te Carrier Ampholytes(Phast Gel IEF 3-9)を使用する
等電点電気泳動法により、等電点がｐＩ４からｐＩ７〜
９に移動していることが分かる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Pha
st Gel勾配１０〜１５、Phast Gel ＳＤＳ緩衝液ストリ
ップ、非還元性）により測定されるアルブミンの分子量
６７，０００は、陽イオン化により変化しない。同じ技
術を使用し、分子量がより高い凝集物は検出されない。

【０１２３】陽イオン化したアルブミンのＵＶ吸収極大
は、２７６〜２７８nmである。陽イオン化の程度は、第
１級アミン官能基をフルオレスカミン(fluorescamine)
と、３９０nm（励起）／４７５nm（発光）およびpH７で
反応させることにより、フルオリメトリー的に定量する
ことができる。転化係数２．０〜２．３から、反応が完
了していることが分かる。文献から公知のＢＣＡタンパ
ク質検定を使用し、陽イオン化アルブミンを、例えばプ
ラスミドとの混合物中で、５〜１０μｇ/ml の濃度範囲
で干渉なしに、５６２nmで光度計により測定することが
できる。

【０１２４】３．３ ｃＨＳＡの官能基の確認 ａ）高分子プラスミド／ｃＨＳＡ複合体の製造 ＣＭＶ−ｌａｃＺプラスミド２２．９５μｇを、無菌の
０．９％塩化ナトリウム溶液１．４ml中、室温、１００
rpmで１０分間インキュベートする。このプラスミド溶
液に、陽イオン化したヒト血清アルブミンを０．９％塩
化ナトリウム溶液に入れ、濾過により無菌化した溶液１
mlを毎秒１滴の滴下速度で加え、この混合物を攪拌しな
がら室温で５分間複合体形成する。

【０１２５】ｂ）複合体の特性決定 プラスミドを中性化し、陽イオン化するのに必要なｃＨ
ＳＡ濃度は、アガロースゲル電気泳動（１％アガロース
ゲル、ＴＡＥ緩衝液、pH７．４、９０Ｖ、３時間）によ
り決定する。未結合プラスミド成分は、臭化エチジウム
インターカレーションにより検出されるのに対し、タン
パク質成分は、それに続くクーマシー染色により検出さ
れる。選択した条件下で、全体的に正の電荷を有するプ
ラスミド／タンパク質複合体は、明らかに目に見える様
に陰極に移動する。８．３mg／mlｃＨＳＡ溶液０．３ml
を使用して製造した複合体は負の正味電荷を示すのに対
し、０．６ml、１ml、１．５mlおよび２mlの溶液で製造
した複合体は正の正味電荷を示す。遊離のプラスミド成
分は、選択した濃度のいずれにも現れない。プラスミド
は、生理学的食塩水溶液中で１０分間処理しても、検出
される損傷は受けない。

【０１２６】トランスフェクションに好適な複合体の大
きさは、光子相関分光法（ゼータサイザー１、AZ 110、
９０°、波長６３３）を使用して測定する。複合体の大
きさは、インキュベート体積、インキュベート媒体の性
質およびイオン強度、ｃＨＳＡ濃度、ｃＨＳＡでインキ
ュベートする時間、ｃＨＳＡ溶液を注入する速度、およ
びインキュベート媒体のpHを変えることにより、３１０
〜３６０nmに調節する。乳光色の溶液が製造される。

【０１２７】ｃ）ｃＨＳＡ／ＣＭＶ−ｌａｃＺ複合体に
よる細胞のトランスフェクション ３Ｔ３細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ、pH７．１
中で、抗生物質を加えずに、３７℃、５％ＣＯ₂ および
湿度８９％でインキュベートする。

【０１２８】ｄ）遺伝子運搬 ゼラチン被覆した３cmペトリ皿中に２００，０００個の
３Ｔ３細胞を散布し、約５０％集合に達するまで２４時
間インキュベートする。培地を除去し、カルシウムおよ
びマグネシウムを含まないＰＢＳ、pH７．４で細胞を３
回洗浄し、次いでＦＣＳを含まないＤＭＥＭ２mlまたは
１５０mMＮａＣｌ／１０mMＨＥＰＥＳ、pH７．４、１ml
で処理する。それぞれの場合、２．１に記載したプラス
ミド／ｃＨＳＡ複合体０．８４ml（ＤＮＡ８μｇに相
当）で混合物を希釈し、３７℃で１時間（ＮａＣｌ／Ｈ
ＥＰＥＳ）または２時間（ＤＭＥＭ）インキュベートす
る。

【０１２９】さらに、融合遺伝子およびリソソーマトロ
ピック特性(lysosomotropic)を変えるために、８５％グ
リセロール（殺菌、２００μｌ、１．８４ml）の様な様
々な薬品をトランスフェクション混合物に加える。イン
キュベート後、トランスフェクション媒体を吸引分離
し、ＦＣＳを含むＤＭＥＭで置き換え、その後、全体を
さらに４８時間インキュベートする。リソソーマトロピ
ック効果を刺激するために、１または２時間のトランス
フェクションの後、この混合物の一部をさらにクロロキ
ン含有ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ、２．５％ＦＣＳ、０．１ｍ
Ｍクロロキン）で３時間インキュベートする。その後、
クロロキン溶液を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで置き
換える。実験条件を確認するために、文献から公知の方
法によりリポフェクタミンを使用して３Ｔ３細胞をトラ
ンスフェクションする（試薬１０μｌ、ＤＮＡ２μ
ｇ）。

【０１３０】４８時間後、細胞インキュベート基を除去
し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ、
pH７．４、で細胞を１回洗浄し、ＰＢＳ中０．１％グル
タルアルデヒドで１０分間固定する。ＰＢＳでさらに２
回洗浄することにより、過剰のグルタルアルデヒドを除
去する。トランスフェクションした細胞を、０．００３
Ｍフェリシアン化カリウム、０．００３Ｍフェロシアン
化カリウムおよびＰＢＳ中０．０８％Ｘ−Ｇａｌ（原
液：ＤＭＦ中２％）の溶液で、室温で一晩インキュベー
トすることにより染色し、次いで顕微鏡で検査する。

【０１３１】いずれの場合も、純粋なプラスミド／ｃＨ
ＳＡ複合体はトランスフェクションを生じない。細胞培
地に８５％グリセロールを加えることにより、僅か１時
間後に細胞は死滅する。文献中に見られる、ＤＥＡＥデ
キストランを使用して得られる値に対応するトランスフ
ェクション速度は、ＮａＣｌ／ＨＥＰＥＳ−緩衝溶液中
でクロロキンショックの後に観察することができる。同
じ後処理を使用することにより、遺伝子運搬はＤＭＥＭ
中で著しく少ない。

【０１３２】 表１ 陽イオン化したヒト血清アルブミンの特性 方法 結果 溶解度 − 水および生理学的媒体中で 良好な溶解度 ｐＩ 等電点電気泳動法 ｐＩ ７〜９ 分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ６７，０００ 高分子量凝集物 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 凝集物は検出されない 最大吸収 ＵＶ分光法 ２７６〜２７８nm 陽イオン化程度 蛍光定量法 (fluorescamine) 理論値 ２．１８ 実測値 ２．０〜２．３ 総電荷の測定 アガロースゲル 正電荷 電気泳動法含有量測定 ＢＣＡタンパク質検定 −

【０１３３】表２ 複合体形成条件の確認インキュベート体積 ・１１０μｌ ・１．４mlインキュベート媒体の性質およびイオン強度 ・２回蒸留水 ・カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ、pH
７．４ ・生理学的食塩水 ・１５０mMＮａＣｌ、１０mMＨＥＰＥＳ、pH７．４ ・血清を含まないＤＭＥＭ、pH７．４ｃＨＳＡ濃度 試験した濃度 ・それぞれの場合に１mlあたり、０．１μｇ、１μｇ、
１０μｇ、１００μｇ、０．５mg、１mg、１．５mg、２
mg、２．５mg、３mg、５mgおよび１０mg。選択した濃度 ・それぞれの場合に１mlあたり、２．４９mg、５．１６
mg、８．３mg、１２．４５mgおよび１６．６mg。 インキュベート期間 ・５、３０、６０、１２０および１８０分間。 インキュベート媒体のpH ・pH４．０ ・pH７．４ ・pH９ 注入速度 ・１滴／秒 ・ただちにｃＨＳＡを完全に加える

【０１３４】実施例４ プラスミドの製造 ヒトエンドセリン−１プロモーター［位置＜−１７０〜
＞−１０、Wilson etal.,Mol. Cell Biol. 10, 4654(19
90)] またはＴＡＴＡボックスの長さ（位置＜−１７０
〜＞−４０）だけ短縮された変形物を、その３’末端
で、ヒトｃｄｃ２５Ｃ遺伝子（ＵＫ９５０．６４６６．
３）のＣＤＥ−ＣＨＲ−Ｉｎｒモジュール（位置＜−２
０〜＞＋１２１）の５’末端に結合する。この結合は、
当業者には公知であり、市販されている酵素を使用して
行なう。

【０１３５】この様にして製造したキメラエンドセリン
−１プロモーターモジュール／転写単位を、３’末端
で、ヒトβ−グルクロニダーゼの完全なコード化領域
［位置＜２７〜＞１９８２、Oshima et al.,PNAS USA 8
4, 685(1987)] を含むＤＮＡの５’末端に結合した。こ
のＤＮＡは、分泌に必要なシグナル配列（２２Ｎ−末端
アミノ酸）も含む。細胞からの分泌を促進するために、
このシグナル配列を免疫グロブリンシグナル配列［位置
＜６３〜＞１０７、Riechmann et al.,Nature 332,323
(19 88)]に置き換える。転写調節単位およびβ−グルク
ロニダーゼ用のＤＮＡを、当業者には公知であり、市販
されている酵素を使用して、ｐＵＣ１８／１９またはBl
uescriptに由来するプラスミドベクターの中にクローニ
ングした。

【０１３６】実施例５ 陽イオン化したキャリヤーのプ
ラスミドによる複合体形成 キャリヤーをプラスミドで、これらの２種類の成分を適
当な混合比でインキュベートすることにより、複合体形
成する。会合の程度は、ゼータ電位の変化により確認し
た。陽イオン系ＨＳＡの２０％溶液［ｃ）に記載する様
にして製造し、５〜３５％領域から選択］６．５mlをプ
ラスミド溶液で、１：２（１：１〜１：１０の範囲から
選択）の比で処理した。０．５％Klucel GF を含むジク
ロロメタン／メタノール（９：１）９３．５mlからなる
外部相を温度的に２０℃に３０分間平衡化し、処理量５
００ml／分で循環している有機相にアルブミン溶液を加
えた。このエマルションをパルス状に６５ワットで１５
分間超音波処理した。架橋させるために、この混合物に
塩化メチレン中グルタルアルデヒド６．６ミリモルを加
え、全体を室温、２２００ rpmで８０〜１００分間攪拌
した。粒子は、洗浄および遠心分離を数回行なって精製
した。

【０１３７】実施例６ 親油性基の導入 親油性基は、当業者には公知の条件下でアシル化するこ
とにより導入した。この場合、アシル化の公知の付加−
除去機構により、カルボン酸誘導体がアルブミンの第１
級アミノ基と反応し、カルボキサミドを形成する。塩化
オレオイル０．１ｇを５〜１０mlの無水ジオキサンに溶
解させ、この溶液を１滴毎に、１：４（１：１〜１：１
０の範囲から選択）の比率で、粒子［ｃ）に記載する様
にして製造］のジオキサン中懸濁液で処理し、次いでこ
の混合物を強く振とうする。過剰のアンモニア水溶液を
加えた後、混合物を１０分間攪拌し、希塩酸で僅かに酸
性にする。粒子を遠心分離し、中性になるまで水洗す
る。

【０１３８】実施例７ リガンドおよび融合タンパク質
のキャリヤーに対する複合化 リガンドおよび融合タンパク質を、Khawli et al.,Int.
J. Rad. Appl. Instrum.B 19, 289(1992)、およびCand
iani et al.,Cancer Res. 62, 623(1992) に記載されて
いる様に、ＳＰＤＰ方法による共有結合によりキャリヤ
ー系に結合させる。この場合、アルブミンのリシン残留
物中に存在する第１級アミノ官能基がＳＰＤＰと反応
し、ジスルフィド含有誘導体を形成する。これらの誘導
体は、当業者には公知の条件下で、リガンドおよび融合
タンパク質のスルフヒドリル基に共有結合することがで
きる。

【０１３９】９９．５％エタノール中に入れたＳＰＤＰ
試薬２００ナノモルを、ＰＢＳ中の陽イオン化し、親油
性付与したＨＳＡ粒子［ｆ）に記載する様にして製造］
で、室温で３０分間インキュベートした。複合化させる
ために、混合物を、１：１（１：１〜１：１０の範囲か
ら選択）の比の、エボラウイルスＧＰ糖タンパク質
［ａ）に記載する様にして製造］およびインフルエンザ
のＭ２融合タンパク質［ｂ）に記載する様にして製造］
の溶液で処理し、全体を攪拌しながら室温で一晩インキ
ュベートした。未結合成分は遠心分離した。

【０１４０】実施例８ 標的細胞に特異的なベクターの
活性 上記の実施例に記載する様にして製造した標的細胞に特
異的なベクターは、全身系の、好ましくは静脈内または
動脈内投与の後、組織特異的リガンドにより、内皮細胞
に優先的に結合する。エンドソーム中に取り込まれた
後、融合タンパク質により細胞質中へ浸透し易くなる。
組織に特異的なプロモーター配列、および細胞周期によ
り調節されるプロモーターモジュールにより、遺伝子は
主として増殖内皮細胞中で発現する。これらの遺伝子の
存在により、これらの増殖内皮細胞がβ−グルクロニダ
ーゼを分泌し、これが薬理学的に不活性なβ−グルクロ
ニダジド（プロドラッグ）を活性物質に開裂させる。こ
の活性物質は、例えば抗増殖または制癌作用を有する。
これによって、内皮細胞の増殖、隣接する腫瘍の成長、
または隣接する炎症反応が阻止される。この新規な化合
物は、抗増殖または制癌物質の製造を、腫瘍または炎症
により引き起こされる脈管形成箇所に限定するので、十
分に許容される。

【０１４１】特定の遺伝子に対して（非ウイルス性）キ
ャリヤーを選択することにより、ゲノム中に一体化され
た休止ウイルスの活性化により、または野生型ウイルス
との組換えにより患者の遺伝子が突然変異する危険性は
なくなる。

【０１４２】

【配列表】

配列番号１ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．２９ 配列 GAAGGATCCT GTGGGGCAAC AACACAATG 29

【０１４３】配列番号２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．２７ 配列 AAAAAGCTTC TTTCCCTTGT CACTAAA 27

【０１４４】配列番号３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．１８ 配列 CGGACTCTGA CCACTGAT 18

【０１４５】配列番号４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１．．１８ 配列 TCGTGGCAGA GGGAGTGT 18

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 47/48 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 48/00 ＡＤＵ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ // Ａ６１Ｋ 39/395 37/14 Ｃ０７Ｈ 21/04 37/26 (72)発明者 トーマス、キセル ドイツ連邦共和国マールブルク、ドイチュ ハウスシュトラーセ、81 (72)発明者 ロルフ、ミューラー ドイツ連邦共和国マールブルク、ポイティ エルシュトラーセ、８

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生物の細胞中に少なくとも１つの遺伝子を
   挿入するための、標的細胞に特異的なベクターであっ
   て、下記の成分： ａ）挿入すべき遺伝子のための非ウイルス性キャリヤ
   ー、 ｂ）所望の標的細胞に特異的に結合し得るリガンド、 ｃ）標的細胞の細胞質中にベクターを浸透させるための
   融合タンパク質、または融合遺伝子ペプチド、および ｄ）導入すべき遺伝子 を含むベクター。
2. 【請求項２】標的細胞に特異的なベクターの個々の成分
   が、共有的結合によりに、および／または吸着結合によ
   り互いに結合している、請求項１に記載のベクター。
3. 【請求項３】遺伝子用の非ウイルス性キャリヤー（ａ）
   が、タンパク質、ポリペプチド、多糖、リン脂質、陽イ
   オン系脂質、糖タンパク質、リポタンパク質またはリポ
   ポリアミンからなる群から選択される、請求項１または
   ２に記載のベクター。
4. 【請求項４】非ウイルス性キャリヤー（ａ）が、正に帯
   電した側鎖の導入により陽イオン化され、非ウイルス性
   キャリヤーと正に帯電した側鎖の間の結合が吸着結合ま
   たは共有結合により形成される、請求項３に記載のベク
   ター。
5. 【請求項５】非ウイルス性キャリヤー（ａ）が、吸着結
   合または共有結合により結合された親油性側鎖を有し、
   その結果、キャリヤーに両親媒性が付与される、請求項
   １〜４のいずれか一項に記載のベクター。
6. 【請求項６】非ウイルス性キャリヤー（ａ）が、アルブ
   ミンまたはキシランである、請求項１〜５のいずれか一
   項に記載のベクター。
7. 【請求項７】リガンド（ｂ）が、動物または人の細胞の
   外側膜に特異的に結合することができる、請求項１〜６
   のいずれか一項に記載のベクター。
8. 【請求項８】リガンド（ｂ）が、内皮細胞に特異的に結
   合することができ、かつ内皮細胞に対して特異的である
   モノクローナル抗体またはそれらの断片、キニンまたは
   それらの類似体またはホモローグ、末端にマンノースを
   有する糖タンパク質、糖脂質または多糖、サイトカイ
   ン、成長因子、接着分子、または内皮細胞に対して走化
   性を有するウイルスの外殻由来の糖タンパク質からから
   なる群から選択される、請求項７に記載のベクター。
9. 【請求項９】リガンド（ｂ）が、平滑筋細胞に特異的に
   結合することができ、かつアクチンに特異的に結合する
   モノクローナル抗体またはそれらの断片、細胞膜受容体
   および成長因子、または平滑筋細胞に対して走化性を有
   するウイルスの外殻由来の糖タンパク質からなる群から
   選択される、請求項７に記載のベクター。
10. 【請求項１０】リガンド（ｂ）が、マクロファージおよ
    び／またはリンパ球に特異的に結合することができ、か
    つマクロファージおよび／またはリンパ球上の膜抗原に
    特異的に結合するモノクローナル抗体、マクロファージ
    および／またはリンパ球上の膜抗原に特異的に結合する
    ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の無傷の免疫
    グロブリンまたはＦｃ断片、サイトカイン、成長因子、
    末端にマンノースを有するペプチド、タンパク質、脂質
    または多糖、ウイルスの外殻由来の糖タンパク質、ヌク
    レオチド位置８７２に突然変異を有するインフルエンザ
    ＣウイルスのＨＥＦタンパク質、またはインフルエンザ
    Ｃウイルスから得られる、触媒的トライアッド(triad)
    であるセリン７１、ヒスチジン３６８または３６９およ
    びアスパラギン酸２６１を含むＨＥＦ開裂生成物からな
    る群から選択される、請求項７に記載のベクター。
11. 【請求項１１】リガンド（ｂ）が、グリア細胞に特異的
    に結合することができ、かつグリア細胞の膜構造に特異
    的に結合する抗体および抗体断片、接着分子、末端にマ
    ンノースを有するペプチド、タンパク質、脂質または多
    糖、成長因子またはグリア細胞に対して走化性を有する
    ウイルスの外殻由来の糖タンパク質からなる群から選択
    される、請求項７に記載のベクター。
12. 【請求項１２】リガンド（ｂ）が、造血細胞に特異的に
    結合することができ、かつ幹細胞因子、ＩＬ−１（特に
    受容体型ＩまたはII）、ＩＬ−３（特に受容体型ａまた
    はβ）、ＩＬ−６またはＧＭ−ＣＳＦ受容体に対して特
    異的な抗体および抗体断片、および無傷な免疫グロブリ
    ン、またはこの特異性を示すＦｃ断片、および成長因
    子、およびそれらの、関連する受容体に結合する断片か
    らなる群から選択される、請求項７に記載のベクター。
13. 【請求項１３】リガンド（ｂ）が、白血病細胞または腫
    瘍細胞に特異的に結合することができ、かつ白血病細胞
    上の膜構造に特異的に結合するステロイドホルモン、ペ
    プチドホルモン、抗体、抗体断片、免疫グロブリンまた
    はＦｃ断片、例えばＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、Ｃ
    Ｄ３３、ＣＡＭＡＬ、sialosyl−Ｌｅ、ＣＤ５、ＣＤ１
    ｅ、ＣＤ２３、Ｍ３８、ＩＬ−２受容体、Ｔ−細胞受容
    体、ＣＡＬＬＡまたはＣＤ１９、および成長因子、また
    はそれらに由来する断片、またはレチノイドからなる群
    から選択される、請求項７に記載のベクター。
14. 【請求項１４】リガンド（ｂ）が、ウイルスに感染した
    細胞に特異的に結合することができ、かつウイルスに感
    染した後、その感染した細胞の細胞膜上で発現するウイ
    ルス抗原に対して特異的な抗体、抗体断片、無傷の免疫
    グロブリンまたはＦｃ断片からなる群から選択される、
    請求項７に記載のベクター。
15. 【請求項１５】リガンド（ｂ）は、気管支上皮細胞、肝
    臓の洞様血管細胞または肝細胞に特異的に結合すること
    ができ、かつこれらの標的細胞に特異的に結合するトラ
    ンスフェリン、アシアロ糖タンパク質、例えばアシアロ
    オロソムコイド、ネオグリコプロテインまたはガラクト
    ース、インシュリン、末端にマンノースを有するペプチ
    ド、タンパク質、脂質または多糖、無傷の免疫グロブリ
    ンまたはＦｃ断片、およびこれらの標的細胞に特異的に
    結合するウイルスの外殻由来の糖タンパク質からなる群
    から選択される、請求項７に記載のベクター。
16. 【請求項１６】融合タンパク質（ｃ）が、インフルエン
    ザＡまたはＢウイルスのヘマグルチニン、インフルエン
    ザＡまたはＢウイルスのヘマグルチニンのＨＡ２成分、
    およびそれらのペプチド類似体、インフルエンザＡウイ
    ルスのＭ２タンパク質、インフルエンザＣウイルスのＨ
    ＥＦタンパク質、フィロウイルスの膜貫通タンパク質、
    狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、セムリキ森林
    熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスの膜貫通糖タンパク
    質、ＨＩＶウイルス、センダイウイルスまたはＲＳウイ
    ルスの融合タンパク質、およびこれらのウイルス性融合
    タンパク質の断片または膜貫通領域を除去した膜間糖タ
    ンパク質の断片から選択される、請求項１〜１５のいず
    れか一項に記載のベクター。
17. 【請求項１７】導入すべき遺伝子（ｄ）がプラスミドの
    形態である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベ
    クター。
18. 【請求項１８】請求項１〜１７のいずれか一項に記載の
    ベクターを含んでなることを特徴とする医薬。
19. 【請求項１９】請求項１〜１７のいずれか一項に記載の
    ベクターの、所望の遺伝子を特定の標的細胞中に、静脈
    内、動脈内、門脈内、頭蓋内、胸膜内、腹腔内、または
    局所的に導入するための医薬を製造するための使用。