JPH10500573A

JPH10500573A - 複合マトリックスからの汚染微生物の迅速な分離および同定方法

Info

Publication number: JPH10500573A
Application number: JP7530329A
Authority: JP
Inventors: コパトシス，アレクサンダー・デメトリオス
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1994-05-23
Filing date: 1995-05-18
Publication date: 1998-01-20
Also published as: EP0760865A1; CA2186355A1; WO1995032304A1

Abstract

(57)【要約】食品のような複合マトリックスから標的微生物を分離および同定する方法が提供される。その方法は、水性二相高分子分離系を使用して、バックグラウンド菌叢に対して標的微生物の数を選択的に増強し、次いで、標的微生物の選択的増殖および同定を行う。

Description

【発明の詳細な説明】複合マトリックスからの汚染微生物の迅速な分離および同定方法発明の分野本発明は、汚染された複合マトリックス（ｃｏｍｐｌｅｘｍａｔｒｉｘ）から特定の微生物を分離および検出するための微生物学の分野、ならびに方法に関する。より具体的には、本発明は、特定の標的微生物のメンバーを単離するための水性二相高分子系の使用に関する。背景食品に保持される汚染細菌は、発展途上国と同様に先進国においても健康を害する顕著なものである。例えば、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の食中毒については２〜３百万例が、毎年、米国において発生すると試算されている。この疾病の急性症候は、悪心、嘔吐、下痢、悪寒、発熱および疲憊を含む。約２，０００〜３，０００（０．１％）人が、毎年、米国においてサルモネラ中毒により死亡するが、これらの犠牲者は、幼児、病人および老人を含むのが普通である。家禽、赤肉、海産食品、卵、およびこれらの生産物を含むすべての食品は、特に、細菌性病原体を担持している可能性を有する。食品微生物学者への挑戦は、しばしば、多数の種々の他の細菌群を含む食料品から少数のこれらの選択された病原体を回収できるようにすることである。死滅寸前までに傷害を受けた細菌性病原体の回収は、なお一層困難である。加熱、凍結、化学薬品および他の加工段階は、食品中の病原細菌を死滅寸前まで損傷もしくは衰弱させることができる。５百万回以上のサルモネラの分析が、米国において年間実施されると試算される。臨床、食品、酪農、環境、および水のサンプルにおける細菌性病原体の慣用的検出は、少なくとも２種類の集積培養ブロスにおいて目的とする特定微生物を増殖させることを必要とする。最初は、サンプルが、１種類のブロス（前集積）に添加され、次いで、一定温度で一定時間培養される。次に、このブロスの一定量が、第２の種類の（選択的）集積ブロス中に添加され、次いで、一定温度で一定時間培養される。集積過程の目的は、サンプル中の極端に低いレベルの病原体を、検出に十分なレベルまで増殖させることである。例えば、２５グラムの食品サンプル中には、わずか１個の生きているサルモネラ細胞が存在するだけかも知れない。かくして、純粋培養アッセイ、免疫アッセイ、運動性固定アッセイおよびハイブリダイゼーション・プローブアッセイのようなアッセイにおいて検出を可能とするのに十分な高い濃度まで、サルモネラを増殖させることが必要である。もっとも感度の高い免疫アッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイは、一般に、集積培養において１ｍｌ当たり少なくとも１００，０００細胞、好ましくは１０，０００，０００細胞の存在を必要とする。典型的には、食品に保持される細菌性病原体の同定は、３つの基本段階を伴う：１．非選択的または前集積増殖：一般に、食品サンプルは、先ず、ストマッカーまたはブレンダーを用いて、非選択的、液体培地（前集積ブロス）中にホモジナイズされる。食品サンプルは、すべてが病原体ではないが、広範なスペクトルの細菌を含有している。これらの非病原菌叢は、検出されるべき病原種が標的生物体として既知であるのに対して、バックグラウンド生物体として言及される。しばしば、食品サンプル中に含有される標的生物体は、食品加工環境において損傷を受けており、蘇生させるためには非選択ブロスが必要である。食品に応じて、前集積の末期における標的対バックグラウンド生物体の比は、１：１から１：１００，０００までにわたることができる。サルモネラの典型的な前集積培地は、若干の変更はあるが、Bacteriological Analytical Manual，6th Edition， Association of Official Analytical Chemists，Arlington，VA(1984)に記載の種々の食品に対するラクトースブロスである。２．選択的集積：次に、サンプルは、標的微生物の選択的増殖を促進する培地で培養される。この段階では、選択的な阻害試薬をさらに含んでもよい増殖促進培地において、サンプルがさらに集積させられる。標的生物体の連続増殖は、バックグラウンド細菌の増殖を同時に抑制しながら達成される。３．選択平板培養：この段階は、バックグラウンド細菌の生育を抑制し、そして病原性標的であると考えられる純粋な分離したコロニーを肉眼的に識別できる固体選択培地を用いる。単離される「陽性の疑いのある」コロニーの相対的な数は、食品マトリックス、そしてまた液体および固体培地の選択性に依って異なる。望ましくは、単離されるべき疑いのある標的コロニーの数が、多数のバックグラウンドのコロニーの存在下に十分存在して、初期の生化学的確認、すなわち仮に陽性または陰性と同定するための標的物の統計的選択を可能にすることである。４．仮定的同定：陽性の疑いのあるコロニーは、さらに、適当な鑑別アガーに移植される。もし、これらの試験が陽性であれば、そのコロニーは、仮定的に陽性と考えられ、次いで、最終的確認と同定のために一連の生化学的および血清学的試験にかけられる。かくして、慣用の方法を用いると、陽性の疑いのある信号は、３日以内に作成でき、仮定的陽性は、４〜５日以内に、そして確認と血清学的同定は、５〜７日以内に行うことができる。陽性の同定までには時間がかかるので、食品がもつ細菌性病原体を、より一層迅速に陽性と同定する方法に対するニーズが存在する。例えば、もし、今、病原体決定に要する増殖段階の一つが、取り除かれたり、または短縮することができて、より迅速な同定が可能になれば、それは望ましいことであろう。本発明者は、水性二相分配が、食品マトリックスからの汚染細菌の標的対バックグラウンド比を選択的に高め、その結果、実際に、先に議論された先行技術の段階２に置き換わる能力を有することを発見した。水性二相分配技術は、粒子分離に対して長い間適用されてきた（Bronsted，J ．N．，Z ．Phys．Chem．Abt. A 257，(1931)）。Per-Ake Albertssonは、生物実質の分離のためにその方法の潜在力を実現させた最初の一人である（Per-Ake Al bertsson，"Partition of cell particles and macromolecules"，3rd edition ，J．Wiley & Sons，(1986)）。Albertssonの仕事以来、水性二相系における分配は、細胞表面の性質を明らかにしたり、決定するために、そして例えばタンパク質、酵素および核酸を分離するために使用されてきた。米国特許第4,980,065 号は、生化学剤および光学異性体の分離および精製に有用な水性二相系の使用を教示している。国際特許WO 90/05768は、汚染微生物を除去して工業滑沢剤を精製するための高分子二相系の使用を記述している。また、水性二相分配は、生物細胞分離のために、種々の方法で使用されてきた。例えば、Johanssonら（Anal ．Biochem，155，215，(1986)）は、種々の生物実質例えば、酵素、核酸、細胞オルガネラ、真核細胞、およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラおよびシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の菌株を含む細菌細胞の分配のための水性二相系の使用の総説を提供している。同様に、Tortoliら（Eur ．J．Clin．Microbiol．Enfect．Dis ．12，425，(1993)）は、臨床標本からのミコバクテリア単離のための水性二相系を開示している。種々の生物細胞を分離する二相系の能力に関与するメカニズムは、液体系に接する細胞壁もしくは細胞膜の生化学的組成に見いだされる変化に依っている。生物細胞、特に細菌細胞は、さまざまの構造体や生化学高分子、例えば、細胞表面に発現される線毛、鞭毛、タンパク質、酸性炭水化物およびリポ多糖をもっている。構造体や生化学的化合物の種類、および細胞表面上のそれらの発現程度や濃度は、物理化学的表面特性を決定する。異なる属、種もしくは菌株に属する細胞は、他の細菌群からそれらを区別し、識別する異なる物理化学的表面特性をもつ。例えば表面特性の一般的セットは、すべての細菌に共通するかもしれないが、これらの特性の変化の程度は、その細胞集団をその他から識別するであろう。これらの性質は、表面電荷、疎水性／親水性、細胞密度、サイズおよび形状における差異、ならびに、細胞が、他の細胞および／または他の種類の表面／界面（固体、液体もしくは空気）に接する時に働く表面力を規定する「表面エネルギー」を含む。二相系は、細菌細胞の表面特性の間の差異を利用して、非常に近い関係にある菌株をも分離するために、独特な適格性をもつ。例えば、Leviveら（J ．Liq．Chromatogr.，7，403，(1984)）は、表面特性が、長い多糖鎖と短い多糖鎖をもつリポ多糖分子の割合を除いては、同一であるサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の細胞を分離するために、向流分配クロマトグラフィーの使用を教示している。もっとも普遍的な水性二相高分子系の１つは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストランを含む。ＰＥＧ−デキストラン系は、特に、細菌細胞の分離に利用される。例えば、WO 9002948は、高分子二相系が、穀物産物における真菌胞子もしくは細菌細胞の定量的または半定量的測定に有用であることを例証している。さらに、Xiuら（J ．Gen．Microbiol.，129，3075，(1983)）は、異なる血清グループに属するサルモネラを分離するためのデキストラン−ポリエチレングリコールにおける水性二相分配の使用を開示し、そしてStendahlら（Acta P athol ．Microbiol．Scand．Sect．B Microbiol .，85，334，(1977)）は、平滑および粗面サルモネラ・チフィムリウムの表面電荷特性における差異を利用して、６．２％（ｗｔ／ｗｔ）デキストラン５００と４．４％（ｗｔ／ｗｔ）ポリ（エチレングリコール）６０００の使用に続くフリーゾーン電気泳動によって細菌を分離している。上記方法は、緊密な関係にある細菌の分離に有用であるけれども、食品または他の複合マトリックスから病原菌を単離、検出する問題に対して、水性二相系を適用する努力はなされなかった。また、今日まで、水性二相系は、種々のバックグラウンド細菌集団からある細菌属のすべてのメンバーを分離するというよりも、むしろ関連する細菌菌株を互いに分離するために使用されてきた。本発明者は、水性二相高分子系が、バックグラウンド微生物から特定の標的細菌属の全メンバーを、分離、濃縮するのに適応できることを発見した。標的病原体に関しては包含し、そしてバックグラウンド生物体と複合マトリックスの他の要素に関しては排除するという両面をもつ本方法の能力は、技術的に独特である。その上、二相分離は、実施にわずかな時間を必要とするだけであるので、この方法は、かなりの培養時間を要する選択的増殖過程を要求する従来の方法以上に、相当の時間の節減をもたらす。さらに、本発明者は、二相分離系の使用が、慣用法によっては検出されない病原体のある菌株の検出を可能にすることを発見した。それ故、汚染されたマトリックスからの病原体の分離および同定のための水性二相高分子分離技術の使用は、微生物検出技術における重要な進歩を表すものである。発明の概要本発明は、次の段階を含む、複合マトリックス内に含まれる標的微生物の分離方法を提供する：ｉ）該複合マトリックスをホモジナイズし、そして、前集積培地の存在下、該複合マトリックスを培養して、該標的微生物を蘇生し、増殖させ、それによって該複合マトリックス中の該標的微生物の数が増強させる段階；ｉｉ）段階ｉ）の該増強された複合マトリックスのサンプルを、少なくとも１種の水性高分子二相分離系中に乳化させる段階；ならびにｉｉｉ）該乳化系を上相と下相に分離させ、それによってサンプルからの著量の該標的微生物が、該上相か該下相のいずれかに見い出す段階。また、本発明は、次の段階を含む、複合マトリックス内に含まれる標的微生物の分離および検出方法を提供する：ａ）該複合マトリックスをホモジナイズし、そして、前集積ブロスの存在下、該複合マトリックスを培養して、該標的微生物を蘇生し、増殖させ、それによって該複合マトリックス中の該標的微生物の数が増強させる段階；ｂ）段階ａ）の該増強された複合マトリックスのサンプルを、少なくとも１種の水性高分子二相分離系中に乳化させる段階；ｃ）該乳化された系を上相と下相に分離させ、それによってサンプルからの著量の該標的微生物が、該上相か該下相のいずれかに見い出す段階；ならびにｄ）著量の該標的微生物を含む段階ｃ）の相から一定分量を採取し、そしてその一定分量中の該標的微生物の存在を検出する段階。その好適な実施態様では、標的微生物が細菌であり、複合マトリックスが食品であり、そして水性二相系がＰＥＧ／デキストランである。図の簡単な説明図１は、いずれかの二相液体高分子系に関する典型的な相図である。図２は、上相および下相の高分子組成を決定する方法を例証する、いずれかの二相液体高分子系に関する典型的な相図である。図３は、ＰＥＧ（６０００）およびデキストラン（５００）系の相図である。図４Ａは、種々の量のＮａＣｌを含むＰＥＧおよびデキストランにおけるＥ．コリ菌株の二相分離のプロットである。図４Ｂは、種々の量のＮａＣｌを含むＰＥＧおよびデキストランにおけるクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａ）菌株の二相分離のプロットである。図５は、フィードポイント組成における種々の量のＮａＣｌによる、Ｅ．コリおよびクレブシエラ・オキシトカの二相分離の結果を図示する。図６は、汚染された複合マトリックスからの標的病原微生物単離のための単系列の二相分離法を図示する。図７は、汚染複合マトリックスからの標的病原微生物単離のための２系列の二相分離法を図示する。図８は、前集積培地における混合菌の増殖時から二相分離スキムの末期までの、Ｅ．コリ、Ｅ．クロアカエ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）およびＣ．フロインディイ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）の混合集団の存在下で、Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の標的細菌対バックグラウンド細菌比における縮小を示すデータである。図９は、前集積培地における混合菌の増殖時から二相分離スキムの末期までの、摩砕牛肉中に接種されたＳ．チフィムリウムの標的細菌対バックグラウンド細菌比における縮小を示すデータである。図１０は、前集積培地における混合菌の増殖時から二相分離スキムの末期までの、乾燥ミルク中に接種されたＳ．チフィムリウムの標的細菌対バックグラウンド細菌比における縮小を示すデータである。図１１は、前集積培地における混合菌の増殖時から二相分離スキムの末期までの、摩砕牛肉、鶏肉、摩砕七面鳥および豚肉ソーセージ中に接種された多数のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種の標的細菌対バックグラウンド細菌比における縮小を示すデータである。発明の詳細な記述本明細書で使用される場合、次の用語は、請求の範囲および明細書の解釈のために使用されてもよい。用語「マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）」または「複合マトリックス（ｃｏｍｐｌｅｘｍａｔｒｉｘ）」は、種々の微生物の生育を支えるであろうすべての有機または無機物質を指すであろう。本発明のマトリックスは、事実上複合物であり、そして種々の生物の成長を支える種々の物質からなるであろう。典型的なマトリックスは、食品材料、生物組織、有機廃棄物、排泄物、血液、土壌、地下水、汚水およびそれに類するものの成分を含む。本明細書で使用される場合、用語「ストマッカー（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ）」または「ホモジナイザー」または「ブレンダー」は、互換可能に使用され、そして微生物と食品マトリックスを徹底的にブレンドおよび混合することができる機器を指すであろう。「ホモジナイズする」ことは、複合マトリックスが、小さいかなり均一な物質片に破砕されるように、機械的にブレンドまたは混合することを意味する。マトリックスが、既に微粒子状にされている場合には、「ホモジナイズ」段階は、マトリックスの単なる撹拌または混合によって行われて、微生物の均一な分布が達成される。用語「水性二相系」または「水性高分子系」または「二相系」は、激しい混合により、２種の高分子の分子構造、イオン的および静電的性質の間の差異に基づいて２相に分離するであろう、すべての２種の水溶性高分子の組み合わせを指すであろう。普通の二相水性高分子系は、他の高分子も可能であり、しばしば使用されるけれども、ポリエチレングリコールおよびデキストランを含んでなる。他の典型的な二相系は、それには限定されないが、ヒドロキシプロピル澱粉−ＰＥＧ／Ｈ₂Ｏ；フィコール−ＰＥＧ／Ｈ₂Ｏ；フィコール−デキストラン／Ｈ₂Ｏ；ポリビニルアルコール−デキストラン／Ｈ₂Ｏ；カルボキシメチルデキストランナトリウム−ＰＥＧ−ＮａＣｌ／Ｈ₂Ｏ；ＰＥＧ−リン酸カリウム／Ｈ₂Ｏ；および高分子両性電解質アクリル酸コポリマーを含んでもよい。いずれか１つまたは両方の高分子が、非イオン性か高分子電解質のいずれかである場合、または高分子の１種が、低分子量成分により置換できる場合には、さらに、その他の組み合わせ物も可能である。多相、好ましくは二相水性系は、単回でも、または連続「向流」系の部分として使用されてもよい。ここに使用される用語「向流分離」は、水性二相系の少なくとも２段階が使用される場合、および乳化が実施され、平衡が達成された後、各段階における高分子の相対重量％組成が同じである場合の二相水性分配を指すであろう。この方式では、目的の標的生物体に対するより高い選択性が得られる。用語「標的微生物」または「標的生物体」または「標的細菌」は、本方法によって単離され、同定されるべき微生物を指すであろう。標的微生物は、原核生物か真核生物のいずれでもよく、そして合成された混合培養のメンバーでもよいし、また複合マトリックス中の汚染菌として存在してもよい。特に興味ある標的微生物は、食品に保持される細菌である。用語「バックグラウンド微生物」または「バックグラウンド細菌」または「バックグラウンド生物体」は、標的生物体の存在下に見いだされるが標的生物体ではないすべての生物体を指すであろう。標的生物体と同様に、バックグラウンド生物体は、原核生物か真核生物かいずれでもよく、そして標的生物体に、遺伝的または生化学的に関連していても、関連しないなくてもよい。本発明の文脈上、もっとも興味あるそれらのバックグラウンド生物体は、食品に保持される細菌である。用語、あるサンプルの「著量の標的微生物」は、そのサンプルからの過半数の標的生物体を意味する。用語「選択増殖培地」は、標的生物体の増殖を増強し、バックグラウンド生物体の増殖を抑制するために、特別に作成された固体か液体かいずれかの増殖培地を指すであろう。その上、選択増殖培地は、標的生物体の検出を、一般に肉眼観察によって容易にするように計画された成分を含有してもよい。用語「前集積培地」は、標的およびバックグラウンド両微生物の増殖を促進するよう計画された液体か固体かいずれかの培地を指すであろう。微生物は、存在するすべての微生物数を増強させるために前集積培地に接種され、培養され、そして初期のサンプル処理において損傷を受けたかもしれないすべての標的生物体を蘇生させる。本発明の前集積培地は、種々の食品マトリックスのｐＨにおける変化を許容するよう緩衝化されるであろう。用語「集積」または「増強」培養物は、標的および非標的微生物数が増加する前集積培地における培養後に得られる培養物を指すであろう。用語「フィードポイント組成」は、混合および乳化前の、そして存在する各高分子成分の全重量％に基づき、そして相図に基づいて計算された、少なくとも２種の液相高分子の始発組成を指すであろう。本発明は、複合マトリックスからの標的微生物の迅速な単離および同定方法を提供する。標的微生物を含むと疑われるマトリックスのサンプルは、最初に、ホモジナイズされ、次いで、前集積培地に接種される。前集積培地における培養は、バックグラウンド微生物と検出されるべき標的微生物の両方の数を増強するのに役立つ。十分な培養時間の後、集積培養のサンプルは、典型的にはＰＥＧとデキストランを含む二相向流二相水性高分子系による分離にかけられる。二相系で行われる分離は、バックグラウンド上の標的生物体を単離（すなわち、優先的に選択）し、同定操作を容易にするのに役立つ。同定過程は、本好適な実施態様におけるように、選択的平板培養と肉眼的同定を用いて遂行できる。しかしながら、同定の別法は、例えば、同種またはハイブリダイゼーションアッセイ用の十分な標的ＤＮＡを得るためのポリメラーゼ連鎖反応のような遺伝子増幅技術；または例えばＥｌｉｓａ型アッセイを用いる抗体検出法を含むであろう。標的集積：食品に保持される細菌病原体の検出に関する最小工業基準は、食品マトリックス２５ｇ中１個の病原細胞の存在を確実に検出する方法である。この厳格な試験に適合するために、生化学的、免疫学的または核酸ハイブリダイゼーション手段によるその検出を容易にする目的で、標的病原細胞の増殖を増強するべく集積方法および培地が開発されてきた。典型的な集積操作は、標的生物体の増殖と正常化を増強するだけでなく、存在するいかなるバックグラウンドまたは非標的微生物の増殖をも促進するであろう培地を使用する。例えば、米国食品、医薬品局は、Andrewsら記載のサルモネラ・アッセイ法、”Isolation and Identification of Salmonella Species,”Chapter 7 in Bacteriological Analytical Manual． 6th Edition，Association of Official Analytical Chemists，Arlington，VA( 1984)を承認している。この方法では、少なくとも２回の集積段階が記載されている。最初の段階は、食品サンプルが、栄養的、非選択ブロス培地で増菌されて、傷害を受けたサルモネラ細胞を安定な状態へ回復させ、増殖を促進させる。次には、前集積ブロス（すなわち、第１の集積ブロス）のサンプルが、２種の選択集積ブロス（すなわち、第２の集積ブロス）に添加されるが、そこでは、サンプルが、選択試薬を含む増殖促進培地において、さらに集積される。各選択集積ブロスは、ほとんどの他の細菌の増殖を同時に抑制しながら、サルモネラ生物体の連続的増加を可能にする。本発明は、食品マトリックスからの細菌病原体の検出に特に適応された、特別に作成された前集積培地を用いることによって、上記標的集積法を改良した。２種の異なる培地が、本発明の好適な実施態様における使用のために開発されたが、１つは、具体的には、サルモネラに対するものであり、他は、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｌａ）に対するものである。これらの培地は、種々の食品マトリックスのｐＨの変化を許容できるよう高度に緩衝化されている。サルモネラ培地は、ラクトースブロス、リン酸カリウム、マニトール、塩化マグネシウムおよびペプトンからなる。リステリア培地は、ブレインハートインフュージョンブロス、グルコース、塩化リチウム、クエン酸第二鉄、高分子酸およびリン酸カリウムからなる。標準法において典型的な細菌標的の選択集積段階は除外され、そして本発明では、下記の二相水性分離系によって置換される。本発明の合成前集積培地が有効であることは、本培地におけるサルモネラおよびリステリアの増殖が、ＦＤＡによって示され、Bacteriological Analytical M anual．6th Edition前出に記載の培地と比較される場合に見られる。サルモネラ前集積ブロス（ＢＢＳＭ）とＦＤＡ’ｓＢＡＭラクトースブロスとの比較は、両培地における純粋なサルモネラ菌株の比増殖速度を比較することによって可能である。液体培地での増殖の場合に、生物体がたどるＳ型増殖曲線が与えられれば、曲線の対数増殖部分は、次の式によって記述できる：１ｎＮ＝１ｎＮ₀＋Ψｔ式中、Ｎ＝ある時間における細胞濃度「＝」細胞／ｍｌＮ₀ ＝時間０における始発細胞濃度 Ψ ＝（生物体の）比増殖速度［＝］１／ｈｒｔ＝増殖時間［＝］ｈｒ比増殖速度(Ψ)は、また、倍加時間(ｔ_D)または平均世代時間に関係し、もし、１つがＮ＝２Ｎ₀に設定されれば、すなわち、１倍加は：ｔ_D＝（１／Ψ）１ｎ２＝０．６９（１／Ψ）ＢＢＳＭ培地で増殖するサルモネラ菌株の比増殖速度は、ＦＤＡのＢＡＭラクトースブロスにおける比増殖速度と有利に比較される。比増殖速度は、以下のとおり比較される：ＢＢＳＭは、少なくともラクトースブロスに匹敵されることが証明される。水性二相高分子分離系：液体高分子相分離は、それが非常に温和な分画方法であり、さらに、生物材料を区別する広範な表面の装いや物理化学的性質の利点を利用するので、生物実質の分離に特によく適合される。もっとも単純な系は、一定の割合における２種の混和しない水性高分子の混合液を必要とする。高分子系の激しい混合は、最初に乳濁液をもたらし、最後に、２つの異なる相への高分子の分離をもたらす。手元の問題に対する適当な二相系の選択は不可避である。生物実質、（具体的には、分離操作を通して細胞の生存が維持されることが重要である生物細胞）の分離では、相は、温和であらねばならず、そして水含量、イオン組成、浸透圧および変性効果に対する考慮が払われねばならない。これらの配慮のほとんどは、有機溶媒を含む相を排除し、そして基本的に水溶性の高分子を残す。二相系による分離の基礎は、相間への物質の選択的分配である。溶解性物質では、分配は、主として２つの大きな相の間で起き、そして分配は、分配係数Ｋ、Ｋ＝Ｃ_t／Ｃ_b によって特徴付けられるが、式中、Ｃ_tおよびＣ_bは、それぞれ、上相および下相の分配物質の濃度（ｍｏｌｅ／ｌ）である。分配係数は、相の容積には依らず、２相の性質、分配物質の性質および温度によって影響される。分配を支配するメカニズムは、完全には理解されてないが、しかしながら、粒子および２つの高分子相間の水素、イオンおよび疎水的結合の相互作用が一緒になった結果であると思われる。一般に、分配への最大効果をもつ性質は、粒子の表面電荷、粒子の大きさ、および粒子の疎水性である。二相系における粒子の分配を支配する理論の完全な総括については、Per-Ake Albertsson、前出、または本明細書に引用によって組み入れられる米国特許第5,110,733号を参照せよ。単段階分離は、しばしば、細菌胞子のＤＮＡのように、均一な分配係数をもつ粒子の分離には十分である。種々の分配係数をもつ他の材料は、向流分配のような多段階操作を必要とするであろう。向流二相系は、乳化が実施され、平衡が達成された後、各段階における高分子の相対重量％組成が同じである水性二相系の少なくとも２段階を使用する。向流技術においては、サンプルは、先ず、第１段階の分離にかけられる。二相が平衡になった後、標的物に富む相の一定量が、第２段階に移される。第２段階は、移された標的物に富む相と混合されて、第１段階のそれと等しい高分子の相対重量％組成をもたらす特定バランスの高分子を含有する。段階の数が、１０または１００のオーダーに増えるにしたがって、「向流」系は、可変滞留時間を通して混合物を分離することにおいてクロマトグラフィーカラムのように働き始める。繰り返される相の分割と再混合は、さらに一層の精製を進める。典型的な向流法は、特定の物質の許容純度を得るために、しばしば、５０〜６０の別れた抽出を必要とする。理論上は、どんな段階数も、向流の実施には使用できる、しかしながら、本発明の目的のためには、３段階法が好適であり、そして必要ならば、例えばサルモネラの単離には、３段階法が２系列に分けられる。２系列に分けられた二相分離法は、各々が３段階をもち、向流方式で実施される２つの別々の異なる水性二相系セットを組み入れる方法を指す。２系列のアプローチにおいて、サンプルの第１の一定量が、第１の二相系での分離にかけられ、一方、サンプルの第２の一定量が、第２の二相系での分離にかけられる。両系の第３段階の完了で、各二相系の標的物に富んだ相のサンプルが、別々の選択増殖培地上に塗布される。標的物に富んだ相は、集積された量の標的微生物か、減少された量のバックグラウンド微生物、または両方の組み合わせ物を含む。この方式では、より高度に選択された目的の標的生物体が得られる。標的物が濃厚になるであろう相は、適当な水性二相系を用いて行われる純粋培養の単段階分配実験に基づいて予め決定される。適切な高分子：少なくとも２種の水性高分子からなる種々の高分子系が、本発明のために適切であり、そしてそれに限定されないが、次のものを含んでもよい：ポリエチレングリコール／デキストラン；ポリプロピレングリコール／デキストラン；ポリエチレングリコール／ポリビニルアルコール；ポリエチレングリコール／フィコール（スクロースとエピクロロヒドリンのコポリマー、Pharmacia Fi ne Chemicals，Uppsala，Sweden）；ポリビニルアルコール／デキストラン；メチルセルロース／デキストラン；ポリプロピレングリコール／ポリビニルピロリドン；電荷ポリエチレングリコール／デキストラン；ポリプロピレングリコール／メトキシポリエチレングリコール；ポリプロピレングリコール／ポリビニルアルコール；ポリプロピレングリコール／ヒドロキシプロピルデキストラン；ポリエチレングリコール／ポリビニルピロリドン；ポリエチレングリコール／澱粉；およびポリビニルアルコール／メチルセルロース高分子両性電解質−ポリビニルアルコール。これらと他の高分子のさらなる組み合わせ物も、また適切であり、文献（Per-Ake Albertsson,前出）から周知である。本単離に好適な高分子系は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストラン（Ｄｘ）の高分子を含む。ＰＥＧは、種々の分子量において入手できる直鎖の合成ポリマーである。ＰＥＧは、溶液において、それが発売されている乾燥粉末かフレーク状において、全く安定である。本発明の相分配法に使用されたUnion Carbide Corporationによって供給されたＰＥＧの通常の画分は、範囲約３００〜５０，０００、好ましくは範囲３００〜３０，０００の分子量をもつＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３，４００、ＰＥＧ８，０００およびＰＥＧ２０，０００を含む。他のＰＥＧの市販名は、ポリグリコールＥ（Dow Chemical）、Ｃａｒｂｏｗａｘ（Union Carbide）、およびｐｏｕｒａｃｏｌＥ（BASF）を含む。３０〜４０重量％のＰＥＧ保存液は、粉末の正確な秤取と室温での溶解によって作成される。ＰＥＧは、数時間の撹拌で容易に溶解し、そして新鮮な適切に保存されたＰＥＧ末は、通常０．５％未満の水分を含む。保存濃度は、屈折率によって測定できる。デキストラン、主としてポリ（α−１，６−グルコース）は、分子量画分の範囲約２，０００〜２百万において市販されている。また、誘導体についても同様の分子量のものが有用である。デキストラン２０〜３０重量％の保存溶液は、粉末を等重量の水を用いてペースト状に混合し、次いで、デキストラン中の水を考慮するために、目的より約１０％高い見かけの濃度を得るのに十分量の水を添加することによって作成される。デキストラン保存溶液は、室温で２〜３時間撹拌されるが、その時間は、加熱により短縮されてもよい。デキストラン保存溶液の濃度は、旋光分析によって測定できる。溶解度、相分離またはキラリティーを増進するために、水溶性高分子に塩類、例えばリン酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅および硫酸リチウム、単糖類および二糖類を添加することは、また、本発明の範囲内にあると考えられる。水性二相系は、高分子の保存溶液から調製されてもよい。保存溶液は、ｐＨを調節するために既知のバッファーを、そして溶液の張性を増すために塩を含んでもよい。好ましくは、リン酸カリウムバッファーが、ｐＨ調整に使用される。これらのバッファーおよび塩は、分離されるべき材料の性質に応じて選択され、そして前述の基準を用いて、容易に当業者によって決定できる。例えば、水溶性高分子は、一般に、電荷をもたず、高分子量であるので、それらの高濃度における溶液の張性への寄与は小さい。もし、分離されるべき混合物が、低イオン強度の溶液によって破壊されるであろう細菌細胞を含む場合には、塩の添加が指示されるであろう。相の張性は、蒸気圧浸透計を用いて測定できる。塩、バッファー、糖類およびポリマーのような添加物が、相分離や分離ファクターを増進するために添加されてもよい。適切な添加物は、リン酸カリウム、グルコース、グリセロール、ブチルセルソルブ、プロピルアルコールおよび塩化ナトリウムを含む。二相間の密度または疎水性における差を増し、いずれかの相の粘度を低下し、あるいは二相間の界面張力を増すことができる添加物は、相分離と分離ファクターを増進するであろう。また、温度および圧力も、相分離と分配係数を増進するために操作できる。適切な温度は、水性二相系が凍結始めるところから、水の沸点までの範囲、一般には、約−１０℃から１００℃までにわたる。しかしながら、標的微生物が生きていることが望ましいので、本発明の好適な温度は、０℃から３７〜４３℃の間までである。圧力の範囲は、二相系をもたらすすべての圧力、一般に０．０１〜１，０００大気圧を含む。好適な圧力は周囲圧力である。種々の分子量の種々のＰＥＧおよびデキストランが利用できるけれども、好適なＰＥＧは、ＰＥＧ（８０００）もしくはＰＥＧ（３４００）であり、好適なデキストランはＤｘＴ５００である。二相系の選択：特定の分離のための適当な高分子の選択は、相図の使用によって容易になされる。２種の高分子と水の混合液において、二相系は、構成分が、ある範囲の割合において存在する場合に、生じるであろう。相分離が起きる構成分組成は、図１に示されるような相図において表される。図１では、２種の高分子の濃度は、水中の高分子の重量％としてプロットされる。２つの領域を分ける曲線は、バイノーディアル・ルーカス・オブ・ポイント（ｂｉｎｏｄｉａｌｌｏｃｕｓｏｆｐｏｉｎｔｓ）と呼ばれる。線より上の点によって表される組成をもつすべての混合液は、二相分離を起こし、一方、線より下の点によって表される混合液は均質溶液を与える。平衡にある二相系は、図２の相図によって具体的に説明される。もし、図２の線Ｃ−Ｂ上の点Ａが、全系の組成を表すならば、その時、下相と上相の組成は、それぞれ、点ＢおよびＣによって表されるであろう。点Ａは、乳化前の系に添加される高分子系の成分の組成であるフィードポイント組成を表す。乳化および沈静の後、上相と下相の相対組成は変化し、そしてもはや、フィードポイントパラメーターを反映しない。かくして、相図は、フィードポイントの組成が知られる場合に、両相の組成を決定するために使用される。相図を支配する理論および二相系の組成の決定におけるそれらの使用の完全な議論については、Per-Ake Albertsson、前出、または本明細書に引用によって組み入れられる米国特許第5,110,733号を参照せよ。本発明は、バックグラウンド微生物により汚染された複合マトリックスからの特定の微生物集団の単離を実施するために、生物実質の二相分離のために使用される標準技術の改良を提供する。本発明の方法は、微生物細胞表面のパラメーターおよび二相系の性質の利点を利用し、そして細胞／二相系の動力学をうまく模して、特定の標的微生物に対する効果的な特殊な二相法を開発した。目的の標的生物体の単離のために適当なフィードポイント組成を決定する適切な段階的操作は、次の通りである：ａ）分離すべき細胞または生物実質に基づいて、使用される高分子の種類、分子量、ポリマー・リガンド、電解質、バッファー性能、沈静時間および温度を選択する；ｂ）前記Albertssonによる記述のように、一相と二相間、およびその逆の転移指標としてゲル浸透クロマトグラフィーか濁度のいずれかを使用することによって、上記系の二相図を構築する；ｃ）バイノーディアル曲線内に良好なフィードポイントを選択し、そしてサンプル中に共存すると思われる数種の標的およびバックグラウンド微生物を選択する；ｄ）微生物単離法の一部として使用される前集積培地において、これらの微生物の純粋培養を増殖させて、単離操作に対して典型的に提供される標的およびバックグラウンド生物体のバランスを達成する；ｅ）技術上周知の技術および方法（すなわち、コールターカウンター装置、光学密度、非選択アガ−上への塗布、等）を用いて培養物中の標的およびバックグラウンド細胞の細胞数を決定することによって、上記純粋培養物の各々を用いる単段階分配実験を行う；ｆ）標的およびバックグラウンド細胞について、上相、下相およびまた乳化（混合）相をサンプリングする；ｇ）適当なマスバランス式を書くことによって、上相と下相および界面における細胞画分を決定する；ｈ）上相か下相いずれかにおいて、バックグラウンドからの標的物の最大分離が最適である、全標的およびバックグラウンド生物体の分配結果を比較する；ｉ）もし、分離が不十分であれば、バイノーディアル曲線により近いフィードポイントを選択し、段階ｄ）〜ｈ）を繰り返す；ｊ）もし、操作条件が、二相を満足なものにしなければ、段階ａ）に進む。サルモネラおよびリステリアの分離のための二相高分子系：サルモネラおよびリステリアの分離のために有用な本二相系は、細胞分離のための先のそれらの使用に基いて選ばれたＰＥＧおよびデキストランからなる（P ．A.Albertsson、前出）。ＰＥＧとデキストランの始発フィードポイント組成は、図３に示された相図を基に決定された。水中５〜６．５％デキストランと水中３．５〜６．５％ＰＥＧの組み合わせが、前記段階的フィードポイント選択法を用いる標的およびバックグラウンド微生物の純粋培養の分配データを基に使用された。高分子系が選択された後、電解質とバッファーの濃度が、６種の細菌菌株の純粋培養を用いて決定された。電解質の濃度は、種々の電解質濃度に応じた純粋な標的およびバックグラウンド微生物の分配挙動に基づき、そしてまた、ＮａＣｌリン酸バッファーが、前集積ブロスからの固定量の種菌が添加される時に、二相系に持ち込まれるという知識により決定された。さらに、ＰＥＧ−ビス（アミン）（正電荷のＰＥＧ分子）が、細胞表面の電荷特性の利点を生かすため、そして標的およびバックグラウンド微生物の分配を増進するために二相系に添加される。細菌は、種々のＮａＣｌ量を含む０．０１２リン酸カリウムバッファー中４％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ（ＭＷ８０００）および０．０１２リン酸カリウムバッファー中５％（ｗ／ｗ）Ｄｘ（ＭＷ５００，０００）における二相分配にかけられた。図４Ａは、は、Ｅ．コリを用いるそのような分配の１つの結果を図示する。図４Ａにおいて見られるように、二相系のフィードポイント組成においてＮａＣｌ濃度を増大することは、先ず、上相に見いだされるＥ．コリを、下相に見いだされる大多数の細菌へとシフトし、そして最後に、高塩濃度では２相の界面における著量の細胞へのシフトをもたらした。この一般的パターンは、クレブシエラ・オキシトカ（図４Ｂ）およびすべての試験された細胞菌株について真実であったが、しかし各相における細胞の相対濃度は、種々の割合で変化した。例えば、０．０４ＭＮａＣｌで、そしてＥ．コリおよびＫ．オキシトカのそれぞれ５．８ｘ１０９および１．２ｘ１０８の細胞濃度では、Ｅ．コリ細胞の８８％およびＫ．オキシトカ細胞の９６％が、それぞれ上相および下相において濃縮された。次に、試験は、種々の量のＮａＣｌを用いる混合２種培養物の二相分配に関して実施された。図５は、フィードポイント組成において種々の量のＮａＣｌを用いるＥ．コリおよびＫ．オキシトカの二相分配の結果を図示する。混合培養のデータは、０．０４ＭＮａＣｌではＥ．コリ細胞の４６％のみが上相に動き、一方、Ｋ．オキシトカ細胞の９５％が下相に留まり、そしてＥ．コリ細胞の５２％が、界面に移動した点で、純粋培養とは異なった。これら、および他の混合培養からの結果に基づき、向流分離が、細菌細胞の分離に好適な方法であると結論された。それ故、潜在的な標的細菌病原体による実地試験を基に、そして細胞表面の性質の知識を用いて、本発明者は、各標的微生物のための向流二相分離系を築く方法を開発した。図７は、サルモネラ属に対する２系列の３段階向流二相分離系を略述する。前集積培養のサンプル１ｍｌが、２種の異なる二相分離系、ＡおよびＢに添加された。系Ａは、上相中に標的細菌を分配するように計画され、一方、系Ｂは、下相中に標的細菌を分配するように計画される。向流操作は、わずか３段階で上記のように行われ、その時点で、標的物を含有する相が、選択鑑別培地上に塗布され、そして検出のために培養される。食品マトリックスを含む実験においては、食品マトリックスが、一般にそして予期せぬことに、界面中に分配したことは注目されねばならない。かくして、３段階の最終段階では、ほとんどまたは全く、汚染している食品マトリックスは系中に残されない。二系列法の開発は、サルモネラ属標的細菌のすべての菌株および種の単離を可能にするために必要であった。実験的データは、サルモネラ菌株の分配係数には、大きな差があるので、すべての菌株が、非常に高い分配数と不明瞭な属の包括なしには、同じ相中に確実には分配できないということを示唆した。例えば、サルモネラ属は、非常に多様であり、約２，０００菌株からなる。本方法は、すべてのサルモネラ菌株を包括し、いかなる食品マトリックスからもすべてのサルモネラを単離させるものでなければならない。かくして、必要な分配数を減少させ、すべての標的細菌株の全包括を可能にするために、二系列法が考案された。リステリア種および属の細胞表面の性質の変異は、サルモネラよりも低く、そしてリステリアの属内の種菌株変異は、サルモネラよりも低いので、リステリアを分配するには、わずか１回の３段階水性二相系を必要とするだけであった。リステリアを標的とする水性二相系は、純粋なリステリアと他の拮抗する微生物の分配実験に基づき、そしてまたリステリア集積培地に適合させられる。食品マトリックス：実地状況への適用について本方法を試験する目的で、広い範囲の生鮮および加工食品が、サルモネラおよびリステリアの種々の菌株と混合され、そしてその混合物が、二相分離系にかけられた。食品マトリックスは、２つの分類、生鮮および加工物に分けられた。生鮮食品は、摩砕牛肉、摩砕七面鳥、鶏肉、鶏バック（ｂａｃｋ）、摩砕鶏肉、豚肉ソーセージおよび卵を含む。加工食品は、乾燥ミルク、全乳、ココア、サラダドレッシング、コテージチーズ、粗挽きコショウ、およびアイスクリームを含む。各種類の食品は、分離工程に大きく影響する種々のパラメーターを示した。例えば、多くの生鮮食品は、高濃度の非病原性微生物叢をもち、それが、接種された（または自然に存在する）サルモネラまたはリステリア標的菌株の増殖速度に拮抗的圧力を加えることができる。その結果、多くの標的菌株は、バックグラウンド細菌の拮抗的圧力により、バックグラウンド濃度よりも３桁〜４桁低い濃度レベルで増殖することが分かった。さらに、加工食品は、しばしば、損傷されたバックグラウンドの非病原性細菌を含むが、それらは、接種された標的菌株の増殖を特異的に妨げるだけでなく、標的細胞の増殖を阻害するであろう増殖阻害剤を含むかもしれない。しばしば、加工食品中に見いだされる発酵産物は、その生産物の発酵には有用であるが、接種されたり自然に存在する標的菌株には阻害的であるスターター、生菌を有する。最後に、食品の破片は、平板塗布や細菌培養の選択的増殖を阻害するので、食品マトリックス自体およびそれから発する種々の溶質化合物の存在でさえ、克服されるべき問題を提供する。予期せぬことに、好適な３段階向流二相分配系は、その系からすべての食品破片を事実上除去した。本水性二相系では、食品破片は、速やかに界面に移動して、その結果、第２段階に移行される量を低下した。同じ過程が、再度繰り返された時、事実上、標的相に残されるすべての食品は、除去され、そして移植および／または細胞塗布の妨害が防がれた。選択的増殖：本発明において、同定に使用される選択鑑別アガーは、微生物学の分野における基本であり、日常的に多くの参考方法とともに使用される。本発明の目的では、ＨｅｃｋｔｒｏｎＥｎｔｅｒｉｃ（ＨＥ）およびＸｙｌｏｓｅＬｙｓｍｅＤｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ＸＬＤ）アガーが使用された。両アガーは、ラクトースおよび／またはスクロースの細菌の利用に基づいている。これらのアガーにおけるサルモネラの同定は、不溶性の鉄−硫黄塩として代謝Ｈ₂Ｓガスの捕捉からもたらされる黒色コロニーの出現によって容易になる（Bacteriological An alytical Manual．6th Edition,前出）。酵母および藻類の分配：本発明の教示を用いて、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）のような種々の酵母を含む、他の微生物の混合物が、水性ＰＥＧ／デキストラン系において分離できた（実施例参照）。本発明の柔軟性を例証するために、酵母および藻類の数種の純粋培養物の分配特性が、サルモネラおよびリステリアについて開発された水性二相系を用いて試験された。酵母および藻類の混合物の分離は、たとえ水性二相系が、これらの細胞に最適ではなくても、数種については十分達成することができた。次の実施例は、本発明の重要な態様を具体的に説明することを意図するが、いかなる点においても限定されるものと考えてはならない。実施例材料および方法ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Sigma Co.）種々の分子量の直鎖合成ポリマー、およびＰＥＧ−ビス（アミン）（Sigma Co.）ＰＥＧの正電荷誘導体は、それぞれ２０％ｗ／ｗおよび１０％ｗ／ｗバッチで調製され、４℃で保存され、そして３〜４週間以内に使用される。同様に、種々の重量のデキストラン（Ph armacia）が、２０％ｗ／ｗバッチで調製され、４℃で保存され、そして３〜４週間以内に使用される。また、ヒドロキシプロピル澱粉（Reppe AB）が、同様に調製される。微生物培地（ブロス、選択および鑑別アガー）は、設定されたレシピーおよび滅菌条件にしたがい、そしてDifco Co.またはBecton-Dickson and Co.のような販売者から購入して、実験室において調製される。細菌菌株は、内部DuPontコレクションの１部である。酵母菌株は、the Americ an Tissue Culture Collection(ATCC)から、そして藻類菌株は、Ward's Natural Science Establishment，Live Materials Departmentからのものである。水性二相系における純粋培養物の挙動の位置付けは、ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Coulter Corp.）および／または非選択ヌートリエントアガー上への十倍希釈による直接平板塗布によって決定される。微生物：次の実施例において試験された微生物菌株は、種々の細菌、酵母および藻類からなり、以下に列挙される：サルモネラ属：（内部DuPontデータベース）Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｙｍｕｒｉｕｍ），Ｓ．ハイデルベルグ（Ｓ．ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、Ｓ．ブレデネイ（Ｓ．ｂｒｅｄｅｎｅｙ），Ｓ．エンテリジチス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ），Ｓ．ハダール（Ｓ．ｈａｄａｒ），Ｓ．トンプソン（Ｓ．ｔｈｏｍｐｓｏｎ），Ｓ．インファンチス（Ｓ．ｉｎｆａｎｔｉｓ），Ｓ．ニューポルト（Ｓ．ｎｅｗｐｏｒｔ），Ｓ．アリゾナエ（Ｓ．ａｒｉｚｏｎａｅ），Ｓ．ベルタ（Ｓ．ｂｅｒｔａ），Ｓ．モンテビデオ（Ｓ．ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ），Ｓ．ガリナルム（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ），Ｓ．アゴナ（Ｓ．ａｇｏｎａ），Ｓ．ケドウゴウ（Ｓ．ｋｅｄｏｕｇｏｕ），Ｓ．ビンザ（Ｓ．ｂｉｎｚａ），Ｓ．ビルコウ（Ｓ．ｖｉｒｃｈｏｗ），Ｓ．アナタム（Ｓ．ａｎａｔｕｍ），Ｓ．セントポール（Ｓ．ｓａｉｎｔｐａｕｌ），Ｓ．スタンレイ（Ｓ．ｓｔａｎｌｅｙ），Ｓ．ブランデンブルグ（Ｓ．ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ），Ｓ．ナポリ（Ｓ．ｎａｐｏｌｉ），Ｓ．ブラエンデオウプ（Ｓ．ｂｒａｅｎｄｅｏｕｐ），Ｓ．ブロックレイ（Ｓ．ｂｌｏｃｋｌｅｙ），Ｓ．マンチェスター（Ｓ．ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ）リステリア属：（内部DuPontデータベース）Ｌ．モノシトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ），Ｌ．ウェルシメリ（Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ），Ｌ．イバノビイ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ），Ｌ．ムライ（Ｌ．ｍｕｒｒａｙｉ），Ｌ．イノクア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ），Ｌ．グライ（Ｌ．ｇｒａｙｉ）真菌類：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ２３４１，カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ７５０藻類：（Ward's Natural Science Establishment）（Rochester，New York）ナビクラ・ペリクロサ（Ｎａｖｉｃｕｌｌａｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）（褐色珪藻類）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｏｒｅｌｌａｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）（緑藻類）、ペリジミウム種（Ｐｅｒｉｄｉｍｉｕｍｓｐ．）（渦鞭毛藻類；黄金色）、アナシスチス・ニヅランス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓｎｉｄｕｌａｎｓ）（藍藻類）、カリタミオン種（Ｃａｌｉｔｈａｍｍｉｏｎｓｐ．）（紅藻類）増殖条件：全サルモネラは、前集積培地、ＢＢＳＭ中、３７℃、振盪で培養された。リステリア培養は、前集積ＬＢＨＩブロス中、３０℃、高速（３００ｒｐｍ）で激しく撹拌する振盪機／培養機で培養された。酵母培養は、標準Ｓａｂａｒａｕｄデキストロースブロス（Difco）中、２７ ℃で増殖された。種々の藻類は、次のような販売元によって提供されるそれぞれの特殊培地において増殖された：ナビクラ・ペリクロサは、Ｂｒｉｓｔｏｌ液（Ward's,前出）において、クロレラ・ピレノイドサは、Ｂｒｉｓｔｏｌ液（Ward's,前出）において、ペリジミウム種は、土壌培地培養（Ward's,前出）において、アナシスチス・ニヅランスは、Ｂｒｉｓｔｏｌ液および／またはＥｒｄｓｃｈｒｅｉｂｅｒ液（Ward's,前出）において、カリタミオン種は、Ｅｒｄｓｃｈｒｅｉｂｅｒ液において増殖された。藻類は、１８〜２４℃、蛍光下で培養された。前集積ブロス：ＢＢＳＭおよびＬＢＨＩの組成は、以下の通りである：ＢＢＳＭ（サルモネラ）ラクトースブロス１３ｇ／ｌＫＨ２ＰＯ４３４ｇ／ｌマニトール７.５ｇ／ｌＭｇＣ１２．６Ｈ２Ｏ５.０ｇ／ｌ水１.０１^* ^*ＮａＯＨでｐＨ７.０に調整ＬＢＨＩ（リステリア）ブレインハートインフュージョン３７.０ｇ／ｌＫＨ２ＰＯ４６.８ｇ／ｌグルコース５.０ＬｉＣｌ１０.０ｇ.ｌクエン酸第二鉄２０.０ｍｇ／ｌピルビン酸ナトリウム０.２ｇ／ｌアクリフラビン７.５ｍｇ／ｌシクロヘキシミド２５ｍｇ／ｌナリジキシン酸２０.０ｍｇ／ｌ木炭１.０ｇ／ｌ水１.０１^* ^*ＮａＯＨでｐＨ７.０に調整選択的増殖：サルモネラの同定用選択培地は、ＨｅｃｈｔｒｏｎＥｎｔｅｒｉｃ（ＨＥ）またはＸｙｒｏｓｅＬｙｓｍｅＤｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ＸＬＤ）アガー（Difco）である。リステリアの同定用選択培地は、LiC1濃度を増大した改変ｏｘｆｏｒｄアガー (ＭＯＸＡ)である。ＭＯＸＡの組成は、以下の通りである：ＭＯＸＡコロンビアブラッドアガーベース３９ｇ／ｌエスクリン１０ｇ／ｌクエン酸第二鉄アンモニウム５ｇ／ｌＬｉＣｌ１５ｇ／ｌ水１１^* ^*ＮａＯＨでｐＨ７.０に調整酵母は、ＢＨＩアガープレート（Difco）で選択的に増殖される。藻類は、平板培養されず、液体培地で増殖した時の色を基に同定される。二相水性高分子系：本発明で使用されるフィードポイント二相水性高分子系は、以下の表１〜２に列挙される。系は、サルモネラおよびリステリアの単離のために開発された。また、これらの組成物は、酵母および藻類の混合培養の分離に有用であるように決定された。実施例１純粋培養の混合集団からの標的細菌の分離実施例１は、細菌の分離のための二相水性高分子系に有効な組成物を決定するために使用された方法を例証する。単段階水性二相分配実験は、クレブジラ・オキシトカ、Ｅ．コリ（６５６）、スタフィロコッカス・エピデルミチス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｔｉｓ）およびラクトバチルス・カルニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｒｎｉｓ）の純粋培養を用いて行われた。細胞は、Ｐｅｎａｓｓａｙブロスで一夜増殖され、翌日、低速遠心によって集菌され、そして２０ｍＭリン酸カリウムバッファーで２回洗浄された。その細胞は、最後に、１０ｍＭリン酸カリウムバッファーに再懸濁された。全容量は１０ｍｌであった。水性二相系のフィードポイント組成は、ＮａＣｌ含有および不含の１００ｍＭカリウム中、４％ｗ／ｗＰＥＧ（８０００）、５％ｗ／ｗデキストラン（Ｔ５００）であった。マスバランスは、種菌容量１ｍｌ、上相および下相中の細菌を数えることによって行った。全容量は、１０ｍｌであった。分配は、室温で３０〜５０分間放置（沈静時間）して実施した。純粋培養の分配挙動が最初に解析され、その結果が、以下の表３に示される：表３のデータは、基準化され、各画分中の細胞％を表す。純粋培養の分配結果に基づき、Ｅ．コリ（６５６）とスタフィロコッカス・エピデルミチス、またはＥ．コリ（６５６）とクレブジラ・オキシトカのような二種混合物が、同じ組成の単段階水性二相系中に添加され、そして各微生物の分配挙動が、マスバランスチェックと前記標的各微生物の選択鑑別アガーを実施することによって測定された。二種の細菌混合物の単段階分配結果は、以下の表４に一覧される：表４のデータは、基準化され、各画分中の細胞％を表す。表４のデータから例証されるように、Ｅ．コリ（６５６）を上相そしてＫ．オキシトカを下相に選択することが先験的に知られていれば、水性二相分配の１段階において、Ｅ．コリ（６５６）／Ｋ．オキシトカの二種混合物を分離することが十分可能であった。二種混合物Ｅ．コリ（６５６）／Ｓ．エピデルミチスの分離は、両微生物の大部分が界面に移動したので、理想的には行かなかった。しかしながら、残りの部分は、反対相、Ｅ．コリ（６５６）を上相、そしてＳ．エピデルミチスを下相に分配した。細胞が、可逆的に界面に吸着するならば、向流多段階操作が、Ｅ．コリ（６５６）とＳ．エピデルミチスを効果的に分離するであろうと決定した。実施例２純粋培養の混合集団からのサルモネラの単離実施例２の目的は、前集積ブロスにおける増殖２０時間後に、バックグラウンド細菌の混合集団からサルモネラを分離する能力を例証することである。次の細菌株が、分離されるべき混合物を作るために、一緒に増殖された：Ｓ．チフィムリウム（ＬＴ２）標的Ｅ．コリ（９２５）バックグラウンド細菌Ｅｎｔ．クロアカエ（１０７４）バックグラウンド細菌Ｃ．フロインディイ（８９４）バックグラウンド細菌分離は、３段階の向流スキームを用いて実施された（図６）。使用された始発フィードポイント組成は、次の通りであった：段階＃１：５％ｗ／ｗデキストラン（Ｔ５００）４％ｗ／ｗＰＥＧ（８０００）０．０２５ＭＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ１ｍｌサルモネラ細胞第１段階の総容量は、二相成分１０ｇの総容積に対応する約９．５ｍｌであった。段階１〜３の分配は、次の操作にしたがって実施された：（ａ）細胞を含まない段階＃１と同じ組成をもつ「マスター」二相系が、調製され、乳化され、そして約１時間沈静化するために放置された。（ｂ）段階１の下相の一定量が、向流スキームの段階＃２と＃３になる空のチューブ中にピペットで注入された。下相の量は、段階＃２では約５．３、そして段階＃３では４．０ｍｌであった。（ｃ）混合培養を含む前集積ブロス１ｍｌが、段階＃１のチューブに添加された。混合および沈静化の後、段階＃１の上相約５．５ｍｌが段階＃２に転移された。段階＃２の内容物が、上記のように混合され、沈静化され、次いで、上相内容物の約４．１ｍｌが、段階＃３成分を含むチューブに転移された。混合および沈静化がもう１回実施された。（ｄ）段階＃３が、３０分間沈静化のため放置され、次に、その上相の内容物が連続的に希釈され、そして菌数を数えるためにＢＨＩおよびＸＬＤアガー上に塗布された。上記の用に、ＢＨＩアガーは、全細菌濃度を測定するために使用されたが、ＸＬＤアガーは、サルモネラ濃度を測定するために使用された。この分配操作は、第１，２および３段階のフィードポイント組成が、相図（図３）において互いに近く、二相の枠内によく当てはまることを確認した。いかなる容量の組み合わせも、二相系が二相の枠内に長い間よく留まるようにすることが可能である。標的およびバックグラウンド細菌濃度は、ＢＨＩおよびＸＬＤアガー上の希釈塗布により、時間０，２０、および３段階向流分配スキームの終了後に、測定された。菌数を数えれば、標的−バックグラウンド比が、各操作時間において計算され、そしてデータは、図８に示される。この実施例は、向流３段階スキームで実施された水性二相分配が、バックグラウンド微生物の混合集団からの標的サルモネラの効果的な分離に使用できることを例証している。実施例３摩砕牛肉および乾燥ミルク食品マトリックスからのサルモネラの単離実施例３は、３段階向流水性二相系が、食品マトリックスからサルモネラの１種を分離し、単離するために使用できることを例証する。Ｓ．チフィムリウムＡＴＣＣ（１０８４）細胞が、食品マトリックス２５ｇを含むサルモネラ前集積ブロス（ＢＢＳＭ）（２２５ｍｌ）中に接種された。食品マトリックスは、摩砕牛肉か乾燥ミルクのいずれかからなった。各食品マトリックスからの在来微生物叢が、バックグラウンド微生物を提供し、具体的には特定されなかった。サルモネラを接種された食品マトリックスは、前述のように増殖され、実施例２で使用されたと同じ分配操作にかけられた。向流系の段階＃３からのサンプルが、実施例２記載のように、鑑別のために平板塗布され、そして分配結果が、図９および図１０に示される。図９は、摩砕牛肉中に接種されたサルモネラの分配データを示し、図１０は、乾燥ミルク中に接種されたサルモネラの同様データを示す。図９および図１０のデータによって分かるように、本二相系は、種々のバックグラウンド微生物で汚染された複合食品マトリックスからのサルモネラ種の単離に有効である。実施例４食品マトリックスの種々の組み合わせからの広範囲なサルモネラ種の単離図４は、種々のバックグラウンド細菌に汚染された複合食品マトリックスから、広範囲なサルモネラ種を単離するための本方法の能力を例証する。サルモネラの１１２株が、「材料および方法」の項に列挙した種に対応して試験された。食品マトリックスは、２分類、生鮮および加工物に分けられた。生鮮食品は、摩砕牛肉、摩砕七面鳥、鶏肉、鶏バック（ｂａｃｋ）、摩砕鶏肉、豚肉ソーセージおよび卵を含む。加工食品は、乾燥ミルク、全乳、ココア、サラダドレッシング、コテージチーズ、粗挽きコショウ、およびアイスクリームを含む。すべての食品は、地方の販売店から市販品を得た。実施例２のように、単離方法は向流系を含むが、より大きくサルモネラ属を包括するために、その方法は、図７に具体的に説明されるように、２系列に分けられた３段階向流系に改変された。使用された二相系のフィードポイント組成は、Ａ，Ａ＊；Ｂ，Ｂ＊として言及され、そして「材料および方法」の項の表１に記載される。種々のサルモネラ株の培養は、１２０ｒｐｍの振盪機／培養機において、１２５ｍｌフラスコ中ヌートリエントブロスで、３７℃一夜増殖された。試験された各食品マトリックスでは、２５ｇのサンプルが、ＦＤＡ’ｓＢＡＭｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Bacteriological Analytical Mannual．6th Edition,前出）によって、サルモネラ前集積ブロス（ＢＢＳＭ）２２５ｍｌとともに、ストマッカー中で混合された。これらの混合物の各々に、種々のサルモネラ菌株が、約０．０１細胞／ｍｌの細胞濃度で接種された。この細胞濃度は、ＦＤＡ’ｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Bacteriological Analytical Mannual．6th Editio n,前出）によって要求される食品マトリックス２５ｇ中サルモネラ細胞１個の最小検出レベルに対応した。次いで、接種されたブロスは、滅菌５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中に移され、静置条件下で２０時間、３７℃で培養された。ＢＢＳＭブロス２２５ｍｌ中に未接種の食品マトリックスを含むネガティブ対照フラスコは、常に、試験される各セットの１部であった。前集積の後、前集積ブロス１ｍｌづつの２分量が、図７に示される水性二相系ＡおよびＢにそれぞれ添加された。２種の水性二相系ＡまたはＡ＊、およびＢまたはＢ＊（表１）は、サルモネラ株７７株の純粋培養の単段階分配挙動の実施例１記載の広範なスクリーニング実験に基づいて、決定された。３段階向流分離を実施するために使用された操作法は、実施例２および３記載のものとはやや異なっていた。水性二相系の全量（すべて他の価値の１０または５ｍｌのいずれか）に応じて、段階＃１または＃２からの系Ａ（またはＡ＊）の上相の一定量（４または２ｍｌ）または系Ｂ（またはＢ＊）の下相の一定量（３．０または２ｍｌ）が、それぞれ段階＃２または＃３に移された。適当な量および相を移すことにより、全体でのフィードポイント成分が、段階＃１と丁度同じにするために、段階＃２および＃３は、適当なバランスの水性二相成分を含んだ。かくして、段階＃１のフィードポイント組成（系Ａ／Ａ＊またはＢ／Ｂ＊）が、ポイントＡ’であったならば（図２）、段階＃２および＃３の転移を実施するには、またポイントＡ’か、最小ではそれに非常に近いポイントであった。二相分離に続いて、上相（第３段階、系Ａ／Ａ＊）または下相（第３段階、系Ｂ／Ｂ＊）の１０μｌが、前記ＸＬＤまたはＨＥ選択鑑別アガーにストリークされた。各プレートは、３７℃で２４時間培養された。標的サルモネラコロニーの同定は、不溶性ＦｅＳ塩のようなＨ₂Ｓ沈殿による黒色形成に基づいた。データは、水性二相分配段階後０時間、２０時間および直後に収集された。測定されたサルモネラおよび全細菌濃度に基づいて、標的対バックグラウンド比が、各工程時間において計算され、全工程、特に二相段階の成績を評価するのに使用された。標的対バックグラウンド比による種々の食品マトリックスからの標的サルモネラ濃度の単離を例証するデータは、図１１に示される。図１１のデータによって分かるように、試験されたすべてのサルモネラ種の大部分は、食品マトリックスの如何にかかわらず、組成Ａの上相か、または組成Ｂの下相のいずれかに分配された。１１２種の接種された食品実験のすべてに基づいて、前述の食品マトリックスのいずれかにおける種菌サルモネラ回収の統計的数値は、次に通りである：回収されたサルモネラ：いくつかの場合では、接種されたものと異なる在来サルモネラが、ネガティブ対照およびある接種食品サンプルにおいて回収されたことは、指摘する価値がある。粗挽き黒コショウのサンプルは、Ｓ．ニューポルトＡＴＣＣ（１２６６）（ポリグループＢ）を接種され；単離された疑いのあるコロニーの数種は、在来サルモネラ菌株の潜在的存在を示唆するポリグループＡと確認された。摩砕七面鳥のネガティブ対照サンプルは、血清グループＢの在来サルモネラをもつと確認された。分離株は、両水性二相系ＡおよびＢから釣菌された。さらに、同じ食品マトリックスのいくつかの接種サンプルは、接種されたサルモネラ菌株Ｓ．パナマＡＴＣＣ（１２５０）、ポリグループＡ／血清グループＩに加えて、血清グループＢサルモネラ（系Ａ）をもつことが確認された。同様に、ポリグループＡにはいるＳ．ハイデルベルグＡＴＣＣ（１２３９）を接種された摩砕七面鳥サンプルについても、事実、血清グループＢサルモネラが両系ＡおよびＢにおいて回収された。食品マトリックスが、向流法の第３段階の最後には完全に除去されたことは、注目すべき重要なことである。本方法が、種々の食品マトリックスから広範囲のサルモネラ菌株を単離することができることは、実施例４から明白である。さらに、本方法が、最初に実験的に導入されたものでない、食品からのサルモネラ菌株を単離できる感度の高いものであることも明らかである。実施例５ＦＤＡ’ｓＢＡＭ法と二系列サルモネラ法の比較実施例５は、本二系列二相向流法が、汚染された食品からのサルモネラの検出および単離に関する工業基準と、有利に比較されることを例証する。１０種の実験が、生鮮および加工食品、および８種のサルモネラを用いて実施された。実験は、二相系についての実施例４記載のように実質的に行われた。同じ食品マトリックスとサルモネラ菌株が、前出のBacteriological Analytical M anual．6th Editionに記載のＢＡＭ法により解析され、そして比較結果は、下記の表６に示される。二系列サルモネラ法が、ＦＤＡ’ｓＢＡＭ法と比較されたが、前者は、後者よりも少なくとも２４時間迅速な方法であった。実施例６食品マトリックスからのリステリアの単離食品マトリックスにおいて他のバックグラウンド生物体からのリステリア属を単離するための水性二相系が、前記実施例記載のサルモネラの方法と同じ方式において開発された。最適な水性二相系は、ＬＬ−ＰまたはＡ₂Ｐ−８２と命名され、そして「材料および方法」の項の表２に記載される。これらの組成物は、数種のリステリア種、および潜在的に拮抗菌として知られる他のバックグラウンド細菌の純粋培養についての単段階分配データを用いて、候補の二相系を幅広くスクリーニングした後に選択された。食品マトリックスからのリステリア単離の提案されたスキムは、サルモネラのそれと類似するが、例外として、二系列分配スキムの場合における図６に記載の３段階向流水性二相系を、１系列で実施した。また、実施例４におけるように、ほとんど全食品マトリックスは、リステリア二相系による第３段階の最後に除去されることが観察された。リステリアが存在すると予想される数種の新鮮および加工食品が試験された。これらは、乾燥ミルク、サラミ、リコッタチーズ、摩砕豚肉、ベーコン、ブリーチーズおよびサワークリームを含んだ。食品は、実施例４に略述される操作にしたがって種々のリステリア種を用いて、低レベル（約１．０ｘ１０^-2および１．０ｘ１０^-1細胞／ｍｌ）で接種された。振盪機／培養機（３００ｒｐｍ；強い撹拌）において３０℃２４時間、接種およびネガティブ対照サンプルを培養した後、リステリア集積ブロスからの１つのサンプルが、水性二相系の第１段階に転移された。向流分配が一度行われた後、標的の上相（系ＬＬ−Ｐ）１０μｌが、改変ＯｘｆｏｒｄＡｇａｒ（ＭＯＸＡ）プレート上にストリークされた。そのプレートは、３０℃で２４時間培養された。疑いのあるリステリアコロニーは、メタリック灰色、およびａｅｓｃｕｌｉｎ加水分解の結果であるコロニー周辺のレンガ／ベーコン色に基づき、バックグラウンドから区別された。選択鑑別アガー（ＭＯＸＡ）上のリステリア単離に加えて、リステリアおよび全バックグラウンド微生物の濃度が、集積／増殖段階の末期（ｔ＝２４時間）に、そして水性二相段階の後に、ＢＨＩおよびＭＯＸＡプレート上で希釈／計数することによって測定された。また、標的対バックグラウンド比の評価が、ストリークプレートの結果とともに使用されて、接種リステリア種の単離および水性二相分配段階の有用性を評価した。全食品マトリックスは、３並列のフラスコにおいてリステリアを接種された。その結果の総括が、下記表７に示される：実施例７酵母および藻類の分配挙動実施例７は、細菌以外の生物体が、本方法により単離および検出されることを例証する。水性二相系Ａ＊，Ｂ＊およびＡ₂Ｐ８２（単段階）において数種の酵母および藻類の分配特性が試験された。酵母および藻類の種は、次の通りであった：酵母：サッカロミセス・セレビシエ（２３４１）ＡＴＣＣカンジダ・トロピカリス（７５０）ＡＴＣＣ藻類：ナビクラ・ペリクロサ（褐藻類）クロレラ・ピレノイドサ（緑藻類）ペリジニウム種（黄金色藻類）アナシスチス・ニヅランス（藍藻類）カリタミオン種（紅藻類）。酵母の分配挙動は、実施例１）のようにマスバランスを実施することによって決定された。各相の計数は、ＢＨＩアガー上での１０倍希釈およびプレート塗布によって行われた。藻類が示す色彩の利点を生かして、上相または下相のいずれか、または界面における藻類の移動を肉眼的に検査して定性的に決定され、そしてまた写真撮影された。酵母および藻類の分配挙動は、下記表８に総括される：上記データに基づき、本発明者は、酵母および藻類の限定的分離が、二系列または単段階の二相系を用いる本方法を適用することによって得ることができると確信する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年５月２８日【補正内容】請求の範囲１．下記段階を含んでなる複合マトリックス内に含まれる多様なバックグラウンド生物体集団からの特定の属の標的微生物の分離方法。ｉ）該複合マトリックスをホモジナイズし、そして前集積培地の存在下、該ホモジナイズされた複合マトリックスを培養して、該標的微生物と該バックグラウンド微生物を蘇生し、増殖させる段階；ｉｉ）段階ｉ）の該ホモジナイズされた複合マトリックスのサンプルを、特定のフィードポイント組成をもつ少なくとも１種の水性高分子二相分離系中で乳化する段階；ｉｉｉ）該乳化されたサンプルを、各々の水性高分子二相分離系の上相と下相に分離させ、それによって乳化されたサンプルからの著量の該標的微生物を、該上相か該下相のいずれかに見い出し、著量の該バックグラウンド微生物を、その他の該上相か該下相に見い出す段階；ｉｖ）段階（ｉｉｉ）の該上相の一定分量および新しい水性成分が、段階（ｉｉ）の特定のフィードポイント組成を達成するような新鮮な水性高分子成分のバランスにおいて、その一定分量を乳化する段階；ｖ）段階（ｉｉｉ）の該下相の一定分量および新しい水性成分が、段階（ｉｉ）のフィードポイント組成を達成するような新鮮な水性高分子成分のバランスにおいて、その一定分量を乳化する段階；ｖｉ）場合により、段階（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を、一回以上繰り返す段階；ならびにｖｉｉ）段階ｖｉ）の該上相か該下相のいずれかにおいて、該標的微生物の存在を検出する段階。２．検出段階（ｖｉｉ）が、下記のように遂行される、請求の範囲１の方法。ａ）段階（ｉｉｉ）、（ｉｖ）または（ｖ）の上相または下相から一定分量を採取し；ｂ）該一定分量を、１種以上の固体、選択増殖培地上に平板塗布し；そしてｃ）該標的微生物の肉眼的検出を可能にするのに十分な時間、該接種された固体、選択増殖培地を培養する。３．特定の属の該標的微生物が病原細菌である、請求の範囲１の方法。４．該病原細菌が、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、クレブシエラ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである、請求の範囲３の方法。５．該複合マトリックスが食品である、請求の範囲１の方法。６．該食品が、摩砕牛肉、摩砕家禽、摩砕豚肉、卵、乾燥ミルク、全乳ココア、サラダドレッシング、スパイスまたはチーズ製品である、請求の範囲５の方法。７．段階ｉ）において、該標的微生物がサルモネラ属のメンバーであり、そして該前集積ブロスがＢＢＳＭである、請求の範囲１の方法。８．段階ｉｉ）において、該サンプルが、さらに、２種の異なる水性高分子二相系である、第１の二相系および第２の二相系中で乳化され該第１の二相系が、６．５％ｗ／ｗデキストランＴ５００および６．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール３４００を含み；そして該第２の二相系が、５．０％ｗ／ｗデキストランＴ５００および３．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００を含む請求の範囲７の方法。９．段階ｉｖ）が、さらに、該第１の二相系の該上相の一定分量および新鮮な水性高分子成分が、第１の二相系の特定のフィードポイント組成を達成するように新鮮な水性高分子成分のバランスにより、その一定分量を乳化することを含み；そして段階ｖ）が、さらに、該第２の二相系の下相の一定分量および新鮮な水性高分子成分が、該第２の二相系の特定のフィードポイント組成を達成するように新鮮な水性高分子成分のバランスにより、その一定分量を乳化することを含む、請求の範囲８の方法。１０．段階ｖｉｉ）における該標的微生物の存在が、固体、選択増殖培地上への平板塗布によって、第１の二相系か第２の二相系のいずれかにおいて検出される、請求の範囲９の方法。１１．該標的微生物が細菌属リステリアのメンバーであり、そして該前集積培地がＬＢＨＩである、請求の範囲１の方法。１２．段階ｉｉ）において、該サンプルが、３％ｗ／ｗデキストランＴ５００、１．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００、１％ｗ／ｗポリオキシエチレングリコールビス（ＮＨ₂）３３５０および６．０％ｗ／ｗポリエチレングリコール２０００か、または１８％ｗ／ｗヒドロキシプロピル澱粉Ｐ＆Ｓ２００、５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００および１％ｗ／ｗポリオキシエチレンビス（ＮＨ₂）３３５０のいずれかを含む水性高分子二相分離系により乳化される、請求の範囲１１の方法。１３．該固体、選択培地が、ヘクトン・エンテリック・アガー（ＨｅｋｔｏｅｎＥｎｔｅｒｉｃａｇａｒ）およびキシロース・リジン・デスオキシコレート・アガー（ＸｙｌｏｓｅＬｙｓｉｎｅＤｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅａｇａｒ）からなる群より選ばれる、請求の範囲２または１０の方法。１４．検出段階ｖｉｉ）が、下記のように遂行される、請求の範囲１２の方法。ａ）段階（ｉｉｉ）、（ｉｖ）または（ｖ）の上相または下相から一定分量を採取し；ｂ）該一定分量を、１種以上の固体、選択増殖培地上に平板塗布し；そしてｃ）該標的微生物の肉眼的検出を可能にするのに十分な時間、該接種された固体、選択増殖培地を培養する。１５．該固体選択培地が、モディファィド・オックスフォード・アガー（ＭｏｄｉｆｉｅｄＯｘｆｏｒｄＡｇａｒ）である、請求の範囲１４の方法。【図１】【図２】【図３】【図４】【図５】【図６】【図７】【図８】【図８】【図８】【図９】【図９】【図９】【図１０】【図１０】【図１０】【図１１】【図１１】【図１１】

Claims

【特許請求の範囲】１．下記段階を含む、複合マトリックス内に含まれる標的微生物の分離方法。ｉ）該複合マトリックスをホモジナイズし、そして前集積培地の存在下、該複合マトリックスを培養して、該標的微生物を蘇生し、増殖させ、それによって該複合マトリックス中の該標的微生物の数を増強させる段階；ｉｉ）段階ｉ）の該増強された複合マトリックスのサンプルを、少なくとも１種の水性高分子二相分離系中で乳化する段階；ならびにｉｉｉ）該乳化された系を上相と下相に分離させ、それによってサンプルからの著量の該標的微生物が、該上相か該下相のいずれかに見い出す段階。２．該標的微生物が細菌である、請求の範囲１の方法。３．該細菌が病原細菌である、請求の範囲２の方法。４．該病原細菌が、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、クレブシエラ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である、請求の範囲３の方法。５．該複合マトリックスが食品である、請求の範囲１の方法。６．該食品が、摩砕牛肉、摩砕七面鳥、摩砕豚肉、卵、乾燥ミルク、全乳ココア、サラダドレッシング、スパイスまたはチーズ製品である、請求の範囲５の方法。７．段階ｉ）において、該標的微生物がサルモネラであり、そして該前集積ブロスがＢＢＳＭである、請求の範囲１の方法。８．段階ｉｉ）において、該サンプルが、さらに、２種の異なる水性高分子二相系、第１の系および第２の系中で乳化される、請求の範囲７の方法であって、該第１の系が、６．５％ｗ／ｗデキストランＴ５００および６．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール３４００を含み；そして該第２の系が、５．０％ｗ／ｗデキストランＴ５００および３．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００を含む方法。９．段階ｉｉｉ）の後に、さらに、次の段階を含む、請求の範囲８の方法。ｉｖ）著量の該標的微生物を含む該第１の系の上相の一定分量を採取し、そして該一定分量を、新鮮な第１の水性高分子二相系中で乳化する段階；その間、さらに、著量の該標的微生物を含む該第２の系の下相の一定分量を採取し、そして該第２の系の該一定分量を、新しい第２の水性高分子二相系中で乳化する段階；ならびにｖ）段階ｉｉｉ）を繰り返す段階。１０．段階ｉｖ）とｖ）を、さらに、１回以上連続的に繰り返すことを含む、請求の範囲９の方法。１１．該細菌がリステリアであり、そして該前集積ブロスがＬＢＨＩである、請求の範囲１の方法。１２．段階ｉｉ）において、該サンプルが、さらに、３％ｗ／ｗデキストランＴ５００、１．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００および６．０％ｗ／ｗポリエチレングリコール２０００を含む水性高分子二相系中で乳化される、請求の範囲１１の方法。１３．段階ｉｉｉ）の後に、さらに、次の段階を含む、請求の範囲１２の方法。ｉｖ）著量の該標的微生物を含む該水性高分子二相分離系の上相の一定分量を採取し、そして該一定分量を、段階ｉｉ）の新鮮な水性高分子二相系中で乳化する段階；ならびにｖ）段階ｉｉｉ）を繰り返す段階。１４．段階ｉｖ）とｖ）を、さらに、１回以上連続的に繰り返すことを含む、請求の範囲１３の方法。１５．下記段階を含む、複合マトリックス内に含まれる標的微生物の分離および検出方法。ａ）該複合マトリックスをホモジナイズし、そして、前集積ブロスの存在下、該複合マトリックスを培養して、該標的微生物を蘇生し、増殖させ、それによって該複合マトリックス中の該標的微生物の数を増強させる段階；ｂ）段階ａ）の該増強された複合マトリックスのサンプルを、少なくとも１種の水性高分子二相分離系中で乳化させる段階；ｃ）該乳化された系を上相と下相に分離させ、それによってサンプルからの著量の該標的微生物が、該上相か該下相のいずれかに見い出す段階；ならびにｄ）著量の該標的微生物を含む段階ｃ）の相から一定分量を採取し、そしてその一定分量中の該標的微生物の存在を検出する段階。１６．段階ｄ）において、該検出が、固体選択増殖培地上に該一定分量を接種し、そして該固体選択増殖培地を培養することによって行われ、それによって該培地に増殖する単離された標的微生物が肉眼的に検出される、請求の範囲１５の方法。１７．段階ａ）において、該標的微生物がサルモネラであり、そして該前集積ブロスがＢＢＳＭであり；そして段階ｂ）において、２種の異なる水性高分子二相分離系；６．５％ｗ／ｗデキストランＴ５００および６．５％ｗ／ｗデキストランＴ５００および６．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール３４００を含む第１の系、ならびに５．０％ｗ／ｗデキストランＴ５００および３．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００を含む第２の系が使用され；そして段階ｂ）およびｃ）が、連続的に３回実施されるが、第２回と第３回の間で、著量のサルモネラを含む段階ｃ）の相から採取されたサンプルが、段階ｂ）におけるサンプルとして使用され；そして段階ｄ）において、該固体選択増殖培地が、ＨＥまたはＸＬＤ培地である、請求の範囲１６の方法。１８．段階ａ）において、該標的微生物がリステリアであり、そして該前集積ブロスがＬＢＨＩであり；そして段階ｂ）において、該水性高分子二相分離系が、３％ｗ／ｗデキストランＴ５００、１．５％ｗ／ｗポリエチレングリコール８０００および６．０％ｗ／ｗポリエチレングリコール２０００を含み；そして段階ｂ）およびｃ）が、連続的に３回実施されるが、第２回と第３回の間で、著量のリステリアを含む段階ｃ）の相から採取されたサンプルが、段階ｂ）におけるサンプルとして使用され；そして段階ｄ）において、該固体選択増殖培地が、改変ＭＯＸＡである、請求の範囲１６の方法。