SE462004B - Foerfarande och komposition foer bestaemning av mikrobiella foeroreningar i spannmaal med hjaelp av polymera tvaafassystem - Google Patents

Description

462 10 15 zo' 25 30 35 004 2 Spannmålsanalysen skall bl.a. ligga till grund för att fastställa spannmålspriset och hur spannmålet skall lagras och användas. Exempelvis får inte en undermålig spannmålssats lagras tillsammans med en högvärdig spannmålssats, eftersom den senare då kan kontamineras mikrobiellt av den förra, och det finns då inte tid att skicka prover till ett laboratorium för analys.

Det finns sålunda ett stort behov av förbättrade metoder för spannmålsanalys.

I E. . E! Föreliggande uppfinning syftar till att tillhandahålla ett förbättrat analysförfarande för kvalitetsbedömning av spannmål.

Uppfinningen syftar speciellt till att åstadkomma ett analysförfarande, som är snabbt (kan utföras på. platsen), enkelt (kan utföras av okvalificerad personal), tillförlit- ligt (ger kvantitativa eller semikvantitativa resultat) och väsentligt billigare än de f.n. tillgängliga kvantitativa metoderna.

Uppfinningen syftar även till att tillhandahålla kom- positioner och testsatser för genomförande av det nya analys- förfarandet.

Dessa och andra syften och fördelar' med uppfinningen kommer att framgå av den efterföljande beskrivningen och de bifogade ritningarna. s En. E..

De angivna syftena och fördelarna uppnås enligt uppfin- ningen genom att analysförfarandet, analyskompositionerna och analyssatsen har givits de utmärkande särdrag, som anges i de bifogade patentkraven. Föredragna utföringsformer av uppfin- ningen anges i underkraven.

Analysförfarandet enligt uppfinningen är baserat på op- tisk detektering av bakterieceller och mögelsvampsporer i extraktionslösningar från spannmålskärnor. Den optiska detek- tionen kräver relativt rena mikroorganismsuspensioner, fria från stärkelsegranuler och skalrester. För att möjliggöra 10 15 20 25 30 35 3 462 004 detta utnyttjas enligt uppfinningen separation i polymera tvåfassystem.

Polymera tvåfassystem är i och för sig kända, exempelvis genom Albertsson P Å, 1960, Partition of cell particles and macromolecules, 2:a upplagan, Uppsala, Sverige, men denna teknik har inte använts - än mindre avpassats - för spann- målsanalys.

Uppfinningen omfattar två samverkande sådana system, som även kan användas oberoende av varandra, nämligen ett första system (här kallat svampsystem), som separerar' organiska icke-mikrobiella partiklar och bakterieceller från sporer från lagerskadesvampar, och ett andra system (här kallat totalsystem), som separerar organiska icke-mikrobiella par- tiklar fràn bakterieceller och svampsporer. Genom att kom- binera separationen j. de två systemen med optisk detektion kan mängden svampsporer och bakterieceller i en extraktions- vätska från spannmâlskärnor skattas. ' .t . S .vn.

De bifogade ritningarna visar följande: Figur 1 ett diagram, illustrerar korrelationen mellan den enligt uppfinningen uppmätta optiska absorbansen som funktion av koncentrationen av svampsporer.

Figur 2 är ett diagram motsvarande Figur 1, som illust- rerar korrelationen mellan uppmätt optisk absorbans enligt uppfinningen som funktion av koncentrationen av bakterie- SOITI celler.

Figur 3 är ett diagram, mellan mätdata för svampsporer i spannmål erhållna med det spektrofotometriska förfarandet enligt uppfinningen resp. med den konventionella laboratoriemetoden epifluorescensmiskro- skopi.

Figur 4 är ett diagram motsvarande Figur 3, men avser bestämning av bakterieceller i spannmål. som illustrerar korrelationen . . V u e 0 Några föredragna utföringsformer av uppfinningen kommer att beskrivas i de efterföljande exemplen, i vilka förekom- 462 004 4 10 15 20 25 30 35 mande uppgifter om koncentrationer och motsvarande är vikt- baserade, om inte annat anges. 2351119214 Bulklösningar (20%) av dextran och DEAE-dextran bereds genom att väga in 220 gram pulver tillsammans med 780 gram vatten. Pulvret löses genom upphettning i t.ex vattenbad eller i mikrovågsugn. Den exakta koncentrationen av dextran eller DEAE-dextran i stamlösningarna fastställs genom att mäta den optiska vridningen (polarimetri) alternativt gravi- metriskt genom att indunsta en känd mängd lösning. Stamlös- ningarna späds till 20.0%.

Bulklösning av polyetylenglykol 8000 bereds genom att lösa 400 g Carbowax 6000 i 600 g vatten. Övriga lösningar, 0.5 M citrat/fosfatbuffert pH 4,8 och 7 samt 2 M Li2SO4, bereds av kemikalier av p.a. kvalitet.

Bulklösningarna av polymererna, buffert, salt och vatten vägs in i 12x100 mm glasprovrör. sammansättningen på de två typerna av system anges nedan och är beräknade på 2 gram (svampsystem) respektive 3 gram (totalsystem), vari ingår 1 g extraktionsvätska. åyampsystgmi 4,8% dextran 500 Uppsala), 3,85% polyetylenglykol 8000 Union Carbide, New York), 1,l% dietylaminoetyldextran 500 Fine Chemicals, Uppsala), 26 mM citrat/fosfatbuffert pH 4,8, 1 mm Li2so4.

(Pharmacia Fine Chemicals, (Carbowax 6000, (Pharmacia 8,4% dextran 500, 5,8% polyetylenglykol 8000, 25 mM Citrat/fosfatbuffert pH 7,0, 50 IHM Li2SO4.

Toppfasvolymerna i de två systemen efter separation är ca 1,0 ml (svampsystem) respektive 1,5 ml (totalsystem) och 10 15 20 25 30 35 462 004 5 separationstiden ca 1,5 minuter i horisontalläge och ca 6 minuter i vertikalläge. c) Egtraktiog av spannmålsprover Spannmålsprov (hela kärnor) extraheras med en steril- filtrerad vattenlösning innehållande 0,5% Tween 80, enligt följande: En del spannmålskärnor invägs i plastpåsar med 1/2 del alternativt 1 del tvättvätska. Plastpåsarna försluts och placeras i ett ultraljudsbad under 3 minuter. Efter avslutad ultraljudsbehandling öppnas påsarna varefter tvättvätskan grovfiltreras genom glasull. s e ss 1 ml provvätska från Exempel 1 c) sätts till respektive svamp- och totalsystem (beredda enligt Exempel lb), varefter innehållet i systemen blandas väl med hjälp av en provrörs- skak under ca 10 sekunder. Som blanksystem för den optiska mätningen tillsätts 1 ml sterilfiltrerat vatten till ett svamp- respektive totalsystem. Efter omblandning läggs prov- rören i horisontalläge i ett provrörsställ tills faserna har separerat.

Absorbansen i toppfaserna för respektive svamp- och totalsystem mäts med hjälp av en spektrofotometer (NOVASPEC 40/49) vid 400 alternativt 560 nm enligt följande; Blankprovet för svampsystemet sätts ned i kyvetthållaren i spektrofotometern, varefter denna nollställs. Absorbansen i svampsystemet mäts. På motsvarande sätt bestäms absorbansen för totalsystemet.

Med kännedom om extraktionsförhållandet spannmâl/prov- vätska, toppfasvolym och absorbanserna i respektive toppfas, kan koncentrationen svampsporer och bakterier i spannmålspro- vet bestämmas, såsom kommer att förklaras närmare nedan i Exempel 4.

EK§E2§l_3 E J 1 En ! ll.

För att förbättra separationen mellan störande organiska 462 004 6 10 15 20 25 30 35 icke-mikrobiella partiklar och svamp/bakterieceller i total- systemet, samt för att förbättra separationen mellan svamp och bakterieceller i svampsystemet för att härigenom öka precisionen i analysen utfördes en förextraktion på följande sätt. 1 ml extraktionsvätska sätts till vardera av ett svamp- system och ett totalsystem (system la resp. 2a). På samma sätt tillsätts 1 ml sterilfiltrerat vatten innehållande 0,5% Tween 80 till motsvarande svamp- och totalsystem (system lb resp. 2b). Systemen blandas väl med hjälp av en provrörsskak under ca 10 sekunder, varefter rören placeras horisontellt på ett provrörsställ tills faserna separerat.

Efter fasseparation avlägsnas och kastas 0,5 ml av toppfaserna från system lb och 2b, varefter 0,5 ml av topp- fasen från system la överförs till toppfasen i system lb. Pâ samma sätt överförs 0,5 ml av toppfasen i system 2a till system 2b. System lb och 2b blandas ånyo på provrörsskak och får separera i ett horisontellt provrörsställ under 2-3 minu- ter.

Som blanksystem tillsätts 1 ml sterilfiltrerat vatten till ett svamp- respektive totalsystem, vilka behandlas och får separera på samma sätt som provsystemen.

Den spektrofotometriska. mätningen i system lb och 2b utförs på samma sätt som. beskrivits för analys utan för- separation i Exempel 2 ovan. fixsmmLi E lf . _ 1 1 1 . Ü 3 I de bifogade ritningsfigurerna 1 och 2 redovisas det optiska sambandet mellan log absorbansen som en funktion av (A) log koncentrationen svampsporer och (B) log bakterie- celler i en vätskesuspension. Mätningarna har utförts vid 560 nm. Som typorganismer har använts Penicillium brevi compactum (svampsporer) och Bacillus subtilis (bakterieceller).

Vid den grafiska skattningen av mängden svampsporer och bakterieceller i den från spannmålsextraktionen erhållna tvättvätskan, utnyttjas de två absorbansvärdena från svamp- respektive totalsystemet enligt följande: 10 15 20 25 462 ÛÛ4 7 1. Mängden svampsporer skattas direkt genom att avläsa log koncentrationen sporer för den i systemet uppmätta log absorbansen. 2. Mängden bakterieceller skattas genom att från absorban- sen i totalsystemet subtrahera absorbansen från svamp- systemet, varefter log bakterieceller kan bestämmas med hjälp av log restabsorbansen. 3. Med kännedom om toppfasvolymerna (l.0 ml), de skattade koncentrationerna av bakterieceller och svampsporer samt förhållandet spannmål/tvättvätska, kan mängden svamp- respektive bakterieceller per gram spannmålskärnor bestämmas. e ' s e 'v' spannmâlskärnor resulterar i en bakterieceller Extraktíon av hela blandning av stärkelsegranuler, skalrester, och svampsporer. För att med hjälp av optiska metoder kvan- tifiera mängden svampsporer och bakterieceller i extraktions- vätskan krävs: 1. Att stärkelsegranuler och skalrester kan separeras från bakteriecellerna/svampsporerna. 2. Att bakterieceller kan separeras från svampsporer.

I Tabell 1 redovisas den ungefärliga reningseffektivite- ten i de två systemen (svamp- och totalsystem) vid separa- tionsförsök utförda på extraktionslösningar av havrekli, vetekli och vetemjöl, varvid reningseffektiviteten har ut- tryckts som skillnaden i absorbans före resp efter separation enligt uppfinningen. 10 15 20 25 30 35 40 "4e2 004 8 Iâb§ll_l Havrekli ------- --abs-före- _ abs efter reningseff.

Svampsystem 15,50 0,32 >98 % Totalsystem 15,60 0,46 >97 % Vetekli abs_före abs efter reningseff Svampsystem 17,80 0,25 >99 % Totalsystem 17,80 0,32 >98 % Vetemjöl abs före abs efter reningseff. svampsystem "šfZš ' _"'8fšš"" >98 % Totalsystem 9,45 0,45 >95 % _____________________________________________________ Eftersom stärkelsegranuler och skalrester orsakar den kraftigaste absorbansen i extraktionslösningar av krossad spannmål och mjöl får man, som framgår av Tabell 1, en mycket god separation (>95%) i de tvâ systemen. flxsmmLä n E.. i E.. n] Separation och spektrofotometrisk detektion av mängden bakterieceller och svampsporer i extraktionsvätskor från hela spannmålskärnor har utförts på ett stort antal spannmål av olika kvalitet med användning av det förfarande, som beskrivs i Exempel 3 ovan. Som referensmetod användes direkträkning av mängden bakterieceller och svampsporer, efter infärgning med acridineorange, i epifluorescensmikroskop. Resultaten av 72 jämförande mätningar presenteras grafiskt i ritningsfigu- rerna 3 och 4. Figur 3 visar korrelationen i mätdata mellan de två metoderna vad gäller svampsporer, medan Figur 4 visar korrelationen i mätdata för bakterieceller.

Som framgår av Figurerna 3 och 4 ger metoden enligt uppfinningen en god överensstämmelse med den tidsödande (och för dagligt praktiskt bruk inte användbara) laboratoriemeto- den epifluorescensmikroskopi, med en korrelation av 0,90 vid bestämning av mängden svampsporer och 0,82 vid bestämning av bakteriekoncentrationen. 10 15 20 25 30 35 9 462 004 EzemBel_§ B i I 1 ! le ln .

Reproducerbarheten för en analysmetod kan definieras som reproducerbarheten i analyssvaret när flera analyser utförs på ett och samma prov (= reproducerbarhet av grad 1), alter- nativt när flera spannmålsprover tas ut från en större batch, extraheras och analyseras var för sig (= reproducerbarhet av grad 2).

I tabellerna 2a-b nedan redovisas resultaten från nâgra reproducerbarhetsförsök utförda med förfarandet enligt upp- finningen.

Tabell 2a. Trippelprov utfört på spannmål med kvalitet prima.

(Reproducerbarhet grad 1) Prov nr Mögelsporer* Bakterier* 1 2,2x1ø5 ___- 2,sx1o7 2 z,2x1o5 z,sx1o7 3 z,zx1o6 2,6x1o7 = Antalet uttryckt i mikroorganismer/g våtvikt Tabell 2b. Två stickprov från olika batcher av spannmål av olika kvalitet, extraherade och analyserade var för sig.

(Reproducerbarhet grad 2).

Provomgång 1* Provomgång 2* Mögelsporer o,93x1o7 1,oox1o7 Bakterier 2,1ox1o8 3,sox1o8 Mögelsporer o,71x1o6 z,2ox1ø6 Bakterier 2,sox1o7 2,sox1o7 Mögelsporer 4,50x105 3,70xl05 Bakterier 1,3ox1o8 1,6sx1o8 Mögelsporer 2,35x106 2,70x105 Bakterier 2,s3x1o7 2,9ox1o7 _________________________________-________________________ = Antalet uttryckt i mikroorganismer/g våtvikt 462 004 10 10 15 20 25 30 35 Resultaten från denna undersökning visar att reproducer- barheten av första, såväl som andra graden är mycket god. När det gäller reproducerbarheten av andra graden, spelar givet- vis homogeniteten vad gäller mikrobiell förekomst på spann- målskärnorna, en avgörande roll, vilket kan förklara de små skillnader i koncentrationer som registrerats vid de två analystillfällena.

Eftersom separation i polymera tvàfassystem är ett fördelningsfenomen, dvs man utnyttjar skillnader i fördel- ningskoefficient mellan störande partiklar och mikroorganis- mer, medför ett extraktionsförfarande en fördel när det gäller separationen av organiska icke-mikrobiella partiklar från totalsystemet. På samma sätt får man ett säkrare värde i svampsystemet tack vare en ökad separation av bakterieceller och andra partiklar från svampsporerna.

Effekten av extraktionsförfarandet vad gäller detektion av svampsporer i en extraktionsvätska, presenteras i tabell 3.

Tabell 3. Extraktioners betydelse för spektrofotometrisk bestämning av mögelsporer i svampsystem.

Prov nr Extraktion 1 Extraktion 2 Epifluor- escensvärde 1 1,2x1o7 1,1x1o6 9,2x1o6 2 2,sx1o6 1,sx1o6 2,ox1o6 3 1,sx1o6 9,sx1o5 1,2x1o5 4 3,sx1o5 2,sx1o6 2,4x1o6 s 7,sx1o5 4,sx1o5 4,ox1o6 6 2,2x1o6 1,7x1o5 1,9x1o5 7 4,sx1o7 3,9x1o7 4,1x1o7 a 4,9x1o5 4,ox1o5 3,1x1o5 Som framgår av tabellen medför en extraktion i svampsys- temet att koncentrationen sporer i systemet närmar sig refe- rensvärdet, i det här fallet kvantifierat genom, epifluor- escensmikroskopi.

Claims (16)

10 15 20 25 30 462 004 ll B_A_I_E_E_ILK_B_A_¥

1. Användning av polymera tvåfassystem för kvantitativ eller semikvantitativ bestämning av svampsporer eller bak- terieceller i spannmâlsprodukter.

2. Förfarande för kvalitativ, semikvantitativ eller kvan- titativ bestämning av mikrobiella föroreningar i spannmåls- produkter, k ä n n e t e c k n a t av att det innefattar stegen att: (a) bilda en provlösning genom att extrahera mikroorganismer från ett spannmålsprov, (b) blanda provlösningen med ett polymert tvåfassystem, (c) låta systemet separera, så att mikrobiella föroreningar samlas i systemets överfas och väsentligen alla icke- mikrobiella partiklar samlas i systemets underfas, (d) bestämma halten mikrobiella föroreningar i överfasen optiskt.

3. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e t e c k n a t av att extraktionsvätskan i steg (a) utgörs av partikelfritt vatten, som företrädesvis inne- håller ett ytaktivt medel.

4. Förfarande enligt patentkravet 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a t av att den optiska bestämningen i steget (d) utförs spektrofotometriskt, turbidimetriskt eller visuellt genom jämförelse med en standard.

5. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t av att det polymera tvåfassystemet innefattar ett färgämne med förmåga att bindas till eller upptas av åtminstone vissa av mikroorganismerna i överfasen, eller färgförändras vid kontakt med dessa.

6. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t av att de mikrobiella förore- p ningarna innefattar svampsporer eller bakterieceller, och att 462 004 12 10 15 20 25 30 det polymera tvåfassystemet är så valt, att väsentligen alla svampsporer och bakterieceller i provlösningen samlas i överfasen när tvåfassystemet separerar vid steget (c).

7. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t av att det polymera tvåfassys- temet omfattar minst en polyalkylenglykol, företrädesvis en polyetylenglykol med en medelmolekylvikt av 200 - 20.000, särskilt 1.000 ~ 10.000, speciellt 4.000 - 8.000, som bildar systemets överfas, och minst en polysackarid, som företrä- desvis är tvärbunden och har högre medelmolekylvikt än poly- alkylenglykolen i överfasen, särskilt minst 40.000, som bildar systemets underfas.

8. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t av att polysackariden är tvärbunden dextran, stärkelse, cellulosa eller tvärbundna mono-, di- eller olígosackarider. *

9. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t av att det polymera tvåfassystemet även innefattar minst ett oorganiskt salt, företrädesvis ett alkalimetallsalt, som har förmåga att förstärka de lnikro- biella föroreningarnas anrikning i överfasen.

10. Förfarande för bestämning av halten av svampsporer i ett spannmålsprov, k ä n n e t e c k n a t av att det omfattar stegen att (a) bilda en provvätska genom extraktion av mikroorganismer från ett spannmålsprov, (b) blanda provvätskan med ett polymert tvåfassystem, (c) låta systemet separera, så att överfasen kommer att vä- sentligen innehålla endast svampsporer, medan övriga mikrobiella samt icke-mikrobiella föroreningar i prov- vätskan samlas i underfasen, och I (d) bestämma mängden svampsporer i överfasen optiskt. 10 15 20 25 30 35 462 004 13

11. Förfarande enligt patentkravet 10, k ä n n e t e c k n a t av att det polymera tvåfassyste- met innefattar ett sådant system enligt patentkravet 1 eller 2 och dessutom antingen (i) en positivt laddad polymer, som vid, separation. befinner sig i. bottenfasen, eller (ii) en negativt laddad polymer, som vid separation befinner sig i överfasen.

12. Förfarande enligt patentkravet 10 eller 11, k ä n n e t e c k n a t av att det polymera tvåfassystemet även innefattar ett oorganiskt salt, särskilt alkalimetall- salt, som har förmåga att förstärka en positivt laddad poly- mers fördelning till bottenfasen.

13. Förfarande enligt patentkravet 10, ll eller 12, k ä n n e t e c k n a t av att man upprätthåller surt pH i det polymera tvåfassystemet.

14. Förfarande för att kvantitativt bestämma halten mikro- biella föroreningar i ett spannmâlsprov, k ä n n e t e c k n a t av att man (a) bestämmer halten av svampsporer i en första alikvot av spannmàlsprovet med hjälp av förfarandet enligt något av patentkraven 9 - 13, (b) bestämmer totalhalten av mikrobiella föroreningar i en andra alikvot av spannmålsprovet med hjälp av förfaran- det enligt något av patentkraven 2 - 8, och (c) skattar halten av bakteriella föroreningar genom att subtrahera det vid bestämningssteget (a) erhållna värdet från det vid bestämningssteget (b) erhållna värdet.

15. Komposition lämpad för kvantitativ bestämning av förore- ningar av svampsporer i spannmâlsprover, k ä n n e t e c k n a d av att den innehåller: (a) 0,5 - 15 viktdelar av minst en eventuellt tvärbunden polysackarid och/eller tvärbunden mono-, di- eller oligosackarid, (b) 0,5 - 15 viktdelar av minst en polyalkylenglykol, 462 004 14 (C) (d) (6) 5

16. minst 10'4 viktdelar av minst en laddad polymer, ett buffertsystem som ger kompositionen surt pH, och minst ett alkalimetallsalt. Komposition lämpad för kvantitativ bestämning av total- halten mikrobiella föroreningar i ett spannmålsprov, k ä n n e t e c k n a d av att den innehåller komponen- terna (a), (b) och (e) i patentkravet 15, ett buffertsystem, som ger neutralt till basiskt pH.