JPH10500657A

JPH10500657A - クルクミン、クルクミン類似体、およびそれらの新しい使用法

Info

Publication number: JPH10500657A
Application number: JP7518587A
Authority: JP
Inventors: アガーワル，バラト，ビー．
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1994-01-06
Filing date: 1995-01-05
Publication date: 1998-01-20
Also published as: EP0738143A1; IL112205A0; AU687509B2; CA2180477A1; WO1995018606A1; AU1558595A

Abstract

(57)【要約】本発明は病態的細胞増殖性疾患を措置するための新しい方法を提供する。本発明によるこの新しい方法は、薬学的に有効な量のクルクミン、またはその類似体を動物に投与するステップを含む。本発明はまた、ホスホリラーゼ・キナーゼおよびチロシン・キナーゼの活性を抑制するための新しい方法と、薬学的に有効な量のフラボノイドを投与して、細胞増殖性疾患を処理するための新しい方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称クルクミン、クルクミン類似体、およびそれらの新しい使用法発明の背景発明の分野本発明は基本的には細胞増殖性疾患に関するものである。より具体的には、本発明はクルクミンおよびその類似体の新しい抗増殖効果に関係している。関連技術の説明クルクミン（ジフェルロイルメタン）は食品香料ウコン（クルクマ・ロンガ）の主要活性成分である。動物においてこれまで知られているクルクミンの性質としては、ベンゾ−アルファーピレンおよび７，12ヂメチルベンズ−アルファ−アントラセンによって誘発される腫瘍の開始およびフォルボル・エステルによって誘発される腫瘍促進の両方を抑制することなどがある。加えて、クルクミンはイン・ビボで抗炎症作用を示す。クルクミンの薬学的な安全性は１日100mgまでの摂取量については実証されている。イン・ビトロで、クルクミンは中性親和性の活性を抑制し、血液単核白血球細胞のミトゲンによって誘発される増殖を抑制し、混合リンパ球反応を示し、そして円滑筋細胞の増殖を抑制する。クルクミンは、また反応性酸素種の強力なスカベンジャーであり、亜硝酸塩が誘発するメテモグロビンへの酸化から発生するヘモグロビンを保護し、脂質類の過酸化を阻止する。こうした活性の一部は遊離基によって引き起こされるダメージからＤＮＡを保護したり、肝細胞を種々の毒素から護ったりするクルクミンの能力と関連している可能性がある。加えて、フォルボル・エステルが誘発する転写因子ｃ−jun/ＡＰ−１がクルクミンによって抑制される。最近、クルクミンはタイプ１ヒト免疫不全長端反復指向遺伝子表現およびウィルス複製の抑制において極めて効果的であることも示されている。癌およびその他の細胞増殖性疾患に対する化学療法の分野では、安全で、毒性がなく、経口で使用できる効果的な薬剤へのニーズや願望が存在している。本発明は先行技術において長期間にわたって存在していた課題を解決するものである。発明の要約本発明の１つの実施態様において、動物に対する、薬学的に効果のある量のクルクミン、あるいはその類似体を投与するステップを含んだ病態的細胞増殖性疾患を措置するための方法が提供される。本発明の別の実施態様においては、薬学的に有効な量のクルクミンまたはその類似体を動物に投与するステップを含んだホスホリラーゼ・キナーゼの活性を抑制する方法が提供される。本発明の別の実施態様においては、薬学的に有効な量のクルクミンまたはその類似体を動物に投与するステップを含んだチロシン・キナーゼの活性を抑制する方法が提供される。本発明の別の実施態様においては、薬学的に有効な量のフラボノイドまたはその類似体を動物に投与するステップを含んだ、病態的細胞増殖性疾患を措置する方法が提供される。本発明のその他の、そしてさらなる側面、特徴、および利点は、開示のために以下に示される本発明の現段階で好ましい実施態様の説明で明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、クルクミンおよび関連類似体の構造を示すものである。図２は、ホルモン依存ヒト乳腺腫瘍細胞に対するクルクミンの容量応答曲線を示している（図２Ａ；ＭＣＦ−７細胞）および（図２Ｂ；Ｔ−４７Ｄ細胞）。５ ×10³細胞を96−ウェルプレートに一昼夜37℃の温度で入れて、放置した。次にこれらの細胞をいろいろな濃度のクルクミン（左側のパネル）で72時間、あるいは最終総量0.2mlとなるようにクルクミン（2.7uMまたは１ug/ml）を用い、時間を変えて培養を行った。最後の６時間の間に、細胞を取り出す前にトリチウムを含んだチミジンで刺激を与えた。すべての判定は三重テストで行われた。相対細胞生存率は以下のように計算した：措置された細胞へのチミジン取り込みと未処理細胞へのチミジン取り込みの比率×100。図３は、ヒト乳腺腫瘍細胞，ＭＣＦ−７の成長に対するクルクミンの経時的な影響を示す。５×10³細胞を96−ウェルプレートに一昼夜37℃の温度で入れて放置し、洗浄し、その後、種々の濃度のクルクミンで時間を変えて培養した。細胞の成長可能性はチミジンの取り込み（図３Ａ）または成長可能な細胞のカウンティング（図３Ｂ）によって調べられた。図４は、ホルモン依存ヒト乳腺腫瘍細胞の成長に対するクルクミンの影響の用量−応答（図４Ａ）および時間的変化（図４Ｂ）を示している。図５は、ヒト骨髄単核腫瘍細胞、ＨＬ−60の成長に対するクルクミンの影響における用量−応答（図５Ａ）および時間的変化（図５Ｂ）を示している。５×10³ 個の細胞が96−ウェルプレート内に入れられて、一昼夜37℃の温度で放置された。次にこれらの細胞をクルクミンの濃度を変えて72時間（左側のパネル）、あるいは最終総体積が0.2mlとなるようにクルクミン（2.7uMまたは１ug/ml）を用いて時間を変えて（右側のパネル）で培養した。最後の６時間の期間に、細胞を取り出す前にトリチウムを含んだチミジンで刺激を与えた。すべての判定は三重テストで行われた。相対細胞成長可能性は以下のように計算した：措置された細胞へのチミジン取り込みと未措置細胞へのチミジン取り込みの比率×100。図６はヒト膠質真性腫瘍Ｕ−251細胞の成長（図６Ａ）およびヒト血管内皮細胞（図６Ｂ）に対するクルクミンの影響を示している。図７はヒトの組織球リンパ球細胞株Ｕ−937の影響に対するクルクミンおよびＴＮＦの添加効果を示している。細胞はＴＮＦ（100ユニット/ml）か、あるいはクルクミン（１ug/ml）を用いて、いずれの場合にも72時間培養された。図８は、クルクミンの継続的な存在がヒト乳腺腫瘍細胞（ＭＣＦ−７）の成長にとって必要であることを示している。図９は、種々の蛋白質キナーゼの活性に対するクルクミンの影響を示している。ホスホリラーゼ・キナーゼ（ホスＫ，134ユニット/ml）、蛋白質キナーゼＣ（ＰkＣ，6.8ユニット/ml）、蛋白質キナーゼＡ触媒性サブユニット（ＰkＡ，５ユニット/ml）、シトソリック・プロタミン・キナーゼ（cＰＫ，500ユニット/ml）、自動ホスホリル化活性キナーセ（ＡＫ，500ユニット/ml）、および細胞性チロシン・キナーゼ（pp60^c-src；８ユニット/ml）の製剤は、示された濃度のクマリンの存在下での基質としての、ホスホリラーゼｂ、ヒストンＨ−１、ヒストンＨ −２Ｂ、プロタミン・スルフェート、ミエリン塩基性蛋白質、およびポリ・グルタミン酸チロシンを用いてアセスメントを行った。コントロール群は、クルクミンの代わりにジメチルスルホキシドが用いられたことを除いて、同じ方法で措置された。図10は、ホスホリラーゼ・キナーゼとクマリンの用量−応答を示している。図 10Ａで、ホスホリラーゼ・キナーゼ（134ユニット/ml）は示された濃度のクルクミンの存在下でホスホリラーゼｂによってアセスされた。同じ組み合わせの培養はトリクロロ酢酸の代わりにラエムリ（laemmli）・サンプル緩衝液で打ち切られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた。その後、蛋白質バンドをクマシー（coomas sie）・ブリリアント・ブルーで染色され、それらのゲルを乾燥した。図10Ｂで、放射性物質でラベルしたホスホリラーゼｂが乾燥されたオートラジオグラフィーで検出された。図11Ａはクルクミンによるホスホリラーゼ・キナーゼの抑制に関するラインウィーバー−バーク・プロットを示してる。培養は図示されているようないろいろの濃度のクルクミンを用いて行われた。各セットのクルクミン濃度に対して、ホスホリラーゼｂの濃度はいろいろに変えられた。他の２つの基質、つまりＭｇ²⁺ およびＡＴＰは飽和レベル（それぞれ２mMと0.2mM）で存在した。各反応の速度は１分間あたりにホスホリラーゼに組み込まれた³²Ｐのpmolで計算された。逆数プロットをラインウィーバー−バーク・プロットとして、ホスホリラーゼの濃度を基準としたグラフとして示した。図11Ｂはクルクミンに対するＫ_i値を基準として、クルクミンの関連濃度を基準としてプロットされた二重逆数プロットから導かれた直線の勾配を示している。図12は、本発明の方法において有益な２つのフラボノイド化合物の構造を示している。発明の詳細な説明本発明は、薬学的に有効な量のクルクミン、またはその類似体、あるいはフラボノイドを動物に投与するステップを含む、病態的細胞増殖性疾患を措置する方法に向けられたものである。本発明による方法は、腫瘍性疾患および非腫瘍性疾患のいずれかを措置するために用いることができる。腫瘍性疾患の代表的な例は卵巣癌、膀胱癌、肺癌、子宮頸部癌、乳癌、前立腺癌、神経膠腫、線維肉腫、網膜芽細胞腫、黒色腫、軟組織肉腫、骨肉腫、結腸癌、腎臓の悪性腫瘍、およびすい臓癌である。非腫瘍性疾患の代表的な例は、乾癬、良性増殖性皮膚疾患、魚鱗癬、乳頭腫、基底細胞悪性腫瘍、鱗状細胞悪性腫瘍、レスチノシス（restinosis）、強皮症、および血管腫である。本発明による方法はどの動物の措置にも用いることができる。最も好ましくは、本発明の方法はヒトにおいて有益である。一般的に、抗増殖性またはホスホリラーゼ・キナーゼ抑制効果を達成するために、クルクミンおよびクルクミン類似体をどのような薬学的有効量で投与してもよい。好ましくは、クルクミンまたはクルクミン類似体は１マイクログラム程度から100マイクログラム程度の用量で用いられる。広範なクルクミン類似体が本発明による方法において有効である。クルクミン類似体の代表的な例は、例えば、（ａ）フェルラ酸、つまり、４−ヒドロキシ− ３−メトキシケイ皮酸（化合物＃１）、および３，４−メチレンジオキシ・ケイ皮酸（化合物＃２）、および３，４−ジメトキシケイ皮酸（化合物＃３）などの類似体；（ｂ）４−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ブテン− ２−オン（化合物＃４）、ジンジャロン（化合物＃５）、４−（３，４−メチレンエジオキシフェニル）−２−ブタノン（化合物＃６）、４−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−３−ブテン−２−オン（化合物＃７）、４− ヒドロキシヴァレロフェノン（化合物＃８）、４−ヒドロキシベンジルアクトン（化合物＃９）、４−ヒドロキシベンゾフェノン（化合物＃10）、１，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−１，４−ペンタジエン−３−オン（化合物＃ 11）などの芳香族ケトン類；（ｃ）６−ヒドロキシジベンゾイルメタンなどの芳香族ジケントン類（化合物＃12）；（ｄ）３，４−ジヒドロキシケイ皮酸などのコーヒー酸（化合物＃13）；（ｅ）ケイ皮酸（化合物＃14）；（ｆ）３，４−ジヒロドキシヒドロケイ皮酸（化合物＃15）、２−ヒドロキシケイ皮酸（化合物＃ 16）、３−ヒドロキシケイ皮酸（化合物＃17）、および４−ヒドロキシケイ皮酸（化合物＃18）などの芳香族カルボン酸；（ｇ）４−ヒドロキシフェニルピルビック酸（化合物＃19）などの芳香族ケトカルボン酸；（ｈ）４−ヒドロキシフェネチル・アルコール（化合物＃20）などの芳香族アルコール類である。図１はこれらクルクミン類似体の構造を示している。フラボノイドの代表的な例は図12の構造21および22に示されている。本発明はまた、動物におけるホスホリラーゼ・キナーゼの活性を抑制する新しい方法を提供する。この新しい方法は薬学的に有効な量のクルクミンまたはその類似体を投与するステップを含んでいる。本発明はまた、動物におけるチロシン・キナーゼの活性を抑制するための新しい方法を提供する。この新しい方法は動物に対して、薬学的に有効な量のクルクミンまたはその類似体を投与するステップを含んでいる。『個体』という用語は動物およびヒトをさして伝えられる。増殖性細胞の成長を「生物学的に抑制する』またはその成長の『抑制』という用語は、成長の部分的、または全体的な抑制を意味し、また、増殖または細胞成長の速度の低下を含んだ意味を有している。本発明による組成物の薬学的に抑制効果を示す量とは、組織培養における標的悪性、または異常増殖細胞の成長、動物および細胞培養における腫瘍成長に対するテスト要素の影響の評価、あるいは当業者に知られているいずれかの方法によって判定することができる。本発明の組成物の投与は、局所、眼球内、腹膜内、経口、鼻腔内、静脈内、皮下、あるいは他の適切な手段で行われてよい。投与される用量は年齢、治療段階、および疾患の範囲や個体の遺伝的傾向、位置、体重、同時に行われる処理があればそのタイプ、そして、病態的または悪性状態の性質などに依存している。本発明の方法において有益な効果的伝達システムは、経口投与用のカプセル、タブレット、溶液、懸濁液、またはエリキシル剤、または、そうした溶液、懸濁液、または乳剤の殺菌された液体形態などである。食塩水、あるいはりん酸塩緩衝食塩水、あるいは本発明による方法において用いられる化合物が適切な可溶性を有するいずれかの基質を用いることが好ましい。好ましくは、本発明による方法で有益な伝達システムは、溶液、懸濁液、または乳剤などの殺菌された液体形態で用いられる。局所的な使用のためには、油剤、クリーム、またはスプレイなどの形態で用いることができる。好ましくは、食塩水、またはりん酸塩緩衝食塩水、またはいずれかの、本発明の方法において用いられる化合物が適切な可溶性を示す基質が用いられる。本発明による組成物および方法が治療的効果を示す病態的癌性または非癌性増殖状態はひろい範囲において存在する。これらの病態的状態は異常細胞増殖を発生させる可能性を有するほとんどすべての細胞において発生する可能性がある。病態的、または異常な成長を示す細胞タイプとしては、（１）線維肉腫、（２）血管内皮細胞、および（３）表皮細胞などがある。上のことから、本発明の方法は個体のほとんどすべての器官および組織システム内の局所的、または分散した病態的状態の措置において有効であることが分かる。精製されたクルクミンはミエロイドおよびリンパ球白血病、乳房悪性腫瘍、および肺悪性腫瘍を含むいろいろなヒト腫瘍細胞の成長を抑制した（表Ｉ）。検査されたすべての乳房腫瘍細胞系はクルクミンに対して高度に感作性を示し、腎臓、肝臓、およびある種の表皮細胞タイプなど他の細胞タイプは抵抗性を示した。クルクミンの抗増殖効果と免疫システムの細胞によって主につくりだされるシトキンである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の効果との比較結果では、１ug/mlの濃度のクルクミンは0.2ug/ml（10,00 0ユニット/ml）のＴＮＦと少なくとも同程度の有効性を示した。ＴＮＦに対して高度に抵抗性を示すヒト骨髄真核細胞系である、ＨＬ−60もクルクミンに対して感作性を示すことが分かった。クルクミンの構造類似体クルクミンの構造類似体を誘導することができる。ヒドロキシケイ皮酸は、アセチル化ヒドロキシ芳香性アルデヒドのトリエチルホスホノアセテートとの反応を介して合成される。対応飽和類似体はケイ皮酸の水素化によって得られる。共役カルボニル化合物は、固体支持体上での反応を含むアルドール縮合によって合成される。この方法はカルボメトキシ基などの敏感な官能性（sensitive functi onality）を持つ化合物の合成にも適用できる。形態学的には、ほとんどの細胞は２つの異なったメカニズム、つまりアポプトシスおよび壊死によって死ぬ。アポプトシスは、一般的には、膜出血、核濃縮、およびＤＮＡの200−bpフラグメントへの細分化などをもたらすプログラムされた細胞死として特徴づけることができ、一方、壊死による細胞死は膨張、細胞成分の分解、そしてランダムなＤＮＡ細分化などを特徴としている。以下の実施例は本発明の種々の実施態様を示すことだけを目的として開示されるものであり、いかなる意味においても本発明の範囲の限定は意図していない。実施例１クルクミンの抗増殖効果５×10³個の細胞を37℃の温度下で一昼夜放置し、その後、クルクミン（2.7uM ）またはＴＮＦ（0.2ug/ml）で培養した。37℃で66時間培養した後、トリチウムを含むチミジンで細胞に６時間刺激を与えてから、取り出した。すべての判定は三重テストで行われた。表Ｉに示すように、クルクミンは骨髄細胞、特に骨髄性Ｈ1−60およびＭＬ− １細胞系および骨髄性（myelogenous）細胞系に対しては強い抗増殖効果を示した。クルクミンはＢ細胞およびＴ細胞リンパ球細胞系を抑制し、乳房細胞系および肺細胞系、Ａ549を強力に抑制した、対照的に、バーキット・リンパ球（Ｒaji ）細胞系、初期の腎（Ａ293ＬＴ）細胞系、上皮様（ＨeＬa）の細胞系、および肝（Ｈep Ｇ２）細胞系はクルクミンによる影響を受けなかった。図２Ａおよび２Ｂは、ホルモンに依存したヒト乳腺悪性腫瘍細胞（ＭＣＦ−７細胞）およびＴ−47Ｄ細胞の成長に対する用量−応答抑制効果をそれぞれ示している。両方のタイプの細胞において、１ug/mlの用量で、ほとんど完全な抑制効果が示された。図３Ａと３ＢはＭＣＦ−７細胞の成長に対するクルクミンの経時的な抗増殖効果を示した。図３Ａは１ug/mlのクルクミンが成長を約80％抑止したことを示している。図３Ｂは、シミジンの取り込みに対するクルクミンの経時的な影響を示している。図４Ａと４Ｂはホルモンには無関係な乳房腫瘍細胞，ＳＫ−ＢＲ３およびＢＴ −20に対するクルクミン影響の用量応答および経時的な抗増殖効果をそれぞれ示している。図５Ａと５Ｂは、骨髄単核ＨＬ−60細胞に対するクルクミンの抗増殖効果の用量−応答と経時的な変化をそれぞれ示している。図５Ａは、１ug/mlの用量でＨＬ−細胞の成長が90％程度抑制されたことを示している。図６Ａおよび６Ｂは、神経膠肉腫（Ｕ251）細胞およびヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するクルクミンの抗増殖効果をそれぞれ示している。図６Ａは、２ug/mlの用量がＵ−251の成長を60％程度抑制することを示しており、図６Ｂは、２ug/mlのクルクミンの用量がＨＵＶＥＣ細胞の用量を40％程度抑制したことを示している。図７は、１ug/mlのクルクミン、あるいは100ユニット/mlのＴＮＦのいずれもが、Ｕ−9371細胞株の成長を抑制したことを示している。しかしながら、図７に示されているように、クルクミンとＴＮＦの両方を同時に用いると、抗増殖相乗効果を示し、これらの細胞の成長を95％程度抑制した。図８は、クルクミンがその抗増殖効果を発揮するためには数時間存在しなければならないことを示している。実施例２フェルラ酸の抗増殖効果表IIに示されている研究にあたっては、５×10³個の細胞を37℃の温度で一昼夜放置し、その後、フェルラ酸（１ug/ml）で培養した。37℃で68時間培養した後、チミジンで６時間刺激を与えてから、細胞を取り出した。措置されていない細胞によるチミジンの取り込みは100％として示された。すべての測定は三重テストで行われた。これら三重テストにおける偏差は10％以下であった。表IIに示されているように、フェルラ酸および関連化合物は前骨髄細胞（ＨＬ −60およびＭＬ−１）に対して強力な抗増殖効果を示した。加えて、フェルラ酸は乳房腫瘍細胞系（ＢＴ−20およびＴ−47Ｄ）、肝臓（Ｈep Ｇ２）細胞系および発生期腎（Ａ293 ＬＴ）細胞系を抑制した。実施例３芳香族ケトン類の抗増殖効果表IIIに示されている実験において、５×10³個の細胞を37℃の温度下で一昼夜放置し、その後、芳香族ケトン類（１ug/ml）で培養した。37℃で68時間培養した後、細胞にチミジンで６時間刺激を与えてから取り出した。未措置細胞によるチミジン取り込みを 100％として示した。すべての測定は三重テストで行われた。三重テストにおける偏差は10％以下であった。表IIIに示されているように、芳香族ケトン類は骨髄性（ＨＬ−60およびＭＬ −１）細胞系および前骨髄（ＫＧ−１およびＫＧ−１ａ）細胞系を抑制した。さらに、芳香族ケトン類の抗増殖効果はバーキット・リンパ球（Ｒaji）細胞系および乳房腫瘍（ＢＴ−20，Ｔ47ＤおよびＳＫ−ＢＲ３）細胞系を抑制した。実施例４芳香族ジケトンの抗増殖効果表IVに示されている実験で、５×10³個の細胞が37℃で一昼夜放置し、その後、芳香族ジケトン（１ug/ml）によって培養した。37℃で68時間培養した後、チミジンで６時間刺激を与えてから、細胞を取り出した。未措置細胞によるチミジン取り込みを100％として示した。すべての測定は三重テストで行われた。三重テストにおける偏差は10％以下であった。表IVに示されているように、芳香族ジケトンは組織細胞リンパ球（Ｕ−937）細胞系を除いて、すべての骨髄腫瘍細胞に対して強力な抗増殖効果を示した。加えて、芳香族ケトン類はＢ細胞およびＴ細胞リンパ球腫瘍細胞および乳房腫瘍細胞系を抑制したが、ＳＫ−ＢＲ３は抑制しなかった。実施例５コーヒー酸の抗増殖効果表Ｖに示されている実験で、５×10³細胞を37℃の温度で一昼夜放置し、その後、コーヒー酸（１ug/ml）によって培養した。37℃で68時間培養した後、細胞にチミジンで６時間刺激を与えてから取り出した。未処理細胞によるチミジン取り込みを100％として示した。すべての測定は三重テストで行われた。三重テストにおける偏差は10％以下であった。表Ｖに示されているように、コーヒー酸は他のクルクミン類似体と比較して、ほとんどの細胞系に対して弱い抗増殖効果を示した。コーヒー酸に最も感作性を示した腫瘍細胞はＴ細胞リンパ球（Jurkat）細胞系であった。実施例６ケイ皮酸の抗腫瘍効果表VIに示す実験で、５×10³個の細胞を37℃の温度下で一昼夜放置し、その後、ケイ皮酸（１ug/ml）で培養した。37℃で68時間培養したあと、チミジンで６時間刺激を与えてから、細胞を取り出した。未処理細胞によるチミジン取り込みを100％として示した。すべての測定は三重テストで行われた。三重テストにおける偏差は10％以下であった。表VIは、ケイ皮酸が、Ｔ細胞リンパ球（Jurket）細胞、乳房腫瘍（ＢＴ−20およびＴ−47Ｄ）細胞、肝臓細胞性（Ｈep Ｇ２）腫瘍細胞系および網膜色素（Ｄ4 07）細胞系に対して抗増殖効果を有することを示している。実施例７カルボン酸の抗増殖効果表VIIに示されている実験で、５×10³個の細胞を37℃の温度下で一昼夜放置し、その後、芳香族カルボン酸（１ug/ml）によって培養した。37℃で68時間培養した後、細胞にチミジンで６時間刺激を与えてから、取り出した。未処理細胞によるチミジン取り込みを100％として示した。すべての測定は三重テストで行われた。三重テストにおける偏差は10％以下であった。表VIIは、芳香族カルボン酸が前骨髄（ＭＬ−１およびＨＬ−60）細胞、骨髄性（ＫＧ−１）細胞およびＴ細胞リンパ球細胞に対して抗増殖効果を有することを示している。加えて、芳香族カルボン酸は発生期腎（Ａ293ＬＴ）細胞、網膜色素（Ｄ407）細胞および乳房（ＢＴ−20）腫瘍細胞系を抑制した。実施例８芳香族ケトカルボン酸の抗増殖効果表VIIIに示す実験で、５×10³個の細胞を37℃の温度で一昼夜放置した後、芳香族ケトカルボン酸（１ug/ml）で培養した。37℃で68時間培養した後、チミジンで６時間刺激を与えた後、細胞を取り出した。未処理の細胞によるチミジンの取り込みを100％で示した。すべての測定は三重テストで行った。三重テストでの偏差は10％以内であった。表VIIIは、芳香族ケトカルボン酸が前骨髄（ＨＬ−60およびＴＨＰ−１）腫瘍細胞系を抑制したことを示している。加えて、芳香族ケトカルボン酸はＴ細胞リンパ球腫瘍細胞および網膜色素（Ｄ407）細胞を抑制した。実施例９芳香族アルコールの抗増殖効果表IXに示す実験で、５×10³個の細胞を37℃の温度下で一昼夜放置し、その後、芳香族アルコール（１ug/ml）によって培養した。37℃で68時間培養した後、チミジンで６時間刺激を与えた後、細胞を取り出した。未処理の細胞によるチミジンの取り込みを100％として示した。すべての測定は三重テストで行われた。これら三重テストでの偏差は10％以下であった。表IXは、前骨髄（ＨＬ−60）腫瘍細胞系に対する芳香性アルコール類の抗増殖効果を示している。加えて、芳香族ケトカルボン酸はＴ細胞リンパ球腫瘍細胞および網膜色素（Ｄ407）細胞を抑制した。実施例10 フラボノイドの抗増殖効果腫瘍細胞系に対するフラボノイドの影響を調べるために、５×10³個の細胞を3 7℃で一昼夜放置した後、フラボノイド（１ug/ml）で培養した。37℃の温度で68 時間培養した後、チミジンで６時間刺激を与えた後、細胞を取り出した。未処理細胞によるチミジン取り込みを100％として示した。すべての測定は三重テストで行った。これら三重テストでの偏差は10％以下であった。表Ｘは、フラボノイドが骨髄（ＨＬ−60およびＭＬ−１）細胞、骨髄（ＫＧ− １およびＫＧ−１ａ）細胞、肝臓（Ｈep Ｇ２）細胞、乳房腫瘍細胞系（ＢＴ−2 0，Ｔ−47ＤおよびＭＣＦ−７）、および発生期腎（Ａ293 ＬＴ）細胞に対する抗増殖効果を有することを示している。キナーゼ活性に対するクルクミンおよびクルクミン同族体の効果実施例11 蛋白質キナーゼ・アッセイ細胞質ゾルのプロタミン・キナーゼおよび自動ホスホリル化で活性化された蛋白質キナーゼをサウス・カロライナ州コロンビア、生化学部のZ．Damuni博士から入手した。これらの蛋白質キナーゼ製剤はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル浸透クロマトグラフィーに基づいて、均一であると判断された。ホスホリラーゼ・キナーゼ（170ユニット/mg）、ホスホリラーゼｂ、蛋白質キナーゼＡの触媒性サブユニット（41ユニット/mg）、ヒストンＨ−１およびＨ−２Ｂ、プロタミン・スルフェート（サルミン）、ミエリン塩基性蛋白質、クルクミン、およびホスファチジル−Ｌ−セリネはSigma ChemicalCo．から入手した。蛋白質キナーゼＣ（1200 ユニット/mg）はCalbiochem Corp．から入手した。ガンマ［³²Ｐ］ＡＴＰはICN Biomedicals，Inc．から入手した。蛋白質キナーゼＣ、蛋白質キナーゼＡ、および細胞質ゾルのプロタミン・キナーゼは、Damuniらが、1989“Purification and properties of a distinct prot amine kinase from the cytosol of bovine kidney cortex．J．Biol．chem．26 4，6412−6416 with modifications”で述べた方法で分析した。要約して言うと、この分析は25mMトリス塩酸、pH7.3、10％グリセロル、１mMベンザミジン、14m M Ｂ−メルカプトエタノール、0.2mMフェニルメチル・スルフォニル・フルオライド、100ug/mlレウペプチン、４uMミクロシスチンＬＲ、２ug/mlアプロチニン、蛋白質キナーゼ、50ugヒストンＨ−１（ＰＫＣ）またはヒストンＨ−２Ｂまたは 100ugプロタミン・スルフェート、10mM ＭgＣl₂，0.2mM［ガンマ−³²Ｐ］ＡＴＰ（200〜500cpm/pmol）を含んだ混合物0.05ml内で行われた。この反応はＭgＣl₂ およびＡＴＰを付加することによって開始された。37℃の温度下で10分間培養した後、この反応は10％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を１mlを加えることによって打ち切られた。ＴＣＡで反応を打ち切られた混合物の蛋白質は、Beckman遠心分離機で15,000×ｇの条件で２分間遠心分離することによって、ペレット化された。このペレットをＴＣＡで５回洗浄して、１mlのシンチラント（scintillant）を加え、Packcard社液体シンチレーション・カウンターで放射活性を測定した。コントロール・チューブは、蛋白質キナーゼをその混合物から取り除いたことを除けば、まったく同じ方法で処理された。蛋白質キナーゼＣは培養混合物が0.5mM ＣaＣl₂と40ug/mlのホスファチジル−Ｌ−セリンを含んでいたことを除くと、上に述べたのと同じ方法で分析された。ホスホリラーゼ・キナーゼは以下の修正を加えて、同様の方法で分析された。この分析対象の混合物は25mMトリス塩酸，pH 7.3、10％グリセロル、１mMベンザミジン、14mM Ｂ−メルカプトエタノール、0. 2mMフェニルメチル・スルフォニル・フルオライド、100μg/mlレウペプチン、４ uMミクロシスチンＬＲ、２ug/mlアプロチニン、および0.5mM ＣaＣl₂を含んだ蛋白質キナーゼを含んでいた。 37℃の温度下で10分間培養した後、１mlの10％ＴＣＡを用いて反応を打ち切り、上と同様に処理した。自動ホスホリル化によって活性化されたキナーゼは、まず最初に予備活性化されてから、基質としてミエリン塩基性蛋白質によって分析した。１ユニットの蛋白質キナーゼ活性を１分間あたりに１nmolのホスホリル基を基質に取り込む酵素の量と定義した。必ず線形になるように、ホスホリル基の取り込みの程度は１nmol未満に限定された。ナトリウム−ドデシル・ゲル電気泳動：ポリアクリルアミド・スラブ・ゲル（12％）をBiorad p バンドはクマシー・ブリリアント・ブルー染色で検出し、乾燥後、オートラジオグラムにかけた。60kDaの分子量を有する細胞性チロシン・キナーゼの活性は、以下の修正を加えて、Buddeら、Ｊ．Biol．Chem.，268：24868−24872（1993）に述べられているように測定された。簡単に言うと、培養混合物は25mMトリス塩酸、pH7.3、10％グリセロル、１mMベンザミジン、14mM β−メルカプトエタノール、0.2mMフェニルメチル・スルフォニル・フルオライド、100μg/mlレウペプチン、２μg/mlアプロチニン、蛋白質キナーゼ、50μgポリグルタミン酸チロシン（４：１）、10mM ＭgＣl₂および0.2mM［ガンマ−³²Ｐ］−ＡＴＰ（200−500c pm/pmol）を含んでいた。37℃で10分間培養した後、この混合物0.05mlをろ紙にブロットし、10％ＴＣＡに即時に浸潤した。次に、ろ紙を10％ＴＣＡで洗浄してから、シンチラントの存在下で放射活性をカウントした。実施例12 キナーゼ活性のクルクミン抑制本発明においては、異なった濃度のクルクミンの、６つの異なった蛋白質キナーゼの活性に関する影響が示される。図９は、クルクミンが調査対象のすべてのキナーゼを抑制したが、その程度は異なっていることを示す。１mMクルクミンで、ＰhＫ，pp60s-src，ＰkＣ，ＰkＡ，ＡＫおよびcＰＫはそれぞれ、98％、40％、15％、10％、１％および0.5％抑制された。しかしながら、クルクミンの濃度が高くなると、これらのキナーゼの活性はそれぞれ、98％、95％、46％、49％、 17％および２％抑制された。この抑制作用は用量に依存していた。調査されたキナーゼのうちで、ＰhＫが一番低い濃度のクルクミンで最も完全に抑制された。細胞性チロシン・キナーゼもほぼ完全な抑制が観察された。Ｐh Ｋに対するクルクミンの抑制効果を図10Ａに示す。クルクミンの影響はクルクミンの濃度が５uMと低い用量でも認められ、３mMの濃度でその抑制効果は頭打ちとなった。ＰhＫの反応生成物、つまりホスホリラーゼｂがＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で分析された。図10Ｂはクルクミンの抑制効果が５uMでも観察されること、そして、1.36uMでホスホリル化生成物が観察されなかった。クルクミンの抑制係数を調べるために、基質の濃度を変えて、ＰhＫに対する抑制因子の影響を調べた。これらの結果をラインウィーバー −バーク・プロット分析で分析された。図11Ａは、異なった基質濃度での抑制効果に関する曲線がほぼ線形であることを示している。このように、クルクミンは非競合的抑制因子であり、ホスホリラーゼの場合とは異なった部位で酵素に結合する。さらに、クルクミン濃度を変えて示した曲線の勾配はＫiが0.75mMであることを示している（図11Ｂ）。クルクミンに対して構造が似ている天然の類似体もＰhＫの活性を抑制した。ホスホリラーゼ・キナーゼ（134ユニット/ml）をクルクミンおよび上に述べたようなその類似体で分析した。表XIに示されているように，これらの類似体はクルクミンと同様に抑制的であるが、いずれも、クルクミンと同じ程度には酵素を抑制しなかった。本明細書に述べられているすべての特許および刊行物は、本発明が関連している分野の当業者には理解できる程度のレベルである。すべての特許および刊行物は、個々の刊行物が具体的、個別的に参照されていると同じ程度に、その組み合わせにおいても引例として参照されている。当業者なら、本発明が上に述べた課題を実行し、目的と利点、およびそれらに本質的に付随した目的や利点を達成できることは容易に分かるであろう。これらの実施例は、ここに記載されているその方法、手順、措置、分子、および具体的な化合物も含めて、現段階での好ましい実施例を代表しており、説明のために開示されるものであって、本発明の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に定義されているような本発明の精神の範囲において、変更や他の使用法は当業者には容易に思い付くであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９５年６月２０日【補正内容】１．薬学的に有効な量のクルクミン、またはその類似体の動物への投与を含む、肺癌、乳癌および黒色腫からなる群から選ばれた腫瘍性疾患を処理するための方法。２．該疾患が、腫瘍性疾患および非腫瘍性疾患を含むことを特徴とする請求項１の方法。３．キャンセルされた。４．該非腫瘍性疾患が、乾癬、良性増殖性皮膚疾患、魚鱗癬、乳頭腫、基底細胞悪性腫瘍、鱗状細胞悪性腫瘍、restinosis、強皮症、および血管腫であることを特徴とする請求項２の方法。５．該動物がヒトである請求項１の方法。６．該クルクミンが約１マイクログラムから約100ミ【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年７月６日【補正内容】１．薬学的に有効な量のクルクミン、またはその類似体の動物への投与を含む、肺癌、乳癌および非乳頭腫黒色腫からなる群から選ばれた腫瘍性疾患を処理するための方法。２．キャンセルされた。３．第19条補正によりキャンセルされたまま。４．キャンセルされた。５．該動物がヒトである請求項１の方法。６．該クルクミンが約１マイクログラムから約100ミ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．薬学的に有効な量のクルクミン、またはその類似体の動物への投与を含む、肺癌、乳癌および非乳頭腫黒色腫からなる群から選ばれた腫瘍性疾患を処理するための方法。２．キャンセルされた。３．キャンセルされた。４．キャンセルされた。５．該動物がヒトである請求項１の方法。６．該クルクミンが約１マイクログラムから約100ミリグラムの用量で投与される請求項１の方法。７．該類似体が、４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸、４−メチレンジオキシ・ケイ皮酸、３，４−ジメトキシケイ皮酸、４−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ブテン−２−オン、ジンゲロン、４−（３−メチレンジオキシフェニル）−２−ブタノン、４−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−３−ブテン −２−オン、４−ヒドロキシヴァレロフェノン、４−ヒドロキシベンジルアクトン、４−ヒドロキシベンゾフェノン、４−ヒドロキシベンジルラグトン、４−ヒドロキシベンゾフェノン、１，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−１，４−ペンタジエン−３−オン、６−ヒドロキシジベンゾイルメタン、３，４−ジヒドロキシケイ皮酸、ケイ皮酸、３，４−ジヒドロキシヒドロケイ皮酸、２−ヒドロキシケイ皮酸、３−ヒドロキシケイ皮酸，４−ヒドロキシケイ皮酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、および４−ヒドロキシフェネチルアルコールからなる群から選ばれたものである請求項１の方法。８．薬学的に有効な量のクルクミン、あるいはその類似体を動物に投与することを含む、ホスホリラーゼ・キナーゼの活性を抑制する方法。９．該動物がヒトである請求項８の方法。 10．該クルクミンが約１マイクログラムから約100ミクログラムの用量を投与する請求項８の方法。 11．該類似体が、４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸、４−メチレンジオキシケイ皮酸、３，４−ジメトキシケイ皮酸、４−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ブテン−２−オン、ジンゲロン、４−（３−メチレンジオキシフェニル）−２−ブタノン、４−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−３−ブテン− ２−オン、４−ヒドロキシヴァレロフェノン、４−ヒドロキシベンジルアクトン、４−ヒドロキシベンゾフェノン、４−ヒドロキシベンジルラクトン、４−ヒドロキシベンゾフェノン、１，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−１，４ −ペンタジエン−３−オン、６−ヒドロキシジベンゾイルメタン、３，４−ジヒドロキシケイ皮酸、ケイ皮酸、３，４−ジヒドロキシヒドロケイ皮酸、２−ヒドロキシケイ皮酸、３−ヒドロキシケイ皮酸、４−ヒドロキシケイ皮酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、および４−ヒドロキシフェネチルアルコールを含む群から選ばれる請求項８の方法。 12．薬学的に有効な量のフラボノイド、あるいはその類似体を動物に投与することを含む、病態的細胞増殖性疾患を処理する方法。 13．薬学的に有効な量のクルクミン、あるいはその類似体を動物に投与することを含む、チロシン・キナーゼの活性を抑制する方法。 14．該動物がヒトである請求項13の方法。 15．該クルクミンが約１マイクログラムから約100ミクログラムの用量で投与される請求項13の方法。 16．該類似体が、４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸、４−メチレンジオキシケイ皮酸、３，４−ジメトキシケイ皮酸、４−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ブテン−２−オン、ジンゲロン、４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−２−ブタノン、４−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−３−ブテン−２−オン、４−ヒドロキシヴァレロフェノン、４−ヒドロキシベンジルアクトン、４−ヒドロキシベンゾフェノン、４−ヒドロキシベンジルラクトン、４− ヒドロキシベンゾフェノン、１，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−１，４−ペンタジエン−３−オン、６−ヒドロキシジベンゾイルメタン、３，４− ジヒドロキシケイ皮酸、３，４−ジヒドロキシヒドロケイ皮酸、２−ヒドロキシケイ皮酸、３−ヒドロキシケイ皮酸、４−ヒドロキシケイ皮酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、および４−ヒドロキシフェネチルアルコールを含む群から選ばれる請求項13の方法。