JPH10501122A

JPH10501122A - Ｐ▲下２ｘ▼レセプター（プリノセプターファミリー）

Info

Publication number: JPH10501122A
Application number: JP8500271A
Authority: JP
Inventors: バルラ，ソルダ; ナッターバエル，ゲーリー
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1994-05-27
Filing date: 1995-05-24
Publication date: 1998-02-03
Also published as: WO1995033048A3; EP0760850A1; US5985603A; US6194162B1; AU2566595A; WO1995033048A2

Abstract

(57)【要約】ＡＴＰのＰ_2xレセプターが組換えＤＮＡ技術によりクローニングおよび発現され、そのレセプターは他のＡＴＰレセプターを含まずに作製できる。Ｐ_2Xレセプターは抗体を作製することができ、てんかん、認識、嘔吐、痛み（特に片頭痛）、喘息、末梢血管疾患、高血圧、免疫系の疾患、過敏性腸症候群および早漏を含めた様々な疾患および症状において使用する化合物をスクリーニングする上で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】Ｐ_2Xレセプター（プリノセプターファミリー）本発明はＰ_2X‐プリノセプター、その製法および用途に関する。Ｐ_2X‐プリノセプターはリガンドゲートイオンチャンネルであり、即ちそのレセプター自体は細胞外アデノシン５′‐三リン酸（ＡＴＰ）がレセプターと結合するときに開くイオンチャンネルを形成する。他に５つのクラスの神経伝達物質レセプター（ニコチン性アセチルコリン、グルタミン酸、グリシン、ＧＡＢＡ_A および５‐ＨＴ₃）があり、これらはリガンドゲートイオンチャンネルの構造関連スーパーファミリーを形成している（Barnard,Trends Biochem.Sci.17,368-37 4(1992)）。Ｐ_2X‐レセプターはこのタイプのレセプターの新たなファミリーを特定する。このレセプターの独特な構造、体全体におけるこのレセプターの広範な分布並びにこのレセプターが果たす多くの生理学的役割から、それは多くの病状の治療に用いる新たな治療上有効な化合物を特定する上で使用できる重要なタンパク質である。１９２９年、著名な生理学者Szent-Gyorgyi は細胞外プリンヌクレオシド（例えばアデノシン）およびヌクレオチド（例えばＡＴＰ）の強力な心血管系作用について記載しているが（Drury & Szent-Gyorgyi,J.Physiol.68,213-237(1929)）、１９７２年になるまで細胞外ＡＴＰについて（即ちアデノシンではなく、ＡＴＰを認識する）別個のレセプターの存在を示唆する薬理学的証拠は提出されなかった（Burnstock,Pharmacological Reviews,21,509-581(1972)）。Burnstock とその同僚によるこの分野での独創的なその後の研究は、比較的選択的なリガンドとＡＴＰを直接測定する技術の開発により相当に具体化されたBurnstock の仮説を発表するまで、１９７０年代から１９８０年代初期にかけて大部分が容認されなかった（Barnard et al.,Trends Pharmacol.Sci.15,67-70(1994)）。過去４または５年間において、神経伝達物質としてＡＴＰの役割に関する疑う余地のない証拠が精管、膀胱および尿管のような尿生殖器組織で腸および平滑筋緊張（収縮性）に対する血流の交感神経制御について提出された（Barnard et al.（前掲）およびEvans & Surprenant,Brit.J.Pharmacol.106,242-249(1992)）。実質的間接証拠も、脊髄、自律神経節および中枢神経系のある核中におけるいくつかの異なるニューロンで神経伝達物質としてＡＴＰの役割に関して存在する（Bean,Trend s Pharmacol.Sci.15,67-70(1992)、Evans et al.,Nature,357,503-505(1992)およびEdwards et al.,Nature,359,144-147(1992)）。プリノセプターはＰ₁（リガンドとしてアデノシン）およびＰ₂（リガンドとしてＡＴＰ）として分類される。Ｐ₂レセプターは２つの広範なタイプ、即ちＧ‐ タンパク質とカップリングする７‐貫膜レセプターであるタイプ（Ｐ_2Y、Ｐ_2U、Ｐ_2TおよびたぶんＰ_2Z）と、直接ゲート化されたイオンチャンネルを形成するタイプ（Ｐ_2X）に細分類される。これらタイプのレセプターの各々のサブタイプに関する薬理学的および／または生理学的証拠が存在している。これらのレセプターに関して最も最近の名称は以下で示されている。様々なＰ₂レセプターが以前にクローニングされた。Ｐ_2Y1は他の７‐ＴＭＧ‐ タンパク質カップリングレセプターとの相同性に基づきBarnard／Burnstockグループ（Webb et al.,FEBS Lett.324,219-225(1993)）によりクローニングされた。このグループは、哺乳動物脳ｃＤＮＡライブラリーと最後に成功した胚ニワトリ全脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、ＰＣＲ技術と、第二および第六膜貫通領域の保存領域に基づくプライマーを用いた。Ｐ_2Y2／Ｐ_2Uは、ＮＧ１０８‐１５ニューロブラストーマ細胞系から得られたｃＤＮＡから卵母細胞での発現クローニングにより、Julius研究所（Lustig et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,90,5113-5117(1993)）によりクローニングされた。Ｐ_2Y3／Ｐ_2Tも、Ｐ_2Y1レセプターを得るために用いられたのと同様のプローブと胚脳ｃＤＮＡライブラリーを用いて、Barnard／Burnstock グループにより得られた（Barnard et al.,Trends Pharmacol.Sci.15,67-70(1994)）。しかしながら、今までのところ、Ｐ_2Xレセプターのクローニングは捕らえどころのない目標のままであった。他のＰ₂レセプターで行われた従来のクローニング実施では、Ｐ_2Xレセプターをクローニングさせることができる適切な手掛かりを提供していない。第一に、すべての上記プリノセプターはＧ‐タンパク質カップリング７‐ＴＭタンパク質である。（すべての７‐ＴＭレセプターの場合のような）それらの無数の機能は、１種以上の第二メッセンジャー系のＧ‐タンパク質活性化を通して生じている。この７‐ＴＭ／Ｇ‐タンパク質カップリングファミリーに属する特定されたタンパク質には現在２００以上ある。これらのレセプターにおける作動剤はしばしばいくつかの酵素を伴う細胞内導入経路のカスケードを活性化させるが、細胞の応答は本来的に遅く（数秒〜分間）、興奮の変化は生じるにしても弱い。逆に、Ｐ_2Xレセプターはイオンチャンネルを組み込んだ基本的に異なるタイプのプリノセプターである。Ｐ_2Xレセプターの活性化は速く（ミリセカンド）、主に局所的な効果を有して、即時の脱分極および興奮を引き起こす。第二に、Ｐ_2Xレセプターの組織分布は他のプリノセプターと明確に異なり、生理学的役割は他のプリノセプターと異なる。レセプターをクローニングするために確立された主要な手法の１つはレセプタータンパク質のアミノ酸をコードするヌクレオチドの配列関連性に基づいており、それは既知配列と未知レセプターの場合とにかなり高レベルの相同性があることに依存している。この方法はＰ_2Y1形（上記）をクローニングするために用いられた。本出願人のものを含めたいくつかの研究所では、ＰＣＲ技術と、様々なリガンドゲート化イオンチャンネル（即ち、ニコチン性ＡＣｈ、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、５‐ＨＴ₃）の保存領域に基づくプライマーを用いて、Ｐ_2Xレセプターを得る上で相当な努力を払った。このアプローチは失敗した。後の解釈だと、この失敗は今になると合理的に解釈できるが、今ではＰ_2Xレセプターの構造がこれらリガンドゲートイオン化チャンネルのいずれとも相同性を有していないことがわかった。同様の理由から、フラグメントハイブリッド形成に基づくアプローチも成功しなかった。しかしながら、異なるアプローチを採用することにより、Ｐ_2Xレセプターをクローニングできることがここに可能とわかった。本発明が一部基づいているのはこの実績である。本発明の主要な面によれば、（ａ）図１、図２、図３または図４で示されたアミノ配列を有するか、または（ｂ）図１、図２、図３または図４で示された配列と実質的に相同的であるＰ_2X レセプターをコードする組換えまたは単離ＤＮＡ分子、あるいはこのようなＤＮＡ分子の断片（その断片には図１で示されたヌクレオチド１〜８１３、図２および３で示された全ヌクレオチド配列、または図４で示されたヌクレオチド１〜１７４４から取り出される少くとも１５のヌクレオチドを含む）が提供される。図１で示された配列は、ラット精管Ｐ_2XレセプターをコードするｃＤＮＡ配列である。この配列は長さ１８３７塩基であり、３９９アミノ酸のタンパク質をコードしている。レセプターがクローニングされた後で決定してみると、ヌクレオチド８１４から先にあるタンパク質コード配列の約半分は以前に発見されていたが、以前にクローニングされた配列の機能はアポトーシス細胞死に関与しているらしいことを除いて知られていなかった（Owens et al.,Mol.Cell.Biol.11,4177 -4188(1991)）。Owens et al.の配列は翻訳開始部位を欠いており、タンパク質にできなかった（図１において、Owens et al.により報告された配列の上流部分、即ちＰ_2Xレセプターと共通していないＰＱＬＡＨＧＣＹＰＣＰＰＨＲは比較目的で示され、本発明の一部を形成していない）。好ましくは、図１配列断片はヌクレオチド１〜８１０から取り出される。しばしば、図４配列断片はヌクレオチド１〜７７７から取り出される。図２で示された配列は、ラット上頸神経節（superior cervical ganglion）Ｐ_2X レセプターをコードするｃＤＮＡ配列である。図３で示された配列は、ラット後根神経節（dorsal root ganglion）Ｐ_2XレセプターをコードするｃＤＮＡ配列である。図４で示された配列は、ヒトＰ_2XレセプターをコードするｃＤＮＡ配列である。ｃＤＮＡはラットＰ_2Xプローブを用いてヒト膀胱から単離された。それは２６４３塩基長であり、ラット精管から単離されたラットＰ_2Xレセプター、ラット上頸神経節およびラット後根神経節から単離されたラットＰ_2Xレセプターのアミノ酸配列と高度に相同性であるアミノ酸配列を有した３９９アミノ酸タンパク質をコードしている。最近、我々は残基１７４５‐１９３３に対応する発現配列タグに気づいた（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,10645-10649(Oct.1994)）。図１、図２、図３または図４アミノ酸配列と実質的に相同的である配列には、好ましさの増加順に、少くとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％相同性を有するタンパク質をコードした配列がある。図１、図２、図３または図４のアミノ酸配列と少くとも９９％相同性を有するタンパク質は、このような配列から４以下のアミノ酸バリエーションを有する。好ましい実質的相同性配列には、他の種からのＰ_2X配列も含む。このため、ラットＰ_2X レセプター配列の場合には、好ましい実質的相同性配列はヒトＰ_2X配列である。配列相同性を決定する１つの方法はW.R.Pearson and D.J.Lipman,Proc.Natl. Acad.Sci.USA,85,2444-2448（1988）に開示されている。断片は勿論１５ヌクレオチド以上の長さであればよい。Ｐ_2Xラットレセプターまたはヒトレセプターの実質的全部をコードする断片は、レセプターの生物活性またはその生物活性の少くとも一部を保有していると予想される。それより短い断片も、レセプターの１以上の選択されたドメインについてコードする上で、あるいは単純に実質的相同性タンパク質をコードするものを含めた他の有用なＤＮＡ配列を検出または特定するためのプローブとして有用である。少くとも２０、３０または５０ヌクレオチドの断片は、それより短いものよりも有用なことが多い。本発明のＤＮＡ分子はいくつかの目的に有用である。第一に、特に、図１、図２、図３および図４で示されたＰ_2XｃＤＮＡは関連タンパク質を生細胞で発現させることができる。これはｃＤＮＡの断片だと不可能である。しかしながら、本発明の範囲内にはＤＮＡの断片だけでなく、上記の様々な目的のためのＤＮＡのゲノムおよび他の配列（天然で遺伝子中に存在するイントロンの全部ではなく少くとも１つを含んだ合成ＤＮＡおよび“ミニ遺伝子”を含む）もその範囲内に含まれる。ラットレセプタータンパク質またはヒトＰ_2Xレセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は一部の環境で好ましいが、その理由はこのような配列がゲノムまたはミニ遺伝子ＤＮＡよりも小さいためにクローニング操作し易いからである。Ｐ_2Xレセプタータンパク質は、下記のように、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で安定的に発現させうる。なお発現の問題について、真核細胞でゲノムＤＮＡを発現させることは可能であるが、一般的にイントロンに起因する大きなサイズのために宿主細胞中への挿入のためＤＮＡを操作することがかなり困難である。そのサイズはＲＮＡの発現に特に重要であり、非常に長いｃＲＮＡ‐全遺伝子のサイズ‐は十分な量で作ることが困難である。他方、ＲＮＡの発現は少くともイオンチャンネルタンパク質の研究上かなり好ましいが、その理由はXenopus 卵母細胞が電気生理学的方法により容易に研究できるほど十分に大きいからである。第二に、ｃＤＮＡ配列は、膜内で予想されるそれらのフォールディングの点で他の公知タンパク質と異なるタンパク質をコードしている。歴史的先例に基づくと、これは関連タンパク質の大きなファミリーの発見につながることから有利であり、これらはＡＴＰにより媒介されるシグナリングと無関係な機能的役割を有している。第三に、ラットおよびヒトＰ_2XｃＤＮＡによりコードされるタンパク質配列の知識は、膜内の詳細な配置を予想する分子モデルの開発を可能にする。それは更に、このようなモデルの正しさを変異タンパク質の発現から調べることを可能にする。これら２つのアプローチは、それらがレセプターを活性化または阻止させる補助治療剤の分子デザインを可能にすることから有利である。第四に、Ｐ_2XｃＤＮＡ配列から、このレセプターをコードするＲＮＡとそのレセプタータンパク質自体の分布をヒト組織で地図にすることができる。ＲＮＡ分布はin situ ハイブリッド形成により決定できる。このようなハイブリッド形成研究は本例で開示されている。ｃＤＮＡから求められたアミノ酸配列の知識があれば、Ｐ_2Xレセプターを選択的に認識する抗体を生成させるために使用できる合成ペプチドを作れる。このため、Ｐ_2Xタンパク質は免疫組織化学により地図化できる。これは、Ｐ_2Xレセプターを活性化または阻止する、レセプターを限局化させる上で選択的でない現在の方法（放射性リガンド結合）に基づくと予想できない薬物の新規治療適用を示唆している。第五に、ラットＰ_2XｃＤＮＡによれば、ヒト組織から密接に関連したｃＤＮＡを単離することができるため有利である。第六に、ヒトＰ_2XｃＤＮＡクローンを単離すれば、ヒトゲノムクローンを得ることができる。ヒト遺伝病につながるこの遺伝子の変異が発見される可能性がある。このような変異の分析は、このような変異に起因する疾患または障害の適切な治療につながる。本発明の一面において、ラット精管Ｐ_2Xレセプターは構造について従来の推論を必要としない方法によりクローニングされた。関心あるレセプターについてＲＮＡに富むと考えられる組織が選択された。いくつかの組織源が試みられたが、それらは卵母細胞でＡＴＰ応答につながるＲＮＡを出さなかった。結局、精管が選択された。抽出されたポリアデニル化ＲＮＡから、できるだけ組織中のＤＮＡに対応するｃＤＮＡライブラリーまたはバンクが構築された。ラットＰ_2X遺伝子が表される満足のいくｃＤＮＡライブラリーが構築されることは、研究が始まる前または満足のいくように終えるまで確かでなかったが、それにもかかわらずこれはプラスミドｐＢＫＣＭＶで達成された。関心あるラット精管Ｐ_2XｃＤＮＡを含むライブラリー内における個別クローンはライブラリーの漸次的分別により検出され、各段階においてフラクションはそれから作られたＲＮＡが関心あるタンパク質の形成を指図できるかどうかを調べるために試験された。更に詳しくは、ＲＮＡはライブラリー（約２百万）中にあるｃＤＮＡからインビトロで転写され、ＲＮＡ（“ｃＤＮＡ”）混合物が未成熟 Xenopus 卵母細胞中に注入された。ｃＤＮＡは意図しない酵素分解を非常にうけやすく、そのためすべての操作は無菌条件下で行われた。ｃＤＮＡプールはミニプレプ操作により作られ、したがって多量のE.coli ＲＮＡを含有していたが、この困難さはｃＤＮＡが転写される前にＲＮＡを沈降させることにより克服された。タンパク質の検出は、原則として、放射性リガンド結合または機能的応答により行える。Xenopus 卵母細胞中におけるＧタンパク質の活性化と、その後の細胞応答は、Ｐ_2Y2／Ｐ_2Uレセプターを得るために用いられた。現在の研究では、応答としてＰ_2Xの内在性イオンチャンネルの開放を用いる決定がなされた。個別卵母細胞は、それらがそれらの膜でＰ_2Xレセプタータンパク質を作ったかどうかを調べるために注入後２日間スクリーニングされた。これはＡＴＰ（３０μＭ）が卵母細胞の外側に適用されたときに卵母細胞膜を通る電流の流れを記録することにより行われたが、Ｐ_2Xレセプターが作られたならば、小さな一過性電流が予想される。しかしながら、卵母細胞が本来他の種類のＡＴＰレセプターを発現するので、卵母細胞の一部のバッチはＡＴＰに対する応答を示すことから、レセプターの発現に関する試験は直接的な簡単なものではなかった。この困難さは次のように克服された：卵母細胞が予想電流でＡＴＰに応答したとき、これはＰ_2Xレセプター拮抗剤（スラミン）での遮断により更に試験された。このような卵母細胞で陽性の応答を示すｃＤＮＡフラクションは更に分割され、各フラクションは再び試験された。このような漸次的分別が単一クローンの単離につながった。プラスミド中にあるインサートが配列決定されたが、その配列は図１で示されている。この配列は、ラット上頸神経節からのＰ_2XレセプターをコードするｃＤＮＡのクローニングに用いられるＰＣＲプライマーをデザインするために用いられた（図２参照）。同様の操作は、ラット後根神経節からのＰ_2XレセプターをコードするｃＤＮＡのクローニングにも用いられた（図３参照）。本発明によるＤＮＡは通常組換または単離形であり、プラスミド、ファージミド、コスミドまたはウイルスのようなベクターの形でもよく、一部の態様では例えば異種宿主でタンパク質の発現を指図する要素を含んでいる。非発現性ベクターはクローニングベクターとして有用である。本発明によるＤＮＡは合成してもよいが、組換えＤＮＡ技術により作製されることが好ましい。結局、双方の技術は連続ヌクレオチドの結合鎖および／またはオリゴ‐および／またはポリヌクレオチドの結合に依存している。本発明では、組換えＤＮＡ技術により作製されて、このため本来伴われるかまたは混入されるタンパク質（例えばＰ_2U、特にＰ_2Yレセプター、または他のＡＴＰレセプター、あるいは結合タンパク質）を含んでいないＰ_2Xレセプターを初めて得ることができ、これ自体が本発明のもう１つの面を形成している。そのタンパク質は細胞、オルガネラまたは人工膜のような脂質二重層に通常伴う。第一面に従いＤＮＡの発現により作製されたＰ_2Xレセプターはグリコシル化してもよいが、そうする必要はない。一般的に言えば、グリコシル化されるレセプタータンパク質およびイオンチャンネルは炭水化物除去後またはタンパク質をグリコシル化しない細胞で発現されたときにも機能する。しかしながら、グリコシル化およひ非グリコシル化タンパク質の間には機能上でしばしば重要な量的差異がある。ラット精管Ｐ_2Xレセプターの場合、クローン化タンパク質における４５ｋｄの分子量と比較してラット精管から精製されたときに６２ｋｄの分子量を有しているため、我々は天然タンパク質がグリコシル化されていると考えている。同様の結果はヒトＰ_2Xレセプターでも得られた（後記参照）。細胞外ドメインにはいくつかのアスパラギン残基もあるが、これは糖付加部位であるらしい。Ｐ_2Xレセプターのアミノ酸配列の知識があると、必要ならば、タンパク質またはそのペプチド断片を化学合成で作製することができる。しかしながら、ＤＮＡからの発現または少くともＲＮＡからの翻訳による作製が通常は好ましい。本発明の範囲内にある特に有用なペプチド断片は、Owens et al.前掲に開示されたＲＰ‐２ポリペプチドと免疫上非交差反応性である、Ｐ_2Xレセプターの（少くとも５、６、７、１０、１５または２０アミノ酸残基を含む）エピトープを含んでいる。Ｐ_2Xレセプターおよびその断片は、それ自体が本発明の一部を形成する特異的ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製するために使用できる。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、当業界で十分に確立された方法により作製される。モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマおよび他の細胞も本発明内に属する。本発明によるＤＮＡから転写しうる、他のＲＮＡを実質上含まない、Ｐ_2XレセプターをコードするＲＮＡも、本発明の一部を形成しており、ハイブリッド形成研究、インビトロ翻訳と、Xenopus 卵母細胞のような適切なインビボ系での翻訳を含めたいくつかの目的にとり有用である。本発明は前記のようなベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞にも関する。宿主細胞は原核でもまたは真核でもよく、それには哺乳動物細胞〔例えばＣＯＳ、ＣＨＯ細胞およびヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）〕、昆虫細胞、酵母（例えばSaccharomyces cerevisiae）および細菌（例えばEscher ichia coli）がある。宿主細胞はＣＯＳ細胞の場合のようにレセプターの一時的発現を生じるだけでもよいが、好ましくは宿主細胞はベクターで安定的にトランスフェクトされる。レセプターを適切にグリコシル化する宿主細胞が好ましい。Ｐ_2Xレセプターを安定的に発現するＣＯＳ細胞系または他の細胞系は、電気生理学的なカルシウム流入、カルシウムイメージングおよびリガンド結合研究に使用できる。レセプターを発現しない宿主細胞は、クローニング宿主としてなお有用である。本発明に従い組換えＤＮＡ技術により作製されたＰ_2Xレセプターは、発現宿主の膜においてその場でまたはインビトロ系でいくつかの用途を有している。特に、そのレセプターはここで簡単に記載されるように、様々なヒト（または他の動物）疾患および症状に有用な化合物のスクリーンとして使用できる。このような化合物には、組合せライブラリーと、未知化合物含有抽出物（例えば、植物抽出物）に存在しているものがある。てんかんてんかんは、脳の特定領域、特に海馬にある独特なニューロンの過剰興奮に起因する。機能性ＡＴＰＰ_2Xレセプターは、一部の海馬ニューロンに存在することが知られている。Ｐ_2Xレセプターが阻害性介在ニューロンで発現されるならば、レセプター作動剤は治療上有用である。レセプターが主要（錐体または顆粒）細胞で発現されるならば、レセプター拮抗剤は有用である。どのクラスのニューロンがレセプターを発現するかを調べることが可能になる。認識海馬ニューロンはＰ_2Xレセプターの活性化によりＡＴＰに応答するが、これらの領域は認識上特に重要である。海馬でＰ_2Xレセプターの細胞局在性を調べることは可能であり、この局在性に応じて作動剤または拮抗剤は記憶力を高める上で有効かもしれない。嘔吐嘔吐の鋭敏な誘因は上部胃腸管の平滑筋の急激な収縮である。ＧＩ管、特に胃および気管の平滑筋に存在するＡＴＰＰ_2Xレセプターの活性化は、強い急激な筋肉収縮を起こす。内臓平滑筋に選択的なＰ_2X拮抗剤は嘔吐に有用である。更に、Ｐ_2Xレセプターは孤束の核で発現されることが知られており（Ueno et al.,J.Neurophysiol.68,778-785(1992)）、一次内臓求心性神経からの伝達に関与しているが、これは選択的Ｐ_2X拮抗剤により遮断される。痛み第一に、Ｐ_2Xレセプターは脊髄の後角ニューロンで発現される。ＡＴＰによるこれらニューロンの活性化は速やかな脱分極興奮性応答を起こすが（Jahr & Jessell,Nature,304,730-733(1983)）、侵害受容繊維からの伝達成分がＡＴＰにより媒介されるならば、これはＰ_2X拮抗剤により遮断できる。第二に、ＡＴＰは皮内に適用されたときに知られる最も有害な物質の１つである。これは小径侵害受容繊維の末梢終末を直接活性化するためであり、後根神経節にある細胞体はＰ_2Xレセプターを発現することが知られている。Ｐ_2X拮抗剤は末梢で活性な鎮痛剤であり、片頭痛に有効なようである。喘息気管支平滑筋はＰ_2Xレセプターの活性化に応答して収縮する。これは交感神経または局所免疫細胞から放出されるＡＴＰに応答して生じる。Ｐ_2X拮抗剤は気管支平滑筋の刺激誘発痙攣を妨げる上で役立ち、それにより喘息発作の頻度および／または程度を減少させる。末梢血管疾患ノルアドレナリンではなくＡＴＰは、全末梢抵抗の７０％以上を占める小抵抗動脈の一次血管収縮神経伝達物質であることが明らかになっている。これは多くの血管で示された（Westfall et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.603,300 -310(1991)）。選択的拮抗剤は局所側副血管拡張に使用できる。高血圧交感神経緊張増加に伴う高血圧はＰ_2Xレセプター拮抗剤で治療できるが、その理由はＡＴＰがヒトを含めたいくつかの種で多くの抵抗血管に対する主要な興奮伝達物質だからである（Westfall et al．前掲およびMartin et al.,Br .J.Pharmacol.102,645-650(1991)）。免疫系の疾患Ｐ_2Xレセプターの一部分と同一な分子が、死ぬように誘導された胸腺細胞からクローニングされた（Owens et al.前掲）。これらの症状下における選択的発現は、Ｐ_2Xレセプターと密接に関連した分子が免疫担当細胞の選択の必須部分であるアポトーシスで役割を有することを意味している。Owens et a l.により記載された分子（ＲＰ‐２）は不完全であり、タンパク質に翻訳されなかった。Ｐ_2Xレセプターのクローニングによれば、全長ＲＰ‐２クローンの単離、それらの異種発現およびそれらの機能的役割の決定を行える。過敏性腸症候群ＡＴＰは腸管、特に結腸の平滑筋に対する重要な伝達物質である。それは、Ｐ_2Xレセプターを活性化させることによる、腸神経系にあるニューロン間の伝達物質でもある（Galligan,Gastroenterology,in press）。したがって、Ｐ_2Xレセプターでの拮抗剤はこの症状の管理に有用性を有している。早漏これは精管平滑筋の刺激誘発収縮を妨げることにより防止できる。Ｐ_2X レセプターはこの組織で高度に発現され、この部位での拮抗剤は交感神経興奮中に精管収縮性を妨げる。膀胱炎Ｐ_2Xレセプターは膀胱炎患者で膀胱感受性増加に関係している。このため、このようなＰ_2Xレセプターの拮抗剤は膀胱炎を治療する上で有用である。上記のように特定された有用な作動剤および拮抗剤も本発明の面を形成している。ｈＰ_2Xレセプターのクローニングは本発明の重要な面である。ｈＰ_2Xは向イオン性プリノセプターの多重遺伝子族の最初のヒトメンバーである。ラット精管から単離されたＰ_2X、ラット上頸神経節またはラット後根神経節から単離されたＰ_2X とのその強い類似性は、それがラットタンパク質のヒトホモログであることを示唆している。本発明者らは、これら２つの配列間の差異が親水性残基のほぼすべての保存的置換であることを発見した。意外にも、ｈＰ_2Xは他に報告されたＰ_2X レセプター、即ちラットＰＣ１２細胞からの場合と４１％の同一性を有するだけである（Brake et al.,New structural motif for ligand-gated ion channel s defined by an ionotropic ATP receptor,Nature,371:519-523(1994)）。ＰＣ１２由来レセプターは類似した膜トポグラフィーを有すると提唱され、システイン残基の保存スペースを保有しており、図５で２つの平滑筋配列について示されている。ｈＰ_2Xポリペプチドの計算分子量（４５ｋｄ）は、膵臓ミクロソーム膜の不在下で作られたときに、インビトロ翻訳産物の場合と一致する。ミクロソームの存在下で産生された大きな６０ｋｄ産物はグリコシル化を示唆し、中心細胞外ドメインの考えを支持している。このため、予想ｈＰ_2Xタンパク質はこのファミリーの他のクローン化膜の一般的特徴（Valera et al.,A new class of ligand-gate d ion channel defined by P_2X receptor for extracellular ATP,Nature,371:5 16-519(1994)；Brake，前掲）、即ち２つの貫膜スパンと短い内部Ｎ‐およびＣ ‐末端に隣接した大きなシステインに富む細胞外中心ドメインを有している。ｈＰ_2XｍＲＮＡの分布はノーザンブロット分析により調べられた。主要２．６ｋｂ種のハイブリッド形成は、脳を除き、試験されたすべてのＲＮＡサンプルでみられた。脾臓で観察される小さな１．８ｋｂバンドおよび肺臓ｍＲＮＡは、ラット精管からのＰ_2XｍＲＮＡで生じるように、ｍＲＮＡの短い３′未翻訳部分によるものである。胸腺、肺臓、脾臓および肝臓ＲＮＡで観察されるハイブリッド形成は、それらの臓器中における平滑筋の含量を反映しているのかもしれない。しかしながら、ｈＰ_2Xは副腎および造血細胞系ＨＬ６０中でその存在により証明されるように、他の細胞タイプで役割を有しているらしい。ＨＬ６０分化によるｈＰ_2XｍＲＮＡの強い誘導はラットでのパラレルな観察を反映し、そこでは平滑筋形のＰ_2XｍＲＮＡがデキサメタゾンにより未成熟胸腺細胞で誘導できる（ＲＰ２ｍＲＮＡ；Owens et al.,Identification of mRNAs associated with progr ammed cell death in immature thymocytes,J.J.Molec.Cell.Biol.11,4177-4188 (1991)）。本発明では、クローン化Ｐ_2X‐プリノセプターの最初の包括的な薬理学的特徴付けを行うことができた。ＡＴＰに対する応答とα，β‐メチレンＡＴＰに対する感受性の時間的推移は、膀胱中の天然ｈＰ_2Xについて報告された場合と似ている（Inoue & Brading,Human,pig and guinea-pig bladder smooth muscle cells generate similar inward currents in response to purinoceptor activation ,Br.J.Pharmacol.103:1840-1841 (1991)）。このため、一部天然Ｐ_2Xプリノセプターの機能的性質は単一分子種の発現により得られる。ｈＰ_2Xクローンを発現する卵母細胞から記録された作動剤誘導電流は、低レベルの内在エクトヌクレオチダーゼ活性の系でＰ_2X‐プリノセプターの活性化の直接的尺度を与える。ｈＰ_2X における作動剤プロフィール２ＭｅＳＡＴＰ≧ＡＴＰ＞α，β‐ｍｅＡＴＰは、クローン化ラット精管Ｐ_2X‐プリノセプターの場合と似ている。全組織研究での α，β‐ｍｅＡＴＰの高効力（α，β‐ｍｅＡＴＰ＞＞２ＭｅＳＡＴＰ≧ＡＴＰ）は、エクトヌクレオチダーゼに対するその抵抗をおそらく反映している。ＡＴＰ、２ＭｅＳＡＴＰおよび２‐クロロ‐ＡＴＰに関する濃度‐効果曲線は重ね合わせできて、アデニン環上２′位でのこれら特定の置換はＰ_2X‐プリノセプターへの作動剤結合に影響を与えないことを示している。血小板から放出されたジアデノシンリン酸（ＡＰ₅ＡおよびＡＰ₆Ａ）がＰ_2X‐プリノセプターの活性化により血管作動剤として作用できることから、ＡＰ₅Ａの作動剤活性が存在しているらしい。本発明の各面の好ましい特徴は、必要な変更を加えて、他の各面のとおりである。本発明は下記例で説明される。その例は以下の添付図面に言及している：図１は、例２で決定したような、ラット精管Ｐ_2XレセプターのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）。図２は、例１１で決定したような、ラット上頸神経節Ｐ_2XレセプターのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）。図３は、例１２で決定したような、ラット後根神経節Ｐ_2XレセプターのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）。図４は、例６で決定したような、ヒトＰ_2XレセプターのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）。図５は、ｈＰ_2Xとラット精管Ｐ_2Xとの予想アミノ酸配列の並び方と、ｈＰ_2Xタンパク質のインビトロ翻訳を示す。ＴＭ１およびＴＭ２陰影ボックスは疎水性領域を示し、ボックスアミノ酸は２つの配列間の差異を示す。 ○は保存システイン残基を示す。 ★はＮ‐グリコシル化の可能な部位を示す。図６は³⁵Ｓ‐メチオニン標識ｈＰ_2Xタンパク質のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析について示す。レーン１および２は、各々ミクロソーム膜の不在および存在下におけるｐＢＫＣＭＶ‐ｈＰ_2XｃＤＮＡのインビトロカップリング転写／翻訳について示す。図７および８はｈＰ_2XｃＤＮＡのノーザン分析について示す：Ａ）図７は分化ＨＬ６０細胞からの全ＲＮＡ８μｇによるノーザンブロットについて示す。０は処理なしのＨＬ６０細胞を示し、ＰＭＡ２およびＰＭＡ３は各々ＰＭＡで２日間および３日間処理された細胞を示し、ＤＭＳＯはＤＭＳＯで６日間処理された細胞を示し、ｄｃＡＭＰはジブチリルｃＡＭＰで５日間処理された細胞を示し、ＵＢはヒト膀胱からのポリＡ⁺ＲＮＡ１００ｎｇを示す。Ｂ）図８はヒト組織におけるｈＰ_2Xの分布を示す。各列は、ポリＡ⁺ＲＮＡ０．２μｇを含有した膀胱を除き、ポリＡ⁺ＲＮＡ１μｇを含有していた。図９、１０および１１はプリノセプター作動剤に対するｈＰ_2X発現卵母細胞の応答性について示す：Ａ）図９はＡＴＰ、２ｍｅＳＡＴＰおよびα，β‐ｍｅＡＴＰ（０．１、１および１００μＭ）により誘発される内部電流を表すトレースについて示す。各作動剤に関する記録は別々な卵母細胞による。Ｂ）図１０は全体Ｐ_2X‐プリノセプター作動剤の濃度応答関係を示す。データは１００μＭＡＴＰに対するピーク応答と比較して表示されている。Ｃ）図１１は部分Ｐ_2X‐プリノセプター作動剤の濃度応答を示す。データは１のヒル（Hill）スロープと合う（ｎ＝４〜８）。図１２および１３はｈＰ_2X媒介応答のＰ₂‐プリノセプター拮抗剤の効果について示す：Ａ）図１２はＰ₂‐プリノセプター作動剤スラミン（１、１０および１００μ Ｍ）の存在下でＡＴＰについての濃度応答曲線を示す（各点でｎ＝４）。Ｂ）図１３は、１０μＭＡＴＰに対する応答を阻害する上で、スラミン、ＤＩＤＳ、ＰＰＡＤＳおよびＰ５Ｐの濃度依存性について示す（各点でｎ＝４）。図１４は（例１０で記載されたクローン３によりコードされているような）ラット上頸神経節Ｐ_2Xレセプターの機能的特徴付けの結果を示す。これらの実験ではトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの電気的記録を提供した。上左：時間がバーで示されている、ＡＴＰ（３０μＭ）により誘発された重ね合わせ電流。保持ポテンシャルは−７０から２０ｍＶに変化させた。上右：膜ポテンシャルの関数としてのピーク電流下左：１〜３００μＭＡＴＰにより誘発された重ね合わせ電流下右：ＡＴＰおよびα，β‐メチレンＡＴＰに関する濃度応答曲線（ポイントは実験５〜８回の平均±ｓ．ｅ．平均である）図１５は、ＨＥＫ２９３細胞においてＰＣ１２およびヒト膀胱形と比較した、（例１１に記載されたような）Ｐ_2Xレセプターのクローン３形で作用する様々な物質により起きた電流の阻害について示す。上：スラミンによる阻害中：ＰＰＡＤＳによる阻害下：ピリドキサール５‐リン酸による阻害例（ｉ）ラット精管Ｐ_2Xレセプター例１ラット精管Ｐ_2Xレセプターのクローニング全ＲＮＡを４週齢Sprague-Dawley雄性ラットの精管からグアニジニウムイソチオシアネート法（Sambrook et al.,"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ,Cold Spring Harbor Laboratory Press,second edition(1989)）により単離し、その後ポリＡ⁺ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）‐セルロースにより精製した。配列５′‐ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ‐３′（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）でプライミングされた第一鎖ｃＤＮＡを SUP ERSCRIPT^TM（ＢＲＬ、Gaithersburg、ＭＤ、ＵＳＡ）で合成した。ｃＤＮＡから二本鎖への変換後（Gubler & Hoffman,Gene,25,263-269(1983)）、ＥｃｏＲＩリンカーをｃＤＮＡに結合させ、生成物をＮｏｔＩで切断した。１．３〜９ｋｂのＥｃｏＲＩ‐ＮｏｔＩｃＤＮＡをゲル電気泳動により単離し、一方向ライブラリーを同酵素で切断されたｐＢＫＣＭＶ(Stratagene，San Diego ,ＣＡ，ＵＳＡ）へのそのｃＤＮＡの結合により構築した。ライブラリーをE.col i ＤＨ１０Ｂ細胞中にエレクトロポレーションし、８×１０⁴クローンの２４プールに分けた。そのプールからのプラスミドＤＮＡをミニアルカリ溶解、その後ＬｉＣｌ沈降により作製した（Sambrook et al.,前掲）。ＮｏｔＩ直鎖化ｃＤＮＡをキャップアナログｍ７ＧｐｐｐＧの存在下においてＴ３ＲＮＡポリメラーゼでインビトロ転写させた（Sambrook et al.,前掲）。インビトロ転写ＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を４mg/ml に濃縮した。例２ラット精管Ｐ_2XレセプターｃＤＮＡの配列決定ｃＤＮＡインサートをエキソヌクレアーゼ方法で配列決定した(Henikoff,Meth .Enzymol.155,156-164(1987))。配列は図１に示されている。例３卵母細胞におけるラット精管Ｐ_2XレセプターｃＤＮＡの機能的特徴付けＲＮＡ５０ｎｌ（２００ｎｇ）をデフォリキュレート化（defolliculated）Xe nopus 卵母細胞中に注入した。１８℃で２〜６日間のインキュベート後、卵母細胞を２電極電圧クランプ(GENECLAMP^TM)によりＡＴＰ誘発電流についてアッセイしたが、１つの電極は（−１００ｍＶで）電圧を一定に保つためであり、他方は電流を測定するためである。ＡＴＰ誘発電流を示すｃＤＮＡプールは、単一クローン（Ｐ_2X）を得るために細分割した。電気生理学的測定は９６ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＫＣｌ、１．８ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．６および５ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有した灌流培地中において−１００ｍＶで行った。用量‐応答曲線およびスラミン阻害では、卵母細胞にＰ_2XｃＲＮＡ１００ｎｇを注入し、すべての記録を内在Ｃａ²⁺の代わりにＢａ²⁺により−６０ｍＶで行って、内在Ｃａ²⁺活性化Ｃｌ^-電流の活性化を妨げた。マイクロ電極（０．５〜２ＭΩ）は３ＭＫＣｌで満たした。例４ＨＥＫ２９３細胞におけるラット精管Ｐ_2Xレセプターの機能的特徴付けＨＥＫ２９３細胞をＰ_2X‐プラスミドでリポフェクチン法（Felgner et al.,P roc.Nat'l.Acad.Sci.USA,84,7413-7417(1987)）によりトランスフェクトした。用いられたＤＮＡ濃度は４枚の１１ｍｍ径カバースリップを含む３５ｍｍペトリ皿中に置かれた１mg／２ml培地であり、そこではＨＥＫ細胞をカバースリップ当たり１０，０００細胞で置いた。細胞を６時間にわたりリポフェクチン／ＤＮＡに暴露させ、記録を１６〜３６時間後に行ったところ、記録が行われた細胞の４０〜６０％がＰ_2X応答を示した。電流は全細胞記録法およびAXOPATCH^TM２００増幅器（Axon Instruments）を用いてＨＥＫ２９３細胞から記録したが、パッチピペット（５ＭΩ）は（ｍＭ）アスパラギン酸ＣｓまたはＫ１４０、ＮａＣｌ５、ＥＧＴＡ１１、ＨＥＰＥＳ５を含有していた。外部溶液は（ｍＭ）ＮａＣｌ１５０、ＫＣｌ２、ＣａＣｌ₂ ２、ＭｇＣｌ₂ １、ＨＥＰＥＳ５およびグルコース１１であって、双方の溶液のｐＨおよび浸透圧は各々７．３および３０５mosmol／ｌに維持した。すべての記録は室温で行った。データ収集および分析はpCLAMP^TMおよびAXOPATCH^TMソフトウエア（Axon Instruments）を用いて行った。ＨＥＫ細胞でＡＴＰ電流のカルシウム透過性を試験する実験のための溶液は（ｍＭ）：内部溶液ＮａＣｌ１５０、ＨＥＰＥＳ５、ＣａＣｌ₂ ０．５およびＥＧＴＡ５（遊離カルシウム濃度約５ｎＭ）；外部ナトリウム溶液ＮａＣｌ１５０、グルコース１１、ヒスチジン５、ＣａＣｌ₂ ２；外部カルシウム溶液ＣａＣｌ₂ １１５、グルコース１１およびヒスチジン５を含有していた。溶液のｐＨおよび浸透圧は、各々７．４および２９５mosmol／ｌであった。単チャンネル測定の場合、GENECLAMP^TM５００増幅器およびアウトサイド‐ アウト記録法を用いた（Adelman et al.,Neuron,9,209-216(1992)）。ワックスコートパッチピペット（５〜１０ＭΩ）は（ｍＭ）グルコン酸Ｋ１１５、ＨＥＰＥＳ５、ＢＡＰＴＡ５およびＭｇＣｌ₂ ０．５を含有し、外部溶液は９６ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＫＣｌ、１．８ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．６および５ｍＭピルビン酸ナトリウムであった。ＡＴＰは典型的には１ｓでＵチューブにより適用し、データは作動剤（ＡＴＰ）適用の開始の３００ｍｓ前に始めて２ｓセグメントにて５ｋＨｚでサンプリングし、１ｋＨｚでロ過した。例５ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３細胞中へのラット精管Ｐ_2XレセプターｃＤＮＡのトランスフェクションＣＨＯ細胞を他のイオンチャンネルに用いられた方法で安定的にトランスフェクトさせた（Claudio,Meth.Enzymol.207,391-408(1992)）。トランスフェクションはａ）電気生理学的記録およびｂ）放射性リガンド結合により確認した。ＡＴＰおよび他の作動剤（３０μＭ以内）は安定的にトランスフェクトされた１４ＣＨＯ細胞中１４例で急激に脱感作する内部電流を起こし、４５非トランスフェクト細胞中４５例で効果を有しなかった。〔³Ｈ〕α，β‐メチレンＡＴＰ結合は百万トランスフェクト細胞当たり６００ｃｐｍ以上であり、非特異的結合は８０ｃｐｍ以下であった。ＨＥＫ２９３細胞の安定的トランスフェクションも行った。これは電気生理学的記録により確認した。（ii）ヒトＰ_2XレセプターヒトＰ_2Xレセプターの例で用いられた物質および方法は以下に記載されている：インビトロ翻訳インビトロカップリング転写／翻訳はイヌ膵臓ミクロソーム膜(Promega)２μｌと共にまたはそれなしでPromega's ＴＮＴカップリング網状赤血球溶解系を用いて行った。μｇ Circular ｐＢＫＣＭＶ‐ｈＰ_2X（０．５μ ｇ）を３０℃で２時間２５μｌ反応液中においてシステムマニュアルで記載されたようにＴ３ＲＮＡポリメラーゼで転写させた。合成タンパク質（５μｌ）をＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。ＨＬ６０細胞の分化ＨＬ６０細胞（ヒト前骨髄細胞ＡＴＣＣＣＣＬ２４０）を２５ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Glutamax IIおよび１０％熱不活化牛胎児血清(GIBCO BRL)で補充されたＲＰＭＩ‐１６４０中において１週間で２回継代させた。各実験毎に、３３×１０⁶細胞を指定時間にわたりホルボールミステートアセテート（１００ｎＭ）、１．１％ＤＭＳＯまたはジブチリルｃＡＭＰ（２００μＭ）(SIGMA)のいずれかを含有した培地に２．５×１０⁵細胞／mlで再懸濁させた。ノーザンブロット分析ポリＡ⁺ＲＮＡはClontech Laboratories Inc.(Palo Alto)から得たが、但し膀胱およびＨＬ６０ｍＲＮＡは記載どおりに作製した（V alera et al(1994)‐前掲）。サンプルは２６０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定して、メチレンブルーで膜を染色することにより定量した。ＲＮＡを１％アガロース‐６％ホルムアルデヒドゲルで分別し、非荷電ナイロン膜（ＢＤＨ）にエレクトロブロットした。６８℃のプレハイブリッド形成をハイブリッド形成緩衝液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％阻止緩衝液（Boehringer Mannheim）、０．１％ラウロリルサルコシン、０．０２％ＳＤＳ）中で６時間かけて行った。ハイブリッド形成には、全ｈＰ_2X配列に対応するジゴキシゲニン‐ＵＴＰ標識リボプローブ（１００ ng/ml）と共に新鮮ハイブリッド形成緩衝液中６８℃で一夜かけた。膜を６８℃において２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで２回、および０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。ハイブリッド形成の化学発光検出を下記のように室温で行った：膜を緩衝液Ｂ１（０．１Ｍマレイン酸、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で５分間すすぎ、１％阻止緩衝液（Ｂ２）中で１時間飽和させ、Ｂ２で１：１５０００希釈された複合化抗ジゴキシゲニン抗体アルカリホスファターゼ（７５０ｕ／ml、Boehringer Mannheim）と共に３０分間インキュベートし、Ｂ１＋０．３％ツイーン２０で洗浄し（１×５分間、１×１５分間、１ ×１ｈ）、緩衝液Ｂ３（０．１Ｍ Tris ＨＣｌｐＨ９．５、０．１ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ₂）で５分間平衡化し、Ｂ３で１：１００希釈されたルミゲンＰＰＤ(Boehringer Mannheim)で４５〜６０秒間インキュベートした。湿った膜をプラスチックバッグに密封し、３７℃で１５分間インキュベートし、Hyperfilm-ECL（Amersham）に１５〜２０分間露出させた。卵母細胞中へのＰ_2X発現ｐＢＫＣＭＶ発現ベクター中にサブクローニングされたヒト膀胱Ｐ_2XｃＤＮＡをＮｏｔＩで直鎖化し、キャップアナログｍ７Ｇ（５ ′）ｐｐｐ（５′）Ｇの存在下においてＴ３ポリメラーゼでインビトロ転写した。デフォリキュレート化Xenopus 卵母細胞（Bertrand et al,Electrophysiology of neuronal nicotinic acetylcholine receptors expressed in Xenopus oocy tes following nuclear injection of genes or cDNAs,Meth.Neurosci.4:174-19 3(1991)）をヒトＰ_2Xインビトロ転写ＲＮＡ５０ｎｇで注入し、ＮＤ９６溶液（ｍＭ）：ＮａＣｌ９６、ＫＣｌ２、ＭｇＣｌ₂ １、ＣａＣｌ₂ ２、ピルビン酸ナトリウム５、ＨＥＰＥＳ５ｐＨ７．６‐７．５、ペニシリン（１０Ｕ／ml）およびストレプトマイシン（１０μg/ml）中１８℃で２〜６日間インキュベートした。電気生理学卵母細胞を１ｍｌチャンバーに入れ、２ｍＭＣａＣｌ₂の代わりに０．１ｍＭＢａＣｌ₂を含有したＮＤ９６溶液を２〜３ml/minで注いで、内在カルシウム活性化クロリド電流の活性化を防いだ（Barish,A transient cal sium-dependent chloride current in the immature Xenopus oocytes,J.Physio l.342:309-325(1983)）。電流は−６０ｍＶの保持ポテンシャルで２電極電圧クランプ増幅器（Geneclamp Axon Instruments）を用いて測定した。マイクロ電極は３ＭＫＣｌで満たした（０．５〜２ＭΩ）。データはPClampソフトウエア（ Axon Instruments）を用いて集めた。ＡＴＰおよび他のプリノセプター作動剤を卵母細胞近く（２００〜５００μｍ）に置かれたＵチューブ灌流系（Fenwick et al,A patch clamp study of bovine chromaffin cells and their sensitivity to acetylcholine,J.Physiol.331:577-597(1982)）により適用した。初期研究では、ＡＴＰが（１ｍＭ以内の濃度で）１０分毎に５ｓでｈＰ_2X注入卵母細胞に適用されたときに、再現性のある応答（ピーク振幅で＜１０％偏差）が得られることを示した。ＡＴＰおよびそのアナログに対する濃度応答関係は、１０分間隔で適用された作動剤の５ｓ適用に対する応答のピーク振幅を測定することにより調べた。作動剤に対する応答は１００μＭＡＴＰで誘発されたピーク応答に対して各卵母細胞で標準化したが、１００μＭＡＴＰは応答の衰退があるかどうかを調べるために実験の最初および最後に通常適用した。内部電流は、用いられた最大濃度でプリノセプター作動剤の適用に応答する未注入卵母細胞で記録しなかった（各作動剤についてｎ＝３）。拮抗剤は注液中と、ＡＴＰと一緒にＵチューブ溶液中で適用した。拮抗剤はＡＴＰの適用前に５〜１０分間で注いだ。データ分析プリノセプター作動剤に関する濃度応答曲線は１のHillスロープと合った。等有効濃度、即ち１００μＭＡＴＰに対する応答の５０％を示す作動剤の濃度（ＥＥＣ₅₀）を、個別の濃度応答曲線から調べた。拮抗剤の場合には、１０μＭＡＴＰに対する応答（ＡＴＰに対するピーク応答の約９０％）の５０％阻害を示す上で要求される濃度（ＩＣ₅₀）を調べた。データは所定数の卵母細胞で平均±ＳＥＭとしてずっと提示されている。薬物アデノシン、アデノシン５′‐一リン酸ナトリウム塩（ＡＭＰ）、アデノシン５′‐二リン酸ナトリウム塩（ＡＤＰ）、アデノシン５′‐三リン酸マグネシウム塩（ＡＴＰ）、アデノシン５′‐Ｏ‐（３‐チオリン酸）四リチウム塩（ＡＴＰ‐γ‐Ｓ）、ウリジン５′‐三リン酸ナトリウム塩（ＵＴＰ）、α，β ‐メチレンＡＴＰリチウム塩（α，β‐ｍｅＡＴＰ）、β，γ‐メチレン‐Ｄ‐ ＡＴＰナトリウム塩（Ｄ‐β，γ‐ｍｅＡＴＰ）、２′，３′‐Ｏ‐（４‐ベンゾイルベンゾール）ＡＴＰテトラエチルアンモニウム塩（ＢｚＡＴＰ）、４，４′‐ジイソチオシアナトスチルベン‐２，２′‐ジスルホン酸二ナトリウム塩（ＤＩＤＳ）をSigma から得た。２‐メチルチオＡＴＰ四ナトリウム塩（２ＭｅＳＡＴＰ）、２‐クロロ‐ＡＴＰ四ナトリウム塩およびβ，γ‐メチレン‐１‐ ＡＴＰ（１‐β，γ‐ｍｅＡＴＰ）をＲＢ１から得た。ピリドキサール５‐リン酸一水和物(Aldrich)、ｐ１，ｐ５‐ジ〔アデノシン‐５′〕五リン酸三リチウム塩（ＡＰ５Ａ）（Boehringer Mannheim）、ピリドキサールリン酸６‐アゾフェニル‐２′，４′‐ジスルホン酸（ＰＰＡＤＳ、G.Lambrecht,University of Frankfurt から入手）およびスラミン(Bayer)を試験した。薬物をストック溶液の凍結させた一部分から調製し、必要最終濃度にするよう希釈した。例６膀胱からのｈＰ_2Xの配列および特徴付けヒトＰ_2XｃＤＮＡの単離ヒト膀胱組織を膀胱腫瘍の切除から得た。患者は膀胱不安定または尿力学的異常の症状を示さなかった。肉眼的に正常にみえる（Pa lea et al.‐前掲）腫瘍周辺の部分だけを用いた。全ＲＮＡをグアニジニウムイソチオシアネートにより単離し、ポリＡ⁺ＲＮＡを記載どおりに精製した（Valer a et al.(1994)‐前掲）。λｇｔ１０でｃＤＮＡライブラリーの作製、ラット平滑筋Ｐ_2Xプローブのランダムプライマー標識（Valera et al.(1994)‐前掲）、低ストリンジェンシーハイブリッド形成スクリーニングおよびラムダファージＤＮＡ単離はすべて標準プロトコールにより行った（Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd edn.,Cold Spring Harbor Laboratory Press ,New York(1989)）。いくつかの独立ファージ単離物を試験し、１つからのｃＤＮＡインサートをＥｃｏＲＩ‐ＮｏｔＩ切断ｐＢＫＣＭＶ中へのサブクローニングのために選択した。この２６７７ｂｐｈＰ_2XｃＤＮＡを記載どおりに配列決定した（Valera et al.(1994)‐前掲）。２６７７ｂｐｃＤＮＡ、ｈＰ_2Xは、３９９アミノ酸のタンパク質に対応する単一の長いオープンリーディングフレームを含んでいた（図４）。このアミノ酸配列はラット精管から単離されたＰ_2Xレセプターの場合と高度に相同的である（８９％相同性）。膜を横断するほど十分に長いタンパク質のいずれかの末端近くには疎水性の２領域があるが、疎水性Ｎ末端リーダー配列はない。グルコシル化のために可能な５つすべての部位と、タンパク質の中央セクションにある１０すべてのシステイン残基は保存されている。ミクロソームの存在下におけるｈＰ_2X ＲＮＡのインビトロ翻訳では６０ｋＤ産物を産生したが、ミクロソームの不在下における翻訳では４５ｋＤペプチドを産生した（図６）。４５ｋＤは計算分子量であり、付加１５ｋＤがグルコシル化に起因することを示している。一部のヒト膀胱Ｐ_2XｃＤＮＡは、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトさせるために用いた。安定なトランスフェクションが電気生理学的記録により確認された。例７ヒト膀胱Ｐ_2XｍＲＮＡの分布ヒト膀胱Ｐ_2XｍＲＮＡの分布をノーザン分析により調べた。単一の２．６ｋｂｍＲＮＡ種を膀胱、胎盤、肝臓および副腎で観察した（図８）。胸腺、脾臓および肺臓サンプルでは、２．６ｋｂバンドと、３．６および４．２ｋｂの付加高分子量ＲＮＡがみられた。１．８ｋｂの小さな付加ＲＮＡ種は脾臓および肺臓で観察された。ハイブリッド形成は脳ｍＲＮＡについて検出されなかった。例８ＨＬ６０細胞におけるｈＰ_2XｍＲＮＡの誘導３′‐未翻訳領域の一部分は、ヒト前骨髄細胞系ＨＬ６０の分化のための発現配列タグとしてデーベース（ＨＳＧＳ０１７０１）に既に蓄積されていた（Okub o,未発表）。我々はノーザンブロット分析によりＨＬ６０細胞でｈＰ_2XｍＲＮＡの誘導について試験した（図７）。ＨＬ６０細胞は誘導剤に応じて別な系統系譜に分化させることができる（Koeffler,Induction of Differentiation of Human Acute Myelogenous Leukemia Cells: Therapeutic Implications,Blood, 62:709-721(1983)）。ホルボールジエステルによるマクロファージ様特徴、あるいはＤＭＳＯまたはジブチリルｃＡＭＰによる顆粒球分化の誘導は各々Ｐ_2XｍＲＮＡの増加を起こさせ（図７、レーン６）、ＨＬ６０ＲＮＡ（レーン１〜５）は２バンド（１．８および２．６ｋｂ）のハイブリッド形成を示し、これら双方が誘導性であった。これは膀胱と対照的であり、ノーザン分析では単一のＲＮＡ種（２．６ｋｂ）のみを示した（図７、レーン６）。例９ｈＰ_2Xの薬理学的特徴ｈＰ_2XレセプターＲＮＡで注入された卵母細胞へのＡＴＰ（３０ｎＭ〜１ｍＭ）の適用では内部電流を誘発させた（図９、１０および１１）。低濃度のＡＴＰ（３０〜３００ｎＭ）に対する応答が３〜５ｓにわたり発生した。高濃度のＡＴＰ（１μＭ）では、１〜１．５ｓ以内でピークに達して、その後ＡＴＰの継続適用中に減衰する応答を誘発した（５ｓ後にピーク増幅の４０〜６０％）。電流はＡＴＰの洗浄除去でコントロール値に戻った。ＡＴＰにより誘発された内部電流のピーク増幅は濃度依存性であり（図９、１０および１１）、０．８２μＭのＥＣ₅₀でHillスロープ１の曲線と合った。ＡＴＰ（１００μＭ）が１０分毎に５ｓで適用されたときは、再現性のある内部電流が記録された。これはラット精管からのＰ_2Xレセプタークローンの応答と対照的であり、そこでは１回目の１０分間後に適用されたＡＴＰ（＞１μＭ）の２回目適用により初期ピーク増幅の〜５０％である内部電流を誘発させた。濃度応答曲線を他のいつくかのＰ２‐プリノセプター作動剤について作成した（図９、１０および１１）。２ｍｅＳＡＴＰ、２‐クロロ‐ＡＴＰ、α，β‐ｍｅＡＴＰおよびＡＤＰは完全作動剤であった。ＢｚＡＴＰ、ＡＰ₅ＡおよびＡＴＰ‐γ‐Ｓは最大ＡＴＰ応答の約６５％の最大応答を生じた。ｄおよびｌ‐β， γ‐ｍｅＡＴＰに対する最大応答は調べなかった。アデノシン、ＡＭＰおよびＵＴＰ（１００μＭ）は小さな内部電流を誘発させた（各々１００μＭＡＴＰに対する応答の２．３±１．５、６．０８±２および３．７±１．８％）。プリノセプターアナログのＥＥＣ₅₀値および相対的効力は下記表１にまとめられている。ＥＥＣ₅₀：１００μＭＡＴＰに対するピーク応答の５０％に相当する内部電流を生じる等有効濃度。Hillスロープ１の個別に適合された濃度応答曲線からみたＥＥＣ₅₀。全実験の平均データからのＡＴＰに関するＥＥＣ₅₀（ｎ＝３〜４）例１０拮抗剤研究Ｐ２‐プリノセプター拮抗剤スラミン（１〜１００μＭ）は、ＡＴＰに関する濃度応答曲線を右にシフトさせた。１μＭスラミンのとき、シフトはほとんど平行であった。Ｋ_B＝１／（ＤＲ−１）（ＤＲは用量比率である）から評価された解離平衡定数（Ｋ_B）は１３０ｎＭであった。高濃度のスラミンになると、阻害は競合的でないようだった。本実験条件下において、このＫ_B評価はスラミンについて以前に報告された場合よりも高い（ｐＡ２５．９、Trezise et al,Br,J .Pharmacol.112:282-288(1994);ｐＫ_B５．２、von Kugelgen et al,Interaction of adenine nucleotides,UTP and suramin in mouse vas deferens: suramin -sensitive and suramin-insensitive components in the contractile effect of ATP,Naunyn Schmiedeberg's Arch.Pharmacol.342:198-205(1990)）。スラミンによる拮抗作用は１０分間洗浄後に完全に逆転されて、高濃度での非競合的拮抗作用がレセプターへの拮抗剤の不可逆的結合によるものではないことを示している。推定Ｐ_2Xプリノセプター拮抗剤ＰＰＡＤＳ、ＤＩＤＳおよびピリドキサール５ ‐リン酸（Ziganshin et al,Selective antagonism by PPADS at P_2X purinocep tors in rabbit isolated blood vessels,Br,J.Pharmacol.111:923-929(1994)； Bultmann & starke,Blockade by 4,4'-diisothiocyanatostilben-2,2'-disulpho nate(DIDS)of P_2X purinoceptors in rat vas deferens,Br,J.Pharmacol.112:69 0-694(1994)；Trezise et al,Eur,J.Pharmacol.259:295-300(1994)）は、濃度依存的に１０μＭＡＴＰ（約ＥＣ₉₀濃度）により誘発された内部電流を阻害した（図１２および１３）。スラミン、ＰＰＡＤＳおよびＤＩＤＳはＡＴＰ誘発電流を阻害する上で等しく有効であった（ＩＣ₅₀〜１μＭ）。Ｐ５Ｐに関するＩＣ₅₀ は〜２０μＭであった。ＰＰＡＤＳおよびＰ５Ｐ拮抗作用は洗浄除去で容易な可逆性であった。対照的に、ＤＩＤＳ（１００μＭ）の阻害効果は洗浄除去で逆転するのが非常に遅い。(iii) ラット上頸神経節Ｐ_2Xレセプター例１１ラット上頸神経節からのＰ_2XレセプターをコードするｃＤＮＡ（クローン３）の単離および機能的発現４４０ｂｐ断片を、ラット精管Ｐ_2XレセプターｃＤＮＡ内にある保存ヌクレオチド配列およびＰＣ１２ｃＤＮＡの配列に基づく縮重プライマーを用いて、ラット精巣ｃＤＮＡからポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させた（Ehrlic h,H.A.(ed.),PCR Technology,MacMillan,Basingstoke(1989)）。用いられたプライマーは以下で示されている：センス５′ ＴＧＴ／ＣＧＡＡ／ＧＡ／ＧＴＩＴＴ／ＣＩＧＧ／ＣＩＴＧＧＴＧＴ／ＣＣＣ３′（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）アンチセンス５′ ＧＣＡ／ＧＡＡＴ／ＣＣＴＡ／ＧＡＡＡ／ＧＴＴＡ／ＧＴ／ＡＡＩＣＣ３′（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）〔上記において、Ｉ＝イノシンであり、“Ｔ／Ｃ”はＴまたはＣのどちらかが提示された位置に存在することを示している（これは、必要な変更を加えて、提示された他の代替例にもあてはまる）〕クローン化ＰＣＲ断片を標識して、λＺＡＰでラット精巣ｃＤＮＡバンクをスクリーニングするためのハイブロッド形成プローブとして用いた。１つの組換えファージは陽性であり、そのインサートを切り出し、プラスミド（＃４３２）に移した。このｃＤＮＡは単一のＥｃｏＲＩ部位（１０００位、なおオープンリーディングフレームにも存在する）を有する１５００ｂｐであった。ｃＤＮＡの５ ′末端は短すぎて、全Ｎ末端をコードできなかった。新たな配列に特異的な内部プライマーを作り、組織分布をＰＣＲにより試験した。候補は褐色細胞腫（ＰＣ１２）細胞、腸および上頸神経節（ｓｃｇ）から作製されたｍＲＮＡに存在していた。したがって、ハイブロッド形成プローブはλ ｇｔ１０でラットｓｃｇｃＤＮＡバンクをスクリーニングするために用いた。３０の初期陽性から２０の純粋ファージＤＮＡストックを作製したが、１９は候補配列の様々な部分であり、１つからのインサートはプラスミド（ｐ４５７）に移して、配列決定した。そのインサートは全長ｃＤＮＡのようであったが、それは３８８アミノ酸の単一オープンリーディングフレームを有している（図２）。ｐ４５７からのインサートをｐｃＤＮＡ３（ｐ４６４）中にサブクローニングして、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞をトランスフェクトさせるために用いた。図２で示されたクローン（ここではクローン３と称される）の機能的特徴付けは、ラット精管Ｐ_2Xレセプターについて例４で記載されたように、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞とインビトロ転写ＲＮＡで注入された卵母細胞からの電気的記録により行った。表Ａはラット精管／ヒト膀胱ｃＤＮＡクローンおよびＰＣ１２ｃＤＮＡクローン（San Francisco にある the University of Calif ornia のDavid Fulius and Tony Brake）の場合と比較したクローン３の主な性質についてまとめている。クローン３の主な機能的性質は以下のとおりである。（ａ）ＡＴＰにより誘発された電流は数秒の適用中にほとんどまたは全く減衰を示さず、即ちほとんど脱感作がない（図１４）。（ｂ）ナトリウム、カリウム、セシウム、テトラエチルアンモニウムおよびカルシウムに対するイオン孔の相対的透過性は、ラット精管／ヒト膀胱またはＰＣ１２形のレセプターについて観察された場合と異ならない。（ｃ）細胞外カルシウム（３０ｍＭ）はＰＣ１２形のＰ_2Xレセプターチャンネルを通る内部電流を阻害し、ラット精管／ヒト膀胱形による電流を阻止せず、クローン３は感受性の点で中間である。（ｄ）ＡＴＰと構造的に関連した作動剤の有効性はＰＣ１２形でみられる場合と同様であり、最も注目すべきことにα，β‐メチレンＡＴＰは作動剤作用をほとんどまたは全く有していない（図１４）。（ｅ）クローン３レセプターでＡＴＰにより活性化される電流は、他の２つの形（ラット精管／ヒト膀胱；ＰＣ１２）により媒介される同様の電流の場合よりも、スラミン、ピリドキサール５′‐リン酸およびピリドキサールリン酸‐６‐アゾフェニル‐２′，４′‐ジスルホン酸（ＰＰＡＤＳ）による拮抗作用に対してかなり低感受性であった（図１５）。（iv）ラット後根神経節Ｐ_2Xレセプター例１２ラット後根神経節からのＰ_2XレセプターをコードするｃＤＮＡの単離例１１に用いたのと同様のプライマーと共にＰＣＲを用いて、但し異なるｃＤＮＡ源を用いることにより、更にＰ_2Xファミリーメンバーを見い出すことができる。この方法を用いて、ラット後根神経節Ｐ_2XレセプターｃＤＮＡを単離した。図１Ｂは、推定アミノ酸配列と一緒に、（ここではクローン６と称される）このクローンのｃＤＮＡ配列を示している。この図における下線部分は初めに用いられたＰＣＲプライマーに対応する。例１１に記載された場合に類似した操作を、全長ｃＤＮＡを単離するために用いた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 21/08 9455−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 9455−4ＣＮ 9735−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バエル，ゲーリーナッタースイス国プラン−レ−ズアト、シュマン、デ、ゾル、14 グラクソ、インスティチュート、フォー、モレキュラー、バイオロジー内

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）図１、図２、図３または図４で示されたアミノ配列を有するか、または（ｂ）図１、図２、図３または図４で示された配列と実質的に相同的であるＰ_2X レセプターをコードする組換えまたは単離ＤＮＡ分子、あるいは図１に示されたヌクレオチド１〜８１３、図２および３に示された全ヌクレオチド配列、または図４に示されたヌクレオチド１〜１７４４から取り出される少くとも１５のヌクレオチドを含むこのようなＤＮＡ分子の断片。２．（ａ）図１または図４で示されたアミノ配列を有するか、または（ｂ）図１または図４で示された配列と実質的に相同的であるＰ_2Xレセプターをコードする組換えまたは単離ＤＮＡ分子、あるいは図１に示されたヌクレオチド１〜８１３、または図４に示されたヌクレオチド１〜７７７から取り出される少くとも１５のヌクレオチドを含むこのようなＤＮＡ分子の断片。３．（ａ）図１に示されたアミノ配列を有するか、または（ｂ）図１に示された配列と実質的に相同的であるＰ_2Xレセプターをコードする組換えまたは単離ＤＮＡ分子、あるいは図１に示されたヌクレオチド１〜８１３から取り出される少くとも１５のヌクレオチドを含むこのようなＤＮＡ分子の断片。４．ヒトＰ_2Xレセプターをコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。５．ｃＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。６．ベクターの形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。７．請求項６に記載されたベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。８．Ｐ_2Xレセプターを発現する安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。９．天然でアソシエートされるタンパク質を含んでいない、Ｐ_2Xレセプターの調製物。１０．Ｐ_2Yレセプターを含んでいない、Ｐ_2Xレセプターの調製物。１１．組換えＤＮＡ技術により作製されたＰ_2Xレセプター。１２． Owens et al.（前掲）に開示されたＲＰ‐２ポリペプチドと免疫上非交差反応性であるエピトープを含む、Ｐ_2Xレセプターのペプチド断片。１３． Owens et al.（前掲）に開示されたＲＰ‐２ポリペプチドと免疫上非交差反応性であるＰ_2Xレセプターのエピトープに特異的である抗体。１４．モノクローナル抗体である、請求項１３に記載の抗体。１５．請求項１４に記載の抗体を発現する細胞。１６．ヒトまたは非ヒト動物疾患または症状の治療または予防に有用な化合物のスクリーンとしての、請求項７、８または９に記載のＰ_2Xレセプターまたはその調製物の使用。１７．Ｐ_2X作動剤またはＰ_2X拮抗剤を特定するためのスクリーンとしての、請求項９、１０または１１に記載のＰ_2Xレセプターまたはその調製物の使用。１８．請求項１７に記載のスクリーンにより特定されたＰ_2X作動剤またはＰ_2X 拮抗剤。１９．分子が化学合成によりまたは組換えＤＮＡ技術を用いることにより得られる、請求項１に記載のＤＮＡ分子を得る方法。２０．請求項８に記載の宿主細胞を用いてＰ_2Xレセプターを発現させ、場合によりＰ_2Xレセプターを精製することからなる、Ｐ_2Xレセプターを得る方法。２１．添付例を参考にして実質上前記されたような、ＤＮＡ分子、Ｐ_2Xレセプター、Ｐ_2X作動剤またはＰ_2X拮抗剤、方法あるいは使用。