ES2255152T3

ES2255152T3 - Composiciones y metodo de proteinas de activacion sinaptica.

Info

Publication number: ES2255152T3
Application number: ES98909181T
Authority: ES
Inventors: Paul F. Worley; Paul R. Brakeman
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1997-03-14
Filing date: 1998-03-13
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2018-03-13
Also published as: EP0970119A4; EP0970119B1; US20040229274A1; US7399830B2; AU6702698A; JP4127861B2; US20030027147A1; AU733575B2; WO1998040407A1; EP0970119B9; CA2287591A1; DE69832156T2; US6780600B2; JP2001517217A; US6294355B1; ATE308564T1; DE69832156D1; EP0970119A1

Abstract

Se describen secuencias de codificación de nucleótidos y secuencias de polipéptidos para proteínas de unión de activación sin ptica, que se caracterizan por la inducción del sistema nervioso central después de la actividad neuronal en hipocampo de rata. Dichas proteínas se identifican por (i) una homología sustancial a nivel de secuencia de nucleótido o proteína con secuencias de codificación o proteínas específicamente definidas en rata, humano o ratón, (ii) la capacidad de unirse y afectar a la actividad de proteínas efectoras del SNC, tales como los receptores de glutamato metabotrópico, (iii) la especificidad de unión de una secuencia de unión particular, y (iv) la presencia en la secuencia de un dominio de tipo PDZ. Los nucleótidos y polipéptidos de la invención son útiles en ensayos de cribado y diagnóstico.

Description

Composiciones y método de proteínas de activación sináptica.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una nueva familia de proteínas activadas sinápticamente, y en particular, una proteína que se une específicamente y altera la función de los receptores de metabotrópicos glutamato.

Referencias

Ausubel, F.M., et al., en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, Inc., Media PA (1992).

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Antecedentes de la invención

La localización espacial y el agrupamiento de proteínas de membrana son críticos para el desarrollo neuronal y la plasticidad sináptica. Las proteínas que interactúan con las proteínas de la membrana celular, según se cree, afectan a la distribución espacial de tales proteínas de membrana. Estas interacciones pueden ser importantes en la regulación de la(s) función(ones) de las proteínas de membrana, tales como los receptores de neurotransmisores, que controlan la actividad sináptica en el sistema nervioso central.

La presente invención se refiere al descubrimiento de una nueva familia de proteínas que son ricas en el sistema nervioso central de mamíferos y que interactúan con las proteínas implicadas en la función sináptica.

Estas proteínas están implicadas en la función sináptica, como se prueba por su inducción por la activación neuronal, tales como convulsiones, estimulación, intoxicación aguda de cocaína, trauma y otros similares. Estas proteínas son llamadas en conjunto "proteínas de activación sináptica".

Una nueva proteína dendrítica, llamada "Homer", ejemplifica la presente invención. Esta proteína contiene un solo dominio de unión del tipo PDZ y se une específicamente al extremo C de los receptores metabotrópicos de glutamato. Los receptores metabotrópicos de glutamato liberan calcio intracelular a la fosfolipasa C, que cataliza la hidrólisis de los fosfoinositidos de membrana. Sin embargo, a diferencia de las que contienen un dominio del tipo PDZ, la proteína Homer por otra parte no se parece a las conocidas proteínas PDZ y tiene una identidad de secuencia de menos del 10% con la proteína PDZ más parecida. Además, la proteína Homer está regulada como un gen de actividad inmediata. Este control dinámico transcripcional sugiere que Homer media un nuevo mecanismo celular que regula la señalización del glutamato metabotrópico.

Las propiedades señaladas para la proteína Homer caracterizan a una nueva familia de proteínas, proteínas de activación sináptica, que forman la base para la presente invención. Como estas proteínas están implicadas en la función sináptica, tienen utilidades particulares, por ejemplo, en los ensayos de rastreo para los fármacos que afectan a la función sináptica y que son, por lo tanto, activos centralmente, como se describe más abajo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una nueva familia de proteínas que están presentes en el sistema nervioso central de mamíferos. Estas proteínas se caracterizan particularmente por (i) su mayor expresión en tejidos del sistema nervioso central en mamíferos en respuesta a la activación sináptica, y (ii) un nuevo dominio de unión del tipo PDZ.

La nueva familia de proteínas se ilustra por una proteína de rata, llamada "Homer" (SEQ ID NO: 2). Otros miembros de la familia tienen una secuencia que es sustancialmente idéntica (80% o mayor identidad de secuencia) a la de la proteína de rata, o a los miembros humanos y los de ratón de la familia. Los miembros de la familia pueden identificarse por una hibridaciónmoderada, PCR un cebador degenerado, u otros métodos que detecten secuencias de nucleótido o aminoácidos que son al menos en un 80% idénticas a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, respectivamente.

Las proteínas de la invención son particularmente útiles para uso en ensayos de rastreo para fármacos centralmente activos. Las proteínas son también componentes útiles de ensayos diagnósticos para medir la inducción de la activación sináptica, como puede ocurrir en respuesta a múltiples estímulos que causan la activación sináptica. Asimismo los fragmentos de péptidos de tales proteínas, particularmente los fragmentos peptídicos derivados del sitio de unión entre tales proteínas y sus parejas de unión del efector sináptico, tienen utilidad como inhibidores a largo plazo como consecuencia de su activación sináptica anormal.

En una realización relacionada, la invención incluye polipéptidos como los descritos anteriormente, pero que además exhiben una capacidad de unirse selectivamente a una proteína de membrana sináptica que tiene una región peptídica del extremo C seleccionada del grupo que consiste en SSSL y SSTL.

En un aspecto relacionado, la invención también incluye secuencias de nucleótidos que codifican para los miembros de la nueva familia de la proteína descrita en este documento. En consecuencia, las secuencias de nucleótidos que tienen una identidad sustancial a la proteína Homer descrita que codifica secuencias (tales como SEQ ID NO: 1), así como las propias secuencias descritas, también están incluidas dentro de la invención.

También forma parte de la invención vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos descritas anteriormente. Tales vectores son útiles, por ejemplo, en la producción de las proteínas reivindicadas por técnicas recombinantes.

En un aspecto relacionado, la invención también incluye un método para seleccionar un compuesto que interfiere con la unión de una proteína de activación sináptica en una proteína de unión celular en el sistema nervioso central de mamíferos. El método incluye añadir de un compuesto de ensayo a una mezcla de reacción que contiene (i) una proteína de activación sináptica aislada que tiene una identidad sustancial frente a uno o varios polipéptidos que tienen una identidad de secuencia sustancial para el polipéptido que tiene una secuencia presentada como SEQ ID NO: 2, (ii) una proteína de unión aislada a la cual la proteína de activación sináptica se une, y (iii) medios para detectar la unión entre la proteína de activación sináptica y dicha proteína de unión. La unión de la proteína de unión a la proteína de activación sináptica se mide en presencia de un compuesto de ensayo y se compara con la unión medida en ausencia del compuesto de ensayo. Un compuesto de ensayo se selecciona para uso como fármaco en el centro activo si tal comparación revela una diferencia sustancial en la unión en estas condiciones.

En una realización particular, la proteína de unión en el método de ensayo es un polipéptido del receptor metabotrópico de glutamato que incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SSSL y SSTL. En otra realización particular, la proteína de unión es un mGluR unido a fosfoinositidasa C. En otra realización más, mGluR se expresa en células, y la unión entre el receptor y la proteína de unión se mide midiendo la actividad de fosfoinositidasa C en células.

Estos y otros objetos y propiedades de la invención se harán evidentes más totalmente cuando la siguiente descripción detallada de la invención sea leída junto con los dibujos que la acompañan.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la secuencia de codificación de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) de una proteína de activación sináptica derivada de rata (SEQ ID NO: 1);

La figura 2 muestra la secuencia amino deducida de rata ("Homer"; SEQ ID NO: 2), y compara las secuencias de aminoácidos derivadas de los EST de proteínas de activación sináptica en humanos (SEQ ID NO: 3) y en ratón (SEQ ID NO: 4);

La figura 3 muestra una imagen generada por ordenador de una transferencia Northern de ARN total (10 \mug) a partir de cerebro de rata (hipocampo, corteza) y otros órganos indicados, mostrando una inducción rápida y transitoria por convulsiones de la proteína de unión de mGluR de 6,5 kb (aprox.) en el hipocampo y la corteza;

La figura 4 muestra una imagen generada por ordenador de un inmunoensayo de las proteínas de unión de cadena entera expresadas en células HEK-293 como una proteína de 28 kDa (banda "Homer") y como un doblete de 28/29 kDa en el hipocampo de ratas estimuladas por convulsiones, como se indica por la flecha;

La figura 5 muestra una imagen generada por ordenador de un inmunoensayo de mGluR5 (banda de 140 kDa) expresada en células HEK-293 (ruta 2) comparado con células transfectadas con el vector solo (banda 1), de fracciones de elución de una columna de afinidad GST (banda 4), y las fracciones de elución de una columna de afinidad de GST-Homer (banda 5), en el que ambas columnas fueron cargadas con extractos del hipocampo (banda 3), ilustrando que la proteína Homer eluida se une a mGluR5;

La figura 6 muestra una imagen generada por ordenador de un inmunoensayo que muestra la inmunoprecipitación de mGluR5 a partir de extracto de hipocampo (banda 1) por suero preinmune (banda 2) antisuero de proteína antiHomer (banda 3), y suero antiHomer preabsorbido (banda 4), ilustrando que la proteína Homer y mGluR5 interactúan in vivo;

Las figuras 7A y 7B muestran las imágenes generadas por ordenador de inmunotinción de tejido de corteza parietal de rata usando antisuero antiHomer (7A) y antisuero anti-mGluR5 (7B) en una amplificación 100 x;

Las figuras 7C-7F muestran la inmunoreactividad de la proteína Homer en la corteza de ratas adultas detectada por el control del método de la peroxidasa (C) y 4 horas después de una convulsión (D), en el que la convulsión induce la inmunotinción y se enriquece en las neuronas piramidales de las capas II/III y V (amp. 100x); (E) ilustrando que la inmunoreactividad está presente a lo largo de los ejes dendríticos (flechas) y en cuerpos celulares, pero no en el núcleo (cabeza de flecha; amp. 600 x); las dendritas distales poseen perfiles del tipo espina (F, amp. 1000x);

Las figuras 8A y 8B muestran una doble localización inmunofluorescente del receptor de glutamato del tipo AMPA, GluR1 y Homer en neuronas de cultivo primario del hipocampo (amp. 600x); en el que las flechas indican el modelo de puntos de tinción Homer que se colocaliza extensivamente con GluR1, demostrando que la proteína Homer dirige la sinápsis estimulante;

Las figuras 9 (A-E) muestran los diez aminoácidos del extremo C de los receptores metabotrópicos de glutamato mGluR1\alpha (9A), mGluR2 (9B; SEQ ID NO: 6), mGluR3 (9C; SEQ ID NO: 7), mGluR4 (9D; SEQ ID NO: 8), y mGluR5 (9E; SEQ ID NO: 9);

Las figuras 10A-10D muestran las imágenes generadas por ordenador de un inmunoensayo de unión in vitro por la proteína Homer de receptores metabotrópicos de glutamato mGluR1 (10A), mGluR2 (10B), mGluR3 (10C), mGluR5 y mGluR5 truncado (10D) a la proteína Homer, demostrando la unión selectiva de la proteína Homer a mGluR1\alpha y mGluR5;

Las figuras 10E-10F muestran los resultados del inmunoensayo de ensayos de unión in vitro usados para examinar las estructuras de deleción de GST-Homer para unir el extremo C de mGluR5 myc-marcado (195 aa) expresado en células HEK-293, en el que los marcadores de banda indican la parte de Homer expresada, en el que el inmunoensayo mostrado en la figura 10E fue sometido a inmunoensayo para myc y demuestra la unión de mGluR5 a la cadena entera de Homer (1-186) y al fragmento 1-131, pero no al fragmento 109-186, y en el que la imagen mostrada en la figura 10F es tinción de Comassie de estrucuturas de deleción de Homer;

La figura 11 muestra una imagen generada por ordenador de un inmunoensayo Northern (10 \mug de ARN total) que muestra el aumento de mRNA de Homer post-parte en el cerebro anterior de rata;

Las figuras 12 (A-F) muestran las imágenes generadas por ordenador de secciones coronarias tomadas de crías de rata criadas en la oscuridad sacrificadas en la oscuridad (12B, 12C) o expuestas a un espacio de luz ambiental durante 30 de la misma edad envejecidas criadas en condiciones normales diurnas (12D, 12E) y sometidas a hibridación in situ con una sonda de ARN antisentido radiomarcada específica para la región no traducida 3' de Homer;

La figura 13 muestra una imagen generada por ordenador de un experimento de hibridación in situ que demuestra el efecto de una inyección uniocular de tetrodotoxina (TTX) en el ojo de las ratas antes del sacrificio;

La figura 14 muestra una imagen generada por ordenador que muestra un experimento de hibridación in situ que demuestra la inducción de mRNA de Homer en asociación con una potentiación a largo plazo (LTP), en el que la flecha indica la expresión inducida de ARN de Homer en células granulares del hipocampo después de un estímulo sináptico que produjo la LTP; y

La figura 15 muestra una imagen generada por ordenador que muestra un experimento de hibridación in situ que demuestra la inducción en el cuerpo estriado de Homer por la administración de cocaína (10 mg/kg) intraperitonealmente 2 horas antes del sacrificio.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

El término "polinucleótido" según se usa en este documento se refiere a una molécula polimérica que tiene una estructura que sustenta las bases capaces de formar puentes de hidrógeno con polinucleótidos típicos, en el que la estructura polimérica presenta las bases de una manera que permite tales puentes de hidrógeno de una manera de secuencia específica entre la molécula polimérica y un polinucleótido típico (por ejemplo, ADN monocatenario). Tales bases son típicamente inosina, adenosina, guanosina, citosina, uracilo y timidina. Las moléculas poliméricas incluyen ARN y ADN monocatenario y bicatenario, y sus modificaciones estructurales, por ejemplo, enlaces de metilfos-
fonato.

El término "vector" se refiere a una secuencia de nucleótidos que puede asimilar nuevos ácidos nucleicos, y propagar las nuevas secuencias en un huésped apropiado. Los vectores incluyen, pero no están limitados, a plásmidos recombinantes y virus. El vector (por ejemplo, el plásmido o el virus recombinante) que comprende el ácido nucleico de la invención puede estar en un vehículo, por ejemplo, un plásmido complejado con la proteína, un plásmido complejado con sistemas de transducción de ácidos nucleicos con base lipídica, u otros sistemas de vehículos no
virales.

El término "polipéptido" según se usa en este documento se refiere a un compuesto hecho de una sola cadena de residuos de aminoácidos unidos según enlaces peptídicos. El término "proteína" puede ser sinónimo del término "polipéptido" o puede referirse, además, a un complejo de dos o más polipéptidos.

Según se usa en este documento, las expresiones "homología sustancial" o "identidad sustancial", y sus declinaciones, se refiere a la concordancia de una secuencia de aminoácidos con otra secuencia de aminoácidos o de una secuencia de polinucleótidos con otra secuencia de polinucleótidos de al menos 70% o preferiblemente, al menos 80%, en el que tales secuencias se disponen en la alineación que mejor se ajuste. En el caso de secuencias de nucleótidos, los términos o las expresiones también implican que la secuencia de nucleótidos en cuestión es capaz de ser detectada en un ensayo de rastreo por una sonda de hibridación derivada de la secuencia de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 1 (secuencia de codificación de Homer) en condiciones de severidad moderadas. (Ausubel)

Una "alineación" se refiere a la disposición de dos o más aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos de tal modo que se alineen las áreas de las secuencias que comparten propiedades comunes. El grado de similitud u homología entre las secuencias es predicho computacionalmente o estadísticamente basado en los pesos asignados a los elementos alineados entre las secuencias.

El porcentaje (%) de identidad, en lo que concierne a dos secuencias de aminoácidos, se refiere al tanto por ciento de los residuos que son idénticos en las dos secuencias cuando las secuencias se alinean óptimamente. La alineación óptima se define como la alineación que da la puntuación de identidad en porcentaje más alta. Tales alineaciones pueden ser realizadas usando el programa "GENEWORKS". De forma alternativa, las alineaciones pueden ser realizadas usando el programa de alineación local LALIGN con un ktup de 1, parámetros estándar y PAM estándar. En el contexto de la presente invención, cuando se explicita que una proteína o ácido nucleico tiene una identidad del 80% de una secuencia dada, es implícito que esto se refiere a la secuencia entera de la más larga de las dos proteínas. Así, por ejemplo el producto de traducción deducido de un EST que es idéntico a la longitud de la secuencia completa de SEQ ID NO: 2 para la longitud del producto EST, pero donde el producto de EST es sólo el 25% de la longitud de la secuencia de la cadena entera, no se considera que cae dentro de una secuencia reivindicada definida teniendo el 80% o más identidad de secuencia de SEQ ID NO: 2.

La expresión el dominio de unión del "tipo PDZ" se refiere a una parte de un polipéptido que contiene una o varias repeticiones del aminoácido GLGF y, preferiblemente, un aminoácido básico precedente, tal como una arginina, preferiblemente, separada de GLGF por 1-10 residuos.

Según se usa en este documento, la expresión "receptor metabotrópico de glutamato" o "mGluR" se refiere a un sitio de unión del glutamato que se une funcionalmente a la adenilato ciclasa (AC) o fosfoinositidasa c (PI-PLC). Se han identificado al menos cinco receptores neuronales metabotrópicos de glutamato: MGluR1 y mGluR5 se unen a PLC; mGluR2 y mGluR4 regulan la actividad de AC.

Según se usa en este documento, la expresión "proteína de unión del receptor metabotrópico de glutamato" se refiere a un polipéptido que se une a uno o varios receptores metabotrópicos de glutamato, como se prueba por coinmunoprecipitación de la proteína de unión y mGluR por un anticuerpo Anti-mGluR, o por unión in vitro comparando con una proteína de control no relevante. Una afinidad de unión típica para esta interacción es de al menos aproximadamente 10^{-6} M.

La expresión "sistema nervioso central" (CNS) se refiere al cerebro y a la médula espinal, incluyendo el fluido cerebrospinal (CSF).

La expresión "variante de corte y empalme" se refiere a una proteína que se codifica por un gen común, pero que tiene una secuencia que se cambia debido al corte y empalme alternativo del mRNA antes de la traducción.

Un "marcador de secuencia expresada" o EST (siglas en inglés) es un segmento corto (típicamente 200-300 bp) derivado de una secuencia de cDNA, cuya secuencia es única, como se prueba por la capacidad de ser amplificada selectivamente usando cebadores específicos en una reacción en cadena de la polimerasa. Los EST generalmente no representan secuencias de cadena enteras.

Los residuos de aminoácidos se remiten en este documento por sus notaciones de letras estándar únicas: A, alanina; C, cisteína; D, ácido aspártico; E, ácido glutámico; F, fenilalanina; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptófano; X, hidroxiprolina; Y, tirosina.

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II. Aislamiento de proteínas de unión

Es un descubrimiento de la presente invención que la activación de la actividad sináptica estimulante en el cerebro causa una mayor expresión de una familia nueva de proteínas, denominadas en este documento "proteínas de activación sináptica", y que son ilustradas por una proteína de rata denominada en este documento "Homer". Junto con sus variantes de corte y empalme y sus homólogos de otras especies, esta proteína define la nueva familia de proteínas de activación sináptica que se unen y afectan a la actividad de cierto efectores fisiológicos (por ejemplo, receptores, canales iónicos, proteínas de transporte, enzimas) en el sistema nervioso central.

1. Aislamiento de secuencias que codifican nucleótidos para proteínas de activación sináptica

a. Identificación de la secuencia codificante. Por vía del ejemplo, la proteína de rata denominada en este documento la proteína Homer de rata fue identificada al principio por rastreo diferencial sobre la base de su rápida inducción de la expresión durante la actividad sináptica estimulante en el hipocampo y la corteza. Proteínas de activación sináptica adicionales pueden ser identificadas por este método o por los métodos de rastreo de homología descritos en la Sección 2, debajo.

El ejemplo 1 proporciona los detalles del método de rastreo diferencial usado para identificar la proteína Homer de rata. Brevemente, fue extraído Poli(A)^{+} ARN de cerebros de animales que tenían convulsiones activas y fue usado para preparar cDNA. Este cDNA estimulado fue hibridado hasta ARN en exceso de los cerebros de los animales control no estimulados. El cDNA preparado a partir del mRNA restante fue usado después para construir una genoteca, en la que fue identificada la proteína Homer de rata. Como se discute en este documento, esta proteína tiene características de secuencia particulares y las propiedades de unión que definen una familia de unión sináptica o proteínas de activación.

En un procedimiento de rastreo diferencial, un total de 16 clones nuevos independientes fueron identificados que parecían tener niveles más altos en el hipocampo de rata estimulado que en el control. El análisis Northern estándar confirmó la expresión diferencial del mRNA. La proteína Homer de rata fue producida como un producto de la traducción de uno de estos clones expresados diferencialmente. El análisis Northern demostró que el mRNA Homer era de 6,5 kilobytes de longitud. Varias cadenas enteras de cDNAs de la proteína Homer de rata fueron identificadas rastreando una genoteca de bacteriófago (\lambda Zap II) que fue especialmente preparada para contener cDNAs grandes. Ambas cadenas de dos clones independientes fueron secuenciados y fue identificado un marco de lectura abierto (ORF) de 558 nucleótidos. El ORF fue confirmado por análisis del tamaño del producto proteico generado por transcripción in vitro y traducción in vitro de mRNA preparado a partir de clones de supuestas longitud completas y comparando esto con la proteína preparada con mRNA a partir de los clones que carecían de metionina al principio. El ORF además fue confirmado preparando antisuero policlonal de conejo contra una proteína de fusión bacteriana de cadena entera Homer o contra un péptido sintético que representa el extremo C de la proteína Homer. Estos antisueros fueron usados para confirmar la presencia de una proteína medida en su tamaño de manera apropiada en el cerebro que se induce rápidamente después de convulsiones electroconvulsivas máximas (MECS).

Se muestra la secuencia de codificación de nucleótidos de la proteína Homer aislada a partir de cerebro de rata en la figura 1 como SEQ ID NO: 1. La secuencia de codificación tiene un marco de lectura abierto (ORF) de 558 nucleótidos (figura 1A; SEQ ID NO: 1). Como se menciona anteriormente, el mRNA de 6,5 kilobytes derivado de este ADN codifica para una proteína de 186 aminoácidos (figura 2A; SEQ ID NO: 2). Un 3'UTR largo (Nº. de entrada del GENBANK:: U92079) codifica múltiples repeticiones AUUUA, tal como se han implicado en la desestabilización del mRNA de genes de actividad inmediata (IEG, siglas en inglés). La secuencia de aminoácidos predice una proteína soluble que contiene una secuencia sola de GLGF y arginina precedente (figura 2), un denominado "dominio del tipo PDZ" que es predicho por tener ciertas propiedades de unión, basado en su caracterización en diferentes proteínas no emparentadas, tal como PSD-95. La secuencia de la proteína Homer es, por otra parte, nueva e imprevisible a partir de secuencias más cortas tales como EST. Hay identidad de secuencia de aminoácidos de menos del 10% entre los miembros de la rata de Homer y los publicados de la familia PDZ (Doyle, et al., 1996).

Los marcadores de secuencia expresada (EST) de humano (Z17805) y ratón (AA166092 y AA013888) fueron identificados que eran 84% y 72% idénticos a las regiones de las secuencias que codificaban para el ORF para la proteína Homer (figura 2; humano, SEQ ID NO: 3 y ratón, SEQ ID NO: 4). La traducción de los EST indica que las secuencias de aminoácidos de los EST y de ratón humano son idénticas entre sí en su región limitada de traslapo pero los EST de ratón son divergentes de la proteína Homer de rata en esta región, sugiriendo que los EST son homólogos de miembros de familia adicionales. Con base al presente descubrimiento de Homer de rata, pueden ser ampliadas las secuencias de proteína de humano y de ratón para incluir la secuencia de rata y/o sus sustituciones conservadoras, como se describe en este documento. Tales secuencias ampliadas caerán dentro de la definición de un miembro de la familia de la proteína de activación sináptica, como se define en este documento.

Los miembros de la familia de la proteína de activación sináptica adicionales pueden identificarse usando un protocolo de rastreo diferencial similar al descrito en el Ejemplo 1, junto con sondas basadas en las secuencias descritas en este documento, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. De forma alternativa o además, tales proteínas son identificadas por (i) la homología sustancial en el nivel de la secuencia de nucleótidos o proteína respecto a la secuencia de codificación de Homer de rata o a la proteína, (ii) la capacidad de unirse y de afectar a la actividad de proteínas efectoras en el CNS, tales como los receptores metabotrópicos de glutamato, (iii) la especificidad de unión para una secuencia de unión particular, y (iv) la presencia en la secuencia del dominio tipo PDZ de Homer. Según se implica por su expresión diferencial en el cerebro de rata estimulado, como se discute anteriormente, y como se describe además debajo, la expresión del gen es estimulada por la actividad sináptica estimulante. Estos atributos de las proteínas de activación sináptica son descritos en las secciones que siguen.

b. Identificación de homólogos de proteína de activación sináptica. A partir de la presente descripción de las secuencias de codificación y polipéptidos de Homer de rata, la identificación de los miembros adicionales de la familia de polipéptidos de Homer que tienen una homología sustancial a Homer puede ser lograda por uno o varios métodos conocidos para las personas expertas en la técnica que se comentan debajo.

Por ejemplo, usando sondas de nucleótidos derivadas de SEQ ID NO: 1, los miembros de la familia son identificados rastreando las genotecas apropiadas. En particular, las sondas de hibridación derivadas de nt 558-nt 1127 del cDNA de longitud casi completa mencionado en la Genoteca (Nº. de entrada: U92079) pueden ser sintetizadas con sintetizadores de ADN disponibles en el comercio (por ejemplo, el modelo 381A de Applied Biosystems) utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica (Ausubel, et al., 1992). Una genoteca particularmente apropiada es una genoteca del CNS o cerebral, tales como las genotecas cerebrales humanas que están disponibles en el comercio de Stratagene (La Jolla, CA) y en InVitrogen (San Diego, CA). La sonda es típicamente hibridada a 65ºC y lavada a 55ºC (condiciones de severidad medias). Los clones identificados por este método son aislados y sus secuencias de codificación son determinadas, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Los clones además se seleccionan si sus secuencias de aminoácidos deducidas incluyen en un grado mínimo a la región del dominio tipo PDZ de Homer, como se discute anteriormente.

Una caracterización más de clones seleccionados se lleva a cabo por la inserción de regiones de codificación aisladas en vectores para la expresión en un sistema de expresión apropiado, tal como cualquiera u otros de los sistemas descritos en el Ejemplo 3, o en otros sistemas apropiados conocidos en la técnica. Los productos traducidos entonces son aislados, tal como por los métodos descritos en el Ejemplo 4, y son analizados por su capacidad de unirse a proteínas objetivo específicas en el CNS y por la especificidad de unión para una secuencia de unión del péptido particular, tal como la secuencia SSTL o SSSL, como se discute en la Sección III.C., debajo.

Además, usando las secuencias de proteína presentadas como SEQ ID NO: 2 (Homer de rata), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, mostradas en las figuras 2 (A-C), como plantillas, se aprecia que los miembros de la familia adicionales pueden identificarse basado en (i) la variación inter-secuencia y entre los polipéptidos y (ii) la sustitución conservadora de aminoácidos dentro de las secuencias.

Así, mirando la región del extremo N de los polipéptidos mostrados en la figura 2, es evidente que los 30 primeros aminoácidos son invariantes entre las tres secuencias. Sin embargo, las posiciones 31-34 se diferencian. La secuencia de rata es AVTV, mientras que las proteínas de humano y de ratón comparten la secuencia GHRF. De esta variación, es posible construir polipéptidos en los cuales las posiciones 31-34 tienen las secuencias variables: A/G V/F T/R V/H. Las otras regiones de variabilidad son evidentes a partir de la inspección de las secuencias alineadas. Ciertas regiones de la proteína Homer de rata han sido identificadas y son significativas en el contexto de su función. Por ejemplo, la secuencia GLGF del dominio del tipo PDZ y la arginina precedente en las posiciones 87-90 y 81, respectivamente, pueden formar "una bolsa de unión", basada en la bolsa de unión conocida de la proteína de unión sináptica PSD95 (Kornau, et al., 1995). Conforme a las directrices precedentes acerca de la sustitución, esta región es invariante entre las tres proteínas de activación sináptica ejemplificadas y por lo tanto debería conservarse en cualquier secuencia deducida a partir de estas proteínas.

Otra sustitución de las posiciones variables identificadas puede hacerse haciendo sustituciones de aminoácidos conservadoras. Es decir, si dos o más de los aminoácidos posibles en una posición variante están en una clase de sustitución común, la sustitución en aquella posición por un aminoácido dentro de aquella clase puede conservar la conformación y la función del polipéptido. Las clases de sustitución estándar que pueden usarse en este análisis son las seis clases basadas en las propiedades de cadena lateral comunes y la frecuencia más alta de sustitución en las proteínas homólogas en la naturaleza, según se determina, por ejemplo, por una matriz de intercambio de frecuencia de Dayhoff estándar (Dayhoff, 1972). Estas clases son la Clase I: C; Clase II: S, T, P, X, A y G que representan pequeñas cadenas laterales alifáticas y cadenas laterales del grupo OH; Clase III: N, Q, D y C, que representan cadenas laterales neutras y negativamente cargadas capaces de formar enlaces de hidrógeno; Clase IV: H, R y K, que representan cadenas laterales básicas polares; Clase V: I, V y L, que representan cadenas laterales ramificadas alifáticas, y Met; y Clase VI: F, Y y W, que representan cadenas laterales aromáticas. Además, cada grupo puede incluir a análogos de aminoácidos emparentados, tales como ornitinina, homoarginina, N-metil-lisina, dimetil-lisina o tri-metil-lisina en la Clase IV, y ciclohexilalanina o una tirosina halogenada en el Grupo VI. Además, las clases pueden incluir tanto a los isómeros L como a los D, aunque los L-aminoácidos son preferidos para las sustitu-
ciones.

Las secuencias de polipéptido diseñadas de acuerdo con las directrices precedentes pueden ser producidas, por ejemplo, por expresión recombinante. El ORF seleccionado se clona como una fusión con la glutationiona-S-transferasa (GST) y se expresa en bacterias. De forma alternativa, el ORF puede ser clonado en un vector de expresión de mamíferos y expresarse en células de mamífero, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

c. Preparación de oligonucleotidos de proteína de activación sináptica/vectores. Basado en las secuencias de proteína reveladas por el análisis precedente, los nucleótidos que codifican las proteínas de activación sináptica pueden ser diseñados de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Como se discute debajo, tal diseño puede incluir consideraciones del tipo de las células usadas para la expresión de la proteína.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención pueden ser diseñadas para cambiar la secuencia que codifica para la proteína por una variedad de motivos, incluyendo, pero no limitado, a las alteraciones que modifican la clonación, el procesamiento y/o la expresión del producto génico. Por ejemplo, pueden ser introducidas alteraciones usando técnicas que son conocidas en la técnica, por ejemplo, mutagénesis dirigida, insertar nuevos sitios de restricción, cambiar el modelo de glicosilación, cambiar la preferencia del codon, producir variantes de corte y empalme, etc.

La presente invención también incluye estructuras recombinantes que comprenden una o varias de las secuencias que se describen de forma amplia anteriormente. Las estructuras comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el que una secuencia de la invención ha sido insertada, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la estructura además comprende secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, unido de forma operativa a la secuencia. Se conocen muchos vectores adecuados y promotores para los expertos en la técnica, y están disponibles en el comercio. Los vectores de clonación apropiados y de expresión para uso con huéspedes procariotas y eucariotas también son descritos en Sambrook, et al., 1989.

Como se detalla en el Ejemplo 2, una estructura de expresión de mamífero de la proteína Homer de rata de cadena entera fue preparada clonando el fragmento 5' de EcoRI (1,6 kilobytes) en el vector de expresión de mamífero pRK5. El vector fue usado para transfectar células eucariotas de mamífero (riñón humano embrionario; células HEV293).

Pueden usarse vectores alternativos para la transfección de diferentes tipos de células. Por ejemplo, para la expresión de una proteína de fusión que contenía el polipéptido de Homer de rata fusionado a GST, el ORF de Homer fue clonado en los vectores bacterianos pGEX. Para la expresión en un sistema de levadura, fue clonado el ORF de Homer en pPC86.

2. Producción de proteínas de activación sináptica

a. Expresión de proteínas de activación sináptica. Pueden producirse proteínas de activación sináptica recombinantemente por cualquiera de los métodos disponibles para la expresión de proteínas. Por vía del ejemplo, el Ejemplo 3 proporciona los métodos que han sido usados para expresar la proteína Homer de rata en un sistema de transcripción/traducción de células libres.

Para la producción a gran escala, la expresión de la proteína Homer y los homólogos del miembro de la familia de la proteína de activación sináptica puede llevarse a cabo en cualquiera de los sistemas de expresión celulares. Las posibles células huésped incluyen, pero no son restringidas, a células bacterianas, de levadura, insecto y mamífero. Puede apreciarse que la expresión en un sistema particular puede ser optimizada adaptando los codones al tipo de célula particular cuya expresión debe ocurrir. De ahí que los polinucleótidos abarcados según la presente invención incluyan los polinucleótidos que codifican para la proteína de interés, como los modificados para la expresión óptima en cualquier sistema de expresión dado, sin tener en cuenta la identidad de la secuencia total en SEQ ID NO: 1. Tal diseño puede ser efectuado con la ayuda del uso del codon o se conocen tablas de preferencia tales como las conocidas en la técnica. Como se muestra en la figura 5, el mGluR5 fue expresado en células HEK-293 (banda 2) y fue comparado con las células transfectadas con el vector solo (banda 1). Aquí, mGluR5 emigra como una banda principal de 140 kDa con un 50 fragmento de división secundario de presumiblemente 50 kDa. En los extractos de hipocampo (banda 3), la banda superior (peso molecular más alto) aparece como un doblete. En estos experimentos, los extractos del hipocampo también fueron pasados por columnas de gel Affigel que contenían GST o la proteína de fusión de GST-Homer y fueron eluidos con tampón de carga SDS (rutas 4 y 5). La inmunotransferencia positiva con el anticuerpo anti-GluR5 demuestra la asociación de la proteína Homer de rata con el receptor mGluR5 en el extracto.

b. Purificación de extractos celulares de proteína Homer de rata. La proteína Homer y sus análogos pueden purificarse a partir de extractos celulares estándar utilizando procedimientos preparatorios. La purificación de la etapa final puede llevarse a cabo por cualquiera de los métodos estándar, incluyendo la purificación por inmunoafinidad en columna usando anticuerpos preparados contra la proteína Homer o sus fragmentos, como se describe en el Ejemplo 4.

3. Localización en tejido de las proteínas de activación sináptica

En los experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención, se ha determinado que la expresión de proteínas de activación sináptica está enriquecida sumamente en el sistema nervioso central. Por ejemplo, como se demuestra en los datos mostrados en la figura 3, el mRNA de Homer de rata fue encontrado casi exclusivamente en el tejido nervioso central.

Además, la expresión de mRNA de Homer está fuertemente regulada en el hipocampo por la activación neuronal inducida por convulsiones. La expresión de mRNA máxima ocurre 1 hora después de la convulsión en el hipocampo (figura 3). La proteína Homer está enriquecida en los extractos de hipocampo y emigra como un doblete con un peso molecular aparente de 28/29 kDa (figura 3) que es inducida rápidamente por la convulsión.

El ejemplo 6 proporciona métodos ejemplares que pueden usarse para medir los niveles de expresión de la proteína Homer. Los modelos anatómicos y celulares de la expresión de proteína Homer en rata fueron examinados por análisis inmunohistoquímicos realizados en el cerebro de ratas adultas. Compatible con su regulación como un IEG, la inmunotinción de Homer en la corteza aumentó notablemente 4 horas después de una convulsión (figura 4).

III. Características de unión celular de proteínas de activación sináptica

De acuerdo con una propiedad importante de la presente invención, los miembros de la familia de la proteína de activación sináptica se unen a receptores del sistema nervioso central específicos o a parejas de unión y modifican la función de tales proteínas. Como un ejemplo, y como se discute debajo, la proteína Homer de rata se une a dos subtipos del receptor metabotrópico de glutamato (mGluR) encontrado en el sistema nervioso central mGluR1\alpha y mGluR5.

Las parejas de unión del sistema nervioso central adicionales para las proteínas de unión de activación sináptica específicas identificadas como se discute en la Sección II, anteriormente, pueden identificarse usando las metodologías descritas en la Sección A, debajo. Las Secciones B y C describen los métodos usados para caracterizar la interacción de una proteína de unión de activación sináptica específica con su pareja(s) de unión celular.

1. Identificación de sitios de unión celulares para proteínas de activación sináptica en el sistema nervioso central

Los sitios de unión de la proteína de activación sináptica en el tejido nervioso central pueden identificarse usando un ensayo de interacción de proteína doble híbrido (Ausubel, et al., 1992). Este método de ensayo proporciona un medio simple y sensible para detectar la interacción entre dos proteínas en células vivas. Tal ensayo es descrito en el Ejemplo 5, dado que fue usado para identificar ciertas parejas de unión funcionales para la proteína Homer de rata. Se usaron ensayos análogos para determinar los sitios de unión celulares de las proteínas de ratón y humanas, y otras proteínas homólogas de acuerdo con la presente invención.

El sistema de rastreo doble híbrido está basado en la observación de que una interacción proteína - proteína puede ser detectada si dos proteínas que interactúan potencialmente son expresadas como fusiones o quimeras. Una primera proteína de fusión contiene una de un par de proteínas que interactúan fusionadas a un dominio de unión de ADN, y una segunda proteína de fusión contiene el otro de un par de proteínas que interactúan fusionadas a un dominio de activación de transcripción. Las dos proteínas de fusión se expresan por separado en la misma célula, y la interacción entre las partes de la "proteína que interactúa" de las fusiones reconstituye la función del factor de activación de transcripción, que es detectado por la activación de la transcripción de un gen indicador. Para uso en la presente invención, la primera proteína de fusión contiene la proteína de unión de activación sináptica. La segunda proteína de fusión contiene una de una genoteca expresada de proteínas específicas del sistema nervioso central, como se describe debajo.

Hay varias configuraciones posibles del ensayo de rastreo doble híbrido que pueden usarse en el contexto de la presente invención (Ausubel, et al., 1992). En una de estas, un sistema doble híbrido de GAL4 de levadura, son detectadas las interacciones proteína - proteína, basado en la reconstitución de la función de GAL4, un activador transcripcional de levadura, por la activación de un gen indicador GALI-lacZ. Como otros factores de activación de transcripción, GAL4 contiene dos dominios distintos, un dominio de unión de ADN y un dominio de activación de transcripción. Cada dominio puede ser expresado por separado como una parte de una proteína de fusión compuesta del dominio, y una segunda, proteína que interactúa con el "cebo". Las dos proteínas de fusión entonces se expresan por separado juntas en una célula. Cuando los dos dominios GAL4 son juntados por una interacción de unión entre el "cebo" y las proteínas "de unión", se inicia la transcripción de un gen indicador CON el control transcripcional de GAL4. El gen indicador típicamente tiene un promotor que contiene los sitios de unión de la proteína GAL4 (secuencias de activación de GAL corriente arriba, UAS_{G}). Los genes indicadores ejemplares son los genes indicadores GAL1-LacZ y GAL1-HIS3.

Un segundo sistema doble híbrido, descrito detalladamente por Ausubel, et al., (1992) utiliza a una proteína represora LexA natural de E. coli, que se une fuertemente a los operadores apropiados. Se usa un plásmido para expresar una de un par de proteínas que interactúan (la proteína de "cebo", por ejemplo, la proteína Homer) como una fusión a LexA. El plásmido que expresa la proteína de cebo LexA-fusionada se usa para transformar una cepa de indicador de levadura, tal como EGY48, que contiene PSH18-34.

En esta cepa, los sitios unión para LexA se localizan corriente arriba de dos genes indicadores. En el primer sistema de indicador, las secuencias de activación corriente arriba del gen cromosómico LEU2 - requerido en la ruta biosintética para la leucina (Leu) - son sustituidas en EGY48 con operadores de lexA, permitiendo la selección para la viabilidad cuando las células son puestas en placas en un medio que carece de Leu. En el segundo sistema de indicador, EGY48 acoge al plásmido, pSH18-34, que contiene un gen de fusión operador-lacZ de lexA, permitiendo la discriminación basada en el color cuando la levadura se cultiva en un medio que contiene Xgal (Ausubel, et al., 1992).

La genoteca de LexA usa el promotor de levadura inducible GAL1 para expresar proteínas como fusiones a un dominio ácido ("mancha ácida") que funciona como un motivo de activación transcripcional portátil ("acto"), y a otros restos útiles. La expresión de proteínas codificadas por genoteca se induce poniendo en placas los transformantes en un medio que contiene galactosa (Gal), de modo que las células de levadura que contienen las proteínas de la genoteca que no interactúan específicamente con la proteína de cebo fallan al crecer en ausencia de Leu. Las células de levadura que contienen las proteínas de la genoteca que interactúan con las proteína de cebo forman colonias en de 2 a 5 días, y las colonias se vuelven azules cuando las células son teñidas en un medio que contiene Xgal. Los plásmidos son aislados y caracterizados por una serie de ensayos para confirmar la especificidad de la interacción con la proteína de cebo inicial. Aquellos que son específicos están listos para posteriores análisis (por ejemplo, secuen-
ciación).

En los experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención y los descritos en el Ejemplo 5 en este documento, el sistema doble híbrido GAL4 de levadura fue usado para identificar a las parejas de unión de la proteína Homer de rata en una genoteca de cDNA del cerebro de rata (Chevray y Nathans, 1992). Un producto de la PCR del ORF de Homer de cadena entera con sitios SmaI flanqueantes fue subclonado en el vector de expresión de levadura pPC97. Una genoteca de cDNA iniciada arbitraria fue preparada a partir del hipocampo de rata adulta estimulado por convulsión y fue clonado en el vector de expresión de levadura pPC86. La genoteca contiene 2 x 10^{6} cDNAs independientes. Un total de 1,5 x 10^{6} clones fueron rastreados. Las proteínas que interaccionan fueron identificadas por la selección en placas que carecían de leucina, triptófano e histidina, fueron teñidas de nuevo y se confirmaron usando un ensayo de \beta-galactosidasa.

Uno de los cDNA que interactúan identificado en este ensayo codifica para los 195 aminoácidos del extremo C de mGluR5. Esta región de mGLuR5 es citosólica y está implicada en la señalización mediada por fosfolipasa (PLC) C en neuronas. La confirmación y otras caracterizaciones de unión fueron llevadas a cabo como se describe en la Sección B, debajo.

2. Unión de proteínas de activación sináptica a componentes celulares

Conforme al descubrimiento de la presente invención, las proteínas de activación sináptica se unen a componentes celulares, tales como los identificados de acuerdo con los métodos descritos en la Sección A, anterior. Después de la determinación del candidato pareja de unión celular, la proteína de activación sináptica además puede ser analizada para unir al candidato en uno o varios de los ensayos de unión in vitro como los descritos debajo.

Por ejemplo, la proteína de fusión de GST- Homer expresada bacterianamente fue analizada para unir al mGluR5 natural en los extractos detergentes de hipocampo en un ensayo de unión in vitro como se detalla en el Ejemplo 7A. Como se muestra en la figura 5, mGluR5 se une a la proteína de fusión de GST-Homer, pero no a GST solo.

Otro método de evaluar la unión in vitro es proporcionado por un ensayo de co-inmunoprecipitación, en el cual un anticuerpo dirigido a una de las proteínas se usa para evaluar si las dos proteínas forman un complejo de unión en la solución. La figura 6 muestra los resultados de ensayos que analizan la co-inmunoprecipitación de mGluR5 con Homer a partir de hipocampo de acuerdo con métodos detallados en el Ejemplo 7B. En este caso, los extractos de hipocampo fueron inmunoprecipitados con suero preinmune, suero antiHomer o con suero antiHomer pretratato con GST-Homer. Como se muestra, mGluR5 co-inmunoprecipita con el antisuero Homer, pero no con el suero preinmune. Además, la co-inmunoprecipitación fue bloqueada por la preadsorción de antisuero con antígeno Homer (ruta 4), indicando la especificidad del antisuero para la proteína Homer de rata.

El potencial para la interacción natural entre la proteína de activación sináptica y la pareja de unión del candidato además puede ser evaluado in situ y por inmunotinción de las secciones de tejido cerebral con anticuerpos dirigidos a cada una de las proteínas. El objetivo de este análisis es establecer que ambas proteínas son expresadas en las mismas regiones de la célula. Por ejemplo, las figuras 7A y 7B muestran la inmunotinción de la proteína Homer de rata con antisuero antiHomer (7A) y la inmunotinción de mGluR5 con anticuerpos antimGluR5 (7B) en la corteza parietal de rata adulta. De estos experimentos se observa que la inmunotinción de mGluR5 y Homer están ambas enriquecidas en dendritas apicales de neuronas piramidales de la Capa V. Estos datos proporcionan un soporte anatómico para la interacción in vivo entre la proteína Homer y mGluR5.

El modelo anatómico y temporal de la inmunotinción de Homer son análogos, con precisión, en la expresión de mRNA, como se discute en la Sección IV, debajo. Las neuronas piramidales de las capas corticales II/III y V mostraron una inmunotinción más intensa que típicamente rellenaba el soma y que se extendió en las dendritas apicales en un modelo punteado a lo largo del perímetro de la dendrita (figura 7C). Perfiles del tipo espina fueron vistos con frecuencia en las dendritas distales (figura 7D). La inmunoreactividad de Homer no estaba presente en el núcleo. El modelo punteado de inmunotinción de Homer fue confirmado en cultivos primarios de neuronas del hipocampo (figuras 8A, 8B). Además, el hecho de que Homer estaba extensivamente co-localizada con inmunotinción para el receptor de glutamato GluR1 indicó que Homer estaba enriquecida en la sinápsis estimulante. El modelo anatómico de expresión de Homer coincide estrechamente con las publicaciones respecto a la inmunoreactividad de mGluR5. La inmunoreactividad de MGluR5 está enriquecida en las dendritas de neuronas piramidales corticales, así como en muchas otras poblaciones neuronales que expresan a Homer, y está presente en la sinápsis estimulante. La co-distribución extensa de proteína Homer y mGluR5 en dendritas de neuronas piramidales y en la sinápsis estimulante, junto con la asombrosa especificidad de su interacción física, apoya la noción de que estas proteínas son parejas fisiológicas. La proteína Homer de rata también se expresa sumamente en células de Purkinje del cerebelo. Estas células expresan fuertemente mGluR1\alpha, sugiriendo una complementaridad fisiológica entre los dos tipos de proteína en estas neuronas.

Los estudios descritos anteriormente en lo que concierne a la proteína Homer de rata son ilustrativos de los tipos de experimentos a los que pueden someterse los miembros de la familia de la proteína de activación sináptica candidatos, para verificar la inclusión en la familia. En la identificación de la proteína pareja de unión particular a la que la proteína de activación sináptica se une, los ensayos funcionales apropiados se establecen para determinar si tal unión interfiere o realza la función biológica de la proteína de pareja de unión. Por ejemplo, en el caso de la proteína Homer de rata, se sabe que mGluR1 y mGluR5 se acoplan con fosfolipasa C y regulan la hidrólisis de fosfoinositida vía fosfoinositidasa C (PI-PLC), mientras que mGluR2 y 4 regulan negativamente la adenilato ciclasa (Nakanishi, 1994; Pin y Duvoisin, 1995). Por lo tanto, para determinar además si la proteína Homer de rata interfiere o realza esta actividad funcional, se establece un ensayo para monitorizar la actividad de PI-PLC dependiente de MGluR en ausencia o presencia de proteína Homer de rata añadida.

3. Especificidad de la secuencia peptidico de la interacción de unión

De acuerdo con una propiedad más de la presente invención, se ha encontrado que los miembros de la familia de la proteína de activación sináptica, ilustrado por la proteína Homer de rata, se unen a secuencias peptidicas específicas. Tal especificidad de la secuencia puede ser dictada por el dominio PDZ, o por otros dominios presentes en la proteína de activación sináptica.

En los estudios llevados a cabo en apoyo de la presente invención, la especificidad de la interacción entre la proteína Homer de rata y los receptores metabotrópicos de glutamato mGluR5 y mGluR1\alpha fue examinada usando ensayos de unión in vitro.

Los receptores metabotrópicos de glutamato únicamente poseen largas colas del extremo C citoplásmicas que son 67% idénticas en los 55 últimos aminoácidos y que terminan en secuencias similares; -RDYTQSSSSL y -RDYKQSSSTL, respectivamente (figuras 9A-9E). Para medir la interacción de unión, fueron expresados mGluR5 y mGluR1\alpha en células HEK-293. Los extractos de célula fueron mezclados con GST-Homer unido por perlas y después fueron eluidos con tampón de carga SDS. Ambos mGluR1\alpha y mGluR5 de cadena entera expresados transitoriamente se unen a la proteína de fusión de Homer de rata, como se muestra en los figuras 10A y 10D. Cuando se deleccionaron los 4 aminoácidos del extremo C de mGluR5, la unión de mGluR5 a Homer fue reducida en más del 70% (FIG. 10D, rutas 3 y 4). La comparación de las secuencias del extremo C de otros receptores metabotrópicos de glutamato indica que los receptores de mGluR2 y mGluR3 comparten un extremo C-TSSL (figura 8), aunque divergen de mGluR1\alpha y mGluR5 fuera de esta región. Ni mGluR2 ni mGluR4 se unen a la proteína Homer (figuras 10B, 10C). Una proteína no emparentada conocida por poseer el extremo C-TSSL (RSK1) también fue analizada respecto a la unión, pero esta proteína no se unió a Homer. Basado en estos datos, se cree que los 4 aminoácidos finales son importantes, pero no suficientes para la unión.

Los datos precedentes indican que la proteína Homer interactúa específicamente con los receptores metabotrópicos de glutamato unidos a PI-PLC, y que la especificidad de la unión está determinada, al menos en parte, por los 4 aminoácidos del extremo C de estos receptores. Los sitios de unión específicos para proteínas de activación sináptica adicionales pueden tener secuencias de aminoácidos similares o divergentes que pueden ser determinadas empíricamente, usando métodos similares a los discutidos anteriormente.

El efecto de las mutaciones de delección de la proteína Homer en su unión a mGluR5 fue examinado midiendo la unión de la proteína de fusión de Homer-GST de cadena entera al fragmento de 195 aa del extremo C myc-marcado de mGluR5 expresado a partir de células HEK-293. Asimismo, las estructuras de delección que carecen de los 55 aminoácidos del extremo C también se unieron a mGluR5. En contraste, la delección de los 108 aminoácidos del extremo N de la proteína Homer, que incluye la secuencia GLGF, suprimió la unión a mGluR5. Estas observaciones indican un papel para la región GLGF en la unión a la secuencia del extremo C de mGluR5.

IV. Regulación de la expresión in vivo

Es un descubrimiento de la presente invención que las proteínas de activación sináptica que pertenecen a la familia ejemplificada por la proteína Homer de rata pueden ser reguladas dinámicamente por la actividad neuronal, incluyendo la actividad por convulsión y la administración aguda de cocaína, como se discute anteriormente. Además, los experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención muestran que la proteína Homer de rata se regula en el desarrollo con la expresión máxima en el cerebro anterior de rata de la tercera a la quinta semana después del parto (figura 11). Durante este período de expresión máxima del desarrollo, se induce notablemente el mRNA de la proteína Homer en la corteza cerebral de ratas criadas en la oscuridad a los 30 minutos de la primera experiencia visual (figuras 12A-12F). Además, la privación monocular, por el bloqueo de la actividad retinal con tetrodotoxina, causa una reducción rápida del mRNA de Homer en la corteza visual contralateral (figura 13). Estas observaciones indican que la expresión en el desarrollo de la proteína de activación sináptica Homer está regulada en la corteza por actividad sináptica natural. Se espera que los miembros adicionales de la familia de la proteína de activación sináptica pueden compartir estas características de expresión u otras muy similares.

En el adulto, se induce rápidamente mRNA de Homer en el hipocampo de ratas despiertas por estímulos sinápticos dependientes de NMDA que inducen la potentiación a largo plazo (figura 14). La inducción más prominente ocurre en neuronas de células granulares del hipocampo y es similar en magnitud a la inducción por convulsión. También se induce rápidamente la proteína Homer en el cuerpo estriado por la administración de cocaína (figura 15) sugiriendo una regulación debido a mecanismos del receptor de dopamina. Estos estudios indican que, a diferencia de otras proteínas PDZ conocidas, la proteína Homer se regula rápidamente por múltiples formas de actividad neuronal fisiológica.

Las múltiples nuevas propiedades de la proteína Homer de rata sugieren un papel importante en la plasticidad sináptica glutamatérgica para Homer y su análogo humano.

V. Utilidad

Las composiciones de polinucleótido y polipéptido que forman una parte de la presente invención tienen utilidad como componentes principales de ensayos diagnósticos y ensayos de rastreo para identificar fármacos capaces de realzar o inhibir la interacción entre proteínas de activación sináptica y sus sitios de unión celulares. Los ejemplos específicos de tales ensayos y cómo pueden ser éstos usados son proporcionados en las secciones que siguen.

1. Ensayos de rastreo

Las proteínas de activación sináptica descritas en este documento pueden ser usadas en los ensayos de rastreo para identificar los compuestos que interfieren o modulan la unión de la proteína Homer frente a mGluR5 o mGluR1\alpha, y de ahí con la actividad de mGluR unido a PI. Conforme a la presente invención, los compuestos identificados por este ensayo de rastreo pueden ser usados como fármacos para tratar la epilepsia, el desarrollo cerebral anormal, daño neuronal, trauma y ciertas adicciones químicas.

Se conocen protocolos de ensayo para medir la interacción proteína - proteína en la técnica. Por ejemplo, la proteína de activación sináptica purificada puede ser revestida en una fase sólida, tal como una placa de microtítulo, seguido por el bloqueo de los sitios de unión de la placa abiertos, de acuerdo con métodos estándar. Después se añade mGluR a la placa en ausencia o presencia de un compuesto de ensayo. La detección de mGluR unido a la proteína de activación sináptica se logra por el marcaje directo de mGluR o por la adición subsecuente de un reactivo de unión específico de mGluR marcado, tal como un anticuerpo. El reactivo de unión puede ser radiomarcado, por ejemplo, con ^{125}I, o puede marcarse con un tinte fluorescente, una enzima capaz de generar una señal (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante), oro o biotina de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica (Howard, 1993). La detección de la unión entonces se lleva a cabo usando métodos apropiados para la señal generada. Un compuesto de ensayo se selecciona para el desarrollo del fármaco si altera suficientemente la unión entre las proteínas.

En consecuencia, los polinucleótidos que forman parte de la presente invención pueden ser usados en la producción a gran escala de proteínas de activación sináptica para los ensayos de rastreo descritos anteriormente.

2. Ensayos diagnósticos

Usando la interacción entre la forma de rata o humana de la proteína Homer de activación sináptica con mGluR5 por ejemplo, puede hacerse un kit de análisis de un ensayo diagnóstico para medir la inducción de la proteína de activación sináptica. Debe ser apreciado que la inducción de la proteína de activación sináptica puede servir como una medida de la activación cerebral, tal como la actividad convulsiva en el tejido nervioso central. En este punto, la medida de los niveles de proteína de activación sináptica puede servir como un indicador del nivel de actividad convulsiva y/o daño neuronal consiguiente a tal actividad. Tal medida también puede servir como un indicador del nivel de intoxicación agudo de cocaína (c.f., Sección IV, anterior).

Los kits diagnósticos para medir los niveles de proteína de activación sináptica pueden tomar la forma de un radioinmunoensayo, en el que los niveles de proteína de la muestra son medidos por el desplazamiento de la proteína control marcada de un anticuerpo específico. De forma alternativa, los niveles de proteína pueden ser medidos en un ensayo del tipo ELISA, en el que un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítopo específico de la proteína de activación sináptica es unido a la fase sólida. La muestra de ensayo entonces es añadida, seguido por el anticuerpo monoclonal detectable, dirigido a un epítopo diferente de la proteína de activación sináptica. La señal detectable es proporcional a la cantidad de proteína de activación sináptica presente en la muestra.

Los ejemplos siguientes ilustran, pero de ninguna manera limitan, la presente invención.

Ejemplo 1 Clonación de la proteína de activación sináptica homer por rastreo diferencial

La superinducción de lEB en el hipocampo fue alcanzada pretratando ratas con cicloheximida y 15 minutos más tarde administrando repetidamente ataques máximos electroconvulsivos (MECS), con un total de 12 MECS en un período de tiempo de 3 horas.

El ARN total fue aislado del hipocampo de ratas tratadas con MECS y cicloheximida. Poli(A)^{+} ARN fue seleccionado por cromatografía de columna con oligo dT. El ARN entonces fue convertido a cDNA utilizando un iniciador de oligo dT/XhoI y fue clonado direccionalmente en \lambda Zap II (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La complejidad de esta genoteca fue - 2 x 10^{6} clones independientes. Esta genoteca familiar estimulada entonces fue usada para preparar una genoteca sustraída enriquecida para genes inducidos en el hipocampo después de la convulsión. La genoteca estimulada fue puesta en placas en una densidad de 50000 pfu/placa (40 placas totales) y fue preparado el ADN del bacteriófago. Este ADN fue linealizado en el extremo 3' del injerto de cDNA usando Xhol y luego fue usado como plantilla en presencia de T3 ARN Polimerasa para sintetizar cantidades grandes de cRNA in vitro. Para eliminar las transcripciones incompletas y las secuencias del vector, Poli(A)^{+} cRNA fue aislado del cRNA por cromatografía de columna con oligo dT. El cRNA fue convertido a cDNA utilizando un iniciador oligo dT/Xhol y la transcriptasa inversa de SUPERSCRIPT (Gibco BRL, Ground Island, Nueva York). La plantilla de ARN fue eliminada por desnaturación baja seguido de cromatografía de columna en "SEPHADEX G-50" (Pharmacia, Piscataway, NJ) y este cDNA fue restado frente a Poli(A)^{+} ARN aislado de cerebro de rata normal adulta. Para la substracción del Poli(A)^{+} ARN "conductor" cerebral fue biotinilado usando biotina de "PHOTOPROBE" (brazo largo) (Laboratorios Vector, Inc., Burlingame, CA). Para la primera ronda de substracción fue hibridado un exceso de 20 veces ARN de cerebro de conductor biotinilado (200 \mug) con el cDNA estimulado (10 \mug) durante 48 horas a 68ºC. Los híbridos de cDNA/bioRNA no diferenciales fueron eliminados por la adición de estreptavidina (Laboratorios Vector, Inc., Burlingame, CA) seguido de la extracción con fenol y el cDNA monocatenario fue recuperado en la fase acuosa. La primera ronda de substracción eliminó el 80% del cDNA inicial y el cDNA restante monocatenario fue hibridado durante 48 horas adicionales a 68ºC con un exceso de 100 veces de ARN de hígado de conductor biotinilado (200 \mug). Esta segunda ronda de substracción eliminó un 16% adicional del cDNA inicial estimulado. El material restante fue fraccionado por tamaños por cromatografía de columna en "SEPHADEX G-50" (Pharmacia, Piscataway, NJ) para eliminar los cDNA degradados y pequeños. El cDNA restado monocatenario "estimulado" fue convertido a bicatenario utilizando "SEQUENASE" ADN Polimerasa (USB) y el iniciador SK (Stratagene, La Jolla, CA). Después de la digestión con EcoRI y Xhol, y el fraccionamiento por tamaños por cromatografía de columna, el cDNA restado fue clonado direccionalmente en \lambda ZAPII (subtraído/MECS y cicloheximida/hipocampo). La complejidad de esta genoteca de cDNA restada era de \sim5 x 10^{6} clones independientes. Esta genoteca de bacteriófago entonces fue puesta en placas a una densidad de \sim1000 bacteriófagos/placa de 15 cm y fueron obtenidos los brotes de replicado. Los brotes fueron entonces hibridados con cDNA radiomarcado con ^{32}P-dCTP preparado a partir de Poli(A)^{+} ARN de hipocampo de ratas control sin tratamiento o de ratas que recibieron el estímulo MECS/cicloheximida. El cDNA monocatenario fue preparado usando "SUPERSCRIPT" de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la desnaturación de base de la plantilla de ARN el cDNA fue radiomarcado con una actividad específica de 4 x 10^{9} cpm/\mug por el método de cebadura aleatorio. Los filtros fueron hibridados durante 2 días a 65°C con una sonda de cDNA restada y luego se lavaron con 0,5X SSC/0,2%SDS a 65°C y se expusieron a la película de rayos X a -80°C con rastreo intensificador.

Ejemplo 2 Preparación de oligonucleotidos de proteína homer y vectores

Una estructura de expresión de mamífero de Homer de cadena entera fue preparada clonando los fragmentos 5' de EcoRI (1,6 kilobytes) en pRK5 (Genentech, South San Francisco, CA), de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica (Ausubel).

Ejemplo 3 Síntesis de la proteína Homer

La proteína Homer fue expresada en células de riñón embrionario humano (IDEK293). El vector de expresión eucariota de Homer (sRK5 Homer) fue transfectado en células HEK-293 por el método del precipitado con fosfato de calcio estándar. Las células fueron cultivadas 24-48 horas después de la transfección.

1. Traducción en células aisladas

La proteína Homer ha sido expresada usando varias estrategias. Primero fue expresada Homer a partir del cDNA clonado en pBSKS- (Stratagene, La Jolla, CA) usando T3 polimerasa y transcripción in vitro y el método de traducción de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega Biotech, Madison, WI). Esta técnica fue usada para evaluar el tamaño de Homer (Homer emigra en SDS-PAGE con una masa molecular aparente de 28 kDa), confirmando el tamaño predicho por el ORF. Este método también puede ser usado para preparar la proteína Homer para otros usos descritos en este documento.

2. Expresión celular

Las proteínas de fusión bacterianas de Homer fueron preparadas clonando el ORF en pTrkHis (InVitrogen, San Diego, CA) y pGEX (Pharmacia, Piscataway, NJ). Las proteínas de fusión fueron expresadas en bacterias y fueron purificadas en una columna de afinidad apropiada de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

Homer fue expresada en células eucariotas (células humanas embrionarias de riñón, Colección de Cultivo Americana, Rockville, MD) clonando el fragmento de restricción de 2 kilobytes de EcoRI que incluía el ORF en el vector pRK5 (Genentech, South San Francisco, CA), de acuerdo con los procedimientos estándar conocidos en la técnica. El vector de expresión eucariota (pRK4 Homer) fue transfectado en células HEK-293 por los métodos de precipitado con fosfato de calcio estándar. Las células fueron cultivadas 24-48 horas después de la transfección. Las proteínas aisladas a partir de estas células fueron usadas en los ensayos de unión y para confirmar el tamaño de la proteína natural.

Homer también fue expresada en levadura. El ORF fue clonado en pPC86 (Chevray y Nathans, 1992) y fue usado para rastrear las proteínas que interactúan con Homer. Este rastreo primero determinó que Homer interactúa con el receptor metabotrópico de glutamato del tipo 5.

Ejemplo 4 Purificación por inmunoafinidad de la proteína Homer

Anticuerpos monoclonales son acoplados a perlas de proteína A o G (dependiendo del isotipo de Ig) (disponible en el comercio de Pharmacia, Piscataway, NJ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los complejos de perla son recogidos en una columna de inmunoafinidad. Los extractos de células enteras limpias se preabsorben a perlas de agarosa, se pasan por la columna de inmunoafinidad, se lavan con varios volúmenes de tampón de lavado, entonces la proteína de interés se eluye de la columna usando una condición tampón predeterminada. Comúnmente, altas condiciones salinas son usadas para tal elución.

De forma alternativa, los anticuerpos pueden ser unidos directamente a un reactivo en fase sólida de cromatografía, tal como "SEPHAROSE 4B-200" (Pharmacia, Piscataway, NJ) de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Garvey, et al., 1977).

Ejemplo 5 Ensayo de unión de proteína doble híbrido

El ORF de Homer de cadena entera con sitios SmaI flanqueantes fue subclonado en el vector de expresión de levadura pPC97. Una genoteca de cDNA cebado aleatorio fue preparada a partir de hipocampo de rata adulta estimulada con convulsión y fue clonado en el vector de expresión de levadura pPC86. La genoteca contiene 6 x 10^{6} cDNA independientes y un total de 1,5 x 10^{6} fueron rastreados. Las proteínas que interaccionaban fueron identificadas por la selección de colonia en placas que carecían de leucina, triptófano e histidina y fue confirmada usando un ensayo de \beta-galactosidasa (Ausubel, et al., 1992). De forma alternativa, puede ser usado un sistema de detección disponible en el comercio de 2 híbridos para detectar interacciones proteína - proteína, por ejemplo, "HYBRID HUNTER" (InVitrogen, San Diego, CA).

Ejemplo 6 Medida de niveles de expresión 1. Preparación de antisuero

El antisuero policlonal de conejo para los receptores de mGluR fue generado contra péptidos del extremo C; mGluR1 como se discute antes, mGluR2/3 (Chemicon Internacional Inc.), mGluR4 (Wyeth Ayerst Investigación, Princeton, NJ), y mGluR5 contra un péptido de 21 aa del extremo C. El antisuero policlonal de conejo antiHomer fue generado usando el ORF de Homer de cadena entera como una fusión de GST o un péptido de 18 aa del extremo C. Ambos antisueros detectaron una proteína de 28 kDa cuando Homer fue expresado en células HEK293 y una proteína de doblete de 28/29 kDa inducible por convulsión en el hipocampo.

2. Análisis por inmunoensayo

Mezclas de proteína fueron separadas por SDS-PAGE de acuerdo con métodos estándar. Después de la electrofóresis el gel fue lavado extensivamente, y las proteínas entonces fueron transferidas a nitrocelulosa de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Ausubel, et al., 1992). Entonces fue incubada la nitrocelulosa con antisuero policlonal Anti-mGluR5 de conejo policlonal diluido de acuerdo con criterios de detección predeterminados. La tinción fue lavada, luego fue incubada con antisuero de anticonejo radiomarcado o unido por enzima. Los geles secados fueron sometidos a autoradiografía.

Ejemplo 7 Unión de proteína de activación sináptica proteína Homer A MGLUR5 1. Unión de proteína de fusión de GST-Homer expresada bacterianamente en extractos bacterianos

Fue preparado un extracto de hipocampo sonicando a partir del hipocampo de ratas de 21 días (3 x 10 segundos) en PBS y 1% de Triton con inhibidores de proteasa, centrifugando durante 10 minutos a 15.000 g, y prelimpiando con perlas de CL4B de sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ). Las columnas de afinidad de Homer fueron preparadas por entrecruzamiento irreversible de proteína de fusión de GST de Homer a perlas de agarosa de Affigel (1 mg de proteína Homer por 1 ml del volumen de lecho; Laboratorios BioRad, Richmond, CA). 40 ml de perlas entonces fueron incubadas con un extracto de hipocampo durante una hora a 4ºC, fueron lavadas tres veces con PBS, y el mGluR5 unido fue eluido hirviendo en 3 x tampón de carga.

2. Unión de proteína Homer de rata a receptores metabotrópicos de glutamato

Para los experimentos que examinan la especificidad de la unión de Homer a los receptores metabotrópicos de glutamato, fueron transfectadas células HEK-293 transitoriamente con estructuras de expresión de mGluR1\alpha, mGluR2, mGluR4 o mGluR5, fue raspado en PBS + 1% de Triton X100, fueron sonicadas 2 x 10 segundos, centrifugadas a 15.000 g durante 10 minutos a 4ºC y pre-aclaradas. El extracto de la mitad de una placa de 10 cm fue incubado con 50 \mul de perlas unidas a 250 ng de proteína y se lavó como antes. Las muestras fueron analizadas por análisis Western blot usando el anticuerpo policlonal de mGluR apropiado. Las estructuras de delección de Homer fueron preparadas por PCR y fueron clonadas como estructuras de fusión con GST en pGEX (Pharmacia, Piscataway, NJ).

C. Co-Inmunoprecipitación de proteína Homer y mGluR5

Fue preparado extracto de hipocampo como antes. El suero de conejo antiHomer o el suero preinmune fueron unidos irreversiblemente a perlas de agarosa "AFFIGEL" (Laboratorios BioRad, Richmond, CA) y se lavaron extensivamente con PBS. Fueron incubadas perlas de 50 \mul con extracto de un hipocampo de la noche a la mañana a 4ºC, fueron lavadas 2x con PBS con 1% de Triton y 2x con PBS, fueron resuspendidas en 3x tampón de carga SDS y fueron analizadas por electrofóresis de gel y análisis Western blot. En los experimentos de control, la coinmunoprecipitación de mGluR5 fue bloqueada preincubando las perlas unidas de antiHomer con 50 \mug de proteína de fusión GST Homer durante 1 hora a 4ºC.

Ejemplo 8 Inmunohistoquímica

Fueron anestesiadas ratas de seis semanas y fueron perfundidas con paraformaldehído del 4%. Los cerebros enteros fueron eliminados y colocados en fijador durante una hora y luego en sacarosa del 30% durante 72 horas. Fueron cortadas secciones de 35 \mum usando un micrótomo de cortes, fueron bloqueadas y permeabilizadas durante una hora en 1% de leche en polvo y 5% de suero de cabra normal en PBS con 0,1% de Triton. Las secciones fueron incubadas en anticuerpo primario durante 24 horas, fueron lavadas y fue realizada tinción con inmunoperoxidasa con el kit ABC de Vectastain Elite (Laboratorios Vector, Inc., Burlingame, CA). La eliminación del primario o la preadsorción de Homer o antisuero de mGluR5 con los péptidos inmunogénicos bloqueó completamente la tinción. Los cultivos primarios del hipocampo fueron preparados a partir de crías de rata de 4 días después del parto. La tinción con GluR1 fue realizada usando el fragmento de FAB Cy3 marcado de un anticuerpo generado contra el péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 251-269. Las células fueron fijadas en paraformaldehído del 4% durante 1 h, fueron permeabilizadas con 0,1% de Triton y fueron incubadas con antisuero antiHomer de afinidad purificado a 4ºC de noche. Homer fue detectado por el anticuerpo de anticonejo de cabra acoplado a FITC (Laboratorios Vector, Inc., Burlingame, CA).

Ejemplo 9 Kits de ensayo A. Preparación de anticuerpos monoclonales

Se anestesian ratones Balb/c por inyección pentobarbital. Después del afeitado de la piel de la zona esplénica, la zona se limpia con etanol del 70% y se reviste con una gasa estéril impregnada de solución salina estéril isotónica. Una incisión cutánea de aproximadamente 1 cm en longitud se hace en la línea izquierda mediocapsular, seguido por la incisión de la vía abdominal y el peritoneo. Usando fórceps, un disco de nitrocelulosa, escindido de una mancha de nitrocelulosa de un gel que contiene la proteína Homer separada, se inserta en el bazo por la escisión y se mueve con cuidado distalmente hacia el extremo caudal hasta que el disco sea encajado completamente en el tejido esplénico. De forma alternativa, la proteína extraída se inyecta intraplenicalmente en un volumen de menos de 5 microlitros, o intraperitoneal, de acuerdo con métodos estándar. El bazo se observa para asegurarse de que no sangra excesivamente, y se devuelve a la cavidad peritoneal. La pared abdominal y la piel se suturan separadamente con 4-0 suturas interrumpidas de seda. De ocho a diez días más tarde los ratones son desangrados y el suero se analiza para obtener el título del anticuerpo contra las proteínas emparejadas por el peso molecular fraccionadas por electrofóresis preparatoria con SDS (Western blot). Si el título del anticuerpo es bajo, el procedimiento se repite.

Entonces, un anticuerpo que produce hibridoma se produce usando protocolos estándar. Por ejemplo, células de mieloma p3 x 63-Ag8.653 que provienen de ratones Balb/c (mieloma no secretante, resistentes a 8-azaguanina, HPRT) se fusionan de acuerdo con el protocolo de fusión estándar de PEG4000 (Merck, Filadelfia, PA) con esplenocitos inmunizados en una relación de mieloma:linfocito de 10:1 y las células se colocan en microplacas en un medio que contiene HAT, y 10% de medio condicionado a partir de línea de macrófago de murina J774. 1 pulsada con LPS.

Polipéptidos relevantes separados en SDS-PAGE preparatoria y eluidos a partir de ahí son usados para comprobar la especificidad de los anticuerpos monoclonales generados. Por lo general, el eluato que contiene de 30 a 80 \mug/ml de proteína parcialmente purificada se aplica a los pocillos del microtítulo y se incuban, por ejemplo, durante 2 horas a 37ºC seguido por 2 horas a 4ºC. Después del lavado, el sobrenadante de cada pocillo de hibridoma se añade y se incuba durante 1 hora a 4ºC, luego se lava varias veces con PBS. El "segundo" anticuerpo de inmunoglobulina de cabra-anti-ratón fluorinado se añade, luego se lava, y la unión se controla por fluorometría.

Los clones de hibridoma positivos se amplian, se clonan de nuevo, y se inyectan en ratones Balb/c tratados con pristano para la producción a gran escala del anticuerpo (ascitis). El anticuerpo del fluido de ascitis se purifica en columnas de proteína A o G (de acuerdo con el isotipo de Ig).

B. Inmunoensayo en fase sólida

La Homer de rata purificada se diluye en un tampón de dilución estándar de revestimiento, tal como solución salina tamponada de fosfato (PBS) y se reviste en una fase sólida, tal como una placa de microtítulo, seguido por el bloqueo de los sitios de unión de la placa abiertos con una proteína no emparentada tal como albúmina de suero bovino o caseína, de acuerdo con métodos estándar. mGluR entonces se añade a la placa en ausencia o presencia de un compuesto de ensayo. La detección de mGluR unido a la proteína de activación sináptica se logra por marcaje directo del mGluR o por adición subsecuente de un reactivo de unión marcado, específico a MGluR, tal como un anticuerpo monoclonal o policlonal específico para mGluR. Un compuesto de ensayo se selecciona para el desarrollo del fármaco si éste altera considerablemente la unión entre las proteínas.

<110> The Johns Hopkins University

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<120> Composiciones y método de proteínas de activación sináptica

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<130> D 2451 EP

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<140> PCT/US98/04983

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<141> 1998-03-13

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<160> 15

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 558

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<212> ADN

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<213> Rattus norvegicus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)... (558)

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<400> 1

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1

2

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<210> 2

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<211> 186

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 2

3

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<210> 3

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<211> 50

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

4

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<210> 4

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<211> 153

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

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5

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<210> 5

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Eucariota

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (0)... (0)

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<223> C-terminal del receptor metabotrópico del glutamato, mGluR1-alfa.

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<400> 5

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\sa{Arg Asp Tyr Lys Gln Ser Ser Ser Thr Leu}

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<210> 6

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Eucariota

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (0)... (0)

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<223> C-terminal del receptor metabotrópico del glutamato, mGluR2.

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<400> 6

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\sa{Glu Val Val Asp Ser Thr Thr Ser Ser Leu}

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<210> 7

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Eucariota

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (0)... (0)

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<223> C-terminal del receptor metabotrópico del glutamato, mGluR3.

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<400> 7

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\sa{Glu Val Leu Asp Ser Thr Thr Ser Ser Leu}

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<210> 8

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Eucariota

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (0)... (0)

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<223> C-terminal del receptor metabotrópico del glutamato, mGluR4.

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<400> 8

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\sa{Thr Tyr Val Thr Tyr Thr Asn His Ala Ile}

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<210> 9

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Eucariota

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (0)... (0)

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<223> C-terminal del receptor metabotrópico del glutamato, mGluR5.

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<400> 9

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\sa{Arg Asp Tyr Thr Gln Ser Ser Ser Ser Leu}

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<210> 10

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Eucariota

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (0)... (0)

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<223> secuencia de unión peptídica

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<400> 10

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\sa{Ser Ser Thr Leu}

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<210> 11

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Eucariota

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (0)... (0)

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<223> secuencia de unión peptídica

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<400> 11

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\sa{Ser Ser Ser Leu}

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<210> 12

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (0)... (0)

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<223> posiciones 31-34 de SEQ ID NO: 2

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<400> 12

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\sa{Ala Val Thr Val}

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<210> 13

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (0)... (0)

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<223> posiciones 31-34 de SEQ ID NO: 3

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<400> 13

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\sa{Gly His Arg Phe}

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<210> 14

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> dominio similar a PDZ

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<400> 14

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\sa{Gly Leu Gly Phe}

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<210> 15

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> péptido de unión al C-terminal

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<400> 15

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\sa{Thr Ser Ser Leu}

Claims

1. Un polipéptido, caracterizado por (i) expresión enriquecida durante la actividad sináptica en el cerebro de mamíferos, (ii) la presencia de un dominio de unión tipo PDZ, y (iii) una secuencia que es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 2.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, que además exhibe una capacidad de unirse selectivamente a una proteína de membrana sináptica que tiene una región peptídica del extremo C seleccionada del grupo que consiste en SSSL y SSTL.

3. El polipéptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha identidad de secuencia es de al menos aproximadamente el 90%.

4. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polipéptido tiene la secuencia SEQ ID NO: 2.

5. Un polinucleótido capaz de codificar un polipéptido como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector que contiene un polinucleótido como se define según la reivindicación 5.

7. El vector de la reivindicación 6, en el que dicho polinucleótido tiene la secuencia SEQ ID NO: 1.

8. Un método para seleccionar un compuesto que interfiere con la unión de una proteína de activación sináptica a una proteína de unión celular en el sistema nervioso central de mamíferos, que comprende:

(a): añadir un compuesto de ensayo a una mezcla de reacción que contiene: (i) una proteína de activación sináptica definida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, (ii) una proteína de unión a la cual dicha proteína de activación sináptica se une, y (iii) un medio para detectar la unión entre dicha proteína de activación sináptica y dicha proteína de unión;

(b): medir la unión entre dicha proteína de activación sináptica y dicha proteína de unión,

(c): seleccionar dicho compuesto si la unión medida es mayor o menor que la unión medida en ausencia de dicho compuesto de ensayo.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicha proteína de unión es un receptor metabotrópico de glutamato que incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SSSL y SSTL.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicha proteína de unión de mGluR se expresa en células, y dicha unión entre dicho receptor y dicha proteína de unión se mide midiendo la actividad de fosfoinositidasa C (PI-PLC) en dichas células.

11. Un kit que comprende un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un polinucleótido de la reivindicación 5 o un vector de la reivindicación 7.

12. El kit de la reivindicación 11 que es un kit de diagnóstico.

13. El uso de un kit de las reivindicaciones 11 ó 12 para medir los niveles de la proteína de activación sináptica o para identificar fármacos capaces de realzar o inhibir la interacción entre proteínas de activación sináptica y sus sitios de unión celulares.