JPH10513441A

JPH10513441A - 哺乳類宿主の結合組織を治療するための遺伝子導入

Info

Publication number: JPH10513441A
Application number: JP8523081A
Authority: JP
Inventors: シー．グロリオソ，ジョセフ; エイチ．エバンズ，クリストファー; ディ．ロビンズ，ポール
Original assignee: University of Pittsburgh
Current assignee: University of Pittsburgh
Priority date: 1995-01-27
Filing date: 1996-01-25
Publication date: 1998-12-22
Also published as: EP0806967A1; CA2211833A1; US5858355A; WO1996022793A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳類宿主の治療に用いられる哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ、生成物をコード化する１以上の遺伝子を導入する方法に関するものであり、その方法は、組換え技術を用いて、生成物をコード化する遺伝子を含むＤＮＡベクター分子を生成し、生成物をコード化する遺伝子を用いるＤＮＡベクター分子を用いて、哺乳類宿主の結合組織を感染させるものである。生成物をコード化する１以上の遺伝子を、非ウイルス性手段を用いて、哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ導入するための方法が提供されている。結合組織の病理を研究するための動物モデルを生成する方法もまた記載されている。更に、本発明は、インターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域をコード化する遺伝子をインビボで用いる方法を提供している。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳類宿主の結合組織を治療するための遺伝子導入関連出願本願は、１９９３年３月８日出願であって、現在継続している米国特許出願第０８／２７７５０号の一部継続出願及び１９９４年１月１８日出願に係る米国特許出願第０８／１６３５６３号の一部継続出願である。後者出願は、１９９２年１０月２０日出願であって、現在放棄されている米国特許出願第０７／９６３９２８号の継続出願である。該出願は１９９０年１２月２０日出願であって、現在放棄されている米国特許出願第０７／６３０９８１号の継続出願である。発明の背景本発明は、生成物(product)をコード化した少なくも１つの遺伝子を、哺乳類宿主の結合組織の少なくとも１つの組織へ導入し、哺乳類宿主を処置する方法に関するものである。この方法は生成物をコード化した遺伝子を含有するＤＮＡベクター分子を用いること、及び哺乳類の結合組織に、ＤＮＡベクター分子を用いて感染させることを明らかにする。本発明は、生成物をコード化した少なくとも１つの遺伝子を哺乳類の宿主の結合組織の少なくとも１つの細胞中へ導入し、哺乳類の宿主の処置に用いる方法であって、該導入を起こすために非ウィルス性手段の使用を含んでいる。本発明は、関係あるＤＮＡ列を哺乳類宿主の結合組織細胞へ配列するために、エキスビボ法及びインビボ法を開示する。エキスビボ法では、目標の自己由来の結合組織細胞を予め取り出して培養し、インビトロでＤＮＡ列を感染させ、ＤＮＡベクター又は目的とする他の配列媒体(delivery vehicle)を結合組織細胞へ加え、変更された結合組織細胞の哺乳類宿主の目標連結点へ移植し、目的の生成物遺伝子の発現をインビボで生じさせる。インビボ方法は、目標の結合組織細胞をインビトロで培養する必要工程を回避し、その代わりにＤＮＡ列の直接移植によって行い、ＤＮＡベクター又は他の配列媒体を目標の結合組織細胞へインビボで加え、この様にして目的の生成物遺伝子の発現を起こさせる。本発明は、結合組織の病理研究及び炎症の全身性示標の研究のための動物モデルを生成する方法に関するものである。本発明は更に、関節に関連して、有害な病理学上の変化に抵抗するために、末端を切ったインターロイキン−１レセプターをコード化した遺伝子を使う方法に関するものである。具体的には、本発明は、インターロイキン−１レセプターの細胞外のインターロイキン−１の結合領域について、遺伝子コードを哺乳類宿主の滑膜細胞へインビボで導入し、軟骨及び他の軟質組織上でインターロイキン−１の破壊的な活動を中和する方法に関するものである。別手段として、患者自身の滑膜細胞をインビトロで形質導入し、そして冒されている関節へ戻すことが行われる。このとき関節内注射の如き移植操作を行う。滑膜をインビトロで操作することに代えて、目的の生成物をコード化した遺伝子をリポソームに導入し、関節箇所へ直接に注射する方法がある。このときリポソームは滑膜細胞と融合して、インビボで滑膜組織へ遺伝子転換が起こる。滑膜のインビトロ取り扱いに付随して、目的生成物をコード化した遺伝子は、裸のＤＮＡとして関節箇所へ導入される。該裸ＤＮＡは、滑膜細胞中へ入って、インビボで滑膜組織へ遺伝子移入(transfer)がされる。更に他の方法として、造血原種細胞又は成熟したリンパ細胞又は骨髄細胞が、インビトロで当業者に周知な技術を用いて複製され、集められ、患者の骨髄へ注射が行われる。簡単な説明関節学は、通常痛みを伴い、しばしば構造が変形した関節の炎症を取り扱う。関節学は、炎症、免疫障害、外傷、骨関節症などの変成関節病を含む多くの状況から必要とされ、関連を有している。関節の軟骨退化の生化学と、細胞質変化には多くの研究がなされてきた。健全な関節の場合、軟骨中の細胞（軟骨細胞）と、包囲している滑膜（滑膜細胞）は安定した状態にある。この安定状態では、これら細胞はプラスタグランジンＥ２と、コラゲアーゼ、ゲラチナーゼ、ストロンメリシンのごとき各種中性プロテイナーゼが軟骨退化の可能性を伴って、基礎的レベルで分泌する。関節炎症状が拡大しているとき、これら細胞は活性化される。活性状態では、滑膜細胞と軟骨細胞は、多量のプラスタグランジンＥ２、及び、中性プロテイナーゼを合成し分泌する。病理生理学的に細胞活性剤に関するものを見つける研究の過程で、チトキンインターロイキン−１が軟骨細胞と滑膜細胞を活性化し、インビトロ及びインビボで軟骨の崩壊をもたらすことが知られた。更に、インタロイキン−１は滑膜細胞にとって成長要因であり、その組織の合成を促進し、関節炎を伴う滑膜中の肥大によって、インターロイキン１の併発を示唆している。対照的にインタロイキン１は、軟骨細胞による軟骨組織の合成を抑制し、よって軟骨の修復を抑制する。インターロイキン−１は又、骨の吸収を誘発し、リュウマトイド関節炎に見られる骨密度の減少が説明される。インターロイキン−１は、炎症性であってリンパ球の成長要因として役立ち、化学作戦の要素であり、多形核白血球（ＰＭＮ₅）の促進剤となる可能性がある。十分な濃度で存在すれば、インターロイキン−１は発熱、筋肉萎縮、催眠を起こすことができるかもしれない。関節中において、インターロイキン−１の主な発生源は滑膜である。インターロイキン−１は残留性滑膜細胞によって分泌される。該滑膜細胞は、大食細胞とその他の白血細胞によって炎症状態で集まっている。「ヘンステロイド高炎症性薬品」（ＮＳＡＩＤｓ）として特定される薬品の開発に多大な努力が払われた。ＮＳＡＩＤｓは、軟骨の合成を抑制し炎症の修復と調節を行う。ＮＳＡＩＤｓの機構は、身体組織中において、プラスタグランジン合成の抑制と関係があるように思われる。この開発の大部分は、アラキドン酸からプラスタグランジン先駆物質(エンドペロキシド)の形成に、触媒的に働く要となる酵素、環状酸素酵素の一層良好な合成に費やされた。プラスタグランジンは又、炎症中、白血球の侵入割合と程度を調節する役割を果たしていると信じられている。ＮＳＡＩＤｓには、例えば、次の物が含まれる。アセチルサルチル酸(アスピリン)、フェノプロフェンカルシウム(ナルフォン(商標)、パルバレス(商標) ，ディスタプロダクツ社)、イヴプロフェン(モトリン(商標)，ジアップジョン社 )、インドメサシン(インドーシン(商標)、マークシャープ＆ドーム社)。対照的に、本発明が基本とする研究によって、たとえプラスタグランジンの合成が完全に阻止されていても、軟骨を低品質にする各種の中性蛋白質分解酵素の生成が起こることが示された。哺乳類宿主内の特定部位、例えば関節に対し、ＮＳＡＩＤｓのごとく、目標薬剤が使用できないため、関節炎に対する治療が妨げられる。関節炎薬剤を運ぶために、例えば、経口、静脈内又は、筋肉内投与などの従来の薬剤投与の方法は、滑膜の血液循環に依存している。この方法は効果的ではない。なぜなら、小分子の滑膜の移動である、滑膜毛管から関節空間への移動は、一般的に受動的な拡散によって起こるからである。この拡散は、目標分子の大きさが大きくなる程効果が落ちる。従って、蛋白のような大分子の薬剤を関節空間へ近づけることはほとんどできない。薬剤を関節内へ注射することは、これら制約を解消する。しかしながら、関節内へ取り入れた薬剤の半減期は通常短い。薬剤を関節内へ注射することのもう一つの問題は、関節炎のような慢性状態を治療するために、関節空間において所定の薬剤レベルを確保するには、頻繁に注射を繰り返すことが必要である。これまでの治療薬は、選択的に関節に対して集中することはできなかったから、哺乳類宿主の全身を高濃度の薬剤にさらして、関節内治療投与を行うことが必要であった。目標でない組織をこの様な措置にさらすために、抗関節炎薬剤の影響が、胃腸の吐き気、哺乳類宿主の血液、心臓血管、肝臓、腎臓に変化をきたすなどの副作用を生じた。遺伝子物質を哺乳類細胞中へ、化学的又は、生物的手段によって導入(introdu ce)できることが示された。しかも、導入された遺伝子物質は、宿主細胞によって、高レベルの特定蛋白質が合成できるものとして表現されることが示された。導入された遺伝子物質を保有する細胞は、抗生物質抵抗性の遺伝子を含み、従って、対応する抗生物質の存在下で、形質導入(transduced)された細胞を優先的に成長させる選択可能なマーカーを提供する。インターロイキン−１の生成を規制する化合物も知られている。米国特許第４７７８８０６号は、インターロイキン−１の生成を抑制する方法を開示しており、それは非経口的な手段によって、２−２′−［１，３−プロパン−２−オネデーィル(onediyl)−第２(チオ)］第２−１Ｈ−イミダゾール又は薬学的に許容されるこれの塩を投薬した人の単核細胞及び／又はマクラファージを用いる。この特許は、インターロイキン−１の生成を抑制する化合物を開示している。これと対照的に本発明の１つの実施例では、遺伝子治療によって、インターロイキン−１に結合し、中性化させるものである。米国特許第４７８０４７０号は、インターロイキン−１の生成を規制する方法を開示しており、それは４，５−ジアリル−２（置換）イミダゾールを投与し、人の単核細胞を用いるものである。この特許もまた、インターロイキン−１の生成を規制する化合物を開示している。米国特許第４７９４１１４号は、人の経路中にて、５−リポキシゲナーゼを規制する方法を開示しており、それはチアゾールと融合したジアリル−置換イミダゾール，ピロリジン，ピペリジンリング，又は薬学的に許容されるこれらの塩を投薬するものである。この特許は又インターロイキン−１の生成を抑制する化合物を開示している。米国特許第４８７０１０１号は、インターロイキン−１の放出を抑制し、間接状態のインタロイキン−１を緩和する方法を開示しており、それは薬学的に許容される抗酸化剤例えばジサルフィラム，テトラキス［３−(２，６−第３ブチル −４−ヒドロキシフェニール)プロピオニロキシメチル］メタン又は２，４−ジ −イソブチル−６−(Ｎ，Ｎ−ジ−メチルアミノメチ)−フェノール等の薬学的に許容される抗酸化剤化合物の有効量を投薬するものである。この特許も又、インターロイキン−１の放出を抑制する化合物を開示するものである。米国特許第４８１６４３６号は、インターロイキン−１を抗関節炎薬として使用する方法を開示している。この特許は、インターロイキン−１を薬学的な経験のもとで関節炎又は炎症の措置のために、間接内へ注射投薬することを記載している。これとは異なり本発明は、関節炎に抵抗する方法としてインターロイキン−１に結合し、中性化することが出来る遺伝子を作り、これを使用する方法を開示するものである。米国特許第４９３５３４３号は、インターロイキン−１βを検出する免疫検出法を開示している。これはインターロイキン−１βとは結合するが、インターロイキン−１αとは結合しないモノクロナール抗体を使用するものである。この特許はモノクロナール抗体はインターロイキン−１βと結合し、そのインターロイキン−１βがインターロイキン−１レセプターとの結合を妨げる。従ってインターロイキン−１βの生物学的活動を阻止することを開示している。この特許に開示されたモノクロナール抗体はＤＮＡ組換え技術を使用する遺伝子工業によってイムノゲンを生産することにより得られる。イムノゲンはマウスに注射され、その後マウスの脾臓細胞は骨髄腫細胞と融合することによって、不滅化する。その細胞はハイブリッドな連続細胞線（ハイブリドーマ）を含んでおり、それはモノクロナール抗体のため、その後スクリーンされる。この特許は、発明に係るモノクロナール抗体を治療のため、例えば患者の免疫法に使用すること又は、モノクロナール抗体は毒素と結合して毒素免疫(i mmunotoxin)を形成し、又は放射性材料或いは薬剤と結合して、放射性薬剤又は薬剤を形成することが述べられている。米国特許第４７６６０６９号は、ヒトインターロイキン−１遺伝子ＤＮＡシーケンスを含むＤＮＡシーケンスを具えたＤＮＡ組換え体クローニング賦形剤を開示している。この特許は、ヒトインターロイキン−１βを形成する方法を提供し、ヒトインターロイキン−１βを回収するものである。この特許は、人体中にてインターロイキン−１がＴ−細胞とＢ−細胞へ浸透することが出来、免疫グロブリン合成を増大することが出来るから、インターロイキン−１を免疫学の試薬として、使用することを開示している。米国特許第４３９６６０１号は、遺伝子による更なる可能性として哺乳類宿主を用いる方法を開示する。この特許は回収可能な宿主細胞が宿主から除去され、少なくとも１つのマーカーを含む遺伝子材料によって処置するものである。該マーカーは、遺伝子材料が発現し、複製出来る宿主細胞の選択的な利点を有するものである。この特許は変形された宿主細胞は再生状態にある宿主へ戻される。と述べている。本発明では遺伝子物質は(a).宿主細胞へインビボで、又は(b).滑膜細胞へインビトラで、直接に導入され、その後患者の関節へ移植(transplant)して戻されるものである。米国特許第４９６８６０７号は、インターロイキン−１の結合能力を発現する哺乳類インターロイキン−１レセプター蛋白質をコード化したＤＮＡシーケンスを開示している。米国特許第５０８１２２８号は、ネズミとヒトインターロイキン−１レセプターの両方をコード化したＤＮＡシーケンスを開示している。この特許はまた、該ＤＮＡシーケンスをインビトロで発現する方法を開示している。米国特許第５１８０８１２号は、ヒトインターロイキン−１レセプター蛋白質の殆んど純粋な標本を開示している。これら従来技術の開示にも拘わらず、生成物をコード化した少なくとも１つの遺伝子を哺乳類宿主の結合組織の少なくとも１つの細胞へインビトロで、又はそれに代えてインビボで導入し、哺乳類宿主の処置に用いる方法について非常に切実な、実際上の必要性があった。更に末端を切断したインターロイキン−１レセプターをコード化した遺伝子を用いて、関節炎に関連した有害な病理学上の変化に抵抗する方法が必要とされた。具体的には特にインターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域の遺伝子コードであって、インターロイキン−１と結合出来、そしてインターロイキン−１を中性化出来るものを、インビボで宿主滑膜細胞中で発現する方法が必要とされた。また、例えば滑膜細胞の如き目的宿主結合組織細胞中で、１以上のＤＮＡシーケンスを追加的に供給(d eliver)し、蛋白質または蛋白質断片を発現させることによって、各種関節病理学や、炎症の随伴性全身的示標に有効な方法が必要とされた。本発明は、上記した従来の要望に合致するものである。生成物をコード化した少なくとも１つの遺伝子を哺乳物宿主の結合組織の少なくとも１つの細胞へ導入し、哺乳類宿主を処置する方法が本願発明に於いて提供される。この方法には、生成物をコード化した遺伝子を含有するＤＮＡベクター分子を形成し、組換え体技術を用いること、及び生成物のために遺伝子コードを含有するＤＮＡベクター分子を使用して哺乳類宿主の結合組織細胞を感染させることを内容とする。ＤＮＡベクター分子はそれが配置され、目標細胞又は組織中に保持されるものであって、目的生成物のコード化した遺伝子が安定して発現出来るものであれば、任意のＤＮＡ分子が使用出来る。本願発明に用いられたＤＮＡベクター分子は、ウィルス性ＤＮＡベクター分子又はプラスミドＤＮＡウィルス分子である。この方法は、生成物をコード化した遺伝子を治療のために哺乳類結合組織の細胞へ導入することを含むのが望ましい。この明細書に開示されている結合組織障害を処置する１つのエキスビボ方法は、まず蛋白質又は生物学的に活性な蛋白質の断片をコード化したＤＮＡシーケンスを含むウィルス性ベクター組換え体を作る。このウィルス性ベクター組換え体は次に、インビトロで培養された結合組織細胞の母集団の感染に使用され、形質転換(transfe ct)された結合組織の母集団を作る。これら形質転換移入された結合組織細胞は次に哺乳類宿主の目標である関節空間へ移植(transplant)され、該関節空間内にて蛋白質又は蛋白質断片の発現を起こす。目標のＤＮＡシーケンスの発現は少なくとも１つの病理学的に有害な関節又は通常障害のある結合組織と関連している炎症の示標を実質的に減少させる事に有効である。結合組織細胞は、滑膜、軟骨、腱、靱帯、望ましくは滑膜細胞からなるグループの結合組織の中から選んだものである。またウィルス性ベクターとして、ＭＦＧの如きレトロウィルス性ベクターを用いることが望ましい。このエキスビボ法に於いて、形質導入(transduce)細胞の移植は関節内注射によって行なうことが望ましい。通常の知識を有する技術者であれば、人間の患者の措置のために細胞の望ましい入手源としては、患者自身の細胞例えば自己由来の滑膜細胞であることは理解出来るであろう。更に具体的には、この方法は遺伝子として次のグループから選ばれた少なくとも１つの材料をコード化出来る遺伝子を用いる。即ち(a).拮抗筋蛋白質又は生物学的に活性な誘導体又はその断片、望ましくはＭＦＧ−ＩＲＡＰのヒトインターロイキン−１レセプター、(b).ベーターガラクトシーターゼ蛋白質又はそれの誘導体又は断片であって生物学的に活性なものをコード化出来るＬacＺマーカー遺伝子、(c).蛋白質又は生物学的に活性なそれの誘導体或いは断片の易溶性インターロイキン−１レセプター、 (d).蛋白質又はそれの誘導体或いは断片であって生物学的に活性なものの易溶性ＴＮＦ−αレセプター、(e).プロテナーゼインヒビター、(f).サイトカイニンである。そして次のグループの中から選択された少なくとも１つのウィルスベクターを用いる。(a).ＭＦＧとＢＡＧを含む群から選ばれた少なくとも１つの材料を含むレトロウィルス性ベクター、(b).腺に関連するウィルス、(c).アデノウィルス、(d).ヘルペス単体１又はヘルペス単体２を含むが、これらに限定はしないヘルペスウィルス。本発明の更なる実施例としては、遺伝子として次の群の中から選ばれた少なくとも１つの材料を、コード化出来る遺伝子を用いる。(a).拮抗筋蛋白質又は生物学的に活性なこれらの誘導体又は断片のヒトインターロイキン−１レセプター。 (b).ベータガラクトシダーゼ蛋白質又は生物学的に活性なこれの誘導体又は断片をコード化出来るＬacＺマーカー遺伝子。(c).蛋白質又は生物学的に活性なこれの誘導体又は断片の易溶性インターロイキン−１レセプター。(d).蛋白質又は生物学的に活性なこれの誘導体又は断片の易溶性ＴＮＦ−αレセプター。(e).プロテナーゼインヒビター。(f).サイトカイニンである。そしてＤＮＡプラスミドベクターとして、当該技術分野に於いて通常の知識を有する者が知っている任意のＤＮＡプラスミドベクターであって、目的の細胞中又は配置された組織中にて、配置手段の如何に拘わらず安定して保持されることが出来るものが用いられる。ＤＮＡベクター分子がウィルス性であるかプラスミドＤＮＡベクター分子であるかによって、目標の細胞又は組織へ直接に実施される。この方法は又遺伝子として次の群中から選ばれた少なくとも１つの材料をコード化出来る遺伝子を用いる。(a).拮抗筋蛋白質又は生物学的に活性なこれの誘導体又は断片のヒトインターロイキン−１レセプター。(b ).β−ガラクトシダーゼ蛋白質又は生物学的に活性なこれの誘導体又は断片をコード化出来るＬacＺマーカー遺伝子。(c).蛋白質又は生物学的に活性なこれの誘導体又は断片の易溶性インターロイキン−１レセプター。(d).蛋白質又は生物学的に活性なこれの誘導体又は断片の易溶性ＴＮＦ−αレセプター。(e).プロテイナーゼインヒビター。(f).サイトカイシン。実施例として開示し、本発明を制限するものではないが、ある具体例では、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）コードシーケンスを含むＤＮＡプラスミドベクターは、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータの下流側で結索された。このＤＮＡプラスミド構造は、リポソームカプセルに含まれ、被験動物であるウサギの膝関節中へ関節内注射された。ＩＬ−１βは発現し、可成りの量のインターロイキン−１ βが滑膜組織から回収された。別のやり方としては、裸のプラスミドＤＮＡの注射を膝関節に行ない、ＤＮＡを滑膜組織へ直接移入させことである。哺乳類宿主の関節へＩＮ−１βの注射を行なうことは、長期間各種の関節病理学と、明細書に記載したとおり、全身的な感染の示標を研究することが出来る。本発明の他の実施例では、生成物をコード化した少なくとも１つの遺伝子を哺乳類宿主の結合組織の少なくとも１つの細胞へ導入することによって、哺乳類宿主を処置する方法を提供するものである。この方法は、生成物をコード化した遺伝子を非ウィルス性手段を用いて結合組織細胞へ導入するものである。更に具体的にはこの方法は、次に示す少なくとも１つのグループから選ばれた非ウィルス性手段を用いることを内容としており、該グループは、(a).少なくとも１つのリポソーム、(b).Ca₃(PO₄)₂、(c).電気ポレーション(electroporation) 、(d).ＤＥＡＥ−デキストランからなる。そして遺伝子として、次のグループから選ばれた少なくとも１つの材料をコード化することが出来る遺伝子を用いることを内容とする。(a).拮抗筋蛋白質又は生物学的に活性な誘導体又はその断片のヒトインターロイキン−１レセプター。(b).ベーターガラクトシダーゼ蛋白質又は生物学的に活性な誘導体又はその断片をコード化出来るＬacＺマーカー遺伝子。(c).蛋白質又は生物学的に活性な誘導体又はその断片の易溶性インターロイキン−１レセプター、(d). 蛋白質又は生物学的に活性な誘導体又はその断片の易溶性ＴＮＦ−αレセプター、(e).プロテイナーゼインシビター、(f)．サイトカイエン。本発明の実施例では、生成物をコード化する少なくとも１つの遺伝子を哺乳類宿主の結合組織の少なくとも１つの細胞へ導入することによって、哺乳類宿主の処置に使用する方法を提供している。この追加方法に於いてはＤＮＡベクター分子を目的細胞又は組織に供給するためにウィルスを使用する生物学的手段を用いることを内容とする。望ましくはウィルスは偽ウィルスであり、ゲノムは変更されて、偽ウィルスは配置が出来るだけであって、目標の細胞内では安定して保持される。しかし目標の細胞又は組織内では複製を作る能力は保持していない。この変更されたウィルス性ゲノムは組換え体ＤＮＡ技術によって更に操作され、ウィルス性ゲノムは目的の異種遺伝子を含むＤＮＡベクター分子として働き、目標の細胞又は組織中で発現する。この方法は又、遺伝子として次のグループから選ばれた少なくとも１つの材料をコード化出来る遺伝子を用いるものである。該グループは(a).拮抗筋蛋白質又は生物学的に活性な誘導体又はその断片のヒトインターロイキン−１レセプター、(b).β−ガラクトシダーゼ蛋白質又は生物学的に活性な誘導体又はその断片をコード化出来るＬacＺマーカー遺伝子、(c).蛋白質又は生物学的に活性な誘導体又はその断片の易溶性インターロイキン−１レセプター、(d).蛋白質又は生物学的に活性な誘導体又はその断片の易溶性ＴＮＦ−αレセプター、(e)．プロテイナーゼインヒビター、(f)．サイトカイン。本発明の他の実施例は、結合組織病理学、全身的な印象の示標を研究するための動物モデルを提供する。このモデルはエキスビボ又はインビボ法で目的生成物をコード化した少なくとも１つの遺伝子又はＤＮＡシーケンスを哺乳類宿主の結合組織の少なくとも１つの細胞へ供給するために用いられる。あらゆる意味にいて限定する訳ではないが、本発明において研究される関節病理学の例の中には白血球増加症、滑膜炎、軟骨の破壊、軟骨組織合成の抑制の如き関節病理学が含まれる。全身的炎症の示標には決してこれに限定する訳ではないが、エリストサイト沈降比、発熱、体重減少等が含まれる。本発明の実施態様には関節病理学の研究のため動物モデルを生成する方法が含まれる。この実施態様に於いては、蛋白質又は生物学的に活性なそれの断片をコード化したＤＮＡシーケンスを含むウィルスベクター組換え体を作り、該組換え体ウィルスベクターを培養した結合組織細胞の母集団へインビトラで感染させ、移入された結合細胞の母集団とし、該移入された結合細胞を哺乳類宿主の関節へ移植する。それによって該関節空間内での蛋白質の発現が少なくとも１つの有害な関節病理又は結合組織の障害と通常関連する感染示標を実質的に低下させる。この実施態様の結合組織細胞はまた滑膜、軟骨、腱、靱帯から構成される結合組織のグループの内、望ましくは滑膜細胞から選択され、限定する訳ではないが、目的の関節が存在する哺乳類宿主から拮抗筋細胞を直接に取り出す。この明細書を通じて開示されているその他のエキスビボを基本とする方法については、滑膜細胞のように導入された結合細胞を移植する望ましい方法としては、関節内注射を用いる。動物モデル研究のために実施態様として示すＤＮＡシーケンスはヒトＩＬ−１α又は生物学的に活性なそれの断片をコード化したＤＮＡシーケンスである。動物モデル研究のためのＤＮＡシーケンスの実施態様としては、人間の腫瘍の壊死したファクターα又は生物学的に活性なそれの断片をコード化したＤＮＡシーケンスである。医学の研究のため動物モデルを作る方法の他の実施例は、ＤＮＡ組換え体プラスミドベクターを使用する。これは人間蛋白質又は生物学的に活性なそれの断片をコード化した目的のＤＮＡシーケンスを含んでいる。このＤＮＡ組換え体プラスミドベクターは培養された結合組織細胞の母集団をインビトラで変換するのに用いられる。変換された結合細胞望ましくは滑膜細胞は哺乳類宿主の関節空間へ移植され、よって様々な関節病理に関するデータと結合組織障害に関連する炎症の全身的示標を提供する。特にこの実施例は、ＭＦＧ−ＩＬ−１βを目標のウサギの膝関節へエキスビボによって供給し、よって様々な関節病理と炎症の全身的示標を生じさせる。本発明の実体的な実施態様の他の例は、ＧＭＶ−ＩＬ−１βプラスミド構造を、リポソーム媒介供給法によって、ウサギの膝関節へ供給する。この明細書に記載され、例示した動物モデルは、明細書を通じて開示した各種遺伝子治療法の可能性を測定し、関節病理に関する公知の原因物質（例えばＩＬ −１β）からの攻撃と炎症の副作用に対する抵抗をはかる。本発明の更なる実施態様では、生物学的に活性なインターロイキン−１レセプター拮抗筋（ＩＲＡＰ）又はその一部をコード化したＤＮＡシーケンスを使用して、関節病理の結合組織の治療に使用する。ＩＲＡＰ又は生物学的に活性なその断片をコード化したＤＮＡシーケンスは、様々なベクターの作戦とこの明細書を通じて開示された変換技術によって哺乳類宿主の結合組織に供給される。目標関節空間へＩＲＡＰを供給する望ましい方法の実施例では、この明細書に開示しているイクスビボ技術によってレトロウィルス性ベクターを使用し、哺乳類宿主の滑膜内層へＩＲＡＰ遺伝子を供給することを内容とする。換言すれば目的の機能ＩＲＡＰ蛋白質又は蛋白質断片をコード化したＤＮＡシーケンスは選択したレトロウィルス性ベクターへ配置して準クローン化（subcloned）され、ウィルス性ベクター組換え体は適当な力価へ成長して、培養された滑膜細胞をインビトロで感染させるのに用いられ、変換された滑膜細胞、望ましくは自己移植細胞は目的の関節へ望ましくは関節内注射によって移植される。本発明の他の望ましい方法では、ＩＲＡＰ遺伝子をインイボで直接にアデノウィルスベクター，アデノ関連ウィルスベクター(ＡＡＶ)，又はヘルペス単体，ウィルスベクター（ＨＳＶ）を使って哺乳類宿主の滑膜内層へ配置することを内容とする。換言すれば機能ＩＲＡＰ蛋白質又は蛋白質断片をコード化した目的のＤＮＡシーケンスは、各々ウィルス性ベクターへ移して準クローン（subcloned）とし、ウィルス性ベクターを含むＩＲＡＰは適当な力価に成長して関節空間へ直接に、望ましくは関節内注射によって供給される。ＭＦＧ−ＩＲＡＰの如きレトロウィルス性−ＩＲＡＰ構造もまた関節空間内にて予め炎症を起こした目標の結合組織細胞へ直接に使用出来るかもしれない。目的の遺伝子を含むＤＮＡ分子を関節へ直接に関節内注射すると、レシピエントの滑膜細胞を形質転換し、滑膜細胞（実施例の項で開示する）を含むＤＮＡベクター移植と同じく除去、インビトラでの培養、形質変換、選択の必要が回避され、目的の異種遺伝子の安定した発現を促進する。ＤＮＡ分子を目標の関節滑膜組織へ送る方法には、これに限定する訳ではないが、ＤＮＡ分子を陽イオンリポソーム中へカプセル化したり、この明細書を通じて記載している様に、目的のレトロウィルス性ベクターへ目的のＤＮＡシーケンスを準クローニングすること。又は関節中へＤＮＡ分子自体を直接に注射する。が含まれる。ＤＮＡ分子はそれが膝関節へどのような形式で提供されるかに拘わらず、ウィルス性ＤＮＡベクター分子の組換え体又はＤＮＡプラスミドベクター分子組換え体としてＤＮＡベクター分子が提供されることが望ましい。異種の（heterologous）遺伝子の行動領域の上流の真核性（eukaryotic ）細胞中へ直接にプロモータ断片を挿入することにより、目的の異種遺伝子を確実に発現させる。この技術分野で通常の知識を有する者であれば、ベクター製造の公知の技術を用いてＤＮＡ分子を滑膜組織へ挿入して、適当なレベルで発現させることが出来るであろう。各種のウィルス性及び非ウィルス性ベクターをインビボでウサギの膝関節へ供給することは例１４に記載している。本発明の他の実施形態は、目的のＤＮＡシーケンスを明細書に開示した任意の方法によって哺乳類宿主の結合組織へ供給し、ヒトＴＮＦ−α、易溶性レセプター又は生物学的に活性なそれの断片をインビボで発現させる。本発明の他の実施形態は、目的のＤＮＡシーケンスを明細書中に開示した任意の方法によって、哺乳類宿主の結合組織へ提供し、これに限定する訳ではないが、インターロイキン−４及びインターロイキン−１０を含む抗炎症性及び免疫調整特質を有する各種サイトカインをインビボで発現させる。本発明の他の実施形態は、目的のＤＮＡシーケンスをこの明細書に開示された任意の方法によって哺乳類宿主の結合組織へ提供し、各種抗融合性（antiadhesi on）分子をインビボで発現させ、細胞−細胞及び細胞−組織間の作用を規制する。このような蛋白質又は蛋白質断片の例としては限定はしないが、易溶性ＩＣＡＭ−１及び易溶性ＣＤ４４がある。本発明の他の実施形態は、目的のＤＮＡシーケンスをこの明細書に開示された任意の方法によって、哺乳類宿主の結合組織へ適用し、限定はしないが、ＩＧＦ −１及びＴＤＦ−βを含む各種の軟骨成長要因をインビボで発現させる。本発明の他の実施形態は、目的のＤＮＡシーケンスを明細書に開示された任意の方法によって、哺乳類宿主の結合組織へ提供し、各種の自由ラジカル拮抗筋をインビボで発現し、痛風の関節内にて自由ラジカル構造の有害な効果を防止する。その例として、限定はしないが、ジスムターゼ過酸化物及びＮＯを規制する蛋白質又は蛋白質断片を含む。本発明の他の実施形態は、ＩＲＡＰ遺伝子を哺乳類宿主の滑膜内層へ供給することに関係し、目的のＤＮＡシーケンスをウィルス性ベクター例えば、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペス単体ウィルスにサブクローニングしたものを使用することを含む。ウィルス性ベクターを基本とするＩＲＡＰ組換え体の夫々はインビボ注射によって直接に関節へ供給され、ＩＲＡＰ蛋白質又は生物学的に活性なその断片をインビボで発現させる。本発明の他の実施形態は、インターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域をコード化した遺伝子を用いる方法を提供する。この遺伝子は、インターロイキン−１とインビボで結合し、中性化させることが出来、哺乳類宿主の軟骨の低質化に対して実質的な抵抗をする。従来の薬理学の努力と異なり本発明方法は、インビボの遺伝子治療であって、関節炎に対し、それを慢性的に弱める効果がある。切形（trancated）インターロイキン−１レセプターのため遺伝子のコード化を用いる本発明の方法は、切形インターロイキン−１レセプターの遺伝子を含む感染したレトロウィルス性粒体を作る細胞列を形成する。プロデューサ細胞列は遺伝子コードを適当な真核性プロモータの規則でレトロウィルス性ベクターへ挿入することによって作られ、遺伝子コードを含むレトロウィルス性ベクターをウィルス性粒体の製造のため、細胞列を包囲するレトロウィルスへ形質転換され、それは切形インターロイキン−１レセプターのため、遺伝子コードを発現でき、ウィルス性粒体を用いて哺乳類宿主の滑膜細胞を感染させる。更に具体的には、これまで記載した切形インターロイキン−１レセプターのための遺伝子コードを使用する方法には、レトロウィルス性包囲型細胞列を関節内注射によって滑膜細胞の線上にある哺乳類宿主の関節空間へ直接関節内注射し、細胞ラインを包囲するレトロウィルスから得たウィルス性粒体を導入する。望ましい実施例では膝関節から回収された滑膜細胞はインビトで培養され、その後、遺伝子治療の供給システムとして使用される。出願人は開示した特定の滑膜組織の使用に限定するものでないことは明らかであろう。他の組織例えば、皮膚細胞を使ってインビトロで培養する技術は可能である。本発明の遺伝子を使用する方法は、予防学及び関節炎の治療処置の両方に適用出来る。出願人は膝関節の治療にのみ予防又は治療を応用することに限定していないことは明らかであろう。本発明は感受性のあるどこの関節に於いても関節炎の治療のため予防又は治療に用いることが出来るであろう。本発明の他の実施形態では、切形インターロイキン−１レセプターのため、これまで記載してきた遺伝子コードを使用する方法には、培養された滑膜細胞をウィルス性粒体によって感染させ、その後感染した滑膜細胞を関節へ移植することを含んでいる。本発明の遺伝子を用いる方法は、障害を起こすような如何なる部分の関節炎の予防及び治療に使用出来る。本発明の他の実施形態では、インターロイキン−１と結合し、中性化出来るインターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域のため、遺伝子コードを用いる方法には組換え技術によって２つの遺伝子を有するレトロウィルス性ベクターを作ることが含まれる。第１の遺伝子はインターロイキンレセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域をコード化し、第２遺伝子は選択的な抗生物質抵抗性をコード化している。この使用方法にはレトロウィルスベクターを細胞列包囲レトロウィルスに形質転換し、遺伝子を備え、感染したレトロウィルス性粒体を作る細胞列を得る。本発明のもう１つの実施例は、インターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域を調製する方法を提供するものであり、その方法は、遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応により合成し、増幅されたインターロイキン−１レセプターコーディングシーケンスをレトロウイルスベクターに導入し、レトロウイルスベクターをレトロウイルスパッケージング細胞株に形質転換し、レトロウイルスパッケージング細胞株からウイルス粒子を収集するものである。本発明のもう１つの実施例では、インターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域をコード化する遺伝子及び適当な薬剤キャリヤーを含む化合物が、患者への非経口投与のために、治療上有効な量で提供されている。本発明のもう１つの実施例は、インターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域をコード化する遺伝子及び適当な薬剤キャリヤーを含む化合物を、患者への非経口東洋のために、予防上有効な量で提供している。本発明の更なる実施例には、造血プロジェニター細胞若しくは成熟したリンパ細胞又は骨髄細胞を、本発明に記載される任意の単数又は複数の遺伝子を含むＤＮＡベクター分子で形質転換することを要する。形質転換された細胞は回収され、当該分野の技術者に知られていて利用可能な技術を用いて、患者の骨髄に注射される。拒絶を修正するために、本発明の方法の範囲内で、受容骨髄から由来する細胞の代わりに、提供骨髄から由来する細胞を用いることは可能である。本発明の目的は、生成物をコード化する１以上の遺伝子を、哺乳類宿主の治療に用いられる哺乳類宿主の１以上の結合組織へ導入する方法を提供することである。本発明の目的は、生成物をコード化する遺伝子を、治療に用いられる哺乳類宿主の１以上の結合組織へ導入する方法を提供することである。本発明の目的は、治療的特性を持つ蛋白質をコード化する１以上の遺伝子を、哺乳類の関節炎の関節の滑膜ライニング細胞へ導入する方法を提供することである。本発明の目的は、結合組織の病理を研究するための動物モデルを提供することである。本発明の目的は、インターロイキン−１アルファ及びインターロイキン−１ベータを含め、インターロイキン−１のほぼ全てのイソフォームを結合・中和させることができるインターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域をコード化する遺伝子をインビボで用いる方法を提供することである。本発明の目的は、ＩＲＡＰ又はその生物的に活性な誘導体をコード化する遺伝子をインビボで用いる方法を提供することである。ＩＲＡＰ又はその生物的に活性な誘導体は、インターロイキン−１の競合阻害剤であり、このため、インターロイキン−１アルファ及びインターロイキン−１ベータを含め、インターロイキン−１のほぼ全てのイソフォームを結合・中和させることができる。本発明の目的は、インターロイキン−１のほぼ全てのイソフォームを結合・中和させることができる遺伝子を、哺乳類宿主内で、インビボで用いる方法を提供することにより、軟骨劣化を実質的に阻止し、関節窩を包囲する軟部組織を保護することである。本発明の目的は、インターロイキン−１のほぼ全てのイソフォームを結合・中和させることができるインターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域をコード化する遺伝子を、インビボで用いる方法を提供することによって、関節炎を発生させる高い感受性を示す患者における関節炎を防ぐことである。本発明の目的は、ＩＲＡＰ又をコード化する遺伝子をインビボで用いる方法を提供することである。ＩＲＡＰは、インターロイキン−１の競合阻害剤として作用することができ、このため、インターロイキン−１のほぼ全てのイソフォームを結合・中和させることによって、関節炎を発生させる高い感受性を示す患者における関節炎を防ぐ。本発明の目的は、インターロイキン−１のほぼ全てのイソフォームを結合・中和させることができるインターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域をコード化する遺伝子を、インビボで用いる方法を提供することによって、関節炎の患者を治療することである。本発明の目的は、ＩＲＡＰ又はその生物的に活性な誘導体をコード化する遺伝子をインビボで用いる方法を提供することである。ＩＲＡＰ又はその生物的に活性な誘導体は、インターロイキン−１の競合阻害剤であり、このため、インターロイキン−１のほぼ全てのイソフォームを結合・中和させることによって、関節炎の患者を治療する。本発明の目的は、関節炎の慢性的衰弱性病体生理学に焦点をあてる単数又は複数の遺伝子を、インビボで用いる方法を提供することである。本発明の更なる目的は、インターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域をコード化する遺伝子及び適当な薬剤キャリヤーからなる化合物を、非経口投与の目的で、患者に提供することである。本発明の更なる目的は、ＩＲＡＰをコード化する遺伝子及び適当な薬剤キャリヤーからなる化合物を、非経口投与の目的で、患者に提供することである。本発明のこれらの目的及びその他の目的は、本発明の以下の記載、添付の参考図面及び請求の範囲を参照することにより、より十分に理解されるであろう。図面の簡単な説明図１は、レトロウイルスベクターＭＦＧのＮｃｏＩクローニング部位及びＢａｍＨＩクローニング部位に挿入されたヒトのインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト蛋白質（ＩＲＡＰ）遺伝子をコード化するｃＤＮＡの構造を示している。図２は、選択可能なネオ遺伝子マーカーと共にレトロウイルスベクターＭＦＧに挿入されたヒトのインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト蛋白質（ＩＲＡＰ）遺伝子をコード化するｃＤＮＡの構造を示している。図３は、本発明の方法を用いて、ＬａｃＺ⁺滑膜細胞及びネオ滑膜細胞を関節内注射した約１ヶ月後に、ウサギの膝から回収された、滑膜細胞の顕微鏡写真である。図４は、ＭＦＧ−ＩＲＡＰウイルスベクターを採用した本発明の方法を用いて感染されたＨＩＧ−８２細胞(Georgescu，et al.，1988，In Vitro 24: 1015-10 22)の４つの培養組織による、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト蛋白質の生成について説明するウェスタンブロットを示している。図５は、ＭＦＧ−ＩＲＡＰに感染されたＨＩＧ−８２細胞により調整された追加培地による、軟骨細胞の阻害について説明するデータを示している。図６は、リポフェクションを用いた滑膜細胞によるＬａｃＺ遺伝子の吸収及び発現を示している。くぼみ１−リポソームだけで処理された対照細胞；くぼみ２ −ＤＮＡだけで処理された対照細胞；くぼみ３−ＤＮＡ＋１５０ｎモルのリポソーム；くぼみ４−ＤＮＡ＋２４０ｎモルのリポソーム；くぼみ５−ＤＮＡ＋３００ｎモルのリポソーム；くぼみ６−ＤＮＡ＋６００ｎモルのリポソーム。図７は、インターロイキン−１結合領域のアミノ酸配列を示している。図８Ａ〜図８Ｃは、ヒト（SQ ID 番号１及び２）及びマウス（SQ ID 番号３及び４）のインターロイキン−１レセプターのアミノ酸及びヌクレオチドシーケンスを示している。図９は、レトロウイルスベクターに挿入された切形インターロイキン−１レセプターをコード化する遺伝子を示している。図１０は、ＭＦＧ−ＩＲＡＰ導入遺伝子の抗炎症特性を示している。示された量のヒトの組換えインターロイキン−１ベータ（ｒｈＩＬ−１β）を用いた関節内攻撃を行う３日前に、ＭＦＧ／ＨＩＧ−８２細胞（１０⁷）又は形質導入されていないＨＩＧ−８２細胞（１０⁷）が、ウサギの膝関節に移植された。１８時間後に関節は洗浄され、その後、浸潤白血球が数えられた。図１１は、滑膜細胞の移植から４日後のウサギの膝におけるヒトのＩＲＡＰのレベルを示している。形質導入されていない（実験されたことのない）ＨＩＧ− ８２細胞又はヒトのＩＲＡＰ遺伝子（ＭＦＧ−ＩＲＡＰ／ＨＩＧ−８２）を保持する細胞が、ウサギの膝関節に関節内注射された（１０⁷細胞／膝）。４日後、膝は洗浄され、ヒトのＩＲＡＰの濃度が、ＥＬＩＳＡにより測定された。示される値は、平均値＋Ｓ．Ｄ．である（ｎ＝１５）。図１２は、ＩＲＡＰ遺伝子を発現する膝におけるＩＬ−１誘発性白血球浸潤の阻害を示している。実験されたことのないＨＩＧ−８２細胞又はＩＲＡＰを形質導入されたＨＩＧ−８２細胞が、図示される如く、ウサギの膝関節に移植された。３日後に、０〜１００ｐｇ／膝のｈｒＩＬ−ＩＢが、指示された量で関節内注射された。翌日、膝関節は洗浄され、白血球の浸潤は、血球計数器で計数し、シトスピニング(cytospinning)することにより、分析された。平均値＋Ｓ．Ｅ．( ｎ＝３)。（ａ）各膝当たりの白血球(ＷＢＣ)。（ｂ）ＩＬ−１を注射された対照膝からの洗浄液の、染色されたサイトスピンの標本。標本は、サイトスピニングの前に１：１０に希釈された。（ｃ）ＩＬ−１を注射された、ＩＲＡＰを分泌する膝からの洗浄液の、染色されたサイトスピンの標本。標本は、希釈されなかった。図１３は、関節軟骨からのプロテオグリカンの、ＩＬ−１誘発性損失の抑制を示している。実験さたことのないＨＩＧ−８２細胞又はＩＲＡＰを形質導入されたＨＩＧ−８２細胞が、ウサギの膝関節に移植された。３日後、０〜２００ｐｇ／膝のｈｒＩＬ−ＩＢが、指示された量で関節内に注射された。翌日、膝関節は洗浄され、軟骨損傷の指標として、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のレベルが測定された。図１４Ａ〜図１４Ｄは、ＩＲＡＰを発現する膝における、ＩＬ−１を媒体とする滑膜変化の抑制を示している。それぞれの場合、１０ｐｇのｈｒＩＬ−１βが関節内注射された。滑膜は、ＩＬ−１βの注射から１８時間後に回収された。これは、実験さたことのないＨＩＧ−８２細胞又はＩＲＡＰを形質導入されたＨＩＧ−８２細胞を移植してから４日後にあたる。（ａ）ＩＬ−１を注射した対照滑膜、倍率１０倍。（ｂ）ＩＬ−１を注射したＩＲＡＰを分泌する滑膜、倍率１０倍。（ｃ）ＩＬ−１を注射した対照滑膜、倍率１６０倍。（ｄ）ＩＲＡＰを分泌する滑膜、倍率１６０倍。図１５は、ウサギの正常な膝及び関節炎の膝における、ヒトのＩＲＡＰの発現を示している。抗原誘発性の関節炎は、１日目に、オボアルブミン５ｍｇを、前もって間作された(pre-sensitized)ウサギの一つの膝関節（関節炎の膝）へ注射することにより開始された。２日目に、自己由来の滑膜細胞（１ｍｌの生理食塩水中に１０⁷／膝）は、関節内注射により、選択された膝関節へ導入された。関節炎でない膝及び関節炎の膝のいくつかは、ヒトのＩＲＡＰ遺伝子を形質導入された細胞を受け取った。その他の関節炎でない膝及び関節炎の膝は、形質導入されていない細胞又はＬａｃＺ遺伝子及びネオ^r遺伝子を形質導入された細胞を受け取った（対照）。これら２つのタイプの対照細胞により得られた結果は見分けがつかないので、その結果は数字に加えられた。滑膜細胞の培養、形質導入及び関節内移植に関する詳しい方法は、本明細書中に記載されている。４日目に、膝は１ｍｌの生理食塩水で洗浄された。７日目に、ウサギは殺され、膝は再び洗浄された。洗浄液中のヒトのＩＲＡＰの濃度は、市販のセット(R＆ D Systems，Minneapolis，MN)を用いてＥＬＩＳＡにより測定された。示される値は、平均値±Ｓ．Ｅ．である。膝の数は、各コラムの上に示されている。アステリスクは、ｐ＜０．０５（ｔ−テスト）の時に異なる値を示している。図１６は、正常なウサギの及び関節炎のウサギの膝関節内のウサギのＩＬ−１ βの濃度を示している。実験条件は、図１５に記載のものと同一であった。但し、洗浄液は、ウサギのＩＬ−１α及びウサギのＩＬ−１βに関して、市販のセット(Cytokine Sciences，Boston，Ma)を用いて、ＲＩＡにより検定された。関節炎でない膝には、関節内注射が引き起こした僅かな炎症効果の現れとして、低レベルのＩＬ−１βが存在している。ＩＬ−１αは、どの試料でも検出されなかった。示される値は、±Ｓ．Ｅ．の平均値である。膝の数は、各列の上に示されている。アステリスクは、ｐ＜０．０５（ｔ−テスト）の時に異なる値を示している。図１７Ａ−Ｂは、ＩＲＡＰ遺伝子導入が軟骨マトリックス代謝に与える影響を示している。実験条件は、ウサギが２匹とも４日目及び７日目に殺された点を除いては、図１５に記載のものと同一であった。洗浄液中のＧＡＧ濃度（図１７ａ）は、ジメチメチレンブルーアッセイにより、分光測定器で測定された(Farndale，et al.，1986，Biochim．Bi ophy．Acta 883:173-177)。関節軟骨の骨片は、膝の大腿顆から削り取られ、ＧＡＧ合成（図１７ｂ）は、前述の高分子材料が、³⁵ＳＯ₄ ^2-を摂取した量により測定された(Taskiran，et al.，1994，Biophys．Res．Commun．200:142-148)。それぞれの場合に、結果は対照のパーセントで示されている。示される値は、± Ｓ．Ｅ．の平均値である。膝の数は、各列の上に示されている。図１８は、ＩＲＡＰ遺伝子導入が白血球増加に与える影響を示している。実験条件は、図１５に記載のものと同一であった。洗浄液中の白血球の数は、血球計数器により測定された。示される値は、±Ｓ．Ｅ．の平均値である。アステリスクは、ｐ＜０．０５（ｔ−テスト）の時に異なる値を示している。発明の詳細な説明ここで用いられる「患者」という言葉は、動物界の構成員を含み、ヒトを含むが、これに限定されるものではない。ここで用いられる「哺乳類宿主」という言葉は、動物界の構成員を含み、ヒトを含むが、これに限定されるものではない。ここで用いられる「結合組織」という言葉は、哺乳類宿主の靱帯、軟骨、腱及び滑膜を含むが、これらに限定されるものではない。ここで用いられる「ＤＣ−ｃｈｏｌ」とは、陽イオンコレステロール誘導体を含む陽イオンリポソームを意味する。「ＤＣ−ｃｈｏｌ」分子は、Biochem ．Bio phys．Res．Commun. ，179:280-285(1991),X．Gao and L．Hang.に記載されるように、第三アミノ基、中ぐらいの長さのスペーサーアーム（２原子）及びカルバモイルリンカーボンドを含んでいる。ここで用いられる「ＳＦ−ｃｈｏｌ」とは、或るタイプの陽イオンリポソームのことである。ここで用いられる「生物的に活性な」という言葉は、リポソームに関して用いられるときには、機能的ＤＮＡ及び／又は蛋白質を標的細胞に導入できる能力を示している。ここで用いられる「生物的に活性な」という言葉は、核酸、蛋白質、蛋白質の断片又はその誘導体に関して用いられるときには、核酸シーケンス又はアミノ酸シーケンスが、野生型の核酸又は蛋白質により引き出される既知の生物的機能を模倣できる能力のことをいう。ここで用いられる「維持」という言葉は、リポソームの供給に関して用いられるときには、導入ＤＮＡが細胞内に存在し続ける能力を示している。その他の分脈で用いられるときには、標的ＤＮＡが、治療効果を与えるために、標的細胞又は標的組織に存在し続ける能力を意味する。結合組織は、治療目的で標的にするのが難しい器官である。当該技術で知られている静脈注射や経口による薬剤の供給では、これらの結合組織へ効果的にアクセスですることができず、哺乳類宿主の全身が治療薬に曝されるという欠点がある。より具体的には、既知の関節内注射によれば、関節へ直接アクセスできる。しかし、注入された薬剤のほとんどは、関節内での半減期が短い。本発明は、哺乳類宿主の治療に利用できる蛋白質をコード化する遺伝子を、哺乳類宿主の結合組織の中へ導入することにより、これらの問題を解決することができる。より具体的には、本発明は、抗関節炎特性を持つ蛋白質をコード化する遺伝子を、哺乳類宿主の結合組織の中へ導入する方法を提供するものである。本発明は、哺乳類宿主の治療に用いられる哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ、生成物をコード化する１以上の遺伝子を導入する方法を提供するものであり、その方法は、組換え技術を用いて生成物をコード化する遺伝子を含むウイルスベクターを生成し、生成物をコード化する遺伝子を含むウイルスベクターを用いて、哺乳類宿主の結合組織を感染させるものである。この方法は、治療で使用するために、生成物をコード化する遺伝子を、哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ導入することを含んでいるのが望ましい。本明細書に記載されている、結合組織障害を治療するための１つのエクスビボ (ex vivo)の方法では、まず、蛋白質又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスを含む組換えウイルスベクターを生成する。次に、この組換えウイルスベクターは、インビトロ(in vitro)で培養された結合組織細胞の集団を感染させるのに用いられ、その結果、形質転換された結合細胞の集団が生じる。次に、これらの形質転換された組織細胞は、哺乳類宿主の標的関節窩内の結合組織に移植され、続いて、関節窩内での蛋白質又は蛋白質断片で、発現を行う。この関係あるＤＮＡシーケンスの発現は、結合組織障害に通常関連する１以上の有害な関節病又は炎症の兆候を実質的に減らす点で有用である。結合組織細胞は、滑膜、軟骨、腱及び靱帯により構成される結合組織のグループから選択され、滑膜細胞であることが望ましい。ウイルスベクターとして、ＭＦＧ等のレトロウイルスベクターが利用されるのが望ましい。このエクスビボの方法におけるもう１つの望ましいステップは、形質導入された細胞を関節内注射により移植することである。人間の患者を治療するための細胞の望ましい源は、自己由来の滑膜細胞など、患者自身の細胞であることは、当業者によって理解されるであろう。本発明の望ましい実施例では、前述の方法は、遺伝子として、ヒトのインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト蛋白質（ＩＲＡＰ）又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスを利用している。従って、本発明の望ましい実施例は、結合組織の関節の病気の治療のために、生物的に活性なインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト蛋白質（ＩＲＡＰ）又はその一部分をコード化するＤＮＡシーケンスを利用する方法に関するものである。ＩＲＡＰ又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスは、本明細書に記載の種々のベクター方法やトランスダクション技術を任意に組み合わせることにより、哺乳類宿主の結合組織に供給される。ＩＲＡＰを標的関節窩へ供給する実施例の望ましい方法は、本発明に記載のエクスビボの技術を用いて、レトロウイルスベクターを用いることにより、ＩＲＡＰ遺伝子を哺乳類宿主の滑膜ライニング(lining)へ供給することを含んでいる。換言すれば、機能的ＩＲＡＰ蛋白質又は蛋白質断片をコード化する関係あるＤＮＡシーケンスは、選択されたレトロウイルスベクター内にサブクローニングされ、次に、組換えウイルスベクターは、適当なタイターまで増加して、インビトロで培養された滑膜細胞を感染させるのに用いられる。そして、形質導入された滑膜細胞−望ましくは自己移植された細胞−は、望ましくは関節内注射により関係ある関節内に移植される。本発明のもう１つの実施例では、前述の方法は、遺伝子として、β−ガラクトシダーゼをコード化することができるＬａｃＺマーカーを用いることを含む。本発明のもう１つの実施例では、前述の方法は、遺伝子として、可溶性インターロイキン−１レセプターを用いることを含む。本発明のもう１つの実施例では、前述の方法は、遺伝子として、可溶性ＴＮＦ −αレセプターをコード化することができる遺伝子を用いることを含む。本発明のもう１つの実施例では、前述の方法は、遺伝子として、少なくともプロティナーゼ阻害剤をコード化することができる遺伝子を用いることを含む。より具体的には、この方法は、プロティナーゼ阻害剤として、メタロプロティナーゼ(metalloproteinases)の組織阻害剤を用いることを含むことが望ましい。本発明のもう１つの実施例は、前述の方法を含み、それは、遺伝子として、１以上のサイトカインをコード化することができる遺伝子を用いることを含んでいる。より具体的には、この方法は、サイトカインとして、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン −７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子−α （ＴＮＦ−α）及び腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）により構成されるグループから選択される１以上の物質を用いることを含む。本発明の更なる実施例は、前述の方法を含み、それは、サイトカインとして、１以上の形質転換増殖因子を用いることを含んでいる。より具体的には、この方法は、形質転換増殖因子として、ＴＧＦ−ベータ₁、ＴＧＦ−ベータ₂、ＴＧＦ− ベータ₃及びＴＧＦ−アルファにより構成されるグループから選択される増殖因子を用いることを含む。各形質転換増殖因子は、R＆D Systems，614 McKinley P lace，N.E.，Minneapolis，MN 55413より販売されており、入手可能である。本発明のもう１つの実施例では、前述の方法は、サイトカインとして、１以上の線維芽細胞増殖因子を用いることを含む。線維芽細胞増殖因子もまた、R&D Sy stems, 614 McKinley Place，N.E.，Minneapolis，MN 55413より販売されており、入手可能である。本発明のもう１つの実施例は、前述の方法を含み、それは、ウイルスベクターとして、レトロウイルスベクターを用いることを含む。より具体的には、この方法は、レトロウイルスベクターとして、ＭＦＧ及びＢＡＧにより構成されるグループから選択される１以上の物質を用いることを含む。本発明の望ましい実施例は、前述の方法を提供することを含み、それは、遺伝子として、ヒトのインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト蛋白質をコード化することができる遺伝子を用いることと、レトロウイルスベクターとして、ＭＦＧを用いることを含む。本発明のもう１つの望ましい実施例は、前述の方法を含み、それは、ベーターガラクトシダーゼをコード化できる遺伝子として、ＬａｃＺマーカー遺伝子を利用し、レトロウイルスベクターとして、ＭＦＧを用いることを含む。本発明のもう１つの望ましい実施例は、前述の方法を含み、それは、ベーターガラクトシダーゼをコード化できる遺伝子として、ＬａｃＺネオマーカー遺伝子を利用し、レトロウイルスベクターとして、ＢＡＧを用いることを含む。本発明の最も望ましい実施例では、前述の方法は、ＭＦＧ及びＢＡＧにより構成されるグループから選択されるレトロウイルスベクターを用いることを含み、遺伝子として、可溶性インターロイキン−１レセプターをコード化できる遺伝子を用いることを含む。本発明のもう１つの実施例では、前述の方法は、遺伝子として、１以上のプロティナーゼ阻害剤をコード化できる遺伝子を用いることを含み、レトロウイルスベクターとして、ＭＦＧ及びＢＡＧにより構成されるグループから選択される１以上の物質を用いることを含む。本発明のもう１つの実施例では、前述の方法は、レトロウイルスベクターとして、ＭＦＧ及びＢＡＧにより構成されるグループから選択される１以上の物質を用いることを含み、遺伝子として、前述した１以上のサイトカインをコード化できる遺伝子を用いることを含む。本発明のもう１つの実施例では、哺乳類宿主を治療するために利用される哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ、生成物をコード化する１以上の遺伝子を導入する方法が提供され、その方法は、組換え技術を用いて生成物をコード化する遺伝子を含むウイルスベクターを生成し、生成物をコード化する遺伝子を含むウイルスベクターを用いて、哺乳類宿主の結合組織を感染させるものである。ここで、ウイルスベクターとは、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス及び単純疱疹ウイルス１型又は単純疱疹ウイルス２型などのヘルペスウイルスにより構成されるグループから選択される１以上のベクターである。この方法は、遺伝子として、（ａ）ヒトのインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト蛋白質、（ｂ）可溶性インターロイキン−１レセプター、（ｃ）ベーターガラクトシダーゼをコード化できるＬａｃＺマーカー遺伝子、（ｄ）１以上のプロティナーゼ阻害剤及び（ｅ）１以上のサイトカインを含むグループから選択される１以上の物質をコード化できる遺伝子を用いることを含む。より具体的には、この方法は、プロティナーゼ阻害剤として、メタロプロティナーゼの組織阻害剤を用いることを含み、サイトカインとして、（ａ）ＴＧＦ−ベータ₁ 、ＴＧＦ−ベータ₂、ＴＧＦ−ベータ₃及びＴＧＦ−アルファにより構成されるグループから選択される１以上の形質転換増殖因子、（ｂ）１以上の線維芽細胞増殖因子、（ｃ）ＩＬ−１α、（ｄ）ＩＬ−１β、（ｅ）ＩＬ−２、（ｆ）ＩＬ− ３、（ｇ）ＩＬ−４、（ｈ）ＩＬ−５、（ｉ）ＩＬ−６、（ｊ）ＩＬ−７、（ｋ）ＩＬ−８、（ｌ）ＩＬ−９、（ｍ）ＩＬ−１０、（ｎ）ＩＬ−１１、（ｏ）ＩＬ−１２、（ｐ）ＴＮＦ−α及び（ｑ）ＴＮＦ−βを含むグループから選択される１以上の物質を用いることを含む。本発明のもう１つの実施例は、前述の方法を含み、それは、遺伝子を結合組織内に導入することを含む。その組織は、靱帯、軟骨、腱及び滑膜により構成されるグループから選択される。この方法は、靱帯として、十字靱帯を用いるのが望ましい。最も望ましくは、この方法は、十字靱帯として、前十字靱帯及び後十字靱帯により構成されるグループから選択される靱帯を用いることが望ましい。本発明のもう１つの実施例は、前述の方法を含み、その方法は、遺伝子として、維持能力及び発現能力があるＤＮＡを持つ遺伝子を用いることを含む。本発明の更なる実施例は、前述の方法を含み、それは、遺伝子をインビトロで細胞内に導入することを含む。次に、この方法は、感染細胞を哺乳類宿主に移植することを含む。この方法はまた、結合組織細胞の感染を行った後、感染細胞を哺乳類宿主に移植する前に、感染結合組織細胞を保存することを含む。当該技術の専門家であれば、感染結合組織細胞は、液体窒素中の１０％のＤＭＳＯ（ジメチルフォキシド）内で凍結保存できることが分かるであろう。この方法は、関節炎を発生させる感受性が高い哺乳類宿主において、関節炎の発生を実質的に防ぐ方法を用いることを含む。本発明の方法は、治療の目的で、関節炎の哺乳類宿主にその方法を用いることを含む。この方法は、結合組織を修復・再生する方法を用いることを含む。その組織は、靱帯、軟骨、腱及び滑膜により構成されるグループから選択される。この方法は、ヒトである哺乳類宿主に、その方法を用いることを含む。本発明のもう１つの実施例は、前述したように、哺乳類宿主の治療に用いられる哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ、生成物をコード化する１以上の遺伝子を導入する方法を含み、その方法は、生成物をコード化する遺伝子を含むウイルスベクターを、哺乳類宿主へ直接導入することにより、インビボ(in vivo)で感染を行うことを含む。この方法は、哺乳類宿主への直接導入を、関節内注射により行うことを含むことが望ましい。この方法は、関節炎を発生させる感受性が高い哺乳類宿主において、関節炎の発生を実質的に防ぐ方法を用いることを含む。この方法はまた、治療で使用するために、関節炎の哺乳類宿主にその方法を用いることを含む。この方法は更に、前述したように、結合組織を修復・再生する方法を用いることを含む。本発明の更にもう１つの実施例では、哺乳類宿主の治療に用いられる哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ、生成物をコード化する１以上の遺伝子を導入する方法は、生成物をコード化する遺伝子を結合組織細胞内へ導入するための、非ウイルス性手段を用いることを含む。この方法は、１以上のリポソーム、Ｃａ₃ （ＰＯ₄）₂、エレクトロポレーション法及びＤＥＡＥ−デキストラン法により構成されるグループから選択される非ウイルス性手段を用いることを含む。この方法は、リポソームとして、ＤＣ−ｃｈｏｌ及びＳＦ−ｃｈｏｌにより構成されるグループから選択される物質を用いることを含む。哺乳類宿主の治療に用いられる哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ、生成物をコード化する１以上の遺伝子を導入し、生成物をコード化する遺伝子を結合組織細胞内へ導入するために、非ウイルス性手段を用いることを含む本発明の方法は、非感染性の供給システムであることが分かるであろう。非感染性の供給システムを用いることの利点は、挿入的突然変異誘発(insertional mutagenesis )及びウイルス誘発性疾患を排除できることである。リポソームを用いるウイルスベクターは、結合組織細胞の感染及び組込みを行うために、レトロウイルスの場合に必要とされる細胞分裂に限定されるわけではないことは、当該分野の専門家によって理解されるであろう。前述の非ウイルス性手段を用いる方法は、遺伝子として、（ａ）ヒトのインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト蛋白質、（ｂ）ベーターガラクトシダーゼをコード化できるＬａｃＺマーカー遺伝子、（ｃ）可溶性インターロイキン−１レセプター、（ｄ）１以上のプロティナーゼ阻害剤、（ｅ）１以上の形質転換増殖因子及び（ｆ）１以上のサイトカインを含むグループから選択される１以上の物質をコード化できる遺伝子を用いることを含む。より具体的には、この方法は、サイトカインとして、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βを含むグループから選択されるサイトカイン、及び１以上の線維芽細胞増殖因子を用いることを含む。ＩＬ−４及びＩＬ−１０が選択されるサイトカインであることが望ましい。この方法は、形質転換増殖因子として、ＴＧＦ−ベータ₁、ＴＧＦ−ベータ₂ 、ＴＧＦ−ベータ₃及びＴＧＦ−アルファにより構成されるグループから選択される増殖因子を用いることを含むことが望ましい。高レベルのコラゲナーゼ及び、ストロメリシン(stromelysin)やゼラチナーゼなどの他の組織メタロプロティナーゼは、結合組織内でＩＬ−１が存在するときに発現されることができる。コラゲナーゼ、ストロメリシン及びゼラチナーゼは、蛋白質ＴＩＭＰ（コラーゲン分解酵素阻害）により阻害される。従って、本発明のもう１つの望ましい実施例は、前述の非ウイルス性手段を用いる方法を提供することを含み、その方法は、プロティナーゼ阻害剤として、コラーゲン分解酵素阻害（ＴＩＭＰ）を用いることを含む。生成物をコード化する遺伝子を、結合組織細胞へ導入する非ウイルス性手段を用いる前述の方法は、遺伝子を、靱帯、軟骨、腱及び滑膜により構成されるグループから選択される組織である結合組織に導入することを含む。この方法は、靱帯として、十字靱帯を用いることを含むことが望ましい。十字靱帯は、前十字靱帯及び後十字靱帯により構成されるグループから選択される。もちろん、ＴＩＭＰ蛋白質又はその生物的に活性な断片をコード化する遺伝子は、本発明に記載の手段を任意に組み合わせることにより、標的結合組織に供給されることができる。本発明のもう１つの実施例は、本明細書に記載の任意の方法により、関係あるＤＮＡシーケンスを哺乳類宿主の結合組織へ供給して、種々の非付着分子(untia dhesion molecules)の発現をインビボで行うことにより、細胞間及び細胞−マトリクス間の相互作用を阻害するものである。このような蛋白質断片の例として、ＩＣＡＭ−１及び可溶性ＣＤ４４が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のもう１つの実施例は、本明細書に記載の任意の方法により、関係あるＤＮＡシーケンスを哺乳類宿主の結合組織へ供給して、種々の軟骨増殖因子のインビボ発現を行うものである。軟骨増殖因子として、ＩＧＦ−１及びＴＧＦ−β が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のもう１つの実施例は、本明細書に記載の任意の方法により、関係あるＤＮＡシーケンスを哺乳類宿主の結合組織へ供給して、種々のフリーラジカル（遊離基）アンタゴニストのインビボ発現を行うことにより、苦しむ関節内でのフリーラジカル形成の悪影響を防ぐものである。フリーラジカルアンタゴニストの例として、ＮＯを阻害するスーパーオキシドジスムターゼ及び蛋白質又はその断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の更なる実施例は、結合組織の病理及び全身性炎症の指標を研究するための動物モデルを提供している。このモデルは、生成物をコード化する１以上の遺伝子又は関係あるＤＮＡシーケンスを、哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ、エクスビボ又はインビボで供給する方法を用いている。本発明において研究できる関節病理の例として、白血球増加症、滑膜炎、軟骨損傷及び軟骨基質合成の抑制が挙げられるが、これらに限定されるものではない。全身性炎症の指標の例としては、赤血球沈降速度、発熱及び体重減少が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような動物モデルに関する本発明の特別の実施例は、ヒトのＩＬ−１β遺伝子を、ウサギの膝の滑膜ライニングへコード化するＤＮＡシーケンスを供給する方法を用いている。この実施例では、ヒトのＩＬ−β遺伝子は、既知の方法により、ＭＦＧレトロウイルスベクターへサブクローニングされ、その結果、ＭＦＧ−ＩＬ−１βができる。この組換えレトロウイルス構成体は、インビトロで培養された自己由来の滑膜細胞を形質導入するのに用いられた。次に、これらの形質導入された細胞は、本明細書の記載に従って、ウサギの膝に供給された。このように、ヒトのＩＬ−β遺伝子をウサギの膝の滑膜ライニングに供給すると、激しい、慢性の単関節の関節炎(monarticular arthritis)を引き起こした。その病理として、白血球増加症、滑膜炎、軟骨損傷及び軟骨基質合成の抑制が挙げられる。赤血球沈降速度の増加、発熱及び体重減少などの全身性炎症の指標も得られた。本発明のこの特別実施例のもう１つの例では、ヒトのＩＬ−β遺伝子は、ＣＭＶプロモーターの下流にあるＤＮＡプラスミドベクターへサブクローニングされた。このＣＭＶ−ＩＬ−１βプラスミド構成体は、リポソームに被包され、例Ｘに記載するように、標的関節窩へ供給された。注射の４８時間後に、ＩＬ−β上の１ｎｇが膝関節エリアから回収された。本明細書に記載及び例示された動物モデルは、本明細書に記載の様々な遺伝子療法の応用の能力を評価して、関節病理及び炎症的副作用の原因となる既知の因子（例えばＩＬ−１β）からの攻撃に対抗するものである。本発明のもう１つの望ましい実施例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又は単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターを用いて、ＩＲＡＰをインビボで哺乳類宿主の滑膜ライニングへ直接に供給している。言い換えれば、機能ＩＲＡＰ蛋白質又は蛋白質断片をコード化する関係あるＤＮＡシーケンスは、それぞれのウイルスベクターにサブクローニングされ、ウイルスベクターを含むＩＲＡＰは、次に、適当なタイターまで増加し、望ましくは関節内注射により、関節窩へ導かれる。ＭＦＧ−ＩＲＡＰなどのレトロウイルス−ＩＲＡＰ構成体もまた、以前に炎症を起こしている関節窩内の結合組織細胞を直接に標的にするのに用いることができる。関係ある遺伝子を含むＤＮＡ分子を関節窩へ直接に関節内注射すると、受容滑膜細胞を形質転換するため、滑膜細胞（実例のセクションに記載）を含むＤＮＡベクターの、切除、インビトロ培養、形質転換、選択及び移植などの条件を無視して、関係ある異種遺伝子の安定的発現を促進する。ＤＮＡ分子を関節の標的結合細胞に提供する方法としては、ＤＮＡ分子を陽イオンリポソーム内に封入する方法、本明細書に記載のレトロウイルスベクター内で関係あるＤＮＡシーケンスをサブクローニングする方法又はＤＮＡ分子自体を関節へ直接に注射する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＤＮＡ分子は、膝関節への供給方法の如何に拘わらず、組換えウイルスＤＮＡベクター分子又は組換えウイルスＤＮＡプラスミドベクター分子のどちらかのＤＮＡベクター分子として提供されることが望ましい。関係ある異種遺伝子の発現は、真核細胞内で活発なプロモーター断片を、異種細胞のコード領域の上流に直接挿入することにより可能となる。当該技術の専門家は、ベクター構成に関する既知の方法や技術を用いて、ＤＮＡ分子を滑膜組織へ入力した後に、適当なレベルの発現を得ることができる。様々なウイルス性又は非ウイルス性ベクターを、インビボでウサギへ供給する方法については、例ＸＶに記載されている。本発明のもう１つの実施例は、哺乳類宿主の治療に用いられる哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ、生成物をコード化する１以上の遺伝子を導入する方法を提供するものであり、その方法は、前述の非ウイルス性手段を用いることを含み、遺伝子として、維持能力及び発現能力があるＤＮＡを持つ遺伝子を用いることを含む。本発明の更にもう１つの実施例では、哺乳類宿主の治療に用いられる哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ、生成物をコード化する１以上の遺伝子を導入する方法が提供され、その方法は、生成物をコード化する遺伝子を、インビトロで結合組織細胞へ導入するのに非ウイルス性手段を用いることを含み、次に、遺伝子を持つ細胞を哺乳類宿主に移植することを含む。本発明のもう１つの実施例は、生成物をコード化する遺伝子を結合組織細胞へ導入した後、遺伝子を持つ結合組織細胞を哺乳類宿主に移植する前に、遺伝子を持つ結合組織細胞を保存することを含む方法を提供する。この方法は、結合組織細胞を、液体窒素中の１０％のＤＭＳＯ内でで凍結保存することを含む。この方法は、関節炎を発生させる感受性が高い哺乳類宿主において、関節炎の発生を実質的に防ぐ方法を用いることを含む。更にこの方法は、治療の目的で、関節炎の哺乳類宿主にその方法を用いることを含む。この方法は、結合組織を修復・再生する方法を用いることを含む。その組織は、靱帯、軟骨、腱及び滑膜により構成されるグループから選択される。本発明の更にもう１つの実施例は、哺乳類宿主の治療に用いられる哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ、生成物をコード化する１以上の遺伝子を導入する方法を提供し、生成物をコード化する遺伝子を哺乳類宿主の結合組織細胞内へインビボで直接導入するための、非ウイルス性手段を用いることを含む。非ウイルス性手段は、１以上のリポソーム、Ｃａ₃（ＰＯ₄）₂及びＤＥＡＥ−デキストラン法により構成されるグループから選択される。この方法は、哺乳類宿主へのインビボ導入を、関節内注射により行うことを含むことが望ましい。この方法は、関節炎を発生させる感受性が高い哺乳類宿主において、関節炎の発生を実質的に防ぐ方法を用いることを含む。更にこの方法は、治療の目的で、関節炎の哺乳類宿主にその方法を用いることを含む。この方法はまた、結合組織を修復・再生する方法を用いることを含む。その組織は、靱帯、軟骨、腱及び滑膜により構成されるグループから選択される。本発明のもう１つの実施例は、結合組織の病理を研究するための動物モデルを生成する方法を示している。当該分野の専門家によって理解されるように、哺乳類宿主の関節内でのインターロイキン−１の過度の発現(over-expression)が、関節炎疾患を誘発する一般的な原因である。本発明は、本発明の前述した遺伝子転移技術を用いて、動物モデルを生成する方法を提供する。本発明の方法は、本発明の前述した遺伝子転移技術を用いて、動物モデルを生成する方法を提供することにより、関節炎の動物モデルをもたらすことが望ましい。例えば、本発明によって提供される遺伝子転移の方法に伴う、ウサギの関節内でのインターロイキン−１の構成的発現は、関節炎の疾患の開始を引き起こす。治療薬の試験に用いるのに適しているのは、このウサギのモデルであることは、当該分野の専門家によって理解されるであろう。この方法は、生成物をコード化する１以上の遺伝子を、哺乳類宿主の結合組織へ導入することを含み、その方法は、（ａ）組換え技術を用いて、生成物をコード化する遺伝子を含むウイルスベクターを生成し、（ｂ）生成物をコード化する遺伝子を含むウイルスベクターを用いて、哺乳類宿主の結合組織細胞を感染させることにより、動物モデルをもたらすものである。この方法は、遺伝子として、サイトカイン及びプロティナーゼにより構成されるグループから選択される物質を用いることを含む。この方法は、サイトカインとして、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αにより構成されるグループから選択される物質を用いることを含む。この方法は、プロティナーゼとして、マトリクスメタロプロティナーゼを用いることを含む。マトリクスメタロプロティナーゼは、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びストロメリシンにより構成されるグループから選択される酵素である。「コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びストロメリシン」という言葉は、単数形に限定して使用しているのではなく、複数形も含まれることは明らかである。本発明において、マトリクスメタロプロティナーゼとして、多数のコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びストロメリシンを用いることができることは、よく知られた技術である。本発明の更なる実施例は、結合組織の病理を研究するための動物モデルを生成する方法を提供し、その方法は、非ウイルス手段を用いて、哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内に、生成物をコード化する遺伝子を導入することにより、動物モデルをもたらすことを含む。非ウイルス性手段は、１以上のリポソーム、Ｃａ₃（ＰＯ₄）₂、エレクトロポレーション法及びＤＥＡＥ−デキストラン法により構成されるグループから選択される。この方法は、遺伝子として、サイトカイン及びプロティナーゼにより構成されるグループから選択される物質を用いることを含む。この方法は、サイトカインとして、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＴＮＦ− αにより構成されるグループから選択される物質を用いることを含む。この方法は、プロティナーゼとして、マトリクスメタロプロティナーゼを用いることを含む。マトリクスメタロプロティナーゼは、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びストロメリシンにより構成されるグループから選択される酵素である。本発明の更なる実施例は、遺伝子として、（ａ）ヒトのインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト蛋白質若しくはその生物的に活性な誘導体又は断片、（ｂ）ベーターガラクトシダーゼ蛋白質若しくはその生物的に活性な誘導体又は断片をコード化できるＬａｃＺマーカー遺伝子、（ｃ）可溶性インターロイキン −１レセプター蛋白質若しくはその生物的に活性な誘導体又は断片、（ｄ）プロティナーゼ阻害剤、（ｅ）可溶性腫瘍壊死因子レセプター蛋白質若しくはその生物的に活性な誘導体又は断片及び（ｆ）サイトカイン、及びＤＮＡベクターとして、供給方法の如何に拘わらず、供給され次第、標的細胞又は組織内で安定的に維持でき、望ましくはプラスミド又はウイルスベクターである、当該技術の専門家に知られた任意のＤＮＡベクター含むグループから選択される１以上の物質をコード化できる遺伝子を用いることを含む。本発明の１つの実施例では、関係ある遺伝子を含むＤＮＡ分が、関節内へ直接に関節注射された後に、滑膜細胞は、インビボで形質転換される。受容滑膜細胞を形質転換すると、滑膜細胞（実例のセクションに記載）を含むＤＮＡベクターの切除、培養、インビトロ形質転換、選択及び移植などの条件を無視して、関係ある異種遺伝子の安定的発現を促進する。ＤＮＡ分子を関節に挿入する方法としては、ＤＮＡ分子を陽イオンリポソーム内に封入する方法又はＤＮＡ分子自体を関節へ直接に注射する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。滑膜組織のインビボ形質転換の結果起こる、関係ある異種遺伝子の発現は、真核細胞内で活発なプロモーター断片を、異種細胞のコード領域の上流に直接挿入することにより可能となる。当該技術の専門家は、ベクター構成に関する既知の方法や技術を用いて、ＤＮＡ分子を滑膜組織へ入力した後に、適当なレベルの発現を得ることができる。本発明の例であって限定ではないが、ＣＭＶプロモーターの下流にライゲートされるＩＬ−１βコードシーケンスを含むＤＮＡプラスミドベクターは、リポソームに被包され、受容ウサギの膝関節に挿入された。インターロイキン−１βは、滑膜組織内で発現され、関節注射の範囲内の滑膜組織から、かなりの量のインターロイキン−１βが回収された。本発明の更なる実施例は、哺乳類宿主の治療に用いられる哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ、生成物をコード化する１以上の遺伝子を導入する更なる方法を提供するものである。この更なる方法は、ＤＮＡベクター分子を標的細胞又は組織に供給するために、ウイルスを利用する生物学的手段を用いることを含む。ウイルスは、偽ウイルス、つまり、そのゲノムが、標的細胞又は組織内で供給及び安定維持の能力だけを持つように変えられたウイルスであることが望ましく、そのようなウイルスは、標的細胞又は組織内で複製する能力は保持していない。変えられたウイルスゲノムは、更に、組換えＤＮＡ技術により操作され、ウイルスゲノムが、標的細胞又は組織内で発現される関係ある異種遺伝子を含むＤＮＡベクター分子として作用するようしてある。この方法はまた、遺伝子として、（ａ）ヒトのインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト蛋白質若しくはその生物的に活性な誘導体又は断片、（ｂ）ベーターガラクトシダーゼ蛋白質若しくはその生物的に活性な誘導体又は断片をコード化できるＬａｃＺマーカー遺伝子、（ｃ）可溶性インターロイキン−１レセプター蛋白質若しくはその生物的に活性な誘導体又は断片、（ｄ）プロティナーゼ阻害剤、（ｅ）可溶性腫瘍壊死因子レセプター蛋白質若しくはその生物的に活性な誘導体又は断片及び（ｆ）サイトカインを含むグループから選択される１以上の物質をコード化できる遺伝子を用いることを含む。以下に示す実例は、本発明を例示するためのものであって、限定するためのものではない。例ＩＡＡＶのパッケージング組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の複製及びパッケージングに必要な唯一のシス作用性シーケンスは、ＡＡＶ末端リピートである。末端リピート間には、ウイルス複製又はパッケージングを行うことなく、最高４ｋｂのＤＮＡを挿入することができる。ウイルスのレプ(rep)蛋白質及びウイルスカプシド蛋白質は、アデノ随伴ウイルスヘルパーと同様に、トランスにおいて、ウイルス複製に必要とされる。組換えＡＡＶベクターをパッケージするために、末端リピート及び治療遺伝子を含むプラスミドは、レプ蛋白質及びカプシド蛋白質を発現するプラスミドと同時に形質転換され、細胞内に導入される。形質転換された細胞は、次に、アデノ随伴ウイルス及び、形質転換後４８〜７２時間、細胞から隔離されたウイルスで感染される。上澄液は、約５６℃まで加熱され、アデノ随伴ウイルスを不活性にし、組換えＡＡＶの純粋なウイルスストックが残った。例ＩＩエレクトロポレーションエレクトロポレート（電気穿孔）される結合組織細胞は、ヘーペス(Hepes)緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）内に、１ｍｌ当り約１０⁷細胞の濃度で入れられる。エレクトロポレートされるＤＮＡは、ＨＢＳの１ｍｌ当り約５−２０ｕｇの濃度で添加される。その混合物は、キュベットに入れられ、Ｂｉｏ−ＲＡＤエレクトロポレーション装置(1414 Harbour Way Sout h，Richmond，CA 94804)に付随するキュベットホルダー内に挿入される。ほとんどの真核細胞にＤＮＡを導入するには、約９６０ファラドの静電気容量で、約２５０〜３００ボルトの範囲が必要である。ＤＮＡ及び細胞がＢｉｏ−ＲＡＤホルダーに挿入されると、ボタンが押され、一定の電圧が細胞−ＤＮＡ溶液に送られる。細胞は、キュベットから取り除かれ、プラスティック皿に戻される。例ＩＩＩ図１に示す如く、ヒトのインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＲＡＰ）をコード化するｃＤＮＡは、レトロウイルスベクターＭＦＧのＮｃｏＩクローニング部位及びＢａｍＨＩクローニング部位へ挿入された。より具体的には、ＩＲＡＰｃＤＮＡからのＢａｍＨＩ断片へのＰｓｔ１は、ＮｃｏＩ部位（ＩＲＡＰのための翻訳の開始部位を示している）からの合成オリゴヌクレオチドアダプター、Ｐｓｔ１部位（ＮｃｏＩ部位から約１２塩基対下流にある）及びＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化されるＭＦＧバックボーンへ、３部ライゲーション反応で連鎖された。合成オリゴ及び２つのＤＮＡ断片を必要とするこの３部ライゲイションは、クローニングの技術者にはよく知られている。ＬＴＲは長い末端リピート(long terminal repeat)、５’ＳＤは５’スプライスドナー、そして３’ＳＡは３’スプライスアクセプターをそれぞれ意味している。図１の直線及び屈曲線は、それぞれ、スプライシングされていないメッセンジャーＲＮＡ及びスプライシングされたメッセンジャーＲＮＡを示している。ＩＲＡＰは、スプライシングされたメッセージである。図２は、ヒトのインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト蛋白質（ＩＲＡＰ）を、選択可能なネオ遺伝子マーカーでコード化するｃＤＮＡを示している。図３は、ＬａｃＺ⁺滑膜細胞及びネオ⁺滑膜細胞を関節注射した後１ヶ月経過したウサギの膝から回収された滑膜の低出力顕微鏡写真を示している。組織は、ベーターガラクトシダーゼの存在を調べるために、組織科学的に染色された。エオシンで後染色された、この顕微鏡写真は、濃く染色された移植細胞の場所を明らかにし、これらの細胞が、受容関節の滑膜ライニングに定着したことを示した。例ＩＶ動物モデル哺乳類の関節の滑膜へ遺伝子を転移させるという本発明の方法により、以前は不可能だった関節病理の生成及び分析が可能になった。これは、関節炎を生じる (arthriotogenic)可能性のある化合物を関節へ送る他の唯一の方法は、関節内注射によるものだからである。そのような化合物は関節から素早く消えるだけでなく、これらの化合物の塊状注入の効果は、それらが長期に亘り生成されるところでは、生理的状態を正確に模倣しない。これとは対照的に、本発明の遺伝子転移技術では、関節炎の過程への関与が知られている又は推測されている選択された蛋白質が、例えば最低３ヶ月の長期に亘って、関節注射により発現されることが可能になる。従って、本発明の動物モデルでは、各遺伝子生成物の関節炎過程に対する重要性を個別に評価することが可能である。候補遺伝子としては、インターロイキン−１（ＩＬ−１）アルファ、ＩＬ−１ベータ及びＴＮＦ−アルファ等のサイトカインをコード化する遺伝子並びにコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びストロメリシン等のマトリクスメタロプロティナーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に、本発明の遺伝子転移技術は、潜在的な治療蛋白質をスクリーニングに用いるのに適している。この使用では、本発明の動物モデルは、潜在的抗関節炎蛋白質をコード化する遺伝子を発現する滑膜を持つ関節で開始される。候補蛋白質としては、コラーゲン分解酵素阻害等のプロティナーゼ阻害剤及び形質転換増殖因子−ベータなどのサイトカインが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例Ｖ遺伝子治療の供給システムとして滑膜細胞を用いる方法ウサギは、４ｍｌのネンブタールを静脈注射して殺され、その膝は素早く切除された。滑膜は、無菌状態で、各膝から外科的に除去され、細胞は、トリプシン及びコラゲナーゼ（ゲイの(Gey's)緩衝塩類溶液中０．２％ｗ／ｖ）で、それぞれ約３０分及び２時間、連続して消化することにより、細胞を包囲するマトリクスから、除去された。このように回収された細胞は、１０％のウシ胎児血清を補足した約４ｍｌのハムの(Ham's)Ｆ₁₂栄養媒体、約１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと共に、２５ｃｍ²の培養びん内に接種され、９５％空気及び５％ＣＯ₂の大気中で、約３７度で培養される。培養後約３〜４日間で、細胞は合流(confluence)に達する。この段階で培地は除去され、細胞のシートは、リンパ球などの非付着細胞を除去するために、約５ｍｌのゲイの緩衝塩類溶液で２度洗浄される。付着細胞は、次に、トリプシン（緩衝塩類溶液中０．２５％ｗ／ｖ）で処理される。この処理は、線維芽細胞性のＢ型滑膜細胞を分離するが、培養容器に付着しているマクロファージ、多核白血球及びＡ型滑膜細胞を残す。分離された細胞は回収され、１：２の分割比で、２５ｃｍ²の培養容器内に再接種される。合流に達すると、この過程は繰り返される。このような過程を３度経ると、細胞は均一に線維芽細胞性となり、Ｂ型滑膜細胞の異種集団により構成される。この段階で、細胞はレトロビルベクターで感染される。感染の後、細胞は、約１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（GIBCO/BRL，P.O. Box 68，Gr and Island，NY 14072-0068）を補足した新鮮な栄養媒体へ転移され、培養器へ戻される。ネオ細胞が死に、ネオ⁺細胞が増殖して合流に達するので、媒体は３日毎に換えられる。合流すると、上述のように、細胞はトリプシン処理され、二次培養される。ネオ⁺細胞がＬａｃＺ⁺でもあることを確認するためのＸ−ｇａｌ染色用に、１つのフラスコが取っておかれる。二次培養組織が合流に達すると、媒体は回収され、ＩＲＡＰ、可溶性ＩＬ−ＩＲ又は前述した他の適当な遺伝子生成物の存在を調べられる。滑膜細胞の培養組織を生成すると、移植の準備が整う。移植の前日に、細胞は、前述したトリプシン処理により回収される。これらの細胞は、次に、栄養媒体内で浮遊され、未処理のプラスチック遠心管で一晩培養される。このような条件では、細胞は付着しないが、トリプシン処理により除去された細胞表面の蛋白質を再生する。翌朝、細胞は遠心分離により回収され、ゲイの緩衝塩類溶液内で再度浮遊することにより数回洗浄され、最終的に、ゲイの溶液１ｍｌ中約１０⁶〜１０⁷細胞の濃度で再度浮遊される。次に、この浮遊液の約１ｍｌが、関節内注射により、受容ウサギの膝関節に導入される。この目的のためには、２５ゲージ皮下注射針付きの１ｍｌ注射器が必要である。注入は、膝蓋骨腱を通じて行われる。ラジオパク染料を注入した実験は、この方法が、物質を関節全体にうまく導入できることを確認した。本明細書中に記載の多数の実例に関して開示された回収、培養及び移植の条件の変形は、本明細書を参照すれば明らかである。開示された発明の遺伝子治療の部分に基づいてエクスビボ実験を行う人にとっては、本題を離れた(tangential) いくつかのポイントが有用かもしれない。（１）回収された滑膜組織からの滑膜細胞の収量が少ない場合、外科的技術に誤りがあるかもしれない。滑膜は、切断されるときにに収縮する傾向が強い。従って、この組織を切除している間は、内側皮膜と滑膜を共に強く握るべきである。下位で、小さい（約２ｍｍ）横切開を行ってもよく、次に、ピンセットの１つの先を関節窩へ滑らせて、滑膜及び内側皮膜がピンセットの先同士の間に挟まれるようにする。こうして組織は、組織を放さずに切除され、滑膜の収縮を防ぐ。（２）細胞を細胞外の壊死組織片から最初に分離するために、２区画の消化室を用いてもよい。その代わりに、１つの部屋を持つ容器(single chamber vessel )内で滑膜組織を消化し、孔のサイズが４５μｍのナイロンモノフィラメントメッシュを通じて濾過してもよい。（３）細胞を再度浮遊させるとき、細胞集塊の形成を防ぐためには、できるだけ少ない量の媒体を用いるのがよい。細胞集塊は、一旦形成されると、分離するのが困難である。（４）トリプシン処理中、滑膜細胞は、付着状態で持っている星状又は樹枝状の形態を失い、円形になる。細胞は、最初に、円形細胞の塊に分離する。トリプシン処理を終える前に、細胞の大部分を互いに分離させておいてもよい。（５）滑膜細胞は、多数導入遺伝子を含むレトロウイルスベクターを用いるか、又は多数レトロウイルスベクターによるシーケンシャルトランスダクションにより、多数の導入遺伝子で形質導入されてもよい。シーケンシャルトランスダクションでは、第２のトランスダクションは、必要であれば選択の後、そして第１のトランスダクションが経過した後に行われるべきである。（６）滑膜は非常に神経感応な構造物なので、関節注射は、特に急いで行われると苦痛であるかもしれない。１ｍｌ体積の関節内注射には、１０〜１５秒かけるべきである。（７）動物モデルでは、関節内注射の際の注射針の深さは、１ｃｍを越えるべきではなく、注射器のプランジャーを押し下げたとき、抵抗を全く又はほとんど感じないべきである。注射針のプランジャーの前進に対する抵抗は、針の先が関節窩に入っていないことを示している。（８）動物モデルでは、関節の洗浄中に、注入されたゲイの溶液の有用な量を回収するためには、注射針を、あまり深く挿入すべきではない。そうしないと、注射針は、後皮膜を貫通して、膝窩動脈を引き裂くかもしれない。吸引中に、膝を膝蓋骨上、膝蓋下及び横の方向から堅くマッサージすることは、回収される流体の量を増加させるのに役立つ。一般的には、≧０．５ｍｌの流体を回収することが可能なはずである。膝の炎症がひどい時には、関節内に多数の白血球、線維素及びその他の壊死組織片があるため、洗浄がしばしば困難となる。このような条件下では、唯一の手段は、動物を殺して、ゲイの溶液を外科的に回収することである。例ＶＩＢ型滑膜細胞の異種集団の線維芽細胞を大体均一に生成する例Ｖの方法に続いて、ウサギの滑膜線維芽細胞の成長培養組織がもたらされた。ウサギの滑膜線維芽細胞のこれらの成長培養組織は、次に、ベーターガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）をコード化し、ネオマイシンアナログＧ４１８（ネオ⁺）に対して抵抗のあるマーカー遺伝子を保持している両栄養性レトロビルベクターにより感染された。約１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む選択された媒体における感染及び成長に続いて、全ての細胞は、ベータガラクトシダーゼの組織科学的な染色において陽性反応を示した。ＬａｃＺマーカー遺伝子を保持するネオ選択された細胞は、受容ウサギの膝に戻され移植され、これらの遺伝子の残存率及び発現がインビボで調べられた。移植の２週間後に、ＬａｃＺ⁺細胞の島が、受容膝の滑膜内で観察された。これは、本発明の方法が、マーカー遺伝子をウサギの滑膜に導入して、それらをインサイチュー(in situ)で発現できることを確認した。例ＶＩＩネオ選択されたＬａｃＺ⁺滑膜細胞は、細胞の培養組織から回収され、ゲイの緩衝塩類溶液中に浮遊され、受容ウサギの膝関節内に関節注射で注入された(各膝につき、約１０⁵〜１０⁷細胞)。対測性の対照膝は、キャリヤー溶液だけを受け取った。移植後最高３ヶ月の間隔で、ウサギは殺され、その滑膜及びそれを取り巻く皮膜が回収された。各サンプルは、３つの方法で分析することができる。滑膜の３分の１は、ベーターガラクトシダーゼの存在を見るために、集団で(en masse)組織科学的に染色された。第２の部分は、細菌性ベーターガラクトシダーゼに特有の抗体を用いた免疫組織化学に用いることができる。最終部分は、トリプシン及びコラゲナーゼで消化することができ、このように回収された細胞は、Ｇ４１８が存在するところで培養された。大量の滑膜組織の染色により、広範なＬａｃＺ⁺細胞が明らかになり、それらは裸眼で見ることができた。対照滑膜は、無色のままであった。滑膜の組織科学的検査により、ベーターガラクトシダーゼについて陽性反応を示し、濃く染色する細胞の島の存在が明らかになった。これらの細胞は、滑膜ライニングの表面層上に存在し、対照滑膜にはなかった。このような組織からは、ＬａｃＺ⁺細胞及びネオ⁺細胞を増殖させることが可能であった。対照組織から回収された細胞は、ＬａｃＺ^-であり、Ｇ４１８が培養組織に添加されると死んだ。これは、移植され、形質導入された滑膜線維芽細胞は、受容関節の滑膜にうまく移植を行い、２つのマーカー遺伝子であるＬａｃＺ及びネオを発現し続けることを示している。移植された滑膜細胞において、関節内でＬａｃＺ及びネオの発現を維持することは、第１の細胞を用いて３ヶ月間行われ、ＨＩＧ−８２細胞株を用いて１ヶ月間行われた。例ＶＩＩＩこれまでに記載した実例の方法に基づき、当業者によく知られた組換え技術の基準を用いて、ヒトのＩＲＡＰ遺伝子は、図１に示す如く、ＭＦＧベクターに組み込まれた。ウサギを起源とする滑膜細胞の培養組織をこのウイルスベクターで感染させた後に、ＩＲＡＰは、培地に分泌された。当業者によく知られた方法であるウェスタンブロッティングは、ＩＲＡＰに特有のウサギの多クローン抗体を用いて行われた。この抗体は、ヒト又はウサギのＩＬ−１アルファ又はＩＬ−１ベータ並びにウサギのＩＲＡＰを認識しない。図４は、ウェスタンブロットを示しており、それは、ＭＦＧ−ＩＲＡＰで感染されたＨＩＧ−８２細胞の４つの培養組織によるＩＲＡＰの生成について説明している。ＩＲＡＰには３つの形式があり、それは、組換え基準に一致する非グリコシル化形式及び２つのより大きなグリコシル化形式である。図４に示されるウェスタンブロッティングの結果、ＨＩＧ８２滑膜細胞の細胞株(Georgescu，1988，In Vitro 24: 1015-1022)が、本発明のＭＦＧ−ＩＲＡＰベクターで感染された後に、ＩＲＡＰが生成されることが分かった。図４のウェスタンブロッティングは、調整培地のＩＲＡＰの濃度は、５０ｎｇ／ｍｌもの高い濃度であることを示している。これは、５００ｎｇＩＲＡＰ／１０⁶細胞／日に大体匹敵する。図４のレーン１及びレーン２は、受容滑膜組織が、３日目（レーン２）及び６日目（レーン１）に、かなりの量のＨＩＧ−ＩＲＡＰを分泌することを示している。レーン３は、ヒトの組換えＩＲＡＰを示している。レーン６は、ウサギの滑膜細胞は、ＭＦＧ−ＩＲＡＰを注入して感染させた後に、より大きなグリコシル化型のこの分子を生成することを示している。レーン７は、ウサギの本来の滑膜細胞は、このグリコシル化形式のＩＲＡＰを生成しないことを示している。図５は、ＩＲＡＰ⁺滑膜細胞に調整された培地は、組み換えられたヒトのＩＬ −１ベータに曝される関節の軟骨細胞内で、中性メタロプロティナーゼの導入を阻止することを示している。図５は、約５Ｕ／ｍｌ又は１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−１が加えられると、ゼラチナーゼの生成は、それぞれ、４Ｕ／１０⁸細胞及び６Ｕ／１０⁸細胞以上に増加することを示している。本発明の方法により用いられるＭＦＧ−ＩＲＡＰに感染されたＨＩＧ−８２細胞により調整された培地を追加すると、ＩＬ−１で処理された軟骨細胞によるゼラチナーゼの生成が抑制された。５Ｕ／ｍｌのＩＬ−１（図５の右側パネル）を用いたとき、ある培養組織についての阻害率は１００％であり、他の培養組織については４１％であった。１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−１を用いたとき、阻害率は、拮抗阻害剤として予想されるように、３８％及び１８％（図５の左側パネル）に減少した。これらのデータは、ＭＦＧ−ＩＲＡＰにより感染されたＨＩＧ−８２細胞により生成されるＩＲＡＰは、生物的に活性であることを示している。例ＩＸこの例は、リポソームによる感染（リポフェクション法）を用いた滑膜細胞によるＬａｃＺ遺伝子の吸収及び発現を示している。滑膜細胞の培養組織を含む６つのくぼみ付きプレートは、リポフェクション法により、ＬａｃＺ遺伝子を用いて形質導入された。各くぼみの中身は、以下の通りである。くぼみ１リポソームだけで処理された対照細胞くぼみ２ＤＮＡだけで処理された対照細胞くぼみ３ＤＮＡ＋１５０ｎモルのリポソームくぼみ４ＤＮＡ＋２４０ｎモルのリポソームくぼみ５ＤＮＡ＋３００ｎモルのリポソームくぼみ６ＤＮＡ＋６００ｎモルのリポソーム滑膜線維芽細胞の下位合流(sub-confluent)培養組織を含むくぼみ３〜６は、１５０〜６００ｎモル／くぼみの「ＤＣ−ｃｈｏｌ」リポソーム又は「ＳＦ−ｃｈｏｌ」リポソームと複合された６ｕｇのＤＮＡで感染された。３日後、細胞は組織科学的に染色され、ベータ−ガラクトシダーゼの発現を示した（図６）。表１は、滑膜細胞の培養組織を、選択せずに、ＬａｃＺ⁺表現型へ変換する際に「ＤＣ−ｃｈｏｌ」リポソーム及び「ＳＦ−ｃｈｏｌ」リポソームを用いた結果を示している。表１は、約３００ｎモル／くぼみの濃度の「ＤＣ−ｃｈｏｌ」リポソームは、滑膜細胞の培養組織内のおよそ３０％の滑膜細胞を、選択せずに、ＬａｃＺ⁺表現型へ変換することを示している。くぼみ６における発現は、高濃度のリポソームの毒性効果のために減少した。本発明のもう１つの実施例では、遺伝子及びこの遺伝子を用いる方法は、インターロイキン−１の中和をもたらす。インターロイキン−１は、関節炎における軟骨破壊の主なメディエイタである。インターロイキン−１はまた、炎症の原因となり、骨吸収の非常に強力なインデューサーである。これらの効果の多くは、インターロイキン−１が、プロスタグラジンＥ₂、中性プロティナーゼ（コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びストロメリシン）及びプラスミノゲンアクチベーターの細胞合成を膨大に増加させる能力によるものである。インターロイキン−１の軟骨に対する異化効果は、軟骨細胞により軟骨基質の合成を抑制する能力により、激化する。インターロイキン−１は、関節炎の関節から吸収された滑膜液内に、高濃度で存在しており、組換えインターロイキン−１を動物に関節内注射すると、軟骨の損傷及び炎症の原因となることが分かった。インターロイキン−１は、１７，０００ダルトンの非グリコシル化ポリペプチド等の様々な種として存在する。２つの種は以前にクローニングされ、それらは、インターロイキン−１アルファ及びインターロイキン −１ベータである。アルファの形式は、約５のｐＩを持ち、ベータの形式は、約７のｐＩを持つ。これらのイソフォーム(isoforms)の存在にも拘わらず、インターロイキン−１アルファ及びインターロイキン−１ベータは、ほぼ同一の生物的特性を持ち、共通の細胞表面レセプターを共有する。Ｉ型のインターロイキン− １レセプターは、８０ｋＤａ（キロダルトン）グリコプロテインであり、細胞外に、３１９アミノ酸のインターロイキン−１結合部分を含む。これらのアミノ酸は、図７に示されるように、ジスルフィド架橋により共に保持される３つの免疫グロブリン状のドメインに配列されている。２１アミノ酸トランスメンブランドメインは、細胞外の部分を２１７アミノ酸細胞形質ドメインに結合させる。図８Ａ〜図８Ｃは、ヒト及びマウスのインターロイキン−１レセプターのアミノ酸及びヌクレオチドシーケンスを示している。図８Ｂにおいては、インターロイキン −１レセプターの２１アミノ酸トランスメンブラン領域は、太実線で記されている。図８Ａ及び図８Ｂでは、ＰＣＲに対する５’及び３’のオリゴヌクレオチドの位置は、それぞれ、細い短線で記されている。停止コードンに突然変異されるトランスメンブランドメインに対してちょうど５’であるリジンアミノ酸は、図８Ｂに、太い円形で記されている。滑膜は、関節炎の関節において、何より重要な、そして、おそらく唯一のインターロイキンの関節内源である。関節炎の関節から回収された滑膜は、高レベルのインターロイキン−１を分泌する。滑膜ライニング内の定住滑膜細胞及び浸潤性血液単核細胞は、どちらもインターロイキン−１を生成する。本発明は、切形のインターロイキン−１レセプターをコード化する遺伝子をインビボで用いる方法を提供するものであり、そのインターロイキン−１レセプターは、インターロイキン−１を高い親和性で結合する能力を保持するが、細胞外に開放され、このため、シグナルの形質導入が不活発になる。切形及び修正レセプターのインターロイキン−１への結合は、インターロイキン−１の関節内活性を阻害する。インターロイキン−１を結合し、中和する能力のあるインターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン−１結合領域をコード化する遺伝子を用いるこの方法は、切形インターロイキン−１レセプター遺伝子を保持するレトロウイルスベクターを用いることを含み、その遺伝子は、レセプターの切形及び可溶性の活発な形をコード化する。新規なインターロイキン−１レセプター遺伝子の発現は、真核細胞内で活発なベクターに含まれる調整シーケンスによる制御を受ける。この組換えウイルスベクターは、組換えベクターを保持する感染性ウイルス粒子の生成に必要とされるウイルス蛋白質をイントランスで(in trans)安定的に発現している細胞株内に形質転換される。これらのウイルス粒子は、組換えインターロイキン−１レセプターを、インビボでの直接のウイルス感染により受容滑膜細胞へ送るのに用いられる。レトロウイルスベクターに挿入されるべきヒトの可溶性インターロイキン−１レセプターは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成できる。ヒトのインターロイキン−１レセプター(ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＴＡＧＡＡＧＣＴ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５)の５’リーダーシーケンスと相補的なオリゴヌクレオチド及び、インターロイキン−１レセプター(ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴＧＧ；ＳＥＱＩＤＮＯ：６)のトランスメンブランドメインのちょうど上流の領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲのプライマーとして用いられる。トランスメンブランドメインに隣接するインターロイキン−１レセプターの領域のためのプライマーは、１つの塩基変更を含んでいるため、アミノ酸３３６（ＡＡＧ）にあるリジン(lys)コードンは、停止コードン（ＴＡＧ）に変更される。トランスメンブランドメインのちょうど上流に翻訳停止コードンを挿入することにより、細胞により分泌される切形のインターロイキン−１レセプターが生成される。ＢａｍＨＩ認識シーケンス（ＧＧＡＴＣＣ）は、ＰＣＲプライマーの５’端部に加えられ、拡大の後、結果として生じるインターロイキン−レセプター断片は、ＢａｍＨＩ部位にクローニングされる。ヒトのＴ細胞からのｃＤＮＡライブラリーは、インターロイキン−１レセプターｃＤＮＡの源として用いられる。ｃＤＮＡライブラリーからのインターロイキン−１レセプターの適当な領域を拡大するため、相補的プライマーがＤＮＡ及び５０サイクルのアニーリングに加えられ、当業者によく知られたサーモサイクラー(thermocycler)及び標準的ＰＣＲ反応条件を用いて、プライマーの伸長及び変性が行われる。ＰＣＲプロセスを用いたインターロイキン−１可溶性レセプターの拡大の結果生じた断片は、ＢａｍＨＩで消化され、ｐＬＪレトロウイルスベクターに挿入される。ｐＬＪレトロウイルスベクターは、A.J. Korman and R.C．Mulliganから入手可能である。また、Proc ．Natl．Acad．Sci.，Vol．84，pp.2150-2154（April 1987）co- authored by Alan J．Korman，J．Daniel Frantz，Jack L．Strominger and Ric hard C．Mulliganも参照のこと。挿入の正しい方向を決めるために、限定の分析が行われた。切形インターロイキン−１レセプターを保持するレトロウイルスベクターは、ＣＲＩＰに転移される(Proc ．Natl．Acad，Sci.，Vo．85，pp．6460-6464(1988) ，O. Danos and R.C．Mulligan)。ＣＲＩＰは、標準ＣａＰＯ₄形質転換過程及び細胞を用いて、細胞株をパッケージングし、その中では、ウイルスベクターは、安定的に統合され、抗生物質Ｇ４１８への抵抗に基づいて選択される。ネオマイシン耐性（ネオ−ｒ）遺伝子を含むウイルスベクターは、細胞株のＧ４１８への抵抗を与えることができる。ＣＲＩＰ細胞株は、ベクターウイルスＲＮＡｓを感染性粒子にパッケージングするのに必要な３つのウイルス蛋白質を発現する。更に、ＣＲＩＰ細胞株により生成されるウイルス粒子は、ヒトの細胞を含む広範囲の形の哺乳類細胞を効率的に感染させることができる。この細胞株により生成される全てのレトロウイルス粒子は、複製能力を欠くが、滑膜細胞へ安定的に統合する能力を保持しており、このため、これらの細胞の遺伝的特性となる。この方法により生成されるウイルスのストックは、ヘルペス−ウイルス粒子の汚染がほとんどなく、又非病原性である。より具体的には、切形インターロイキン−１遺伝子は、適当な真核細胞プロモーターの調整下で、レトロウイルスベクターに挿入することができる。プロモーターの例としては、図９に示されるｐＬＪベクターなど、遺伝子導入ベクターに既に含まれているレトロウイルスプロモーターがある。図９は、ｐＬＪインターロイキンレセプターレトロウイルスベクターの構造及び部分的限定エンドヌクレアーゼマップを示している。符号(10)は、レトロウイルスベクターに挿入されるインターロイキン−１レセプターを示している。符号(12)は、図８に示されるｐＬＪインターロイキンレセプターレトロウイルスベクターの構造の各端部にある長い末端リピート（ＬＴＲ’ｓ）を示している。これらのＬＴＲは、インターロイキン−１レセプターのウイルス転写及び発現を調整している。抗生物質的ネオマイシン（ネオ−ｒ）への抵抗をコード化する細菌性遺伝子は、符号(1 6)で示されている。サルウイルス４０エンハンサープロモーター（ＳＶ４０）は、符号(18)で示され、ネオ−遺伝子の発現を調整する。符号(20)(22)は、結果的に生じるインターロイキンレセプター断片がクローニングされる部位をそれぞれ示している。異なる真核プロモーターを含む他のベクターを用いることによっても、ほぼ最大レベルのインターロイキン−１レセプターの発現を得られることは、当該分野の専門家によって理解されるであろう。切形で且つ修正されたインターロイキン−１レセプターを含むベクターは、形質転換及び安定的な形質転換体により、レトロウイルスパッケージング細胞株（ＣＲＩＰ）に導入される。安定的な形質転換体は、ｐＬＪも保持しているネオマイシン抵抗遺伝子の発現のための選択により隔離されている。ＣＲＩＰ細胞株は、外因性レトロウイルスＲＮＡのパッケージングに必要な全ての蛋白質を発現する。Ｇ４１８に選択されたＣＲＩＰにより生成されるウイルス粒子は、哺乳類細胞を感染させることができる組換えレトロウイルスを保持し、インターロイキン−１切形レセプターを安定的に発現する。このウイルス粒子は、ウイルスを関節窩に注入することにより、滑膜細胞をインビボで直接感染させるために用いられる。本発明のもう１つの実施例は、前述のウイルス粒子を用いて、哺乳類宿主の関節のライニングから得られた滑膜細胞を培養で感染させる方法を提供する。滑膜細胞を培養で感染させることの利点は、インターロイキン−１レセプターレトロウイルス構成体を持つ感染された細胞を、Ｇ４１８を用いて選択し、ネオマイシン抵抗遺伝子を発現できることである。インターロイキン−１レセプターを発現する感染された滑膜細胞は、次に、関節内中注射により、関節へ戻され移植されることができる。移植された細胞は、関節窩で、高レベルの可溶性インターロイキン−１レセプターを発現し、これによって、インターロイキン−１アルファ及びインターロイキン−１ベータを含め、インターロイキン−１のほぼ全てのイソフォームを結合・中和させる。関節内での滑膜細胞の移植に用いられる方法は、慢性的な炎症性の関節病で用いられる型どおりで比較的小さな手順である。滑膜は、開放外科手術中に関節から回収してもよいが、現在では、特に膝に関しては、関節鏡を用いて滑膜切除を行うのが普通である。関節鏡は、小さい刺し傷を通じて膝へ挿入される中空の杆状体である。線維オプションシステムの関節内挿入を許するだけでなく、関節鏡は、外科的器具へ接近できるので、滑膜組織は関節鏡を用いて切除される。このような手順は、「脊椎」麻酔により行うことができ、患者は同日に帰宅を許される。このように、この遺伝子治療を受ける患者から十分な滑膜を得ることができる。切除された組織に含まれる滑膜細胞は、結合組織マトリクスの酵素的消化により、無菌状態で回収することができる。一般的に、滑膜は、直径約１ミリメートルの断片に切られ、トリプシン（ゲイの緩衝塩類溶液中０．２％ｗ／ｖ）で３７℃で３０分間消化した後、コラゲナーゼ（ゲイの緩衝塩類溶液中０．２％ｗ／ｖ）で３７℃で２時間消化される。この消化により回収された細胞は、１０％のウシ胎児血清及び抗生物質を補足したハンクの(Hank's)Ｆ₁₂媒体を用いて、１平方センチメートル当たり１０⁴〜１０⁵細胞の濃度で、プラスチックの培養皿に接種される。３〜７日後、培地は取り除かれる。リンパ球などの非付着性細胞は、ゲイの緩衝塩類溶液で洗浄することにより取り除かれ、新しい媒体が加えられる。付着性の細胞は、そのままで用いることができ、合流に達するまで増殖することを許されるか、又は、１以上の２次培養を通じて得られる。２次培養は、細胞の数を拡大し、マクロファージなどの非分裂細胞を除去する。このように回収される細胞を遺伝子操作した後、細胞を、トリプシン処理、擦過またはその他の手段により、培養皿から取り除き、標準的な浮遊液にすることができる。ゲイの緩衝塩類溶液又は適当な組成を持つその他の等張塩溶液もしくは食塩水などが適当なキャリヤーである。細胞の浮遊液は、受容哺乳類の関節に注射することができる。このタイプの関節内注射は、型どおりのものであり、医院で容易に行うことができる。外科手術は必要ない。非常に多くの細胞をこのように導入することができ、必要に応じて繰り返し注射をすることができる。本発明のもう１つの実施例は、前述の作製方法により生成される遺伝子である。レトロウイルスに保持されるこの遺伝子は、非経口投与の目的で、緩衝生理食塩水などの適当な薬剤キャリヤーに組み込むことができる。この遺伝子は、治療上有効な量を投与することができる。より具体的には、この遺伝子は、治療上有効な量を適当な薬剤キャリヤーに組み込み、関節内注射により投与することができる。従って、エクスビボでの供給法に関する望ましい方法は、患者の結合組織（例えば滑膜）を除去し、この結合組織をインビトロで培養し、関係あるＤＮＡシーケンスを形質導入し、患者の苦しむ関節へ供給する前に上記の操作を行うものである。本発明のもう１つの実施例では、遺伝子を、予防的手段として患者に投与することにより、この病気を発生する感受性が高いと判断された患者内での関節炎の発生を阻止することができる。より具体的には、レトロウイルスに保持されるこの遺伝子は、予防上有効な量を適当な薬剤キャリヤーに組み込み、関節内注射などの非経口注入により投与することができる。例ＸＣＭＶプロモーターの下流でライゲートされるインターロイキン−１ベータコーディングシーケンスを含む、５０ミクログラムのＤＮＡプラスミドベクター分子は、陽イオンリポソームに包皮され、ゲイの生物的緩衝剤と混合され、ウサギの膝関節に関節内注射された。注射の４８時間後、１ナノグラムのインターロイキン−１ベータが膝関節エリアから回収された。従って、リポソーム溶液を含むＤＮＡを滑膜組織の領域内に注射することにより、リポソームの滑膜細胞への融合、ＤＮＡプラスミドベクターの滑膜細胞への導入及び、その結果としてのＩＬ −１ベータ遺伝子の発現が促進された。更に、包皮されていない（つまり裸の）ＤＮＡを関節エリアに注射し、ＤＮＡベクターの滑膜細胞への形質転換を検査することが可能である。形質転換は、次に起こる滑膜細胞内のＩＬ−１ベータ遺伝子の発現により測定される。従って、本発明でも例示されている滑膜のインビトロでの操作の代わりには、どちらの方法を用いてもよい。例ＸＩＭＦＧ−ＩＲＡＰ構成体のインビボでの生物的活性は、ＩＬ−１βの効果を抑制する能力として検査される。苦しむ関節窩内での白血球濃度を増加させることが知られているヒトの組換えＩＬ−１βが、ウサギの膝に注射された。ＭＦＧ− ＩＲＡＰ／ＨＩＧ−８２細胞をウサギの膝に導入すると、苦しむ関節窩への白血球のＩＬ−１β生成が抑制された。対照的に、対照ＨＩＧ−８２細胞は、ＩＬ− βに攻撃される関節窩への白血球の浸潤を抑制しない（図１０を参照）。ヒトの組換えＩＬ−１β（ｈｒＩＬ−１β）の用量が最低の時、阻害は最高である。これは、ＩＲＡＰがＩＬ−１を拮抗する競合的メカニズムにより予想された通りである。従って、このウサギのモデルは、インビボでの関節内注射によるＩＲＡＰの発現は、生物的に活性であり、ＩＬ−１により引き起こされる炎症から関節を保護することを確認した。例ＸＩＩこの例は、更に、ＭＦＧ−ＩＲＡＰ構成体のウサギの関節へのエクスビボでの供給を測定している。知られているように、ＩＲＡＰは、約２５ｋＤａの酸性グリコプロテインであり、ＩＬ−１レセプターと結合することにより、インターロイキン−１（ＩＬ−１）の生物的活性の自然アンタゴニストとして機能する。ＩＬ−１と異なり、ＩＲＡＰにはアゴニスト活性(agonist activity)がなく、その代わりに、ＩＬ−１の結合の競合阻害剤として作用する。この例は、遺伝子学的に修正された滑膜細胞によるＩＲＡＰのインビボ発現は、ＩＬ−１β誘発性白血球の関節窩への浸潤、滑膜の肥大及び細胞充実性並びにプロテオグリカンの関節軟骨からの損失を阻害することを示している。本明細書に記載の通り、エクスビボのルートで患者を治療する望ましい方法は、関節内注射により、遺伝子学的に修正された滑膜細胞を移植する方法である。しかし、培養で容易に維持されるＨＩＧ−８２が、これらの実験に用いられ、関節内で発現されるＩＲＡＰは、関節内注射されたＩＬ−１の生理学的後遺症を阻害するのに効果的であることを明らかにした。ＭＦＧ−ＩＲＡＰ／ＨＩＧ−８２細胞又は対照（感染されていないＨＩＧ−８２）細胞は、本発明に記載の方法による関節内注射によってウサギの膝に移植された。簡潔に言うと、これらの細胞の培養組織は、ＭＦＧ−ＩＲＡＰで感染された。感染されたＭＦＧ−ＩＲＡＰ／ＨＩＧ−８２細胞により３日間調整された培地は、ヒトのＩＲＡＰを見るために、市販のセット(R&D Systems，Minneapolis ，MN，USA)を用いてＥＬＩＳＡアッセイにより検定され、約５００ｎｇのＩＲＡＰ／１０⁶細胞を含むことが分かった。ウェスタンブロッティングは、サイズ２２〜２５ｋＤａのヒトのＩＲＡＰの存在を確認した。ＨＩＧ−ＩＲＡＰ細胞はトリプシン処理され、ゲイの緩衝塩類溶液に浮遊され、１０⁷細胞を含む１ｍｌの浮遊液が、ニュージーランドホワイトラビット（２，５ｋｇ）の左膝の関節に関節内注射された。対側性の対照膝は、形質導入されていないＨＩＧ−８２細胞の注射を同様に受けた。細胞移植の３日後に、膝関節は、０．５ｍｌのゲイの溶液中に溶けているヒトの組換えＩＬ−１βの１つの関節内注射の量を様々に変えて攻撃された。対照膝は、０．５ｍｌのゲイの溶液を注射された。ｈｒＩＬ−１βを注射した１８時間後に、ウサギは殺され、膝関節はＩＲＡＰの発現を見るために、組織病理学的に測定された。各関節は、まず、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのゲイの溶液で洗浄された。これらの洗浄における細胞の計数は、血球計数器により行われた。一定部分は除去され、光学顕微鏡での検査に先だって「ディフクイック(DiffQuick)」（Baxter Scientific Products)でサイトスピニング(cytospinning)及び染色された。次に、洗浄液は遠心分離にかけられた。上澄液は取り除かれて、ＩＲＡＰＥＬＩＳＡ検定を受け、軟骨損傷のインデックスとしてのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）濃度が測定された。ＧＡＧの測定は、ジメチルメチレンブルー検定法で行われた(Farndale，et al.，198 6, Biochim Biophys Acta 883: 173-177)。滑膜は、膝関節から切開され、７０％エタノール中に固定され、脱水され、パラフィンに埋め込まれ、５μｍに切断され、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された。ＭＦＧ−ＩＲＡＰ／ＨＩＧ８２細胞の移植の４日後の関節の洗浄において、各膝当たり平均２．５ｎｇのヒトのＩＲＡＰが測定された。実験されたことのないＨＩＧ−８２細胞を受ける対側性の対照膝には、検出できるほどのヒトのＩＲＡＰがなかった（図１１）。観察されたレベルＩＲＡＰの発現が、インビボでＩＬ −１の効果を阻害するのに十分であるかどうかを決定するために、濃度を増やしたＩＬ−１β（０−１００ｐｇ）が、対照膝及びＩＲＡＰ膝に注射された。図１２ａに示すように、ｈｒＩＬ−１βの対照膝への注射は、際だった白血球増加症を引き起こし、それは、遺伝子学的に修正された膝の中で強く抑制された。ＩＬ −１を注射されていないＭＦＧ−ＩＲＡＰ／ＨＩＧ−８２細胞を含む膝における白血球の計数は、統計的に著しく減少した。これは、関節へ細胞を注射した結果起こる僅かな炎症にＩＲＡＰが与える影響を反映するかもしれない。ＩＲＡＰによる抑制の程度は、ＩＲＡＰとＩＬ−１との間に存在する阻害の競合的方法に合わせて、注射されたｈｒＩＬ−１βの量が増加するに従って減少した。これらの特定の実験では、ｈｒＩＬ−１βのみに対する用量反応は、明白ではない。何故なら、この特定バッチのＩＬ−１は、最低用量が用いられた時でさえ、最大反応を引き出すのに特に効果的であった。サイトスピン(cytospin)（図１２ｂ及び図１２ｃ）の検査により、浸潤白血球のほとんどは、好中性白血球且つ単核細胞であることが明らかになった。これらの試料はまた、白血球がＩＲＡＰ遺伝子により抑制される効率を説明する役割を果たす。ＩＲＡＰを生成する膝（図１２ｃ）からは、ＩＲＡＰでない膝（図１２ｂ）の洗浄液の１０倍の洗浄液がサイトスピン上に表されている。関節内で発現されたＩＲＡＰが軟骨の損傷を阻止できるかどうかを決定するために、関節の洗浄液内のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の濃度が測定された。対照膝及びＩＲＡＰを発現する膝からの洗浄液のＧＡＧ分析（図１３）により、ＩＲＡＰ遺伝子を導入すると、ＩＬ−１に反応して、軟骨基質の損傷を部分的に阻止することが確認された。今回もまた、ＩＬ−１の濃度が最低の時、阻害が最も強く、ＩＬ−１の用量が最高の時、阻害は終わった（図１３）。注射された１０ｐｇのｈｒＩＬ−１βに反応して、対照滑膜は肥大し（図１４ａ）、細胞充実した（図１４ｃ）。滑膜の細胞充実性の増加には、滑膜細胞の数の増加及び白血球の浸潤の両方が関係しているように思われる。ＭＦＧ−ＩＲＡＰ／ＨＩＧ−８２細胞が存在する膝では、これらの変化は完全に抑制され、滑膜は、対照滑膜とほとんど見分けがつかない（図１４ｂ及び図１４ｄ）。ヒトのＩＲＡＰ遺伝子を、エクスビボでウサギの膝の滑膜ライニングへ導入することは、次に起こるｈｒＩＬ−１βによる関節内抵抗の病理生理学的後遺症から、これらの関節を明らかに保護する。ヒトの組換え滑膜液に存在するＩＬ−１の量を測定すると、０〜５００ｐｇ／ｍｌの範囲の値となる（Westacott，et al.，1990，Ann Rheum Dis．49: 676-68 1；Malvak，et al.，1993，Arthritis Rheum 36: 781-789)。従って、今回の短期間の実験中に関節内で発現されるＩＲＡＰの量は、ヒトの関節炎の関節に存在する濃度のＩＬ−１の生物的活性を阻止するのに十分なはずである。例ＸＩＩＩこの例は、ＭＦＧ−ＩＲＡＰで形質導入された滑膜細部のエクスビボ移植の結果発現される関節内ＩＲＡＰのレベルは、ウサギの膝の抗原誘発性関節炎に関連する様々な病理生理学的変化を阻害するのに十分であることを示している。関節内で発現されるＩＲＡＰは、この病気の急性期に、軟骨保護(chondroprotective )効果及び抗炎症効果の両方を持つ。例ＸＩＩに記載されるデータは、明細書及び請求の範囲に記載される発明は、苦しむ関節へ蛋白質を供給する方法と比較して、関節炎などの結合組織障害を治療するための著しい進歩であるという主張を支持している。例ＸＩＩは、本明細書に記載のように、ＭＦＧ−ＩＲＡＰをウサギの膝へエクスビボ導入することにより、グリコシル化された生物的に活性なＩＲＡＰがナノグラム量で関節内に蓄積されることを示している。この例は、この遺伝子治療に基づく生成物は又、ヒトのリウマチ様関節炎のウサギのモデルにおける関節病理を阻害することを示している。青少年期のウサギは、左膝の関節を外科的に部分切除され、自己由来の細胞が提供された。これらの自己由来の細胞は、例Ｖ及び例ＩＸに記載されるように、これらのバイオプシー（生検によって得られた試料）からウサギの滑膜線維芽細胞（Ｂ型滑膜細胞）の培養組織を生成するのに用いられた。次に、下位合流培養組織は、ＭＦＧ−ＩＲＡＰを注射することにより形質導入された。導入遺伝子の発現は、調整培地におけるヒトのＩＲＡＰの濃度を測定することにより確認された。その値は、一般的には、１００〜５００ｎｇＩＲＡＰ／１０⁶細胞／３日間の範囲である。同じ動物からの滑膜細胞の姉妹培養組織(sister cultures)は、ＬａｃＺ及びネオ^rマーカー遺伝子をコード化するＢＡＧウイルスで感染され、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）の存在するところで増殖させるために選択され、対照とされた。形質導入されていない滑膜細胞もまた、追加対照として用いられた。細胞が増殖され、形質転換されている期間に、提供ウサギは、アジュバント中で乳化されたオボアルブミン５ｍｇを、２回１組の皮内注射を２週間の間隔を空けて行うことにより、オボアルブミンに感作された。２回目の注射から２週間後、１ｍｌの生理食塩水中に溶けているオボアルブミン５ｍｇを右膝関節へ注射することにより、急性の単関節関節炎が開始された。このときまでに、左の提供膝は、その滑膜を再生させており、それぞれ、対照として、１ｍｌの生理食塩水を注射された。関節炎の開始から１日後、１０⁷の自己由来細胞は、ＩＲＡＰ遺伝子若しくはＬａｃ及びネオ遺伝子のどちらかで形質導入され、各関節炎膝及び各対側性の関節炎でない膝に注射された。その他の対照実験において、膝は、形質導入されていない自己由来の細胞を注射された。ウサギのグループは、３日後及び７日後に殺された。これらは、この関節障害の急性期に相当する。膝は、滑膜組織及び関節軟骨を切除して分析する前に、１ｍｌの生理食塩水で洗浄された。ＭＦＧ−ＩＲＡＰ導入遺伝子の関節内発現は、ＥＬＩＳＡにより測定され、洗浄液中のヒトのＩＲＡＰが測定された。対照の、関節炎でない膝におけるＩＲＡＰ濃度は、図１５に示されている。どちらの時点でも、関節炎の膝におけるＩＲＡＰ濃度は、正常な膝におけるものよりも常に数倍も高かった（図１５）。ＭＦＧ−ＩＲＡＰを形質導入された関節炎の膝及び関節炎でない膝の両方で、ＩＲＡＰ発現は、時間と共に僅かに減少した。正常ウサギな又は関節炎のウサギから得られた血清においては、ヒトのＩＲＡＰを検出することはできなかった。これらの実験の過程における、ウサギの関節炎の膝におけるＩＬ−１の関節内濃度は、１００〜２００ｐｇ／膝の範囲であった（図１６）。洗浄液のＩＬ−１ αは、ＲＩＡでは検出されなかった。このように、これらの膝におけるＩＲＡＰの濃度は、約１０〜５０因子分、ＩＬ−１の濃度を上回った。ＩＲＡＰ遺伝子を受ける関節炎の膝におけるＩＬ−１の７日目の濃度は低かった(図１６)。これは、ＩＲＡＰが、オートクリン増幅ループを阻害したことを示唆している。リウマチ様関節において優勢な２つの主な病理は、関節軟骨の損失及び炎症である。前者は、合成の減少及び軟骨基質の分解強化が組み合わさって起こる。一方、炎症は、滑膜炎として明らかであり、滑膜炎には白血球の関節窩への流入が伴う。この例における抗原誘発性関節炎には、洗浄液のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量の増加に反映される軟骨損傷（図１７ａ）及び³⁵ＳＯ₄ ^2-の低い吸収率に反映される軟骨プロテオグリカンの合成の減少（図１７ｂ）が伴う。ＭＦＧ −ＩＲＡＰ導入遺伝子を発現する膝であって、対照膝でないものは、これらの変化からほぼ完全に保護された。ＧＡＧ放出（図１７ａ）は、４日目には５５％阻害され、７日目には３２％阻害された。ＧＡＧ合成の抑制（図１７ｂ）は、４日目には６８％阻害され、７日目には１００％阻害された。ＭＦＧ−ＩＲＡＰ導入遺伝子は、白血球の関節窩への流入を強力に減少させた。この効果は、７日目（３８％の阻害）よりも４日目（６５％の阻害）でより強力であった。実際、７日目での相違は、統計的に重要というほどのものではなかった。ＭＦＧ−ＩＲＡＰ構成体は、本発明の請求の範囲に記載された部分を例示するために用いられている。この構成体以外に、本明細書の開示内容に基づくエクスビボ実験が用いられ、滑膜細胞へ導入し、ヒトのＩＬ−１α、ヒトのＴＮＦ−α 可溶性レセプター、ｖＩＬ−１０、ＬａｃＺ及びネオ^rをコード化するＤＮＡシーケンスをインビボ発現した。例ＸＩＶ本明細書に記載の方法が用いられ、インビトロ培養滑膜細胞内で、ＭＦＧ−ヒトのＩＬ−１可溶性レセプターＩ型及びII型の構成体（ネオ^rと共に）を発現した。これらの形質転換された滑膜細胞は、ネオの選択に続いて、１〜２ｎｇ／１０⁶細胞のＩＬ−１可溶性レセプターＩ型及びII型を生成する。本明細書に記載された追加の方法を用いて、ＭＦＧ−ヒトのＩＬ−１可溶性レセプターＩ型及び II型に関するデータのインビボ発現を得てもよい。例ＸＶウサギの膝関節の１つに、表IIに記載された特定のウイルス性又は非ウイルス性ベクターが関節内注射された。対側性の膝には、異なるパッセンジャー遺伝子を持つ同一のウイルス性又は非ウイルス性ベクターを通常持っている対照が注射された。関節内注射の後、２日から２週間間隔で、ウサギは殺され、膝関節が得られ、Ｘ−Ｇａｌで染色され、ＬａｃＺ発現を調べるために検定された。その結果は表IIに記載されている。ＣＭＶ−ＬａｃＺ融合物からなる組換えアデノウイルスベクター及び、ＣＭＶ−ＬａｃＺ融合物からなる組換えＨＳＶは、関節内注射の後に、最高レベルの発現を生じた。組換えレトロウイルスベクターであるＭＦＧ−ＬａｃＺは、インビボ発現されなかった。このことにより、レトロウイルスベクターは、感染過程で活発に分裂する細胞及び、それに不随して、関節ライニングで滑膜細胞の低い有糸分裂活動を必要とするという概念に信用が添えられた。しかし、炎症を起こしている関節窩の滑膜細胞へＭＦＧ−ＩＲＡＰを関節内注射することで、レトロウイルスの形質導入が支持された。ウサギの炎症を起こしている膝にＭＦＧ−ＩＲＡＰを注射すると、注射から２４時間後に、４１４．７ｐｇ／膝が関節内に蓄積された。対側性の膝は、僅かに４６．０５ｐｇのヒトのＩＲＡＰ含み、これは、バックグラウンドレベルに近いものであった。これらのデータは、本発明の明細書及び請求の範囲に記載の遺伝子治療方法は、関節炎の動物モデルにおける病気の過程を調整するために用いることができることを示している。次に、これらの例は、請求の範囲に記載の遺伝子治療に基づいた、結合組織の病理の治療及び苦しむ関節内での炎症の全身的インデックスを可能にする。本発明は、インビトロ又はその代わりにインビボで、哺乳類宿主の結合組織細胞へ、治療的特性を持つ蛋白質をコード化する１以上の遺伝子を導入する方法を提供するものであることは、当該分野の専門家によって理解されるであろう。この方法は、維持能力及び発現能力のあるＤＮＡを持つ遺伝子を用いることを含む。本発明が、哺乳類宿主の関節炎疾患の治療の目的で、哺乳類宿主の結合組織の１以上の細胞内へ、生成物をコード化する１以上の遺伝子を導入する方法を提供するものであることは、当該分野の専門家によって理解されるであろう。本発明が、哺乳類宿主の結合組織を修復・再生する方法を提供するものであることは、当該分野の専門家によって理解されるであろう。本発明が、関係あるＤＮＡシーケンスを哺乳類宿主の結合組織細胞へ供給するエクスビボ及びインビボの技術を記載していることは、更に理解されるであろう。エクスビボの技術では、標的自己由来結合組織細胞を予め切除して培養し、ＤＮＡシーケンス、ＤＮＡベクター又はその他の関係ある供給手段を結合組織細胞にインビトロで感染させ、次に修正された結合組織を哺乳類宿主の標的関節へ移植することにより、関係ある遺伝子生成物のインビボ発現を行う。インビボの技術は、標的結合組織細胞のインビトロ培養に必要な条件を無視し、その代わりに、ＤＮＡシーケンス、ＤＮＡベクター又はその他の供給手段を、標的インビボ結合組織細胞へ直接に移植する方法によって、関係ある遺伝子生成物の発現を行う。本発明が、結合組織の病理を研究するための動物モデルを提供するものであることは、更に理解されるであろう。本発明が、インターロイキン−１のほぼ全てのイソフォームに結合し、中和させることができるインターロイキン−１レセプターの細胞外インターロイキン− １ドメインをコード化する遺伝子を用いる方法及び調整する方法を提供し、哺乳類宿主の軟骨を病的劣化からほぼ完全に保護するものであることは、当該分野の専門家により理解されるであろう。更に、本発明の遺伝子を用いる方法が、炎症を減少させ、関節の軟部組織を保護し、関節炎で苦しむ患者内で起こる骨の損失を抑制するものであることは、当該分野の専門家により理解されるであろう。前述の発明で用いられるウイルスベクターを用いて、インビボ又は培養によって、滑膜細胞を形質転換できることは、当該分野の専門家により理解されるであろう。その方法としては、例えば、切形インターロイキン−１レセプター遺伝子を保持するレトロウイルスベクターで形質導入された患者からの自己由来の滑膜細胞を直接に間接内注射又は移植することなどがあげられる。本明細書に記載されように、ＩＲＡＰを含み、しかしＩＲＡＰに限定されないＤＮＡシーケンスのクラスは、請求の範囲に記載の方法を用いて、炎症を減少させ、関節の軟部組織を保護し、関節炎で苦しむ患者内で起こる骨の損失を抑制することは、当該分野の専門家により理解されるであろう。以上、本発明を例示する目的で、本発明の特定の実施例を記載してきたが、本発明の詳細な部分に関しては、添付の請求の範囲に記載の発明から逸脱することなく、多数の変形を行いうることは、当該分野の技術者には明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＧＣ１２Ｒ 1:92）Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＧ (72)発明者エバンズ，クリストファーエイチ. アメリカ合衆国 15211 ペンシルバニア, ピッツバーグ，メープルテラス 111 (72)発明者ロビンズ，ポールディ. アメリカ合衆国 15216 ペンシルバニア, ピッツバーグ，オーバールック 527

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）蛋白質又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスを含む組換えウイルスベクターを発生させ、ｂ）インビトロ培養された結合組織細胞の集団を組換えウイルスベクターで感染させ、その結果、形質転換された結合細胞の集団を生じ、ｃ）形質転換された結合細胞を哺乳類宿主の関節窩へ移植させ、これに続く関節窩内の蛋白質の発現は、結合組織障害に通常関連する１以上の有害な関節病理又は炎症の兆候を減少させる結合組織障害を治療する方法。２．結合組織細胞は、滑膜、軟骨、腱及び靱帯により構成される結合組織のグループから選択される請求項１に記載の方法。３．結合組織細胞は、滑膜細胞である請求項２に記載の方法。４．組換えウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである請求項３に記載の方法。５．形質導入された滑膜細胞は、関節内注射により移植される請求項４に記載の方法。６．滑膜細胞は、自己由来の滑膜細胞である請求項５に記載の方法。７．組換えレトロウイルスベクターは、ＩＲＡＰ又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項４に記載の方法。８．組換えレトロウイルスベクターは、ＩＲＡＰ又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項５に記載の方法。９．組換えレトロウイルスベクターは、ＩＲＡＰ又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項６に記載の方法。 10．組換えレトロウイルスベクターは、ＭＦＧ−ＩＲＡＰである請求項４に記載の方法。 11．組換えレトロウイルスベクターは、ＭＦＧ−ＩＲＡＰである請求項５に記載の方法。 12．組換えレトロウイルスベクターは、ＭＦＧ−ＩＲＡＰである請求項６に記載の方法。 13．組換えレトロウイルスベクターは、インターロイキン−１レセプター蛋白質又はその生物的に活性な断片の細胞外ドメインをコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項４に記載の方法。 14．レトロウイルスベクターは、ＭＦＧである請求項１３に記載の方法。 15．組換えレトロウイルスベクターは、ＴＮＦ−α可溶性レセプター蛋白質又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項４に記載の方法。 16．レトロウイルスベクターは、ＭＦＧである請求項１５に記載の方法。 17．組換えレトロウイルスベクターは、ＩＬ４蛋白質又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項４に記載の方法。 18．レトロウイルスベクターは、ＭＦＧである請求項１７に記載の方法。 19．組換えレトロウイルスベクターは、ＩＬ１０蛋白質又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項４に記載の方法。 20．レトロウイルスベクターは、ＭＦＧである請求項１９に記載の方法。 21．形質転換された結合細胞の集団は、移植の前に保存されている請求項１に記載の方法。 22．形質転換された結合細胞の集団は、移植の前に、液体窒素の下で１０％のＤＭＳＯ中に保存されている請求項２１に記載の方法。 23．結合組織は、関節窩内で、損傷した結合組織を再生するのに用いられる請求項２に記載の方法。 24．ａ）蛋白質又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスを含む組換えＤＮＡプラスミドベクターを発生させ、ｂ）インビトロ培養された結合組織細胞の集団を組換えＤＮＡプラスミドベクターで感染させ、その結果、形質転換された結合細胞の集団を生じ、ｃ）形質転換された結合細胞を哺乳類宿主の関節窩へ移植させ、これに続く関節窩内の蛋白質の発現は、結合組織障害に通常関連する１以上の有害な関節病理又は炎症の兆候を減少させる結合組織障害を治療する方法。 25．形質転換過程は、リポソーム包皮、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション法及びＤＥＡＥ−デキストラン法により構成されるグループから選択される手段により達成される請求項２４に記載の方法。 26．結合組織細胞は、滑膜、軟骨、腱及び靱帯により構成される結合組織のグループから選択される請求項２４に記載の方法。 27．ａ）蛋白質又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスを含む組換えウイルスベクターを発生させ、ｂ）インビトロ培養された結合組織細胞の集団を組換えウイルスベクターで感染させ、その結果、形質転換された結合細胞の集団を生じ、ｃ）形質転換された結合細胞を哺乳類宿主の関節窩へ移植させる関節病理の研究のために動物モデルを生成する方法。 28．結合組織細胞は、滑膜、軟骨、腱及び靱帯により構成される結合組織のグループから選択される請求項２７に記載の方法。 29．結合組織細胞は、滑膜細胞である請求項２８に記載の方法。 30．組換えウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである請求項２９に記載の方法。 31．形質導入された滑膜細胞は、関節内注射により移植される請求項３０に記載の方法。 32．滑膜細胞は、自己由来の滑膜細胞である請求項３１に記載の方法。 33．組換えレトロウイルスベクターは、ヒトのＩＬ−１α又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項３２に記載の方法。 34．組換えレトロウイルスベクターは、ヒトのＩＬ−１β又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項３２に記載の方法。 35．組換えレトロウイルスベクターは、ヒトの腫瘍壊死因子−α又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項３２に記載の方法。 36．ａ）蛋白質又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスを含む組換えＤＮＡプラスミドベクターを発生させ、ｂ）インビトロ培養された結合組織細胞の集団を組換えＤＮＡプラスミドベクターで感染させ、その結果、形質転換された結合細胞の集団を生じ、ｃ）形質転換された結合細胞を哺乳類宿主の関節窩へ移植させる関節病理の研究のために動物モデルを生成する方法。 37．結合組織細胞は、滑膜、軟骨、腱及び靱帯により構成される結合組織のグループから選択される請求項３６に記載の方法。 38．結合組織細胞は、滑膜細胞である請求項３７に記載の方法。 39．組換えプラスミドＤＮＡベクターは、ヒトのＩＬ−１α又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項３８に記載の方法。 40．組換えプラスミドＤＮＡベクターは、ヒトのＩＬ−１β又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項３８に記載の方法。 41．組換えプラスミドＤＮＡベクターは、ヒトの腫瘍壊死因子−α又はその生物的に活性な断片をコード化するＤＮＡシーケンスからなる請求項３８に記載の方法。 42．組換えプラスミドＤＮＡベクターは、ＣＭＶ−ＩＬ−１βである請求項４０に記載の方法。