JPH10501237A - オリゴヌクレオチドのためのシクロデキストリン細胞送達系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 シクロデキストリンと複合体を形成したオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。該オリゴヌクレオチドは該シクロデキストリンと非共有結合的に会合している。または、該オリゴヌクレオチドは、該シクロデキストリンと非共有結合的に会合したアダマンタンと共有結合により複合体を形成する。オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みおよび細胞内濃度を促進する方法、オリゴヌクレオチドの細胞中での溶解度を増大させる方法、およびウイルス感染のためまたはウイルス感染を防御するために細胞を処理する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチドのためのシクロデキストリン細胞送達系 発明の背景 本発明は、アンチセンス療法に関する。さらに詳しくは、本発明は、アンチセ ンスオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを促進する組成物および方法に関 する。 細胞性および外来の遺伝子の発現をモデュレートしうる新たな化学療法剤が開 発されている。これらの薬剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれ、塩基 対のワトソン−クリック則またはフーグスティーン則に従って標的核酸分子に結 合し、かくして結合することによって該標的分子の機能を破壊させる一本鎖のオ リゴヌクレオチドであり、かかる機能の破壊は幾つかの機構のうちの一つ、すな わち正常な転写、スプライシングまたは翻訳に必要な因子の結合を妨害すること 、ＲＮアーゼＨによるＲＮＡの酵素的分解を誘起すること、または該アンチセン スオリゴヌクレオチドに直接結合した反応性の基により標的分子を破壊すること によるものである。それゆえ、アンチセンスオリゴヌクレオチドは遺伝子の発現 を配列特異的に抑制するための研究手段として広く用いられるようになってきて おり、治療剤としての可能な用途が研究されているところである(たとえば、ア グラワル(Ａgrawal)ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)(１９９３)９０ ：３８６０−３８８４；バイエバー(Ｂayever)ら(１９９２)Ａntisense Ｒes． Ｄevelopment ２：１０９−１１０を参照)。 アンチセンス分子が治療上の価値を有するためには、それが細胞内に入り、標 的の内生の核酸と接触する能力を有する必要がある。さらに、アンチセンス分子 は細胞の高度にヌクレオチド溶解性の(nucleolytic)環境の苛酷さによく耐えう ることが必要である。 最近の研究によると、人工的なインターヌクレオチド結合などの如きある種の 修飾を有するオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドにヌクレオチド溶解 性分解に対する耐性を付与するのみならず(たとえば、アグラワルら(１９８８) Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)８５：７０７９−７０８３；アグラワル ら(１９８９)Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)８６：７７９０−７７９４ ；ガオ(Ｇao)ら(１９９０)Ａntimicrob．Ａgents Ｃhem．３４：８０８；および ストーリー(Ｓtorey)ら(１９９１)Ｎucleic Ａcids Ｒes．１９：４１０９を参 照)、該オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みをも上昇させうることが示さ れている。たとえば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートインターヌ クレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合したオリ ゴヌクレオチドに比べて一層容易に細胞に結合し、細胞によって取り込まれるこ とがわかった(ザオ(Ｚhao)ら(１９９３)Ａntisense Ｒes．Ｄev．３：５３−５ ６)。 オリゴヌクレオチドの取り込みは飽和しうるものであり、配列には依存せず、 温度およびエネルギーに依存する。かかる取り込みが８０,０００ダルトンの膜 タンパク質を介して起こることを示唆する証拠が挙げられているが(ローク(Ｌok e)ら(１９８９)Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)８６：３４７４；ヤクボ フ(Ｙakubov)ら(１９８９)Ｐroc.Ｎatl．Ａcad．Ｓci.(ＵＳＡ)８６：６４５４) 、このタンパク質の遺伝子は未だクローニングも特徴付けもなされていない。一 つの研究は、オリゴヌクレオチドの内部取り込みがエンドサイトーシスによるよ りも、むしろ陥没性の(caveolar)プロトサイトーシス性の(protocytotic)機構に よることが示唆されている(ザメクニック(Ｚamecnick)(１９９４)Ｐroc．Ｎatl ．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)９１：３１５６)。オリゴヌクレオチドの内部取り込み が、はたして受容体を介したエンドサイトーシス経路によるのか、ピノサイトー シス機構によるのか、それともこれら両機構の組み合わせによるのかについては 、殆どわかっていない。 オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを改善するため、上記以外の方法に よりオリゴヌクレオチドが修飾されている。たとえば、ＷＯ９３２３５７０には 、少なくとも一つのヌクレオチド残基がその２'位にて種々の分子(アミノ酸、ポ リペプチド、タンパク質、糖、糖リン酸、神経伝達物質、ホルモン、シクロデキ ストリン、デンプン、ステロイド、またはビタミンを含む)に共有結合した、細 胞による取り込みが改良されたオリゴヌクレオチドが開示されている。ビオチン 化されたオリゴヌクレオチドのアビジン存在下での細胞による取り込みの促進も ま た示されている(パートリッジ(Ｐartridge)ら(１９９１)ＦＥＢＳ Ｌett．２８ ８：３０−３２)。 加えて、ホスホジエステル結合したオリゴデオキシヌクレオチドが、孔形成剤 であるストレプトリシンＯにより導入されており(バリー(Ｂarry)ら(１９９３) Ｂiotechniques １５：１０１６−１０１８)、カチオン性脂質を含むリポソーム 調製物がヒト細胞間接着分子の部分にターゲティングされたアンチセンス分子の 細胞による取り込みを促進することも示されている(ベネット(Ｂennett)ら(１９ ９２)Ｍol．Ｐharmacol．４１：１０２３−１０３３)。５'−コレステリル修飾 した、ホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドは、増大した細胞取り込み および生物学的効果を示す(クリーグ(Ｋrieg)ら(１９９３)Ｐroc．Ｎatl．Ａcad ．Ｓci．(ＵＳＡ)９０：１０４８)。抗体ターゲティングしたリポソームもまた 、ＨＩＶ感染した細胞により発現したＨＬＡクラスＩ分子に対してターゲティン グしたオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを促進させるのに用いられてい る(ゼルファティ(Ｚelphati)ら(１９９３)Ａntisense Ｒes．Ｄev．３：３２３ −３３８)。 しかしながら、修飾オリゴヌクレオチドおよび非修飾オリゴヌクレオチドの不 十分な取り込みは、インビトロおよびインビボの両者において依然として問題で ある。それゆえ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを促進 するための改良された組成物および方法に対する必要性が存在する。そのような 促進は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効能を上昇させ、投与すべき投与量 を減少させる結果となるであろう。理想的には、そのような組成物および方法は またオリゴヌクレオチドの一般的な溶解度をも上昇させるのに有用であろう。発明の要約 アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞中への取り込みは、かかるオリゴヌク レオチドをシクロデキストリンに非共有結合的に会合させることによって促進さ れることがわかった。この知見は、本発明の種々の組成物を製造するのに利用し た。 一つの態様において、オリゴヌクレオチドをシクロデキストリンに直接、非共 有結合的に会合させるが、シクロデキストリンとしてはベータ(β)−シクロデキ ストリン、ガンマ(γ)−２−シクロデキストリン、メチル置換シクロデキストリ ン、またはそれらの誘導体が好ましい。好ましい誘導体としては、２−ヒドロキ シプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキス トリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン ポリサルフェート、トリメチルβ−シクロデキストリン、およびγ−シクロデキ ストリンポリサルフェート、およびメチル置換シクロデキストリンが挙げられる 。 本発明の幾つかの態様において、シクロデキストリンと複合体を形成するオリ ゴヌクレオチドは、少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチド、一つのリボヌ クレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両者(すな わち、キメラオリゴヌクレオチド)を含む。オリゴヌクレオチドは、幾つかの態 様ではホスホジエステルインターヌクレオチド結合により相互結合されるが、他 の態様ではオリゴヌクレオチドは修飾される。 本明細書において「修飾されたオリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの少 なくとも２つが合成結合、すなわち一方のヌクレオチドの５'末端と他方のヌク レオチドの３'末端との間のホスホジエステル結合以外の結合であって５'ヌクレ オチドリン酸が幾つかの化学基で置換されたものにより共有結合されたオリゴヌ クレオチドとして用いる。好ましい合成結合としては、アルキルホスホネート、 リン酸エステル、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオ エート、２−Ｏ−メチルカーボネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホル アミデート、カルバメート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、およびカ ルボキシメチルエステルが挙げられる。本発明の一つの好ましい態様において、 オリゴヌクレオチドは少なくとも一つのホスホロチオエート結合および／または 一つのアルキルホスホネート結合を含む。 「修飾されたオリゴヌクレオチド」なる語はまた、修飾された塩基および／ま たは糖を有するオリゴヌクレオチドをも包含する。たとえば、３',５'−置換さ れたオリゴヌクレオチドは、その３'位および５'位の両方で水酸基以外の化学基 (その３'位において)およびリン酸基以外の化学基(その５'位において)に結合し た糖を有する修飾されたオリゴヌクレオチドである。修飾されたオリゴヌクレオ チドはまた、キャッピングされた種であってもよい。加えて、分子中のヌクレオ チド当たり一つの非架橋性酸素原子に置換を有する酸化されていないまたは部分 的に酸化されたオリゴヌクレオチドもまた修飾されたオリゴヌクレオチドと考え られる。また、修飾されたオリゴヌクレオチドに包含されると考えられるものと して、その３'および／または５'末端にヌクレアーゼ耐性を付与するかさばった 置換基を有するオリゴヌクレオチド、および／またはヒトの介入なしにはインビ ボで認められない種々の他の構造上の修飾を有するオリゴヌクレオチドもまた修 飾されたものと考えられる。 他の好ましい態様において、本発明の組成物のオリゴヌクレオチドは、シクロ デキストリンに非共有結合的に会合したアダマンタンに共有結合している。共有 結合は、オリゴヌクレオチドおよびアダマンタンの３'−ヒドロキシルまたは５' −アミノの間で形成される。オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドを含有する 他の態様においては、アダマンタンはリボヌクレオチドの２'−ヒドロキシルに 共有結合する。 本発明はまた、好ましくは生理学的に許容しうる担体中の、シクロデキストリ ンと複合体を形成したオリゴヌクレオチド組成物を含む医薬調合物をも提供する 。そのような調合物は、外来のオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを増大 させ、それゆえ、細胞内濃度を促進する方法において有用である。調合物はまた 、たとえばウイルス感染のために細胞を処置する方法において、またはウイルス 感染を防御するためにも用いる。 オリゴヌクレオチドをシクロデキストリンと複合体を形成させることによって オリゴヌクレオチドのインビボでの利用可能性を増大させる方法もまた本発明に よって提供される。 本発明の他の観点において、上記オリゴヌクレオチド組成物を含む医薬調合物 が提供される。これら調合物は、本発明の他の観点、すなわち外来のオリゴヌク レオチドの細胞による取り込みおよび細胞内濃度を増大させる方法において用い る。これら方法において、細胞を該医薬調合物で処理する。 本発明のさらに他の観点において、ウイルス感染のため、またはウイルス感染 の防御のために細胞を処理する方法が提供される。この方法において、ウイルス の核酸の一部に相捕的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含有す る医薬調合物に細胞を接触させる。それゆえ、本発明は、不注意で感染した細胞 培養株を処理するのに有用な組成物を提供する。マイコプラズマまたはウイルス による細胞株の汚染を本発明による組成物を用いて排除することができる。 本発明はまたオリゴヌクレオチドのインビボでの溶解度を増大させる方法を提 供するものであり、該方法はシクロデキストリンをオリゴヌクレオチドに非共有 結合により複合体を形成させる工程を含む。幾つかの態様において、オリゴヌク レオチドをアダマンタンと共有結合により複合体を形成させ、アダマンタンをシ クロデキストリンと非共有結合により複合体を形成させる。図面の簡単な説明 本発明の上記および他の目的、その種々の特性、並びに本発明それ自体は、下 記記載を添付の図面とともに読んだときに一層完全に理解されるであろう。添付 の図面において： 図１Ａは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(Ｃ₄₂Ｈ₇₀Ｏ₃₅) の模式図であり； 図１Ｂは、γ−シクロデキストリン(Ｃ₄₈Ｈ₈₀Ｏ₄₀)の模式図であり； 図２は、(Ａ)オリゴヌクレオチドなし、(Ｂ)ＰＳオリゴヌクレオチド、(Ｃ)シ クロデキストリンと複合体を形成したＰＳオリゴヌクレオチド(４℃にて一夜)、 または(Ｄ)シクロデキストリンと複合体を形成したＰＳオリゴヌクレオチド(２ ５℃にて１時間)、で処理した細胞培養の蛍光強度を示すフローサイトメトリー データ出力記録であり； 図３Ａは、ＦＩＴＣ−結合２０mer ＰＳ−オリゴヌクレオチドで処理した細胞 を示す蛍光顕微鏡写真であり； 図３Ｂは、シクロデキストリンと複合体を形成したＦＩＴＣ−結合２０merで 処理した細胞を示す蛍光顕微鏡写真であり； 図３Ｃは、ＦＩＴＣ−結合４２mer ＰＳ−オリゴヌクレオチドで処理した細胞 を示す蛍光顕微鏡写真であり； 図３Ｄは、シクロデキストリンと複合体を形成したＦＩＴＣ−結合４２merで 処理した細胞を示す蛍光顕微鏡写真であり； 図４は、³²Ｐ−標識した(Ａ)複合体を形成していないＰＯ−オリゴヌクレオチ ドおよびＰＳ−オリゴヌクレオチドまたは(Ｂ)シクロデキストリンと複合体を形 成したＰＯ−オリゴヌクレオチドおよびＰＳ−オリゴヌクレオチドで処理した後 の種々の時間において抽出した細胞のＳＤＳゲルのオートラジオグラフであり； 図５は、³²Ｐ−標識した複合体を形成していないＰＯ−オリゴヌクレオチドお よびＰＳ−オリゴヌクレオチドと³²Ｐ−標識したシクロデキストリンと複合体を 形成しているＰＯ−オリゴヌクレオチドおよびＰＳ−オリゴヌクレオチドとの相 対的移動度を比較したＳＤＳゲルのオートラジオグラフであり； 図６は、ＦＩＴＣ−標識した複合体を形成していないＰＳ−オリゴヌクレオチ ド、ＦＩＴＣ−標識したシクロデキストリンと複合体を形成したＰＳ−オリゴヌ クレオチド、およびＦＩＴＣ−標識したシクロデキストリン−アダマンタンと複 合体を形成したＰＳ−オリゴヌクレオチドで処理した細胞培養の蛍光強度を示す グラフであり； 図７は、アダマンタン結合したシクロデキストリンの調製を示す模式図であり ； 図８は、フルオレセインホスホルアミダイトの模式図であり； 図９Ａは、アダマンタンに共有結合した、ホスホジエステル結合したオリゴヌ クレオチドの模式図であり； 図９Ｂは、アダマンタンに共有結合したＰＳ−オリゴヌクレオチドの模式図で あり； 図９Ｃは、アダマンタンに共有結合した、ＦＩＴＣ−結合したＰＳ−オリゴヌ クレオチドの模式図である。好ましい態様の詳細な説明 本明細書中に引用した特許および科学的文献は、当業者に利用できる知見を確 立するものである。本明細書中に引用する発行された米国特許第および許された 出願および参照文献は参照のため本明細書中に引用する。 本発明は、オリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みを促進し、それによって 治療の効率を増大させ、必要な投与量を減少させるオリゴヌクレオチド組成物を 提供する。該組成物は、シクロデキストリンまたは他の多糖と複合体を形成した オリゴヌクレオチドを含む。 シクロアミロースとしても知られるシクロデキストリンは、６〜８の天然に存 在するＤ(＋)−グルコピラノース単位がα−(１,４)結合してなる一群の環状多 糖である。シクロデキストリンは、それが含有するグルコース単位の数に従って 分類される：アルファ(α)−シクロデキストリンは６つのグルコース単位を有し 、ベータ(β)−シクロデキストリンは７つのグルコース単位を、ガンマ(γ)−シ クロデキストリンは８つのグルコース単位を有する(ブルースター(Ｂrewster)ら (１９８９)Ｊ．Ｐarenteral Ｓci．Ｔechnol．４３：２３１−２４０)。図１Ａ −１Ｂは、これらクラスの代表的なシクロデキストリンを示す。シクロデキスト リンは一群として円錐状の形状をした分子であり、わずかに非極性の内部腔を有 し、その中に種々の他の分子の抱合体を収容することができる。シクロデキスト リンの周辺部の構造は多数のヒドロキシル基を含み、水溶性を付与している。 ある種のシクロデキストリン、およびシクロデキストリンの種々の置換誘導体 、たとえば、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、ヒドロキシエチルシクロ デキストリン、メチルシクロデキストリンまたは硫酸置換シクロデキストリンな どは、種々の薬剤の溶解度および利用可能性を促進する能力を有する。たとえば 、２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン(ＨＰＣＤ)は、インスリン( マーカス(Ｍerkus)ら(１９９１)Ｐharmaceut．Ｒes．８：５８８−５９２)、ウ シ成長ホルモン(シンプキンズ(Ｓimpkins)ら(１９９１)Ｊ．Ｐarenteral Ｓci． Ｔechnol．４５：２６６−２６９)、およびメチルテストステロン(マラー(Ｍull er)ら(１９９１)Ｊ．Ｐharmaceut．Ｓci．８０：５９９−６０４)などの疎水性 タンパク質含有薬剤などのある種のわずかな溶解性しか有しない薬剤の溶解度お よび取り込みを実質的に促進させる(ブルースターら(１９９１)Ｐharmaceut．Ｒ es．８：７９２−７９５；ヤクシュ(Ｙaksh)ら(１９９１)Ｌife Ｓci．４８：６ ２３−６３３)。加えて、エチル化β−シクロデキストリンは、ジルチアゼムな どの 親水性薬剤の除放型担体として用いられている(ホリウチ(Ｈoriuchi)ら(１９９) Ｊ．Ｐharmaceut．Ｓci．７９：１２８−１３２)。 他のシクロデキストリンは独特の生物学的特性を有する。たとえば、硫酸シク ロデキストリンは抗炎症活性、抗高脂血症活性、および抗ウイルス活性を有し、 ウイルスの吸収または出芽を防ぐことによりＨＩＶの複製を抑制することがわか っている(ピサ(Ｐitha)ら(１９９１)Ｊ．Ｐharmaceutic．Ｒes．８：１１５１− １１５４；アナンド(Ａnand)ら(１９９)Ａntiviral Ｃhem．Ｃhemother．１：４ １−４６；モリヤ(Ｍoriya)ら(１９９１)Ｊ．Ｍed．Ｃhem．３４：２３０１−２ ３０４；ワイナー(Ｗeiner)ら(１９９２)Ｐathobiol．６０：２０６−２１２)。 加えて、硫酸シクロデキストリンはゲンタマイシンによって誘発された腎毒性に 対する(ウエカマ(Ｕekama)ら(１９９３)Ｊ．Ｐharm．Ｐharmacol．４５：７４５ −７４７)および赤血球の溶血に対する(バイス(Ｗeisz)ら(１９９３)Ｂiochem． Ｐharmacol．４５：１０１１−１０１６)保護作用を有する。 シクロデキストリンは天然に存在するＤ−グルコースサブ単位からなる生体適 合性のポリマーであるので、その治療上の応用は比較的安全であると考えられて いる。実際、一般に５〜１０％の濃度のシクロデキストリンのインビボ投与が動 物実験において薬剤の吸収を促進するために用いられており、有意の細胞毒性作 用は報告されていない(ガーロクツィ(Ｇerloczy)ら(１９９４)Ｊ．Ｐharmaceut ．Ｓci．８３：１９３−１９６)。 標準的な静脈内投与に加え、シクロデキストリンは、鼻内(マーカスら(１９９ １)Ｐharm．Ｒes．８：５８８−５９２；シャオ(Shao)ら(１９９２)Ｐharm．Ｒe s．９：１１５７−１１６３)、腸上皮(ナカニシ(Ｎakanishi)ら(１９９２)Ｃhem ．Ｐharm．Ｂull．４０：１２５２−１２５６)、角膜上皮(ジャンセン(Ｊansen) ら(１９９０)Ｌens Ｅye Ｔox．Ｒes．７：４５９−４６８)、直腸上皮(アリマ( Ａrima)ら(１９９２)Ｊ．Ｐharm．Ｓoc．Ｊapan １１２：６５−７２)、および 経皮注射(ヨシダ(Ｙoshida)ら(１９９０)Ｃhem．Ｐharm．Ｂull．３８：１７６ −１７９)によって容易に吸収されうる。 加えて、シクロデキストリンはまた、シクロデキストリンに複合体を形成させ た薬剤の望ましくない副作用の幾つかを排除することもわかっている。たとえば 、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンは、眼科の点眼調合物にお けるビヒクルとして用いた場合に角膜移植に対する免疫反応を抑制することがで き(アリマら(１９９２)Ｊ．Ｐharmceut．Ｓoc．Ｊapan １１２：６５−７２)、 角膜上皮に対して毒性はない。 シクロデキストリンは当該技術分野で知られた方法(たとえば、モリヤ(Ｍoriy a)ら(１９９３)Ｊ．Ｍed．Ｃhem．３６：１６７４−１６７７を参照)によって調 製でき、市販されている。 シクロデキストリンと複合体を形成させるオリゴヌクレオチドは、デオキシリ ボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその両者の組み合わせからなり、一 方のヌクレオチドの５'末端と他方のヌクレオチドの３'末端とが共有結合された ものである。これらオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも６ヌクレオチドであ るが、好ましくは１０〜５０ヌクレオチドの長さであり、最も一般的には１５〜 ２５mer である。オリゴヌクレオチドの調製は、ホスホルアミデート化学または Ｈ−ホスホネート化学などの当該技術分野で認められた方法により行うことがで き、これら方法は手動でも、またはブラウン(Ｂrown)のＡ Ｂrief Ｈistory of Ｏligonucleotide Ｓynthesis．Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalo gs,Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology(１９９４)２０：１−８に記載されている ように自動合成機によっても行うことができる。 本発明の組成物のオリゴヌクレオチドはまた、標的核酸とハイブリダイズする 能力およびアダマンタンおよび／またはシクロデキストリンと複合体を形成する 能力を損なうことなく幾つかの仕方で修飾することができる。たとえば、オリゴ ヌクレオチドは、一方のヌクレオチドの５'末端と他方のヌクレオチドの３'末端 との間にホスホジエステルインターヌクレオチド結合以外の結合を含んでいてよ い。そのような結合において、５'ヌクレオチドのリン酸は幾つかの数の化学基 で置換されている。そのような化学基の例としては、アルキルホスホネート、ホ スホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アル キルホスホネート、２−Ｏ−メチルホスホルアミデート、リン酸エステル、カル バメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カーボネート、およ びリン酸トリエステルが挙げられる。これら結合を有するオリゴヌクレオチドは 、公知の方法(たとえば、ソンボー(Ｓonveaux)「オリゴヌクレオチド合成におけ る保護基(Ｐrotecting Ｇroups in Ｏligonucleotides Ｓynthesis)」、アグラ ワルら(１９９４)Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology ２６：１−７２中；ウール マン(Ｕhlmann)ら(１９９０)Ｃhem．Ｒev．９０：５４３−５８３を参照)に従っ て調製できる。 他の修飾としては、オリゴヌクレオチド分子の内部または末端に位置し、コレ ステリルまたはジアミン化合物(アミノ基と末端リボース、デオキシリボースと の間の炭素残基数は種々である)などのインターヌクレオシドリン酸結合の分子 への付加、および開裂するか、または反対側の鎖に架橋するかもしくは結合酵素 もしくは他のタンパク質(ウイルスゲノムに結合する)に架橋するリン酸修飾が挙 げられる。そのような修飾されたオリゴヌクレオチドの例としては、修飾された 塩基および／または糖(たとえば、リボースの代わりのアラビノース)を有するオ リゴヌクレオチドが挙げられ、たとえば、３'位および５'位の両方においてヒド ロキシル基以外の化学基(その３'位にて)またはリン酸基以外の化学基(その５' 位にて)に結合した糖を有する３',５'−置換されたオリゴヌクレオチドが挙げら れる。他の修飾されたオリゴヌクレオチドは、その３'および／または５'末端に てヌクレアーゼ耐性を付与するかさばった置換基でキャッピングされているか、 またはヌクレオチド当たり一つの非架橋性の酸素原子に置換基を有する。そのよ うな修飾はインターヌクレオシド結合の幾つかまたは全部にあってもよいし、オ リゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端および／または分子の内部 にあってよい。 自己安定化された(self-stabilized)オリゴヌクレオチドもまた、本発明の方 法において有用な修飾されたオリゴヌクレオチドと考えられる(タング(Ｔang)ら (１９９３)Ｎucleic Ａcids Ｒes．２０：２７２９−２７３５)。これらオリゴ ヌクレオチドは、２つの領域：すなわち、標的ハイブリダイジング領域、および 該自己安定化オリゴヌクレオチド内の核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配 列を有する自己相補的領域を有する。 シクロデキストリンと複合体を形成するオリゴヌクレオチドは、いかなる所望 のヌクレオチド配列を有していてよく、標的核酸を含む細胞内での通常の生理学 的条件下でＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズしうる。そのような条件として は、ｐＨ、温度、およびイオン条件が挙げられる。 これら修飾されていないオリゴヌクレオチドおよび修飾されたオリゴヌクレオ チドの調製は、当該技術分野でよく知られている(アグラワルら(１９９２)Ｔren ds Ｂiotechnol．１０：１５２−１５８において概説されている)。たとえば、 ヌクレオチドは、ホスホルアミデート、Ｈ−ホスホネート化学、またはメチルホ スホルアミデート化学などの当該技術分野で認められた技術を用いて共有結合さ せることができる(たとえば、ウールマンら(１９９０)Ｃhem．Ｒev．９０：５４ ３−５８４；アグラワルら(１９８７)Ｔetrahedron Ｌett．２８：(３１)：３５ ３９−３５４２；カルサーズ(Ｃaruthers)ら(１９８７)Ｍeth．Ｅnzymol．１５ ４：２８７−３１３；米国特許第５,１４９,７９８号参照)。オリゴマー性のホ スホロチオエートアナログは、メトキシホスホルアミダイト化学(たとえば、ア グラワルら(１９８８)Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)８５：７０７９〜 ７０７３参照)またはＨ−ホスホネート化学(たとえば、フレーラー(Ｆroehler) 、「オリゴヌクレオチド合成：Ｈ−ホスホネート法(Ｏligonucleotide Ｓynthes is：Ｈ-phosphonate Ａpproach)」、アグラワル(１９９４)Ｍethods in Ｍolecu lar Ｂiology ２０：６３−８０中、を参照)などの当該技術分野でよく知られた 方法を用いて調製できる。 オリゴヌクレオチドのシクロデキストリンへの非共有結合による複合体形成は 、細胞増殖培地や種々の緩衝液などの水溶液中でこれらを混合することにより行 うことができる。 別のやり方として、オリゴヌクレオチドをアダマンタン分子に共有結合させ、 ついで該アダマンタン分子をシクロデキストリンに非共有結合させることができ る。アダマンタンはシクロデキストリンの内腔中に収容され、シクロデキストリ ンと安定な非共有結合による複合体を形成する(ブリンカー(Ｂrinker)ら(１９９ ３)Ａngew．Ｃhem.,Ｉnt．Ｅd．Ｅngl．３２：１３４４−１３４５、ウエノ(Ｕe no)ら(１９９３)Ｊ．Ａm．Ｃhem．Ｓoc．１１５：１２５７５−１２５７６)。 アダマンタンの結合は、デオキシリボヌクレオチド末端残基の末端を有するオ リゴヌクレオチドの３'−ヒドロキシル末端または５'アミノ末端にて行う。別の やり方として、アダマンタンはリボヌクレオチド残基の２'−ヒドロキシルと共 有結合による複合体を形成させることができる。このことは、合成オリゴヌクレ オチドに単一のリポーター基を付加するのに用いるような、オリゴヌクレオチド の機械によるアセンブリーの最後のカップリング工程としてリンカーホスホルア ミダイトまたはＨ−ホスホネートを用いて行うことができる(たとえば、アグラ ワルら(１９８６)Ｎucleic Ａcids Ｒes．１４：６２２９−６２４５；ミシウラ (Ｍishiura)ら(１９９０)Ｎucleic Ａcids Ｒes．１８：４３４５−４３５４： ネルソン(Ｎelson)ら(１９９２)Ｎucleic Ａcids Ｒes．２０：６２５３−６２ ５９)。 シクロデキストリンへのアダマンタンの共有結合もまた、ミシウラらによって 記載されたように(Ｊ．Ｎucleic Ａcids Ｒes．(１９９０)１８：４３４５−４ ３５３)アミノリンカーの助けをかりて行うことができる。ついで、アダマンタ ンの結合したオリゴヌクレオチドを水性媒体または緩衝液中でシクロデキストリ ンと混合することにより、両者を非共有結合により会合させる(たとえば、シン プキンズら(１９９１)Ｊ．Ｐarental Ｓci．＆ Ｔechnol．４５：２６６を参照) 。 オリゴヌクレオチド組成物または該組成物を含有する治療調合物は、外来のオ リゴヌクレオチドの細胞による取り込みおよび細胞内濃度を増大させる方法、オ リゴヌクレオチドのインビボでの溶解度を増大させる方法、およびたとえばウイ ルス感染のため、またはウイルス感染を防御するために細胞を処理する方法にお いて有用である。 シクロデキストリンと複合体を形成したオリゴヌクレオチドが細胞によって取 り込まれることは、以下のようにして確認した。フルオレセイン(ＦＩＴＣ)結合 したホスホロチオエート(ＰＳ)オリゴヌクレオチドを、４℃で一夜かまたは２５ ℃でシクロデキストリンと複合体を形成させた。フルオレセイン(ＦＩＴＣ)結合 したホスホロチオエート(ＰＳ)オリゴヌクレオチドを、４℃で一夜かまたは２５ ℃で１時間のいずれかでシクロデキストリンと複合体を形成させた。ついで、か くして処理したオリゴヌクレオチドに培養したＴ細胞白血病細胞株(ＣＥＭ)を接 触させた。ＣＥＭ細胞の蛍光強度を、コンピュータ分析したフローサイトメトリ ーにより測定した。 図２のコンピュータにより得られたスキャンに示されるように、蛍光強度はオ リゴヌクレオチドをシクロデキストリンと複合体を形成させたときに大きく増加 し、複合体形成が細胞による取り込みを大きく増加させることを示していた。 オリゴヌクレオチドのサイズが細胞による取り込みに対するシクロデキストリ ンの能力に影響を及ぼすか否かを決定するため、２０mer および４２mer のＦＩ ＴＣ−結合ＰＳ−オリゴヌクレオチドを２５℃にて１時間、シクロデキストリン と接触させ、ついでＣＥＭ細胞に加えた。これら細胞を蛍光顕微鏡下で調べた。 図３Ａ−３Ｄの蛍光顕微鏡写真に示すように、シクロデキストリンと複合体を 形成した２０mer および４２mer のオリゴヌクレオチドは両者とも細胞によって 取り込まれた。さらに、複合体を形成していないオリゴヌクレオチドで処理した 後に比べてシクロデキストリンと複合体を形成したオリゴヌクレオチドで処理し た後には一層多くの蛍光細胞が検出された。このことは、オリゴヌクレオチドの 取り込みがシクロデキストリンとの複合体形成により促進されることを示してい る。 シクロデキストリンとの複合体形成が細胞に投与されたオリゴヌクレオチドの 安定性に影響を及ぼすか否かを決定するため、細胞培養に投与したシクロデキス トリン複合体形成³²Ｐ−標識ＰＳ−オリゴヌクレオチドおよびＰＯ−オリゴヌク レオチドを投与後の種々の時間で調べた。オリゴヌクレオチドを細胞から抽出し 、電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析した。 図４に示すように、ＰＯ−オリゴヌクレオチドは１５分後においてさえも速や かに分解されたが、一方、ＰＳ−オリゴヌクレオチドは調べたすべての時間にお いて完全なままであった。それゆえ、ＰＳ−オリゴヌクレオチドはＰＯ−オリゴ ヌクレオチドよりも細胞内で一層安定である。シクロデキストリンと複合体を形 成したオリゴヌクレオチドと複合体を形成しなかったオリゴヌクレオチドとの間 で有意の差異は認められず、複合体形成はオリゴヌクレオチドの安定性に影響を 及ぼさないことを示していた。 シクロデキストリンとの複合体形成がオリゴヌクレオチドの相対的な移動度に 影響を及ぼすか否かを決定するため、³²Ｐ−標識した複合体を形成していないＰ Ｏ−オリゴヌクレオチドおよびＰＳ−オリゴヌクレオチドまたはシクロデキスト リンと複合体を形成したＰＯ−オリゴヌクレオチドおよびＰＳ−オリゴヌクレオ チドを電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析した。 図５に示すように、シクロデキストリンと複合体を形成したオリゴヌクレオチ ドの移動度と複合体を形成しなかったオリゴヌクレオチドの移動度との間で有意 の差異は認められず、複合体を形成したＰＯオリゴヌクレオチドおよび複合体を 形成していないＰＯオリゴヌクレオチドは両者とも、複合体を形成したＰＳ−オ リゴヌクレオチドおよび複合体を形成していないＰＳ−オリゴヌクレオチドより も速く移動する。 シクロデキストリンと会合したオリゴヌクレオチドのアダマンタンへの結合が 細胞内への取り込みに影響を及ぼすか否かを決定するため、細胞を、蛍光(ＦＩ ＴＣ)標識したオリゴヌクレオチド、蛍光標識したシクロデキストリン会合オリ ゴヌクレオチド、または蛍光標識した、シクロデキストリンが会合した共有結合 アダマンタン／オリゴヌクレオチドで種々の時間処理した。ついで、細胞の蛍光 強度をフローサイトメトリーにより分析した。 図６に示すように、ＦＩＴＣオリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みは実験 時間につれて徐々に増加した。シクロデキストリンの存在下では増加ははるかに 劇的であり、アダマンタンを結合したオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド −Ａ)で増加は最大であった。それゆえ、アダマンタンへのオリゴヌクレオチド の共有結合はシクロデキストリンが会合したオリゴヌクレオチドの細胞内への取 り込みを促進させる。 本発明の医薬調合物を投与するため、シクロデキストリンが会合したオリゴヌ クレオチド、またはアダマンタンが結合し、シクロデキストリンが会合したオリ ゴヌクレオチドを生理学的に許容しうる担体と混合し、ついで静脈内、筋肉内、 腹腔内、または鼻内により(マーカスら(１９９１)Ｐharmaceut．Ｒes．８：５８ ８−５９２；シャオら(１９９２)Ｐharmaceut．Ｒes．９：１１５７−１１６３) 、経口、経皮、または皮下投与により注射する。シクロデキストリンはまた、腸 上皮(ナカニシ(Ｎakanishi)ら(１９９２)Ｃhem．Ｐharm．Ｂull．４０：１２５ ２−１２５６)、角膜上皮(ジャンセンら(１９９０)Ｌens Ｅye Ｔoxicity Ｒes ．７：４５９−４６８)、および直腸上皮(アリマら(１９９２)Ｊ．Ｐharmaceut ．Ｓoc．Ｊapan １１２：６５−７２)により、および経皮注射(ヨシダら(１９９ ０)Ｃhem．Ｐharmaceut．Ｂull．３８：１７６−１７９)により容易に吸収され る。オリゴヌクレオチドを投与すべき特定の疾患の治療におけるオリゴヌクレオ チドの有効投与量および投与経路は、日常的な実験により決定することができる 。注射および他の使用に適した剤型としては、滅菌水溶液または分散液、および 滅菌注射溶液または分散液を即座に調製するための滅菌粉末が挙げられる。いず れの場合においても剤型は滅菌していなければならない。剤型は製造および貯蔵 の条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの混入微生物の作用に対して 防御しなければならない。担体は溶媒または分散媒体であってよい。微生物の作 用に対する防御は、種々の抗菌剤および抗真菌剤により行うことができる。注射 用治療剤の遅延吸収は、吸収を遅延させる剤の組成物を使用することにより行う ことができる。 以下の実施例は本発明を製造および実施するための好ましい態様を説明するも のであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。なぜなら、 同様の結果を得るために別の方法を用いることができるからである。 実施例 １.オリゴヌクレオチドの合成 ＰＯ−オリゴヌクレオチドおよびＰＳ−オリゴヌクレオチドをホスホルアミデ ート化学(アグラワルら(１９８９)Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)８６： ７７９０−７７９４；マックブライド(ＭcBride)ら(１９８３)Ｔetrahedron Ｌett．２４：２４５参照)を用いて自動合成機(ミリポア(Ｍillipore)８７００ 、ミリポア社、ベッドフォード(Ｂedford)、マサチューセッツ)で合成した。合 成に使用した酸化剤は、ホスホジエステル結合の形成には標準ヨウ素溶液、およ びホスホロチオエート結合の形成にはアセトニトリル１００ｍｌ中の１ｇの溶液 として³Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン−１,１−ジオキシドであった 。メチルホスホネートをボーケージ(Ｂeaucage)の方法により調製した(「オリゴ ヌクレオチド・シンセシス：ホスホルアミダイト・アプローチ(Ｏligonucleotid e Ｓynthesis：Ｐhosphramidite Ａpproach)」、プロトコールズ・フォー・オリ ゴヌクレオチズ・アンド・アナログズ(Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalogs)、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Ｍehtods in Ｍolec ular Ｂiology)(１９９４)２０：３３−６２)。オリゴヌクレオチドの濃度は、 各配列に存在する該ヌクレオチドのモル吸光係数を考慮に入れて、２６０ｎｍの 吸光度により決定した(オースベル(Ａusubel)ら(編)(１９８７)Ｃurrent Ｐroto cols in Ｍolecular Ｂiology(ウィリー(Ｗiley)、ニューヨーク)。 ２.オリゴヌクレオチドのＦＩＴＣ−標識 フルオレセインアミダイト(クローンテック・ラボラトリーズ(Ｃlontech Ｌab oratories)社、パロ・アルト(Ｐalo Ａlto)、カリフォルニア)を用いて５'−ヒ ドロキシルを介してシューベルト(Ｓchubert)の方法(Ｎucleic Ａcids Ｒes.(１ ９９０)１８：３４２７)によりフルオレセイン(ＦＩＴＣ)を該オリゴヌクレオチ ドにコンジュゲートした。全てのオリゴヌクレオチドを５５℃で１２時間濃アン モニアで処理して脱保護した。該オリゴヌクレオチドを使用前に、ポリアクリル アミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)により精製し、Ｓep-Ｐak Ｃ１８カートリッジ( ウォーターズ(Ｗaters)、ミリフォード(Ｍilliford)、マサチューセッツ)により 脱塩し、ついで凍結乾燥させた。 ３.シクロデキストリンの調製 ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(ＨＰＣＤ)をピサらの方法 (Ｉnt．Ｊ．Ｐharm．(１９８６)２９：７３−８２)により調製するか、またはた とえばシグマ・ケミカル(Ｓigma Ｃhemical)社、セントルイス、ミズーリ)など からの市販物を入手した。α(Ｃ₃₆Ｈ₆₀Ｏ₃₀)シクロデキストリンおよびγ−(Ｃ_{4 8} Ｈ₈₀Ｏ₄₀)シクロデキストリンなどの他のシクロデキストリンもまた市販されて おり(たとえば、シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリより)、ヒドロキ シプロピルβ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチルβ−シクロデキストリン 、トリメチルβ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン 、およびβ−シクロデキストリン硫酸はアマイゾ(Ａmaizo)(ハモンド(Ｈammond) 、インディアナ)より入手できる。 ４.ＦＩＴＣ−標識、ＨＰＣＤ−会合オリゴヌクレオチドの調製 １μｇのフルオレセイン(ＦＩＴＣ)コンジュゲートＰＳ−オリゴヌクレオチド を７５μｌのＲＰＭＩ培地中、５−１０％のＨＰＣＤと混合した。該混合物を非 共有結合による複合体の形成のために４℃で一夜または２５℃で１時間維持した (シンプキンズら(１９９１)Ｊ．Ｐarental Ｓci．＆ Ｔechnol．４５：２６６) 。 ５.オリゴヌクレオチドの³²Ｐ−標識 ２００ｎｇのオリゴヌクレオチド(ＰＯまたはＰＳ)を２μｌのポリヌクレオチ ドキナーゼ(ファルマシア(Ｐharmacia)、ピスカタウェイ(Ｐiscataway)、ニュー ジャージー)および２μｌの(α−³²Ｐ)ＡＴＰ(アマーシャム・ライフ・サイエン ス(Ａmersham ＬＩＦＥ Ｓcience)、アーリントン・ハイツ、イリノイ)とともに 最終容量２０μｌにて３７℃で１時間インキュベートすることにより、オリゴヌ クレオチドを５'末端標識した。この混合物をセファデックス(Ｓephadex)Ｇ−２ ５カラム(５プライム−３プライム(５ Ｐrime−３ Ｐrime)、ブルダー(Ｂoulder )、コロラド)に通して標識されていないオリゴヌクレオチドから³²Ｐ−標識オリ ゴヌクレオチドを分離した。 ６.³²Ｐ−標識シクロデキストリン会合オリゴヌクレオチドの調製 ³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチド(ＰＯまたはＰＳ)の半分を対応の非標識オリゴ ヌクレオチド(ＰＯまたはＰＳ)７μｇとともに１７５μｌのＲＰＭＩ培地中、１ ０％のＨＰＣＤと混合し、４℃で一夜、非共有結合コンジュゲートした。³²Ｐ− 標識オリゴヌクレオチドの残り半分を、該溶液中にＨＰＣＤを含まない(コント ロール)以外は同様にして調製した。 ７.共有結合オリゴヌクレオチド／アダマンタン複合体の調製 Ａ.リンカー−アダマンタン複合体 ミシウラらの方法によりアミノリンカーを合成した(Ｊ．Ｎucleic Ａcids Ｒe s.(１９９０)１８：４３４５−４３５４)(図７)。手短に言えば、容易に入手で きるソルケタル(solketal)(化合物１)とアクリロニトリルをテトラヒドロフラン (ＴＨＦ)中、水素化ナトリウムの存在下で反応させ、付加反応生成物である２− シアノエチルソルケタル(化合物２)を得た。ニトリル(化合物２)をメタノール溶 液中、塩化コバルト(II)の存在下で水素化ホウ素ナトリウムを使用して還元して ３−アミノプロピルソルケタル(化合物３)を得、これを分留によって精製した。 化合物３を１−アダマンタンカルボニルクロライドと反応させてＮ−アダマン トイル−３−アミノプロピルソルケタル(化合物４)を得た。一層詳しくは、５. ０ｇ(２６.４２ミリモル)の化合物３を、Ｎ₂の不活性雰囲気下、乾燥ジクロロメ タン(５０ｍｌ)に溶解させた。この溶液にスポイトで乾燥トリエチルアミン(４. ２ｍｌ)３.０４ｇ、３０.３ミリモル)を添加し、ついで１０ｍｌの乾燥ジクロロ メタン中のアダマンタンカルボニルクロライド(５.２ｇ、２６０ミリモル)の溶 液を滴下した。この溶液を室温で１時間撹拌し、ついで濃縮した。得られた残渣 を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶液(３×５０ ｍｌ)で洗浄し、有機抽出物をコンバインし、撹拌し、蒸発乾固した。得られた 油状残渣をシリカゲルカラム(３００ｇ)で精製し、１９：１の比率のジクロロメ タン：メタノールの混合物で溶出して８.８４ｇ(９７％)の化合物４を得た。 化合物５(１−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリチル)−３−Ｏ−(Ｎ−アダマント イル−３−アミノプロピル)グリセロール)を調製するため、８.６５ｇ(２４.３ ５ミリモル)の化合物４をＴＨＦ(４８.７ｍｌ)と１ＭのＨＣｌ水溶液(４８.７ｍ ｌ)の混合物中に溶解した。この溶液を室温で３０分間撹拌した。ついで５０ｍ ｌの無水エタノール(５０ｍｌ)を添加した。この溶液を濃縮し、残渣を再度、無 水エタノール５０ｍｌに溶解し、ついで溶液を再度濃縮した。得られた生成物を ピリジン(２×５０ｍｌ)で共蒸発(co-evaporation)させて乾燥して油状物を得、 これを乾燥ピリジン(１５０ｍｌ)に再度溶解した。ついで、８.２５ｇ(２４.３ ５ミ リモル)の４,４'−ジメトキシトリチルクロライドを２つの部分に分けて１５分 間撹拌しながら添加した。得られた溶液を１時間放置した。５０ｍｌの無水エタ ノールを添加し、溶液を濃縮した。得られた残渣を２００ｍｌのジクロロメタン に溶解し、ついで飽和重炭酸ナトリウム溶液(２×６０ｍｌ)で洗浄した。水層を ジクロロメタン(２×３０ｍｌ)で洗浄し、有機抽出物をコンバインし、蒸発乾固 した。得られた残渣をシリカカラム(３００ｇ)のクロマトグラフィーにかけ、ジ クロロメタン：メタノール(１９：１)の混合物で溶出して白い泡状の生成物(９. １６ｇ(６１.３％))を得た。 長鎖アルキルアミドプロピオン酸制御孔ガラス(ＣＰＧ)(long chain alkylami dopropanoic acid-controlled pore glass)ビーズのカルボキシル残基は１−(３ −ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド塩酸塩の存在下で化合 物５の遊離のヒドロキシル残基とエステル結合できるため、標準の方法(ダムハ( Ｄamha)ら(１９９０)Ｎucleic Ａcids Ｒes．８：３８１３−３８２１)を用い、 化合物５をさらに該ビーズに付着させて化合物６を得た。負荷は２２.１マイク ロモル／ｇＣＰＧであった。 約１０ｍｇの化合物６を１０ｍｌ容のフラスコに入れ、０.２ｍｌのＨＣｌＯ₄ −ＥｔＯＨ(３：２)で１分間処理してジメトキシトリチル基を放出させた。つい で、９.８ｍｌのアセトニトリルを添加し、４９８ｎｍで吸光度を測定して、下 記等式の負荷係数を算出した： Ａ₄₉₈×１０×１４.３)／重量ＣＰＧ(ｍｇ)＝マイクロモル／ｇ Ｂ.標識オリゴヌクレオチドのアダマンタンへの結合 ホスホジエステル結合アダマンタン会合オリゴヌクレオチド(配列番号：１)( 図９Ａ)、アダマンタン会合ＰＳ−オリゴヌクレオチド(配列番号：１)(図９Ｂ) 、およびアダマンタン会合ＦＩＴＣ−コンジュゲートＰＳ−オリゴヌクレオチド (図９Ｃ)をＣＰＧから開裂し、室温で１５時間、ついで５５℃でさらに６時間、 濃アンモニアで脱保護した。５'−ＯＤＭＴ保護したオリゴヌクレオチドを、溶 媒Ａ(０.１Ｍ酢酸アンモニウム)および溶媒Ｂ(２０％の０.１Ｍ酢酸アンモニウ ム＋８０％のアセトニトリル)の線形勾配での溶出により、分取Ｃ−１８逆相カ ラ ムで精製した。脱トリチル化を室温で３０分間、８０％の酢酸水溶液で処理して 行った。得られた完全に脱保護したオリゴヌクレオチドを、ＤＭＴ段階と同じ勾 配で溶出することによって同カラムで再度精製した。 ８.ＦＩＴＣ−標識ＨＰＣＤ−会合アダマンタン結合オリゴヌクレオチドの調製 １μｇのフルオレセイン(ＦＩＴＣ)コンジュゲートしたアダマンタン結合ＰＳ −オリゴヌクレオチドを７５μｌの通常のＲＰＭＩ培地中、１０％の２−ヒドロ キシプロピル−β−シクロデキストリン(ＨＰＣＤ)と混合した。この混合物を非 共有結合による複合体形成のために４℃で一夜または２５℃で１時間維持した( シンプキンズら(１９９１)Ｊ．Ｐarental Ｓci．＆ Ｔechnol．４５：２６６)。 ９.細胞培養 ＣＥＭ(ヒトＴ細胞白血病細胞株)(フォレイ(Ｆoley)ら(１９６５)Ｃancer ４ ：５２２)およびＨ９(ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株)(アメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)、ロックビル、メ リーランド、ＡＴＣＣ Ｎｏ.ＨＴＢ １７６)をこれらの実験に使用した。これら 細胞を、熱で不活性化した(５６℃で３０分間)１０％のウシ胎児血清、２ｍＭの グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン溶液(ＪＲＨバ イオサイエンスイズ(Ｂiosciences)、レネキサ、カンザス)を補充したＲＰＭＩ 培地(ＪＲＨバイオサイエンスィズ、レネキサ、カンザス)にて３７℃で５％のＣ Ｏ₂−９５％のＯ₂の加湿エアーインキュベーターで培養した。 １０.ＦＩＴＣ−標識シクロデキストリン会合オリゴヌクレオチドの取り込み ＣＥＭ細胞を実験に入る前にサブコンフルエンシー(subconfluency)まで増殖 させ、２０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)含有(上記のようにペニシリン／ストレプト マイシン溶液、グルタミンも含有する)ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。２０％ＦＣ Ｓを含むＲＰＭＩ培地の７５μｌ中で、１０％のＨＰＣＤと複合体を形成または 複合体を形成した(コントロールとして)(７５μｌの通常のＲＰＭＩ培地中)１μ ｇのＦＩＴＣオリゴヌクレオチドを５×１０⁵ ＣＥＭ細胞に添加した。最終混合 物は、１０％のＦＣＳを含む１５０μｌのＲＰＭＩ培地中に、１μｇのＦＩＴＣ オリゴヌクレオチド、５％のＨＰＣＤ、５×１０⁵ ＣＥＭ細胞を含む。これら細 胞 を３７℃で４時間培養し、１％のＢＳＡ、１％のアジ化ナトリウムを補充したハ ンク平衡塩溶液(Ｈank's balanced salt solution)(ＨＢＳＳ)で洗浄した。 ついでＣＥＭ細胞の蛍光をフローサイトメトリー(ＦＡＣＳcan、ベックマン− ディクソン(Ｂeckman-Ｄickson)、マウンテイン・ビュー(Ｍountain Ｖiew)、カ リフォルニア；またはＥpics ＸＬ、コルター(Ｃoulter)、ヒアレー(Ｈealeah) 、フロリダ)で分析し、ついでＬysis IIソフトウェア(ＦＡＣＳcanを使用の際) またはＥpics ＸＬソフトウェア、バージョン１.５(Ｅpics ＸＬを使用の際)に より分析した(ザオ(Ｚhao)ら(１９９３)Ａntisense Ｒes．＆ Ｄev．３：５５) 。 １１.蛍光顕微鏡による実験 ２０merおよび４２merの蛍光コンジュゲートＰＳオリゴヌクレオチドを５％の ＨＰＣＤと２５℃で１時間接触させた。１μｇのオリゴヌクレオチドをＣＥＭ細 胞(５×１０⁵／試験管)に添加し、ついで細胞を３７℃で４時間培養した。４時 間の培養の終了時点で、細胞をＦＡＣＳ洗浄バッファー(ＨＢＳＳに１％のＢＳ Ａ、１％のアジ化ナトリウムを添加したもの)で洗浄し、蛍光顕微鏡(ＬＨ５０Ａ 、オリンパス(Ｏlympas)、日本)の下で観察した(図３Ａ−３Ｄ参照)。 １２.³²Ｐ−標識シクロデキストリン会合オリゴヌクレオチドの取り込みおよび オリゴヌクレオチドの安定性に関するシクロデキストリンの効果 ＣＥＭ細胞を実験に入る前にサブコンフルエンシーまで増殖させ、２０％ウシ 胎児血清(ＦＣＳ)含有ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。複合体混合物(１７５μｌの 容量の通常のＲＰＭＩ培地中)を１０⁶ ＣＥＭ細胞(２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培 地１７５μｌの容量中)に添加した。最終混合物は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ 培地３５０μｌ中に、７μｌの非標識オリゴヌクレオチド、約８０ｎｇの³²Ｐ標 識オリゴヌクレオチド(セファデックスカラムの回収効率は８０％)、５％のＨＰ ＣＤを含んでいた。ついで、処理した細胞を３７℃で培養した。種々の１５分の 時点で５０μlの細胞培養混合物のアリコートを採取し、ついでオリゴヌクレオ チドをテムザマニ(Ｔemsamani)らによって記載された方法(Ａntisense Ｒes．＆ Ｄev．(１９９４)４：３５)と同様のやり方で細胞培養から抽出した。手短に言 うと、細胞培養混合物からのアリコートを０.５％のドデシル硫酸ナトリウム(Ｓ ＤＳ)中の プロテイナーゼＫ(２ｍｇ／ｍｌ：最終濃度)で３７℃にて２０分間処理し、つい でフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行った。該³²Ｐ−標識 オリゴヌクレオチドを２０％のポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分 析し、オートラジオグラフィーにかけた。抽出物を変性ポリアクリルアミドゲル 上で流した(図４参照)。 １３.オリゴヌクレオチドの移動度に対するシクロデキストリンの効果 オリゴヌクレオチドの相対的移動度に対するシクロデキストリン複合体形成の 効果を決定するため、³²Ｐ−標識(アマシャム、アーリントン・ハイツ、イリノ イ)したＰＯ−オリゴヌクレオチドおよびＰＳ−オリゴヌクレオチドの両者をセ ファデックスを詰めたスピンカラムを通して精製し、通常のＲＰＭＩ培地中で２ ５℃にて１時間、５％のシクロデキストリンと混合し、ついで非変性の１５％の ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分析し、オートラジオグラフィ ーにかけた(図５)。 １４.アダマンタン結合オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みに対するシク ロデキストリンの効果 蛍光標識したＰＳ−オリゴヌクレオチドまたは蛍光標識した共有結合アダマン タン／ＰＳ−オリゴヌクレオチドを通常のＲＭＰＩ培地中の１.２５％ ＨＰＣＤ と４℃で一夜、複合体を形成するため混合した。１.２３ ％ＨＰＣＤ(上記)と複 合体を形成したまたは複合体を形成していない８μlのＦＩＴＣオリゴヌクレオ チドを、１０z％のウシ胎児血清を含むＲＭＰＩ(最終容量１.２ｍｌ)中の８×１ ０⁵ Ｈ９細胞に添加した。細胞を３７℃で培養するようセットした。種々の時点 で細胞培養のアリコートを採取し、１％のＢＳＡ、１％のアジ化ナトリウムを補 充したハンク平衡塩溶液(ＨＢＳＳ)で洗浄した。ついで、Ｈ９細胞の蛍光強度を フローサイトメトリーで分析した(図６)。均等物 当業者は、上記の特定の物質および方法に均等な多くのものについても常套手 段、実験で確認できるであろう。そのような均等物も本発明の範囲に含まれ、以 下の特許請求の範囲でカバーされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ハブス，イワン アメリカ合衆国01545マサチューセッツ州 シュルースベリー、コモンズ・ドライ ブ・ナンバー32、50番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １.シクロデキストリンと非共有結合的に複合体を形成したオリゴヌクレオチド を含む組成物。 ２.該オリゴヌクレオチドに共有結合し、該シクロデキストリンと非共有結合的 に複合体を形成したアダマンタンをさらに含む請求項１に記載の組成物。 ３.アダマンタンが該オリゴヌクレオチドの３'−ヒドロキシルまたは５'−アミ ノに共有結合している請求項２に記載の組成物。 ４.該オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、アルキ ルホスホネートおよびそれらの組み合わせよりなる群から選択される少なくとも 一つのインターヌクレオチド結合を含む請求項１に記載の組成物。 ５.該オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、アルキ ルホスホネートおよびそれらの組み合わせよりなる群から選択される少なくとも 一つのインターヌクレオチド結合を含む請求項２に記載の組成物。 ６.該シクロデキストリンが、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリ ン、メチル置換シクロデキストリンおよびその誘導体よりなる群から選択される 請求項１に記載の組成物。 ７.該シクロデキストリンが、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリ ン、メチル置換シクロデキストリンおよびその誘導体よりなる群から選択される 請求項２に記載の組成物。 ８.該シクロデキストリンが、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリ ン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シ クロデキストリン、β−シクロデキストリンポリサルフェート、γ−シクロデキ ストリンポリサルフェートおよびその混合物である請求項６に記載の組成物。 ９.該シクロデキストリンが、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリ ン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シ クロデキストリン、トリメチルβ−シクロデキストリン、β−シクロデキストリ ンポリサルフェート、γ−シクロデキストリンポリサルフェートおよびその混合 物である請求項７に記載の組成物。 １０.該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドを含 む請求項１に記載の組成物。 １１.該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドを含 む請求項２に記載の組成物。 １２.該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む請求項 １に記載の組成物。 １３.該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む請求項 ２に記載の組成物。 １４.該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む請求項 １０に記載の組成物。 １５.該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む請求項 １１に記載の組成物。 １６.該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのリボヌクレオチドを含み、アダ マンタンが該リボヌクレオチドの２'−ヒドロキシルに共有結合している請求項 ２に記載の組成物。 １７.請求項１に記載のオリゴヌクレオチド組成物を含む医薬製剤。 １８.請求項２に記載のオリゴヌクレオチド組成物を含む医薬製剤。 １９.請求項１７に記載の医薬製剤で細胞を処理する工程からなる、外来オリゴ ヌクレオチドの細胞への取り込みおよび細胞内濃度を上昇させる方法。 ２０.請求項１８に記載の医薬製剤で細胞を処理する工程からなる、外来オリゴ ヌクレオチドの細胞への取り込みおよび細胞内濃度を上昇させる方法。 ２１.細胞を請求項１７に記載の医薬製剤に接触させることからなり、その際、 該オリゴヌクレオチドはウイルスの核酸の一部に相補的なヌクレオチド配列を有 する、ウイルス感染のため、またはウイルス感染の防御のために細胞を処理する 方法。 ２２.細胞を請求項１８に記載の医薬製剤に接触させることからなり、その際、 該オリゴヌクレオチドはウイルスの核酸の一部に相補的なヌクレオチド配列を有 する、ウイルス感染のため、またはウイルス感染の防御のために細胞を処理する 方法。 ２３.シクロデキストリンをオリゴヌクレオチドと非共有結合的に複合体を形成 する工程からなる、オリゴヌクレオチドのインビボでの利用性を高める方法。 ２４.該オリゴヌクレオチドがアダマンタンと共有結合により複合体を形成して おり、アダマンタンが非共有結合的にシクロデキストリンと複合体を形成してい る請求項２３に記載の方法。