JPH10501403A - 抗体−エンベロープ融合タンパク質および野生型エンベロープ融合タンパク質を含むレトロウィルスベクターを用いる細胞型特異的遺伝子移入 - Google Patents

抗体−エンベロープ融合タンパク質および野生型エンベロープ融合タンパク質を含むレトロウィルスベクターを用いる細胞型特異的遺伝子移入

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JPH10501403A JP7522993A JP52299395A JPH10501403A JP H10501403 A JPH10501403 A JP H10501403A JP 7522993 A JP7522993 A JP 7522993A JP 52299395 A JP52299395 A JP 52299395A JP H10501403 A JPH10501403 A JP H10501403A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子に関する。このレトロウィルスベクター粒子は、レトロウィルスベクターのエンベロープタンパク質に融合されて標的エンベロープを形成する標的ペプチドを有するレトロウィルスベクターを含み、ここで標的ペプチドは、天然のウィルスのレセプター結合部位を置換または破壊し、そして標的ペプチドは、抗体の抗原結合部位、別のウィルスのレセプター結合ペプチド、または標的の特異的なレセプターに特異的に結合するペプチドである。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体-エンベロープ融合タンパク質および野生型エンベロープ融合タンパク質 を含むレトロウィルスベクターを用いる細胞型特異的遺伝子移入 発明の背景 本出願は、1992年11月20日に提出された係属中の出願番号第07/979,619号の一 部継続出願である。 発明の分野 本発明は、標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子に関する。こ のレトロウィルスベクター粒子は、レトロウィルスベクターのエンベロープタン パク質に融合された抗体の抗原結合部位または別のペプチドからなるキメラエン ベロープタンパク質を有するレトロウィルスベクターを含む。抗原結合部位また は他のペプチドは、天然のウィルスのレセプター結合部位を置換または破壊する 。得られるキメラエンベロープは「標的エンベロープ(targeting envelope)」と 呼ばれる。本発明は、標的エンベロープのみならず野生型エンベロープタンパク 質も含むレトロウィルスベクターにも関する。標的エンベロープに追加した野生 型エンベロープの存在は、標的エンベロープにおいて損なわれ得る完全に機能的 な膜融合ドメインを供給することによりヘルパー分子として作用する。このヘル パー機能は、野生型エンベロープに対するレセプターは含まないが、標的分子の 結合に対するレセプターを含む細胞の感染を可能にする、そして/または増強す る。本発明はまた、レトロウィルス粒子を調製するための方法、およびレトロウ ィルスベクターを用いて遺伝子を脊椎動物細胞へ導入するための方法に関する。 背景の説明 本発明の背景を説明し、そしてその実施に関するさらなる詳細を提供するため に本明細書において参照される開示を、本明細書中で参考として援用する。便宜 上、開示を、以下の本文中で参照し、それぞれ添付した参考文献目録において分 類する。 レトロウィルスベクターは脊椎動物細胞へ遺伝子を導入するために最も効率的 な道具である。レトロウィルスベクターを用いてヒトの遺伝的疾患(アデノシン デアミナーセ(ADA)欠損症)を治癒するために臨床的実験が行われている。先天性 代謝異常を矯正することに加えて、遺伝子療法はまた、ガンおよび他の種々の疾 患を治癒するための臨床的試行において試験されている(Science 1992，第258巻 ，744-746頁)。 レトロウィルスベクターは、基本的に、すべてのウィルスタンパク質コード配 列が目的の１つまたは複数の遺伝子で置換されているゲノムを含むレトロウィル ス粒子である。結果として、このようなウィルスは、一回目の感染後、さらに複 製し得ない。レトロウィルスベクター粒子はヘルパー細胞により生成される(図 １)。このようなヘルパー細胞は、複製に必要なすべてのレトロウィルスタンパ ク質を発現するプラスミド構築物を含む細胞株である。このようなヘルパー細胞 をベクターゲノムでトランスフェクトした後、ベクターゲノムは包膜されてウィ ルス粒子になる(特異的包膜配列の存在による)。ウィルス粒子は、目的の１つま たは複数の遺伝子のみを含有するゲノムを有するヘルパー細胞から放出される( 図１)。最近の10年間において、ニワトリまたはマウスレトロウィルス由来のい くつかのレトロウィルスベクター系が種々の遺伝子の発現のために開発されてい る(概説のために、Temin，1987；Gilboa，1990を参照のこと)。 レトロウィルスベクターはいくつかの制限を有する。包膜されてウィルス粒子 になり得るゲノムサイズの制限に加えて、レトロウィルスベクターの適用につい ての最も大きな制限要因は、ベクター粒子の宿主域の制限である。いくつかのレ トロウィルスは、１つの種の細胞しか感染し得ない(エコトロピックレトロウィ ルス)かまたは１つの種の１つの細胞型しか感染し得ない(例えば、HIV)。他のレ トロウィルスは非常に広い宿主域を有し、そして多くの異なる種の多くの異なる 型の組織を感染し得る(両種性レトロウィルス)。 レトロウィルス感染の初期段階は、特異的細胞膜レセプターへのウィルスエン ベロープ(env)糖タンパク質の結合である。ほとんどのレトロウィルスについて この結合の性質は知られていない。しかし、ウィルスenvタンパク質と細胞表面 レセプターとの相互作用は非常に特異的であり、そして特定のウィルスの細胞型 特異性を決定する(Weissら、1985)。すべての公知のレトロウィルスのエンベロ ープタンパク質は２つの結合するペプチドからなる(例えば、SNVにおけるgp70お よびp20(E))。これらのペプチドは、レトロウィルスenv遺伝子によりコードされ る同じ前駆体(gPR90env)からタンパク質分解切断により得られる。TMとも呼ばれ る１つのペプチドp20(E)は、タンパク質をウィルスの膜中にアンカー(anchor)し 、そしてHIVで示されるように、ウィルスと細胞膜の融合を仲介する。SUとも呼 ばれる第２のペプチドgp70は、ウィルスのそのレセプターへの結合を仲介し、従 って宿主域を決定する(Weissら、1985；VarmusおよびBrown、1989)。 いくつかのレトロウィルスで得られたデータは、レトロウィルスエンベロープ タンパク質は三量体または四量体を形成することを示す。三量体の形成は、TMペ プチドにより仲介されるようである(Hunter，E.ら、1990で概説される)。標的エ ンベロープは、(i)膜融合機能を維持するため、および(ii)オリゴマー化を維持 するためにTMを保持する。しかし、Ｘ線画像が得られないため、標的分子の構築 が膜融合ドメインの構造を損なうのか否か、またはどの程度損なうのかは明らか でない。 図面の簡単な説明 図１はレトロウィルスタンパク質を発現するヘルパー細胞を例示する図である 。A)ヘルパー細胞は、感染ウィルス粒子を形成するために必要なすべてのレトロ ウィルスタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトすることにより作 製される。B)レトロウィルスベクターでのトランスフェクション後、ベクターRN Aゲノムは包膜されてコア構造になる。C)プラスミドを含むヘルパー細胞が、改 変されたエンベロープ遺伝子を発現する。 図２は、脾臓壊死ウィルス(spleen necrosis virus)(SNV)の変異エンベロープ 遺伝子を発現するプラスミドを例示する図である。 図３は、ハプテンDNPに対する単鎖抗体遺伝子(scFv)の配列を示す。 図４は、標的エンベロープおよび野生型エンベロープを発現するヘルパー細胞 を例示する図である。このようなヘルパー細胞は、対応するタンパク質を発現す るプラスミドでのトランスフェクションにより作製される。A)(a)レトロウィル スコアタンパク質および(b)標的エンベロープを形成するために必要なすべての レトロウィルスタンパク質を発現するヘルパー細胞。B)標的エンベロープおよび 野生型エンベロープを含有するヘルパー細胞は、このようなタンパク質をコード する遺伝子を発現するプラスミドでトランスフェクトすることにより作製される 。目的の遺伝子を有するレトロウィルスベクターでのトランスフェクション後、 レトロウィルスベクターRNAゲノムは包膜されてエンベロープを提示するレトロ ウィルスベクター粒子になる。 図５は、構築された真核生物遺伝子発現ベクターの図である。遺伝子発現ベク ターは、近年記載された同様のベクター(Sheay，W.ら、1993)に由来した。 図６は、脾臓壊死ウィルス(SNV)コア構造タンパク質、野生型エンベロープタ ンパク質、および種々の標的エンベロープタンパク質を発現するプラスミドを説 明する図である。 発明の要旨 本発明は、標的エンベロープの性質により仲介される規定された標的細胞特異 性を有するレトロウィルスベクター粒子に関する。この標的エンベロープは、レ トロウィルスのエンベロープタンパク質のカルボキシ末端部分に融合される抗体 の抗原結合部位または特異的細胞表面構造(例えば、別のウィルスのレセプター 結合ドメイン)に結合する別のペプチドからなるキメラタンパク質であり得る。 標的エンベロープは、レトロウィルス感染の第１段階を仲介する。この段階は、 ウィルスの特異的細胞表面レセプターへの結合である。本発明はまた、標的エン ベロープに加えて野生型エンベロープを含むレトロウィルス粒子に関する。野生 型エンベロープの存在は、機能的膜融合ドメインを改善または補充するヘルパー 分子として作用する役割をする。野生型エンベロープに対するレセプターを含ま ない標的細胞を用いる場合(例えば、SNVはヒト細胞に感染性でない)、野生型エ ンベロープはレトロウィルス感染の第２段階においてのみ関与する。この段階は 、ウィルスと細胞膜との効率的な融合である。本発明はまた、標的エンベロープ に加えて野生型エンベロープを含むレトロウィルスベクター粒子の構築に関する 。 このレトロウィルスベクター粒子は、標的エンベロープのみを有するレトロウィ ルス粒子で観察される感染力の消失を補い得る。 １つの実施態様において、本発明は、標的細胞特異性を有するレトロウィルス ベクター粒子に関する。このレトロウィルスベクター粒子は、レトロウィルスベ クターのエンベロープタンパク質に融合して標的エンベロープを形成する標的ペ プチドを有するレトロウィルスベクターを含む。ここで、標的ペプチドは、天然 のウィルスのレセプター結合部位を置換または破壊し、そして標的ペプチドは抗 体の抗原結合部位、別のウィルスのレセプター結合ペプチド、または標的の特異 的レセプターに特異的に結合するペプチドである。 別の実施態様において、本発明は、レトロウィルスベクターを用いて脊椎動物 細胞へ遺伝子を導入するための細胞型特異的な方法に関する。この方法は、細胞 に標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子を投与する工程を包含し 、このレトロウィルスベクター粒子は、レトロウィルスベクターのエンベロープ タンパク質に融合されて標的エンベロープを形成するタゲッテイングペプチドを 有するレトロウィルスベクターを含む。ここで、標的ペプチドは、天然のウィル スのレセプター結合部位を置換または破壊し、そして標的ペプチドは、抗体の抗 原結合部位、別のウィルスのレセプター結合ペプチド、または標的の特異的レセ プターに特異的に結合するペプチドである。 さらに別の実施態様において、本発明は、標的細胞特異性を有するレトロウィ ルスベクター粒子を調製するための方法に関する。このレトロウィルスベクター 粒子は、レトロウィルスベクターのエンベロープタンパク質に融合されて標的エ ンベロープを形成する標的ペプチドを有するレトロウィルスベクターを含む。こ こで、標的ペプチドは、天然のウィルスのレセプター結合部位を置換または破壊 し、そして標的ペプチドは抗体の抗原結合部位、別のウィルスのレセプター結合 ペプチド、または標的の特異的レセプターに特異的に結合するペプチドであり、 この方法は以下の工程を包含する： (a)標的ペプチドを提供する工程； (b)ウィルスのレセプター結合部位をコードするエンベロープ遺伝子の部分を 、標的ペプチドで置換して、キメラエンベロープ遺伝子を形成する工程； (c)キメラエンベロープ遺伝子を真核生物遺伝子発現ベクター中にクローニン グする工程；および (d)キメラエンベロープ発現プラスミド、レトロウィルスのコアタンパク質発 現プラスミド、および選択マーカー遺伝子発現プラスミドで真核生物の細胞をト ランスフェクトする工程。 発明の詳細な説明 標的エンベロープ 本発明は、標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子に関する。レ トロウィルスベクター粒子は、レトロウィルスベクターのエンベロープタンパク 質に融合される抗体の抗原結合部位または別のペプチドからなるキメラエンベロ ープタンパク質を有するレトロウィルスベクターを含む。抗原結合部位または他 のペプチドは、天然のウィルスのレセプター結合部位を置換または破壊する。得 られるキメラエンベロープは「標的エンベロープ」と呼ばれる。本発明は、標的 エンベロープのみならず野生型エンベロープタンパク質も含むレトロウィルスベ クターに関する。標的エンベロープに追加した野生型エンベロープの存在は、標 的エンベロープにおいて損なわれ得る完全に機能的な膜融合ドメインを供給する ことによりヘルパー分子として作用する。このヘルパー機能は、野生型エンベロ ープに対するレセプターは含まないが標的分子の結合のためのレセプターは含む 細胞の感染を可能にする、そして/または増強する。本発明はまた、レトロウィ ルス粒子を調製するための方法およびレトロウィルスベクターを用いて遺伝子を 脊椎動物細胞に導入するための方法に関する。 ベクター粒子の宿主域を変えるために、目的の標的細胞に特異的な細胞表面構 造(レセプター)のみを認識するように改変されたエンベロープタンパク質を含む レトロウィルスベクター粒子を構築し得る。タンパク質の特異的な構造を認識す ることが公知であるタンパク質は抗体分子である。従って、目的の細胞型に特異 的なレトロウィルスベクター粒子を作製するために、ウィルスのレセプター結合 ペプチドは、抗体分子の抗原結合部位で置換され得る。このような抗原結合部位 を含むベクター粒子が感染能力があるか否かを試験するために、脾臓壊死ウィル ス(SNV)のエンベロープ遺伝子に融合されるハプテンジニトロフェノール(DNP)に 対する抗体の抗原結合ペプチドを用いてモデル系を開発した。 抗ハプテン(抗DNP)抗体の使用は多くの利点を有する。(1)この抗原と抗体との 相互作用はよく特徴づけられている(DaviesおよびMetzger、1983)。(2)ハプテン は容易に利用可能である。(3)(野生型ベクター粒子で感染され得ない)多くの種 類の細胞がこのハプテンと結合され得る。DNP結合細胞はこのハプテンに対する 抗体と結合する。従って、ハプテンはキメラベクター粒子に対するレセプターの (多数の)存在を模擬し得る。(4)抗ハプテン抗体は頻繁に細胞により吸収される 。従って、キメラエンベロープタンパク質の構築がTMの膜融合ドメインを破壊す る場合、この特性は、この機能の消失を補い得る。(5)ウィルス粒子形成および このようなウィルスのDNPへの結合について試験するためにインビトロ結合アッ セイが容易に確立され得る。 野生型エンベロープ 本発明は、標的細胞特異性を有するレトロウィルス粒子に関する。このレトロ ウィルスベクター粒子は、標的細胞の細胞表面レセプターへのレトロウィルスベ クター粒子の結合を仲介する標的エンベロープを有するレトロウィルスベクター を含む。この結合は、非常に特異的であり、そして宿主域および細胞型特異性を 決定する。この粒子はまた、野生型エンベロープを有する。野生型エンベロープ についての作用するレセプターを含まない標的細胞を使用する場合、野生型エン ベロープの機能は、完全に機能的な膜融合ドメインを供給することのみである。 本発明はまた、レトロウィルスベクター粒子を調製するための方法、およびレト ロウィルスベクターを用いて遺伝子を脊椎動物細胞に導入するための方法に関す る。 野生型エンベロープのみを含む脾臓壊死ウィルス由来のレトロウィルスベクタ ーは、ヒト細胞またはハムスター細胞に感染し得ない。これらの感染力研究にお いて、DSN細胞から採集したレトロウィルス粒子を使用して(Dougherty，J．P.お よびTemin，H．M．1989)、ヒトHeLa細胞およびCol-1細胞、ならびにハムスターC HTG(ret.1)細胞を感染させた(表１および表２)。DSN細胞は、レトロウィルスコ アタンパク質を発現するプラスミドおよび野生型エンベロープを発現する別のプ ラスミドを含む標準的なレトロウィルスパッケージング細胞である(Dougherty， J．P.およびTemin，H．M.、1989)。 SNVレトロウィルスベクター粒子を用いてこのような細胞へ遺伝子を導入する ために、異なる標的エンベロープをさらなる野生型エンベロープと組み合わせて 、および組み合わせずに、２つの異なるアプローチを行った。 １．SNVレトロウィルスベクターを用いるヒトガン細胞(HeLaおよびCol-1)の標 的。ハプテンDNPに対する抗体の抗原結合部位を用いた。しかし、標的エンベロ ープにおいて用いられる抗原結合部位は、種々のヒトガン細胞(例えば、HeLa細 胞およびCol-1細胞、Bird,R.E.ら、1988およびColcher,D.ら、1990)上に発現さ れる細胞表面タンパク質に対する抗体(B6.2と呼ばれる、Bird，R．E.ら、1988お よびColcher,Dら、1990)に由来した。標的エンベロープの発現のための遺伝子構 築物(図６)は、上記の遺伝子構築物と類似している。特に、２つの構築物におい て(図６、pTC24およびpTC25)、抗体部分は、以下に記載される抗DNP抗体と正確 に同じSNVエンベロープ遺伝子の位置に融合された(さらなる詳細は以下：材料お よび方法を参照のこと)。完全に機能的な膜融合ドメイン(野生型エンベロープに より提供される)の付加が感染の効率を増加させるか否かを試験するために、レ トロウィルスコアタンパク質を発現するヘルパー細胞、野生型エンベロープ、お よび標的エンベロープを開発した(図４)。ウィルスをこのようなヘルパー細胞か ら採集し、そして感染力研究に供した。 ２．エコトロピックマウス白血病ウィルスに対するレセプターを発現するCHTG 細胞の標的。抗体の抗原結合部位以外の標的分子を提示するSNVに由来するレト ロウィルス粒子が感染性であるか否かを試験するために、SNVのエンベロープに 融合される別のウィルス(マウス白血病ウィルス)のレセプター結合ペプチドを含 む標的エンベロープを構築した。野生型エンベロープを有するおよび野生型エン ベロープを有さないこのような標的エンベロープを提示するウィルス粒子の感染 力を試験した。 実施例 標的エンベロープ 材料および方法 抗体-エンベロープ融合遺伝子の構築 脾臓壊死ウィルス(SNV)のエンベロープタンパク質をコードする遺伝子は、抗 体-エンベロープ融合遺伝子の構築を可能にする適切な制限酵素部位を含まない 。従って、SNVenv遺伝子中の異なる位置で点変異を誘導し(部位特異的変異誘発 により)、制限酵素認識部位を作製した。この目的のためにSNVenv遺伝子(HindII I-SacIフラグメント)をpSelect(部位特異的変異誘発のための特別に設計された ベクター)にサブクローニングした。制限酵素が２つのコドンの間を切断するよ うに平滑末端を生じる酵素の制限部位を導入した。この方策が堅実に終わった後 、リーディングフレームを変えることなく、すべての変異体を使用して、欠失、 挿入、および融合を任意の組合わせで作製し得る。さらに、疎水性ドメインおよ び親水性ドメインをコードする領域の間に制限酵素部位をネスト(nest)した。１ つまたは複数の特定のドメインの欠失は、続くドメインの適切な折り畳みを妨げ ないと仮定した。この仮説は、進化において多くのタンパク質が機能的ドメイン のエキソンシャフリングにより発生したという知見に基づく。 作製したいくつかの変異エンベロープを図２に示す。pSNV-env-mC(図2a)は、 疎水性ペプチドドメインおよび親水性ペプチドドメインの間に位置する新たな制 限酵素部位を含む。この変異体において、ヌクレオチド配列における変化は、ア ミノ酸配列を変えない。従って、pSNV-env-mCはポジティブコントロールと考え 得る。pSNV-env-mDはエンベロープ前駆体の切断部位内に新たな制限酵素部位を 含む。この変異の導入はまた、アミノ酸配列を変え、調査したすべてのレトロウ ィルスのすべての切断部位において見出された共通のモチーフを破壊した。それ ゆえ、得られるエンベロープ前駆体は切断されず、従って感染性ウィルス粒子を 生じさせないことが予想された。変異env遺伝子を、真核生物遺伝子発現ベクタ ーpHB3に挿入した(図２)。 DNPに対する抗体のH鎖およびL鎖をコードする遺伝子はOgawa博士(Scripps Cli nic、La Jolla、Ca)の好意により贈与された。この遺伝子は配列決定され公表さ れた(Rileyら、1986)。記載のように(WhitlowおよびFilpula、1990)PCR技術を用 いて、DNPに対するシグナルペプチドを含む単鎖抗体遺伝子を構築した。PCR産物 をpBluescriptのSmaI部位にクローニングした。DNA配列決定により、抗原結合ペ プチドの可変領域をコードする２つの遺伝子セグメントがうまく組み合わされた ことを確認した。抗DNP scFv遺伝子の全配列を図３に示す。SacII(pBluescript のポリリンカー中に位置する)からSmaI(3'PCRプライマー中に位置する)までのフ ラグメントを以下のようにエンベロープ遺伝子のアミノ末端部位を置換して真核 生物発現ベクターに挿入した：pTC4においては、envのSacII(env遺伝子のATGコ ドンの上流に位置する)からSmaIまでのフラグメントをscFv遺伝子で置換した；p TC5においては、envのSacIIからMscIまでのフラグメントをscFv遺伝子で置換し た(それぞれ、図２Ｃおよび図２Ｄ)。クローニングの後、抗体エンベロープ連結 部を配列決定して、キメラ遺伝子の適正なリーディングフレームが維持されてい ることを確認した。 インビトロ結合アッセイ 以下の方法でインビトロ結合アッセイを行った。DNPをBSAに結合させた(DNP-B SAを用いて、scFv遺伝子が由来する最初の抗体を惹起させた)。供給者(Sigma)に より推奨されるプロトコルに従って、DNP-BSAを活性化Sepharoseにカップリング させた。抗DNP抗体(S.Pestka博士の好意により贈与された)を用いるElisaアッセ イによりカップリング反応が成功したことを確認した。100mlの組織培養上清培 地を50mlのDNP-BSA-Sepharoseと30分間37℃でインキュベートした。インキュベ ーション後、セファロース粒子を、Qualitron小型遠心分離機での30秒間の遠心 分離によりペレット化した。ペレットを１回PBSで洗浄した。このPBSを除去し、 そしてセファロースペレットに反応液を添加することにより逆転写アッセイを行 った。逆転写アッセイを標準的な手順を用いて行った；cDNAへの32PdTTPの取り 込みを記載のように(SchleifおよびWensink、1981)、TCA沈殿により測定した。 抗体-エンベロープ融合タンパク質を含む粒子の感染力についての試験 それぞれレトロウィルスコアタンパク質を発現するプラスミドおよびハイグロ マシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現のためのレトロウィルスベクター を含むプラスミドであるpBR1およびpJD214HY(図２)との同時トランスフェクショ ンで、図２に示されるエンベロープ発現プラスミドをD17細胞(イヌ骨肉腫細胞株 )中にトランスフェクトした(図１も参照のこと)。ハイグロマイシン耐性につい て細胞を選択した。ハイグロマイシン耐性についての選択の後、ウィルスをコン フルエントな細胞培養物から採集し、感染力アッセイを行った(下記参照のこと) 。感染した標的細胞をハイグロマイシン耐性について選択した(D17細胞を60mg/m lのハイグロマイシンを含有する培地でインキュベートし、CHO細胞を250mg/mlの ハイグロマイシンを含有する培地でインキュベートした)。ハイグロマイシン耐 性細胞コロニーは感染性ウィルス粒子を示す。 感染力アッセイを、結合DNPを有するおよび結合DNPを有さないD17細胞およびC HO細胞において行った。DNPを以下のように細胞に結合させた：ナトリウムココ ジレート(sodium cocodylate)緩衝液(0.25M)中の1.4mg/ml DNBS(2,4,-ジニトロ ベンゼン-硫酸2-水化物、Kodakから購入)を含有する500mlの溶液を用いて３〜５ 分間室温でインキュベートした。5mlの培地を細胞に添加することにより結合反 応を停止させた。 非結合細胞の感染を50mM ポリブレンの存在下、標準的なプロトコルを用いて 行った。DNP結合細胞の場合、ポリブレンなしで感染を行った。 野生型エンベロープ 材料および方法 scA標的ベクター いくつかのヒト腫瘍細胞上に発現される細胞表面タンパク質に対する抗体の抗 原結合部位を含有する標的エンベロープを構築するために、E.coliでの発現のた めに作製された対応する単鎖抗体遺伝子(B6.2と呼ばれる、Bird,R.E.ら、1988お よびColcher,D.ら、1990)を以下の様に改変した：オリジナルのE.coli発現プラ スミドをテンプレートとして用い、PCR技術を用いてB6.2 scA遺伝子を増幅した( Bird,R.E.ら、1988、およびColcher,D.ら、1990)。使用したプライマーは以下の 配列を有した： PCR増幅により、オリジナルのB6.2遺伝子中に存在する細菌ompAシグナル配列お よび終止コドンを含まないフラグメントを得た(Bird,R.E.ら、1988およびColche r,D.ら、1990)。PCR産物をpBluescriptベクター(Strata gene)のSma1部位にクロ ーニングし、そして配列決定を行って適正なリーディングフレームを確認した。 このプラスミドをpTC9と名付けた。Eco47IIIおよびNruIでpTC9プラスミドを消化 することにより、B6.2遺伝子を単離した。対応する制限酵素認識部位を、PCR増 幅に使用したプライマーで導入しておいた。B6.2遺伝子(Eco47IIIからNruIまで のフラグメント)を遺伝子発現ベクターであるpTC13にクローニングした(図５)。 対応するベクター(pTC23と名付けた)は、B6.2遺伝子に融合された、小胞体を通 した輸送を可能にするSNVエンベロープタンパク質のER輸送シグナル配列を含む 。クローニングによりB6.2遺伝子の3'末端にNruI部位が再構築された。SNVエン ベロープ遺伝子のカルボキシ末端部分を単離し、そしてB6.2遺伝子に融合して(N ruI部位)、プラスミドpTC24、pTC25、およびpTC26を得た(図６)。プラスミドpTC 24およびpTC25は、抗DNP抗体を含むpTC4およびpTC5プラスミドと正確に同一のレ トロウィルスエンベロープの部分を保持する。プラスミドpTC26においては、抗 体はSNVエンベロープのコドン168に融合されている。 キメラSNV-MLV標的エンベロープ 別のウィルスのレセプター結合ペプチドを含む標的エンベロープを以下の様に 作製した：エコトロピックマウス白血病ウィルスの遺伝子セグメント(SUペプチ ドをコードするほぼ全領域を含むHindIII-BaIIフラグメント(そのER輸送シグナ ル配列を含む)、Ott,D.、およびRein,A．1992)を単離し、そしてpSNV-env-mCベ クターおよびpSNV-env-mDベクターに挿入して(pSNV-env-mCおよびpSNV-env-mDは 図２に記載された)、SNVエンベロープ遺伝子のアミノ末端部分を置換した。得ら れる構築物は、抗DNP抗体ペプチド(抗DNP scA)が、ecoMLVのレセプター結合ペプ チドにより置換されること以外、それぞれプラスミドpTC4およびpTC5と同一であ る(図６、それぞれpSNV-MLV-chiCおよびpSNV-MLV-chi-D)。 実験系 簡略に述べると、上記のようにレトロウィルスgag-polタンパク質、レトロウ ィルス標的エンベロープ、および野生型エンベロープを発現するプラスミドを選 択マーカーと共に同時トランスフェクションでD17中にトランスフェクトするこ とによりヘルパー細胞を作製し、標的エンベロープのみを含有するヘルパー細胞 株または標的エンベロープおよび野生型エンベロープの両方を含有するヘルパー 細胞株を得た。D17細胞、エコトロピックマウス白血病ウィルスレセプターを発 現するCHTG細胞(Albritton,L.M.ら、1989)およびヒトHeLa細胞およびCol-1細胞 を含む種々の異なる細胞株で感染力アッセイを行った。記載のように(Mikawa,T. ら)、細菌性βガラクトシダーゼ遺伝子を発現するレトロウィルスベクターを用 いて感染力を決定した。 結果 標的エンベロープ インビトロ結合アッセイ。インビトロ結合アッセイは、pSNV-env-mDでトラン スフェクトした細胞のみが、DNPに結合し得るキメラエンベロープを含有するウ ィルスベクター粒子を産生することを示した(表１も参照のこと)。 感染力研究。感染力実験の結果を表１に要約する。野生型エンベロープを含む ベクター粒子(pSNV-env-mC)を、1mlの組織培養上清培地あたり約105のコロニー 形成単位の効率でD17細胞を感染させた。また、このようなウィルス粒子は、DNP と結合したD17細胞を感染させた。しかし、この感染効率は、DNPと結合していな い細胞の感染効率よりも３オーダーの規模小さかった。このウィルス力価におけ る低下は、主に抗生物質を用いたDNP結合細胞の選択の困難さに起因する。結合 反応は細胞を薬物に対して非常に感受性にし、90％より多い細胞が結合反応の２ 〜３日後に死減した。野生型エンベロープを有するウィルス粒子はCHO細胞を感 染しない。 エンベロープ前駆体タンパク質(SNV-env-mD)の切断部位の変異は感染力を完全 になくした。DNPと結合されないD17細胞において１つのコロニーのみが観察され た。この知見は、エンベロープ前駆体の切断部位における変異が非感染性ウィル ス粒子をもたらすという先の報告と一致する。pTC4(図２)でトランスフェクトし た細胞は、D17細胞またはCHO細胞を顕著な効率で感染させ得るベクター粒子を産 生しなかった。pTC5でトランスフェクトした細胞はD17細胞またはCHO細胞を感染 し得ないウィルス粒子を産生した。しかし、このような粒子は、DNPと結合した 細胞を顕著に感染した。 野生型エンベロープ まず、DNPに対する抗原結合部位を提示する粒子における野生型エンベロープ の存在を試験して、DNP結合細胞の感染効率の増加があるか否かを決定した。DNP 結合HeLa細胞は、野生型エンベロープのみを含むベクターウィルス粒子に感染し 得ないことを見出した。しかし、DNP結合細胞は、抗DNP提示レトロウィルスベク ターに非常に低い効率で感染され得た。測定した力価は、1mlの組織培養上清培 地あたり約10の感染性単位であった。標的抗DNPエンベロープに加えて野生型エ ンベロープを含むウィルス粒子は、10〜30倍より効率的に細胞を感染させた。こ のデータは、野生型エンベロープの存在は標的ベクターの感染効率を増加させ得 ることを示す。他の標的分子を用いる２つのさらなる実験のセットを行い、この 知見を確認した。 １．抗体-エンベロープ融合タンパク質を含有するウィルス粒子を用いる感染 力研究。種々のヒトガン細胞上で発現される細胞表面タンパク質に対する抗体(B 6.2、Bird,R.E.ら、1988およびColcher,D.ら、1990)の抗原結合部位を提示する ウィルス粒子で、D17細胞、HeLa細胞およびCol-1細胞を感染させた。ベクターウ ィルス粒子を種々の異なるヘルパー細胞株から採集した(表２)。すべてのウィル ス粒子は、細菌性β-ガラクトシダーゼ遺伝子を形質導入するベクターを有した 。記載のように(Mikawa,T.ら)、細胞をX-galで染色することにより感染力を測定 した。感染後２日〜３日目に青色細胞コロニー数を測定した。以下のウィルス粒 子を感染力について試験した：エンベロープを含まないウィルス粒子(「envなし 」 と名付けた)、野生型エンベロープのみを含むウィルス粒子(wt-env-DSNと名付け る)、抗体-エンベロープ融合タンパク質である標的エンベロープのみを含むウィ ルス粒子(図６に記載のようにTC24、TC25、およびTC26と名付けた)、そして野生 型エンベロープおよび標的エンベロープを含む粒子(TC24+wt-env、TC25+wt-env 、およびTC26+wt-envと名付けた)。 エンベロープを全く含まない粒子は、基本的に非感染性であることが見出され た。野生型エンベロープを含む粒子は、野生型SNVに対するレセプターを含むD17 細胞にのみ感染性であった。この粒子は、HeLa細胞またはCol-1細胞には感染性 でなかった。標的エンベロープのみを含む粒子はD17細胞およびHeLa細胞に感染 性であった。D17細胞における感染効率は、野生型エンベロープを含むウィルス の感染効率の５％未満であった。このような粒子はCol-1細胞には非感染性であ った。野生型エンベロープの付加は、感染効率を10〜50倍増加させた。さらに、 いずれかのエンベロープを単独で含む粒子には感染し得なかったCol-1細胞は、 野生型envおよび標的envの両方を含む粒子に感染し得た。このデータは野生型エ ンベロープが機能を付加して、ウィルス浸透を改善または可能にさえすることを 示す(表２)。これらのデータはまた、感染力のレベルは、抗体がエンベロープに 融合されるエンベロープ遺伝子内の位置に依存することを示す。 ２．SNV-MLV-融合タンパク質を含有するウィルス粒子を用いる感染力研究。エ コトロピックマウス白血病ウィルスに対するレセプターを発現するCHTG細胞(Alb ritton,L.M.ら、1989に記載される)およびD17細胞を、標的エンベロープ(SNV-ML V-chi-CおよびSNV-MLV-chi-D)のみを発現する細胞または標的エンベロープおよ び野生型エンベロープを発現するヘルパー細胞から採集されたウィルスに感染さ せた。ウィルス粒子はハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を有した。感染した細胞を ハイグロマイシン耐性について選択し、そしてハイグロマイシン耐性細胞コロニ ー数を測定した。標的エンベロープのみを含むレトロウィルスベクター粒子は感 染性ではなかった。この粒子は、野生型エンベロープを粒子に付加した後に感染 性になった。野生型エンベロープのみを有する粒子はCHTG細胞に対して感染性で はなかった(表３)。 考察 標的エンベロープ 抗体-エンベロープ融合タンパク質を含有するレトロウイルス粒子を用いて得 られたデータは、このような粒子が感染に応答能があることを示した。驚くべき ことに、SUの中間でenvと融合したscFv遺伝子を含有する構築物であるTC4は、DN Pに結合し得るウイルス粒子を与えなかった。このことは不安定なSU-TM複合体に 起因し得る。この仮説は、このような粒子がDNP-BSA-Sepharoseに結合できない ことを見出したことにより支持される。D17細胞に対するこのような粒子の低レ ベルの感染力は、TMのみを含有するウイルス粒子の非特異的な吸着の結果であり 得る。非特異的に吸着された(SUを欠失した)ウイルス粒子は、細胞に随時侵入し 得る。 pTC５でトランスフェクトされた細胞は、キメラエンベロープを有し、機能的 性レトロウイルス膜融合ドメインを有さないウイルス粒子を生成する。この仮定 は、切断されないエンベロープ前駆体タンパク質(SNV-env-mD)を含有するウイル ス粒子が感染性でないという知見に基づいている。しかし、未知のメカニズムに より細胞表面に結合した後、いくつかの抗体分子が細胞に取り込まれることが知 られている。データは、このような取り込みのメカニズムによってウイルス粒子 が取り込まれ、その結果、首尾よく感染が確立することを十分に可能にし得るこ とを示す。 遺伝子治療における抗体-エンベロープ融合タンパク質を 有するベクター粒子の適用 これまでのヒト遺伝子治療の適用では、全て目的の細胞を患者から単離し、他 の細胞型から精製し、そして組織培養物中で、ヘルパー細胞から採収したレトロ ウイルスベクター粒子に感染させた。組織培養で処置細胞を増殖させた後、それ らを患者に再注射した。細胞の感染はインビトロでなされるべきである。なぜな ら、使用されるレトロウイルスベクター粒子(両種性マウスレトロウイルス由来) が、広範な宿主域を有するからである。従って、患者の血流中に直接注射する場 合、このようなウイルス粒子は全ての種類の組織に感染する。他の危険に加えて 、 この処置は効率が悪い。なぜなら、遺伝子がその適切な標的細胞に送達される可 能性が非常に低いからである。 この臨床的遺伝子治療のプロトコルは、患者に対してどの程度効果的で、そし てどの程度有益な遺伝子治療であるかを見出すのに十分であり得る。実際、臨床 データは、非常に有望であるようてある(Eglitis、私見)。しかし、現在の臨床 プロトコルは、非常に労力を要し、時間がかかり、非常に高価であり、それゆえ 一般的な臨床適用には適切ではない。一般的な臨床適用のために、遺伝子移入ビ ヒクルを直接、患者の体内へ注射することが必要である。 １つの特異的細胞型にのみ感染するレトロウイルスベクター粒子が開発されれ ば、ベクターを患者の血流へ直接注射することを可能にし得る。抗体-エンベロ ープのキメラを含むベクター粒子の開発は、この目的に対する最初のステップと なり得、そしてインビボにおける遺伝子治療に可能性のある適用の新たな領域を 展開し得る。 野生型エンベロープ 抗体の抗原結合部位を提示するレトロウイルスベクター粒子は、抗体に特異的 な抗原を含有する細胞に特異的に感染し得る。しかし、遺伝子移入の効率は低く あり得る。本発明者らは、標的ペプチドとエンベロープの融合が、ウイルスの効 率の良い侵入に不可欠であるエンベロープの天然の融合機能を損傷したとの仮説 を立てた。従って、野生型エンベロープを付加することが、この欠点を補い得る という仮説を試験した。 ２つの異なる型の標的エンベロープを含む新規のレトロウイルスベクター粒子 を構築した。これらの標的エンベロープとは:(1)脾臓壊死ウイルス(SNV)のエン ベロープタンパク質の種々のカルボキシ末端部分に融合された抗体の抗原結合部 位を含む融合タンパク質；および(2)SNVの種々のカルボキシ末端部分に融合され るecoMLVのレセプター結合ドメインからなる融合タンパク質(抗体エンベロープ 構築物に類似)(図６)である。 標的エンベロープ単独では、標的エンベロープに対するレセプターを含有する 細胞に対して、ほとんどあるいは全く感染性がなかった。標的エンベロープを含 む粒子に野生型エンベロープを付加すると、いずれか一方のエンベロープのみを 含むウイルス粒子にはほとんどあるいは全く感染し得なかった標的細胞に対する 感染力が劇的に増加したかまたは完全に可能になった。このデータは、混合型エ ンベロープを含む粒子を構築すると、特定の標的細胞への遺伝子移入の効率が劇 的に改良され、それゆえ、特異的な標的細胞に遺伝子を移入するのに役立つ手段 を提供することを示す。 この方法は、野生型エンベロープの天然のレセプターの結合ドメインを変異す ることにより(例えば、部位特異的変異誘発により)、おそらく改良され得る。混 合型エンベロープレトロウイルスベクター粒子において、非機能的レセプター結 合部位を含有する野生型エンベロープを使用すると、標的細胞の特異性を欠うこ となく、野生型エンベロープに対するレセプターを含有する細胞を標的にするこ ともまた可能にし得る。 本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、プライマー、プローブ、 検出しようとするオリゴマーフラグメント、オリゴマーコントロール、および非 標識のブロッキングオリゴマーをいう。オリゴヌクレオチドは、２つ以上のデオ キシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子である。本明細書で 使用される用語「プライマー」は、オリゴヌクレオチド、好ましくはオリゴデオキ シリボヌクレオチドをいい、精製される制限消化物のように天然に存在するか、 または合成で生成される。プライマーは、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長 産物の合成が誘導される条件(すなわち、ヌクレオチド、DNAポリメラーゼのよう な重合のための薬剤、および適切な温度およびpHの存在下において)を受ける場 合、合成の開始点として作用し得る。プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物 の合成をプライムするために十分な長さでなくてはならない。ポリメラーゼ連鎖 反応(PCR)による核酸配列の増幅方法および検出方法は、米国特許第4,683,195号 、同第4,683,202号、および同第4,965,188号に詳細に記載されており、これらの 開示内容は本明細書に参考として援用される。 図１は、レトロウイルスタンパク質を発現するヘルパー細胞を示す図である。 Ａ)ヘルパー細胞は感染性ウイルス粒子を形成するために必要な全てのレトロウ イルスタンパク質を発現するプラスミドのトランスフェクションにより作製され る。一方のプラスミドは全てのコア／タンパク質(gagおよびpolの発現)を発現す るように設計される。他方のプラスミドはエンベロープ前駆体／タンパク質を発 現するように設計される。両方のプラスミド構築物とも、ウイルス複製のための レトロウイルスのシス／作用配列(例えば、包膜配列、プライマー結合部位など) を含有していない。ポリアデニル化が、非／レトロウイルスポリアデニル化認識 配列において生じる。Ｂ)レトロウイルスベクターのトランスフェクション後、 ベクターRNAゲノムはコア構造中に包膜される。ヘルパー細胞は、目的の遺伝子( １つまたは複数)を伴うベクターゲノムのみを含むレトロウイルス粒子を産生す る。ベクターは、複製のための全てのシス／作用配列を含有する。従って、感染 された標的細胞において、ベクターゲノムは逆転写され、そしてゲノム中へ取り 込まれる。ベクターゲノム中でレトロウイルスタンパク質コード遺伝子が欠損す るため、ウイルス粒子は感染された標的細胞から産生されない。Ｃ)プラスミド を含むヘルパー細胞が、改変されたエンベロープ遺伝子を発現する。ヘルパー細 胞は上で示されたものと非常に類似する。しかし、エンベロープ遺伝子のカルボ キシ末端で融合されたアミノ末端で抗体の抗原結合ドメインを含むキメラエンベ ロープ遺伝子が構築される。このような粒子はキメラエンベロープタンパク質の 抗体部分により認識される抗原構造を含む標的細胞のみに結合し、そして感染し 得る。 図２は、脾臓壊死ウイルス(SNV)の変異エンベロープ遺伝子を発現するプラス ミドを示す図である。遺伝子は、ラウス肉腫ウイルスプロモーター(RSV/pro)か ら発現され、そして単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のポリアデ ニル化シグナル(TK/ポリ(A))内でポリアデニル化される。pBluescriptのポリリ ンカーを、このベクターへの遺伝子のクローニングを容易にするために、プロモ ーターとポリアデニル化配列との間に挿入した（ベクターに隣接するプラスミド 配列は示さず)。a/b)点変異を、部位特異的変異誘発によりenv遺伝子に移入し、 新規の制限酵素認識部位(*で示す)を作製した。全ての酵素は、リーディングフ レームをシフトすることなく容易に連結するために、平滑末端を作製する２つの コドン間で正確に切断する。c/d)envのカルボキシ末端に融合された抗原結合ペ プチドを含有するキメラエンベロープ。e)レトロウイルスベクター粒子により遺 伝子移入を試験するための全ての研究において使用されるレトロウイルスベクタ ーである、pJD214Hy。 図３は、ハプテンDNPに対する単鎖抗体遺伝子(scFv)の配列を示す。 図４は、レトロウイルスパッケージング細胞を示す。Ａ)レトロウイルスベク ター粒子タンパク質の産生のための２つの異なるプラスミドを含有する真核生物 細胞。このような細胞にトランスフェクトされ、および目的の遺伝子を有するレ トロウイルスベクターが、レトロウイルスのコアタンパク質により包膜される。 エンベロープ発現ベクターは、標的エンベロープ(例えば、エンベロープに融合 した抗原結合タンパク質)を発現する。抗原結合部位に特異的なレセプターを含 有する標的細胞のみを感染するウイルス粒子が産生される。Ｂ)に示されるヘル パーは、野生型エンベロープをコードする遺伝子発現ベクターをさらに含有する 以外は上で示したヘルパーと同様である。このようなヘルパー細胞から産生され るウイルス粒子は、標的エンベロープおよび野生型エンベロープからなる「混合 型」エンベロープを含有する。混合型オリゴマーの形成は可能である。なぜなら 、標的エンベロープおよび野生型エンベロープの両方がオリゴマーの形成を介在 する完全なTMペプチドを含むからである。 図５は、ER認識配列を含む高レベルの遺伝子産物を得るための真核生物遺伝子 発現ベクター(pTC13)を示す。示されるベクターはSheay,W.ら、1993において記 載される別の遺伝子発現ベクター(pRD114という)に由来している。このベクター は、小胞体を介してタンパク質を輸送することを可能にするために、ER認識シグ ナル配列をコードする遺伝子フラグメントを含む点でpRD114とは異なる。このベ クターは、ERシグナル配列コード領域の下流の２つのコドン間を切断する制限酵 素、NruIおよびStuIの２つの認識部位を含有する。任意のペプチドをコードする DNAフラグメントは、このベクターに挿入され得る。挿入された遺伝子の翻訳は 、３つの停止コドンのうちの１つを使用することにより、終止する。MLV-U3-pro ：マウス白血病ウイルスのプロモーターおよびエンハンサー；Ad.Vリーダー：ア デノウイルスの三部分リーダー配列；SV40ポリ(Ａ)：シミアンウイルス40のポリ アデニル化シグナル配列； 図６は、標的エンベロープタンパク質を発現するプラスミドベクターを示す。 単鎖抗体B6.2(Eco47IIIからNruIフラグメント、材料および方法を参照のこと)を コードする遺伝子のPCR産物を、pTC13(図５)のNruI部位にクローニングし、プラ スミドpTC23を与える。SNVエンベロープ遺伝子のカルボキシ末端部分を単離し、 そしてB6.2抗体遺伝子のNruI部位下流へクローニングした。得られたpTC24およ びpTC25の標的抗体-エンベロープ融合遺伝子は、pTC4およびpTC5に類似する。pT C24およびpTC25はそれぞれ、pTC4およびpTC5と全く同量のSNVエンベロープを保 持する。pTC26において抗体をコードする遺伝子は、エンベロープ遺伝子の167番 目のコドンでエンベロープコード領域と隣接した。プラスミドpSNV-MLVchiCおよ びpSNV-MLV-chiDは、抗体遺伝子がMLVのほとんど完全なSUペプチドをコードする 遺伝子フラグメントに置換される以外は、pTC4およびpTC5に同一である。これら のクローンにおいて、ER輸送シグナル配列(L)は、MLV由来である。MLV-pro：マ ウス白血病ウイルスのプロモーターおよびエンハンサー；AVtl：アデノウイルス の三部分リーダー配列；L：ER輸送シグナル配列；B6.2scFV：単鎖抗体B6.2をコ ードする遺伝子；ポリ(A)：SV40のポリアデニル化シグナル配列；SU：SNVエンベ ロープのSU表面ペプチドコード領域；TM：SNVエンベロープのトランスメンブレ ンコード領域；RSV：ラウス肉腫ウイルスのプロモーターおよびエンハンサー。 本出願にわたって、種々の刊行物が参照されている。これらの刊行物における 開示は、より十分に当該分野の状態を記載するために参考として本明細書におい て援用される。 それゆえ記載される本発明が、多くの方法で改変され得ることが明白である。 このような改変は、本発明の精神および範囲から逸脱しないものとして考慮され 、そしてこのような全ての改変は以下の請求の範囲内に包含されることが意図さ れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 47/00 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子であって、該レトロ ウィルスベクター粒子はレトロウィルスベクターのエンベロープタンパク質に融 合されて標的エンベロープを形成する標的ペプチドを有するレトロウィルスベク ターを含み、ここで該標的ペプチドは天然のウィルスのレセプター結合部位を置 換または破壊し、そして該標的ペプチドは抗体の抗原結合部位、別のウィルスの レセプター結合ペプチド、または標的の特異的なレセプターに特異的に結合する ペプチドである、レトロウィルスベクター粒子。 ２．前記レトロウィルスベクター粒子が脾臓壊死ウィルス(SNV)である、請求 項１に記載のレトロウィルスベクター粒子。 ３．前記標的ペプチドがハプテンジニトロフェノールに対する単鎖抗体(抗DNP -scFv)である、請求項１に記載のレトロウィルスベクター粒子。 ４．前記標的ペプチドが標的細胞の細胞表面タンパク質に対する抗原結合部位 である、請求項１に記載のレトロウィルスベクター粒子。 ５．前記標的ペプチドが別のウィルスのレセプター結合ペプチドである、請求 項１に記載のレトロウィルスベクター粒子。 ６．前記レトロウィルスベクターが標的エンベロープおよび野生型エンベロー プを含む、請求項１に記載のレトロウィルスベクター粒子。 ７．前記野生型エンベロープが脾臓壊死ウィルス(SNV)に由来する、請求項６ に記載のレトロウィルスベクター粒子。 ８．レトロウィルスベクターを用いて脊椎動物細胞に遺伝子を導入するための 細胞型特異的方法であって、該方法は標的細胞特異性を有するレトロウィルスベ クター粒子を該細胞に投与する工程を包含し、該レトロウィルスベクター粒子は レトロウィルスベクターのエンベロープタンパク質に融合されて標的エンベロー プを形成する標的ペプチドを有するレトロウィルスベクターを含み、ここで該標 的ペプチドは天然のウィルスのレセプター結合部位を置換または破壊し、そして 該標的ペプチドは抗体の抗原結合部位、別のウィルスのレセプター結合ペプチド 、または標的の特異的なレセプターに特異的に結合するペプチドである、方法。 ９．前記レトロウィルスベクター粒子が脾臓壊死ウィルス(SNV)である、請求 項８に記載の方法。 １０．前記標的ペプチドがハプテンジニトロフェノールに対する単鎖抗体(抗D NP-scFv)である、請求項８に記載の方法。 １１．前記標的ペプチドが標的細胞の細胞表面タンパク質に対する抗原結合部 位である、請求項８に記載の方法。 １２．前記標的ペプチドが別のウィルスのレセプター結合ペプチドである、請 求項８に記載の方法。 １３．前記レトロウィルスベクターが標的エンベロープおよび野生型エンベロ ープを含む、請求項８に記載の方法。 １４．前記野生型エンベロープが脾臓壊死ウィルス(SNV)に由来する、請求項 １３に記載の方法。 １５．標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子を調製するための 方法であって、該レトロウィルスベクター粒子はレトロウィルスベクターのエン ベロープタンパク質に融合されて標的エンベロープを形成する標的ペプチドを有 するレトロウィルスベクターを含み、ここで該標的ペプチドは天然のウィルスの レセプター結合部位を置換または破壊し、そして該標的ペプチドは抗体の抗原結 合部位、別のウィルスのレセプター結合ペプチド、または標的の特異的なレセプ ターに特異的に結合するペプチドであって、以下の工程： (a)標的ペプチドを提供する工程； (b)ウィルスのレセプター結合部位をコードするエンベロープ遺伝子の部分を 標的ペプチドで置換してキメラエンベロープ遺伝子を形成する工程； (c)真核生物遺伝子発現ベクター中にキメラエンベロープ遺伝子をクローニン グする工程；および (d)キメラエンベロープ発現プラスミド、レトロウィルスコアタンパク質発現 プラスミド、および選択マーカー遺伝子発現プラスミドで真核生物細胞をトラン スフェクトする工程を包含する、方法。 １６．前記レトロウィルスベクター粒子が脾臓壊死ウィルス(SNV)である、請 求項１５に記載の方法。 １７．前記標的ペプチドがハプテンジニトロフェノールに対する単鎖抗体(抗D NP-scFv)である、請求項１５に記載の方法。 １８．前記標的ペプチドが標的細胞の細胞表面タンパク質に対する抗原結合部 位である、請求項１５に記載の方法。 １９．前記標的ペプチドが別のウィルスのレセプター結合ペプチドである、請 求項１５に記載の方法。 ２０．前記レトロウィルスベクターが標的エンベロープおよび野生型エンベロ ープを含む、請求項１５に記載の方法。 ２１．前記野生型エンベロープが脾臓壊死ウィルス(SNV)に由来する、請求項 ２０に記載の方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002320475A (ja) * 2000-04-14 2002-11-05 Transgene Sa 標的化感染特異性を有するポックスウイルス
JP2002330774A (ja) * 2000-11-07 2002-11-19 Transgene Sa 標的化感染特異性を有するポックスウイルス
JP2022507454A (ja) * 2018-11-14 2022-01-18 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｃｎｓ送達のためのフソソーム組成物
JP2022507453A (ja) * 2018-11-14 2022-01-18 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｔ細胞送達のためのフソソーム組成物

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6534051B1 (en) 1992-11-20 2003-03-18 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cell type specific gene transfer using retroviral vectors containing antibody-envelope fusion proteins and wild-type envelope fusion proteins
GB9604354D0 (en) * 1996-02-29 1996-05-01 Isis Innovation Targeting adapters
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
WO1997038119A1 (en) * 1996-04-08 1997-10-16 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Reagent and method for targeting retrovirus
CA2251738A1 (en) * 1996-04-16 1997-10-23 Immusol Incorporated Targeted viral vectors
FR2762851B1 (fr) * 1997-04-30 1999-10-29 Inst Nat Sante Rech Med Construction et expression d'enveloppe chimerique de retrovirus par des vecteurs et compositions pharmaceutiques les contenant
DE19752855C2 (de) 1997-11-28 2003-04-03 Bundesrepublik Deutschland Let Retrovirale Pseudotyp-Vektoren mit modifizierten Oberflächen-Hüllproteinen und Verpackungszelle zu ihrer Herstellung für den selektiven Gentransfer
DE19752854C2 (de) 1997-11-28 2000-07-06 Bundesrepublik Deutschland Let Zellspezifische retrovirale Vektoren mit Antikörperdomänen und Verfahren zu ihrer Herstellung für den selektiven Gentransfer
NZ532894A (en) * 1998-04-29 2005-10-28 Univ Southern California Retroviral vectors including modified envelope escort proteins
US7078483B2 (en) 1998-04-29 2006-07-18 University Of Southern California Retroviral vectors including modified envelope escort proteins
US11325948B2 (en) 2016-03-19 2022-05-10 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL
US11111505B2 (en) 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
KR20210043574A (ko) 2018-07-09 2021-04-21 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 푸소좀 조성물 및 이의 용도
JP2022513040A (ja) 2018-11-14 2022-02-07 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド コンパートメント特異的カーゴ送達のための組成物および方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993000103A1 (en) * 1991-06-21 1993-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Chimeric envelope proteins for viral targeting
CA2149889A1 (en) * 1992-11-20 1994-06-09 Ralph C. Dornburg Cell-type specific gene transfer using retroviral vectors containing antibody-envelope fusion proteins

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002320475A (ja) * 2000-04-14 2002-11-05 Transgene Sa 標的化感染特異性を有するポックスウイルス
JP2002330774A (ja) * 2000-11-07 2002-11-19 Transgene Sa 標的化感染特異性を有するポックスウイルス
JP2022507454A (ja) * 2018-11-14 2022-01-18 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｃｎｓ送達のためのフソソーム組成物
JP2022507453A (ja) * 2018-11-14 2022-01-18 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｔ細胞送達のためのフソソーム組成物

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