JPH10501534A

JPH10501534A - 強化されたドラッグ・デリバリーのためのスフィンゴソーム

Info

Publication number: JPH10501534A
Application number: JP8501434A
Authority: JP
Inventors: エス．ウェブ，ミューライ; ビー．バリー，マーセル; ディー．メイヤー，ローレンス; エム．ミラー，ジェームズ; ジー．タルディ，ポール
Original assignee: イネックスファーマシューティカルズコーポレイション
Priority date: 1994-06-20
Filing date: 1995-06-19
Publication date: 1998-02-10
Anticipated expiration: 2017-04-02
Also published as: EP0804159A1; CA2193502A1; WO1995035094A1; DE69531701D1; US5543152A; DE69531701T2; AU2709495A; CA2193502C; EP0804159B1; JP3270478B2; PT804159E; ES2206510T3; ATE248586T1

Abstract

(57)【要約】（インビボにおける）延長された循環時間及び増加した薬物保持をもつリポソーム配合物は、スフィンゴミエリンとコレステロールから成り、そして酸性のリポソーム内pHをもつ。これら配合物は、強化された安定性をもち、そしてそれ故、改良されたドラッグ・デリバリー及びより有効な処置を提供する方法において使用される。アルカロイド薬物、特にスワインゾニン、ビンクリスチン及びビンブラスチンのデリバリーが、有意に改良される。

Description

【発明の詳細な説明】強化されたドラッグ・デリバリーのためのスフィンゴソーム関連出願本出願は、引用により本明細書中に取り込む、1994年６月20日に出願された米国逐次番号第08／263,603 号の一部継続である。本発明の背景治療的に活性な薬物のリポソーム配合品は、遊離形態において注射される薬物を超えるかなりの利点をもつ。Weinstein，Liposomes ：From Biophysics to The rapeutics ，(Ostro，M．J.，ed.)，Marcel Dekker，Inc.，NY，pp．277-338，(1 987)。例えば、抗癌アルカロイド、ビンクリスチン(vincristine)のリポソーム配合品は、遊離のビンクリスチンがもつよりも、Ｌ1210白血病細胞に対して大きな効果をもち、そして減少された側枝毒性をもつ。Mayer et al.，Cancer Chemo ther ，Pharmacol. 33: 17-24（1993）及びMayer et al.，Cancer Res ．50: 575- 579(1990)。臨床及び／又は医薬的効力をもつ治療剤のリポソーム配合品の開発は、生物学的効力と長期間の化学的安定性の両方を有するリポソーム／薬物の組合せに依存する。一般に、リポソーム剤の効力は、そのリポソームの循環寿命とそのリポソームが封入された薬物を保持する能力の両方を増加させることにより改善されることができる。Mayer、同じ箇所に、及びBoman et al.，Cancer Res. 54: 2830-2833(1994)。それ故、多くの努力が、延長された循環時間と強化された薬物保持の両方をもつ治療用化合物のリポソーム配合品の開発に集中してきた。多種多様の治療剤が、トランスメンブランpH勾配を使用することにより 100％に達する封入効率をもつリポソーム内に充填されることができる。 Mayer et al.，Biochim ．Biophys．Acta 1025: 143-151（1990）及びMadden et al.，Chem ．Phys．Lipids 53: 37-46(1990)。これらの配合品の化学的安定性、すなわち、インビボにおける循環の間の、そのリポソーム内での充填薬物の有効な保持は、しばしば、そのリポソーム内pHが、pH2.0〜4.0 の間のレンジにあることを要求する。しかしながら、このpHレンジ内では、リポソームのアシル成分の酸加水分解は、そのリポソーム膜を不安定にし、そしてその薬物の未成熟な漏れをもたらすことができる。例えば、ビンクリスチンは、4.0 のリポソーム内pHを使用するpH勾配依存性封入手順によりリポソーム内に効率よく充填されることができる。Mayer et al.，Biochim ．Biophys．Acta 1025: 143-151（1990）及びMayer et al.，Cancer Res . 50: 575-579(1990)。リポソーム・ビンクリスチンに関する研究は、ホスファチジルコリン（PC）、通常、卵PC又はジステアロイル−PC、及びコレステロールを含む小胞に基づくものであった。Mayer et al.，1993、上掲。リポソーム・ビンクリスチンの増加された抗−腫瘍効力は、そのリポソーム内でのビンクリスチンのインビボ保持が 100倍大きなトランスメンブランpH勾配(すなわち、リポソーム内pH＝2.0)を使用して増加されるときに、生じる。Boman et al.，上掲。しかしながら、このpHにおいては、そのリポソームのPC成分の酸加水分解は、かなりの速度で生じ、そしてそのリポソームの化学的安定性を極めて限定する。特に、Sn−１とSn−２位における脂肪酸のカルボン酸エステルは、特に酸加水分解を受け易く、リゾ−PC及び遊離の脂肪酸を作り出す。Grit et al.，Chem ．Phys．L ipids 64: 3-18（1993）。かなりの割合のリゾ−PCを含むリポソームは、溶質に対しより透過性であり、そしてそれ故、ドラッグ・デリバリー媒体として好適でないであろう。スフィンゴミエリンがリポソームの循環寿命における増加を付与することが報告されている。Allen et al.，Biochim ．Biophys．Acta 981: 27-35(1989)及びA llen et al.，FEBS Lett. 223: 42-46(1987)。しかしながら、これらの研究は、リポソーム分布についてのマーカーとして捕獲された水性溶質(¹²⁵Ｉ−チラミニルイヌリン(¹²⁵Ｉ-tyraminylinulin))を使用し、そしてスフィンゴミエリンの存在中でのリポソーム寿命における見かけの増加は、スフィンゴミエリンによる増加された溶質保持から少なくとも部分的に生じたのかもしれない。スフィンゴミエリン含有リポソームがPC−含有リポソームよりもより毒性であるといういくつかの報告もある。Weereratne et al.，Brit ．J．Exp．Pathol. 64: 670-676(198 3)，Allen et al.，J ．Pharmacol．Exp．Jherap. 229: 267-275（1984）、及びA llen et al.，Res ．Commun．Chem．Pathol．Pharmacol. 50: 281-290(1985)。より多くの結論的な研究は利用することができないけれども、その認知（理解）は、スフィンゴミエリン含有リポソームが、増加された毒性リスクに関連するということである。増加された生物学的及び化学的安定性をもつ治療用化合物のリポソーム配合品が、本分野において必要とされる。リポソーム剤の効力は、そのリポソーム循環時間及びそのリポソームが封入された薬物を保持する能を増加させることにより、改善されることができるので、これらの特性をもつリポソーム配合品の開発は、臨床的な処置養生法に対する価値のある付加であるであろう。きわめて驚くべきことに、本発明は上記の及び他の関連した必要性を満たす。本発明の要約本発明は、哺乳類宿主への治療用化合物のデリバリーのためのリポソーム組成物を提供する。本組成物は、スフィンゴミエリン及びコレステロールを含んで成る１以上の膜をもつリポソーム、そのリポソーム外部のpHよりも低いpHをもつリポソーム内部、及びその宿主へのデリバリーのためにそのリポソーム内に包含された治療用化合物、を含んで成る。スフィンゴミエリンとコレステロールは、典型的には、それぞれ、75／25モル％／モル％から、30／50モル％／モル％までのモル比で存在し、そして、好ましい例においては、それぞれ、約55 ／45モル％／モル％の比にある。親油性治療用化合物は、アルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、スワインゾニン(swainsonine)又はエトポジド(etoposide)又はそれらのプロドラッグであることができる。薬物、例えば、ビンクリスチンは、約0.01／1.0 〜 0.2／1.0（重量／重量）の、薬物対脂質比で存在することができる。スワインゾニンは、0.01：1.1 〜 0.5：1.0（モル：モル）の、薬物対脂質比で存在することができる。標的化リガンドと他の脂質は、それらがその薬物及びリポソームの安定性に悪影響を及ぼさない限り、そのリポソームの成分として存在することもできる。これらのリポソームは、単ラメラ又は多ラメラであることができ、そして典型的には、約0.05ミクロン〜0.45ミクロンの、そしてより好ましくは、約0.05ミクロン〜 0.2ミクロンの平均直径をもつであろう。リポソームの内部は、典型的には、約pH２〜pH５のpHをもち、例えば、pH約４においてクエン酸塩バッファーを含むであろう。他の態様においては、本発明は、pH２よりも大きな酸性pHをもつ第１緩衝液化水溶液中にスフィンゴミエリンとコレステロールを含む混合物から作られた、治療用化合物のデリバリーのためのリポソームを提供する。次にこのリポソームは、上記第１緩衝液化水溶液のpHよりも大きなpHをもつ第２緩衝液化水溶液中に懸濁され、それにより、そのリポソームへの上記治療用化合物の輸送を容易にするトランスメンブランpH勾配を作成する。いくつかの態様においては、低いリポソーム内pHにおける薬物捕獲の他の受動的手段を、本工程において使用することもできる。これらの他工程は、典型的には、薬物のより効率の低い薬物捕獲に関連し、そしてそれ故、遊離の薬物を含む第２バッファーからそのリポソームを分離する追加の段階が必要かもしれない。本発明は、治療のための、宿主への親油性治療用化合物、例えば、アルカロイドの強化されたデリバリーのための方法をも提供する。治療の必要な宿主、例えば、腫瘍を患う患者に、スフィンゴミエリンとコレステロールを含んで成る１以上の膜をもつリポソーム、そのリポソーム外部のpHよりも低いpHをもつリポソーム内部、及びその宿主へのデリバリーのためにそのリポソーム内に包含された治療用化合物又は医薬として許容されるその塩を含んで成る、リポソーム組成物が投与される。そのpH勾配は、メチルアンモニウム又はエタノールアンモニウム濃度勾配により生成されることができる。典型的には、コレステロールは、30％〜 50％の合計モル比においてリポソーム組成物中に存在するであろうし、そしてより好ましくは、スフィンゴミエリンとコレステロールは、それぞれ約75／25モル％／モル％〜それぞれ30／50モル％／モル％の比において存在する。アルカロイド化合物、例えば、ビンクリスチン又はスワインゾニンのデリバリーは、上記の方法において特に好適である。ビンクリスチンとスワインゾニンは、それぞれ、約0.01／1.0 〜 0.2／1.0（重量／重量）、そしてそれぞれ、0.01／1.0 〜 0.5 ／1.0（モル／モル）の、薬物対脂質比において存在することができる。いずれの場合においても、上記薬物を含むリポソーム組成物は、その疾患、例えば、腫瘍を抑制又は治療するために十分な薬物の濃度であるが、その宿主に対して許容できない毒性を引き起こす量未満であるものを維持するように、その宿主に繰り返して投与されることができる。投与はさまざまな経路によるものであることができるが、アルカロイド類は、好ましくは、静脈内又は非経口的に与えられる。スワインゾニンは、便利には、経口投与される。宿主に投与されるリポソームは、0.05〜0.45ミクロンの、より好ましくは0.05〜 0.2 ミクロンの平均直径をもつ単ラメラであることができる。本発明は、宿主にリポソーム組成物中のアルカロイド免疫調節化合物をデリバリーするための方法をも提供する。宿主は、化学療法により誘発された免疫抑制を患うものであることができ、そして例えば、スワインゾニンのリポソーム組成物により治療されることができる。リポソーム組成物は、スフィンゴミエリンとコレステロールを含んで成る１以上の膜をもつリポソーム、そのリポソーム外部のpHよりも低いpHをもつリポソーム内部、及びその宿主へのデリバリーのためのそのリポソーム内に包含される治療用化合物又は医薬として許容されるその塩を含んで成る。好ましくは、スワインゾニンは、経口、静脈内、又は非経口で与えられる。図面の簡単な説明図１は、0.3Ｍシトレート、pH2.0，37℃における、DSPC／Chol（55／45，mol ／mol）（○），SM／Chol（55／45，mol／mol）（●）の大きな単ラメラ・リポソームの加水分解を示す。図２Ａと図２Ｂは、DSPC／Chol（55／45，mol／mol）（○），SM／Chol（55／ 45，mol／mol）（●）又はSM/Chol／PEG-PE（55／40／５，mol／mol／mol）（■ ）の大きな単ラメラ・リポソームを注射された BDF１マウスにおける循環中内に残存する脂質の量を示す。注射されたリポソームは、空であるか（図２Ａ）又は約0.1 の薬物／脂質化においてビンクリスチンを充填されていた（図２Ｂ）。注射された脂質投与量は、約 430μｇの脂質の合計注射に対応して、20mg／kgであった。図３は、DSPC／Chol（55／45，mol／mol）（○），SM/Chol（55／45，mol／mo l）（●）又はSM／Chol／PEG-PE（55／40／５，mol／mol／mol）（■）の大きな単ラメラ・リポソームの注射後の各時間における BDF１マウスの血漿中のビンクリスチン／脂質比を示す。マウスに、20mg／kgの脂質投与量及び 2.0mg／kgのビンクリスチン投与量に対応する、約0.1 のビンクリスチン／脂質比において、リポソームを注射した。注射された合計量は、約 430μｇの脂質及び43μｇのビンクリスチンであった。図４は、DSPC／Chol（55／45，mol／mol）（○），SM/Chol（55／45，mol／mo l）（●）又はSM／Chol／PEG-PE（55／40／５，mol／mol／mol）（■）の大きな単ラメラ・リポソームの注射後の各時間における BDF１マウスの血漿中に残存する合計ビンクリスチンを示す。マウスに、20mg／kgの脂質投与量及び 2.0mg／kg のビンクリスチン投与量に対応して、約0.1 のビンクリスチン／脂質比において、リポソームを注射した。注射された合計量は、約 430μｇの脂質及び43μｇのビンクリスチンであった。図５は、腹膜マクロファージによる、SM／Chol(55／45，mol／mol)及びDSPC／ Chol(55／45，mol／mol)の大きな単ラメラ・リポソームの取り込みを示す。非交換性及び非代謝性放射標識¹⁴C-CHDEを含むリポソームを、非経口で 100mg／kgにおいて注射した。４時間後、マクロファージを洗浄により回収し、そして細胞と脂質を、それぞれ、血球計と液体シンチレーション・カウンティングにより測定した。図６は、Ｐ388 腫瘍中へのビンクリスチンのローディングを示す。0.1（重量／重量）の薬物／脂質比においてビンクリスチンを含む、DSPC／Cho l（55／45，mol／moｌ）（○），SM／Chol（55／45，mol／mol）（●）又はSM／ Chol／PEG-PE（55／40／５，mol／mol／mol）（■）の大きな単ラメラ・リポソームの静脈内注射後の BDF１マウスにおける腹膜Ｐ388 腫瘍へのビンクリスチンのデリバリー。ビンクリスチンを20mg／kgの脂質投与量を表す、2.0mg／kgの投与量において注射した。図７Ａ−７Ｃは、ビンクリスチンのリポソーム配合品の抗腫瘍効力を集合的に示す。Ｐ388 腫瘍を含む BDF１マウスに、0.1(重量／重量)の薬物／脂質比においてビンクリスチンを含む、DSPC／Chol（55／45，mol／mol）（▽），SM／Chol （55／45，mol／mol）（□）又はSM／Chol／PEG-PE（55／40／５，mol／mol／mo l）（△）の大きな単ラメラ・リポソームを注射した。注射に先立ってリポソーム濃度を、1.0(図７Ａ)，2.0(図７Ｂ)及び4.0(図７Ｃ)mg／kgのビンクリスチン投薬を達成するように調整した。図８は、リポソーム配合品（Ｌ−Im）又は遊離薬物の水溶液（Ｆ−Im）のいずれかとして投与されたBalb／ｃマウスにおける放射標識されたスワインゾニンの血中レベルを示す。配合品を、胃管栄養法による経口（p.o.）、腹腔内（i.p.）、又は静脈内（i.v.）により、投与した。血液を、上記投薬の１時間、３時間、６時間、及び24時間後に採取した。図９は、Ｃ57BL／６マウスへの化学療法薬投与の14日後の骨髄細胞質に対する GM-CSF及びスワインゾニンの効果を示す。図10Ａと10Ｂは、化学療法薬処置の14日後にＣ57BL／６マウスから採取された、それぞれ、LPS 刺激脾臓細胞からのTNF 生産、及び ConＡ刺激脾臓細胞からの IL−２生産を示す。図11Ａと11Ｂは、Ａ431 腫瘍担持SCIDマウスにおける遊離ビンクリスチン及びリポソーム・ビンクリスチンの投与後の（Ａ）血漿及び（Ｂ）腫瘍中のビンクリスチン・レベルを示す。２つのＡ431 腫瘍担持SCIDマウスに、遊離のビンクリスチン（□）を、又は 0.1（重量／重量）の薬物／脂質比においてビンクリスチンを含むDSPC／Chol（○）又はSM／Chol（●）の大きな単ラメラ・リポソームを、静脈内注射した。ビンクリスチンを、20mg／kgの投与量の脂質を表す、2.0mg／kgの投与量において注射した。データは、３匹のマウス（６腫瘍）の平均（±標準誤差）を表す；図中、標準誤差のバーは見えない。それらは、その記号のサイズよりも小さい。図12は、Ａ431 腫瘍を担持するSCIDマウスにおける遊離ビンクリスチン及びリポソーム・ビンクリスチンの抗腫瘍効果を示す。２つのＡ431 腫瘍を担持するSC IDマウスは、処置を受けず（■）又は、遊離ビンクリスチン（□）を、又は0.1( 重量／重量)の薬物／脂質比においてビンクリスチンを含むDSPC／Chol （○）又はSM／Chol（●）の大きな単ラメラ・リポソームを静脈内注射された。ビンクリスチンは、20mg／kgの投与量の脂質を表す、2.0mg／kgの投与量において注射された。データは、（処置直前の腫瘍重量のパーセントとして表された）Ａ431 腫瘍の重量を表し、そして４〜５匹のマウスにおける８〜10腫瘍の平均（±標準誤差）である。図13は、pH２で37℃においてインキュベートされたリポソーム内のスワインゾニンの時間にわたるパーセント保持を示す。スワインゾニンは、0.3Ｍシトレート、pH４を使用して0.2／1.0(mol／mol)の薬物対脂質比においてリポソーム内に充填された（pH２におけるSM／Cholを除く。）。EPC 、卵ホスファチジル・コリン；EPC／Chol、卵ホスファチジル・コリン／コレステロール(55％／45％)( mol ／mol)；SM／Chol、スフィンゴミエリン／コレステロール（55％／45％）(mol／ mol)。図14は、HEPES 緩衝液化生理食塩水(HBS)，pH7.5 中37℃においてインキュベートされたリポソーム内のスワインゾニンの時間にわたるパーセント保持を示す。図15は、正常マウス血清中37℃においてインキュベートされたリポソーム内のスワインゾニンの時間にわたるパーセント保持を示す。特定の態様の説明本発明は、宿主への治療化合物の強化されたデリバリーのための組成物及び方法を提供する。本発明のリポソーム配合品は、延長された循環寿命及び／又は強化された薬物保持をもつ。“スフィンゴソーム(sphingosomes)”ともいわれるリポソームは、スフィンゴミエリンとコレステロールから成り、そして酸性のリポソーム内pHをもつ。スフィンゴミエリンとコレステロールに基づくリポソーム配合品は、他の配合品と比較するときいくつかの利点をもつ。スフィンゴミエリン／コレステロールの組合せは、酸加水分解に対しかなり高い安定性をもち、有意に良好な薬物保持特性をもち、腫瘍その他内への良好なローディング特性をもち、そしてテストされた他のリポソーム配合品よりも有意に良好な抗腫瘍効果を示す、リポソームを作り出す。 “リポソーム(Liposome)”、“小胞(vesicle)”及び“リポソーム小胞(liposo me vesicle)”は、水性内部を含む脂質含有膜をもつ構造を示すと理解されるであろう。これらの構造は、別段の定めなき場合、１以上の脂質膜をもつことができる。但し、一般には、上記リポソームは、唯一の膜をもつであろう。このような単一層リポソームを、本明細書中“単ラメラ(unilamellar)”という。多層リポソームを、本明細書中“多ラメラ(multilamellar)”という。本発明のリポソーム組成物は、スフィンゴミエリンとコレステロールから構成される。本リポソーム中に存在するスフィンゴミエリン対コレステロールの比は、変動してもよいが、一般には、75／25 mol％／mol％スフィンゴミエリン／コレステロール〜30／50 mol％／ mol％スフィンゴミエリン／コレステロール、より好ましくは約70／30 mol％／ mol％スフィンゴミエリン／コレステロール〜40 ／45 mol％／ mol％スフィンゴミエリン／コレステロールのレンジ内にあり、そして最も好ましくは、約55／45 mol％／ mol％スフィンゴミエリン／コレステロールである。他の脂質は、脂質酸化を防止し、又はそのリポソーム表面上にリガンドを付着させるように、適宜、その配合品中に存在することができる。一般に、他の脂質の包含は、そのスフィンゴミエリン／コレステロール比における減少をもたらすであろう。多種多様な治療用化合物が、本発明のリポソーム及び方法によりデリバリーされることができる。“治療用化合物(Therapeutic compound)”は、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、癌溶解薬、抗感染薬、抗不安薬、向精神薬、免疫モジュレーター、イオン誘起物質(ionotropes)、毒素、例えば、ゲロニン(gelonin) 及び真核タンパク質合成のインヒビターを含むことを意味する。本発明のリポソーム内への捕獲のための治療用化合物の中で好ましいのは、親油性カチオンであるものである。これらの中には、そのリポソームの脂質２重層の相中に分配することができ、そしてそれ故、膜形態においてそのリポソームと会合することができる親油性分子のクラスの治療剤がある。代表的な薬物は、プロスタグランジン、アンフォテリシンＢ、メトトレキセート、シス−プラチン及び誘導体、ビンクリスチン、ビンブラスチン、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール、ドクソルビシン、エピルビシン、ベクロメタゾン（beclomethasone）及びエステル、ビタミンＥ、コルチゾン、デキサメタゾン及びエステル、吉草酸ベタメタゾン、並びに他のステロイド、等を含む。本発明における使用のために特に好ましい治療用化合物は、アルカロイド化合物及びそれらの誘導体である。これらの中には、スワインゾニン並びにビンカ・アルカロイド(vinca alkaloids)のメンバー及びそれらの半合成誘導体、例えば、ビンブラスチン(vinblastine)、ビンクリスチン(vincristine)、ビンデジン(v indesin)、エトホジド(etoposide)、リン酸エトポジド(etoposide phosphate)、及びテニポジド（teniposide）が在る。この群内では、ビンブラスチン及びビンクリスチン、並びにスワインゾニン(swainsonine)が特に好ましい。スワインゾニン(Creaven and Mihich，Semin ．Oncol. 4: 147(1977))は、骨髄増殖を刺激する能力をもつ（White and Olden，Cancer Commun. 3: 83(1991)）。スワインゾニンは、IL−１，IL−２，TNF，GM-CSF及びインターフェロンを含む多くのサイトカインの生産をも刺激する(Newton，Cancer Commun. １：373（1989）；Olden ，K.，J ．Natl．Cancer Inst.，83: 1149(1991))。それは、報告によると、Ｂ− 及びＴ−細胞免疫性、インビトロにおける腫瘍細胞のナチュラル・キラーＴ−細胞及びマクロファージ誘導破壊をも引き起こし、そしてインターフェロンと併合されるとき、インビボにおける結腸癌及び黒色腫癌に対して直接的な抗腫瘍活性をもつ（Dennis，J.，Cancer Res.，50: 1867（1990）；Olden，K.，Pharm ．The r. 44: 85(1989); White and Olden，Anticancer Res.，10: 1515(1990)）。本発明において有用な他のアルカロイドは、パクリタキセル（タキソール）(pacli taxel(taxol))及びそれらの合成誘導体を含む。本発明のリポソームを製造するための代表的な方法をこれから説明する。但し、その手順は、その結果に影響を及ぼさずにさまざまな側面において修正を受けることができる。以下、実験セクション中により十二分に説明するように、トランスメンブランpH勾配に応答して親油性カチオン薬物を捕獲することができ、未だそのリポソームが循環内での薬物の漏れに対して耐性であるリポソームを、調製する。最初に、スフィンゴミエリンとコレステロールを含むリポソームを、スフィンゴミエリンとコレステロールの所望のモル比、例えば、それぞれ、55／45モル／モルに従って、調製する。リポソームの形成のため、そしてそれ故、そのリポソームの内部の形成のために適切なバッファーは、生理学的に許容され、そして酸性pH典型的には、約pH２〜約pH６、より好ましくは、約pH３〜pH５、そして最も好ましくは、約pH４をもつものである。適当な捕獲バッファーの例は、約pH４に調整されたシトレート・バッファーである。他の脂質も、リポソーム調製において含まれることができる。これらの脂質は、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、及びホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチド酸、カルジオリピン、及びホスファチジルイノシトール、であって脂肪アシル組成の変動を伴い、そして天然及び／又は（半）合成起源をもつもの、並びにリン酸ジセチルを含む。セラミド及びさまざまなグリコリピド、例えば、セレブロシド又はガングリオシドも、添加されることができる。カチオン性脂質も添加されることができる。本発明のリポソーム中での使用のために好適であることができる追加の脂質は、当業者によく知られている。一旦、リポソームが、捕獲された酸性バッファーを用いて調製されれば、リポソームは、所望のサイズ・レンジにサイジングされることができる。リポソームは、一般に、サイズ約 1.0ミクロン未満、好ましくは、約0.05〜0.45ミクロン、より好ましくは、約0.05〜 0.2ミクロンでなければならず、これは、そのリポソーム懸濁液が濾過により滅菌されることを許容する。リポソームをサイジングするために、リポソーム懸濁液は、サイズ約0.05ミクロン未満の小さな小胞まで、浴又はプローブのいずれかにより音波処理されることができる。ホモ・ジェナイゼーションは、大きなリポソームをより小さなものに断片化するために使用されることもできる。両方法において、その粒子サイズ分布は、慣用のレーザー−光線粒子サイズ分別その他によりモニターされることができる。細孔ポリカーボネート膜又は不斉セラミック膜を通してのエクストルージョンは、リポソーム・サイズを、比較的よく規定されたサイズ分布に減少させるための有効な方法である。典型的には、懸濁液は、所望のリポソーム・サイズ分布が達成されるまで１回以上上記膜を通して循環される。リポソームは、リポソーム・サイズにおける漸進的な減少を達成するように連続的により小さな細孔の膜を通して、エクストルードされることができる。サイジングの前後において、リポソーム調製物の外部pHは、好適なバッファー、例えば、0.5Ｍ Na₂HPO₄の添加により、約 pH7.0〜7.5 に増加される。次に、選定した薬物（単数又は複数）を、適当な濃度、例えば、0.01／1.0 〜 0.2／1. 0（重量／重量）のビンクリスチン／脂質比において、その薬物のトランスメンブラン取込みを許容するために十分な時間にわたり及び条件下で、例えば、約５〜30分以上にわたり、そして約45〜65℃において（例えば、以下の実施例中に記載するリポソーム・ビンクリスチン調製物の場合においては、60℃において10分間）、リポソームと混合される。但し、当業者は、それらの条件が調整され、そしてそれに従って取り込みがモニターされることができることを理解するであろう。リポソームと治療用化合物（単数又は複数）の配合品は、一般に、サイズ及び薬物−脂質比の点で、比較的均一な小胞集団からなるものでなければならない。 pHトランスメンブラン勾配の直接的形成以外の薬物の受動的捕獲のための手順を使用することができる。１の態様においては、内部／外部濃度勾配は、電荷をもつアミン：メチルアンモニウム又はエタノールアンモニウムを使用して形成される。リポソームは、電荷をもつアミンの水溶液の存在中で形成される。いずれかの数の医薬として許容される電荷をもつアミン、例えば、非限定的には、フルオリド、クロライド、シトレート、スルフェート、ホスフェート、ブロマイド、ヨージド、又はアセテートを、上記溶液を調製するために使用することができる。リポソームの形成後、外部の電荷をもつアミンを、例えば、希釈、濾過、透析又はゲル排除により、希釈又は除去する。それにより、内部／外部pH勾配は、電荷をもたないアミンがそのリポソームの内部を去り、そしてプロトンを置き去るときに生成される。pH勾配の大きさは、形成される濃度勾配の大きさに正比例するであろう。pH勾配は、本明細書中に開示する方法に従って、薬物、例えば、スワインゾニンをリポソームに充填するために使用される。追加の成分が、特異的な細胞のタイプにリポソームを標的化するために、それらに添加されることができる。例えば、リポソームは、特異的な細胞タイプ、例えば、癌関連抗原上にだけ存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体又はそれらの結合性断片に結合されることができ、これらは、全身投与後にそれらリポソームを標的化するための手段を提供する。あるいは、標的細胞タイプの表面レセプターに結合するリガンドも、リポソームに結合されることができる。リポソームを標的化する他の手段を、本発明において使用することもできる。リポソームを含む媒質から遊離の薬物を除去するために必要であることができるような分離段階の後に、リポソーム懸濁液は、患者又は宿主細胞への投与のために医薬として許容される担体中で所望の濃度にもっていかれる。多くの医薬として許容される担体が、本発明の組成物及び方法において使用されることができる。さまざまな水性担体、例えば、水、緩衝液化水、0.4％生理食塩水、0.3％グリシンその他が、使用されることができ、そして強化された安定性のための糖タンパク質、例えば、アルブミン、リポプロテイン、グロブリン等を含むことができる。一般に、正常な緩衝液化生理食塩水(135〜150mM NaCl)が、医薬として許容される担体して使用されるであろうが、他の好適な担体も十分なものであろう。これらの組成物は、慣用のリポソーム滅菌技術、例えば、濾過により、滅菌されることができる。本組成物は、生理学的条件を真似るために適宜、医薬として許容される補助的物質、例えば、pH調整及び緩衝液化剤、浸透圧調整剤その他、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、等を含むことができる。これらの組成物は、先に述べた技術により滅菌され又は滅菌条件下で製造されることができる。得られた水溶液は、使用のために包装され又は無菌条件下で濾過され、そして凍結乾燥されることができ、その凍結乾燥された調製物は、投与に先立って無菌水溶液と併合される。担体中のリポソームの濃度は、変化してもよい。一般に、その濃度は、約20− 200mg／ml、通常、約50− 150mg／ml、そして最も普通には、約75− 125mg／ml 、例えば、約 100mg／mlであろう。当業者は、異なるリポソーム成分による又は特定の患者のための処置を最適化するために、これらの濃度を変えることができる。例えば、この濃度を、処置に関連した液体負荷を低下させるために、増加することができる。本発明は、宿主の細胞内に治療用化合物を導入するための方法をも提供する。本法は、一般に、宿主に、治療用化合物を含むリポソームであって、スフィンゴミエリンとコレステロール、及び場合により、他の脂質から成る膜、並びに生理学的pHよりも実質的に低いpH、例えばpH３〜約５における水性内部、並びに着目の治療用化合物をもつリポソームを、投与することを特徴とする。宿主は、ヒト、非ヒト霊長類、トリ種、ウマ種、ウシ種、ブタ種、ウサギ目、げっ歯類、その他を含むさまざまな動物であることができる。宿主の細胞は、通常、本配合品のインビボ投与により本発明のリポソーム調製物に晒されるが、リポソームにその細胞をエクス・ビボにおいて晒すことも、実行可能である。インビボにより晒すことは、宿主へのリポソームの投与により得られる。リポソームは、多くの方法で投与されることができる。これらは、非経口的な投与系路、例えば、静脈内、筋中、皮下、及び動脈内を含む。一般に、リポソームは、静脈内に又はいくつかの場合には吸入を介して投与されるであろう。しばしば、リポソームは、高濃縮溶液が大容量かつ、大流量の血管内に投与されることを許容するように、大きな中央の静脈、例えば、上大静脈又は下大静脈内に投与されるであろう。リポソームは、罹患血管に直接的に高濃度をデリバリーするための血管手順に従って動脈内に投与されることができる。いくつかの場合、リポソームは、経口的又は経皮的に投与されることができる。但し、本発明の利点は、非経口投与により最良に具現化される。例えば、スワインゾニンは、便利には、経口投与されるが、非経口的に又は静脈内に投与されることができる。リポソームは、設置後の長く継続する放出のための移植可能なデバイス内に取り込まれることもできる。上記のように、リポソームは、一般に、本発明の方法において、静脈内に又は吸入を介して投与されるであろう。しはしば、複数の処置が患者に与えられるであろう。これらの処置の投薬スケジュールは、その疾患及びその患者の症状により決められるであろう。本分野においてよく知られた治療用化合物による標準的な処置は、治療用化合物を含むリポソームによる処置へのガイドとして役立つことができる。処置の継続時間及びスケジュールは、当業者によく知られた方法により変えられることができるが、増加された循環時間及びリポソーム漏れにおける減少は、一般に、その投与量を従来使用された投与量より低い方に調節せしめるであろう。本発明のリポソームの投与量は、処置を受ける動物又は患者の臨床的症状及び大きさに依存して変動することができる。封入されないときの治療用化合物の標準的な投与量は、リポソーム封入された化合物の投与量へのガイドとして役立つことができる。この投与量は、典型的には、処置の経過にわたり一定であろう。但し、いくつかの場合、その投与量は変化することができる。本発明のリポソームの投与量を変更するために使用されることができる標準的な生理学的パラメーターは、処置の間に評価されることができる。以下の実施例を、限定のためでなく説明のために提供する。実施例Ｉ DSPC ／Chol対SM／Cholリポソームの酸安定性本実施例は、ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロールにより調製されたリポソームに比較しての、酸加水分解に対するスフィンゴミエリンとコレステロールにより調製されたリポソームの安定性を立証する。リポソーム調製のために、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）と卵スフィンゴミエリン（SM）を、Avanti Polar Lipidsから得て、さらに精製せずに使用した。コレステロールをSigma Chemical Companyから得て、そしてPEG-PE を、Parr et al．により提出されたBiochim ．Biophys．Acta（1994）に従って合成した。脂質を、CHCl₃、又は微量のCH₃OHを含むCHCl₃中に溶解し、次に以下に示すようなモル比で混合し、そして過剰の溶媒を窒素気流下で除去した。残溶媒を、３〜16時間にわたり高真空下でその脂質膜から除去した。脂質を、0.3Ｍシトレート・バッファー(pH4.0又は2.0)の添加により分散させて、50又は 100mg／ mlのいずれかの最終脂質濃度を達成した。脂質の水和を、撹拌及び65℃への加熱により容易にした。リポソームの内部と外部の間の溶質の平衡を、Mayer et al. ，Biochim ．Biophys．Acta 817: 193-196（1985）（引用により本明細書中に取り込む）中に概説されるように− 196°〜60℃の間の５回の冷凍／解凍サイクルにより達成した。大きな単ラメラ小胞を、Themobarrel Extruder（Lipex Biomem brane，Vancouver，Canada）内に60−65℃に保持された２又は３層の 0.1μｍフィルターを通してのその多ラメラ・リポソームの繰り返してのエクストルージョンにより、作り出した。リポソーム・サイズ分布を、Nicomp Model 270 Submicr on Particle Sizer を使用した擬弾性光散乱により確認した；これらの調製物は典型的には、130〜150nm の平均直径をもっていた。 DSPC／Chol又はSM／Cholの大きな単ラメラ・リポソームを、pH2.0 における 0 .3Ｍシトレート・バッファー中で上記のように調製し、そして次に 3.2mg／mlの脂質まで希釈した。これらのリポソームを、各時間にわたり37℃においてインキュベートし、次に脂質加水分解の測定前に冷凍した。脂質分散体を解凍し、次にその脂質をCH Cl₃／CH₃OH 中に抽出し、そして窒素気流下で濃縮した。既知量の脂質を、Ｋ６Ｆ薄層クロマトグラフィー・プレート上にスポットし、そしてCHCl₃／CH₃OH／H₂ O／NH₄OH(65／25／４／0.3、容量比)中で発色させた。脂質をヨウ素蒸気中で可視化し、次にそのプレートの適当な領域を回収し、そして引用により本明細書中に取り込むBartlett，J ．Biol．Chem. 234: 466-468(1959)に従ってリンについて分析した。DSPCの全加水分解を、サンプル中に存在するMSPCの量から決定し、そして次に全加水分解に補正した；スフィンゴミエリンの加水分解を、クロマトグラフィーにかけられた脂質の量と非加水分解スフィンゴミエリンとして回収された量との間の差異から計算した。換算曲線を、DSPC，MSPC及びスフィンゴミエリンの各々について決定した。図１に示すように、SM／Chol（55／45，mol／mol)から成るリポソームは、DSP C／Chol（55／45，mol／mol)から成るリポソームよりも酸加水分解を有意に受けにくかった。すなわち、37℃及びpH2.0 における加水分解の速度は、DSPC／Chol リポソーム内よりもSM／Cholリポソーム内で約 100倍遅かった。同様の結果が、 pH4.0 及び４℃〜37℃間の各温度におけるリポソームのインキュベーションの間に観察された。これらの結果は、SM／Cholから成るリポソームがDSPC／Cholから成る同一リポソームよりも酸加水分解に対して有意により安定性であることを示している（図１）。DSPC／Cholリポソームにおける主な分解産物は、リゾ−PC(MSPC)であるので、SM／Cholリポソームは、カルボキシル−エステル化脂肪酸を含む脂質に基づくいずれの配合品（すなわち、いずれかのリン脂質−ベースの配合品）よりも安定性である可能性がひじょうに高い。実施例II 脂質及び薬物の薬理動態大きな単ラメラ・リポソーム内へのビンクリスチンの取り込みは、引用により本明細書中に取り込むMayer et al.，Cancer Chemother ．Pharmacol. 33:17-24( 1993)により記載されたpH勾配依存手順を使用して達成された。簡単に言えば、硫酸ビンクリスチン(Oncov 重量）の薬物／脂質比においてリポソームに添加し、そして５〜10分間60℃において平衡にした。トランスメンブランpH勾配に応答するビンクリスチンの取り込みは、その外部pHを 7.2−7.6 にもっていく 0.5Ｍ Na₂HPO₄の添加により開始された。取り込みは60℃において10分間進行に供され、そして典型的には、約95％の捕獲効率をもっていた(Mayer et al.，Cancer Chemother ．Pharmacol. 33: 17 -24(1993))。非交換性及び非代謝性放射標識¹⁴C-CHDE（New England Nuclearから得られ、先に示したような、³Ｈ又は¹⁴Ｃにより放射標識されたコレステリル−４−ヘキサデシル・エーテル）を含む、DSPC／Chol（55／45），SM／Chol（55／45）又は SM／Chol／PEG-PE（55／40／５）のリポソームを調製した。空のリポソーム又は³ Ｈ−ビンクリスチン（Amershaw）を充填されたリポソームを、HBS により所定の濃度に希釈し、次に２mg／kgのビンクリスチン投与量（20mg／kgの脂質投与量）において BDF１マウス(８−10週齢；Charles River)に静脈内注射した。リポソーム注射後の各時間において、血液を、心臓穿刺から得て、そして肝臓、脾臓及び筋肉を回収した。全ケースにおいて、脂質とビンクリスチン分布を、既知容量の血漿及び組織の10％ホモジェネートの液体シンチレーション・カウンティングにより測定した。 DSPC／CholとSM／Cholの空リポソームのクリアランスを、図２Ａに示す。SM／Cholから成るリポソームは、DSPC／Cholリポソームよりも僅かに遅い速度で循環から除去された。DSPC／CholリポソームとSM／Cholリポソームの間のクリアランス速度におけるこの差異は、図２Ｂに示すように、ビンクリスチンを含む配合品においても観察された。但し、総クリアランス速度は、RES 活性に対するその薬物の効果のためにビンクリスチンの存在中より遅かった。循環内に残存するSM／Cholの量は、典型的には、DSPC／Cholリポソームについてのものよりも30−50％高かった。循環内の脂質の量におけるさらなる増加が、SM／Chol混合物への5 mol％PEG-PEの添加により達成された；静脈内注射の24時間後、SM／C hol／PEG-PEリポソームについて 200μｇ脂質／ml血漿が循環中に残存し、これに対し、SM／Cholリポソームについて100μｇ／ml血漿、そしてDSPC／Cholリポソームについて65μｇ／ml血漿であった（図２Ｂ）。リポソームの薬物保持特性は、その小胞の脂質組成における変化によりかなり変更された。DSPC／Cholリポソームからのビンクリスチンの漏れはひじょうに速く、図３に示すように、元々封入されたビンクリスチンのたった50％が循環内で４時間後に残存した。これに反し、SM／Cholリポソームからのビンクリスチンの漏れは、ひじょうに遅く、封入された薬物の60％以上が、注射24時間後にそのリポソーム内に残存した（図３）。さらに、SM／Cholリポソーム内でのビンクリスチンの保持における追加の増加は、２倍大きなトランスメンブランpH勾配(すなわち、pHi＝2.0)の存在中観察されなかった。SM／Cholリポソーム内での5 mol％ PEG-PEの存在は、ビンクリスチンの透過性におけるかなりの増加を引き起こした；図３に示すように、封入されたビンクリスチンの約30％が、循環内で24時間後にそのリポソーム内に残存した。リポソーム・ビンクリスチンの抗−腫瘍効果は、循環内に残存する薬物の量の関数であり、そしてそれ故、循環内でのリポソームの寿命とそのリポソーム内での薬物保持の両方の結果である。循環内に残存するビンクリスチンの合計量は、図４に示すように、リポソームSM／Chol又はSM／Chol／PEG-PE配合品のいずれにおけるよりも、リポソームDSPC／Chol配合品において有意に低かった。両スフィンゴミエリン−ベースのリポソーム配合品は、同一量の、循環内に残存するビンクリスチンをもっていた。これは、SM／Chol／PEG-PEにおけるよりも高い、SM／Cholにおけるビンクリスチン／脂質比（図３）、及びSM／Chol／PE G-PEにおけるよりも低い、SM／Cholにおける循環内に残存する脂質の量（図２Ｂ）、の結果であった。 SM／Cholリポソームの延長された循環寿命が、マクロファージによるSM／Chol リポソームの減少された取り込みの結果であったかどうかを決めるために、腹膜マクロファージによるリポソームの取り込みを計測した。¹⁴C-CHDEを含む空DSPC ／Chol及びSM／Cholリポソームを、上記のように調製し、そしてその外部pHを、 0.5Ｍ Na₂HPO₄により 7.2〜7.6 にもっていった。リポソームを、0.5mlの容量において 100mg脂質／kgでCD１マウス（８−10週齢）に腹腔内注射した。４時間後、腹膜マクロファージを、洗浄により回収し、繰り返しの遠心分離により精製し、そして次にマクロファージを血球計によりカウントし、そしてそのマクロファージにより取り込まれた脂質の量を、液体シンチレーション・カウンティングにより測定した。血清タンパク質結合性検定のために、¹⁴C-CHDEにより標識されたDSPC／Chol又はSM／Cholリポソームのいずれか10mgを、7.2−7.6の外部pHにもっていき、次に HBS により20mg／mlに希釈した。リポソームを、37℃において30分間、500μｌの胎児ウシ血清(ICN Biomedicals)(0.22μｍフィルターを通して事前に濾過されたもの)と共にインキュベートした。リポソームに結合しなかった血清タンパク質を、35ml ／時において(HBS中)１cm（内径）×18cm BioGel Ａ−15ｍカラム（Bio-Red Lab oratories）にサンプルを通過させことにより除去した。各画分(１mol)を、タンパク質について検定し（Sigmaビシンコニン酸（bicinchoninic acid）タンパク質アッセイ・キット）、そして脂質(LSC)と吸着されたタンパク質を、同時溶出された血清タンパク質についての補正後に計算した。マクロファージ内への腹腔内注射されたSM／Cholリポソームの取り込みは、図５に示すように、DSPC／Cholの取り込みよりも50％低かった。マクロファージによるSM／Cholリポソームの減少された取り込み及びそれらの延長された循環寿命は、DSPC／Cholリポソームに対するよりも、SM／Cholリポソームの表面に対する低下されたタンパク質オプソニン作用の結果であったようである。SM／CholとDS PC／Cholリポソームへの胎児ウシ血清タンパク質の吸着の計測は、そのDSPC／Ch olリポソームが13.7μｇタンパク質／mg脂質を吸着したことを示した。これに反し、SM／Cholリポソームへの胎児ウシ血清タンパク質の有意な吸着は検出されなかった。従って、本実施例から、SM／Cholから成るリポソームが、封入されたビンクリスチンの存在又は非存在中の両方において、同様のDSPC／Cholリポソームよりも僅かに長い循環寿命をもっていたことが理解される（図２）。SM／Cholリポソームは、トランスメンブランpH勾配法を使用して封入されていたビンクリスチンの保持においてDSPC／Cholリポソームよりも劇的に良好なものであった（図４）。 SM／CholリポソームへのPEG-PEの添加は、そのリポソームの循環寿命を有意に増加させたが、PEG-PEは、そのリポソームからのビンクリスチンの漏れにおける有意な増加をも引き起こした。SM／CholとSM／Chol／PEG-PEリポソーム配合品における、循環内に残存するビンクリスチンの増加されたレベルが（図４）、SM−含有リポソーム内での改善された薬物保持（図３）とSM／Chol／PEG-PEリポソームの増加された循環寿命（図２ｂ）の両方の結果であった。しかしながら、SM／Chol／PEG-PEリポソームの増加された循環寿命は、PEG-PEを含むリポソームによるより低い薬物保持によりバランスされていた。それ故、ビンクリスチンのSM−ベースのリポソーム配合品においては、脂質PEG-DSPEの添加によるビンクリスチン循環寿命における改善が全く存在しなかった（図４）。さらに、pHi＝2.0 の使用によるインビボにおけるビンクリスチン保持における改善が全く存在しなかったので、循環における最適なビンクリスチン保持が、スフィンゴミエリン、コレステロール及びシトレート・バッファー（pH4.0）だけから成る比較的単純なリポソーム配合品を用いて達成された。実施例III リポソーム・ビンクリスチンの腫瘍ローディング図４に示すような、循環内での増加されたビンクリスチンの寿命が、腫瘍への増加された薬物デリバリーをもたらしたかどうかを決めるために、Ｐ388 腫瘍中へのリポソーム・ビンクリスチンのローディングについて調べた。腫瘍ローディング実験のために、BDF１マウスに、リポソーム注射の24時間前に、(BDF１マウス内で１週間継代した)(National Cancer Institute，Bethesda，MD から得た)1 0⁶ Ｐ388 細胞を、腹腔内注射した。リポソーム注射後の各時間において、その腫瘍を、腹腔洗浄により回収した。全ケースにおいて、脂質とビンクリスチン分布を、既知量の洗浄液の液体シンチレーション・カウンティングにより測定した。図６に示すように、Ｐ388 腫瘍中のDSPC／Cholリポソームからのビンクリスチンの蓄積は、リポソーム注射４時間後において初期ピークをもっており、そしてその後においてかなり低いものであった。これに反し、SM／CholとSM／Chol／PEG-PEの両方の配合品からのビンクリスチンは、リポソーム注射の24〜48時後までの間に、ビンクリスチンの接続したデリバリーを示した。すなわち、ビンクリスチンのSM／CholとSM／Chol／PEG-PE配合品は、DSPC／ Cholリポソームよりも、Ｐ388 腫瘍に少なくとも30多くのビンクリスチンをデリバリーした。 SM−ベースのリポソーム配合品を使用する血漿中の循環内に残存するビンクリスチンの増加したレベル（図４）は、Ｐ388 腫瘍にロードされたより多量のビンクリスチン（図６）を反映していた。この関係は、BDF１マウスにおけるＰ388 腫瘍について、DSPC，SM及び／又はPEG-PEを含むリポソームが、循環から上記腹膜腫瘍まで遊出する(extravasate)それらの能力において有意に差異がないことを示唆する。実施例IV Ｐ388 腫瘍に対するリポソーム・ビンクリスチンのインビボにおける効果実施例III中に示すように、SM／CholとSM／Chol／PEG-PEリポソームによるＰ3 88 腫瘍へのビンクリスチンの増加されたデリバリーが、増加した抗腫瘍活性をもたらしたかどうかを決めるために、ビンクリスチンのリポソーム配合品の効果を測定した。Ｐ388 腫瘍を担持する BDF１マウスを、0.1（重量／重量）の薬物／脂質比においてビンクリスチンを含むDSPC／Chol(55／45，mol／mol)、SM／Chol(55／45 ，mol／mol)又はSM／Chol／PEG-PE(55／40／５，mol／mol／mol)のリポソーム配合品により処置した。 DSPC／Chol（55／45），SM／Chol（55／45）及びSM／Chol／PEG- PE（55／40／５）の大きな単ラメラ・リポソームを、上記のように調製し、そしてそれに、0.1／１（重量／重量）のビンクリスチン／脂質比においてビンクリスチンをロードした。リポソーム・ビンクリスチンを、10⁶ Ｐ388 細胞の腹腔内注射により24時間前に投与されていた BDF１マウスに静脈内注射した。リポソーム濃度を、1.0，2.0 と 4.0mg／kgのビンクリスチン投薬を達成するように調整し、次に、動物の体重及び生存を、その後60日間追跡した。60日間生存した動物に、10⁶ Ｐ388細胞を再注射して、長期間生存の免疫成分について評価した。図７に示すように、リポソーム・ビンクリスチンの注射を全く受けなかった対照マウスは、Ｐ388 腫瘍の投与後10−11日間生存した。１mg／kgのビンクリスチン投薬におけるDSPC／Chol又はSM／Chol／PEG-PE配合品のいずれかによる処置は、それぞれ、17と19日間その生存を増加させた。同一ビンクリスチン投薬におけるSM／Chol配合品による処置は、23日間の、生存における僅かな改善を与えた。２mg／kgのビンクリスチン投薬において、DSPC／CholとSM／Chol／PEG-PE配合品の両方が、30−31日間に生存を増加させた。これに反し、このビンクリスチン投薬においては、SM／Chol配合品は、有意により有効であり；そのマウスの60％が、Ｐ388 腫瘍の投与後60日目において生存していた（図７）。４mg／kgのビンクリスチン投薬においては、DSPC／CholとSM／Chol／PEG-PE配合品の両方が、Ｐ 388 腫瘍注射後60日目において生存していた、上記マウスの40％を与えた。SM／ Cholの配合品は、有意により有効であり；１のビンクリスチン毒性死を除き、60 日目における残存マウスの生存は 100％であった（図７）。従って、SM／Cholリポソームの抗腫瘍効果は、SM／Chol／PEG-PEリポソームのものよりも有意に良好であった（図７）。但し、Ｐ38 8 腫瘍へのビンクリスチンのローディングは、これらの２つのリポソーム配合品において同一であったことが観察された（図６）。この結果は、SM／Chol／PEG- PEリポソームに比較して循環内でのSM／Cholリポソームのよりよいビンクリスチン保持（図３）が、その腹腔内でも生じ、そしてＰ388 腫瘍細胞による改善されたビンクリスチンをもたらすことを示唆する。SM／Cholの配合品は、DSPC／Chol 又はSM／Chol／PEG-PEのいずれかに基づく配合品よりも約２倍有効であった。すなわち、2.0mg／kgのビンクリスチン投薬におけるDSPC／CholとSM／Chol／PEG-P E配合品により達成された生存は、1.0mg／kgの投薬におけるSM／Cholにより達成された。同様に、4.0mg／kgのビンクリスチンの投与量におけるDSPC／CholとSM ／Chol／PEG-PEにより得られる生存は、2.0mg／kgにおけるSM／Chol配合により達成されたものにひじょうに類似していた。実施例Ｖリポソーム・スワインゾニンの生物学的利用能５−６週齢の雌Balb／ｃマウスを、標準条件下で飼養した。これらの動物は、実験操作前の１週間の順化期間後その実験の全体にわたり食物と水の両方への自由なアクセスを受けた。スワインゾニン(Tornto Res．Chem.)を、トリチウムにより放射標識した。トリチル化スワインゾニンを、脂質ベースの配合品（Ｌ−Im ）として、そして遊離の薬物を含む水性配合品として投与した。トリチル化スワインゾニンを、0.2：１(mol：mol)の薬物対脂質化におけるシトレート・バッファー、pH２勾配を使用して、及び80％のローディングの効果を用いて、スフィンゴミエリン／コレステロール(Avanti Polar Labs)スフィンゴソーム内に、ロードした。200μｌの上記脂質と水性スワインゾニン配合品を、胃管栄養による経口により（p.o.）、腹膜内に（i.p.）、又は静脈内に（i.v.）与えた。50マイクロリッターの血液サンプルを、投与１，３，６、及び24時間後に、眼窩後採血により集めた。この血液サンプルを、漂白し、そして次にシンチレーション・カウンター内でカウントした。結果を、投与後各時間点においてその血液中に投与された量のパーセンテージとして表した。図８に示すように、スワインゾニンのリポソーム配合品（Ｌ−Im）は、優れた生物学的利用能をもち、そしてその遊離の水性配合品（Ｆ−Im）に比較したとき、より高い血中レベルを達成する。スワインゾニンの経口の生物学的利用能は、静脈内に投与されたスワインゾニンに比較したとき約60−65％である。実施例VI スワインゾニン及びGM-CSFの効力雌Ｃ57BL／６マウス（平均体重 15.03ｇ）を使用し、そして標準的な条件下で飼養した。これらの動物は、実験操作に先立つ１週間の順化期間の後その実験の全体にわたり食物と水の両方への自由なアクセスを受けた。それらのマウスは、本実験の開始時６週齢であり、そして群当り５マウスの12群内にランダムに入れられた。40マウスに、メトトレキセート(Mtx，410mg／kg)(Sigma Chemical Co.) 又はドクソルビシン(Dox，14.9mg／kg)(Adria Laboratories)のいずれかの単一ボーラスの（腹腔内）注射を与えた。化学療法の２日後、スワインゾニン（２mg ／kg腹腔内又は経口）、組換えネズミGM-CSF(顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子)(１μｇ／マウス／日、腹腔内、５×10⁴ Ｕ／μｇ活性)(R&D Systems) 又はホスフェート緩衝液化生理食塩水(PBS)(200μｌ腹腔内)の投与を、（１日に１回）10日間連続して提供した。死亡数を、14日間の観察期間にわたり各処置群について記録した。表Ｉ（以下）中の結果は、スワインゾニンが、化学療法薬(Mtx又はDox)のLD₅₀投与の後10日間投与されるとき、スワインゾニンを静脈内に又は腹腔内に投与された動物の全てが、その細胞毒性障害をつかみ、そして化学療法後２週間を超えて生存した。Mtx により処置された動物の半分及びDox により処置された動物の半分が、化学療法後２〜３日以内に死亡した。10日間、組換えネズミGM-CSFの腹腔内投与により処置された動物は、スワインゾニンによるのと同様ではなく；Mtx により処置された動物の約半分が、その10日間の投薬期間の開始後２〜３日以内に死亡した。動物は、Dox を投与され、そして10日間のGM-CSFは、２週間の回復期間を生存させた。スワインゾニンは、化学療法処置された動物に10日間経口投与され、そして（Mtx 処置群において）１を除く全ての動物が、その細胞毒性処置を生き延びた。実施例VII 化学療法薬誘導白血球減少症からの回復最初の化学療法薬投薬後15日目に、免疫調節試験（実施例６）の各群からの４マウスを、ランダムに殺し、そして１mlまでの血液を、心臓穿刺により得た。循環末梢WBCsをカウントし、（好中球カウントのための）血液スミアを作り、そして血漿サンプルを採取し、そしてサイトカイン生産(IL−１，IL−２，TNF)についてテストした。血液サイトカイン・レベル（TNF，IL−１，及びIL−２）を、商業的に入手可能なアッセイ・キットにより検定した。脾臓、胸腺及び骨髄を取り出し、そして単一細胞懸濁液を調製した。これのリンパ腫臓器の細胞質を、トリパン・ブルー排除テストにより評価した。図９は、化学療法薬物投与後14日目における骨髄細胞質に対するGM-CSFとスワインゾニンの効果を表す。図示するように、経口又は腹腔内投与により与えられたスワインゾニンは、連続して10日間にわたり腹腔内により与えられたGM-CSFと同程度に有効に機能した。脾臓、胸腺及び骨髄からの細胞を、異なるマイトジェン： ConＡ(１，2.5 及び５μｇ／ml)(Sigma)、フィトヘマグルチニン(PHH)(１、及び 2.5μｇ／ml)(Si gma)及びLPS(2.5 及び５μｇ／ml)(Difco)からの刺激に応答するそれらの能力についてテストした。刺激の72時間後、増幅応答を、Cell Titer 96（Promega）を使用して計測した。同時に、マイトジェン刺激された脾臓細胞は、ConＡ(2.5μ ｇ／ml)及びリポ多糖(LPS)( 2.5μｇ／ml)刺激後のサイトカイン生産について設定された。その上清を、24時間及び48時間後に集め、そして直接ELISA 法を使用して腫瘍壊死因子−α(TNF−α)及びインターロイキン−２（IL−２）についてテストした。非刺激細胞からの上清は、対照として役立つ。結果を、pg／mlの I NF−α（このアッセイの感度は＜25pg／mlである。）又はIL−２（このアッセイの感度は＜３pg／mlである。）として表す。それぞれ、図10Ａと10Ｂに示すように、ConＡとLPS 刺激脾臓細胞におけるTNFとIL−２レベルは、化学療法処置及びPBS(非処置)対照に比較してスワインゾニン処置動物において有意に高められた。投与の経口経路についての利点を確立するために、スワインゾニンを、各時間期間（１，２，４，２４，４８と７２時間）にわたり擬似胃内容物中でインビトロにおいてインキュベートし、そしてスワインゾニンの“経口安定性”を測定した。スワインゾニンを、主要胃消化酵素、ペプシンを含む塩酸（pH２）中でもインキュベートした。このインビトロ安定性テストは、72時間までにわたる上記の激しい条件下でスワインゾニンが安定であることを示した。実施例VIII Ａ431 腫瘍を担持するSCIDマウスにおける薬理動態、腫瘍ローディング及び療法ビンクリスチンのDSPC／CholとSM／Cholリポソーム配合品の腫瘍ローディング及び抗腫瘍効力特性を、固形ヒトＡ431 扁平上皮細胞異種移植片腫瘍を担持するマウスにおいて、測定した。これらの実験は、ネズミ腹水Ｐ388 腫瘍モデルにおいて観察された陽性結果が、他の腫瘍タイプを代表するものであったことを確認するために企図された。100− 200mg固形ヒトＡ431 腫瘍を担持するSCIDマウスに、遊離のビンクリスチンを、又はビンクリスチンを含有するDSPC／Chol又はSM ／Cholのいずれかのリポソームを、静脈内注射した。ビンクリスチン封入DSPC／ CholとSM／Cholリポソームを実施例IIにおけるように調製した。DSPC／Chol及び SM／Cholリポソーム内のビンクリスチンの封入は、遊離ビンクリスチンに比較して、それぞれ、28倍と87倍程投与後24時間目に循環内に残存するビンクリスチンの量を増加させた（図11Ａ）。Ｐ388 腫瘍担持 BDF１マウスにおいて観察されるように、注射24時間後におけるSM／Cholリポソーム中循環内に存在するビンクリスチンの量は、DSPC／Cholリポソーム内に封入されたビンクリスチンについてよりも約３倍大きかった（図11Ａ）。改善されたビンクリスチン循環寿命は、Ａ431 腫瘍中へのビンクリスチンのローディングにける増加に相関した（図11Ａ）。特に、Ａ431 腫瘍中の遊離のビンクリスチン・レベルは、注射0.5 時間後において再考(0.856mg／ｇ腫瘍)であり、そして24時間後に0.32mg／ｇ腫瘍に減少した（図11Ｂ）。DSPC／Cholリポソーム内へのビンクリスチンの封入は、それぞれ、1.35−1.55mg／ｇ腫瘍への投与の４〜48時間後において、Ａ431 腫瘍中のビンクリスチンの量を増加させた（図11 Ｂ）。SM／Cholリポソーム内へのビンクリスチンの封入は、DSPC／Cholリポソームを用いて得られたデリバリーにおいて２倍の増加を示す、2.8− 3.2mg／ｇ腫瘍への注射後２〜48時間目においてＡ431 腫瘍へのビンクリスチン・デリバリーにおけるさらなる増加をもたらした。ネズミ腹水腫瘍モデルにおいて観察されたように、固形ヒトＡ431 腫瘍中に観察されたビンクリスチン／脂質は、血漿中で観察されたものとひじょうに類似していた。すなわち、DSPC／Cholリポソーム内に封入されたビンクリスチンについては、注射後24時間目におけるビンクリスチン／脂質（重量／重量）比は、血漿中で0.022、そして腫瘍中で0.029 であり、一方、SM／Cholリポソーム内に封入されたビンクリスチン／脂質比は、血漿中で 0.055 、そして腫瘍中で0.050 であった。Ａ431 に対する遊離とリポソーム・ビンクリスチンの抗腫瘍効果は、その腫瘍部位におけるビンクリスチン蓄積と密に相関していた（図12）。処置を全く受けなかったＡ431 腫瘍を担持するSCIDマウスは、処置が開始された後４−５日以内に腫瘍重量における 100％増加を示し、そしてその腫瘍がその全体重の10％を超えたとき10日以内に死んだ。2.0mg／kgにおける遊離のビンクリスチンにより処置された腫瘍担持SCIDマウスは、腫瘍成長における短い遅れをもったが（腫瘍重量における 100％増加が６ −８日以内に達成されたが）、10−12日の間に死亡した。これに反し、DSPC／Ch olリポソーム内に封入されたビンクリスチンによる処置は、腫瘍成長における有意な遅れをもたらした（15−20日目における腫瘍重量の 100％増加、処置後21日目における死亡）。この療法は、SM／Cholリポソーム内に封入されたビンクリスチンの単一処置によりさらに強化された。この処置群においては、腫瘍サイズにおける小さいが一貫した減少が観察された。注射後15日目に、いくつかの腫瘍が触診可能であるが測定不可であり、そして処置後33日目までに、いくつかの腫瘍は触診可能ではなかった。SM／Cholリポソーム・ビンクリスチンにより処置された５匹のマウス（全部で10腫瘍）の中で、１匹の動物が、腫瘍成長のためでなく、腫瘍潰瘍のために初期に死んだ。リポソーム注射後40日目に残った８腫瘍の中で、組織学的分析は、全８つの腫瘍が、物理的検査により検出できない質量の活性に分裂する扁平上皮細胞癌腫細胞であったことを示した。それ故、SM／Cholリポソーム・ビンクリスチンによる処置は、腫瘍成長における有意な減少に効果がある。但し、元の腫瘍のいずれも治癒されなかった。要約すれば、本発明は、スフィンゴミエリン／コレステロール小胞に基づくビンクリスチン及び他のアルカロイドリポソーム配合品が、DSPC／コレステロール小胞に基づく配合品を上廻るいくつかの有意な利点をもつことを立証する。特に、スフィンゴミエリン／コレステロールに基づく配合品は：（１）酸加水分解に対してひじょうに安定であり、（２）有意に良好な薬物保持特性をもち、（３）より良好な腫瘍ローディング特性をもち、そして（４）DSPC／Chol又はSM ／Chol／PEG-PEから成る匹敵するリポソームよりも有意に良好な抗腫瘍効果を示す。本明細書中に挙げた全ての刊行物及び特許を、あたかも個々の刊行物又は特許が特別に、そして個々に引用により本明細書中に取り込まれることを意図されるのと同程度に、ここで、引用により本明細書中に取り込む。これまで本発明を理解の明確さの目的をもって図示及び実施例によりいくぶん詳細に説明してきたが、添付の請求範囲内で特定の変更及び修正を行うことができることは自明であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バリー，マーセルビー. カナダ国，ブリティッシュコロンビアブイ０エヌ１ジー０，ボウェンアイランド，ハーディングロード 11，エス. ピー．シー. (72)発明者メイヤー，ローレンスディー. カナダ国，ブリティッシュコロンビアブイ７ジェイ３エム４，ノースバンクーバー，カーマリアコート 2416 (72)発明者ミラー，ジェームズエム. カナダ国，ブリティッシュコロンビアブイ６エス１ワイ８，バンクーバー，ウェストサーティセカンドアベニュ 3391 (72)発明者タルディ，ポールジー. カナダ国，ブリティッシュコロンビアブイ７イー３エス５，リッチモンド，スプリングマウントドライブ７−10900

Claims

【特許請求の範囲】１．スフィンゴミエリンとコレステロールを含んで成る１以上の膜をもつリポソーム、そのリポソーム外部のpHよりも低いpHをもつリポソーム内部、及びその宿主へのデリバリーのためにそのリポソーム内に包含された治療用化合物を、含んで成る哺乳類宿主に治療用化合物をデリバリーするためのリポソーム組成物。２．請求項１に記載のリポソーム組成物であって、そのスフィンゴミエリンとコレステロールが、75／25 mol％／ mol％スフィンゴミエリン／コレステロールから30／50 mol％／ mol％スフィンゴミエリン／コレステロールまでのモル比で存在するリポソーム組成物。３．請求項２に記載のリポソーム組成物であって、そのスフィンゴミエリンとコレステロールが、70／30 mol％／ mol％スフィンゴミエリン／コレステロールから40／45 mol％／ mol％スフィンゴミエリン／コレステロールまでのモル比で存在するリポソーム組成物。４．請求項３に記載のリポソーム組成物であって、そのスフィンゴミエリンとコレステロールが、約55／45 mol％／ mol％スフィンゴミエリン／コレステロールの比で存在するリポソーム組成物。５．請求項１に記載のリポソーム組成物であって、その親油性治療用化合物がアルカロイドであるリポソーム組成物。６．請求項５に記載のリポソーム組成物であって、そのアルカロイドが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、スワインゾニン又はエトポジドあるいはそれらのプロドラッグから選ばれるリポソーム組成物。７．請求項６に記載のリポソーム組成物であって、そのアルカロイドがビンクリスチンであるもの。８．請求項６に記載のリポソーム組成物であって、そのアルカロイドがスワインゾニンであるもの。９．請求項６に記載のリポソーム組成物であって、そのビンクリスチンが、約 0.01／1.0 〜 0.2／1.0（重量／重量）の薬物対脂質比で存在し、そしてスワインゾニンが、0.01／1.0 〜 0.5／1.0(mol／mol)の薬物対脂質比で存在するリポソーム組成物。 10．ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチド酸、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール、セラミド、セレブロシド及びガングリオシドから選ばれた少なくとも１の脂質をさらに含む、請求項１に記載のリポソーム組成物。 11．請求項１に記載のリポソーム組成物であって、そのリポソームが単ラメラであるもの。 12．請求項１に記載のリポソーム組成物であって、そのリポソームが、約0.05 ミクロン〜0.45ミクロンの平均直径をもつもの。 13．請求項１に記載のリポソーム組成物であって、そのリポソームが、約0.05 ミクロン〜 0.2ミクロンの平均直径をもつもの。 14．請求項１に記載のリポソーム組成物であって、そのリポソームの内部が、 pH２〜pH５であるもの。 15．請求項１に記載のリポソームであって、その内部が、約pH4.0 におけるシトレート・バッファーを含んで成るもの。 16．以下の工程： pH２よりも大きな酸性pHをもつ第１緩衝液化水溶液中、スフィンゴミエリンとコレステロールを含む混合物からリポソームを形成し；そして上記第１緩衝液化水溶液のpHよりも大きなpHをもつ第２緩衝液化溶液中に上記リポソームを懸濁させ、それにより、そのリポソームへの治療用化合物の輸送を容易にするトランスメンブランpH勾配を作る、により製造される、アルカロイド治療用化合物のデリバリーのためのリポソーム。 17．請求項16に記載の工程により製造されるリポソームであって、その工程が、リポソームにより封入されていない治療用化合物を含む第２バッファーから、その治療用化合物を包含するリポソームを分離する段階をさらに含むようなリポソーム。 18．アルカロイド治療用化合物を、その化合物により阻止を受ける腫瘍にデリバリーするための方法であって：その腫瘍を含む宿主に、その化合物又は医薬として許容されるその塩を含む請求項１に記載のリポソーム組成物を投与することを特徴とする方法。 19．請求項18に記載の方法であって、そのコレステロールが、30％〜50％の合計モル比においてそのリポソーム組成物中に存在する方法。 20．請求項19に記載の方法であって、そのスフィンゴミエリンとコレステロールが、それぞれ、約55／45 mol％／ mol％の比で存在する方法。 21．請求項18に記載の方法であって、そのアルカロイド化合物がビンクリスチン又はスワインゾニンである方法。 22．請求項21に記載の方法であって、そのアルカロイド化合物がビンクリスチンである方法。 23．請求項21に記載の方法であって、そのアルカロイド化合物がスワインゾニンである方法。 24．請求項21に記載の方法であって、ビンクリスチンが、約0.01 ／1.0 〜 0.2／1.0（重量／重量）の薬物対脂質比でそのリポソーム組成物中に存在し、そしてスワインゾニンが、0.01／1.0 〜 0.5／1.0(mol／mol)の薬物対脂質比で存在する方法。 25．請求項18に記載の方法であって、そのアルカロイド化合物を含むリポソーム組成物が、その腫瘍を抑制するのに十分であるがその宿主に許容されることのできない毒性を引き起こすの量未満にその化合物の濃度を維持するようにその宿主に繰り返し投与される方法。 26．請求項18に記載の方法であって、そのアルカロイド化合物を含むリポソーム組成物が、静脈内投与される方法。 27．請求項18に記載の方法であって、そのアルカロイド化合物を含むリポソーム組成物が、非経口的に投与される方法。 28．請求項18に記載の方法であって、そのアルカロイドを含むリポソーム組成物が、経口投与される方法。 29．請求項18に記載の方法であって、その宿主に投与されるリポソーム組成物のリポソームが、単ラメラである方法。 30．請求項29に記載の方法であって、その組成物の単ラメラ・リポソームが、 0.05ミクロン〜0.45ミクロンの平均直径をもつ方法。 31．請求項30に記載の方法であって、その組成物の単ラメラ・リポソームが、 0.05ミクロン〜 0.2ミクロンの平均直径をもつ方法。 32．アルカロイド免疫調節性化合物のデリバリー方法であって、その免疫モジュレーター又は医薬として許容されるその塩を含む請求項１に記載のリポソームを宿主に投与することを特徴とする方法。 33．請求項32に記載の方法であって、その化合物がスワインゾニンである方法。 34．請求項33に記載の方法であって、スワインゾニンが非経口的又は経口的にデリバリーされる方法。 35．請求項34に記載の方法であって、スワインゾニンが静脈内又は経口によりデリバリーされる方法。 36．請求項33に記載の方法であって、スワインゾニンが、約0.01／1.0 〜 0.5 ／1.0(mol／mol)の薬物対脂質比でそのリポソーム組成物中に存在する方法。 37．アルカロイド治療用化合物の充填方法であって：エタノールアンモニウム又はメチルアンモニウムの第１水溶液中、スフィンゴミエリンとコレステロールを含んで成る混合物からリポソームを形成し、その後エタノールアンモニウム又はメチルアンモニウムの外部濃度を減少させて、そのpH勾配がそのリポソーム内部へのその治療薬の取り込みを容易にするようなリポソーム・トランスメンブランpH勾配を作り；そしてトランスメンブラン取り込みを許容するようにそのリポソームとその治療用化合物を混合する、ことを特徴とする方法。 38．請求項37に記載の方法であって、そのリポソームの内部がpH２とpH５の間にある方法。 39．請求項37に記載の方法であって、その治療用化合物がビンクリスチン又はスワインゾニンである方法。